KR102450893B1 - 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic composition for improving skin comprising complex of exosome derived from Hydrangea Macrophylla and methods of the same}

본 발명은 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

수국(Hydrangea Macrophylla)은 한국, 중국, 일본, 인도네시아, 히말라야, 아메리카 등지 서식하는 식물로서, 해발 700m의 일교차가 큰 고산 지대에서 주로 분포한다. 일반적으로 수국은 차의 형태로 이용되고 있는데 수국차는 감로차 혹은 이슬차의 이름으로 불리우며, 카페인과 칼로리가 없기 때문에 부담 없이 마실 수 있으며, 효능으로는 심장의 열을 내리고 마음을 진정시켜 주는 효과가 있다고 알려져 있다. 상세하게는 수국에는 필로둘신(Phylodulcin) 성분이 들어 있어서 설탕의 1,000배가 넘는 단맛을 내지만 몸에 흡수되는 당은 0.1%도 안되기 때문에 설탕 대용으로 사용되어 당뇨병 환자에게 좋으며, 사포닌, 루틴, 게르마늄 같은 성분들로 인하여 혈압 상승 억제 효능이 있다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, 수국 내 사포닌은 기관지 속의 염증을 배출하고 점막을 보호하는 역할이 있으며, 항균 및 항염 효능이 있기 때문에 잇몸 질환 및 구취를 제거해 주는 역할도 가지고 있어 식재료로 사용되고 있다. 또한, 피부 미용과 관련하여 강력한 항산화작용으로 인하여 노화 방지에 도움을 주며, 예로부터 보습 효과 및 항알러지 작용으로 인하여 화장품의 재료로 사용되고 있다.

현대 사회는 환경적인 문제 뿐만 아니라 스트레스 등과 같은 다양한 요인들로 인하여 피부 트러블 발생이 증가하고 있다. 이에 따라, 사람들에게 있어 항염, 미백, 피부 보습 및 주름 방지는 아름다움 및 노화 억제의 상징으로써 지속적인 관심의 대상이 되어 왔다. 이러한 관심으로 현재 화장품 시장에서는 미백, 피부 보습 및 주름 방지용 제품들이 활발하게 출시되고 있으며, 이에 따른 소비자들의 관심도 증가에 따라 수요는 꾸준히 증가하고 있고, 관련 화장품 산업은 고부가 가치 산업으로 성장하고 있다.

상세하게는 피부 주름의 원인으로 피부 세포의 노화 현상이 가장 밀접하여 연관되어 있다. 세부적으로 자연 노화는 고령화에 따라 나타나는 현상이며 내적인 노화는 외부환경에 의해 나타나는 것으로 분류될 수 있다. 자연 노화는 피부 세포의 유전자적 요인 등이 많이 연관되어 있기 때문에 제어하기가 어렵다.

그러나, 내적인 노화는 자외선，산화，건조 등과 같은 환경적 요인을 제어함으로서 조절할 수 있기 때문에 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

내적인 노화를 발생시키는 환경적 요인은 피부 층 중, 주로 진피층에 포함된 콜라겐(Collagen) 단백질, 엘라스틴(elastin) 단백질 등을 파괴하거나 변성을 일으킴으로서 피부 주름을 유발한다. 특히, 자외선은 피부세포(섬유아세포 (fibroblasts))를 산화시키고 엘라스틴의 합성 저해 및 파괴를 일으키는데, 자외선 등에 의해 피부 조직 내에 엘라스틴 분해 효소(elastase) 발현이 촉진되어 피부 내의 정상적인 엘라스틴 합성을 억제하여 피부 탄력 저하를 유발하게 한다.

이에 따라, 많은 연구들에 의해 위의 부작용은 최소화하면서도 항염 효과, 피부 보습력 촉진과 주름을 생성하는 콜라겐 합성 관련 요소들의 활성 변화를 통한 주름 방지 효과를 모두 극대화할 수 있는 물질의 개발이 진행되고 있다. 또한, 상기 장점들을 극대화시키는 것뿐만 아니라 피부 자극, 세포 독성 등의 위해 요소를 최소화하여 함량의 제한 없이 사용할 수 있는 화장료 조성물에 대한 연구 및 소비자들의 요구도 증가하는 실정이다.

한편, 소포체는 작게는 직경 약 20nm부터 크게는 직경 약 5㎛의 크기를 갖는 막 구조 미세 소낭체로서, 그 크기와 구성에 따라, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로 소낭(microvesicle), 마이크로 입자(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등으로 분류된다. 이 중, 엑소좀(exosome)이란 동물 세포, 미생물, 식물, 체액 등 살아있는 모든 세포에서 세포 간 의사소통의 수단으로 세포 밖으로 분비되는 물질로서 50~200nm 나노 크기의 물질이다.

이러한 나노 크기의 엑소좀은 세포밖 소포체(extracellular vesicles)라는 명칭으로도 통용되고 있으며, 발생 과정은 세포 내 막 함입(Endocytosis)에 의해 초기 엔도좀(endosome)을 생성하고 세포 내의 다양한 물질들이 엔도좀 내에 막 형태로 들어오게 되어 다중소포체(Multi-Vesicular body; MVB)를 형성하게 되는 후기 엔도좀으로 발생하게 된다. 이후, 후기 엔도좀의 막은 세포 막에 융합을 하여 내부에 있는 다중 소포체를 세포 밖으로 방출하게 되는데 이를 엑소좀이라고 한다. 엑소좀의 막 성분은 세포막과 유사한 인지질 이중층으로 이루어져 있으며, 막 단백질 및 세포가 가지고 있는 유전정보 물질(DNA, RNA, 단백질(Protein)) 등을 타겟 세포에 전달할 수 있다. 대표적인 예로 RNA 수송 기전을 들 수 있다. 세포 밖에 존재하는 RNA는 분해되는 반면, 엑소좀 내에 존재하는 RNA는 이들 물질로부터 보호되어 표적 세포로 원활하게 전달될 수 있다. 또한, 엑소좀은 단백질을 표적세포에 전달하여 효율적으로 세포 내 해당 신호 전달을 용이하게 한다는 장점을 가진 물질이며 다양한 2차 대사 산물(secondary metabolism) 및 유전 정보와 관련된 물질을 한번에 수송함으로써 복합적으로 신호를 전달할 수 있다. 세포의 성장 및 증식을 위해서 한 종류의 단백질을 전달하는 것보다 시너지 효과를 낼 수 있는 단백질 집단이나 기타 다른 물질(핵산, 지질)들을 동시다발적으로 수송함으로써 세포 내 신호들을 효율적으로 전달할 수 있다.

또한, 엑소좀은 엑소좀 내에 다른 유효 성분들을 탑재하여 캐리어(carrier)로서 활용할 수 있다는 장점이 있어, 이를 통해 약물(drug)을 엑소좀 내에 함입시켜 표적 항암제로서 이용하기 위해 많은 연구들 및 개발이 이루어지고 있는 실정이다.

국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-2016-0024674호 「수국차잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법」은 조성물이 피부 미백, 주름 개선, 항산화용 화장료 조성물, 피부 미백용 식품 조성물, 피부 미백용 약학 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 멜라닌 형성을 억제하며 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성으로 미백효과가 인정되고, 주름 개선 및 항산화 효능에 우수한 효과가 있다고 기술하고 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-2014-0082555호 「수국 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물」은 조성물이 피부에 대한 안전성을 가지며 티로시나제 활성 억제를 촉진하여 미백 효과가 우수하다고 기술하고 있다. 하지만, 상기 특허들은 추출물에만 한정되어 있어 추출 용매에 의한 효능 차이가 존재한다는 단점이 있다.

이에, 본 발명에서는 수국의 효능을 더욱 개선시키고자, 수국 잎 추출물 및 수국 잎 유래 엑소좀을 혼합한 수국 잎 유래 엑소좀 복합물을 제조할 경우, 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 탄력 증진에 의한 주름 개선, 피부 보습, 항염 효능을 촉진 및 증대시키는 것을 확인하고 이에 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-2016-0024674호 대한민국 등록특허공보 제10-2014-0082555호

본 발명의 목적은 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수국 잎 추출물을 제조하는 단계; 수국 잎에서 엑소좀을 제조하는 단계; 및 수국 잎의 추출물 및 수국 잎에서 분리한 엑소좀을 1:0.5~2 중량비로 혼합하여 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름 개선, 항염, 피부 탄력 및 피부 보습 효능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 수국의 잎 추출물은 수국 잎 부위를 분쇄한 후, 증류수를 용매로 사용하여 60~70℃에서 2~3시간 동안 열처리를 통해 열수 추출한 후 냉각 및 여과하여 수득하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 수국 잎 엑소좀은 (a)수국 잎 원물에 중량비 20배의 증류수를 넣고 분쇄한 후, 4℃에서 24시간 동안 분쇄물을 안정화 시키는 단계; (b) 분쇄물을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 분쇄액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계; (c)분쇄액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (d)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (f)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및 (g) 1차 및 2차 펠렛층을 정제수에 재부유시켜 수국 잎으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 수국 잎 추출물 및 엑소좀이 1:0.5~2 중량비로 혼합된 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 상기 조성물의 제조방법으로부터 수득된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하는 방법의 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 혼합비에 따른 피부 탄력 관련 단백질인 MMP-1 의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 3는 본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 혼합비에 따른 피부 탄력 관련 단백질인 pro-collagen type 1 의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 4은 본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 혼합비에 따른 피부 보습 관련 단백질인 히알루론산(Hyaluronic acid) 생성능의 변화를 확인한 것이다.
도 5은 본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 혼합비에 따른 염증 관련 인자인 산화질소(Nitric oxide; NO)의 활성 변화를 확인한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 발명자들은 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 각각 제조하고, 상기 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 최적의 비율로 혼합하여 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하였다. 그 결과, 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능이 우수하다는 사실을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 수국 잎 추출물을 제조하는 단계; 수국 잎 엑소좀을 제조하는 단계; 및 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 1:0.5~2 중량비로 혼합하여 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 '수국 잎 유래 엑소좀 혼합물'이라 함은 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 혼합하여 수득된 혼합물을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 수국 잎 추출물은 건조된 각 수국 부위를 증류수를 용매로 사용하여 60~70℃에서 2~3시간 동안 열처리를 통해 열수 추출한 후 냉각 및 여과하여 수득하는 것일 수 있다.

이때, 상기 수국 잎 및 용매의 혼합 비율은 1 : 20 중량비로 수행하는 것이 바람직하다.

상기 수국 잎 추출물의 추출 용매 비율, 추출 온도 및 추출 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 추출조건이 맞지 않아 충분한 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 추출 성분의 효능이 떨어지기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 여과 공정을 수행하여 유효성분 외의 잔여물을 걸러내어 수국 잎 추출물의 순도를 높이고 오염을 방지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 수국 잎 엑소좀은 (a)수국 잎 원물에 중량비 20배의 증류수를 넣고 분쇄한 후, 4℃에서 24시간 동안 분쇄물을 안정화 시키는 단계; (b) 분쇄물을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 분쇄액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계; (c)분쇄액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (d)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (f)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및 (g) 1차 및 2차 펠렛층을 정제수에 재부유시켜 수국 잎으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이, (e)공정에서 매우 높은 중력가속도(100,000~150,000g)로 초고속 원심분리하기 전에, (a)공정에서 가장 낮은 중력가속도(3,000~4,000g)로 원심분리하고, (c)공정에서 낮은 중력가속도(10,000~15,000g)로 원심분리한 다음, (d)공정에서 여과하는 과정을 수행하여 엑소좀 외의 잔여물을 걸러내어 엑소좀의 순도를 높이는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 수득한 후, 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 1:0.5~2 중량비로 혼합하여 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하는 것일 수 있다.

이때, 상기 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 1:0.5~2 중량비로 혼합하는 것이 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 동시에 갖을 수 있다는 측면에서 바람직하고, 그 중에서도 수국 잎 추출물 및 엑소좀을 1:2로 혼합하는 것이 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 가장 극대화 시킬 수 있다는 측면에서 바람직하다.

따라서, 본 발명은 수국 잎 추출물 및 엑소좀이 1:0.5~2 중량비로 혼합된 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선, 피부 보습 효능 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물에서, 상기 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 10 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 30 내지 50 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 수국 잎 엑소좀 혼합물 제조

수국 잎 엑소좀 혼합물을 제조하기 위한 공정도는 도 1과 같다. 먼저, 건조된 수국 잎 50g 을 1000ml의 정제수를 가하고 60~70℃에서 3시간 동안 반응하여 열수 추출하였다. 그 후, 정제수를 용매로 사용한 추출물의 경우, 냉장 상태에서 3시간 동안 열을 식히고, bottle top 필터로 2번 여과하여 수국 잎 열수 추출물을 수득하였다. 다음으로, 수국 잎으로부터 엑소좀을 분리하기 위해 분쇄기를 이용하여 수국 잎 부위에 정제수를 중량비 20배를 가하여 불린 후, 분쇄기로 분쇄한 후, 엑소좀의 순도를 높이기 위해 수국 잎 분쇄물을 원심분리기를 이용하여 3,000~4,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿층을 제외하고 상등액만을 취하여 잔여물을 분리 및 제거하였다. 본 과정에서 수득된 상등액을 초고속 원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 10,000~15,000 x g로 20~30분 동안 원심분리하고, 수득된 상등액의 순도를 더욱 높이기 위해 상등액을 여과하여 잔여물을 분리 및 제거함으로 더욱 순도를 높이고자 하였다. 순도가 높은 상등액에 존재하는 엑소좀을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000 x g에서 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 침전시켰다. 최종 펠렛층인 엑소좀을 멸균 증류수에 재부유시켜 분산시켜 엑소좀을 제조하였다. 상기 방법으로부터 수득한 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합물 비교 및 최적 혼합비를 제시하기 위해 혼합 비율을 추출물:엑소좀=1:1 또는 1:2 또는 2:1로 설정하여 최종 수국 부위 별 유래 엑소좀 혼합물을 제조하였다.

	수국 잎 추출물 및 엑소좀 혼합 비율
비교예 1	수국 잎 열수 추출물
비교예 2	수국 잎 유래 엑소좀
실시예 1	수국 잎 추출물 : 수국 잎 엑소좀 혼합물 = 1 : 1
실시예 2	수국 잎 추출물 : 수국 잎 엑소좀 혼합물 = 1 : 2
실시예 3	수국 잎 추출물 : 수국 잎 엑소좀 혼합물 = 2 : 1

<비교예 1> 수국 잎 추출물 제조

상기 <실시예 1~3>에서 수국 잎 추출물을 수득한 방법과 동일한 방법으로 비교예 1을 제조하였다.

<비교예 2> 수국 잎 유래 엑소좀 제조

상기 <실시예 1~3>에서 수국 잎 엑소좀을 수득한 방법과 동일한 방법으로 비교예 2를 제조하였다.

<실험예 1> 엑소좀의 수율 증대 효과 분석

실시예 1~3 및 비교예 1~2의 정량적 및 분자 생물학적 평가를 하기 위해 일반적으로 사용되고 있는 브래드 포드 방법을 통해 단백질 농도를 측정하였으며, 브래드 포드 실험 방법은 바이오래드 BioRad) 사 제품에서 제공하는 절차에 따라 실시하였다. 상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2 시료 40μL와 브래드 포드 시약 160μL을 96-웰 플레이트에서 혼합한 후, 호일로 빛을 차단한 상태에서 5분 간 반응시켰다. 이후, Microplate reader 장비를 이용하여 595nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 통한 단백질의 농도는 시약과 함께 제공된 BSA(Bovine serum albumin) 으로 표준 곡선(Standard curve)를 통해 분석하였다.

또한, 상기 실시예 1~3 및 비교예 2 에서 수득된 엑소좀의 정량(입자 크기, 입자 수) 분석은 나노 입자 추적 분석기(Nano Tracking Analyzer; NTA, Zetaview TWIN, Particle Metrix)를 이용하여 측정하였으며, 본 기기의 분석 프로그램인 ZetaView software을 이용하여 분석을 수행하였다.

참고로, 비교예 1은 엑소좀이 아닌 추출물이므로 본 분석에서 제외하였다.

시료명	평균 입자 크기 (nm)	NTA 분석(Particle/mL)	Protein(μg/mL)
실시예 1	131.4	2.9E+9	149.8
실시예 2	129.8	3.1E+9	193.1
실시예 3	133.9	2.8E+9	170.6
비교예 2	136.1	2.4E+9	134.2

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 나노 입자 추적 분석기(NTA)를 통한 평균 입자 크기, 입자 수 및 단백질 농도를 측정한 결과, 입자 크기 및 입자 수는 비교예 및 각 실시예 간의 큰 차이는 없는 것을 확인되었다. 그러나, 단백질 농도는 실시예 2인 중량비 기준, 추출물 : 엑소좀 = 1 : 2의 혼합 비율에서 가장 큰 단백질 양을 확인하였다. 본 결과들을 통해, 추출물 단백질 농도보다 엑소좀 내의 단백질의 영향이 크다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 항주름 효능 시험 : MMP-1 억제 및 PIP Assay

실시예 1~3 및 비교예 1~2의 MMP-1(콜라겐분해효소) 억제와 PIP(Procollagen type 1 C-Peptide) 생성 정도를 평가하였다.

(1) MMP-1 억제

실시예 1~3 및 비교예 1~2를 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 주름 억제 활성을 확인하고자 MMP-1에 대한 assay 실험을 진행하였다. 본 실험은 UVB의 조사에 의하여 발현되는 MMP-1의 억제 활성을 Real-time PCR을 통하여 확인하였으며, 샘플 처리 농도 별로 조제하여 처리함으로써 MMP-1의 억제 활성에 영향을 주는지 확인하였다. 하기 도 2는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 피부 탄력 관련 바이오마커로서 콜라겐(Collagen) 합성 저해 효소인(MMP-1)의 억제 효과를 나타낸 것이다.

그 결과, 상기 도 2에 나타난 바와 같이, 동일한 농도 및 조건에서의 실시예 1~3은 비교예 1~2 대비 MMP-1 저해 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1~3 중에서도 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합 비율이 1:2일 경우 MMP-1 저해 활성 증가폭이 크게 나타났다. 이러한 결과는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물이 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였으며, 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합 비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay

실시예 1~3 및 비교예 1~2가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 실시예 1~3 및 비교예 1~2를의 시료를 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠ C-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 2시간동안 반응시켜 주었다.그리고 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substrate solution (3,3',5,5'- Tetrametylbenzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 후, ELISA 기기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 도 3은 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물의 콜라겐 합성 관련에 관여하여 피부 탄력 바이오마커인(Procollagen Type I)의 변화를 나타낸 것이다.

그 결과, 상기 도 3에 나타난 바와 같이, 동일한 농도 및 조건에서의 실시예 1~3은 비교예 1~2 대비 Procollagen Type I 활성을 증가시켜 콜라겐 생성 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1~3 중에서도 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합 비율이 1:2일 경우 Procollagen Type I 활성이 크게 증가하였다. 이러한 결과는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물이 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였으며, 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 피부 보습 활성 시험 : 히알루론산 (Hyaluronic acid) 생성능

실시예 1~3 및 비교예 1~2를 이용하여 피부 보습 활성 효과를 확인하기 위해 피부 보습 관련 인자인 히알루론산 (Hyaluronic acid) 생성 활성을 증가시키는 정도를 측정하였다. 세포 배양 및 시료의 처리를 수행한 후, 각 시료에 의해 합성이 촉진되어 배지로 분비된 히알루론산의 양을 알아보기 위해 배지를 수거하여 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorben Assay)를 수행하였다. ELISA를 수행하기 위해 Hyaluronan ELISA Kit(HA-ELISA, Product No : K-1200, Echelon사)을 구입하였다. 상기 세포 배양을 통해 수거한 배지를 HA-ELISA Kit를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하여 수국 엑소좀 혼합물에 의해 인체 피부 진피 섬유아세포에서 합성되어 배지로 배출되는 히알루론산의 합성량을 정량화하였다.

도 4는 인간 피부 진피 섬유아세포에 비교예 1~2 및 실시예 1~3의 수국 잎 엑소좀 혼합물을 포함한 시료들을 농도별로 처리한 후, 히알루론산 합성이 촉진되어 배지로 배출되는 양을 HA-ELISA Kit를 이용하여 확인 정량화한 결과로서, 모든수국 잎 엑소좀 혼합물을 4%, 8%로 처리하였을 때, 각각 단독 추출물 및 엑소좀인 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였으며, 특히 수국 잎 추출물과 엑소좀의 혼합 비율이 1 : 2 로 혼합하였을 때, 동일한 농도 구간에서 40%와 60%의 합성능이 증가함을 알 수 있었다.

이상의 결과를 통하여, 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 인체 피부 진피 섬유아세포에 처리하였을 때 히알루론산 합성효소 유전자의 발현이 증가되어 결과적으로 히알루론산의 생성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물이 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였으며, 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 항염 효능 시험 : Nitric Oxide(NO) 억제 활성

실시예 1~3 및 비교예 1~2를 이용하여 항염증 활성 효과를 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 억제하는 정도를 측정하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24Well plate에 1.0x104 cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 RAW 264.7 cell에 실시예 1~3 및 비교예 1~2를 50(㎍/㎖) 농도로 배지와 혼합 후, 각 Well에 1ml씩 첨가하고 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 Well에 Nitric Oxide detection kit를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96 Well plate에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10분 동안 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. 하기 도 5은 수국 잎 엑소좀 혼합물의 Nitric Oxide(NO) 활성 억제를 통한 항염 활성을 나타낸 것이다.

그 결과, 상기 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1~3은 비교예 1 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제율이 높은 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1~3 중에서도 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합 비율이 1:2일 경우 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제율이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물이 수국 잎 추출물 또는 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 항염 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였으며, 수국 잎 추출물 및 엑소좀의 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 수국 잎 추출물을 제조하는 단계;
   수국 잎 엑소좀을 제조하는 단계; 및
   수국 잎 추출물 및 수국 잎 엑소좀을 1:2 중량비로 혼합하여 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 수국 잎 추출물은 수국 잎을 증류수를 용매로 사용하여 60~70℃에서 2~3시간 동안 열처리를 통해 열수 추출한 후 냉각 및 여과하여 수득하는 것을 특징으로 하는 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 수국 잎 엑소좀은 (a)건조된 수국 잎 원물을 정제수에 불린 후, 냉장 상태에서 1차 반응시키고, 이를 분쇄한 후, 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 분쇄액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계;
   (b)분쇄액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
   (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
   (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계;
   (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및
   (f) 1차 및 2차 펠렛층을 정제수에 재부유시켜 수국 잎으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
   
4. 수국 잎 추출물 및 수국 잎 엑소좀이 1:2 중량비로 혼합된 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능을 갖는 화장료 조성물.
   
5. 제4항의 조성물을 포함하는 화장품.
   

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