JP7129105B2 - 高含有量のカルス代謝産物を有するカルス溶解物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
し、次いで誘導されたカルスを継代培養して大量のカルスを製造してもよい。
前記特定の基準物質としては、フラボノイド、テルペノイドなどが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
ーまたはプルロニック、ポリエチレングリコール、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエトキシル化ヒマシ油、および水素化ヒマシ油が挙げられる。ここで、前記界面活性剤または乳化剤は、前記カルス溶解物100重量部に対して、5~30重量部、好ましくは5~20重量部の量で使用してもよい。
ては、上記の通りである。
。
リンゴの木の当年生枝(学名:Malus pumila,品種名:ふじ、採取部位:枝の形成層を含む部分、生育期間:1~6ヶ月)を35v/v%の過酸化水素に10分、続いて70v/v%のエタノールに1分間浸漬させた後、2v/v%の次亜塩素酸ナトリウム(Sodium hypochlorite)溶液で30分間振とうし、殺菌した。
してカルス(callus)形成を誘導した。
前記製造例1でリンゴの木の当年生枝の代わりにクコの当年生枝(学名:Lycium
chinense,採取部位:枝の形成層を含む部分、生育期間:1~6ヶ月)を使用することを除いては、製造例1と同様に行った。
前記製造例1でリンゴの木の当年生枝の代わりにブドウの木の当年生枝(学名:Vitis vinifera L.,品種名:キャンベル、採取部位:枝の形成層を含む部分、生育期間:1~6ヶ月)を使用することを除いては、製造例1と同様に行った。
製造例1で製造したリンゴカルスを500ml採取し、高圧ホモジナイザー(モデル名:Scientz-150、メーカー:Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd)を用いて、200barで1回当たり20分ずつ、合計3回処理してカルスを破砕した。このように製造されたリンゴカルス高圧均質破砕物を75℃で30分間処理し、低温殺菌および酵素の不活性化の後処理を行った後、使用した。
高圧ホモジナイザーの圧力を500barに変更したことを除いては、実施例1と同様の方法で、リンゴカルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を1,000barに変更したことを除いては、実施例1と同様の方法で、リンゴカルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を2,000barに変更したことを除いては、実施例1と同様の方法で、リンゴカルス高圧均質破砕物を製造した。
製造例2で製造したクコの実カルス培養物を500ml採取し、高圧ホモジナイザー(モデル名:Scientz-150、メーカー:Ningbo Scientz Biotechnology Co.、Ltd)を用いて、200barで1回当たり20分ずつ、合計3回処理してカルスを破砕した。このように製造された植物カルス高圧均質破砕物は、75℃で30分間処理し、低温殺菌および酵素の不活性化の後処理を行った後、使用した。
高圧ホモジナイザーの圧力を500barに変更したことを除いては、実施例5と同様の方法で、クコの実カルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を1,000barに変更したことを除いては、実施例5と同様の方法で、クコの実カルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を2,000barに変更したことを除いては、実施例5と同様の方法で、クコの実カルス高圧均質破砕物を製造した。
製造例3で製造したブドウカルス培養物を500ml採取し、高圧ホモジナイザー(モデル名:Scientz-150、メーカー:Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd)を用いて、200barで1回当たり20分ずつ、合計3回処理してカルスを破砕した。このように製造されたクコの実カルス高圧均質破砕物を75℃で30分間処理し、低温殺菌および酵素の不活性化の後処理を行った後、使用した。
高圧ホモジナイザーの圧力を500barに変更したことを除いては、実施例9と同様の方法で、ブドウカルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を1,000barに変更したことを除いては、実施例9と同様の方法で、ブドウカルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を2,000barに変更したことを除いては、実施例9と同様の方法で、ブドウカルス高圧均質破砕物を製造した。
製造例1で製造したリンゴカルス培養物を500ml採取し、培養液を除去し、1Lの滅菌水に浸漬して80℃で60分間熱水抽出を行った。その後、得られた抽出液をろ紙(Advantes、No.2)でろ過し、植物カルス熱水抽出物を製造した。
製造例2で製造したクコの実カルス培養物を500ml採取し、培養液を除去し、1Lの滅菌水に浸漬して80℃で60分間熱水抽出を行った。その後、得られた抽出液をろ紙(Advantes、No.2)でろ過し、クコの実カルス熱水抽出物を製造した。
製造例3で製造したブドウカルス培養物を500ml採取し、培養液を除去し、1Lの滅菌水に浸漬して80℃で60分間熱水抽出を行った。その後、得られた抽出液をろ紙(Advantes、No.2)でろ過し、ブドウカルス熱水抽出物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を100barに変更したことを除いては、実施例9と同様の方法で、ブドウカルス高圧均質破砕物を製造した。
高圧ホモジナイザーの圧力を2,100barに変更したことを除いては、実施例9と同様の方法で、ブドウカルス高圧均質破砕物を製造した。
前記実施例12で製造したブドウカルス高圧均質破砕物30重量%、精製水65重量%および乳化剤5重量%を混合した後、60~70℃でエマルジョン化して水中油型(O/W)エマルジョンを製造した。
反応器に下表1に示す組成成分を投入した後、70℃に加熱して乳化させた。乳化が完了した後、前記反応器の温度を45℃に冷却し、前記実施例13で製造したブドウカルス含有カプセルを添加して分散させた後、30℃に冷却して、栄養クリーム剤形の化粧料を製造した。
反応器に下表1に示す組成成分を投入した後、70℃に加熱して乳化させた。乳化が完了した後、前記反応器の温度を45℃に冷却し、前記比較例3で製造したブドウのカルス抽出物を添加して分散させた後、30℃に冷却して、栄養クリーム剤形の化粧料を製造した。
反応器に下表1に示す組成成分を投入した後、70℃に加熱して乳化させた。乳化が完了した後、前記反応器の温度を45℃に冷却し、分散させ、次いで30℃に冷却して、栄養クリーム剤形の化粧料を製造した。
人工皮膚(DE、Dermal Equivalent)を用いて、実施例1~12及び比較例1~5の試料の皮膚浸透効果を測定した。
年齢が20代から50代の合計30名の男女対象者を募集し、皮膚保湿能の評価を行った。
、クコの実カルス、ブドウカルスを200~2000barで高圧ホモジナイザーを用いて破砕した植物カルス均質破砕物を含む場合、同じ植物カルスの熱水抽出物を使用した比較例1~3、および破砕圧力が本発明の範囲を超える比較例4及び5に比べて、皮膚保湿能が著しく優れていることが確認された。
コラーゲンを分解する酵素であるコラゲナーゼの活性度を測定するために、抗体を用いた。
Ultra Microplate Reader、イギリス)を用いて450nmで吸光度を測定した。対照群として蒸留水を使用し、吸光度測定値を下記式1に代入してコラゲナーゼ活性阻害率を算出し、その結果を下表4に示した。
コラゲナーゼ阻害率(%)=100-{[(A1-B1)-(C1-D1)]/(A1-B1)}×100
A1:対照群の吸光度
B1:対照群のブランク吸光度
C1:実験群の吸光度
D1:実験群のブランク吸光度
本実験は、マウスメラノーマ(murine melanoma)(B-16 F1)細胞(韓国細胞株銀行)を、10%牛胎児血清(fetal bovine serum:FBS)含有のDMEM培地入り6ウェルプレートに1×105細胞/ウェルウェルの割合で接種し、5%CO2及び37℃下で細胞がウェルの底に約80%以上付着するまで培養した。次いで、培地を除去し、試料を適当な濃度に希釈された培地に入れ替え、5%CO2及び37℃下で三日間培養した。培地を除去した細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS:phosphate buffered saline)で洗浄し、これをトリプシンで処理して細胞を回収した。回収された細胞は、血球計算盤(hematocytometer,Tiefe Depth Profondeur 0.100mm、Paul Marienfeld GmbH&Co.KG、ドイツ)を用いて細胞数を測定し、5,000~10,000rpmにて10分間遠心分離した後、上澄み液を除去してペレットを得た。この細胞ペレットを、溶解緩衝液(lysis buffer)を用いて粉
砕し、12,000rpmにて10分間遠心分離して上澄み液を収集した。
チロシナーゼ阻害率(%)=100-{[(A2-B2)-(C2-D2)]/(A2-B2)}×100
A2:対照群の吸光度
B2:対照群のブランク吸光度
C2:実験群の吸光度
D2:実験群のブランク吸光度
3、及び均質化(破砕)時の圧力が200bar未満である比較例4に比べて、チロシナーゼ阻害能が著しく優れていることが確認された。また、均質化(破砕)時の圧力が2000barを超える比較例5の場合、試料のチロシナーゼ阻害能は十分であるが、試料の変色及び変臭の性状変化が発生したので、外用剤及び化粧料組成物としての適用に適していない。
実施例14及び比較例6~7の方法で製造した栄養クリームを、シミ、そばかす、または色素沈着症を有する健康な成人男女100名を対象に使用し、クロマメーター(Chroma Meter、モデル名:CR-300、MINOLTA CO.,LTD.)を用いて、皮膚色の明るさ変化(△L)を測定した。
フリーラジカルであるDPPH(1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル)に対する消去能を測定することで抗酸化能を評価した。色を呈するラジカルであるDPPHを用いて、試料のラジカル消去能を直接確認することができる。
ラジカル消去能(%)={1-(試料添加群の吸光度/試料無添加群の吸光度)×100}
実施例1~13及び比較例1~5の試料をそれぞれ10mlで準備した後、0.2μmシリンジフィルター(syringe filter)でろ過して検体を用意した。総ポリフェノール含有量は、フォーリンチオカルト法(Folin-Denis法、Gutfinger R.1981)により測定した。各試料の1mgを蒸留水1mLに溶解し、蒸留水で10倍希釈した希釈液2mLに0.2mLのフォーリンチオカルトフェノール試薬(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)を加えて混合した後、室温で3分間放置した。次いで、2mLの2M Na2CO3を入れて1時間反応させた後、上澄み液をマイクロプレートリーダー(microplate reader)を用いて725nmで測定し、没食子酸(gallic acid)を用いて作成
した標準曲線から含有量を求めた。その結果を下表8に示した。
実施例1~13及び比較例1~5の試料をそれぞれ10mlで準備した後、0.2μmシリンジフィルター(syringe filter)でろ過して検体を用意した。各試料を-20℃で48時間凍結乾燥させた後、凍結乾燥物を石油エーテル(60~80℃)で抽出した。抽出物をろ過濃縮後、濃縮物の分取量(画分)を、ベンゼン-酢酸エチル(99:1)溶媒を使用してシリカゲルC上の薄層クロマトグラフィー(TLC)により分析した。試料は、ガラスカラム(2m×5mmOD)を使用してガスクロマトグラフィー(島津GC-7A、京都、日本)により分析した。アルテミシニン(artemisinin)を使用し標準曲線を用いて定量化を行い、総テルペノイド含有量は、メタノール-水(80:20)溶離液(0.8mL/分)を使用してHPLCにより測定した。その結果を下表8に示した。
実施例12と13および比較例3の試料の光に対する安定性を下記のような方法で評価した。各試料を1つ当たり30mlずつ分取し、4個を準備した後、遮光および透光容器に入れ、照度1000±200lux、温度25±2℃(常温)を保つ恒温器に保管して、2週間間隔で高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。高速液体クロマトグラフィーによるレスベラトロール(resveratrol)分析のために、各試料0.1gをとり、100%純度のメタノール10mLに溶解させた後、超音波破砕機で10秒ずつ3回粉砕し、12時間抽出し、次いで、遠心分離し、有機溶媒用の0.2μmナイロンフ
ィルターでろ過して検体液を製造した。
area:検体試料のピーク面積)およびAS(Standard area:標準試料のピーク面積)を測定した。
レスベラトロール(C14H12NO3)の量(mg)=レスベラトロール標準品の量(mg)×AT/AS
検出器:紫外吸光光度計(測定波長305nm)
カラム:内径4.6mm、長さ15cmのステンレス管に約5μmの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填したカラムまたは同等のコラム
カラム温度:室温
移動相:0.1%TFA water:アセトニトリル=70:30
流量:1.0mL/分
Claims (7)
- カルス代謝産物の消失なしにカルス代謝産物を含有するカルス溶解物の製造方法であって、
カルスを200~2,000barの圧力で機械的に均質化(破砕)するカルスの機械的均質化(破砕)ステップと、
前記均質化によって得られたカルス高圧均等破砕物を低温殺菌するステップと、
前記カルス高圧均等破砕物中の酵素を75℃で不活性化するステップと、
を含み、
前記カルス代謝産物の消失は、カルス溶解物に含まれるフラボノイドおよびテルペノイドの含有量が、熱水抽出法で製造した場合と比較して、1.3倍以下であり、
前記カルス溶解物が、人体の皮膚に有用な成分の作用により、皮膚保湿増進、皮膚シワ予防または改善、皮膚弾力増進、皮膚美白、および皮膚トーン改善からなる群より選択される少なくとも1つの効果を有する、カルス溶解物の製造方法。 - 前記カルスの機械的均質化(破砕)ステップの前に、以下のステップのうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項1に記載のカルス溶解物の製造方法:
(a)植物組織からカルスを分離し、収集するステップ;
(b)植物切片体の脱分化過程を誘導して生成されたカルスを収集するステップ;および
(c)前記ステップ(a)またはステップ(b)で収集されたカルスを培養して増殖したカルスを収集するステップ。 - 請求項1に記載の方法で製造されたカルス溶解物を天然高分子素材で被覆してカプセル化したカルス溶解物含有カプセルであり、
前記天然高分子素材が、寒天、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸塩、カラギーナン、カードラン、デンプン(澱粉)、ジェランガム、グルコマンナン、イナゴガム、グアーガム、タラガム、アラビアガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラヤゴム、トラガカンスガム、ラーチガム、デキストラン、セルロース、およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1種を含む、カルス溶解物含有カプセル。 - 前記天然高分子素材と前記カルス溶解物との重量比は、1:0.001~1:10であることを特徴とする、請求項3に記載のカルス溶解物含有カプセル。
- 請求項1に記載の方法で製造されたカルス溶解物を天然高分子素材で被覆してカプセル化するステップを含み、
前記天然高分子素材が、寒天、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸塩、カラギーナン、カードラン、デンプン(澱粉)、ジェランガム、グルコマンナン、イナゴガム、グアーガム、タラガム、アラビアガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラヤゴム、トラガカンスガム、ラーチガム、デキストラン、セルロース、およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1種を含み、
前記カプセル化ステップにおいて、前記天然高分子素材と前記カルス溶解物との重量比は、1:0.001~1:10である、カルス溶解物含有カプセルの製造方法。 - 請求項1に記載の方法で製造されたカルス溶解物又は請求項3に記載のカルス溶解物含有カプセルを含む、皮膚保湿増進、皮膚シワ予防または改善、皮膚美白、皮膚弾力増進、または皮膚トーン改善のための皮膚外用剤組成物。
- 請求項1に記載の方法で製造されたカルス溶解物又は請求項3に記載のカルス溶解物含有カプセルを含む、皮膚保湿増進、皮膚シワ予防または改善、皮膚美白、皮膚弾力増進、または皮膚トーン改善のための化粧料組成物。
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