KR102463930B1

KR102463930B1 - 2α-하이드록시유데스마-4,11(13)-디엔-8β,12-올라이드를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102463930B1
Application number: KR1020200088390A
Authority: KR
Inventors: 장대길; 유희민
Original assignee: 스타링포스 주식회사; 한국표준과학연구원
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2022-11-10
Also published as: KR20220010644A

Abstract

본 발명은 국화목 국화과 금불초속에 속하는 Inula britannica로부터 분리한 2α-Hydroxyeudesma-4,11(13)-Dien-8β,12-Olide(HEDO)의 신규한 의약용도(특히, 항암제)에 관한 것으로서, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 실시예 화합물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

2α-하이드록시유데스마-4,11(13)-디엔-8β,12-올라이드를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing 2α-Hydroxyeudesma-4,11(13)-Dien-8β,12-Olide as an active ingredient}

본 발명은 국화목 국화과 금불초속에 속하는 Inula britannica로부터 분리한 2α-Hydroxyeudesma-4,11(13)-Dien-8β,12-Olide(HEDO)의 신규한 의약용도(특히, 항암제)에 관한 것이다.

림프종은 면역 체계를 담당하는 림프 조직에서 발생하는 암으로, 혈관계와 같이 전신 구석까지 분포되어 있어 신체 어느 곳에서도 발생할 수 있다. 림프종은 성숙된 백혈구 중의 하나인 림프구에서 생성된 악성 종양이므로 혈액암 중 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 이러한 혈액암은 나이가 들면서 증가하는 경향을 보이는데, 특히 림프종은 고령화 시대에 들어서면서 발생 빈도가 더욱 증가할 것으로 보인다.

림프종에는 호지킨 림프종과 비호지킨 림프종(NHL)의 두 가지가 있으며, 비호지킨 림프종이 전체 림프종의 95%를 차지한다. 비호지킨 림프종은 다시 B세포 림프종과 T/NK세포 림프종으로 나누어 지고, B세포 림프종 중 가장 흔한 것이 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL)이다. DLBCL은 주로 림프 조직에 발병하나, 림프절 외의 조직에 발병하는 경우도 흔하여 위장관, 피부, 중추신경계, 갑상선 등에서 발병할 수 있다. 흔히 다발성으로 나타나며, 매우 급속적으로 자라는 것이 특징이다. 항암치료에 높은 반응을 보여 상당수가 완치 판정을 받지만, 재발 위험이 높고 치료 실패율도 약 30%에 달하여 적극적인 연구가 필요하다.

DLBCL은 유전자형에 따라 ABC형과 GCB형으로 분류되며, ABC-DLBCL은 약이 잘 듣지 않는 악성 임파종으로 알려져 있다. ABC-DLBCL에서는 B세포의 항원 수용체에서 세포 내로의 신호전달경로에 이상이 생겨, 암세포의 생존이나 증식을 촉진하는 NF-κB 분자가 과잉 활성화되어 발생한다.

NF-κB는 DNA의 전사와 세포의 생존을 제어하는 단백질 복합체 중 하나이다. NF-κB는 거의 모든 동물 세포에서 발견되며, 스트레스, 활성산소, 중금속, 자외선, 박테리아, 바이러스 항원 등의 자극에 대한 세포 반응에 관여한다. NF-κB는 특히 감염에 대한 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 예를 들어 NF-κB 단백질이 비정상적으로 활성화되면 면역에 관여하는 단백질인 PHF20과 결합하여 세포에서 자살 신호전달 스위치 역할을 하는 인산기가 세포에서 떨어지지 못하도록 막아 계속 증식하게 만드는 문제가 있다.

NF-κB의 활성화는 IκB 키나아제(IKK) 복합체에 의한 인산화 후, NF-κB(IκB) 단백질 억제제의 프로테아좀 분해에 의존한다. NF-κB 이량체는 p65(REL-A), REL 및 p50 소단위로 구성되어 있는데, 핵으로 침투하여 표적 유전자의 전사를 매개하는 역할을 한다. NF-κB 활성에 대한 발암성이 DLBCL에서 입증되었지만, DLBCL의 대안이 될 수 있는 NF-κB 경로의 활성화를 차단하는 억제제는 아직 개발되지 않은 실정이다.

금불초(Inula japonica Thunberg)는 우리나라 각처의 산과 들에서 자라는 다년생 초본이다. 산과 들의 물기가 많은 곳에서 잘 자라며, 반그늘 혹은 양지식물이고, 키는 20~60㎝, 잎은 길이 5~10㎝, 폭 1~3㎝ 이고 어긋나며, 긴 타원형이고 가장자리에 드문드문 톱니가 있다. 꽃은 노란색이며 가지 끝과 줄기 끝에 달리고 지름은 약 3㎝ 내외이고, 열매는 10월 경에 달리고 길이 0.5㎝ 정도 되는 갓털이 붙어 있다. 꽃은 다른 국화류와는 달리 꽃잎이 좁고 길게 나와 있는 것이 특징이며, 어린순은 식용으로, 꽃은 기관지염, 당뇨병, 궤양, 소화 장애 및 염증 치료를 위한 약용으로도 쓰인다.

금불초에는 지상부에 세스퀴테르페노이드 락톤(sesquiterpenoid lactone), 브리타닌(britanin) 및 이눌린(inulin)이 함유되어있고, 꽃인 선복화에는 퀘르세틴(quercetin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 카페인산(caffeic acid), 클로로겐산(cholorogenic acid), 이눌린(inulin) 및 타락스테롤(taraxasterol) 등 다량의 스테롤(sterol) 성분이 함유되어 있다.

특히, 테르페노이드(terpenoid)의 15-탄소는 금불초의 가장 특징적인 성분으로 볼 수 있다. 금불초에서 대부분의 세스퀴테르펜은 락톤화된 형태로 발생하고, 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)의 주요 유형은 유데스마놀라이드(eudesmanolide)이다. 유데스마놀라이드는 5원자 γ-부티롤락톤 고리를 가지는 삼환계 세스퀴테르펜 락톤이고, 이것은 락톤 고리, 6,12- 및 8,12-olide의 고리화에 따라 두 가지 구조적 분류로 나눌 수 있다.

2α-Hydroxyeudesma-4,11(13)-dien-8β,12-olide(HEDO)는 테르페노이드에 속하는 유데스만 유형의 세스퀴테르펜 락톤이다. 천연 공급원에서 항암제를 찾는 과정에서, DLBCL 세포주에 대하여 HEDO가 세포독성 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 따라서, 우리는 in vitro에서 OCI-LY3 세포에 대한 HEDO의 항암 활성과, 그에 관련된 메커니즘을 조사하였다.

종래 기술에 대해 언급하면,

대한민국 공개특허(2011-0087448)에는 선복화 추출물로부터 분리된 화합물이 각종 염증 및 알러지 질환의 원인이 되는 비만세포로부터 시클로옥시게나제-2(COX-2) 의존적 프로스타글란딘(prostaglandin) 생성 및 류코트리엔(leukotriene)의 생성을 억제함과 동시에 비만세포로부터 히스타민(histamine)의 방출을 억제하므로, 각종 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있음이 개시되어 있다.

또한, 선행논문(J Ethnopharmacol. 2014 Jun 11;154(2):286-310)에는 genus Inula의 대사산물과, 이들의 약리학적 용도를 개시하고 있다.

한편, 본 발명은 국화목 국화과 금불초속에 속하는 Inula britannica로부터 분리한 HEDO의 신규한 의약용도(특히, 항암제)에 관한 것으로서, HEDO와 같은 유데스마놀라이드의 세스퀴테르펜 락톤을 포함하는 금불초는 세스퀴테르펜에 의해 항암, 항염증, 항박테리아 활성 등 광범위한 생물학적 특성을 나타낼 수 있음을 개시하고 있으나, HEDO를 백혈병 치료용도로 사용할 수 있음을 직접적으로 개시하고 있진 않기 때문에, 앞서 언급한 선행논문 내용과는 차별성이 있다.

본 발명의 일 측면에서의 목적은 2α-Hydroxyeudesma-4,11(13)-Dien-8β,12-Olide(HEDO) 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 상기 화합물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 상기 화합물의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면은 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 상기 화합물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 상기 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 측면에서 제공하는 실시예 화합물은 암, 특히 백혈병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 OCI-LY3 세포에 HEDO를 처리한 경우, 처리한 HEDO의 양에 따른 세포 활성을 분석하여 세포의 항증식성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2에서 A는 TMRM을 처리한 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 미토콘드리아 막전위가 감소함을 나타내는 그래프이고, B는 HEDO를 처리한 경우에 미토콘드리아 막전위 감소로 인하여 TMRM의 형광이 감소하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3에서 A는 H₂DCFDA를 처리한 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 세포 내 활성산소의 양이 증가함을 나타내는 그래프이고, B는 HEDO를 처리한 경우에 활성산소의 양이 증가하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4에서 A는 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 sub-G₀/G₁ 단계의 세포의 수가 증가함을 나타낸 그래프이고, B는 세포 주기의 각 단계에 있는 세포의 비율을 정량화한 그래프이다.
도 5에서 A는 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 자멸한 세포의 수가 증가함을 나타내는 그래프이고, B는 HEDO를 처리한 경우에 자멸한 세포의 비율이 증가하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에 BCL2, BCL-XL, BAX, procaspase-3, cleaved caspase-3 단백질과 같은 항체의 western blot을 통하여 세포 자멸을 촉진하였음을 나타내는 그림이다.
도 7은 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포의 Bax, Bak, Noxa의 mRNA level을 분석하기 위한 qRT-PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8에서 A는 DMSO를 처리한 경우와 비교하여 HEDO를 처리한 세포의 경우에 세포 자멸의 특징인 형태적 변화가 발생하였음을 보여주는 그림이고, B는 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포에서 p65의 핵 이동을 나타내는 그림이다. 도 8.B.에서 흰색 화살표는 p65의 핵 이동이 HEDO에 의하여 저해되었음을 나타내고 있다.
도 9에서 A는 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포의 형광 이미지를 나타내고(초록색 형광은 살아있는 세포를, 붉은색 형광은 죽은 세포를 표현), B는 EthD-1과 calcein을 처리한 사멸한 세포와 살아있는 세포의 flow cytometry 분석 결과이며, C는 HEDO를 처리한 경우에 사멸한 세포의 수가 증가하였음을 정량화한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 측면은,

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R¹, R² 및 R³는 독립적으로 수소, 하이드록시, 할로겐, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다.

다른 측면에서,

상기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 수소, 하이드록시, 할로겐, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시일 수 있다.

또 다른 측면에서,

상기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 하이드록시, C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시일 수 있다.

또 다른 측면에서,

상기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 하이드록시, 또는 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있다.

또 다른 측면에서,

상기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 하이드록시, 또는 메틸일 수 있다.

가장 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecμLar force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1당량 이상, 바람직하게는, 1당량 내지 5당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.

용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조 이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 입체 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 암은 혈액암 또는 고형암일 수 있다.

이때, 상기 혈액암은 백혈병, 악성림프종, 또는 다발성골수종일 수 있고, 상기 고형암은 위암, 유방암, 폐암, 대장암, 간암 및 담낭암, 신장암, 췌장암, 갑상선암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 또는 방광암일 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은,

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

다른 측면에서,

또 다른 측면에서,

[화학식 2]

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

나아가, 상기 외에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 상기 화합물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다. 나아가, 본 발명의 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 상기 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 일 측면은,

약제학적으로 치료가능한 양의 항암제를 포함하는 제1성분; 및

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2성분;을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

다른 측면에서,

또 다른 측면에서,

[화학식 2]

또한, 상기 제1성분과 제2성분은 환자의 상태에 따라 동시, 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서 제공하는 실시예 화합물은 암, 특히 백혈병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 이는 후술하는 실시예, 실험예에 의해 뒷받침된다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예를 통해 상세히 설명한다.

단, 후술하는 실시예, 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 2α-하이드록시유데스마-4,11(13)-디엔-8β,12-올라이드 준비

건조된 I.britannica의 꽃 1 kg을 80℃ 에서 3시간 동안 에탄올 10 L를 사용하여 추출한 다음, 이를 여과하고 추출하여 60 g의 에탄올 추출물(수율 6%)을 수득한다. 추출물 50 g을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피(50 × 10 cm)로 분별하고, 메탄올 및 물이 포함된 용액을 사용하여 용리시킨다.

박층 크로마토그래피(TLC) 결과에 따라 나누어진 3개의 분획 중에서, 세스퀴테르펜이 풍부한 B 분획을 MeOH-H₂O 용액(20:80→100:0)을 사용하여 YMC 역상(RP)-18 컬럼(50×6.5 cm)에서 크로마토그래피하여 3개의 분획을 수득하였다(B1-B3). 그 중에서, B1 분획을 YMC RP-18 컬럼(50×3.5 cm)에서 크로마토그래피하고, MeOH-H₂0 용액(40:60→80:20)에서 용리하여 220 mg의 HEDO를 수득하였다.

Whiter powder; [α]_D -87(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) λ_max 207 nm; IR(KBr) ν_max 3479, 2980, 1745, 1645, 1320, 1262, 1141, 999, 928, and 811 cm^-1; ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 6.20(1H, d, J = 2.8 Hz, H-13a), 5.74(1H, d, J = 2.8 Hz, H-13b), 4.54(1H, m, H-8), 3.56(1H, m, H-2), 3.16(2H, m, H-7), 2.95(1H, dd, J = 13.6, 7.6 Hz, H-6a), 2.23(1H, dd, J = 13.6, 4.4 Hz, H-6b), 2.16-1.96(2H, m, H-3), 1.84-1.73(2H, m, H-9), 1.66(3H, s, CH₃-15), 1.46(1H, dd, J = 13.6, 10.8 Hz, H-1α), 1.01(3H, s, CH₃-14); ¹³C-NMR(100 MHz, CD₃OD) δ 173.0(C-12), 141.7(C-11), 132.0(C-5), 127.8(C-4), 122.8(C-13), 77.9(C-8), 72.8(C-2), 41.7(C-7), 40.5(C-10), 38.6(C-1), 32.1(C-9), 28.9(C-3), 27.8(C-6), 21.0(CH₃-15), 19.1(CH₃-14); ESIMS m/z 249[M + Na]⁺.

<실험예 1> 세포의 항증식성 평가

HEDO를 처리한 경우에 세포의 항증식성 효과를 알아보기 위하여 혈액암 세포주를 100 ㎕의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 medium에서 5×10⁵ cells/well 밀도로 배양한 후, 각기 다른 농도의 HEDO(3, 5, 10, 21, 50, 100 μM)를 처리하였다. 세포 활성은 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium; MTS)을 사용하여 분석하였다.

HEDO는 OCI-LY3 세포에 대하여 강한 항증식성 활성을 보여주었고, 항증식성 효과는 HEDO를 처리한 시간과 처리한 HEDO의 양에 따라 증가하였다. 이러한 결과를 통해 HEDO가 OCI-LY3 세포에 대하여 세포독성 활성을 가진다는 것을 알 수 있다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 OCI-LY3 세포에 HEDO를 처리한 경우, 처리한 HEDO의 양에 따른 세포 활성을 분석하여 세포의 항증식성 효과를 나타내는 그래프이다.

<실험예 2> 미토콘드리아 막전위의 변화

HEDO에 의한 미토콘드리아 막전위의 변화(Δψm)는 형광 검출기인 테트라메틸로다민 메틸 에스터 퍼클로레이트(tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate; TMRM)의 형광 강도를 측정하여 분석하였다. 먼저 세포를 100 nM TMRM을 사용하여 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 washing하고, phosphate-buffered saline(PBS)를 사용하여 재현탁한 후, flow cytometer와 FlowJo software를 사용하여 관찰하였다.

HEDO를 48시간 동안 처리한 세포는 급격한 막전위 감극이 나타난 것으로 보아, OCI-LY3 림프종 세포에서 HEDO가 미토콘드리아 감극을 유도한 것으로 볼 수 있다. 이러한 결과는 HEDO가 혈액암에 화학적 치료 효과를 가질 수 있음을 제시하는 것이다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2.A.는 TMRM을 처리한 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 미토콘드리아 막전위가 감소함을 나타내는 그래프이고,

도 2.B.는 HEDO를 처리한 경우에 미토콘드리아 막전위 감소로 인하여 TMRM의 형광이 감소하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

<실험예 3> 발생한 활성산소(ROS)의 변화

세포에서 ROS를 측정하기 위하여 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 아세틸 에스터(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; H₂DCFDA) 검출기를 사용하였다. 세포를 실온에서 1 μM H₂DCFDA를 사용하여 인큐베이션 하고, 미토콘드리아의 ROS를 측정하기 위하여 MitoSOX-red mitochondrial superoxide indicator를 사용하였다. Δψm를 관찰하기 위하여 세포를 MitoProbe JC-1(5′,6,6′-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcacyanine iodide)을 사용하여 인큐베이션 하고, Fluorescence-activated cell sorting (FACS) buffer (PBS supplemented with 1% fetal bovine serum)를 사용하여 washing과 재현탁을 하였다. 세포 내 형광 ROS와 Δψm는 flow cytometer를 사용하여 측정하였다.

종양 세포는 항산화 수준을 억제하여 활성산소의 생성량을 유지시키고, 상승된 물질대사로 인하여 일반 세포에 비해 활성산소의 농도가 높다. HEDO가 OCI-LY3 세포 사멸에 어떠한 관련이 있는지 분석하기 위하여, H₂DCFDA를 사용하여 활성산소의 양을 측정하였다. 48시간 후에 HEDO가 OCI-LY3 세포 내 활성산소의 양에 영향을 준다는 것을 flow cytometer를 통하여 관찰하였다. 활성산소의 생성은 flow cytometer에 의하여 정량화되고, 활성산소의 생성은 HEDO 처리에 의하여 급격하게 증가하는 것도 알 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3.A.는 H₂DCFDA를 처리한 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 세포 내 활성산소의 양이 증가함을 나타내는 그래프이고,

도 3.B.는 HEDO를 처리한 경우에 활성산소의 양이 증가하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

<실험예 4> 세포 주기 진행의 저지

HEDO를 처리한 세포의 DNA 함량 분석을 통하여 세포가 세포 주기의 어떠한 단계에 존재하는지 분석하였다(sub-G₀/G₁, G₀/G₁, S, 또는 G₂/M). HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포를 6-well plate에 배양하고 48시간 동안 인큐베이션 한 후, 수득한 세포를 PBS를 이용하여 washing하고, 4℃ 80% 에탄올에서 3시간 동안 고정시킨다. 세포 주기 측정을 위하여 Muse cell cycle assay kit를 사용하였고, sub-G₀/G₁, G₀/G₁, S, 및 G₂/M 단계의 비율 측정은 flow cytometer와 FlowJo software를 사용하였다.

HEDO에 의하여 sub-G₀/G₁ 단계의 세포의 수가 증가됨을 알 수 있었다. 세포에 아무런 처리가 없는 경우 sub-G₀/G₁ 단계의 세포는 6.74%에 불과함에 반해, HEDO(10μM)를 48시간 동안 처리한 결과, sub-G₀/G₁ 단계의 세포를 19.0%로 증가시켰다. 이렇게 HEDO에 의하여 사멸된 림프종 세포의 축적은 HEDO가 세포 주기를 sub-G₀/G₁ 단계에서 저지하여 세포 성장을 방해한 것임을 알 수 있었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4.A.는 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 sub-G₀/G₁ 단계의 세포의 수가 증가함을 나타낸 그래프이고,

도 4.B.는 세포 주기의 각 단계에 있는 세포의 비율을 정량화한 그래프이다.

<실험예 5> 세포 자멸

자멸한 세포와 살아있는 세포의 비율을 분석하기 위하여 Annexin V 및 propidium iodide (PI) 염료를 사용하였다. 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 발견을 위하여 Annexin V APC/PI apoptosis detection kit를 사용하였고, flow cytometer를 통해 분석하였다. HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션 하고, 수득한 세포를 PBS를 통해 washing하고, Annexin V/PI를 이용하여 염색한다. 염색 후에, 자멸한 세포는 flow cytometer를 사용하여 관찰하였고, 세포의 비율은 FlowJo software를 사용하였다.

72시간 동안 HEDO를 처리한 결과, 자멸한 세포의 비율은 증가하였으나 살아있는 세포의 비율은 줄어든 것으로 보아, 자멸한 세포는 HEDO에 의한 것임을 확인할 수 있었다. HEDO를 72시간 동안 처리한 OCI-LY3 세포는 자멸한 세포의 비율이 증가하고, HEDO가 림프종 세포의 세포 자멸을 유발하는 것을 볼 수 있었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5.A.는 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에는 그렇지 않은 경우보다 자멸한 세포의 수가 증가함을 나타내는 그래프이고,

도 5.B.는 HEDO를 처리한 경우에 자멸한 세포의 비율이 증가하였음을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

<실험예 6> western blot 분석

HEDO를 처리한 세포를 수집하고, protease inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA buffer에 용해시킨다. 용해물의 농도는 Bradford assay를 사용하여 측정하였다. 모든 단백질은 도데실황산나트륨폴리아크릴아미드겔전기영동법을 통하여 분리하였고, 겔은 디플루오르화 폴리비닐리덴막을 통과한다. 막은 5% nonfat milk를 이용하여 차단되었다. 1차 항체, 즉, anti-BCL-2, anti-BCL-XL, anti-actin, anti-cleaved caspase-3를 희석하여 처리한 후에, 1:5000으로 희석한 2차 항체를 이용하여 인큐베이션 시켰다.

웨스턴 블롯을 분석하면 HEDO가 BCL2, BCL-XL, 및 procaspase3를 하향 조정하고, BAX 및 cleaved caspase-3를 상향조정하여 세포 사멸을 촉진시키는 것을 알 수 있었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 OCI-LY3 세포에서 HEDO를 처리한 경우에 BCL2, BCL-XL, BAX, procaspase-3, cleaved caspase-3 단백질과 같은 항체의 western blot을 통하여 세포 자멸을 촉진하였음을 나타내는 그림이다.

<실험예 7> RT-qPCR

모든 RNA는 RNeasy mini kit를 이용하여 HEDO를 48시간 동안 처리한 세포로부터 분리시킨다. 각각의 PCR 반응은 iTaq Universal SYBR Green Supermix를 사용하여 수행하였다. RT-qPCR 분석은 StepOnePlus Real-Time PCR system를 통하여 수행하였다.

아무런 처리를 하지 않은 세포와 비교하여 qRT-PCR 결과를 통해 HEDO가 OCI-LY3 세포에서 세포 사멸을 촉진하는 Bax, Bak, Noxa와 같은 세포 자멸 마커를 증가시켰다는 것을 알 수 있었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포의 Bax, Bak, Noxa의 mRNA level을 분석하기 위한 qRT-PCR 결과를 나타내는 그래프이다.

<실험예 8> NF-κB의 저해 분석

HEDO를 48시간 동안 처리한 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정시킨다. 고정된 세포는 PBS 내에서 3% BSA 및 0.01% Triton X-100를 이용하여 차단되고 투과된다. p65는 사용되었던 1차 항체이고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 한다. 사용된 2차 항체는 donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555이다. 최종 이미지는 형광 현미경을 통하여 관찰하였다.

20 μM의 HEDO를 처리한 결과 세포 활성을 현격하게 감소시켰고, 현미경 관찰 결과 HEDO 처리는 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 처리한 세포와 비교하여 전형적인 세포 자멸 형태변화를 발생시켰다. 림프종에서 전통적인 NF-κB 경로 안에 포함되는 p65와 p50은 가장 흔한 NF-κB subunit이다. p65의 핵 국소화는 NF-κB 활성화의 측정에 사용되는데, HEDO는 p65의 핵 이동을 저해함으로써 세포 자멸의 촉진을 가능하게 한다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8.A.은 DMSO를 처리한 경우와 비교하여 HEDO를 처리한 세포의 경우에 세포 자멸의 특징인 형태적 변화가 발생하였음을 보여주는 그림이고,

도 8.B.는 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포에서 p65의 핵 이동을 나타내는 그림이다. 도 8.B.에서 흰색 화살표는 p65의 핵 이동이 HEDO에 의하여 저해되었음을 나타내고 있다.

<실험예 9> OCI-LY3 세포의 사멸 여부

생존 능력/세포독성 분석은 ethidium homodimer-1(EthD-1, red)와 calcein(green) 형광을 세포에 라벨링하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 수량화하는데 일반적으로 사용된다. 세포의 사멸 여부 분석은 형광 현미경을 통하여 이미지화했다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 얼룩의 특징을 분석한 결과, HEDO(10 μM)를 처리한 경우, 약한 붉은색 형광을 볼 수 있었고, 48시간 동안 20 μM HEDO에 노출된 OCI-LY3 세포의 경우에는 붉은 색으로 표시된 죽은 세포의 급격한 증가를 불 수 있었다. 그러나, 이러한 관찰은 DMSO에서는 반대로 관찰되었다. 이러한 결과는 HEDO가 사멸된 세포의 비율을 월등하게 증가시켰음을 나타낸다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9.A.는 HEDO를 처리한 OCI-LY3 세포와 그렇지 않은 세포의 형광 이미지를 나타내고(초록색 형광은 살아있는 세포를, 붉은색 형광은 죽은 세포를 표현),

도 9.B.는 EthD-1과 calcein을 처리한 사멸한 세포와 살아있는 세포의 flow cytometry 분석 결과이고,

도 9.C.는 HEDO를 처리한 경우에 사멸한 세포의 수가 증가하였음을 정량화한 그래프이다.

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 2]

.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 혈액암은 백혈병, 악성림프종, 또는 다발성골수종인 것을 특징으로 하는, 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
[화학식 2]

.
삭제
삭제
삭제
약제학적으로 치료 가능한 양의 항암제를 포함하는 제1성분; 및
하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2성분;을 포함하는, 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 키트:
[화학식 2]

.
제14항에 있어서,
상기 제1성분과 제2성분은 동시, 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.