KR102425028B1 - 작은 지질 나노 입자 및 이를 포함하는 암 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 작은 지질 나노 입자와, 이를 포함하는 작은 지질 나노 입자-기반 나노백신 플랫폼(small lipid nanoparticle (SLNP)-based nanovaccine platform) 및 면역관문 억제제와의 병용 치료 요법에 관한 것이다. 본 발명의 지질 나노 입자는 항원과 음이온성 약물을 세포 내로 용이하게 전달할 수 있고, 종양-연관 항원을 탑재하는 경우에는 강력한 항종양 효력을 나타낸다. 특히 본 발명의 지질 나노 입자를 제1차 백신 조성물로 포함하고, 지질 나노 입자와 면역관문 억제제를 제2차 백신 조성물로 포함하는 본 발명의 암백신 키트를 이용하면 암 나노 백신에 대한 면역억제 발생에 의한 종양의 재성장 및 재발을 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

작은 지질 나노 입자 및 이를 포함하는 암 백신{Small lipid nanoparticle and cancer vaccine comprising the same}

본 발명은 작은 지질 나노 입자와, 이를 포함하는 작은 지질 나노 입자-기반 나노백신 플랫폼(small lipid nanoparticle (SLNP)-based nanovaccine platform) 및 면역관문 억제제와의 병용 치료 요법에 관한 것이다.

종양-관련 항원(tumor-associated antigens) 또는 종양-특이적 신생 항원(tumor-specific neoantigens)을 운반하는 나노 물질에 기초한 암 나노 백신은 전임상 동물 모델에서 유망한 치료 효능을 나타내었지만, 이들 나노 백신의 임상적 사용은 제한되어왔다. 종양-특이적 T 세포의 풀을 확대하는 암 나노 백신의 능력에도 불구하고, 종양 미세 환경 (tumor microenvironment, TME)에서의 면역 회피 및 면역 억제의 발생은 나노 백신 시험에서 불량한 치료 반응을 유발하는 것으로 여겨진다. 특히, T 세포에서 PD-1 수용체(programmed cell death-1)에 결합하는, PD-L1(programmed death ligand 1)의 면역 체크 포인트에서 증가된 발현은 백신에 의해 매개되는 면역 반응(vaccine-mediated immune responses)에 대한 종양의 적응 저항성(adaptive resistance)을 유도하여, 이러한 백신의 치료 효능을 제한하는 것으로 보고되었다. 이 면역 억제는 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체와 같은 면역 체크 포인트 차단제(ICB)와 암 나노 백신의 조합에 의해 극복되어, 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것이다. 그러나 현재까지 암 나노 백신 및 ICB의 최적시기 및 순서를 평가한 연구는 거의 없다. 예를 들어, 동시 치료가 더 나은 치료 결과를 가져오는지 또는 순차 치료가 더 나은 치료 결과를 가져오는지 확실하지 않다. 더욱이, 두 양식의 최적 조합 타이밍은 결정되지 않았다. 암 나노 백신 및 ICB의 투여시기 및 순서를 결정하기 위해서는 합리적인 접근법이 필요하다. 본 발명은 나노 백신-유도된 적응성 면역 저항성을 개선하여 종양 성장 및 재발을 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 조합 치료 요법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 합리적으로 설계된 항원-운반 나노 물질(antigen-carrying nanomaterials)이 암 나노 백신에 적합한 후보인지 여부를 조사하기 위하여 항원 및 어주번트-운반 나노 백신 둘 다로서 작용하는 중성-하전된 작은 지질 나노 입자 (small lipid nanoparticle, SLNP)를 제작하였다. 본 발명자들은 나노 백신 및 항 -PD1 항체의 순차적 투여 및 조합이 효과적인 항 종양 효과 및 종양 재발의 억제를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

Shirota et al., Vaccines 2015, 3, 390-407.

본 발명의 목적은 항원, 인지질, 양이온성 지질, 및 어주번트를 포함하는 지질 나노 입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 지질 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양-연관 항원(tumor-associated antigen), 인지질, 양이온성 지질, 및 음이온성 약물을 포함하는 지질 나노 입자를 제1차 백신 조성물로 포함하고; 상기 지질 나노 입자 및 면역관문 억제제를 제2차 백신 조성물로 포함하는 암 백신 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항원, 인지질, 양이온성 지질, 및 어주번트를 포함하는 지질 나노 입자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 종양-연관 항원(tumor-associated antigen)이다.

보다 구체적으로 상기 종양-연관 항원은 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-12, BAGE, GAGE, NY-ESO-1, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, gp100, MART-1, MCIR, Ig idotype, CDK4, Caspase-B, beta-catenin, CLA, BCR/ABL, mutated p21/ras, mutated p53, proteinase 3, WT1, MUC-1, Her2/neu, PAP, PSA, PSMA, G250, HPV E6/E7, EBV LMP2a, CEA, alpha-Fetoprotein, 5T4, onco-trophoblast glycoprotein 등으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 동 분야의 암백신에서 적용될 수 있는 다양한 항원이 적용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 종양(또는 암)은 유방암, 두경부암, 방광암, 위암, 직/결장암, 췌장암, 폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 간암, 자궁경부암 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인지질은 지방족 탄소수가 14 내지 22인 인지질이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 인지질은 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-1000] (DSPE-PEG₁₀₀₀) 를 포함하는 DSPE-PEG 유도체, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-PDP) 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-Maleimide) 등을 포함하는 기능화된 (functionalized) DSPE-PEG 유도체, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) 및 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (DPPE-Rhodamine)를 포함하는 형광 표지된 인지질, 1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DDPC), 1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate (DEPA), 1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC), 1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DEPE), 2-Dierucoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DEPG), 1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLOPC), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate (DLPA), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPE), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DLPG), 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DLPS), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate (DMPA), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DMPS), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate (DOPA), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DOPS), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (DPPA), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DPPG), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DPPS), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphate (DSPA), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (DSPG), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DSPS), Egg-PC (EPC), Hydrogenated Egg PC (HEPC), Hydrogenated Soy PC (HSPC), 1-Myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (LYSOPC MYRISTIC), 1-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (LYSOPC PALMITIC), 1-Stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (LYSOPC STEARIC), 1-Myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero 3-phosphocholine (Milk Sphingomyelin MPPC), 1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC), 1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PMPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-Phospho-rac-(1-glycerol) (POPG), 1-Palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PSPC), 1-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SMPC), 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC) 및 1-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SPPC) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1이상의 인지질이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromide (DDAB), Dimethyldioctadecylammonium (DDAB), (N,N-dimethyl-N-([2-sperminecarboxamido]ethyl)-2,3-bis(dioleyloxy)-1-propaniminium pentahydrochloride) (DOSPA), (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium) (DOTMA), (N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium) (DOTAP), 3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol (DC-Chol), N4-Cholesteryl-Spermine (GL67), 1,2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane (DODMA), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (12:0 EPC)를 포함하는 O-alkyl phosphatidylcholines 유도체, N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium (DOBAQ) 및 1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane (18:0 DAP)을 포함하는 DAP 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 양이온성 지질이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 양이온성 콜레스테롤 유도체이다. 구체적으로 상기 양이온성 콜레스테롤 유도체는 Monoarginine-cholesterol (MA-Chol)이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 상기 어주번트 외에도 음이온성 약물을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 음이온성 약물은 올리고뉴클레오타이드, 압타머, mRNA, siRNA, miRNA 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 어주번트는 면역 자극성 단일사슬 또는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드, 면역자극성 저분자 화합물, 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 자극성 단일사슬 또는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 유용한 어주번트(면역보조제)로서 알려져 있다. 이들은 종종 CpG 모티프(구아노신에 연결된 메틸화되어 있지 않은 시토신을 포함한 디뉴클레오타이드 서열)를 포함한다. TpG 모티프, 회문(palindrome) 배열, 복수의 연속한 티미딘 뉴클레오타이드(예를 들면 TTTT), 복수의 연속한 시토신 뉴클레오타이드(예를 들면 CCCC) 또는 폴리(dG) 배열을 포함한 올리고뉴클레오타이 드도 또한 이중가닥 RNA와 같이 공지의 어주번트이다. 이들이 다양한 면역 자극성 올리고뉴클레오타이드 중 하나를 본 발명과 함께 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 대표적으로는 10~100뉴클레오타이드, 예를 들면15~50뉴클레오타이드, 20~30뉴클레 오타이드 또는 25~28뉴클레오타이드를 가진다. 그것은 대표적으로는 단일사슬이다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 오로지 천연의 뉴클레오타이드, 오로지 비천연의 뉴클레오타이드, 또는 그 양쪽 모두의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 및/또는 하나 이상의 2'-O-메틸 변경이 될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 단일사슬 또는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 CpG 올리고뉴클레오타이드, STING 활성 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합이다.

본 명세서에서 용어 "Stimulator of Interferon Genes (STING)"은 선천성 면역 반응에서 주요한 역할을 수행하는 분자인 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 의미한다. STING은 주로 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 내에 존재하는 5개의 추정적인 막관통(TM) 영역을 포함하며, I 형 IFG을 유도하고, 발현 후 강력한 항 바이러스 상태를 발휘하는 NF-kB 및 IRF3 전사 경로를 활성화할 수 있다 (미국 특허 출원 일련번호 제13/057,662호 및 PCT/US2009/052767 참조). STING의 소실은 폴리IC가 I형 IFN을 활성화시키는 능력을 감소시키고, 표적화된 상동 재조합에 의해 생성된 STING이 결여되고, 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV) 감염에 걸리기 쉬운 마우스 배아 섬유아세포(-/- MEF)를 제공한다. STING의 부재시, DNA-매개 I형 IFN 반응은 저해되며, 이는 STING이 바이러스, 박테리아 및 세포를 감염시킬 수 있는 다른 병원균들로부터 DNA를 인식하는데 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다. 효모 이중 혼성화 및 공동면역침전 연구는 STING이 RIG-I 및 Ssr2/TRAPβ(번역 후 ER 막을 가로지르는 단백질 이동에 요구되는 트랜스로콘-결합 단백질(transloconassociated protein, TRAP) 복합체의 구성원)와 상호작용한다는 것을 나타내었다. TRAPβ의 RNAi 제거는 STING 기능을 저해하고, 폴리IC에 반응한 I형 IFN의 생성을 방해하였다. 추가의 실험은 STING 자체가, 예를 들면 병원균 또는 세포사멸성 DNA로부터의 단일 및 이중 가닥 DNA를 포함하는 핵산에 결합하고, DNA 매개 관절염 및 암과 같은 염증성 병태에서의 전염증성 유전자 발현을 조절하는 데 중심적 역할을 수행한다는 것을 보여주었다. STING 발현 또는 기능을 상향조절하는 다양한 새로운 방법 및 STING 발현 또는 기능을 상향조절하기 위한 다양한 새로운 조성물들이 STING과 상호작용하는 다른 세포성 분자들의 추가적인 특성분석과 함께 본원에 기술된다. 이러한 발견은 면역계 및 다른 시스템들을 조절하기 위한 새로운 어주번트, 백신 및 치료요법을 설계할 수 있게 한다.

상기 STING 활성 올리고뉴클레오타이드는 STING 기능을 STING에 결합하는 핵산 분자일 수 있다. STING-결합 핵산 분자는 길이가 40 내지 150 염기쌍인 단일 가닥 DNA 또는 길이가 40 내지 150, 60 내지 120, 80 내지 100 또는 85 내지 95 염기쌍 이상의 이중 가닥 DNA일 수 있다. STING결합 핵산 분자는, 예컨대, 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드로 제조된 뉴클레아제 저항성일 수 있다. STING-결 합 핵산 분자는, 또한, 막관통 수송을 촉진하는 분자와 결합할 수 있다. 이러한 방법에서, 질환 또는 장애는 DNA-의존성 염증성 질환일 수 있다. 또한, 염증성 면역 세포가 침투된 암성 종양을 가지는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 기술된다. 이러한 방법은 STING의 기능 또는 발현을 하향조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 임의의 양을 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, CpG 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합이다.

본 명세서에서 용어, CpG 올리고뉴클레오타이드(CpG oligodeoxynucleotide, 또는 CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN)는 메틸화되지 않은 시토신 트리포스페이트 디옥시뉴클레오타이드("C")와 구아닌 트리포스페이트 디옥시뉴클레오타이드("G")를 포함하는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자로서, 면역자극제(immunostimulant)로 알려져 있다. 상기 CpG는 본 발명의 나노 백신의 구성성분으로 포함되는 경우 수지상 세포의 면역반응을 강화하는 어주번트로서의 역할을 수행한다.

상기 면역자극성 저분자 화합물은 저분자 어주번트(small molecule adjuvant)라고도 불리우고, 합성 저분자 어주번트와 천연 저분자 어주번트가 있다. 상기 면역자극성 저분자 화합물 또는 저분자 어주번트의 예로는 monophosphoryl lipid A, Muramyl dipeptide, Bryostatin-1, Mannide monooleate (Montanide ISA 720), Squalene, QS21, Bis-(3',5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate, PAM2CSK4, PAM3CSK4, Imiquimod, Resiquimod, Gardiquimod, cl075, cl097, Levamisole, 48/80, Bupivacaine, Isatoribine, Bestatin, Sm360320, 및 Loxoribine 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 저분자 어주번트에 대해서는 Flower DR et al. (Expert Opin Drug Discov. 2012 Sep;7(9):807-17.)에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 지질 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 약제학적 조성물로서, 상술한 지질 나노 입자 외에 약제학적으로 허용되는 부형제, 또는 담체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "약제학적으로 허용되는"은 조성, 제형, 안전성, 환자 허용성 및 생물 이용성에 대해 약리학적/독성학적 관점으로부터 환자에게 허용되고 물리적/화학적 관점으로부터 조제 약제사에 대해 허용되는 특성들 및/또는 물질을 언급한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 매질을 언급하며, 투여시 숙주에 무독성이다.

본 백신 조성물의 적용 대상체는 모든 동물일 수 있으며, 구체적으로 포유동물, 예를 들어 사람, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 원숭이, 소, 말, 돼지 등이다. 가장 바람직한 대상체는 사람이다.

백신 조성물은 당해 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 따라 동결-건조되거나 액체 제제로서 제형화 될 수 있다. 액체 형태의 제제의 비제한적 예는 용액, 현탁물, 시럽, 슬러리 및 에멀젼을 포함한다. 적합한 액체 담체는 모든 적합한 유기 또는 무기 용매, 예를 들어 물, 알콜, 식염수, 완충된 식염수, 생리 식염수, 덱스트로즈 용액, 프로필렌 글리콜 용액 등을 포함하며, 바람직하게는 멸균 형태로 존재한다.

백신 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화 될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염 (활성 폴리펩타이드의 유리 아미노 그룹과 함께 형성됨)을 포함하며, 이는 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 함께 형성된다. 또한, 유리 카복실 그룹으로부터 형성되는 염은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.

백신 조성물은 바람직하게는 대상체에게 접종 또는 주사하기 위해 제형화된다. 주사를 위해, 본 발명의 백신 조성물은 수성 용액, 예를 들어 물 또는 알콜 중에 또는 생리학적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크스 (Hanks) 용액, 링거 (Ringer) 용액 또는 생리학적 식염 완충액 중에 제형화 될 수 있다. 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 또한, 주사 제형은, 예를 들어 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균수, 식염수 또는 알콜로 재구성함으로써, 사용 직전에 주사에 적합한 액체 형 태 제제로 전환되는 고체 형태 제제로 제조될 수 있다.

또한, 백신 조성물은 지연 방출 비히클 또는 데포 (depot) 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용 제형은 접종 또는 이식 (예를 들어 피하 또는 근육내)에 의하거나 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 백신 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제형화될 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 담체로서 사용하기에 적합한 전달 비히클로서 널리 알려진 예이다.

백신 조성물은 백신의 보호 효능을 증진시키는 작용제, 예를 들어 애주번트를 포함할 수 있다. 애주번트는 펩타이드 항원에 대한 보호 면역 반응을 증진시키도록 작용하여 백신에 필요한 항원의 양 및/또는 보호 면역 반응을 생성하는데 필요한 투여 횟수를 감소시키도록 작용하는 임의의 화합물 또는 화합물들을 포함한다. 어주번트는, 예를 들어 유화제, 무라밀 디펩타이드, 아브리딘, 수성 애주번트, 예를 들어 수산화알루미늄, 키토산-기 본 애주번트, 및 다양한 사포닌 중 임의의 것, 오일 및 당해 기술 분야에 공지된 기타 물질, 예를 들어 암피겐 (Amphigen), LPS, 세균 세포벽 추출물, 세균 DNA, CpG 서열, 합성 올리고뉴클레오타이드 및 이의 배합물 [참조: Schijins et al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:456], 미코박테리알 플레이 (M. phlei) 세포벽 추출물 (MCWE) (미국 특허 번호 4,744,984), 엠.플레이 DNA (M-DNA) 및 M-DNA-엠.플레이 세포벽 복합체 (MCC)를 포함할 수 있다. 유화제로서 사용될 수 있는 화합물은 천연 및 합성 유화제 및 음이온성, 양이온성 및 비이온성 화합물을 포함한다. 합성 화합물 중, 음이온성 유화제는, 예를 들어 라우르산 및 올레산의 칼슘, 나트륨 및 알루미늄 염, 지방산의 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염, 및 유기 설포네이트, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다. 합성 양이온성 작용제는, 예를 들어 세틸트리에틸암모늄 브로마이드를 포함하며, 합성 비이온성 작 용제는 글리세릴에스테르 (예: 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 및 에테르, 및 소르비 탄 지방산 에스테르 (예: 소르비탄 모노팔미테이트) 및 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체 (예: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트)로 예시된다. 천연 유화제는 아카시아, 젤라틴, 레시틴 및 콜레스테롤을 포함한다.

기타 적합한 애주번트는 오일 성분, 예를 들어 단일 오일, 오일 혼합물, 유중수 에멀젼 또는 수중유 에멀젼으로 형성될 수 있다. 오일은 광유, 식물성유 또는 동물성유일 수 있다. 광유는 증류 기술을 통해 바셀린로부터 수득되는 액체 탄화수소이며, 또한 당해 기술 분야에서 액체 파라핀, 액체 바셀린 또는 화이트 광유로도 언급된다. 적합한 동물성유는, 예를 들어 간유, 가자미유, 큰청어유, 오렌지 러기유 (orange roughy oil) 및 상어간유를 포함하며, 이들 모두 시판된다. 적합한 식물성유는, 예를 들어 카놀라유, 아몬드유, 면실유, 옥수 수유, 올리브유, 낙화생유, 홍화유, 참기름, 대두유 등을 포함한다. 프로인트 완전 애주번트 (FCA) 및 프로인트 불완전 애주번트 (FIA)는 백신 제제에 통상 사용되는 2가지의 일반적인 애주번트이며, 또한 본 발명에서 사용하기에도 적합하다. FCA 및 FIA 모두 광유중수 에멀젼이다; 그러나, FCA는 사멸된 미코박테리움 종 (Mycobacterium sp.)도 또한 포함한다.

또한, 면역조절 사이토카인도 백신 효능을 향상시키기 위해, 예를 들어 애주번트로서 백신 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 사이토카인의 비제한적 예는 인터페론 알파 (IFN-α), 인터루킨-2 (IL-2) 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 이의 배합물을 포함한다. GM-CSF가 매우 바람직하다.

항원을 포함하고 애주번트를 추가로 포함하는 백신 조성물은, 이로 제한됨이 없이, 혼합, 초음파 처리 및 마이크로유동화 (microfluidation)를 포함한 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 애주번트는 백신 조성물의 약 10% 내지 약 50% (v/v), 보다 바람직하게는 약 20% 내지 약 40% (v/v), 더욱 바람 직하게는 약 20% 내지 약 30% (v/v), 또는 이들 범위 내의 임의의 정수로 포함될 수 있다. 약 25% (v/v)가 매우 바람직하다.

백신 조성물은 주입 또는 주사 (예: 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 경막내, 십이지장내, 복강내 등)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 백신 조성물은 비내, 질, 직장, 경구, 또는 경피로 투여될 수 있다. 추가로, 백신 조성물 은 "바늘-없는" 전달 시스템에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 피내 주사에 의해 투여된다. 투여는 의사 또는 의료 보조원의 지시에 따를 수 있다.

주사는 수회 주사로 나뉠 수 있으며, 이러한 분할 접종은 바람직하게는 실질적으로 동시에 투여된다. 분할 접종으로 투여되는 경우, 면역원의 용량은 바람직하게는, 반드시 필수적이지는 않지만, 각각의 분리된 주사시 동등하게 할당된다. 애주번트가 백신 조성물에 존재하는 경우, 애주번트의 용량은 바람직하게는, 반드시 필수적이지는 않지만, 각각의 분리된 주사시 동등하게 할당된다. 분할 접종을 위한 분리된 주사는 일부 양상으로 환자의 신체에서 실질적으로 서로 인접하게 투여된다. 일부 양상으로, 주사는 신체에서 서로 적어도 약 1 cm 떨어지게 투여된다. 일부 양상으로, 주사는 신체에서 서로 적어도 약 2.5 cm 떨어지게 투여된다. 일부 양상으로, 주사는 신체에서 서로 적어도 약 5 cm 떨어지게 투여된다. 일부 양상으로, 주사는 신체에서 서로 적어도 약 10 cm 떨어지게 투여된다. 일부 양상으로, 주사는 신체에서 서로 10 cm 초과로, 예를 들어 적어도 약 12.5, 15, 17.5, 20 cm 또는 그 이상으로 떨어지게 투여된다. 일차 예방접종 주사 및 부스터 주사는 본원에서 기술되고 예시되는 바와 같이 분할 접종으로 투여될 수 있다.

다양한 대안적 약제학적 전달 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 시스템의 비제한적 예는 리포좀 및 에멀젼을 포함한다. 특정 유기 용매, 예를 들어 디메틸설폭사이드가 또한 사용될 수 있다. 추가로, 백신 조성물은 지연 방출 시스템, 예를 들어 치료제를 포함하는 고형 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 전달될 수 있다. 이 용가능한 다양한 지연 방출 물질이 당업자에게 널리 알려져 있다. 지연 방출 캡슐은, 이들의 화학적 특성에 따라, 수일 내지 수주 내지 수개월의 범위에 걸쳐 백신 조성물을 방출할 수 있다.

암 완화 상태에 있는 환자에서 암의 재발을 예방하기 위해서, 치료학적 유효량의 백신 조성물이 대상체에 게 투여된다. 치료학적 유효량은, 당해 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 측정시, 환자에서 종양 연관 항원-특이적 세포독성 T-림프구 (CD8⁺) 수의 임상적으로 유의한 증가 및 항원에 대한 세포독성 T-림프구 반응의 임상적으 로 유의한 증가를 제공할 것이다. 대체로 환자에서, 치료학적 유효량의 백신 조성물은 남아있는 미세한 질환을 파괴하여 환자에서 암의 재발 위험을 유의하게 감소 또는 제거시킬 것이다.

백신 조성물의 유효량은, 이로 제한됨이 없이, 인종, 품종, 치수, 신장, 체중, 연령, 환자의 전체적 건 강 상태, 제형의 유형, 투여 방식 또는 방법, 또는 암이 환자에서 재발할 가능성을 상당히 증가시키는 위험 인자의 존재 또는 부재를 포함하여 많은 변수에 의존적일 수 있다. 이러한 위험 인자는, 이로 제한됨이 없이, 수술 유형, 림프절의 상태 및 양성의 수, 종양의 크기, 종양의 조직학적 등급, 호르몬 수용체 (에스트로겐 및 프로게스테론 수용체)의 존재/부재, HER2/neu 발현, 림프혈관 침윤 및 유전적 소인 (BRCA 1 및 2 등)를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 유효량은 환자가 림프절 양성 또는 림프절 음성인지의 여부에 의존적이며, 환자가 림프절 양성인 경우 양성 림프절의 수 및 정도에 의존적이다. 모든 경우에서, 적합한 유효량은 일반적으로 통상적인 최적화 기술 및 전문가의 능숙하고 정통한 판단 및 당업자에게 분명한 기타 인자들을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기술되는 치료학적 유효량의 백신 조성물은 대상체에게 실질적인 독성을 일으키지 않으면서 치료학적 예방 이점을 제공할 것이다.

백신 조성물의 독성 및 치료 효율은, 예를 들어 LD₅₀ (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 측정 될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD₅₀/ED₅₀의 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 백신 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어지는 자료는 환자에서 사용하기 위한 일정 범위의 용량을 제형화 하는데 이용될 수 있다. 이러한 백신 조성물의 용량은 바람직 하게는 독성이 매우 적거나 없는 ED₅₀을 포함하는 일정 범위의 순환 농도 내에 속한다. 용량은 사용되는 용량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다.

독성 정보는 특정 대상체, 예를 들어 사람에서 유용한 용량을 보다 정확히 결정하는데 이용될 수 있다. 치료의 는 독성 또는 기관 기능이상 때문에 투여를 끝내거나 중단하거나 조절할 수 있으며, 임상 반응이 반응을 개선시키는데 적합하지 않은 경우 필요에 따라 처리를 조절할 수 있다. 재발 암의 예방에 있어 투여 용량의 크기 는 다른 요인들 중에서 환자 상태의 중증도, 재발에 대한 상대적 위험 또는 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 환자 상태의 중증도는, 예를 들어 부분적으로 표준 예후적 평가 방법에 의해 평가될 수 있다.

백신 조성물은 암의 재발에 대해 보호 면역을 유도 및/또는 지지하기 위하여, 세포독성 T 림프구 반응을 유도 및/또는 지지하기 위하여 적합한 임의의 스케줄로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 일차 예방접종으로서 본원에서 기술되고 예시되는 바와 같은 백신 조성물을 환자에게 투여한 후, 보호 면역을 지지 및/또는 유지하기 위해 부스터를 투여할 수 있다. 일부 양상에서, 백신 조성물은 1개월 당 1회, 2회 또는 그 이상의 횟수로 환자에게 투여될 수 있다.

일차 예방접종 및 부스터 접종을 포함한 백신 투여 스케줄은, 환자에게 필요한 한, 환자의 수명을 연장하기 위해, 예를 들어 수년의 과정에 걸쳐 계속될 수 있다. 일부 양상으로, 백신 스케줄은 백신 요법의 시작시에 보다 빈번한 투여를 포함하며, 보호 면역을 유지하기 위한 시간 동안은 보다 덜 빈번한 투여 (예: 부스터)를 포함한다.

백신 조성물은 백신 요법의 시작시에는 보다 저용량이 투여되고, 시간이 지남에 따라 보다 고용량이 투여될 수 있다. 또한, 백신은 백신 요법의 시작시에는 보다 고용량이 투여되고, 시간이 지남에 따라 보다 저용량이 투여될 수 있다.

일차 백신 및 부스터 투여의 횟수 및 투여되는 항원의 용량은, 당해 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 따라 담당 의사에 의해 결정되는 바와 같이, 개개 환자의 특정 요구를 만족시키도록 맞춰지고/지거나 조절될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따른 백신 조성물은 상술한 지질 나노 입자를 공통적으로 포함하는 조성물로서, 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 범위 내에서는 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물은 암 예방용이다. 상기 백신 조성물이 암 예방용인 경우에는 유효성분인 나노 지질 입자의 항원은 종양-연관 항원이다.

본 명세서에서 용어, "예방"은 방사선학적 또는 신체 조사의 결과를 포함하여 임의의 객관적 또는 주관적 변수로 측정시, 임상적 완화 상태의 환자에서 암의 재발 (recurrence/relapse)을 미리 막는데 있어서의 모든 성공 또는 성공의 징후를 언급한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 종양-연관 항원(tumor-associated antigen), 인지질, 양이온성 지질, 및 음이온성 약물을 포함하는 지질 나노 입자를 제1차 백신 조성물로 포함하고; 상기 지질 나노 입자 및 면역관문 억제제를 제2차 백신 조성물로 포함하는 암 백신 키트를 제공한다.

본 명세서에서 "면역 관문(immune checkpoint)"이란 면역시스템의 조절자를 의미한다. 면역관문 분자에는 자극성 면역관문 분자와, 억제성 면역관문 분자가 있다. 억제성 면역관문 분자는 암 면역치료제의 타겟이 된다. 상기 억제성 면역관문 분자로는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, NOX2, PD-1, TMI-3, VISTA, SIGLEC7 등이 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 현재까지 승인된 면역관문 억제제는 CTLA4, PD-1, 및 PD-L1을 타겟으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체이다.

본 발명은 항원, 인지질, 양이온성 지질, 및 음이온성 약물을 포함하는 지질 나노 입자, 이를 포함하는 백신 조성물 및 암백신 키트를 제공한다. 본 발명의 지질 나노 입자를 이용하는 경우, 항원과 음이온성 약물을 세포 내로 용이하게 전달할 수 있고, 특히 본 발명의 지질 나노 입자를 제1차 백신 조성물로 포함하고, 지질 나노 입자와 면역관문 억제제를 제2차 백신 조성물로 포함하는 본 발명의 암백신 키트를 이용하면 암 나노 백신에 대한 면역억제 발생에 의한 종양의 재성장 및 재발을 효과적으로 억제할 수 있다.

도 1a는 본 발명에 사용된 모노아르기닌-콜레스테롤(monoarginine-cholesterol, MA-Chol)의 합성방법을 나타낸 도이다.
도 1b는 MA-Chol의 DMSO-d⁶ -에서의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 1c는 MA-Chol의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2a는 본 발명에 사용된 DSPE-PEG₂₀₀₀-OVA_PEP. 의 컨쥬게이션 방법을 나타낸 도이다.
도 2b는 DSPE-PEG₂₀₀₀-OVA_PEP. 의 HPLC를 이용한 정제결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 DSPE-PEG₂₀₀₀-OVA_PEP.의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3a는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 예상되는 구조를 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 예상되는 작용원리를 나타낸 도이다.
도 4는 CPG-ODN 의 로딩효율을 평가한 도이다. 구체적으로 CpG ODN 로딩 효율은 세파로즈 CL-4B 크기배제 칼럼을 통하여 평가되었다. 8 μmol의 OVAPEP-SLNP에 1.65 nmol of CpG ODN을 로딩하였을 때 CpG ODN의 로딩 효율은 거의 100%였다.
도 5는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 전자 현미경 사진(TEM) 및 이들의 직경을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 나노 입자의 유체역학적 직경 및 제타 전위를 dynamic light scattering (DLS)로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 수지상 세포(DC2.4)에 대한 세포 독성을 WST-1 분석으로 평가한 도이다.
도 8은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 수지상 세포및 골수유래 DC에서 세포내 흡수를 유세포 분석을 이용하여 평가한 도이다. 유세포 분석에는 로다민 염료-라벨링된 OVA_PEP-SLNP@CpG가 사용되었다.
도 9는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 세포내 흡수를 확인하기 위하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰한 도이다.
도 10은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자 처리에 의한 성숙 수지상세포의 빈도를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자 처리에 의한 공동자극 분자인 CD80의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 12은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자 처리에 의한 공동자극 분자인 CD86의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자 처리에 의한 B3Z 반응을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자 처리에 의한 IL-2의 분비 수준을 ELISA를 통하여 측정한 결과이다.
도 15는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 림프관 배출을 나타낸 도이다. 근적외선 염료-로딩된 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자를 IVIS를 이용하여 측정하였다.
도 16은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 림프관 배출을 나타낸 도이다. 피하주사 후 시간에 따른 형광의 강도를 나타내었다.
도 17은 림프절에서 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 입자의 생체내 분포를 나타낸 도이다.
도 18은 림프절에서 특정세포의 분포를 확인하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략을 나타낸 도이다. FSC x SSC 게이팅이 크기와 과립화 여부에 기초하여 싱글렛과 림프구를 얻는데 사용되었고, CD45는 백혈구 마커로 사용되었다. CD3^- CD19^- 7-AAD^- 세포는 T 세포, B세포 및 죽은 세포를 제외하기 위하여 게이팅되었다.
도 19는 림프절에서 본 발명의 나노입자의 항원제시 세포에 의한 흡수를 유세포 분석을 통해 나타낸 도이다. 로다민-라벨링된 OVA_PEP-SLNP@CpG가 마우스의 발다닥에 주사되었고, 오금 림프절이 절제되었다.
도 20은 성숙한 수지상 세포로 여겨지는 CD11c⁺ MHCⅡ⁺ 세포의 게이팅에 의한 림프절에서의 수지상 세포 성숙도 평가 전략을 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 나노입자의 처리에 의한 in vivo 에서 수지상세포의 성숙도를 평가한 결과이다. 성숙도 마커인 CD40과 CD86이 유세포분석에 의해 측정되었다.
도 22는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노백신의 in vivo 항원-특이적 T 세포 반응 증강 효과를 평가하기 위한 면역화 일정을 나타낸 도이다.
도 23은 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노백신으로 면역화된 마우스에서 비장세포를 채취하고, 재자극시킨 후의 비장세포에서 분비되는 인터페론-감마의 수준을 ELISA로 측정하여 나타낸 도이다.
도 24는 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노백신으로 면역화된 마우스에서 비장세포를 채취하고, 재자극시킨 후의 비장세포에서 인터페론-감마를 분비하는 IFN-γ spot forming cells (SFCs)의 수를 나타낸 도이다.
도 25는 인터페론 감마를 생산하는 CD8+ T 세포의 비율을 나타낸 도이다.
도 26은 인터페론 감마와 그랜자임 B를 생산하는 CD8+ T 세포의 비율을 나타낸 도이다.
도 27은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG의 항원-특이적 사멸능력을 평가히기 위한 in vivo CTL 분석에 사용되는 마우스의 면역화 및 실험 일정을 나타낸 도이다.
도 28은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG의 OVA_PEP-특이적 비장세포의 사멸을 분석하기 위하여 CFSE^high　세포 및 CFSE^low　세포를 측정하여 정량적으로 CTL 사멸 능력을 비교한 도이다.
도 29는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG의 종양 항원-특이적 종양 예방 효과를 평가하기 위한 면역화 및 종양 접종일정을 나타낸 도이다.
도 30 및 도 31은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 이후 EL 종양 세포 접종 후의 평균적 종양크기와 개별 마우스에서의 종양크기를 나타낸 도이다.
도 32는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 이후 EL4 종양 세포 접종 후의 평균 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 33-34는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 이후 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 평균 종양 크기(도 33) 및 개별 마우스에서의 종양 크기(도 34)를 나타낸 도이다.
도 35는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 이후 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 평균 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 36은 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 이후 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 개별 마우스의 종양 사진이다.
도 37은 OVA_PEP-SLNP@CpG의 치료적 효능 평가를 위한 실험 일정을 나타낸 도이다.
도 38-39는 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 평균 종양 크기(도 38) 및 개별 마우스에서의 종양 크기(도 39)를 나타낸 도이다.
도 40은 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 평균 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 41은 E.G7-OVA 종양 세포 접종 후의 개별 마우스의 종양 사진이다.
도 42는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 마우스에서 종양 조직을 제거하고, 본 발명의 나노 백신의 항종양 효능을 세포 수준에서 평가하기 위하여 TUNEL-양성 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 43은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 마우스의 종양 조직에서 손상된 세포를 나타낸 것으로, H&E로 염색한 조직이다.
도 44는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 마우스의 종양 조직에서 아폽토시스 된 세포를 나타낸 것으로, 갈색의 세포가 TUNEL-양성 세포를 나타낸 것이다.
도 45는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 면역화한 마우스의 종양 조직에서 각 그룹별 무작위 3개 필드에서 계수한 TUNEL-양성 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 46은 종양 조직에서의 PD-L1 발현을 면역 조직 화학적 (IHC) 분석을 통하여 나타낸 것이다. PD-L1⁺ 세포는 녹색으로 염색되었고 Hoechst 염색으로 식별된 세포핵은 청색으로 표시되었다.
도 47은 종양 조직으로의 CD8⁺ T 세포 침윤을 IHC 분석을 통하여 평가한 도이다. CD8⁺ T 세포는 적색으로 염색되었고 Hoechst 염색으로 확인된 세포핵은 청색으로 표시되었다.
도 48은 인터페론-감마 처리 유무에 따른 E.G7-OVA 종양세포에서 PD-L1의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 49는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신과 ICB 항체의 순차적 조합 처리에 의한 종양 재발 억제 효능을 평가하기 위한 실험 일정을 나타낸 도이다.
도 50은 사량체 분석을 위한 마우스 PBMC의 게이팅 전략을 나타낸 것으로, FSC x SSC 게이팅으로 크기 및 과립화 정도에 따라 싱글렛 및 림프구를 얻는다. CD45는 백혈구 마커로 사용되었고, CD3 및 CD8은 T 세포 마커로 사용되었다. 7-AAD^- 세포를 죽은 세포를 배제하기 위해 게이팅하고, CD3⁺ CD8⁺ T 세포를 사량 체 염색 분석을 위해 게이팅 하였다.
도 51은 종양 접종 후 20 일에 OVA_PEP 사량체에 대해 양성인 말초 혈액 CD8⁺ T 세포의 대표적인 유동 세포 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 52 및 53은 유세포 분석법 (n = 6)에 의해 결정된 종양 접종 후 20 일째의 본 발명의 나노 백신으로 면역화 된 마우스의 말초 혈액에서 OVA_PEP-특이적 CD8⁺ T 세포(도 52) 및 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포의 백분율(도 53)을 나타낸 도이다.
도 54는 마우스에서 E.G7-OVA 세포 접종 후 종양의 크기를 나타낸 도이다. 첫 백신 접종주기 후, 40 명의 우수한 대응자들을 4 개의 그룹으로 나누었다. 종양 부피가 ~ 2000 mm³에 도달하면 불량한 반응자들이 희생되었다.
도 55는 각 그룹별 마우스 희생시의 종양 무게를 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± S.E.M.로 표시되었다.
도 56은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노백신을 면역관문 치료제와 함께 사용하는 순서와 시간에 관하여 시각적으로 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험재료 및 실험방법

실험재료(Materials)

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-1000] (DSPE-PEG₁₀₀₀), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-PDP), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) 및 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (DPPE-Rhodamine)는 아반티 폴라 리피드 (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. Boc-Arg(Pbf)-OH 및 콜레스테롤은 시그마 알드리치 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN; 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3') 및 대조군 ODN (control ODN; 5'-TCC ATG AGC TTC CTG AGC TT-3')은 제노텍 (Daejeon, Korea)에서 포스포로티오에이트 백본(phosphorothioate backbone)을 이용하여 합성하였다. OVA_{257 -264} SIINFEKL (OVA_PEP) 및 N-말단 시스테인을 가진 SIINFEKL (C-OVA_PEP) 펩타이드는 코스모 제네텍 (Seoul, Korea)에서 합성되었다. 모든 다른 시약은 다른 표시가 없는 한 시그마 알드리치에서 구입하였다.

동물 및 세포(Animals and cells)

암컷 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오 (Korea)로부터 입수하여 병원체가 없는 조건하에 수용되었다. 동물에 대한 관리 및 실험 절차는 한국과학기술원 (KAIST)의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다. DC2.4 뮤린 수지상 세포주는 K. L. Rock 박사 (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA)에 의해 제공되었다. B3Z 뮤린 CD8⁺ T 하이브리도마 세포주는 임용택 교수 (성균관대학교)에 의해 제공되었다. DC2.4 및 B3Z 세포는 10 % 열-불활성화 된 우태아혈청 (FBS; Welgene), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10 mM이 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 1X 비-필수 아미노산 및 50 μM 2-머캅토에탄올로 보충된 RPMI-1640 배지 (웰진, 한국 경산시)를 이용해 유지되었다. EL4 뮤린 림프종 세포주, 및 오발부민(Ovalbumin)으로 형질 감염된 E.G7-OVA 뮤린 EL4 림프종 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. EL4 세포를 10 % FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 50 μM 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. E.G7-OVA 세포를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 50 μM 2-머캅토에탄올 및 0.5 mg/mL G418 (Gibco, Grand Island, NY, USA )로 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 모든 세포는 5% CO₂를 포함하는 가습 된 대기에서 37 ℃로 유지시켰다.

유세포 분석(Flow cytometry )

모든 항체는 바이오레전드 (San Diego, CA, USA), eBiosciences (San Diego, CA, USA) 및 톤보 바이오사이언스 (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 사용된 항체는 anti-CD16/CD32 (clone 2.4G2), anti-CD45 (clone 30-F11), anti-CD3 (clone 145-2C11), anti-CD8 (clone 53-6.7), anti-CD19 (clone 1D3), anti-CD169 (clone 3D6.112), anti-CD11b (clone M1/70), anti-CD11c (clone N418), anti-MHCⅡ (clone M5/114.15.2), anti-CD40 (clone 3/23), anti-CD80 (clone 16-10A1), anti-CD86 (clone GL-1), anti-IFN-γ (clone XMG1.2), anti-Granzyme B (clone 16G6), anti-PD-1 (clone 29F.1A12), 및 anti-PD-L1 (clone 10F.9G2)를 포함하였다. 세포는 항-CD16/CD32 항체로 4℃에서 10분간 블로킹하였고 다른 항체들로 20-30 min at 4℃에서 20-30분간 면역염색하였다. 죽은 세포들은 7-AAD viability staining solution (Biolegend) or Ghost Dye^TM Violet 450 (Tonbo Biosciences)으로 염색하여 제외하였다. 유세포분석은 LSRFortessa flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행되었고, 데이터는 FlowJo software (TreeStar)를 이용하여 분석되었다.

OVA _PEP -인지질 컨쥬게이트의 합성 (Synthesis of OVA _PEP - phospholipid conjugate)

C-OVA_PEP 펩티드를 다이설파이드 교환 반응에 의해 DSPE-PEG₂₀₀₀-PDP에 컨쥬게이션되었다. 간략하게, 2 mg의 C-OVA_PEP 및 7.8 mg의 DSPE-PEG₂₀₀₀-PDP를 200 μl DMSO에 용해시키고, 용액을 실온에서 밤새 부드럽게 볼텍싱하였다.

200 μl의 아세토 니트릴을 첨가하여 혼합물을 퀀칭(quenched)시키고 C4 컬럼 (Nomura Chemical)을 사용하여 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC, Agilent)로 정제하였다. 생성물-함유 분획을 동결 건조하고, 컨쥬게이트(DSPE-PEG₂₀₀₀-OVA_PEP)를 백색 고체로서 수득하였다. 컨쥬게이트(접합체)는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) 분광법 (Bruker)에 의해 추가적으로 분석되었다.

OVA _PEP -SLNP@CpG 나노백신의 제조 및 분석 (Preparation and characterization of OVA _PEP -SLNP@CpG nanovaccine )

모노 아르기닌-콜레스테롤 (Monoarginine-cholesterol, MA-Chol)은 전술한 바(Lee, J. et al. Theranostics 6, 192-203, 2016)와 같이 합성되었다. 작은 지질 나노 입자 (small lipid nanoparticle, SLNP) 기반의 나노 백신 (OVA_PEP-SLNP@CpG)은 필름 형성 및 재수화에 의해 제조되었다. 간단히 설명하면, MA-Chol (3.89 μmol), DOPE (3.89 μmol), DSPE-PEG₁₀₀₀ (0.2 μmol) 및 DSPE-PEG₂₀₀₀-OVA_PEP (0.02 μmol)를 유리 바이알에 첨가하고 진공 하에서 밤새 건조시켜 잔류 용매를 완전히 제거하였다. 생성된 지질 필름을 1.65 nmol의 CpG ODN 을 포함하는 1 ml의 HEPES-완충 글루코오스 (HEPES-buffered glucose, HBG)로 재수화시켰다. 용액을 10분간 초음파 처리한 후, 마그네틱 바로 실온에서 적어도 4시간 동안 교반하였고, 소형압출기 (mini extruder) (Avanti Polar Lipids)를 이용하여 적어도 11회 압출하였다. OVA_PEP-SLNP@CpG의 형태 및 크기는 음성 염색을 위해 1% 우라닐 아세테이트 용액으로 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM)에 의해 평가되었다. 나노 입자의 평균 사이즈는 ImageJ software (National Institutes of Health)를 이용하여 측정되었고, 이의 유체역학적 크기 및 제타 전위는 주변온도에서 Zetasizer Nano range system (Malvern, Worcestershire, UK)을 이용하여 DLS (dynamic light scattering)에 의해 측정되었다. CpG ODN 로딩의 효율은 Sepharose CL-4B 크기 배제 컬럼 (Sigma Aldrich)을 사용하여 평가되었다.

OVA_PEP-SLNP@CpG를 HEPES-완충 식염수(HBS)로 세척한 컬럼에 로딩하고; 15 개의 용리된 분획을 수집하고, 각 CpG ODN을 Quant-iT OliGreen ssDNA 시약 (Thermo Fisher)를 사용하여 측정하였다. CpG ODN의 로딩 효율은 100 μl의 각 분획과 20 μl의 5% Triton-X 100 및 100 μl의 OliGreen을 혼합하고 여기 파장 480 nm 및 방출 파장 520 nm에서 형광 세기를 측정하여 결정하였다. 분획 2-4는 나노백신을 포함하였으나, 분획 6-10은 이들의 크기 차이에 의해 유리 CpG ODN을 포함하였다. 8 μmol의 SLNP에서 1.65 nmol의 CpG ODN 의 로딩 효율은 거의 100%였다.

세포 생존성 분석 (Cell viability assays)

나노 백신의 세포 독성은 제조사의 지시에 따라 EZ-Cytox Cell Viability Assay 키트 (DoGenBio, Seoul, Korea)를 사용한 수용성 테트라 졸륨 염 (WST-1) 분석으로 평가하였다. 간략하게, DC2.4 세포를 100 μl 배지에서 웰당 1 x 10⁴ 세포의 밀도로 96- 웰 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 OVA_PEP-SLNP @ CpG로 처리하고 24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 10% 부피의 WST-1 시약을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션 하였다. 마이크로 플레이트 리더 (VERASmax^TM, Molecular Devices)에서 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

수지상세포의 시험관 내 흡수( In vitro uptake of DCs ).

OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신의 세포 내 흡수를 유세포 분석법 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 법에 의해 평가하였다. 간단히 설명하면, DC2.4 세포를 2 ml 배지에서 웰당 5 x 10⁵ 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 부착시켰다. 나노 백신의 세포 내 흡수를 검출하기 위해, 0.5 중량%의 DPPE-로다민 염료를 지질 나노 입자 제제에 첨가하였다. 세포를 200 μM의 로다민-표지 된 나노 백신과 함께 4 시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 세척하고, 세포 흡수를 유세포 분석에 의해 평가하였다. 공초점 현미경으로 세포 흡수를 확인하기 위해, DC2.4 세포를 24-웰 플레이트의 커버 슬립 상에 0.5 ml 배지에서 웰당 4 x 10⁴ 세포의 밀도로 시딩하고 성장시켜 밤새 부착시켰다. 세포를 200 μM 로다민-표지 된 나노 백신과 함께 4 시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 10 % 포르말린 용액으로 고정시키고 이들의 핵을 DRAQ5 (Thermo Fisher)로 염색 하였다. 모든 샘플은 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (LSM 780; Carl Zeiss)에 의해 이미지화되었다.

골수 수지상세포(BMDC)의 생성, 흡수, 성숙 및 T 세포 교차 프라이밍(Generation, uptake, maturation and T cell cross-priming of BMDCs .)

BMDC는 Kang, S. et al. (J Control Release 256, 56-67, 2017)에서 설명한대로 생성되었다. 나노 백신의 세포 내 흡수를 평가하기 위해, BMDC를 0.5 ml 배지에 웰당 3 x 10⁵ 세포의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 부착시켰다. 200 μM 로다민-표지 된 나노 백신과 4 시간 동안 인큐베이션 한 후, 세포를 세척하고, 수확하고, 항-CD11c-PE/Cy7 및 항-MHCII-APC 항체로 염색하였다.

세포 흡수는 유세포 분석에 의해 평가되었다. DC 성숙을 강화시키는 나노 백신의 능력을 평가하기 위해, 미숙한 BMDC를 0.5 ml 배지에서 웰당 5 x 10⁵ 세포의 밀도로 12-웰 플레이트에 배양하고 밤새 부착시켰다. BMDC를 24 시간 동안 HBG 완충제, 가용성 CpG, 가용성 OVA_PEP, 가용성 OVA_PEP + CpG, OVA_PEP-SLNP@ODN 또는 OVA_PEP-SLNP@CpG (CpG : 0.1 μM; OVA_PEP : 1.2 μM; SLNP : 0.48 mM)와 24 시간 동안 배양 하였다. 이어서, BMDC를 세척하고, 수확하고, 항-CD11c-PE/Cy7, 항-MHC±항-CD80-FITC 및 항-CD86-PE 항체로 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다.

T 세포의 교차-프라이밍을 평가하기 위해, BMDC를 1 ml 배지에서 웰당 1x10⁶ 세포의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 접착시켰다. BMDC를 HBG 완충제, 가용성 CpG, 가용성 OVA_PEP, 가용성 OVA_PEP + CpG, OVA_PEP-SLNP @ ODN 또는 OVA_PEP-SLNP @ CpG (CpG : 0.1 μM; OVA_PEP : 1.2 μM; SLNP : 0.48 mM)와 함께 18 시간 동안 배양하고, 수거 및 얼음에서 3 분 동안 시트레이트-포스페이트 완충액 (pH 3.2)으로 세척하여 표면으로부터 펩티드/MHC 클래스 I 복합체를 제거하였다.

이들 BMDC를 이어서 B3Z CD8⁺ T 하이브리도마 세포와 함께 24 시간 동안 공동 배양하였다. 간략히 설명하면, BMDC를 0.1 ml 완충액에서 웰당 2 x 10⁴ 세포의 밀도로 96- 웰 U 바닥 플레이트에 시딩한 다음, B3Z 세포를 0.1 ml 배지에서 웰당 4 x 10⁴ 세포의 밀도로 각 웰에 첨가하고, 24 시간 동안 배양하였다. 현탁액을 원심 분리하여 세포 펠릿 및 상청액을 분리하였다.

β-갈락토시다제 활성을 세포 펠렛에서 분석하였다. 간단히 설명하면, 수확된 세포 펠렛을 세척하고 CPRG 분석 완충액 (0.1 % 트리톤 X-100, 100 μM 2-머캅토에탄올, 10 mM MgCl₂ 및 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노시드 (chlorophenol red-β-D-galactopyranoside, CPRG)을 함유하는 PBS)에 재현탁시켰다. 각각의 재현탁 된 펠렛을 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 플레이트를 어두운 곳에서 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션 하였다. 570 nm에서 각각의 웰의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다. 수집된 상청액 중의 IL-2 농도는 제조사의 지시에 따라 IL-2 ELISA 키트 (R & D Systems, Minneapolis, USA)를 사용하여 평가되었다.

생체 내 림프관 배출, 흡수 및 수지상세포 성숙( In vivo lymphatic drainage, uptake and DCs maturation.)

OVA_PEP-SLNP @ CpG 나노 백신의 림프관 배출(lymphatic drainage)을 평가하기 위해, 0.37 중량%의 페길화 된 cypate 염료를 나노 입자 제형에 첨가하였다. 페길화된 cypate-로딩된 나노 백신을 C57BL/6 마우스의 발바닥에 피하 주사하였다. 2, 4, 8 및 12 시간 후, 생체 내 영상화 시스템 (IVIS)을 사용하여 형광 신호를 평가하였다. 림프관 내 배출은 또한 공초점 현미경 영상으로도 평가되었다. 로다민 염료-표지 된 나노 백신을 마우스의 발바닥에 피하 주사하고 8 시간 후에 오금림프절(popliteal LN)을 제거하였다. 제거된 LN을 OCT 화합물 (Leica, Germany)에 매립하고 동결시키고, 동결 마이크로톰 (CM1850; Leica)을 사용하여 15 μm 슬라이스로 분할하고, 이를 유리 슬라이드에 마운팅 하였다. LN 섹션을 10% 포르말린 용액에 고정시키고, 2% 소혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS로 1 시간 동안 실온에서 블로킹 하였다. 슬라이드는 VectaMount^TM AQ 마운팅 미디엄 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)으로 마운팅하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 영상화 되었다. LN에서 APC에 의한 흡수를 확인하기 위해, 로다민-표지 된 나노 백신을 마우스 발바닥에 피하 주사하고 8 시간 후에 오금림프절 LN을 제거하였다. 제거된 LN은 세척, 절제 및 37 ℃에서 30 분 동안 콜라게나제 타입 IV 용액 (1 mg/ml; Sigma Aldrich)에서 소화되었다. 세포를 다시 세척하고 70 μm 세포 여과기 (팔콘)를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 회수하였다. LN 세포를 항-CD45-퍼시픽 블루, 항-CD3-PerCP/Cy5.5, 항-CD19-PerCP/Cy5.5, 항-CD169-FITC, 항-CD11b-APC, 항-CD11c-PE/Cy7 항체 및 7-AAD와 함께 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 이들 세포를 세척하고 유세포 분석에 의해 분석하였다.

면역화(Immunization)

6 주령 암컷 C57BL/6 마우스를 상동성 프라임-부스트 요법을 사용하여 면역화시켰다. 마우스를 4 개의 그룹으로 나누고, 이를 HBG 완충액 비히클, 가용성 OVA_PEP + CpG, OVA_PEP-SLNP @ ODN, 또는 OVA_PEP-SLNP @ CpG (CpG : 마우스 당 0.4 nmol; OVA_PEP : 마우스 당 5 nmol; SLNP : 마우스 당 2 μmol)로 표시된 시점에서 양 발바닥에 피하 주사하여 면역화시켰다.

항원 특이적 T 세포 반응의 평가 (Evaluation of antigen-specific T cell responses)

상기한 바와 같이 4 개의 그룹으로 분할된 마우스를 10 일 간격으로 3 회 면역하고 마지막 면역화 3 주 후에 희생시켰다. 항원-특이적 T 세포 반응을 평가하기 위해, 비장 세포를 OVA_PEP (SIINFEKL 펩티드; 10 μg/ml)로 생체 외에서(ex vivo) 재 자극시켰다. 분비된 IFN-γ의 양은 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정되었고 INF-γ 생산 세포의 수는 효소-결합 면역점 (ELISpot) 분석에 의해 평가되었다. CD8⁺ T 세포에 의해 생성된 INF-γ 및 그랜자임 B를 세포 내 사이토 카인 염색 (intracellular cytokine staining, ICS)에 의해 정량화 하였다. ELISA에 의해 INF-γ 수준을 측정하기 위해, 비장 세포를 웰당 3 x 10⁵ 세포의 밀도로 96-웰 U 바닥 플레이트에 시딩하고 72 시간 동안 OVA_PEP으로 재 자극시켰다. 배양 상청액을 수거하고 IFN-γ ELISA 키트 (R&D Systems)를 사용하여 IFN-γ 농도를 측정하였다. ELISpot에 의한 INF-γ 생산 세포를 측정하기 위해, 비장 세포를 웰당 3 x 10⁵ 세포의 밀도로 마우스 IFN-γ에 특이적인 단일 클론 항체로 코팅 된 96-웰 마이크로 플레이트에 시딩하고, 세포를 30 시간 동안 OVAPEP로 재 자극시켰다. INF-γ 생산점은 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 IFN-γ ELISpot 키트 (R&D Systems)를 사용하여 현상되었다. 현상 후, 자동 ELISpot 판독기 (AID GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 사이토카인 국재화 부위의 청색-흑색 점을 계수 하였다. ICS 분석의 경우, 비장 세포 (둥근 바닥 시험관 당 3 x 10⁶ 세포)를 1 시간 동안 OVA_PEP로 재자극시켰다. 사이토카인의 세포 내 수송을 억제하기 위해 GolgiStop^TM 또는 GolgiPlug^TM (BD Biosciences)을 각 튜브에 첨가하였다. 세포를 5 시간 동안 인큐베이션하고, 4 ℃에서 30 분 동안 Ghost Dye^TM Violet 450으로 염색하여 사멸 세포를 구별한 후, 4 ℃에서 20 분 동안 항-CD3-PerCP/Cy5.5 및 항-CD8-APC/Cy7 항체로 염색하였다. 세포 내 사이토 카인 염색의 경우, 세포를 Cytofix/Cytoperm^TM 용액 (BD Biosciences)을 사용하여 투과시키고 PE-접합된 항-IFN-γ 및 Alexa Fluor 647-접합된 항-그랜자임 B 항체와 함께 배양하였다. 샘플을 세척하고 유세포 분석에 의해 분석하였다.

생체 내 세포 독성 T 림프구 분석 (In vivo cytotoxic T lymphocyte assay)

상기 기재된 바와 같이 마우스를 4개의 처리 군으로 나누고, 7 일 간격으로 3 회 면역시켰다. 마지막 면역화 7일 후, 생쥐에게 비면역 C57BL/6 생쥐의 비장 세포로부터 제조된 세포의 혼합물을 주입하였다. 비장 세포의 절반을 37 ℃에서 1 시간 동안 OVA_PEP (1 μg/ml)로 펄스화하고 다른 절반은 펄스화하지 않았다. 비 펄스화 세포는 0.5 μM CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 표지되었고, OVA_PEP 펄스화 된 세포는 5 μM CFSE로 10 분 동안 표지되었다. 펄스화 된 (CFSE^high) 및 비 펄스화 된 (CFSE^low) 세포의 1:1 혼합물을 면역화 된 마우스에 정맥 내 주사 하였다. 주사 후 18 시간에, 수여 마우스(recipient)의 비장 세포를 수확하고 유세포 분석법에 의해 분석하여 CFSE^high 및 CFSE^low 세포의 상대적인 수를 측정하였다. 항원-특이적 표적 세포 사멸은 다음 식을 사용하여 계산되었다 :

식

특이적 표적 세포 사멸 백분율 = 100 - [100 x {(%CFSE^high 면역화 마우스 / %CFSE^low 면역화 마우스) / (%CFSE^high 비면역 마우스/%CFSE^low 비면역 마우스)}]

항종양 효과 시험( Antitumor efficacy test)

종양 예방에서의 치료 효과를 평가하기 위해, 마우스를 상기 기재된 각 백신 양식으로 10 일 간격으로 3 회 면역화 시켰다. 마지막 면역화 3 주 후, 각 마우스의 한 옆구리에 2x10⁵ EL4 세포를 피하 접종하고, 다른 측면에 2x10⁵ E.G7-OVA 세포를 피하 접종하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 이틀마다 종양 성장을 모니터링하고 종양 부피를 0.5Х길이Х폭² 으로 계산하였다. 평균 종양 부피가 윤리적 종말점 (~ 2000 mm³)에 도달했을 때 마우스를 안락사 시켰다.

종양 부피 감소에 있어서 치료의 효과를 분석하기 위해, 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 2x10⁵ E.G7-OVA 세포를 피하로 접종하였다. 평균 종양 부피가 ~ 50 mm³에 도달했을 때, 마우스를 4 개의 치료 그룹으로 무작위로 나누고 4 일 간격으로 3 회 면역화시켰다. 조합 면역 요법의 효능을 평가하기 위해, 마우스는 마우스-PD-1 (alpha PD-1; BioXcell; clone : RMP1-14)에 대한 항체를 갖거나 갖지 않는 2 회의 면역화주기를 거쳤다. 2 x 10⁵ E.G7-OVA 암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사하여 마우스에 접종하였다. 4 일 간격으로 OVA_PEP-SLNP @ CpG 나노 백신을 3 회 피하 주사하는 것으로 구성된 첫 번째 면역주기는 6 일 후에 시작되었다. 20 일째에, 마우스를 소형-종양(양호한 반응자)을 갖는 마우스 및 대형-종양(불량한 반응자) 을 갖는 마우스로 나누었다. 종양 부피가 ~ 2000 mm³에 도달하면 불량한 반응자들은 희생되었다. 양호한 반응자들은 26 일에 시작하여 2 차 면역화주기를 시작하였다. 2 차 면역화주기는 6 일 간격으로 2 회 피하 주사로 구성되었다. 또한, 각 백신 접종 후 1, 3 및 5 일에 alpha PD-1 (주사당 200 μg)을 마우스 복강 내 투여하였다. 종말점에 이르면, 종양 조직을 제거하고, 칭량하고, 사진을 찍었다.

PD-L1의 시험관 내 유도 ( In vitro induction of PD-L1)

E.G7-OVA 세포를 0.5 ml 배지에서 웰당 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩 하였다. 세포를 재조합 뮤린 IFN-γ (100 ng / ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)로 48 시간 동안 처리하고, 세척, 수확 및 PE-접합 된 항-PD-L1 항체로 염색하였다. 시험 관내 PD-L1 유도는 유세포 분석에 의해 확인되었다.

종양 조직의 조직 병리학 분석 ( Histopathological analysis of tumor tissues)

절제된 종양 조직을 OCT 용액에 매립시키고, 즉시 냉동시키고, 동결 슬라이드를 사용하여 20 μm 슬라이스로 절편화하고, 이를 유리 슬라이드 상에 마운팅 하였다. 조직 절편을 10% 포르말린 용액에 10 분 동안 고정시키고 2% BSA를 함유하는 PBS로 1 시간 동안 실온에서 블로킹 하였다. 비오틴-접합된 항-마우스 CD8a 항체 (1:100 희석; Tonbo Biosciences)와 함께 조직 절편을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 종양 조직으로의 CD8⁺ T 세포 침윤을 평가 하였다.

이어서 조직 절편을 세척하고 PE-접합된 항-스트렙타비딘 항체 (1:200 희석; BD 바이오사이언시스)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 랫트 모노클로날 항-PD-L1 항체 (1:100 희석; Abcam)와 함께 조직 절편을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 종양 조직에서의 PD-L1 유도를 평가하였다. 이들 절편을 이어서 세척하고 실온에서 1 시간 동안 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-랫트 IgG 항체 (1:100 희석; Abcam)와 함께 배양하였다.

핵을 Hoechst 33342 (1:5000 희석)로 염색하고 슬라이드를 VectaMount AQ 마운팅 미디엄으로 마운팅 하였다. 모든 절편은 공 초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 영상화 되었다. 절제된 종양 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시키고, 파라핀에 포매하고 4 μm 슬라이스로 절단하였다. 이들 절편을 H&E로 염색하고, 제조사의 지시에 따라 종말점 비색계 TUNEL 시스템 (Dead End Colorimetric TUNEL system) (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 아폽토시스 된 세포를 측정하였다. 모든 슬라이드를 니콘 정립 형광 현미경을 사용하여 분석하였다.

사량체 분석( Tetramer analysis.)

후안와 채혈로 얻은 마우스 말초 혈액을 혈청 분리기 튜브 (BD)에 수집하였다. 적혈구 (RBC)를 1 ml의 RBC 용해 완충액 (Biolegend)과 함께 실온에서 2 분 동안 부드럽게 진탕하면서 배양함으로써 제거하였다. 사량체 염색을 위해, 혈액 세포를 iTAg H-2Kb OVA 사량체-PE (MBL, 일본)와 함께 4 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 이어서 세포를 세척하고 퍼시픽 블루-접합된 항-CD45, PE/Cy7 접합된 항-CD3, Alexa Fluor 488 접합된 항-CD8, 및 APC 접합된 항-PD-1 항체 및 7-AAD와 함께 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 세포를 다시 세척하고 유세포 분석에 의해 분석하였다.

통계 분석(Statistical analysis.)

데이터는 평균 ± S.E.M.로 표시되었다. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software)를 사용한 post hoc Tukey 검정으로 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 그룹을 비교하였다. 통계적 유의성은 P <0.05로 정의되었다.

실시예 1: 본 발명의 항원- 및 어주번트 -운반 나노 백신(OVA _PEP -SLNP@CpG)의 합성 및 특성

본 발명에서 항원- 및 어주번트-운반 나노 백신으로 사용된 작은 지질 나노 입자(small lipid nanoparticle, SLNP)는 두 개의 인지질인 i) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) 및 ii) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)₁₀₀₀] (DSPE-PEG₁₀₀₀); 및 콜레스테롤 유도체인 monoarginine-cholesterol (MA-Chol)로 제조되었다.

상기 DOPE는 지질 나노 입자의 엔도솜 탈출에 관여하는 중성 지질이다. 따라서, SLNP 내로 DOPE의 혼입은 엔도솜으로부터 세포질로 항원 이동을 향상시켜 세포막에서의 항원 발현을 촉진시킬 수 있다. 상기 DSPE-PEG₁₀₀₀은 생리학적 조건 하에서 SLNP의 콜로이드 안정성을 증가시켜 SLNP의 림프관을 통한 배출(lymphatic drainage)을 촉진시키는 PEGylated phospholipid(페길화 인지질)이다.

상기 MA-Chol은 아르기닌과 콜레스테롤 및 SLNP의 주요 성분으로 구성된 양이온성 분자로, SLNP와 올리고 뉴클레오타이드 사이에 복합체 형성을 가능케한다 (도 1a-1c).

본 발명에 사용된 어주번트는 TLR9 작용성 CpG 올리고 디옥시뉴클레오타이드 (Toll-like receptor 9 agonistic CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN)이다. CpG ODN 및 ICB 면역 요법의 조합은 강력한 상승적 항종양 효능을 갖는 것으로 보고되었으며, 이 조합의 몇몇 임상 시험이 현재 진행 중이다. 모델 종양 항원은 오발부민(ovalbumin)의 MHC 클래스 I-제한 에피토프 (SIINFEKL; OVA_PEP으로 명명됨)였으며, 이는 CD8⁺ T 세포 반응을 자극하는 것으로 나타났다. OVA_PEP은 이황화 결합을 통해 PEGylated DSPE의 말단에 화학적으로 부착되었다 (도 2a-2c).

세포로 내재화 될 때, 이 분자는 세포질에서 글루타티온에 의해 절단되고, 방출된 유리 OVA_PEP(free OVA_PEP)은 MHC 클래스 I 또는 II에 의해 세포막에 제시되었다 (도 3a-3b).

OVA_PEP-SLNP@CpG로 명명된, 항원-표시, CpG 어주번트-포함 SLNP는 필름 형성 및 재수화의 단일-포트 순차적 공정(one-pot sequential process)에 의해 제조되었다 (도 1a). 크기 배제 크로마토그래피는 OVA_PEP-SLNP에 CpG ODN의 거의 완전한 로딩을 나타냈다 (도 4).

투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM)은 0.25 몰%의 OVA_PEP 항원을 사용하여 제조된 OVA_PEP-SLNP@CpG가 구형 형태를 가지며, 155 개의 입자를 분석하여 ~ 72 nm의 평균 직경을 가지는 것을 확인하였다(도 5).

이들 OVA_PEP-SLNP@CpG 입자는 ~ 104.5 nm의 유체 역학적 크기 및 중성 표면 전하를 나타내는 +0.23 mV의 제타 전위를 가졌다. OVAPEP-SLNP@CpG와 크기 및 제타 전위가 유사한 대조군 나노 백신으로, 비-면역 자극제 대조군 ODN-복합 SLNP (OVA_PEP-SLNP@ODN)를 동일한 절차를 사용하여 제조하였다 (도 6).

실시예 2: 본 발명의 OVA _PEP -SLNP@CpG 나노 백신의 in vitro 에서 DC 성숙 및 T 세포 교차- 프라이밍 향상 효과

생체 내 나노 백신은 수지상 세포 (dendritic cell, DC) 또는 대식세포(macrophage)에 의해 흡수될 것으로 예상되기 때문에, DC에 대한 OVA_PEP-SLNP@CpG의 세포 독성은 WST-1 분석을 사용하여 평가되었다. 본 발명의 나노 백신은 500 nM의 높은 CpG 농도에서도 DC2.4 뮤린 DC의 생존성(viability)에 영향을 미치지 않았다 (도 7).

DC에 의한 나노 백신의 세포 내 흡수는 로다민 염료로 표지된 OVA_PEP-SLNP@CpG를 사용하여 평가되었으며, 유세포 분석법(flow cytometry)은 로다민-양성 세포의 새로운 밴드를 나타냈고, 원래의 DC2.4 세포 및 골수 유래 DC(bone marrow-derived DC, BMDC)의 밴드와는 상이하였다 (도 8).

공 초점 레이저 스캐닝 현미경은 나노 백신의 세포 내 위치를 추가로 확인하였다 (도 9).

DC의 성숙 및 MHC 클래스 I 분자를 통한 전달된 항원의 막 제시는 효과적인 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는데 필수적이다. OVA_PEP-SLNP@CpG가 DC 성숙을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 유세포 분석법을 수행하였다. 마커 CD11c⁺ MHCII^high를 발현하는 성숙 DC의 빈도 및 공동자극 분자 (CD80 및 CD86)의 발현은 다른 세포 그룹보다 유의하게 더 높았다 (도 10-12).

가용성 항원 및 어주번트의 혼합물(OVA_PEP + CpG ODN) 또는 대조군 OVA_PEP-SLNP@ODN은 DC 성숙을 유도하지 않았으며, 이는 CpG 어주번트의 중요성을 가리킨다. 그러나, 가용성 CpG 단독으로는 DC 성숙을 유도할 수 없었으며, 이는 DC에 적절한 전달 시스템이 필요하다는 것을 시사한다. 이러한 발견은 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신이 DC에 의해 흡수되어 성숙을 유도할 수 있음을 나타낸다.

T 세포 수용체가 OVA_PEP (SIINFEKL)-MHC 복합체를 특이적으로 인식할 때 β-갈락토시다제를 분비하도록 조작된 BMDC 및 CD8⁺ T 세포 하이브리도마 B3Z 세포에서의 나노 백신의 교차-프라이밍 능력이 평가되었다. BMDC를 18 시간 동안 각각의 백신 양식으로 처리하고, 엄격하게 세척하여 세포 내 가공 및 교차-표시(cross-presentation)가 없도록 MHC 분자 상에 존재하는 임의의 항원 펩티드를 세포 외적으로 제거하였고, 24시간 동안 B3Z 세포와 공동 배양하였다. β-갈락토시다제 분석 및 IL-2 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)은 OVA_PEP-SLNP@CpG가 다른 요법보다 훨씬 더 높은 수준의 β-갈락토시다제 및 IL-2 분비를 유도함을 보여주었다(Fig. 2d). OVA_PEP-SLNP@ODN 및 OVA_PEP + CpG는 둘 다, 가용성 OVA_PEP 또는 CpG 단독보다 높은 활성을 보였지만 (도 13 및 14), OVA_PEP-SLNP@CpG보다 훨씬 낮았다.

종합하면, 이러한 in vitro 연구 결과는 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신이 DC에 의해 쉽게 흡수되어 성숙을 유도하고, MHC를 통해 표면에 방출된 항원을 제시함으로써 항원에 대해 CD8⁺ T 세포를 효과적으로 교차-프라이밍 할 수 있음을 나타냈다.

실시예 3: OVA _PEP -SLNP@CpG 국소 주사의 림프절에서 DC의 성숙 유도 (Local injection of OVA _PEP -SLNP@CpG results in maturation of DCs in lymph nodes)

크기와 표면의 기능에 따라, 국소 주사된 나노 백신은 국소 림프절 (LN) 내로 흘러 나가는 것으로 나타났으며, 여기에서 나노 백신은 DC 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC)에 의해 흡수된다. 나노 백신의 림프관 내로의 배수(lymphatic drainage)를 평가하기 위해, 본 발명자들은 근적외선 염료로 표지된 OVA_PEP-SLNP@CpG를 C57BL 6 마우스의 발바닥에 피하 주사하였다. 생체 내 영상화 시스템 (in vivo imaging system, IVIS)은 배출 LN 주위에서 명확한 형광 신호 강도를 나타냈고, 형광 신호는 2 시간 후에 시작하여 12 시간 동안 지속되었다 (도 15-16).

림프절에서의 나노 백신의 분포를 조사하기 위해, 로다민 염료로 표지 된 OVA_PEP-SLNP@CpG를 피하 주사하고 8시간 후에 배출 오금 림프절(draining popliteal LN )을 절제하였다. 공 초점 현미경은 대부분의 나노 백신이 림프절의 피막하동(subcapsular sinus) 영역에 국재화 된다는 것을 보여주었다(도 17).

OVA_PEP-SLNP@CpG가 2 시간 이내에 가장 가까운 림프절에 도달하면, 나노 백신은 주사 부위의 DC에 의해 흡수되어 림프절로 전달되기보다는, 림프관을 통해 직접 LN으로 배출될 가능성이 높으며, 이 과정은 ~24 시간이 소요된다. 오금 림프절에서 염료로 표지 된 나노 백신을 흡수하는 APC의 능력은 유세포 분석-기반 게이팅에 의해 평가되었다 (도 18).

대식세포 (CD169⁺ CD11b⁺)의 대략 19.7 % 및 DC (CD169^- CD11c⁺)의 25 %는 로다민 형광-양성이었으며, 이는 림프절에서 APC에 의한 높은 수준의 나노 백신 흡수를 시사한다 (도 19).

본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG의 in vitro에서 DC 성숙을 활성화시키고 촉진하는 능력을 확인한 후, 본 발명자들은 성숙 마커 CD40 및 CD86을 사용한 게이팅 전략에 의해 나노 백신을 포함하는 오금 림프절에서의 DC 성숙을 평가하였다 (도 20).

OVA_PEP-SLNP@CpG는 CD40 및 CD86의 발현을 크게 증가 시켰지만, 가용성 OVA_PEP과 CpG의 혼합물, 또는 대조군 OVA_PEP-SLNP@ODN은 이들 마커의 발현을 약간만 증가시켰다(도 21).

종합하면, 이들 in vivo 결과는 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신이 고효율로 국소 림프절에 직접 전달될 수 있고, 림프절에 상주하는 DC 및 대식세포에 의해 흡수되며, DC 성숙을 효과적으로 유도할 수 있음을 입증하였다.

실시예 4: In vivo 에서 항원-특이적 세포독성 T 세포 반응의 평가 (Evaluation of antigen-specific cytotoxic T cell responses in vivo )

i) 비히클, ii) 가용성 OVA_PEP + CpG, iii) OVA_PEP-SLNP@ODN 또는 iv) OVA_PEP-SLNP@CpG의 항원-특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 평가하기 위해, 각 물질을 10 일 간격으로 마우스에 3 회 면역(0일, 10일, 20일)하고, 3 차 면역화 후 3 주째(41일)에 희생시켰다 (도 22).

비장 세포를 면역화 시킨 마우스로부터 단리하고, OVA_PEP (SIINFEKL 펩티드)로 재 자극한 후, 활성화 된 CD8⁺ T 세포에 의해 분비 된 대표적인 사이토카인인, 인터페론-감마 (IFN-γ)의 분비를 ELISA 및 ELISpot 분석에 의해 측정 하였다.

OVA_PEP-SLNP@CpG 면역은 ELISA에서 INF-γ의 더 큰 분비를 유도했으며 (그림 3b), ELISpot 분석에서 INF-γ 스팟 형성 세포 (spot forming cell, SFC)의 생산은 다른 면역원보다 훨씬 높았다 (도 24).

세포 내 사이토 카인 염색 (Intracellular cytokine staining, ICS)을 수행하여 활성화 된 CD8⁺ T 세포의 기능성을 테스트하고, Supplementary Figure 6에 도시된 게이팅 전략을 사용하여 INF-γ 및 그랜자임 B를 측정 하였다. 가용성 OVA_PEP+CpG 및 OVA_PEP-SLNP@ODN은 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 데 효과적이지 않았지만, 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 면역화 된 마우스에서 분리한 CD8⁺ T 세포는 훨씬 더 높은 수준의 INF-γ와 그랜자임 B를 생산했다 (도 25-26).

이들 CD8⁺ T 세포의 in vivo 항원-특이적 사멸 활성은 펄스되지 않은 마우스에서 얻은 비장 세포 반, 및 OVA_PEP로 펄스 된 비장 세포 반의 혼합물을 각각의 백신 요법으로 면역화 된 수용 마우스에 양자적으로 전달함으로써 평가되었다. 양자적 전달(adoptive transfer) 18시간 후, CD8⁺ T 세포의 항원-특이적 사멸 능력은 유세포 분석법에 의해 평가되었다 (도 27).

가용성 OVA_PEP+CpG (60.7 %) 또는 OVA_PEP-SLNP@ODN (82.9 %)으로 면역화 된 마우스에서 보다 OVA_PEP-SLNP @ CpG (89 %)로 면역 된 마우스에서 전이 된 비장 세포의 OVA_PEP-특이적 사멸의 백분율이 더 높았다 (도 28).

종합적으로, 이들 결과는 OVA_PEP-SLNP@CpG가 가용성 항원 + 어주번트의 물리적 혼합물보다 CD8⁺ T 세포에서 훨씬 더 높은 항원-특이적 사멸 활성을 유도할 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 예방 효과 : OVAPEP - SLNP @ CpG 나노 백신에 의한 종양 예방(Prophylactic effect: tumor prevention by OVA _PEP -SLNP@CpG nanovaccine )

본 발명자들은 두 가지 마우스 림프종 세포주, EL4 및 E.G7-OVA를 이용하여 종양 성장을 방지하기 위한 각 백신 요법의 in vivo 효과를 조사하였다. E.G7-OVA 는 OVA 유전자의 형질 감염에 의해 EL4 세포로부터 유래된 것이다.

먼저 마우스를 사기 4 가지의 백신 양식으로 각각 10 일 간격으로 3 회 면역시켰다; 3차 면역화 3주 후, EL4 및 E.G7-OVA 세포를 이들 마우스의 반대쪽 옆구리에 각각 주사 하였다 (도 29).

OVA_PEP-SLNP@CpG는 EL4 유래 종양의 성장을 억제하지는 않았지만, 반대편 옆구리에서 E.G7-OVA 유래 종양의 성장을 완전히 방지하였다(도 30-31).

가용성 OVA_PEP + CpG는 두 세포주에서 종양 성장을 예방하는데 전혀 효과가 없었지만, OVA_PEP-SLNP@ODN은 둘 다에 대해 적당히 효과적이지만 E.G7-OVA- 유래 종양에 대해 OVA_PEP-SLNP @ CpG보다 효과적이지는 않았다 (도 32-36).

이러한 발견은 본 발명의 나노 백신이 항원-특이적 방식으로 종양 성장을 예방했음을 의미한다.

실시예 6: 확립된 종양 모델에서 OVA _PEP -SLNP@CpG의 치료 효능

본 발명자들은 다음으로, E.G7-OVA 종양 보유 마우스에서 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@ CpG나노 백신의 치료 효능을 평가 하였다. 평균 종양 부피가 ~ 50 mm³에 도달할 때, 마우스를 4 개의 그룹으로 무작위로 나누고 각 백신 양식으로 4 일 간격으로 3 회 면역화시켰다 (도 37).

가용성 OVA_PEP + CpG 또는 OVA_PEP-SLNP @ ODN으로 유도한 면역화는 비히클 대조군과 비교하여 단지 중간 수준의 종양 성장 억제를 나타냈지만, 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG로 유도한 면역화는 종양 성장을 유의하게 억제하였고, 7 마리 마우스 중 2 마리는 종양이 없게 되었다 (도 38-41).

세포 수준에서 나노 백신의 효과를 더 잘 이해하기 위해 종양 조직의 조직 병리학적 분석을 수행하였다. 면역 조직 화학 (Immunohistochemistry, IHC)은 CD8⁺ T 세포 침윤이 다른 그룹에서보다 본 발명의 OVA_PEP-SLNP @ CpG로 면역화 된 마우스로부터의 종양 조직에서 훨씬 더 높았다는 것을 보여주었다 (도 42).

CTL 반응의 후기 거부기(late rejection phase) 동안 종양 조직을 분석하였지만, 그룹 간에 T 세포 침윤 정도의 차이는 유의하였다.

종양 조직의 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG-면역화 된 그룹에서 변형된 핵, 탈핵된 괴사 세포 및 죽은 세포-유래 파편과 같은 막대한 세포 손상이 발생했음을 보여 주었으나, 다른 그룹들에서는 그렇지 않았다 (도 43).

말단 데옥시 뉴클레오티딜-트랜스퍼라제-매개된 dUTP 닉-엔드 라벨링 (nick-end labeling, TUNEL) 분석은 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG-면역화 된 그룹으로부터 종양 조직에서 대량의 아폽토시스를 확인했다(도 44-45).

종합적으로, 이러한 조직 병리학적 분석은 OVA_PEP-SLNP@CpG 면역화로 인한 치료 효능이 종양으로의 T 세포 침윤 증가에 따른 암 세포의 대량 사멸에 기인한 것을 가리킨다.

실시예 7: 면역 체크 포인트 차단과 OVA _PEP - SLNP @ CpG nanovaccine의 순차적 조합의 종양 재성장 억제 효과

OVA_PEP-SLNP @ CpG 나노 백신은 종양 성장을 예방 및 억제하는 데 매우 효과적이었지만, 치료 반응은 개별 마우스에서 다양하였다. 항종양 효과의 변화를 평가하기 위해, OVA_PEP-SLNP@CpG-면역화 된 마우스로부터 수득된 종양을 그들의 상대적 크기에 기초하여 임의로 2 개의 그룹으로 나누었다: 큰 종양군 (> ~ 60 mm³, 7 마리 생쥐 중 2 마리) 및 작은 종양군(<~ 60 mm³, 7 마리 생쥐 중 3 마리).

IHC는 PD-L1 발현이 큰 종양군 ('불량한 반응자'로 분류됨) 또는 예방 접종되지 않은 대조군보다 작은 종양군 ('양호한 반응자'로 분류됨)에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었다(도 46). 또한, CD8⁺ T 세포 침윤은 불량한 반응자 또는 백신 접종되지 않은 마우스에서 보다, 양호한 반응자에서 훨씬 더 우수 하였다 (도 47).

본 발명자들은 또한 E.G7-OVA 암 세포에서 PD-L1 발현이, 활성화 된 CD8⁺ T 세포에 의해 분비되는 대표적인 항종양 사이토카인인 IFN-γ의 처리에 의해 현저하게 유도됨을 발견하였다 (도 48).

TME에서 PD-L1 발현이 T 세포로부터 분비된 IFN-γ에 의해 증가되기 때문에, 이러한 발견은 양호한 반응자에서 더 큰 항종양 효능이 IFN-γ에 의한 더 높은 CD8⁺ T 세포 침윤 및 암세포 사멸로부터 초래될 수 있음을 시사한다. 그러나, PD-L1 발현 및 종양 조직에서 종양 침윤성 T 세포의 공동-국재화는 적응성 면역 억제 및 저항과 밀접한 관련이 있기 때문에, 종양에서 PD-L1 유도가 높은 양호한 반응자는 T 세포 고갈을 통해 적응성 면역 저항성을 발달시켜 종양 재발을 초래할 수 있다. 이러한 발견은 암 나노 백신 및 ICB의 치료 순서 및 시기를 포함하는 새로운 조합 전략을 조사할 필요가 있음을 시사한다.

나노 백신을 ICB 요법과 순차적으로 조합하는 요법의 타당성을 조사하기 위해, 50 마리의 마우스에 백신 접종을 마우스 PD-1 (αPD-1)에 대한 항체와 함께 또는 항체 없이 2회 수행하였다. 구체적으로 E.G7-OVA 암 세포로 측면에 접종한 후 6 일 후에 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신을 3 회 피하 주사하여 제1차 면역화를 수행하였다 (도 49). E.G7-OVA 암 세포를 접종한 후 20 일째에는 마우스를 나노 백신에 대한 치료 반응에 기초하여 2 개의 그룹으로 나누었다. 10마리 (20 %)는 불량한 반응자이고 40 마리(80 %)는 양호한 반응자였다. CD8⁺ T 세포는 불량한 반응자 및 양호한 반응자 둘 다로부터 단리되었고, 이들의 표현형은 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석에 의해 분석되었다 (도 50).

사량체 검정은 OVA_PEP (SIINFEKL)-특이적 CD8⁺ T 세포의 백분율이 불량한 반응자 및 면역화되지 않은 대조군보다 양호한 반응자에서 약 2 배 더 높았다는 것을 보여주었다 (도 51-52). 또한, CD8⁺ T 세포에 의한 PD-1의 발현은 불량한 반응자 및 백신 접종되지 않은 대조군보다 양호한 반응자에서 훨씬 더 높았다 (도 53).

이 발견은 백신 접종에 의해 유도된 항원-특이적 CD8⁺ T 세포에서 PD-1 발현이 상향 조절되고, T 세포 고갈 및 활성화를 반영하는 것으로 간주될 수 있음을 보여주는 보고들과 잘 일치한다. TME에서 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포의 수는 말초 혈액에서 이들 세포의 수와 양의 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 또한, PD-1⁺ CD8⁺ T 세포의 종양으로의 침윤은 ICB 요법에 대한 반응에 대한 양성 마커 인 것으로 보고되었다. 말초 혈액에서 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포의 수가 양호한 반응자에서 높았고 (도 53), PD-L1이 종양 조직에서 발현되었기 때문에 (도 46), 양호한 반응자만 αPD-1으로 치료하는 것이 합리적으로 보였다.

40 개의 우수한 반응자들을 각각 10 마리씩 4 마리씩 무작위로 나누었다 (도 49 및 54).

i) 한 그룹은 비히클 대조군이고, ii) 다른 하나는 αPD-1 단독으로 처리되었고, iii) 다른 하나는 OVA_PEP-SLNP @ CpG로 다시 면역화되고, iv) 다른 하나는 OVA_PEP-SLNP@CpG로 다시 면역화되고 αPD-1로 처리되었다.

26 일째에 시작하여, 마지막 2 개 그룹의 마우스를 6 일 간격으로 본 발명의 OVA_PEP-SLNP @ CpG로 2 회 면역시키고, 2 번째 및 4 번째 그룹의 마우스는 2 일 간격으로 6번의 αPD-1 복강 내 주사를 맞았다.

비히클 대조군 만이 수일 내에 종양의 빠른 재성장을 나타냈고(도 54), 이는 종양 내 항원-특이적 T 세포의 소진으로 인해, 결과적으로 종양 재발을 제어할 수 없기 때문인 것으로 추정된다.

본 발명자들의 초기 예상과 달리, 소진된 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포를 다시 활력을 줄 것으로 예상되었던 αPD-1 단독은 종양 재성장을 거의 억제할 수 없었다. 왜냐하면 항원-특이적 T 세포는 단기간 활성만을 가지기 때문에, CTL 반응을 다시 부스팅하기 위해 추가적인 나노 백신이 필요했다. 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 단독 면역의 두 번째 주기는 종양 재성장을 부분적으로 억제하였지만, 그 효능은 비히클 대조군 또는 αPD-1 군과 비교하여 현저하게 다르지 않았으며, 이는 제1 면역화 주기 후 종양에서 높은 수준으로 PD-L1 발현이 유도되면 나노 백신을 이용한 제2 주기 면역화의 치료 결과가 불량하게 나타날 수 있음을 시사한다. 대조적으로, 본 발명의 OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신 + αPD-1의 제 2 사이클의 조합에 의해 종양 재성장이 효과적으로 억제되었다 (도 54-55).

이러한 결과는 복합 치료의 효과가 나노 백신 및 ICB 요법의 투여 순서 및 시기에 따라 다르다는 것을 시사한다.

즉, 나노 백신으로의 초기 면역화는 높은 종양 성장 억제를 야기 할 수 있지만 동시에 PD-L1의 종양 발현을 유도하여 항원-특이적 T 세포 고갈을 초래할 수 있다. 제 1주기 면역화에 대해 양호한 반응자에게 제 2주기의 나노 백신 면역화 + ICB의 조합으로 치료하는 경우 강력한 치료적 반응을 야기할 수 있다 (도 56).

토의(Discussion)

항원 및/또는 어주번트-전달 담체로서 나노 물질을 사용하는 암 나노 백신은 종양 항원-특이적 T 세포 면역을 유도 할 수 있고 생체 내 동물 모델에서 치료 방법으로서의 가능성을 보여 주었다. 또한, ICB 면역 요법과 암 나노 백신의 조합은 암 나노 백신의 항 종양 효능을 추가로 강화시킬 수 있다.

그러나, 독성 및 제조 가능성과 같은 항원 전달 나노 물질 자체와 관련된 문제, 및 암 백신에 대한 종양의 적응 저항성을 해결할 수 있는 최적의 백신 접종 요법의 부재는 암 나노 백신의 임상 적용을 방해하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 생체 적합성 지질 성분으로 만들어진 새로운 항원/어주번트-운반 나노 입자를 개발하였다. 이러한 나노 입자는 ICB 면역 요법과 병용하여, 예방적 및 치료적 종양 모델 둘 모두에서 매우 강력한 항종양 효능을 나타내었고, 종양 재발을 효과적으로 억제하는 양식의 순서 및 시점에 기초하여 새로운 치료 요법의 타당성을 입증하였다.

항원-전달 나노 물질과 관련된 독성의 결핍 및 나노 백신의 항 종양 효력은 성공적인 임상 적용을 위한 주요 요인이다. 본 발명은 생체 적합성 및 비 독성의 자연 발생 또는 합성 성분을 이용한 암 나노 백신의 구성에 관하여 개시하였다. 2 개의 생체적합성 및 비독성 중성-하전 인지질인, DOPE 및 DSPE-PEG₁₀₀₀은 임상적으로 이용 가능한 리포좀-기반 치료에 널리 사용되어 왔다. 본 발명자들은 이전 연구에서 양이온성 콜레스테롤 유도체인 MA-Chol은 siRNA 및 CpG ODN과 같은 올리고 뉴클레오티드와 안정적인 복합체를 형성할 수 있음을 보여주었다. MA-Chol은 에스테르 결합을 통해 내인성 아르기닌 및 콜레스테롤로부터 합성되기 때문에 생분해성이고 비독성이다. 실제로, 3 가지 생체적합성 및 비독성 성분 모두 CpG ODN과 함께 SLNP를 성공적으로 형성할 수 있었으며, 항원/어주번트-운반 나노 백신 (OVA_PEP-SLNP @ CpG)은 생리학적 배지에서 충분히 안정적이어서 국소 주사에 따라 국소 LN으로 직접 배출되었다. 이러한 결과는 SLNP가 암 나노 백신에 사용하기에 임상적으로 적합하다는 것을 나타낸다. 또한, 모델 종양 항원 (OVA_PEP)은 이황화 결합을 통해 SLNP 표면에 연결되어, 온전한 형태의 항원이 세포질 내에서 방출되고 APC의 MHC에 효과적으로 표시되었다. 실제로, OVA_PEP-SLNP@CpG 나노 백신은 시험 관내 및 생체 내 DC에 의해 효율적으로 흡수되어 MHC를 통해 DC 표면 상에 방출된 항원을 제시하였고, 이로 인해 항원에 대해 CD8⁺ T 세포를 효과적으로 교차-프라이밍 할 수 있었다. 본 실시예에서 사용된 실험 조건은 다른 나노 백신 시스템의 조건과 다를 수 있지만, OVA_PEP-SLNP@CpG의 항종양 효능은 예방적 종양 모델에서 6 마리 마우스 중 4 마리, 치료적 종양 모델에서 7 마리 마우스 중 2 마리에서 종양이 없었기 때문에 인상적이었다. 이러한 나노 백신의 효능은 항원-발현 E.G7 종양에 대해 강한 CTL 반응을 유도하는 능력 때문일 수 있다. OVA_PEP-SLNP@CpG는 생체적합성, 비독성 물질로 만들어졌으며 강력한 항종양 활성을 나타내므로, 치료적 암 나노 백신의 용도로 사용할 임상적 가능성이 있다.

종양의 암 백신에 대한 적응성 저항의 생성은 암 백신의 임상 적용을 중단시켰다. PD-L1 발현 및 종양 침윤 CD8⁺ T 세포의 공동국재화 (colocalization)는 적응성 면역 저항성과 밀접하게 관련되어 있다. 이 연구는 개별 E.G7 종양-보유 마우스의 나노 백신에 대한 치료 반응의 차이에 초점을 맞추었다. PD-L1의 종양 발현, CD8⁺ T 세포의 침윤, 및 말초 혈액에서 순환 OVA_PEP-특이적/PD-1 + CD8⁺ T 세포의 비율은 불량한 반응자 및 백신 접종되지 않은 대조군에서보다 양호한 반응자에서 유의하게 더 높았다. 이는 양호한 반응자들이 'cold tumor' 보다 ICB 요법에 더 나은 반응을 보이는 'hot tumor'로 간주될 수 있음을 시사한다. 다른 한편으로, 이러한 발견은 또한 양호한 반응자가 나노 백신에 대한 적응성 저항을 일으켜, 적절히 치료하지 않으면 종양 재발을 유발한다는 것을 나타냈다. 따라서, 양호한 반응자만이 나노 백신과 ICB 요법의 조합으로 치료되었다. 각 양식의 순서 및 타이밍을 변화시켜 치료 결과를 최대화하기 위한 노력이 이루어졌다. 백신 접종의 첫 번째 주기는 항원-특이적 T 세포 면역을 전신적으로 증가시키고 종양에서 PD-L1 발현을 유도하기 위해 수행되었다. 이어서, ICB 요법에 민감한 양호한 반응자들은 ICB 항체와 조합하여 두 번째 백신 접종으로 처리하였다. 그러나 αPD-1 단독으로 양호한 반응자를 처리하는 것은 종양 재성장을 억제하는데 전적으로 비효과적이었으며, 이는 추가 백신 접종이 제 1 면역화 주기로부터 유래된 항원-특이적 기억 T 세포를 재활성화시키기 위해 필요하다는 것을 시사한다. 또한, 두 번째 주기의 OVA_PEP-SLNP@CpG 백신 접종만으로 양호한 반응자를 치료하는 방법은 효과가 없었으며, 이는 종양에서 높은 PD-L1 유도에 의한 T 세포 고갈이 가능하다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 OVA_PEP-SLNP@CpG 백신 접종의 두 번째 주기와 αPD-1의 조합만이 치료 결과를 유의하게 향상시켜 종양 재성장 또는 재발의 효과적인 억제를 초래한다는 것을 발견했다. 이것은 ICB 항체에 의한 면역 억제의 역전과 함께, 제 2 백신 접종에 의한 항원-특이적 T 세포 반응의 재-증폭(re-boosting) 때문일 수 있다. 종합하면, 이러한 발견은 나노 백신 및 ICB 항체를 포함하는 병용 요법에서 각 양식의 치료 순서 및 타이밍의 중요성을 분명히 나타낸다.

높은 치료 잠재력에도 불구하고, 암 백신은 암 세포를 자극하여 면역 억제 분자를 생성하고 면역 조절 세포를 TME에 모집할 수 있다. 예를 들어, 백신-유도된 CD8⁺ T 세포는 PD-L1 및 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO) 발현을 상향 조절하고 전이성 흑색종의 모델에서 조절 T 세포 (Treg)를 동원하여 면역 억제를 유발하는 것으로 나타났다. 또한, 암 백신은 종양 침윤 CD8⁺ T 세포에서 NKG2A 억제성 수용체의 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 다양한 억제 및 면역 억제 분자의 존재에도 불구하고, 본 연구는 단지 하나의 억제 분자, PD-L1의 발현에 대한 나노 백신의 효과를 조사하였다. 따라서, 나노 백신에 의해 유도된 다른 면역 억제 분자 및 이들의 활성 메카니즘을 조사할 필요가 있다. 또한, 동일한 유전적 배경을 갖는 개별 마우스의 나노 백신에 대한 치료 반응의 차이에 대한 이유는 불분명하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 결과는 나노 백신을 포함하는 조합 면역 요법을 설계하는데 있어서 각 양식의 순서 및 타이밍의 중요성을 나타낸다. 비록 종양의 크기가 양호한 반응자와 불량한 반응자를 구별하는데 있어서 좋은 마커가 아닐 수는 있지만, 본 연구에서 제안된 순차적 조합 전략은 개인화된 요법에 대한 추가적인 임상적 평가를 필요로 한다. 종양 크기를 모니터링하기 위한 컴퓨터 단층 촬영 및 종양 활성을 모니터하기 위한 양전자 방출 단층 촬영과 같은 영상 양식은 양호한 반응자와 불량 반응자를 구별하는 기준이 될 수 있다.

결론적으로, 본 발명자들은 생체 적합성 및 비 독성 지질 성분으로 이루어진 새로운 유형의 항원/어주번트-운반 나노 백신을 개발 하였다. 이러한 나노 백신은 예방 및 치료적 종양 모델 둘 다에서 매우 강력한 항 종양 효능을 나타냈다. 또한, 치료 순서 및 시기에 따라 암 나노 백신 및 ICB 면역 요법으로 구성된 새로운 조합 치료 요법을 제안하였다. 이러한 프로토콜은 종양 성장 및 재발의 효과적인 억제를 포함하여 항종양 면역의 지속성을 향상시킬 수 있다. 이러한 발견은 추가적으로 다른 면역 요법 양식에서 이들 새로운 조합 치료 요법을 평가할 필요성을 시사한다.

Claims (12)

1. 종양-연관 항원, 인지질, 양이온성 지질, 및 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 지질 나노 입자에 있어서,
   상기 인지질은 i) DSPE-PEG 유도체; ii) DSPE-PEG 유도체 및 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE); iii) DSPE-PEG 유도체 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE); 또는 iv) DSPE-PEG 유도체, DSPE, 및 DOPE를 포함하고,
   상기 종양-연관 항원은 상기 DSPE-PEG 유도체에 접합되고 지질 나노 입자의 표면에 배향되며,
   상기 양이온성 지질은 양이온성 콜레스테롤 유도체이고,
   상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 상기 양이온성 지질과 정전기적 결합에 의해 결합된 것인, 지질 나노 입자.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 지방족 탄소수가 14 내지 22인 인지질인 것인, 지질 나노입자.
4. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질로 Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromide (DDAB), Dimethyldioctadecylammonium (DDAB), (N,N-dimethyl-N-([2-sperminecarboxamido]ethyl)-2,3-bis(dioleyloxy)-1-propaniminium pentahydrochloride) (DOSPA), (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium) (DOTMA), (N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium) (DOTAP), 3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol (DC-Chol), N4-Cholesteryl-Spermine (GL67), 1,2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane (DODMA), O-alkyl phosphatidylcholines 유도체, 및 dimethylammonium-propane (DAP) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 양이온성 지질을 추가적으로 포함하는 것인, 지질 나노 입자.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 콜레스테롤 유도체는 Monoarginine-cholesterol (MA-Chol)인 것인, 지질 나노 입자.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 지질 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 백신 조성물.
10. 삭제
11. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 지질 나노 입자를 제1차 백신 조성물로 포함하고;
    상기 지질 나노 입자 및 면역관문 억제제를 제2차 백신 조성물로 포함하는 암 백신 키트에 있어서,
    상기 지질 나노 입자를 포함하는 제1차 백신 조성물이 투여된 후, 상기 지질 나노입자 및 면역관문 억제제를 포함하는 제2차 백신 조성물이 투여되는 것인, 암 백신 키트.
12. 제11항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인, 암백신 키트.
    

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