KR102421648B1

KR102421648B1 - Method for extracting nucleic acid from sample rich in ribonuclease

Info

Publication number: KR102421648B1
Application number: KR1020200167517A
Authority: KR
Inventors: 박기범
Original assignee: 주식회사 인바이러스테크
Priority date: 2020-10-08
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-07-18
Also published as: KR20220047115A

Abstract

본 발명은 고추 등 RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법 및 이에 사용되는 버퍼 조성물에 관한 것이다. 상기 핵산의 추출 방법은 구아니딘염산(Gu-HCl)을 포함하는 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 염화소듐(NaCl)을 포함하는 제3 버퍼를 혼합하는 단계; Tris-HCl을 포함하는 제1 버퍼를 혼합하는 단계; 및 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하는 제2 버퍼를 혼합하는 단계를 포함한다.The present invention relates to a method for extracting nucleic acids from a sample rich in RNA-degrading enzymes, such as red pepper, and a buffer composition used therefor. The nucleic acid extraction method comprises: mixing a fourth buffer containing guanidine hydrochloride (Gu-HCl) with the sample; mixing a third buffer containing sodium chloride (NaCl); mixing a first buffer containing Tris-HCl; and mixing a second buffer containing sodium dodecyl sulfate (SDS).

Description

RNA 분해효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법{METHOD FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID FROM SAMPLE RICH IN RIBONUCLEASE}Method for extracting nucleic acids from samples rich in RNA-degrading enzymes

본 발명은 시료로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 RNA 분해효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법 및 이에 사용되는 시약에 관한 것이다.The present invention relates to a method for extracting nucleic acids from a sample. In particular, the present invention relates to a method for extracting a nucleic acid from a sample richly containing RNA degrading enzyme and a reagent used therein.

핵산(nucleic acid)은 뉴클레오티드(nucleotide)라는 단위체로 구성된 중합체로서 생체 분자의 일종이다. 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid)와 RNA(ribonucleic acid)로 대별될 수 있다. Nucleic acid is a type of biomolecule as a polymer composed of units called nucleotides. Nucleic acids may be roughly classified into deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA).

핵산이 가진 유전 정보는 핵산의 염기 서열에 포함되어 있고, 생합성 과정을 통해 단백질의 형태로 발현된다. 그리고 발현된 단백질이나 효소는 세포의 성장, 유지 및 분열 등에 중요한 역할을 하기 때문에 서로 다른 생명체는 DNA와 RNA의 염기서열 조합이 다를 수 있다. 또한 같은 생명체라 하더라도 외부 환경 조건, 영양상태, 병원체 감염 유무, 발달 단계, 조직 분화, 생장 상태 등에 따라 유전자의 발현 양상이 달라질 수 있다. The genetic information of a nucleic acid is contained in the nucleotide sequence of the nucleic acid and is expressed in the form of a protein through the biosynthesis process. In addition, since the expressed protein or enzyme plays an important role in cell growth, maintenance, and division, different organisms may have different combinations of DNA and RNA sequences. Also, even in the same organism, the expression pattern of genes may vary depending on external environmental conditions, nutritional status, presence or absence of pathogen infection, developmental stage, tissue differentiation, growth status, etc.

이 때 달라지는 유전자의 발현 양상은 RNA 발현양, 유전자 발현량, gene expression pattern, RNA transcription level, RNA 전사량 변화, 전사체 프로파일 등으로 표현될 수 있다. 이러한 이유로 특정 생물종을 분자생물학적 도구를 통해 생명의 원리, 감염 유무, 시약의 테스트 등을 수행할 때 기본적으로 처음 수행되는 것이 RNA 또는 DNA를 시료에서 정제하는 것이다. In this case, the different gene expression patterns may be expressed as RNA expression levels, gene expression levels, gene expression patterns, RNA transcription levels, changes in RNA transcription levels, transcript profiles, and the like. For this reason, the first thing that is basically performed is to purify RNA or DNA from a sample when a specific biological species is tested for the principle of life, infection, and reagent through molecular biological tools.

일반적으로 정제된 DNA는 functional genomics 연구에 활용되며 또는 DNA의 특정 부위. 예를 들어 COI barcode, ITS barcode, ribosomal RNA sequencing 등을 통해 정제된 DNA의 서열을 확보하고 Genbank 등의 public database와 1:1 비교를 통해 생물종동정(biological identification)에 활용될 수 있다. 이외에도 정제된 DNA는 유전자 조작 등 다양한 분자생물학적 기초연구의 핵심 기초재료로 사용된다. In general, purified DNA is used for functional genomics studies or specific regions of DNA. For example, the DNA sequence purified through COI barcode, ITS barcode, ribosomal RNA sequencing, etc. can be obtained and used for biological identification through 1:1 comparison with public databases such as Genbank. In addition, purified DNA is used as a core basic material for various basic molecular biology studies such as genetic manipulation.

정제된 RNA는 Reverse transcription을 통해 complement DNA로 합성될 수 있으며 이렇게 합성된 DNA는 cDNA library로 명하기도 한다. cDNA는 방법과 절차에 따라 specific primer만 사용하는 1^st RT-PCR법으로 준비될 수도 있으며, 10-20 mer 사이의 oligo dT 또는 5~20 mer 사이의 random sequence를 사용하여 cDNA library를 구축할 수 있다. 이렇게 합성된 cDNA library로 PCR을 수행할 경우 two step RT-PCR 과정이라고 말한다. 이와 같은 과정을 통해 합성된 DNA는 taq polymerase와 sequence specific DNA oligo를 이용하여 taq polymerase의 고유한 특성인 polymerase chain reaction을 통해 특정 염기서열의 DNA를 지수함수적으로 증폭할 수 있다. 이러한 원리를 통해 증폭된 DNA의 양을 실시간으로 추적하여 유전자의 발현량을 추정하는 quantitative real-time PCR과 유전자 발현 상대정량법이 개발되어 전세계적으로 널리 사용하고 있다. Purified RNA can be synthesized into complement DNA through reverse transcription, and the synthesized DNA is also called cDNA library. cDNA can also be prepared by ^1st RT-PCR using only specific primers depending on methods and procedures, and cDNA libraries can be constructed using oligo dT between 10-20 mers or random sequences between 5-20 mers. have. When PCR is performed with this synthesized cDNA library, it is said to be a two-step RT-PCR process. DNA synthesized through this process can exponentially amplify DNA of a specific nucleotide sequence through polymerase chain reaction, which is a unique characteristic of taq polymerase, using taq polymerase and sequence specific DNA oligo. Through this principle, quantitative real-time PCR and gene expression relative quantitation, which track the amount of amplified DNA in real time to estimate the amount of gene expression, have been developed and are widely used worldwide.

또한 PCR의 고유 현상인 특정 서열의 특이적 증폭 원리를 기반으로 증폭된 DNA를 감염된 시료, 또는 비감염된 시료와 비교함으로써 유전학적 질병의 진단이나 또는 세균, 바이러스 등의 감염성 질환 진단에 이용할 수 있다. 이와 같이 PCR 기법은 현대생물학의 기초적이며 가장 핵심적인 연구 도구이며 현재 유전 물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에서 사용하는 방법이다. In addition, by comparing the amplified DNA based on the principle of specific amplification of a specific sequence, which is a unique phenomenon of PCR, with an infected or uninfected sample, it can be used for diagnosis of genetic diseases or for diagnosing infectious diseases such as bacteria and viruses. As such, the PCR technique is a basic and most essential research tool in modern biology, and is currently used in almost all processes of manipulating and experimenting with genetic material.

대한민국 등록특허 제10-0486179호, 2005.05.03., 핵산을 분리하고 정제하기 위한 세포 용해 조성물, 방법 및 키트Republic of Korea Patent No. 10-0486179, 2005.05.03., Cell lysis composition, method and kit for isolating and purifying nucleic acids 미국 등록특허 제5,234,809호, 1993.08.10., Process for isolating nucleic acidU.S. Patent No. 5,234,809, August 10, 1993, Process for isolating nucleic acid 대한민국 등록특허 제10-2094079호, 2020.03.27., 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 RNA 추출 방법Republic of Korea Patent No. 10-2094079, 2020.03.27., Composition for extracting viral RNA using silica-coated magnetic beads and RNA extraction method using the same

Aranda, P. S., LaJoie, D. M., & Jorcyk, C. L. (2012). Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis, 33(2), 366-369. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., & Jorcyk, C. L. (2012). Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis, 33(2), 366-369.

전술한 것과 같이 PCR 기법은 매우 강력한 도구이기는 하나, PCR의 핵심요소인 DNA polymerase와 RNA를 cDNA로 합성하는 reverse transcriptase는 기능을 갖는 단백질 효소이므로 효소를 저해하는 인자인 저해제에 민감하게 반응한다. 이들 저해제는 농도 의존적으로 효소의 활성을 저해하기 때문에 성공적인 PCR 실험을 위해선 모든 과정에서 저해제가 낮은 농도로 유지되어야 한다. As described above, although the PCR technique is a very powerful tool, DNA polymerase, which is a key element of PCR, and reverse transcriptase, which synthesizes RNA into cDNA, are protein enzymes having a function, so they react sensitively to inhibitors, which are factors that inhibit the enzyme. Since these inhibitors inhibit enzyme activity in a concentration-dependent manner, the inhibitor must be maintained at a low concentration in all processes for a successful PCR experiment.

특수한 실험이 아닌 이상 저해제는 효소 반응 직전에 포함된 정제된 RNA 산물 또는 DNA 산물에 포함되어 있고, 최초 시료로부터 추출된 핵산의 품질에 따라 진단 및 실험 결과가 크게 좌우되기 때문에 보다 정확한 PCR 과정을 위해서는 고품질의 핵산을 추출하는 것이 무엇보다 중요하다.Unless it is a special experiment, the inhibitor is contained in the purified RNA product or DNA product included immediately before the enzymatic reaction, and the quality of the nucleic acid extracted from the initial sample greatly affects the diagnosis and test results. Extracting high-quality nucleic acids is of paramount importance.

핵산을 추출하는 방법은 시료의 세포벽을 파괴하고 그 내부의 핵산을 용출시키며 핵산 외 불순물을 걸러내는 것을 기본으로 한다. 핵산 추출에 사용되는 시약은 주로 카오트로픽염(chaotropic salt)을 포함하는 제품군과 페놀, 클로로포름 등을 포함하는 제품군으로 대별될 수 있다.The method of extracting nucleic acids is based on destroying the cell wall of the sample, eluting the nucleic acids therein, and filtering out impurities other than nucleic acids. Reagents used for nucleic acid extraction can be roughly divided into a product group containing mainly chaotropic salts and a product group containing phenol, chloroform, and the like.

카오트로픽염 기반 제품은 단백질 분자 주변의 수분을 강하게 빼앗아 단백질을 변형시키는 원리를 기반으로 RNA 분해 효소를 불활성화시킴으로서 고품질의 RNA를 추출할 수 있다. 반면 페놀 기반 제품은 단백질 용해능을 이용하여 RNA와 단백질을 분리하고, 클로로포름을 이용하여 RNA층과 단백질층을 분리함으로써 고품질의 RNA를 추출할 수 있도록 한다.Chaotropic salt-based products can extract high-quality RNA by inactivating RNA-degrading enzymes based on the principle of transforming proteins by strongly stealing moisture around protein molecules. On the other hand, phenol-based products use protein dissolving ability to separate RNA and protein, and use chloroform to separate RNA and protein layers to extract high-quality RNA.

현재 퀴아젠社의 핵산 추출 키트가 보편적으로 이용되고 있다. 퀴아젠社의 핵산 추출 키트는 실험실 수준에서 불특정 시료를 대상으로 1차적으로 적용 가능한 범용 키트(universal kit)이다.Currently, Qiagen's nucleic acid extraction kit is commonly used. Qiagen's nucleic acid extraction kit is a universal kit that can be applied primarily to unspecified samples at the laboratory level.

그러나 전술한 것과 같이 가능한 높은 수준의 분자 진단 검사 결과를 요구하는 산업 분야에서, 특히 감염병의 진단 분야에 있어서, 검사 결과의 신뢰성과 정확성을 높이고 검사에 소요되는 인력과 시간을 단축시키기 위해서는 고품질의 핵산을 추출하는 것이 무척 중요하다. However, as described above, in the industrial field that requires molecular diagnostic test results as high as possible, especially in the field of diagnosis of infectious diseases, in order to increase the reliability and accuracy of the test results and reduce the manpower and time required for the test, high-quality nucleic acid It is very important to extract

특히 시료가 동물인지 식물인지에 따라, 또한 같은 식물이라 하더라도 식물들의 생물학적 특징, 예컨대 잎 또는 조직에 고농도로 존재하는 2차 대사 산물에 의해 핵산의 추출 효율은 전혀 달라질 수 있다. In particular, depending on whether the sample is an animal or a plant, and even in the same plant, the extraction efficiency of the nucleic acid may be completely different due to the biological characteristics of the plants, for example, secondary metabolites present in high concentrations in leaves or tissues.

다른 예를 들어, 동일한 검출 버퍼(또는 시약)를 이용하여 동일한 방법으로 핵산을 추출하는 경우에도, 어느 시료를 대상으로는 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 반면, 다른 시료를 대상으로는 그렇지 못하거나, 심지어 또 다른 시료를 대상으로는 핵산이 전혀 추출되지 않을 수도 있다.For another example, even when nucleic acids are extracted by the same method using the same detection buffer (or reagent), high-quality nucleic acids can be extracted from one sample, but not from another sample. , even in another sample, nucleic acids may not be extracted at all.

한편, 식물은 800종이 넘는 바이러스에 노출 및 감염되는 것으로 알려져 있다. 특히 식물은 동물과 다르게 바이러스 감염병에 대한 치료가 실질적으로 곤란하기 때문에 한번 감염되면 해당 지역을 폐쇄할 수 밖에 없는 문제가 있다. 반면 최근 식용 작물의 수출 및 수입 시장 규모가 확대됨에 따라 어느 지역에서 발생한 작물 병해가 타지역으로 확대되는 일이 빈번해지고 있다. 이러한 이유로 각국 정부에서는 수출입물을 대상으로 꼼꼼한 검역을 수행하여 바이러스에 감염된 작물로 인한 피해 확대를 예방하고 있으나, 진단 결과의 모호성 등으로 인해 검역 진단에 소요되는 기간이 짧지 않은 실정이다.On the other hand, plants are known to be exposed to and infected with over 800 viruses. In particular, unlike animals, plants have a problem in that they have no choice but to close the area once infected because it is practically difficult to treat viral infections. On the other hand, as the size of the export and import market of edible crops has recently expanded, crop diseases that have occurred in one region are frequently expanding to other regions. For this reason, governments of each country conduct meticulous quarantine on imports and exports to prevent damage from crops infected with the virus, but the period required for quarantine diagnosis is not short due to ambiguity in the diagnosis results.

식물은 생물학적 특징으로 인해 동물에 비해 상대적으로 다양한 DNA 및 RNA 추출 저해 성분을 풍부하게 포함하고 있으며, 상대적으로 고품질의 핵산 추출이 쉽지 않다. 그리고 그 결과, 진단에 소요되는 시간과 비용 상승을 초래할 수 있으며, 잘못된 음성판정 또는 실험 결과를 도출하게 된다. Plants contain relatively diverse DNA and RNA extraction inhibitory components compared to animals due to their biological characteristics, and relatively high-quality nucleic acid extraction is not easy. And, as a result, it may lead to an increase in the time and cost required for diagnosis, and an erroneous negative judgment or experimental result is derived.

이러한 현상이 수십억 원 규모로 거래되는 농작물의 수출입 검역 과정에서 발생한다면 잘못된 음성결과로 인해 수입대상국 또는 수출대상국에서 바이러스 감염을 이유로 모든 농작물을 임의 폐기처분을 할 수 있으며, 이는 책임소재에 따라 국내에 경제적인 피해를 입힐 수 있는 문제이다.If this phenomenon occurs in the process of import/export quarantine of crops traded in billions of won, due to false negative results, the importing country or exporting country may arbitrarily discard all crops due to virus infection. It is a problem that can cause economic damage.

일반적으로 잘 알려진 핵산 추출 버퍼를 이용하여 RNA 분해 효소를 매우 풍부하게 함유하는 시료로부터 고품질의 핵산을 추출 및 회수하는 것은 곤란한 실정이다. 식물 중에서도, 특히 RNA 분해 효소를 풍부하게 함유하는 시료로는 고추, 피망 등의 작물, 이들의 열매, 이들의 줄기, 이들의 뿌리 및/또는 이들의 잎을 예시할 수 있다.In general, it is difficult to extract and recover high-quality nucleic acids from a sample containing a very rich RNA-degrading enzyme using a well-known nucleic acid extraction buffer. Among plants, crops such as red pepper and green pepper, their fruits, their stems, their roots, and/or their leaves can be exemplified as samples particularly rich in RNA-degrading enzymes.

이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for extracting high-quality nucleic acids from a sample rich in RNA-degrading enzymes.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to provide a reagent or buffer capable of extracting high-quality nucleic acids from a sample rich in RNA-degrading enzymes.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to provide a kit including a reagent or buffer capable of extracting high-quality nucleic acids from a sample richly containing RNA-degrading enzymes.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problems of the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법은 구아니딘염산(Gu-HCl)을 포함하는 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 염화소듐(NaCl)을 포함하는 제3 버퍼를 혼합하는 단계; Tris-HCl(트리스(히드록시메틸)아미노메테인-HCl)을 포함하는 제1 버퍼를 혼합하는 단계; 및 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하는 제2 버퍼를 혼합하는 단계를 포함한다.The method for extracting nucleic acids according to an embodiment of the present invention for solving the above problems comprises the steps of: mixing a fourth buffer containing guanidine hydrochloride (Gu-HCl) with a sample; mixing a third buffer containing sodium chloride (NaCl); mixing a first buffer comprising Tris-HCl (tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl); and mixing a second buffer containing sodium dodecyl sulfate (SDS).

상기 단계들은 순차적으로 이루어질 수 있다.The steps may be performed sequentially.

몇몇 실시예에서, 상기 제1 버퍼를 혼합하는 단계와 상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계 사이에, 상기 제4 버퍼를 추가로 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.In some embodiments, the method may further include mixing the fourth buffer between the mixing of the first buffer and the mixing of the second buffer.

상기 제1 버퍼는, 0.8M 내지 1.2M의 Tris-HCl을 포함할 수 있다.The first buffer may include 0.8M to 1.2M Tris-HCl.

또 상기 제1 버퍼는 20mM 내지 30mM의 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v)의 메타중아황산소듐(sodium metabisulfite), 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 또는 황산나트륨, 및 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.In addition, the first buffer is 20mM to 30mM of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.3% (w / v) to 0.7% (w / v) of sodium metabisulfite (sodium metabisulfite), sodium sulfite, Acid sodium sulfite or sodium sulfate, and 1.8% (w/v) to 2.2% (w/v) of polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone or polyethylene glycol may be further included.

상기 제2 버퍼는, 3%(w/v) 내지 8%(w/v)의 SDS를 포함할 수 있다.The second buffer may include 3% (w/v) to 8% (w/v) SDS.

또 상기 제2 버퍼는 20mM 내지 30mM의 EDTA, 120mM 내지 180mM의 소듐시트레이트(sodium citrate), 및 15mM 내지 25mM의 Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.In addition, the second buffer may further include 20 mM to 30 mM EDTA, 120 mM to 180 mM sodium citrate, and 15 mM to 25 mM Tris-HCl.

상기 제3 버퍼는, 4.2M 내지 4.8M의 염화소듐을 포함할 수 있다.The third buffer may include 4.2M to 4.8M sodium chloride.

또 상기 제3 버퍼는 80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄, 및 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.In addition, the third buffer is 80mM to 120mM of potassium chloride, calcium chloride, ferric chloride, ferrous chloride, ammonium aluminum or ammonium sulfate, and 1.8% (w / v) to 2.2% (w / v) of polyvinyl p. Rollidone, polyvinyl polypyrrolidone or polyethylene glycol may be further included.

상기 제4 버퍼는, 3.5M 내지 4.5M의 구아니딘염산을 포함할 수 있다.The fourth buffer may include 3.5M to 4.5M guanidine hydrochloride.

또 상기 제4 버퍼는 10mM 내지 20mM의 Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.In addition, the fourth buffer may further include 10 mM to 20 mM Tris-HCl.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제3 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다.The volume ratio of the fourth buffer and the third buffer that are initially mixed may be 1:1.1 to 1:1.2.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제1 버퍼의 사용 부피비는 1:0.6 내지 1:0.8일 수 있다.A volume ratio of the fourth buffer and the first buffer that are initially mixed may be 1:0.6 to 1:0.8.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제2 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다.A volume ratio of the fourth buffer and the second buffer that are initially mixed may be 1:1.1 to 1:1.2.

상기 제4 버퍼의 최초 사용 부피는 350㎕ 내지 450㎕일 수 있다.The first used volume of the fourth buffer may be 350 μl to 450 μl.

몇몇 실시예에서, 최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 이후에 혼합되는 상기 제4 버퍼의 혼합비는 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다.In some embodiments, a mixing ratio of the fourth buffer initially mixed and the fourth buffer mixed thereafter may be 1:0.9 to 1:1.1.

상기 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계는, 상기 제4 버퍼, 상기 시료 및 환원제 40㎕ 내지 60㎕를 혼합하는 단계, 및 상기 시료를 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다.Mixing the fourth buffer with the sample may include mixing 40 μl to 60 μl of the fourth buffer, the sample, and a reducing agent, and crushing the sample.

여기서 상기 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 0.3M 내지 0.7M의 TCEP-HCl 또는 0.8M 내지 1.2M의 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다.Here, the reducing agent may include β-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol), 0.3M to 0.7M of TCEP-HCl, or 0.8M to 1.2M of dithiothreitol (DTT).

또, 상기 제4 버퍼와 상기 환원제의 사용 부피비는 1:0.08 내지 1:0.15일 수 있다.In addition, the volume ratio of the fourth buffer and the reducing agent used may be 1:0.08 to 1:0.15.

몇몇 실시예에서, 상기 제3 버퍼를 혼합한 후 상기 제1 버퍼를 혼합하기 전에, 혼합물을 55℃ 내지 65℃에서 2분 내지 8분 배양하는 제1 배양 단계; 상기 제1 버퍼를 혼합한 후, 혼합물을 원심 분리하는 제1 원심 분리 단계; 상기 제1 원심 분리 단계 후, 혼합물을 30초 내지 5분 배양하는 제2 배양 단계; 상기 제2 버퍼를 혼합한 후, 혼합물을 30초 내지 5분 배양하는 제3 배양 단계; 상기 제3 배양 단계의 배양물을 원심 분리하는 제2 원심 분리 단계; 상기 제2 원심 분리 단계의 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계를 더 포함할 수 있다.In some embodiments, after mixing the third buffer, before mixing the first buffer, a first incubation step of incubating the mixture at 55 ° C. to 65 ° C. for 2 minutes to 8 minutes; a first centrifugation step of centrifuging the mixture after mixing the first buffer; After the first centrifugation step, a second culturing step of incubating the mixture for 30 seconds to 5 minutes; After mixing the second buffer, a third incubation step of incubating the mixture for 30 seconds to 5 minutes; a second centrifugation step of centrifuging the culture of the third culturing step; The method may further include mixing the supernatant of the second centrifugation step and isopropanol and loading the mixture into the column.

상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계는, 제1 원심 분리 단계의 상층액, 또는 제1 원심 분리 단계의 상층액의 배양물과 상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.The mixing of the second buffer may include mixing the culture of the supernatant of the first centrifugation step or the supernatant of the first centrifugation step and the second buffer.

몇몇 실시예에서, 이소프로판올 및 염화소듐을 포함하는 제5 버퍼로 컬럼을 세척하는 제1 세척 단계; 에탄올, Tris-HCl 및 구아니딘-염산을 포함하는 제6 버퍼로 컬럼을 세척하는 제2 세척 단계; 및 에탄올 및 Tris-HCl을 포함하는 제7 버퍼로 컬럼을 세척하는 제3 세척 단계; 및 핵산을 회수하는 단계를 순차적으로 더 포함할 수 있다.In some embodiments, a first washing step of washing the column with a fifth buffer comprising isopropanol and sodium chloride; a second washing step of washing the column with a sixth buffer containing ethanol, Tris-HCl and guanidine-hydrochloric acid; and a third washing step of washing the column with a seventh buffer containing ethanol and Tris-HCl; And it may further include sequentially recovering the nucleic acid.

상기 시료는, 고추 또는 피망을 포함하는 과수작물로부터 유래한 것일 수 있다.The sample may be derived from an orchard including red pepper or green pepper.

상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 복수의 버퍼를 포함하는 키트는, 제1 버퍼, 제2 버퍼, 제3 버퍼 및 제4 버퍼를 포함하는 복수의 버퍼를 포함하는 키트로서, 상기 제4 버퍼와 환원제를 혼합하여 시료를 파쇄하고, 상기 제1 버퍼 내지 상기 제3 버퍼를 추가로 혼합한 후, 이소프로판올을 혼합하여 컬럼에 로딩하고, 적어도 하나의 세척 버퍼를 이용하여 세척하도록 구성된다.A kit including a plurality of buffers according to an embodiment of the present invention for solving the other problem is a kit including a plurality of buffers including a first buffer, a second buffer, a third buffer and a fourth buffer. , The fourth buffer and the reducing agent are mixed to disrupt the sample, the first buffer to the third buffer are further mixed, and then isopropanol is mixed to load the column, and at least one wash buffer is used to wash the sample. is composed

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다. Details of other embodiments are included in the detailed description.

본 발명의 실시예들에 따르면, RNA 분해 효소를풍부하게 함유하는 시료, 예를 들어 식물 시료, 더 구체적인 예를 들어 고추, 피망 등의 작물로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있다. According to embodiments of the present invention, it is possible to extract high-quality nucleic acids from a sample richly containing RNA-degrading enzyme, for example, a plant sample, more specifically, from crops such as red pepper and green pepper.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.Effects according to the embodiments of the present invention are not limited by the contents exemplified above, and more various effects are included in the present specification.

도 1은 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.
도 3은 실시예 2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 실시예 3에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 비교예 1-1에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은 비교예 1-2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7 및 도 8은 비교예 2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 비교예 3들에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 10은 비교예 4에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 11은 비교예 5에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 12는 비교예 6들에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 13은 비교예 7에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 14 내지 도 16은 실험예 1에 따라 측정한 핵산의 순도 등을 나타낸 이미지들이다.
도 17은 실험예 2에 따른 증폭 곡선 및 융해 곡선을 나타낸 이미지들이다.1 and 2 are flowcharts illustrating a method for extracting nucleic acids according to an embodiment of the present invention.
3 is an image showing the result of extracting nucleic acids according to Example 2 and electrophoresis.
4 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Example 3.
5 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 1-1.
6 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 1-2.
7 and 8 are images showing the results of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 2.
9 is an image showing the results of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Examples 3;
10 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 4.
11 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 5;
12 is an image showing the results of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Examples 6.
13 is an image showing the result of nucleic acid extraction and electrophoresis according to Comparative Example 7.
14 to 16 are images showing the purity of nucleic acids measured according to Experimental Example 1.
17 is an image showing an amplification curve and a melting curve according to Experimental Example 2.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described below in detail in conjunction with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in various different forms, and only the embodiments allow the disclosure of the present invention to be complete, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. It is provided to fully inform the person of the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims. That is, various changes may be made to the embodiments presented by the present invention. It should be understood that the embodiments described below are not intended to limit the embodiments, and include all modifications, equivalents, and substitutions thereto.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used herein may be used with the meaning commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. In addition, terms defined in a commonly used dictionary are not to be interpreted ideally or excessively unless clearly defined in particular.

본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.In this specification, 'and/or' includes each and every combination of one or more of the mentioned items. The singular also includes the plural, unless the phrase specifically states otherwise. As used herein, 'comprises' and/or 'comprising' does not exclude the presence or addition of one or more other components in addition to the stated components. Numerical ranges indicated using 'to' indicate numerical ranges including the values stated before and after them as the lower and upper limits, respectively. 'About' or 'approximately' means a value or numerical range within 20% of the value or numerical range recited thereafter.

본 명세서에서 사용되는 용어 '버퍼(buffer)' 또는 '시약'은 핵산의 추출 과정에서 첨가되거나, 혼합되거나, 추가되는 물질을 의미하며, 완충용액의 의미에 제한되는 것은 아니다. 용어 '버퍼'와 '시약'은 혼용될 수 있다.As used herein, the term 'buffer' or 'reagent' refers to a material that is added, mixed, or added during the extraction of nucleic acids, and is not limited to the meaning of a buffer solution. The terms 'buffer' and 'reagent' may be used interchangeably.

본 명세서에서 사용되는 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 갖는 핵산 서열로, 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base fair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 핵산 서열을 의미한다. As used herein, the term 'primer' is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template of the nucleic acid, and the template strand refers to a nucleic acid sequence that serves as a starting point for copying.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

제1 버퍼 조성물first buffer composition

제1 버퍼 조성물은 시료의 산성 또는 염기성의 pH를 약 7.0의 중성으로 중화시키고 시료의 항산화 물질의 산화과정을 억제할 수 있다. 예를 들어, 주요 항산화인자인 폴리페놀이 산화하며 발생하는 ROS, quinone 등이 발생하지 않도록 고안된 버퍼일 수 있고 또는 폴리페놀을 흡착하여 핵산과 화학적으로 반응하지 않도록 방해하는 목적일 수 있다. 또, 제1 버퍼 조성물은 bead beating 같은 고열이 발생하는 균질과정에서 시료의 온도가 급격히 올라가지 않도록 방지하는 균질화 용액으로 기능할 수 있다.The first buffer composition may neutralize the acidic or basic pH of the sample to a neutral value of about 7.0 and inhibit the oxidation process of the antioxidant material of the sample. For example, it may be a buffer designed to prevent ROS, quinone, etc. generated by oxidation of polyphenols, which are major antioxidant factors, or it may be for the purpose of adsorbing polyphenols and preventing them from chemically reacting with nucleic acids. In addition, the first buffer composition may function as a homogenizing solution that prevents the temperature of the sample from rising rapidly during a homogenization process in which high heat such as bead beating occurs.

제1 버퍼 조성물은 Tris-HCl(Tris 완충용액)을 포함하고, 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 메타중아황산소듐(sodium metabisulfite), 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)을 더 포함할 수 있다.The first buffer composition contains Tris-HCl (Tris buffer solution), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sodium metabisulfite, and polyvinyl pyrrolidone further may include

Tris-HCl의 농도는 약 0.8M 내지 1.2M, 또는 약 0.9M 내지 1.1M일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 6.9 내지 7.1, 또는 약 7.0일 수 있다. The concentration of Tris-HCl may be about 0.8M to 1.2M, or about 0.9M to 1.1M. The pH of Tris-HCl may be about 6.9 to 7.1, or about 7.0.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 감소하여 시료 균질 시 시료 내에서 유래한 산성 또는 염기성 물질에 의해 균질물의 pH가 급격히 변할 수 있다. 이러한 경우 추출 목적물인 핵산의 품질 또는 수율이 급격히 감소할 수 있다. 반면 Tris-HCl의 함량이 너무 많으면 삼투압이 증가하여 원하지 않는 단계에서 내인성 RNAse, DNAase가 다량 방출되어 핵산의 수율이 감소할 수 있다.If the content of Tris-HCl is too small, the buffering effect is reduced, and the pH of the homogenate may change rapidly due to acidic or basic substances derived from the sample during homogenization of the sample. In this case, the quality or yield of the nucleic acid to be extracted may be drastically reduced. On the other hand, if the content of Tris-HCl is too large, the osmotic pressure may increase, resulting in the release of a large amount of endogenous RNAse and DNAase in an undesired stage, thereby reducing the yield of nucleic acids.

또, EDTA의 농도는 약 20mM 내지 30mM, 또는 약 22mM 내지 28mM, 또는 약 24mM 내지 26mM일 수 있다.In addition, the concentration of EDTA may be about 20mM to 30mM, or about 22mM to 28mM, or about 24mM to 26mM.

EDTA의 함량이 너무 적으면 DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 반대로 EDTA의 함량이 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.If the content of EDTA is too small, DNA extraction efficiency may be lowered because DNAse activity cannot be reduced. Conversely, if the content of EDTA is too large, the pH of the composition may rise and the pH buffering effect of the original purpose may be lost.

몇몇 실시예에서, Tris-HCl과 EDTA의 몰(mol) 비는 약 35:1 내지 45:1, 또는 약 36:1 내지 44:1, 또는 약 37:1 내지 43:1, 또는 약 38:1 내지 42:1, 또는 약 39:1 내지 41:1, 또는 약 40:1일 수 있다.In some embodiments, the molar ratio of Tris-HCl to EDTA is about 35:1 to 45:1, or about 36:1 to 44:1, or about 37:1 to 43:1, or about 38: 1 to 42:1, or about 39:1 to 41:1, or about 40:1.

메타중아황산소듐의 농도는 약 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 또는 약 0.4%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 또는 약 0.5%(w/v) 내지 0.6%(w/v)일 수 있다. 본 명세서에서, 다르게 정의되지 않는 한 용액 중의 % 농도는 %(w/v, weight/volume)을 의미한다.The concentration of sodium metabisulfite is about 0.3% (w/v) to 0.7% (w/v), or about 0.4% (w/v) to 0.6% (w/v), or about 0.5% (w/v) ) to 0.6% (w/v). In this specification, unless otherwise defined, % concentration in solution means % (w/v, weight/volume).

메타중아황산소듐의 함량이 너무 적으면 폴리페놀의 산화를 방지하지 못해 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아지며, 너무 많으면 이후 버퍼인 용해버퍼의 용해력을 감소시켜 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아질 수 있다.If the content of sodium metabisulfite is too small, it cannot prevent the oxidation of polyphenols, so the extraction efficiency of RNA and DNA is lowered.

다른 실시예에서, 메타중아황산소듐 대신에, 또는 추가로 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 및/또는 황산나트륨을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 메타중아황산소듐, 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 및 황산나트륨의 함량의 합은 전술한 농도 내에 있을 수 있다.In other embodiments, sodium sulfite, sodium sulfite acid and/or sodium sulfate may be further included in place of, or in addition to, sodium metabisulfite. In this case, the sum of the contents of sodium metabisulfite, sodium sulfite, acid sodium sulfite and sodium sulfate may be within the above-mentioned concentration.

폴리비닐피롤리돈의 농도는 약 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 또는 약 1.9%(w/v) 내지 2.1%(w/v), 또는 약 2.0%(w/v)일 수 있다. 다른 실시예에서, 폴리비닐피롤리돈 대신에, 또는 추가로 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜의 함량의 합은 전술한 농도 내에 있을 수 있다.The concentration of polyvinylpyrrolidone is about 1.8% (w/v) to 2.2% (w/v), or about 1.9% (w/v) to 2.1% (w/v), or about 2.0% (w/v) v) can be In another embodiment, instead of or in addition to polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone or polyethylene glycol may be further included. In this case, the sum of the contents of polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone or polyethylene glycol may be within the above-mentioned concentration.

폴리비닐피롤리돈(또는 폴리비닐폴리피롤리돈, 또는 폴리에틸렌글리콜)의 함량이 너무 적으면 폴리페놀의 흡착량이 적어져서 이후 침전 단계에서 폴리페놀을 효과적으로 제거할 수 없다. 이러할 경우 폴리페놀이 핵산과 반응하여 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아진다. 너무 많으면 용액의 점성이 증가하여 균질과정이 곤란해지며 이후 액체 조작 과정에서 난이도가 증가할 수 있다.If the content of polyvinylpyrrolidone (or polyvinylpolypyrrolidone, or polyethylene glycol) is too small, the adsorption amount of polyphenols decreases, so that the polyphenols cannot be effectively removed in the subsequent precipitation step. In this case, the polyphenol reacts with the nucleic acid, and the extraction efficiency of RNA and DNA decreases. If too much, the viscosity of the solution increases, making the homogenization process difficult, and the difficulty may increase in the subsequent liquid handling process.

몇몇 실시예에서, 메타중아황산소듐 등과 폴리비닐피롤리돈 등의 중량 비는 약 1:3.8 내지 1:4.2, 또는 약 1:3.9 내지 1:4.1, 또는 약 1:4일 수 있다.In some embodiments, the weight ratio of sodium metabisulfite to polyvinylpyrrolidone and the like may be about 1:3.8 to 1:4.2, or about 1:3.9 to 1:4.1, or about 1:4.

예시적인 실시예에서, 제1 버퍼 조성물은 구아니딘 염(guanidine salt), 페놀, 클로로포름, 이소아밀알콜(iso-amyl alcohol) 및/또는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyl trimethylammonium bromide, CTAB) 등의 양이온성 계면활성제를 불포함할 수 있다.In an exemplary embodiment, the first buffer composition is a cationic interface such as guanidine salt, phenol, chloroform, iso-amyl alcohol and/or cetyl trimethylammonium bromide (CTAB). It may contain no active agent.

후술할 바와 같이 제1 버퍼 조성물은 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 파쇄된 시료와 가장 먼저 혼합되는 버퍼일 수 있다. 이 때, 본 실시예에 따른 제1 버퍼 조성물은 구아니딘염을 불포함하여 폴리페놀과 다당류가 화학 반응하는 것을 미연에 방지할 수 있다. As will be described later, the first buffer composition may be a buffer that is first mixed with the crushed sample rich in polyphenols and/or polysaccharides. In this case, the first buffer composition according to the present embodiment does not contain a guanidine salt to prevent chemical reaction between polyphenols and polysaccharides in advance.

또, 페놀, 클로로포름 및/또는 이소아밀알콜과 같이 휘발성이 강하고, 인체에 유해한 물질을 불포함함으로써 핵산을 추출하는 작업자의 안전을 도모할 수 있고, 복잡한 설비를 갖추지 않고 상대적으로 마일드한 조건 하에서 안정적으로 작업을 수행할 수 있기 때문에 현장 진단용 키트로 구현하는 것이 가능하다. 또한 세틸트리메틸암모늄브로마이드를 불포함하기 때문에 액체 질소의 사용이 필수적이지 않을 수 있고, 에탄올 공침법을 사용하지 않아도 되므로 시료에 따라 선택적으로 액체 질소 또는 에탄올 공침법을 사용하지 않을 경우, 핵산의 추출 공정이 간단해지는 것은 물론, 액체 질소를 이용한 시료의 파쇄 및 균질화 과정에서 시료가 오염되는 문제를 방지할 수 있으며, 핵산 추출에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.In addition, since it does not contain substances that are highly volatile and harmful to the human body, such as phenol, chloroform and/or isoamyl alcohol, it is possible to promote the safety of workers extracting nucleic acids, and it does not have complicated facilities and is stable under relatively mild conditions. It can be implemented as a point-of-care kit because it can perform the task. In addition, since it does not contain cetyltrimethylammonium bromide, the use of liquid nitrogen may not be essential, and since it is not necessary to use the ethanol co-precipitation method, depending on the sample, the nucleic acid extraction process may be As well as simplifying, it is possible to prevent the problem of sample contamination in the process of crushing and homogenizing the sample using liquid nitrogen, and shortening the time required for nucleic acid extraction.

제1 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the first buffer composition

제1 버퍼 조성물은 Tris-HCl을 혼합하고, EDTA, 메타중아황산소듐 및 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The first buffer composition may be prepared by mixing Tris-HCl, and further mixing EDTA, sodium metabisulfite and polyvinylpyrrolidone or polyethylene glycol. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and replaceable substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제1 버퍼 조성물은 2M Tris-HCl(pH 7.0)을 25ml, 0.5M EDTA를 2.5ml, 메타중아황산나트륨(분말상)을 0.25g 및 폴리비닐피롤리돈(pH value 3.0 내지 5.0, 몰평균분자량 25,000 내지 35,000, 분말상) 1.0g을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제1 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the first buffer composition contains 25 ml of 2M Tris-HCl (pH 7.0), 2.5 ml of 0.5 M EDTA, 0.25 g of sodium metabisulfite (powder), and polyvinylpyrrolidone (pH value 3.0 to 5.0). , molar average molecular weight 25,000 to 35,000, powder) 1.0 g can be prepared by mixing. In this case, the volume of the prepared first buffer composition may be about 50ml.

다만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 전술한 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량을 도출할 수 있는 경우, 각 혼합 성분의 중량 및 부피는 제한되지 않는다. 또, 각 성분의 몰농도(M)는 시판 제품을 그대로 이용하거나, 또는 희석하여 이용할 수 있음은 물론이다.However, the present invention is not limited thereto, and when the above-described molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content can be derived, the weight and volume of each mixing component are not limited. In addition, it goes without saying that the molar concentration (M) of each component can be used as it is or diluted with a commercially available product.

제1 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다. The total amount (volume) of the first buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less, or about 40 ml or less, or about 30 ml or less. .

제1 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The lower limit of the total amount of the first buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제2 버퍼 조성물second buffer composition

제2 버퍼 조성물은 계면활성제를 포함하여 세포 및 단백질을 파괴 및 변형하고, 단백질을 흡착시킬 수 있다. 또, 다당류를 적어도 부분적으로 제거할 수 있다.The second buffer composition may include a surfactant to destroy and modify cells and proteins, and to adsorb proteins. In addition, polysaccharides can be at least partially removed.

제2 버퍼 조성물은 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하고, EDTA, 소듐시트레이트(sodium citrate) 및 Tris-HCl(Tris 완충용액)을 더 포함할 수 있다.The second buffer composition includes sodium dodecyl sulfate (SDS), and may further include EDTA, sodium citrate, and Tris-HCl (Tris buffer solution).

SDS의 농도는 약3%(w/v) 내지 8%(w/v), 또는 약4%(w/v) 내지 7%(w/v), 또는 약5%(w/v) 내지 6%(w/v)일 수 있다.The concentration of SDS is from about 3% (w/v) to 8% (w/v), or from about 4% (w/v) to 7% (w/v), or from about 5% (w/v) to 6 % (w/v).

SDS의 함량이 너무 적으면 단백질의 변성력 예를 들어 RNase의 변성도가 낮아져 용출된 RNA를 분해할 수 있고. 세포 파괴 효율이 낮아져 RNA 또는 DNA의 용출량이 줄어들 수 있어 RNA, DNA의 추출 효율이 떨어질 수 있다. 너무 많으면 단백질 또는 버퍼 조성물의 기타 화합물과 과다하게 반응하여 이후 단계의 조작 난이도가 증가할 수 있고, RNA, DNA도 같이 흡착하여 추출 효율이 낮아질 수 있다.If the content of SDS is too small, the denaturing ability of the protein, for example, the denaturation of RNase, is lowered, and thus the eluted RNA can be degraded. Since the cell destruction efficiency is lowered, the elution amount of RNA or DNA may be reduced, and thus the extraction efficiency of RNA or DNA may be reduced. If too much, it may excessively react with other compounds of the protein or buffer composition to increase the operation difficulty of the subsequent step, and the extraction efficiency may be lowered by adsorbing RNA and DNA together.

EDTA의 함량이 너무 적으면 DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.If the content of EDTA is too small, DNA extraction efficiency may be lowered because DNAse activity cannot be reduced. If it is too large, the pH of the composition may rise and the original purpose of pH buffering effect may be lost.

소듐시트레이트의 농도는 약 120mM 내지 180mM, 또는 약 130mM 내지 170mM, 또는 약 140mM 내지 160mM, 또는 약 150mM일 수 있다.The concentration of sodium citrate may be about 120 mM to 180 mM, or about 130 mM to 170 mM, or about 140 mM to 160 mM, or about 150 mM.

소듐시트레이트의 함량이 너무 적으면, DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.If the content of sodium citrate is too small, DNA extraction efficiency may be lowered because the activity of DNAse cannot be reduced, and the cell wall cannot be smoothly destroyed because calcium ions or other iron ions cannot be removed. If it is too large, the pH of the composition may rise and the original purpose of pH buffering effect may be lost.

몇몇 실시예에서, EDTA와 소듐시트레이트의 몰비는 약 1:4 내지 1:8, 또는 약 1:5 내지 1:7, 또는 약 1.6일 수 있다.In some embodiments, the molar ratio of EDTA to sodium citrate may be about 1:4 to 1:8, or about 1:5 to 1:7, or about 1.6.

또, Tris-HCl의 농도는 약 15mM 내지 25mM, 또는 약 16mM 내지 24mM, 또는 약 17mM 내지 23mM, 또는 약 18mM 내지 22mM, 또는 약 19mM 내지 21mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다.Further, the concentration of Tris-HCl may be about 15mM to 25mM, or about 16mM to 24mM, or about 17mM to 23mM, or about 18mM to 22mM, or about 19mM to 21mM. The pH of Tris-HCl may be about 7.4.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 감소하여 시료 균질 시 시료 내에서 유래한 산성 또는 염기성 물질에 의해 균질물의 pH가 급격히 변할 수 있다. 이러한 경우 추출 목적물인 핵산의 품질 또는 수율이 급격히 감소할 수 있다. 너무 많으면 삼투압이 증가하여 원하지 않는 단계에서 내인성 RNAse, DNAase가 다량 방출되어 핵산의 수율이 감소할 수 있다.If the content of Tris-HCl is too small, the buffering effect is reduced, and the pH of the homogenate may change rapidly due to acidic or basic substances derived from the sample during homogenization of the sample. In this case, the quality or yield of the nucleic acid to be extracted may be drastically reduced. If too much, the osmotic pressure may increase, resulting in the release of a large amount of endogenous RNAse and DNAase at an undesired stage, thereby reducing the yield of nucleic acids.

몇몇 실시예에서, EDTA와 Tris-HCl의 몰비는 약 1:1 내지 1.5:1, 또는 약 1.1:1 내지 1.4:1, 또는 약 1.2:1 내지 1.3:1, 또는 약 1.25:1일 수 있다.In some embodiments, the molar ratio of EDTA and Tris-HCl may be about 1:1 to 1.5:1, or about 1.1:1 to 1.4:1, or about 1.2:1 to 1.3:1, or about 1.25:1. .

제2 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the second buffer composition

제2 버퍼 조성물은 SDS를 혼합하고, EDTA, 소듐시트레이트 및 Tris-HCl을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The second buffer composition may be prepared by mixing SDS and further mixing EDTA, sodium citrate and Tris-HCl. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and replaceable substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제2 버퍼 조성물은 20% SDS를 12.5ml, 0.5M EDTA를 2.5ml, 소듐시트레이트(분말상)를 1.93g, 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 1.0ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제2 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the second buffer composition is prepared by mixing 12.5 ml of 20% SDS, 2.5 ml of 0.5M EDTA, 1.93 g of sodium citrate (powder), and 1.0 ml of 1.0M Tris-HCl (pH 7.4) can do. In this case, the volume of the prepared second buffer composition may be about 50ml.

제2 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다. The total amount (volume) of the second buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less, or about 40 ml or less, or about 30 ml or less. .

제2 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The lower limit of the total amount of the second buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제3 버퍼 조성물third buffer composition

제3 버퍼 조성물은 높은 삼투압을 형성하고 제2 버퍼 조성물로 인해 용출된 핵산의 표면 전하를 중화하여 용매상 용해율을 감소시킬 수 있다. 또, 제2 버퍼 조성물의 SDS를 흡착시키거나 및/또는 침전시켜 제거할 수 있고 단백질과 다당류를 침전시킬 수 있으며, 핵산의 바인딩에 도움을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 소듐 이온이 핵산의 인산과 반응하여 표면을 코팅하므로 RNAse, DNase 같은 핵산분해효소가 접근하지 못하도록 방해할 수 있다.The third buffer composition may reduce the solvent phase dissolution rate by forming a high osmotic pressure and neutralizing the surface charge of the nucleic acid eluted by the second buffer composition. In addition, the SDS of the second buffer composition may be adsorbed and/or removed by precipitation, proteins and polysaccharides may be precipitated, and may help in binding of nucleic acids. In addition, sodium ions react with phosphoric acid of nucleic acids to coat the surface, which can prevent access to nucleases such as RNAse and DNase.

제3 버퍼 조성물은 염화소듐(NaCl)을 포함하고, 염화칼륨(KCl) 및 폴리비닐피롤리돈을 더 포함할 수 있다.The third buffer composition may include sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), and polyvinylpyrrolidone.

염화소듐의 농도는 약 4.2M 내지 4.8M, 또는 약 4.3M 내지 4.7M, 또는 약 4.4M 내지 4.6M, 또는 약 4.5M일 수 있다.The concentration of sodium chloride may be about 4.2M to 4.8M, or about 4.3M to 4.7M, or about 4.4M to 4.6M, or about 4.5M.

염화소듐의 함량이 너무 적으면 삼투압이 낮아져 상기 설명한 삼투압 형성, 핵산의 표면 전하 중화, 핵산의 바인딩, 단백질과 다당류 침전, SDS의 흡착 및 침전 효과를 얻을 수 없다. 너무 많으면 용액이 포화되어 염화소듐 및 다른 첨가물이 석출될 수 있다.If the content of sodium chloride is too small, the osmotic pressure is lowered, and the above-described osmotic pressure formation, surface charge neutralization of nucleic acids, nucleic acid binding, protein and polysaccharide precipitation, and SDS adsorption and precipitation effects cannot be obtained. Too much may saturate the solution and precipitate sodium chloride and other additives.

염화칼륨의 농도는 약 80mM 내지 120mM, 또는 약 90mM 내지 110mM일 수 있다. 다른 실시예에서, 염화칼륨 대신에, 또는 추가로 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 및/또는 황산암모늄을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 및 황산암모늄의 함량의 합은 후술할 농도 내에 있을 수 있다.The concentration of potassium chloride may be about 80 mM to 120 mM, or about 90 mM to 110 mM. In other embodiments, ferric chloride, ferrous chloride, ammonium aluminum and/or ammonium sulfate may be further included in place of or in addition to potassium chloride. In this case, the sum of the contents of calcium chloride, ferric chloride, ferrous chloride, aluminum ammonium and ammonium sulfate may be within a concentration to be described later.

염화칼륨의 함량이 너무 적으면 SDS와 NaCl의 결합력을 촉진시킬 수 없어서 침전물의 안정도가 떨어질 수 있다. 너무 많으면 핵산이 칼륨과 반응하여 마지막 회수단계에서 칼륨이 용출될 수 있으며 이는 PCR 과정을 방해하거나 오작동을 일으킬 수 있다If the content of potassium chloride is too small, the binding force between SDS and NaCl cannot be promoted, and the stability of the precipitate may be deteriorated. If there is too much, the nucleic acid may react with potassium and elute potassium in the final recovery step, which may interfere with the PCR process or cause malfunction.

몇몇 실시예에서, 염화소듐과 염화칼륨 등의 몰비는 약 40:1 내지 50:1, 또는 약 41:1 내지 49:1, 또는 약 42:1 내지 48:1, 또는 약 43:1 내지 47:1, 또는 약 44:1 내지 46:1, 또는 약 45:1일 수 있다.In some embodiments, the molar ratio of sodium chloride to potassium chloride, etc. is from about 40:1 to 50:1, or from about 41:1 to 49:1, or from about 42:1 to 48:1, or from about 43:1 to 47: 1, or about 44:1 to 46:1, or about 45:1.

제3 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the third buffer composition

제3 버퍼 조성물은 염화소듐을 혼합하고, 염화칼륨 및 폴리비닐피롤리돈을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The third buffer composition may be prepared by mixing sodium chloride and further mixing potassium chloride and polyvinylpyrrolidone. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and replaceable substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제3 버퍼 조성물은 5M의 염화소듐을 45ml, 염화칼륨(분말상)을 0.37g, 및 폴리비닐피롤리돈(pH value 3.0 내지 5.0, 몰평균분자량 25,000 내지 35,000, 분말상) 1.0g을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제3 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the third buffer composition contains 45 ml of 5M sodium chloride, 0.37 g of potassium chloride (powder), and 1.0 g of polyvinylpyrrolidone (pH value 3.0 to 5.0, molar average molecular weight 25,000 to 35,000, powder) It can be prepared by mixing. In this case, the volume of the prepared third buffer composition may be about 50ml.

제3 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.The total amount (volume) of the third buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less, or about 40 ml or less, or about 30 ml or less. .

제3 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The lower limit of the total amount of the third buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제4 버퍼 조성물fourth buffer composition

제4 버퍼 조성물은 제2 버퍼 조성물의 SDS 및 폴리페놀과 결합된 폴리비닐피롤리돈을 침전시킬 수 있다. 또, 잔여 단백질을 변성시킬 수 있으며, 핵산의 바인딩에 도움을 줄 수 있다.The fourth buffer composition may precipitate polyvinylpyrrolidone combined with SDS and polyphenol of the second buffer composition. In addition, the residual protein can be denatured, and it can help the binding of nucleic acids.

제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산(Guanidine-HCl)을 포함하고, Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.The fourth buffer composition includes guanidine-HCl, and may further include Tris-HCl.

구아니딘염산의 농도는 약 3.5M 내지 4.5M, 또는 약 3.6M 내지 4.4M, 또는 약 3.7M 내지 4.3M, 또는 약 3.8M 내지 4.2M, 또는 약 3.9M 내지 4.1M일 수 있다.The concentration of guanidine hydrochloride may be about 3.5M to 4.5M, or about 3.6M to 4.4M, or about 3.7M to 4.3M, or about 3.8M to 4.2M, or about 3.9M to 4.1M.

구아니딘염산의 함량이 너무 적으면 폴리페놀과 결합한 PVP를 침전시킬 수 없고, 그 결과 추출된 핵산이 폴리페놀로 오염될 수 있다. 또한 핵산이 실리카막과 결합하는 효율이 줄어들어 핵산의 추출효율이 감소할 수 있다. 너무 많으면 용액이 포화되어 3버퍼 조성물의 염화소듐 및 다른 첨가물이 석출될 수 있다.If the content of guanidine hydrochloride is too small, PVP bound to polyphenol cannot be precipitated, and as a result, the extracted nucleic acid may be contaminated with polyphenol. In addition, the efficiency of binding of the nucleic acid with the silica film may decrease, thereby reducing the extraction efficiency of the nucleic acid. If too much, the solution may be saturated and sodium chloride and other additives of the 3-buffer composition may be precipitated.

또, Tris-HCl의 농도는 약 10mM 내지 20mM, 또는 약 12mM 내지 18mM, 또는 약 14mM 내지 16mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다. 제4 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 내지는 농도는 제2 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 보다 작을 수 있다.In addition, the concentration of Tris-HCl may be about 10mM to 20mM, or about 12mM to 18mM, or about 14mM to 16mM. The pH of Tris-HCl may be about 7.4. The content or concentration of Tris-HCl of the fourth buffer composition may be smaller than the content of Tris-HCl of the second buffer composition.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 줄어들 수 있고, 너무 많으면 pH가 급격히 증가 또는 기타 첨가물이 석출될 수 있다.If the content of Tris-HCl is too small, the buffering effect may be reduced, and if it is too large, the pH may rapidly increase or other additives may be precipitated.

몇몇 실시예에서, 구아니딘염산과 Tris-HCl의 몰비는 250:1 내지 280:1, 또는 약 260:1 내지 270:1, 또는 약 265:1 내지 268:1, 또는 약 266:1 내지 267:1일 수 있다.In some embodiments, the molar ratio of guanidine hydrochloride and Tris-HCl is 250:1 to 280:1, or about 260:1 to 270:1, or about 265:1 to 268:1, or about 266:1 to 267: can be 1.

제4 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the fourth buffer composition

제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산을 혼합하고, Tris-HCl을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The fourth buffer composition may be prepared by mixing guanidine hydrochloride and further mixing Tris-HCl. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and substitute substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산(분말상)을 19.1g 및 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조될 수 있다. 이 경우, 제조된 제4 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the fourth buffer composition may be prepared by mixing 19.1 g of guanidine hydrochloride (powder) and 0.75 ml of 1.0M Tris-HCl (pH 7.4). In this case, the volume of the prepared fourth buffer composition may be about 50ml.

제4 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.The total amount (volume) of the fourth buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less, or about 40 ml or less, or about 30 ml or less. .

제4 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The lower limit of the total amount of the fourth buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제5 버퍼 조성물fifth buffer composition

제5 버퍼 조성물은 컬럼에 로딩 후 1차 세척 버퍼일 수 있다. 제5 버퍼 조성물은 이소프로판올, 염화소듐 및 비이온계 계면활성제를 포함할 수 있다. 특히 식물 조직에 다량 포함되어있는 클로로필 등 특유의 색소를 제거하는 것을 목적으로 할 수 있다.The fifth buffer composition may be a first wash buffer after loading on the column. The fifth buffer composition may include isopropanol, sodium chloride and a nonionic surfactant. In particular, it may be aimed at removing a unique pigment such as chlorophyll contained in a large amount in plant tissue.

이소프로판올의 농도는 약 55%(v/v, volume/volume) 내지 65%(v/v), 또는 약 60%(v/v)일 수 있다.The concentration of isopropanol may be about 55% (v/v, volume/volume) to 65% (v/v), or about 60% (v/v).

이소프로판올의 함량이 너무 적으면 핵산이 용해물에서 석출되지 않아 실리카막 등과 결합하기에 곤란하며, 너무 많으면 전체 혼합물의 부피가 증가하여 조작 난이도가 증가하고 또한, 핵산 이외의 물질도 석출되어 핵산의 오염도가 증가할 수 있다.If the content of isopropanol is too small, the nucleic acid does not precipitate from the lysate, making it difficult to bind to a silica film, etc., and if the content of isopropanol is too large, the volume of the entire mixture increases, increasing the difficulty of operation. may increase.

또, 염화소듐의 농도는 약 120mM 내지 180mM, 또는 약 130mM 내지 170mM, 또는 약 140mM 내지 160mM일 수 있다.In addition, the concentration of sodium chloride may be about 120mM to 180mM, or about 130mM to 170mM, or about 140mM to 160mM.

염화소듐의 함량이 너무 적으면 세척 시 실리카막 등의 고체지지상과 핵산의 결합력이 줄어들어 세척 과정에서 핵산을 잃을 수 있고, 너무 많으면 염화소듐이 석출되어 염화소듐의 오염도가 증가하는 등 세척 효율을 떨어트릴 수 있다.If the content of sodium chloride is too small, the binding force between the nucleic acid and the solid support phase such as silica film is reduced during washing, and nucleic acid may be lost during the washing process. can be dropped

비이온계 계면활성제의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 0.3%(v/v), 또는 약 0.15%(v/v) 내지 0.25%(v/v), 또는 약 0.2%(v/v)일 수 있다.The concentration of the nonionic surfactant is about 0.1% (v/v) to 0.3% (v/v), or about 0.15% (v/v) to 0.25% (v/v), or about 0.2% (v/v) v) can be

비이온계 게면활성제가 너무 적으면 실리카막 등의 고체지지상과 세척용 버퍼의 접촉부위가 감소할 수 있고 실리카막 자체의 소수성으로인해 세척 효율이 감소할 수 있다. 너무 많으면 과정 중 거품이 발생하여 조작 난이도가 증가하고 생성된 거품이 파괴될 때 비산되는 입자에 의해 시료간 오염 가능성이 증가할 수 있다.If the amount of the nonionic surfactant is too small, the contact area between the solid support phase such as a silica film and the washing buffer may be reduced, and the washing efficiency may decrease due to the hydrophobicity of the silica film itself. If too much, bubbles are generated during the process, which increases the difficulty of manipulation, and the possibility of contamination between samples by particles scattered when the generated bubbles are destroyed can increase.

제5 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the fifth buffer composition

제5 버퍼 조성물은 이소프로판올, 염화소듐 및 비이온계 계면활성제를 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The fifth buffer composition may be prepared by mixing isopropanol, sodium chloride and a nonionic surfactant. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and substitute substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제5 버퍼 조성물은 99% 이소프로판올을 30ml, 5M 염화소듐을 1.5ml 및 99% 트윈-21(tween-21)을 10㎕ 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제5 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the fifth buffer composition may be prepared by mixing 30 ml of 99% isopropanol, 1.5 ml of 5M sodium chloride, and 10 μl of 99% tween-21. In this case, the volume of the prepared fifth buffer composition may be about 50ml.

제5 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제5 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The total amount (volume) of the fifth buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less. The lower limit of the total amount of the fifth buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제6 버퍼 조성물sixth buffer composition

제6 버퍼 조성물은 2차 세척 버퍼일 수 있다. 제6 버퍼 조성물은 에탄올, 구아니딘염산(Gu-HCl) 및 Tris-HCl을 포함할 수 있다. 특히 구아니딘염산을 첨가함으로써 단백질의 변성을 초래하여 실리카막 등 고체지지상에서 단백질을 제거하는 목적으로 사용할 수 있다.The sixth buffer composition may be a secondary washing buffer. The sixth buffer composition may include ethanol, guanidine hydrochloride (Gu-HCl) and Tris-HCl. In particular, it can be used for the purpose of removing proteins from a solid support such as a silica film by causing protein denaturation by adding guanidine hydrochloric acid.

에탄올의 농도는 약 55%(v/v, volume/volume) 내지 65%(v/v), 또는 약 60%(v/v)일 수 있다. The concentration of ethanol may be about 55% (v/v, volume/volume) to about 65% (v/v), or about 60% (v/v).

에탄올의 함량이 너무 적으면 핵산이 버퍼 조성물에 용해되어 세척 과정 중 핵산을 손실할 수 있고, 너무 많으면 첨가물인 구아니딘 염산이 석출되어 목적하는 바인 단백질 제거효율이 감소할 수 있다.If the content of ethanol is too small, the nucleic acid may be dissolved in the buffer composition and the nucleic acid may be lost during the washing process, and if the content of ethanol is too large, guanidine hydrochloride as an additive may be precipitated, thereby reducing the desired protein removal efficiency.

또, 구아니딘염산의 농도는 약 1.5M 내지 2.0M, 또는 약 1.6M 내지 1.8M, 또는 약 1.65M 내지 1.7M일 수 있다.In addition, the concentration of guanidine hydrochloride may be about 1.5M to 2.0M, or about 1.6M to 1.8M, or about 1.65M to 1.7M.

구아니딘염산의 함량이 너무 적으면 단백질의 변성효율이 감소하여 단백질 제거가 원활하게 이뤄질 수 없고 또한 핵산이 세척 과정 중 용출되어 핵산의 품질 및 수율이 감소할 수 있다. 너무 많으면, 이후 세척과정에서 구아니딘염산이 제거되지 않아 핵산추출 후 후속과정인 PCR, RT-PCR 등 분석과정을 방해할 수 있다.If the content of guanidine hydrochloride is too small, protein denaturation efficiency is reduced, so protein removal cannot be performed smoothly, and nucleic acids are eluted during the washing process, thereby reducing the quality and yield of nucleic acids. If there is too much, guanidine hydrochloride is not removed in the subsequent washing process, which may interfere with the subsequent process after nucleic acid extraction, such as PCR and RT-PCR.

Tris-HCl의 농도는 약 10mM 내지 20mM, 또는 약 12mM 내지 18mM, 또는 약 14mM 내지 16mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다. 제6 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 내지는 농도는 제2 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 보다 작을 수 있다.The concentration of Tris-HCl may be about 10 mM to 20 mM, or about 12 mM to 18 mM, or about 14 mM to 16 mM. The pH of Tris-HCl may be about 7.4. The content or concentration of Tris-HCl of the sixth buffer composition may be smaller than the content of Tris-HCl of the second buffer composition.

제6 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the sixth buffer composition

제6 버퍼 조성물은 에탄올, 구아니딘염산 및 Tris-HCl을 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The sixth buffer composition may be prepared by mixing ethanol, guanidine hydrochloric acid and Tris-HCl. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and substitute substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제6 버퍼 조성물은 99% 에탄올을 30ml, 1.67M 구아니딘염산(분말상)을 7.98g 및 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제6 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the sixth buffer composition can be prepared by mixing 30 ml of 99% ethanol, 7.98 g of 1.67 M guanidine hydrochloride (powdered), and 0.75 ml of 1.0 M Tris-HCl (pH 7.4). In this case, the volume of the prepared sixth buffer composition may be about 50 ml.

제6 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제6 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The total amount (volume) of the sixth buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less. The lower limit of the total amount of the sixth buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

제7 버퍼 조성물Seventh Buffer Composition

제7 버퍼 조성물은 3차 세척 버퍼일 수 있다. 제7 버퍼 조성물은 에탄올, 염화소듐 및 Tris-HCl을 포함할 수 있다. 특히 앞선 조성물의 고농도염을 제거하는 목적과 남아있는 실리카막 또는 고체지지상에 남아있는 색소를 제거하는 것을 목적으로 할 수 있다.The seventh buffer composition may be a third wash buffer. The seventh buffer composition may include ethanol, sodium chloride and Tris-HCl. In particular, the purpose of removing the high-concentration salt of the above composition may be for the purpose of removing the remaining silica film or the pigment remaining on the solid support.

에탄올의 농도는 약 70%(v/v) 내지 80%(v/v), 또는 약 71%(v/v) 내지 79%(v/v), 또는 약 72%(v/v) 내지 78%(v/v), 또는 약 73%(v/v) 내지 77%(v/v), 또는 약 74%(v/v) 내지 76%(v/v)일 수 있다.The concentration of ethanol is about 70% (v/v) to 80% (v/v), or about 71% (v/v) to 79% (v/v), or about 72% (v/v) to 78% (v/v). % (v/v), or between about 73% (v/v) and 77% (v/v), or between about 74% (v/v) and 76% (v/v).

에탄올의 함량이 너무 적으면 핵산이 고체지지상에서 용해되어 세척과정 중 핵산을 손실할 수 있다. 너무 많으면 잔여 염류가 용해되지 않아 마지막 추출과정에서 염이 함께 용출될 수 있다.If the content of ethanol is too low, the nucleic acid may be dissolved on the solid support and the nucleic acid may be lost during the washing process. If there is too much, the residual salt may not be dissolved, and the salt may be eluted together in the final extraction process.

염화소듐의 농도는 약 15mM 내지 25mM, 또는 약 16mM 내지 24mM, 또는 약 17mM 내지 23mM, 또는 약 18mM 내지 22mM, 또는 약 19mM 내지 21mM일 수 있다.The concentration of sodium chloride may be between about 15 mM and 25 mM, or between about 16 mM and 24 mM, or between about 17 mM and 23 mM, or between about 18 mM and 22 mM, or between about 19 mM and 21 mM.

제7 버퍼 조성물의 제조 방법Method for preparing the seventh buffer composition

제7 버퍼 조성물은 에탄올, 염화소듐 및 Tris-HCl을 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.The seventh buffer composition may be prepared by mixing ethanol, sodium chloride and Tris-HCl. Molar (mol), volume (ml), and weight (g)-based content and concentration of each component, and substitute substances are the same as described above.

예시적인 실시예에서, 제7 버퍼 조성물은 99% 에탄올 37.5ml, 5M 염화소듐 0.2ml 및 1M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제7 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.In an exemplary embodiment, the seventh buffer composition may be prepared by mixing 37.5 ml of 99% ethanol, 0.2 ml of 5M sodium chloride, and 0.75 ml of 1M Tris-HCl (pH 7.4). In this case, the volume of the prepared seventh buffer composition may be about 50ml.

제7 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제7 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.The total amount (volume) of the seventh buffer composition may be about 100 ml or less, or about 90 ml or less, or about 80 ml or less, or about 70 ml or less, or about 60 ml or less, or about 50 ml or less. The lower limit of the total amount of the seventh buffer composition is not particularly limited, but in terms of high-quality nucleic acid extraction, about 300 μl or more, or about 350 μl or more, or about 400 μl or more, or about 450 μl or more, or about 500 μl or more, or at least about 550 μl, or at least about 600 μl, or at least about 650 μl, or at least about 700 μl, or at least about 750 μl, or at least about 800 μl, or at least about 850 μl, or at least about 900 μl, or about 950 μl or more. μl or more, or about 1,000 μl or more.

핵산의 추출 방법Nucleic Acid Extraction Method

도 1은 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.1 and 2 are flowcharts illustrating a method for extracting nucleic acids according to an embodiment of the present invention.

본 발명에 따른 핵산의 추출 방법은 시료와 제4 버퍼를 혼합하는 단계(S10), 환원제를 더 혼합하여 시료를 파쇄하는 단계(S20), 제3 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양하는 단계(S30), 제1 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양 및 원심 분리하는 단계(S40), 제4 버퍼를 추가로 더 혼합하고 배양하는 단계(S50), 제2 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양 및 원심 분리하는 단계(S60), 이소프로판올을 더 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계(S70)를 포함하고, 제5 버퍼로 세척하는 단계(S80), 제6 버퍼로 세척하는 단계(S90), 및 제7 버퍼로 세척하는 단계(S100)를 더 포함할 수 있다.The nucleic acid extraction method according to the present invention comprises the steps of mixing the sample and the fourth buffer (S10), crushing the sample by further mixing a reducing agent (S20), further mixing the third buffer and culturing it (S30) , further mixing the first buffer, culturing and centrifuging it (S40), further mixing and culturing the fourth buffer (S50), further mixing the second buffer, and culturing and centrifuging it (S40) S60), further mixing isopropanol and loading the column (S70), washing with a fifth buffer (S80), washing with a sixth buffer (S90), and washing with a seventh buffer (S100) may be further included.

우선 시료를 준비한다. 예시적인 실시예에서, 시료는 식물, 식물의 잎, 식물의 과육, 식물의 줄기 및/또는 식물의 뿌리로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 식물은 고추 또는 피망 등 RNA 분해 효소를 풍부하게 함유한 터프한 식물일 수 있다. 전술한 바와 같이 종래의 핵산 추출 방법에 있어서, RNA 분해 효소는 저해제(inhibitor)로 기능하기 때문에 이러한 식물로부터 고품질의 핵산을 추출하는 것은 극히 곤란하였다. 그러나 전술한 버퍼 조성물들, 그리고 후술할 핵산의 추출 방법에 따를 경우 고품질의 핵산 추출이 가능하며, 진단 결과의 신뢰성과 정확성을 높이고 진단에 소요되는 시간을 현저하게 단축시킬 수 있다.First, prepare a sample. In an exemplary embodiment, the sample may be derived from a plant, a plant leaf, a plant flesh, a plant stem, and/or a plant root. For example, the plant may be a tough plant rich in RNA-degrading enzymes, such as red pepper or green pepper. As described above, in the conventional nucleic acid extraction method, since the RNA-degrading enzyme functions as an inhibitor, it is extremely difficult to extract high-quality nucleic acids from such plants. However, when the above-described buffer compositions and a method for extracting nucleic acids to be described below are followed, high-quality nucleic acid extraction is possible, the reliability and accuracy of diagnosis results can be increased, and the time required for diagnosis can be significantly shortened.

그리고 시료와 제4 버퍼를 혼합한다(S10). 시료 100mg을 기준으로 제4 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제4 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.Then, the sample and the fourth buffer are mixed (S10). Based on 100 mg of sample, the fourth buffer may be mixed with about 350 μl to 450 μl, or about 360 μl to 440 μl, or about 370 μl to 430 μl, or about 380 μl to 420 μl, or about 390 μl to 410 μl. have. Since the fourth buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted.

그 다음 튜브에 환원제를 더 혼합한다(S20). 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)(99% 용액), 0.5M TCEP-HCl 또는 1M 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다. 제4 버퍼와 환원제의 사용 부피비는 약 1:0.07 내지 1:0.16, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.15, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.13일 수 있다. 예를 들어, 환원제는 약 30㎕ 내지 70㎕, 또는 약 40㎕ 내지 60㎕, 또는 약 50㎕ 혼합될 수 있다. 환원제는 RNA 분해 효소의 불활성화에 기여할 수 있다. 환원제를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.Then, the reducing agent is further mixed in the tube (S20). The reducing agent may include β-mercaptoethanol (99% solution), 0.5M TCEP-HCl or 1M dithiothreitol (DTT). The use volume ratio of the fourth buffer and the reducing agent may be about 1:0.07 to 1:0.16, or about 1:0.08 to 1:0.15, or about 1:0.08 to 1:0.13. For example, the reducing agent may be mixed in about 30 μl to 70 μl, or about 40 μl to 60 μl, or about 50 μl. Reducing agents may contribute to the inactivation of RNA degrading enzymes. After mixing the reducing agent, it is preferable to shake the tube to mix thoroughly.

그리고 시료, 제4 버퍼 및 환원제를 혼합된 튜브를 흔들어 시료를 파쇄한다. 시료를 파쇄하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 비드 비팅 튜브(bead beating tube)를 이용하거나, 액체 질소 파쇄법을 이용할 수 있으며, 시료의 상태, 예컨대 수분 함유량 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. And shake the tube in which the sample, the fourth buffer, and the reducing agent are mixed to disrupt the sample. The method of crushing the sample is not particularly limited, and a bead beating tube may be used or a liquid nitrogen crushing method may be used, and may be appropriately selected in consideration of the state of the sample, for example, moisture content.

그 다음 튜브에 제3 버퍼를 더 혼합한다(S30). 제4 버퍼와 제3 버퍼의 사용 부피비는 약 1:1.05 내지 1:1.25, 또는 약 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다. 예를 들어, 제3 버퍼는 약 400㎕ 내지 500㎕, 또는 약 410㎕ 내지 490㎕, 또는 약 420㎕ 내지 480㎕, 또는 약 430㎕ 내지 470㎕, 또는 약 440㎕ 내지 460㎕ 혼합될 수 있다. 제3 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제3 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.Then, the third buffer is further mixed in the tube (S30). The use volume ratio of the fourth buffer and the third buffer may be about 1:1.05 to 1:1.25, or about 1:1.1 to 1:1.2. For example, the third buffer may be mixed between about 400 μl and 500 μl, or between about 410 μl and 490 μl, or between about 420 μl and 480 μl, or between about 430 μl and 470 μl, or between about 440 μl and 460 μl. . Since the third buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted. After mixing the third buffer, it is preferable to shake the tube to mix thoroughly.

그리고 제3 버퍼가 혼합된 혼합물을 약 55℃ 내지 65℃, 또는 약 60℃의 조건 하에서 약 2분 내지 8분, 또는 약 3분 내지 7분 동안 배양한다(제1 배양 단계).And the third buffer mixture is incubated for about 2 minutes to 8 minutes, or about 3 minutes to 7 minutes under the conditions of about 55 ℃ to 65 ℃, or about 60 ℃ (first incubation step).

전술한 제4 버퍼를 혼합하고, 환원제를 혼합하고 시료를 파쇄하며, 제3 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 핵산을 용출시키고 RNA 분해 효소를 불활성화시킬 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.The above-described fourth buffer is mixed, the reducing agent is mixed, the sample is disrupted, and the nucleic acid can be eluted and the RNA-degrading enzyme can be inactivated through the steps of mixing and incubating the third buffer, but the present invention is limited to any theory it's not going to be

그 다음 튜브에 제1 버퍼를 더 혼합한다(S40). 제4 버퍼와 제1 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.5 내지 1:0.9, 또는 약 1:0.6 내지 1:0.8, 또는 약 1:0.65 내지 1:0.75일 수 있다. 예를 들어, 제1 버퍼는 약 250㎕ 내지 350㎕, 또는 약 260㎕ 내지 340㎕, 또는 약 270㎕ 내지 330㎕, 또는 약 280㎕ 내지 320㎕, 또는 약 290㎕ 내지 310㎕ 혼합될 수 있다. 제1 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제1 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.Then, the first buffer is further mixed in the tube (S40). The use volume ratio of the fourth buffer and the first buffer may be about 1:0.5 to 1:0.9, or about 1:0.6 to 1:0.8, or about 1:0.65 to 1:0.75. For example, the first buffer may be mixed between about 250 μl and 350 μl, or between about 260 μl and 340 μl, or between about 270 μl and 330 μl, or between about 280 μl and 320 μl, or between about 290 μl and 310 μl. . Since the first buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted. After mixing the first buffer, it is preferable to shake the tube to mix thoroughly.

그리고 제1 버퍼가 혼합된 혼합물을 원심 분리한다(제1 원심 분리 단계). 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 3분 내지 10분, 또는 약 4분 내지 7분 동안 수행될 수 있다.Then, the mixture in which the first buffer is mixed is centrifuged (first centrifugation step). Centrifugal separation is performed under conditions of 0°C to 10°C, or about 2°C to 8°C, or about 3°C to 7°C, or about 4°C to 6°C, about 10,000 rpm to 20,000 rpm, or about 11,000 rpm to 18,000 rpm, Alternatively, it may be carried out at a speed of about 12,000 rpm to 17,000 rpm for about 3 minutes to 10 minutes, or about 4 minutes to 7 minutes.

폴리페놀의 산화 및 흡착을 위해 제1 버퍼가 추가로 혼합되며 이후 원심분리하는 단계를 통해 제3 버퍼의 성분이 다당류를 적어도 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.A first buffer is further mixed for oxidation and adsorption of polyphenols, and then a component of the third buffer can at least partially remove polysaccharides through a step of centrifugation, but the present invention is not limited to any theory.

몇몇 실시예에서, 그 다음 원심 분리된 상층액(제1 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 2.0ml을 취하여 다른 튜브에 넣고, 제4 버퍼와 혼합한다(S50). 즉, 제4 버퍼를 추가로 혼합할 수 있다. 최초 혼합된 제4 버퍼와 본 단계에서 혼합된 제4 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.9 내지 1:1.1, 또는 약 1:1일 수 있다.In some embodiments, the next centrifuged supernatant (supernatant from the first centrifugation step), for example, approximately 2.0 ml of the supernatant, is taken and placed in another tube and mixed with the fourth buffer (S50). That is, the fourth buffer may be additionally mixed. The volume ratio of the first mixed fourth buffer and the fourth buffer mixed in this step may be about 1:0.9 to 1:1.1, or about 1:1.

제1 버퍼를 추가하며 제1 버퍼의 구성물질에 의해 폴리페놀이 흡착된다 (S40). 이후 제4 버퍼를 추가로 넣어 구아니딘염의 농도를 높여 폴리페놀을 흡착한 폴리비닐피롤리돈이 응집되도록 한다.A first buffer is added and polyphenol is adsorbed by the constituent materials of the first buffer (S40). After that, a fourth buffer is added to increase the concentration of the guanidine salt so that polyvinylpyrrolidone adsorbed with polyphenols is aggregated.

다른 실시예에서, 2차 제4 버퍼의 혼합 단계(S50)는 생략될 수도 있다.In another embodiment, the mixing step ( S50 ) of the second and fourth buffer may be omitted.

그리고 제4 버퍼가 추가로 혼합된 혼합물(또는 제1 버퍼의 혼합물)을 실온, 예를 들어 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30분 내지 5분, 또는 약 1분 동안 배양한다(제2 배양 단계).And the fourth buffer is further mixed with the mixture (or the mixture of the first buffer) is incubated for about 30 minutes to 5 minutes, or about 1 minute under the conditions of room temperature, for example, about 20 ° C. to 30 ° C. (second incubation stage).

그 다음 튜브에 제2 버퍼를 더 혼합한다(S60). 제4 버퍼와 제2 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.8 내지 1:1.2, 또는 약 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다. 예를 들어, 제2 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제2 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제2 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.Then, the second buffer is further mixed in the tube (S60). The use volume ratio of the fourth buffer and the second buffer may be about 1:0.8 to 1:1.2, or about 1:0.9 to 1:1.1. For example, the second buffer can be mixed between about 350 μl and 450 μl, or between about 360 μl and 440 μl, or between about 370 μl and 430 μl, or between about 380 μl and 420 μl, or between about 390 μl and 410 μl. . Since the second buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted. After mixing the second buffer, it is preferable to shake the tube to mix thoroughly.

그리고 제2 버퍼가 혼합된 혼합물을 실온, 예를 들어 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30초 내지 5분, 또는 약 1분 내지 3분 동안 배양한다(제3 배양 단계).And the mixture in which the second buffer is mixed is incubated at room temperature, for example, at about 20° C. to 30° C. for about 30 seconds to 5 minutes, or about 1 minute to 3 minutes (third incubation step).

또, 배양된 배양물을 원심 분리한다(제2 원심 분리 단계). 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 1분 내지 8분, 또는 약 2분 내지 5분 동안 수행될 수 있다.Further, the cultured culture is centrifuged (second centrifugation step). Centrifugal separation is performed under conditions of 0°C to 10°C, or about 2°C to 8°C, or about 3°C to 7°C, or about 4°C to 6°C, about 10,000 rpm to 20,000 rpm, or about 11,000 rpm to 18,000 rpm, Alternatively, it may be carried out at a speed of about 12,000 rpm to 17,000 rpm for about 1 to 8 minutes, or about 2 to 5 minutes.

전술한 제2 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 분쇄된 시료를 용해하고 단백질을 흡착시켜 부분적으로 제거할 수 있으며 이후 원심분리를 통해 흡착된 단백질과 제1 버퍼와 제4 버퍼에 의해 응집된 폴리페놀을 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.By dissolving the pulverized sample and adsorbing the protein through the step of mixing and incubating the above-mentioned second buffer, it can be partially removed, and then the protein adsorbed through centrifugation and the poly aggregated by the first buffer and the fourth buffer Phenol may be partially removed, but the present invention is not limited to any theory.

그 다음 원심 분리된 상층액(제2 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 900㎕ 내지 1,100㎕를 취하여 다른 튜브에 넣고, 이소프로판올과 혼합한다(S70). 이소프로판올의 혼합량은 약 400㎕ 내지 600㎕, 또는 약 450㎕ 내지 550㎕일 수 있다. 예를 들어, 제2 원심 분리의 상층액과 이소프로판올의 혼합 비율(v/v)은 약 1:1.5 내지 1:2.5, 또는 약 1:1.8 내지 1:2.3, 또는 약 1:2.0일 수 있다. 이소프로판올을 혼합한 후 완전히 흔들어 혼합시켜주는 것이 바람직하다.Then, take the centrifuged supernatant (supernatant from the second centrifugation step), for example, approximately 900 μl to 1,100 μl of the supernatant, put it in another tube, and mix with isopropanol (S70). The mixing amount of isopropanol may be about 400 μl to 600 μl, or about 450 μl to 550 μl. For example, the mixing ratio (v/v) of the supernatant of the second centrifugation and isopropanol may be about 1:1.5 to 1:2.5, or about 1:1.8 to 1:2.3, or about 1:2.0. After mixing isopropanol, it is preferable to shake thoroughly to mix.

그리고 이소프로판올 혼합물을 컬럼에 로딩한다. 예를 들어, 이소프로판올 혼합물을 스핀 컬럼에 로딩하여 핵산의 추출을 시작할 수 있다. 컬럼에 로딩하는 단계는 두번 이상으로 나누어 진행할 수 있다. 컬럼은 양이온 금속 비드, 또는 양이온 흡착 섬유로 패킹된 핵산 흡착성 컬럼일 수 있다. And the isopropanol mixture is loaded into the column. For example, an isopropanol mixture can be loaded onto a spin column to initiate extraction of nucleic acids. The step of loading the column may be divided into two or more steps. The column may be a nucleic acid adsorbent column packed with cationic metal beads, or cationic adsorbent fibers.

다만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 컬럼을 이용한 회수 대신에 에탄올 침전법, 핵산 침전법, 또는 자성 비드법 등을 이용할 수도 있다.However, the present invention is not limited thereto, and an ethanol precipitation method, a nucleic acid precipitation method, or a magnetic bead method may be used instead of the recovery using a column.

그 다음 제5 버퍼로 세척한다(S80). 세척에 사용되는 제5 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제5 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제5 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.Then, it is washed with a fifth buffer (S80). The amount of the fifth buffer used for washing may be about 500 μl or more, or about 600 μl or more, or about 700 μl or more, or about 800 μl or more, or about 900 μl or more, or about 1,000 μl or more. The upper limit of the amount of the fifth buffer is not particularly limited, but may be about 1,500 μl or less. Since the fifth buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted.

세척은 원심 분리를 통해 수행될 수 있다. 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 10초 내지 60초, 또는 약 20초 내지 50초, 또는 약 30초 내지 40초 수행될 수 있다.Washing may be performed via centrifugation. Centrifugal separation is performed under conditions of 0°C to 10°C, or about 2°C to 8°C, or about 3°C to 7°C, or about 4°C to 6°C, about 10,000 rpm to 20,000 rpm, or about 11,000 rpm to 18,000 rpm, Alternatively, at a speed of about 12,000 rpm to 17,000 rpm, it may be performed for about 10 seconds to 60 seconds, or about 20 seconds to 50 seconds, or about 30 seconds to 40 seconds.

본 단계를 통해 시료의 색소를 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.Although the pigment of the sample may be removed through this step, the present invention is not limited to any theory.

몇몇 실시예에서, 제5 버퍼를 이용한 세척 단계 이후, DNA 분해 효소(DNAse) 처리를 더 수행할 수 있다. DNA 분해 효소 처리 및 처리 조건 등에 대해서는 공지의 방법을 이용할 수 있다. DNA 분해 효소를 이용하여 유전체 DNA(genomic DNA)를 제거할 수 있다.In some embodiments, after the washing step using the fifth buffer, a DNA degrading enzyme (DNAse) treatment may be further performed. A well-known method can be used about a DNA-degrading enzyme treatment, treatment conditions, etc. Genomic DNA can be removed using a DNA degrading enzyme.

그 다음 제6 버퍼로 세척한다(S90). 세척에 사용되는 제6 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제6 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제6 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제6 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.Then, it is washed with a sixth buffer (S90). The amount of the sixth buffer used for washing may be about 500 μl or more, or about 600 μl or more, or about 700 μl or more, or about 800 μl or more, or about 900 μl or more, or about 1,000 μl or more. The amount of the sixth buffer may be smaller than the amount of the fifth buffer. The upper limit of the amount of the sixth buffer is not particularly limited, but may be about 1,500 μl or less. Since the sixth buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted.

몇몇 실시예에서, 제6 버퍼를 로딩한 후 원심 분리 전에 소정의 시간 동안 대기하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 10초 내지 60초, 또는 약 20초 내지 50초, 또는 약 30초 내지 40초 동안 대기한 이후 원심 분리를 수행할 수 있다.In some embodiments, the method may further include waiting for a predetermined time before centrifugation after loading the sixth buffer. For example, centrifugation may be performed after waiting for about 10 seconds to 60 seconds, or about 20 seconds to 50 seconds, or about 30 seconds to 40 seconds.

본 단계를 통해 분해된 DNA와 DNA 분해 효소를 제거하고, 잔존하는 토탈 RNA(total RNA)를 재결합할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.Although the degraded DNA and DNA-degrading enzyme may be removed through this step and the remaining total RNA may be recombined, the present invention is not limited to any theory.

그 다음 제7 버퍼로 세척한다(S100). 세척에 사용되는 제7 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제7 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제7 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제7 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.Then, it is washed with the seventh buffer (S100). The amount of the seventh buffer used for washing may be about 500 μl or more, or about 600 μl or more, or about 700 μl or more, or about 800 μl or more, or about 900 μl or more, or about 1,000 μl or more. The amount of the seventh buffer may be smaller than the amount of the fifth buffer. The upper limit of the amount of the seventh buffer is not particularly limited, but may be about 1,500 μl or less. Since the seventh buffer has been described above, a redundant description thereof will be omitted.

몇몇 실시예에서, 제7 버퍼를 이용한 세척 단계는 복수번 수행될 수 있다. 즉, 제7 버퍼를 로딩 후 원심 분리를 수행하고, 다시 제7 버퍼를 로딩 후 원심 분리를 수행할 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.In some embodiments, the washing step using the seventh buffer may be performed multiple times. That is, centrifugation may be performed after loading the seventh buffer, and centrifugation may be performed after loading the seventh buffer again, but the present invention is not limited thereto.

본 단계를 통해 잔존하는 염(salt)을 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.The remaining salt may be removed through this step, but the present invention is not limited to any theory.

이후 도면으로 표시하지 않았으나, 컬럼을 건조하여 에탄올을 제거하고, 핵산 분해효소 free water 또는 그에 준하는 저염 버퍼를 컬럼에 넣고 원심 분리하여 RNA 또는 DNA를 회수하는 등의 단계를 더 포함하여 핵산을 회수 내지는 추출할 수 있다.Thereafter, although not shown in the drawings, the nucleic acid recovery or can be extracted.

바이러스 진단Virus diagnosis

본 발명에 따라 핵산을 추출한 이후 바이러스의 유무를 진단할 수 있다. 바이러스 유무의 진단을 위해 증폭하는 방법은 공지의 증폭 방법, 예를 들어 PCR법, Nested-PCR법, RT-PCR법, ICAN법, UCAN법, LAMP법 등을 이용할 수 있다.After the nucleic acid is extracted according to the present invention, the presence or absence of a virus can be diagnosed. As the amplification method for diagnosing the presence or absence of a virus, known amplification methods, for example, PCR method, nested-PCR method, RT-PCR method, ICAN method, UCAN method, LAMP method, etc. can be used.

PCR법은 특정 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성반응의 반복을 통해 해당 DNA 영역을 증폭하는 방법으로, 경우에 따라 Nested-PCR법 및 real-time PCR법을 포괄하는 용어로 사용될 수 있으며, RNA를 시작물질로 할 경우 (reverse transcription) RT 단계를 수행하여 RNA를 DNA로 합성할 수 있다.The PCR method is a method of amplifying a corresponding DNA region by repeating a DNA synthesis reaction by two types of primers and a DNA polymerase sandwiched between a specific DNA region. In some cases, nested-PCR method and real-time PCR method It can be used as an inclusive term, and when RNA is used as a starting material (reverse transcription), RNA can be synthesized into DNA by performing an RT step.

Nested-PCR법은 외측의 프라이머와 내측의 프라이머를 사용하여 2단계의 PCR을 수행하는 방법이다. 1회차에서 표적 핵산이 충분히 증폭되지 않는 경우에도, 2회차에서 더욱 증폭시키는 것이 가능하다. 또, 1회차 PCR에서 비특이적 증폭 산물이 생성된 경우, 이들 비특이적 증폭 산물은 2회차 PCR에서의 프라이머와 유사한 배열을 가질 확률이 낮고, 따라서 2회차 PCR에서는 표적의 배열을 갖는 단편 만을 증폭할 확률이 높아질 수 있다. RT-PCR은 PCR의 전 단계로서, 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 수행하는 단계를 포함하는 PCR법이다. The nested-PCR method is a method of performing two-step PCR using an outer primer and an inner primer. Even when the target nucleic acid is not sufficiently amplified in the first round, it is possible to further amplify it in the second round. In addition, when non-specific amplification products are generated in the first PCR, the probability that these non-specific amplification products have a similar sequence to the primers in the second PCR is low, and therefore, in the second PCR, the probability of amplifying only the fragment having the sequence of the target is low can rise RT-PCR is a PCR method that includes performing a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase as a previous step of PCR.

핵산의 증폭 이후 진단 시약을 혼합하여 증폭된 핵산 시료에 표적 DNA가 존재하는지 검출하는 단계를 수행할 수 있다. 검출 단계는 프로브 분석 반응(probe assay), 혼성화 분석 반응(hybridization assay), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석 반응(oligonucleotide ligation assay), PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction) 등에 사용되는 시약을 이용해 수행될 수 있다.After the amplification of the nucleic acid, a step of detecting whether the target DNA is present in the amplified nucleic acid sample may be performed by mixing a diagnostic reagent. The detection step is performed using reagents used in probe assay, hybridization assay, oligonucleotide ligation assay, PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), etc. can be performed.

또, 표적 DNA의 검출은 DNA 칩, 겔 전기 영동법, 방사성 측정, 형광/인광 측정 등을 통해 수행될 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지 않음은 물론이다.In addition, the detection of the target DNA may be performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence/phosphorescence measurement, etc., of course, the present invention is not limited thereto.

검출 대상 바이러스는 apple necrosis 바이러스(NC040469, NC040470, NC040471 등), banana bunchy top 바이러스(NC003473, NC003474, NC003475, NC003476, NC003477, NC003479 등), cherry leaf roll 바이러스(NC015414, NC015415 등), cherry necrotic rusty mottle 바이러스(NC002468 등), citrus psorosis 바이러스(NC006314, NC006315, NC006316 등), citrus ringspot 바이러스(NC003093 등), citrus vein enation 바이러스(NC021564 등), grapevine fanleaf 바이러스(NC003615, NC003623 등), peach phony 바이러스, peach rosette mosaic 바이러스, peach wart 바이러스, plum line pattern 바이러스(NC003451, NC003452, NC003453 등), prune dwarf 바이러스(NC008037, NC008038, NC008039 등), raspberry ringspot 바이러스(NC005266, NC005267 등), tomato black ring 바이러스(NC004439, NC004440 등), 또는 tomato bushy stunt 바이러스(NC001554 등)일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.Viruses to be detected are apple necrosis virus (NC040469, NC040470, NC040471, etc.), banana bunchy top virus (NC003473, NC003474, NC003475, NC003476, NC003477, NC003479, etc.), cherry leaf roll virus (NC015414, NC015415, etc.), cherry necrotic rusty mottle Virus (NC002468, etc.), citrus psorosis virus (NC006314, NC006315, NC006316, etc.), citrus ringspot virus (NC003093, etc.), citrus vein enation virus (NC021564, etc.), grapevine fanleaf virus (NC003615, NC003623, etc.), peach phony virus, peach rosette mosaic virus, peach wart virus, plum line pattern virus (NC003451, NC003452, NC003453, etc.), prune dwarf virus (NC008037, NC008038, NC008039, etc.), raspberry ringspot virus (NC005266, NC005267, etc.), tomato black ring virus (NC004439, NC004440, etc.), or tomato bushy stunt virus (NC001554, etc.), but the present invention is not limited thereto.

이하, 실험예를 참조하여 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples.

실시예 1. 버퍼의 제조Example 1. Preparation of buffer

실시예 1-1. 제1 버퍼의 제조Example 1-1. Preparation of the first buffer

2M의 Tris-HCl(pH 7.0)을 25ml, 0.5M의 EDTA를 2.5ml, 메타중아황산나트륨(분말상)을 0.25g, PVP K30(분말상)을 1.0g 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제1 버퍼의 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.25ml of 2M Tris-HCl (pH 7.0), 2.5ml of 0.5M EDTA, 0.25g of sodium metabisulfite (powder), and 1.0g of PVP K30 (powder) were mixed to make a final volume of 50ml. The pH of the first buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-2. 제2 버퍼의 제조Example 1-2. Preparation of the second buffer

20%의 SDS를 12.5ml, 0.5M의 EDTA를 2.5ml, 소듐 시트레이트(분말상)을 1.93g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 1.0ml 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제2 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.12.5ml of 20% SDS, 2.5ml of 0.5M EDTA, 1.93g of sodium citrate (powder), and 1.0ml of 1M Tris-HCl (pH 7.4) were mixed so that the final volume was 50ml. The final pH of the second buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-3. 제3 버퍼의 제조Examples 1-3. Preparation of the third buffer

5M의 염화소듐을 45ml, 염화칼륨(분말상)을 0.37g, 소듐 시트레이트(분말상)을 1.93g, PVP K30(분말상)을 1.0g 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제3 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.45 ml of 5M sodium chloride, 0.37 g of potassium chloride (powder), 1.93 g of sodium citrate (powder), and 1.0 g of PVP K30 (powder) were mixed to make a final volume of 50 ml. The final pH of the third buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-4. 제4 버퍼의 제조Examples 1-4. Preparation of the fourth buffer

구아니딘염산(Gu-HCl)(분말상)을 19.1g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4) 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제4 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.19.1 g of guanidine hydrochloride (Gu-HCl) (powdered) was mixed with 0.75 ml of 1M Tris-HCl (pH 7.4), and the final volume was 50 ml. The final pH of the fourth buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-5. 제5 버퍼의 제조Examples 1-5. Preparation of the fifth buffer

99% 이소프로판올 용액을 30ml, 5M의 염화소듐을 1.5ml, 99% 트윈-21 용액을 10㎕ 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제5 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.30 ml of 99% isopropanol solution, 1.5 ml of 5M sodium chloride, and 10 μl of 99% Tween-21 solution were mixed so that the final volume was 50 ml. The final pH of the fifth buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-6. 제6 버퍼의 제조Example 1-6. Preparation of the sixth buffer

99% 에탄올 용액을 30ml, 구아니딘염산(Gu-HCl)(분말상)을 7.976g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제6 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.30ml of 99% ethanol solution, 7.976g of guanidine hydrochloric acid (Gu-HCl) (powder), and 0.75ml of 1M Tris-HCl (pH 7.4) were mixed so that the final volume was 50mL. The final pH of the sixth buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 1-7. 제7 버퍼의 제조Examples 1-7. Preparation of the seventh buffer

99% 에탄올 용액을 37.5ml, 5M의 염화소듐을 0.2ml, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제7 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.37.5ml of 99% ethanol solution, 0.2ml of 5M sodium chloride, and 0.75ml of 1M Tris-HCl (pH 7.4) were mixed so that the final volume was 50mL. The final pH of the seventh buffer was in the range of 7.0 to 7.4.

실시예 2. RNA 추출Example 2. RNA extraction

실시예 2-1. 시료 준비 및 제4 버퍼 혼합Example 2-1. Sample preparation and fourth buffer mixing

시료로 고추의 잎을 준비하였다. 그리고 비드 비팅 튜브(2ml)에 대상 시료 100mg와 제4 버퍼 400㎕, 및 99% β-메르캅토에탄올 50㎕를 넣고 5m/s 조건으로 60초 동안 파쇄하였다. 이후 강하게 볼텍싱(vortexing)한 후 스핀 다운(spin-down)하였다.Pepper leaves were prepared as a sample. Then, 100 mg of the target sample, 400 μl of the fourth buffer, and 50 μl of 99% β-mercaptoethanol were placed in a bead beating tube (2 ml) and disrupted for 60 seconds at 5 m/s. After strongly vortexing, spin-down was performed.

실시예 2-2. 제3 버퍼 혼합Example 2-2. 3rd Buffer Mix

실시예 2-1의 결과물에 제3 버퍼 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 60℃에서 5분간 배양하였다.450 μl of the third buffer was added to the resultant of Example 2-1, vortexed strongly, and incubated at 60° C. for 5 minutes.

실시예 2-3. 제1 버퍼 혼합Example 2-3. first buffer mix

실시예 2-2의 결과물에 제1 버퍼 300㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심 분리하였다.After adding 300 μl of the first buffer to the resultant of Example 2-2 and vortexing strongly, the culture was centrifuged at 13,000 rpm at 4° C. for 5 minutes.

실시예 2-4. 제2 버퍼 혼합Example 2-4. Second Buffer Mix

실시예 2-3의 결과물에 제2 버퍼 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 실온에서 1분간 배양하였다. 그리고 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 3분간 원심 분리하였다.450 μl of the second buffer was added to the resultant of Example 2-3, vortexed strongly, and incubated at room temperature for 1 minute. And the culture was centrifuged for 3 minutes at 13,000rpm at 4 ℃.

실시예 2-5. 이소프로판올 혼합물 로딩 및 제5 버퍼 세척Example 2-5. Loading the isopropanol mixture and washing the fifth buffer

실시예 2-4의 결과물의 상층액 800㎕를 2ml 튜브에 옮겨 담았다. 그 다음 이소프로판올 400㎕을 넣고 강하게 볼텍싱하였다.800 μl of the supernatant of the result of Example 2-4 was transferred to a 2 ml tube. Then, 400 μl of isopropanol was added and vortexed vigorously.

그리고 스핀 컬럼에 600㎕씩 로딩하여 원심 분리하였다. 그리고 제5 버퍼 700㎕ 투입 후 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 1회 세척하였다.Then, each 600 μl of the spin column was loaded and centrifuged. Then, 700 μl of the fifth buffer was added, followed by centrifugation at 4° C. at 13,000 rpm for 30 seconds, followed by washing once.

실시예 2-6. DNase 처리 및 제6 버퍼 세척Example 2-6. DNase treatment and 6th buffer wash

이어서 제5 버퍼가 통과한 스핀 컬럼 멤브레인에 DNAse 용액 (DNase 5 내지 10 unit, DNase buffer) 50uL를 투입 후 실온에서 15분간 반응한다. 반응 종료 후 제6 버퍼 600㎕ 투입 후 60초간 대기하고 다음으로 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 1회 세척하였다.Next, 50 uL of a DNAse solution (DNase 5 to 10 units, DNase buffer) is added to the spin column membrane through which the fifth buffer has passed, and then reacted at room temperature for 15 minutes. After completion of the reaction, 600 μl of the sixth buffer was added, waited for 60 seconds, and then centrifuged at 13,000 rpm at 4° C. for 30 seconds, followed by washing once.

실시예 2-7. 제7 버퍼 세척Example 2-7. 7th Buffer Wash

이어서 제7 버퍼 600㎕ 투입 후 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 세척하였다. 이를 한번 더 반복하여 총 2회 세척하였다.Then, 600 μl of the 7th buffer was added and washed by centrifugation at 4° C. at 13,000 rpm for 30 seconds. This was repeated once more for a total of two washes.

실시예 2-8. 핵산 회수 및 전기 영동Examples 2-8. Nucleic Acid Recovery and Electrophoresis

이어서 4℃에서 13,000rpm으로 2분 간 원심 분리하고, RNAse free water 50㎕를 투입하여 4℃에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하였다. 회수된 RNA를 Agarose 2%, 0.5X TBE로 구성된 Bleach gel에 400ng을 정량하여 전기 영동하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.Then, centrifugation was performed at 13,000 rpm at 4° C. for 2 minutes, 50 μl of RNAse free water was added, and centrifugation was performed at 4° C. at 13,000 rpm for 30 seconds. The recovered RNA was electrophoresed by quantifying 400ng on a Bleach gel composed of agarose 2% and 0.5X TBE. The results are shown in FIG. 3 .

도 3을 참조하면, 본 발명에 따른 버퍼들 및 추출 방법을 이용할 경우 고추 시료에서 우수한 품질의 핵산을 추출하는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 3 , it was confirmed that excellent quality nucleic acids were extracted from the pepper samples when the buffers and extraction method according to the present invention were used.

실시예 3. 제4 버퍼의 2차 사용Example 3. Secondary use of the fourth buffer

실시예 2-3과 실시예 2-4 사이에 제4 버퍼를 2차로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 2차 제4 버퍼는 400㎕ 혼합하였다. Nucleic acid was recovered and electrophoresed in the same manner as in Example 2, except that the fourth buffer was mixed a second time between Examples 2-3 and 2-4, and the results are shown in FIG. 4 . 400 μl of the second and fourth buffer was mixed.

도 4를 참조하면, 2차로 제4 버퍼를 혼합한 경우에도 우수한 품질의 핵산을 추출하는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 4 , it was confirmed that nucleic acids of excellent quality were extracted even when the fourth buffer was secondarily mixed.

비교예 1. 타사 제품을 이용한 핵산 회수Comparative Example 1. Nucleic acid recovery using a third-party product

비교예 1-1. QIAGEN N.V.사Comparative Example 1-1. QIAGEN N.V.

QIAGEN N.V. (hilden, Germany)사의 RNeasy plant mini kit을 사용하여 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA), 고추(PP)에서 핵산을 추출하였고 추출한 핵산을 전기 영동한 결과를 도 5에 나타내었다. QIAGEN N.V. Mango (MG), strawberry (SB), grape (GV), tomato (TM), peach (PC), banana (BN), pear tree (PA), red pepper ( PP) was extracted, and the result of electrophoresis of the extracted nucleic acid is shown in FIG. 5 .

도 5를 참조하면, 토마토(TM)와 복숭아(PC)를 제외한 다른 시료, 특히 고추(PP) 시료에서 추출된 RNA의 품질 및 수율이 낮았고 분해된 양상을 보였다.Referring to FIG. 5 , the quality and yield of RNA extracted from other samples except tomato (TM) and peach (PC), particularly, from red pepper (PP) samples were low and showed degradation.

즉, 퀴아젠 사에서 시판 중인 RNeasy 플랜트 미니 키트(RNeasy plant mini kit)를 이용해서는 고추 시료의 핵산 추출에 적용할 수 없었다.That is, using the RNeasy plant mini kit commercially available from Qiagen, it could not be applied to nucleic acid extraction of pepper samples.

비교예 1-2. Norgen Biotek Corp.사Comparative Example 1-2. Norgen Biotek Corp.

Norgen Biotek Corp. (Thorold, Canada)사의 Plant RNA/DNA Purification Kit (Cat. 24400)을 사용하여 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA), 고추(PP)에서 핵산을 추출하였고 추출한 핵산을 전기 영동한 결과를 도 6에 나타내었다. Norgen Biotek Corp. Mango (MG), strawberry (SB), grape (GV), tomato (TM), peach (PC), banana (BN), Nucleic acids were extracted from pear trees (PA) and red pepper (PP), and the results of electrophoresis of the extracted nucleic acids are shown in FIG. 6 .

도 6을 참조하면, 망고(MG)에서는 핵산이 분해된 양상으로 나타났고. 배나무(PA)에선 핵산 이외의 산물이 함께 추출되어 band가 끌리는 현상을 나타내고 있으며 고추(PP)의 경우 28S rRNA 같은 보다 큰 분자의 RNA는 완전히 분해된 양상을 나타내었다.Referring to FIG. 6 , the nucleic acid was decomposed in mango (MG). In the case of pear tree (PA), products other than nucleic acids are extracted together, indicating a band dragging phenomenon, and in the case of red pepper (PP), RNA of larger molecules such as 28S rRNA was completely decomposed.

즉, 노르겐 바이오텍 사에서 시판 중인 플랜트 핵산 정제 키트(Plant RNA/DNA Purification Kit)를 이용해서는 고추 시료의 핵산 추출에 적용할 수 없었다.That is, it could not be applied to nucleic acid extraction of pepper samples using a plant nucleic acid purification kit (Plant RNA/DNA Purification Kit) commercially available from Norgen Biotech.

비교예 2. 버퍼의 순서를 변경(1)Comparative Example 2. Changing the buffer order (1)

버퍼 1, 버퍼 2, 버퍼 3 및 버퍼 4를 순차적으로 혼합하여 핵산을 추출하고 전기 영동하여 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 시료로는 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA), 고추(PP)를 이용하였다.Buffer 1, Buffer 2, Buffer 3, and Buffer 4 were sequentially mixed to extract nucleic acids and electrophoresis, and the results are shown in FIGS. 7 and 8 . As samples, mango (MG), strawberry (SB), grape (GV), tomato (TM), peach (PC), banana (BN), pear tree (PA), and red pepper (PP) were used.

도 7 및 도 8을 참조하면, 버퍼 1 내지 버퍼 4를 순차적으로 이용할 경우, 망고, 딸기, 포도, 토마토, 복숭아, 바나나 및 배나무에서는 우수한 품질의 핵산을 추출할 수 있는 반면, 고추에서는 추출된 RNA의 품질 및 수율이 낮았고 분해된 양상을 보였다. 즉, 버퍼의 혼합 순서에 따라 추출되는 핵산의 품질이 영향을 받는 것을 확인할 수 있다.7 and 8, when buffers 1 to 4 are sequentially used, nucleic acids of excellent quality can be extracted from mango, strawberry, grape, tomato, peach, banana and pear tree, whereas RNA extracted from red pepper was of low quality and yield and showed decomposition. That is, it can be confirmed that the quality of the extracted nucleic acids is affected by the mixing order of the buffer.

비교예 3. 일부 버퍼 농도 및 순서를 조정하여 수행Comparative Example 3. Performed by adjusting some buffer concentrations and sequences

비교예 3-1. 실시예 2-2를 변경(샘플 4)Comparative Example 3-1. Modified Example 2-2 (Sample 4)

고추잎 시료를 이용하여, 실시예 2-2에서 4.5M의 염화소듐 대신에, 3M의 NaOAc를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 9의 샘플 4에 나타내었다.Using a red pepper leaf sample, nucleic acid recovery and electrophoresis were performed in the same manner as in Example 2, except that 3M NaOAc was used instead of 4.5M sodium chloride in Example 2-2. 4 is shown.

비교예 3-2. 실시예 2-1을 변경(샘플 6)Comparative Example 3-2. Modified Example 2-1 (Sample 6)

고추 시료를 이용하여, 실시예 2-1에서 제4 버퍼의 구아니딘 염산의 농도를 4M이 아닌 1M을 적용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 9의 샘플 6에 나타내었다.Using a red pepper sample, nucleic acid recovery and electrophoresis were performed in the same manner as in Example 2, except that the concentration of guanidine hydrochloride in the fourth buffer in Example 2-1 was 1M instead of 4M, and the results are shown in FIG. Sample 6 is shown.

도 9를 참조하면, 모든 샘플들에서 RNA가 완전히 분해된 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 9 , it can be confirmed that RNA is completely degraded in all samples.

비교예 4. 버퍼의 조성을 조정하여 수행Comparative Example 4. Performed by adjusting the composition of the buffer

실시예 2-1의 제4 버퍼에서, 구아니딘염산 대신에 구아니딘티오시안을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.In the fourth buffer of Example 2-1, nucleic acid was recovered and electrophoresed in the same manner as in Example 2 except that guanidinethiocyanate was used instead of guanidine hydrochloride, and the results are shown in FIG. 10 .

도 10을 참조하면, 시료에서 RNA가 분해된 양상을 나타내었고 RNA 수율이 낮은 것으로 확인되었다.Referring to FIG. 10 , it was confirmed that RNA was degraded in the sample and the RNA yield was low.

비교예 5. 가열 과정을 생략하여 수행Comparative Example 5. Omitting the heating process

실시예 2-2에서, 60℃ 가열을 생략한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.In Example 2-2, nucleic acid was recovered and electrophoresed in the same manner as in Example 2 except that heating at 60° C. was omitted, and the results are shown in FIG. 11 .

도 11을 참조하면, 고추 시료에서 확연히 RNA 추출양이 감소한 것을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 11 , it can be seen that the amount of RNA extracted from the pepper sample was significantly reduced.

비교예 6. 버퍼의 순서를 변경(2)Comparative Example 6. Changing the buffer order (2)

비교예 6-1. 제1 버퍼의 생략(1)Comparative Example 6-1. Omission of the first buffer (1)

고추잎을 제3 버퍼로 균질하고 제2 버퍼를 혼합하여 1차 원심 분리 후 상층액에 제4 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 핵산을 추출하고 전기 영동하여, 그 결과를 도 12의 샘플 1에 나타내었다.The red pepper leaves are homogenized with the third buffer, the second buffer is mixed, the fourth buffer is added to the supernatant after the first centrifugation, and the nucleic acid is extracted by centrifugation and electrophoresis, and the result is shown in Sample 1 of FIG. It was.

비교예 6-2. 제1 버퍼의 생략(1)Comparative Example 6-2. Omission of the first buffer (1)

고추잎을 제3 버퍼로 균질하고 제2 버퍼를 혼합하여 1차 원심 분리 후 상층액에 제3 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 핵산을 추출하고 전기 영동하여, 그 결과를 도 12의 샘플 2에 나타내었다.The red pepper leaves are homogenized with the third buffer, the second buffer is mixed, the third buffer is added to the supernatant after the first centrifugation, and the nucleic acid is extracted by centrifugation and electrophoresis, and the result is shown in Sample 2 of FIG. It was.

도 12를 참조하면, 제1 버퍼 없이 균질한 경우 RNA의 품질이 불량하였다.Referring to FIG. 12 , in the case of homogenization without the first buffer, the quality of RNA was poor.

구체적으로, 샘플 1을 참조하면 제3 버퍼로 균질하고 제1 버퍼 없이 제4 버퍼로 2차 침전한 경우, 고추잎의 RNA 분해를 효과적으로 억제하지 못한 것을 확인할 수 있다.Specifically, referring to Sample 1, it can be seen that when homogeneous with the third buffer and secondary precipitation with the fourth buffer without the first buffer, RNA degradation of red pepper leaves was not effectively inhibited.

또 샘플 2를 참조하면, 제4 버퍼로 균질하고 제1 버퍼 없이 제3 버퍼로 2차 침전한 경우, RNA가 소폭 분해한 양상을 나타내었다.Also referring to sample 2, when homogenized with the fourth buffer and secondary precipitation with the third buffer without the first buffer, RNA was slightly degraded.

즉, 이러한 결과를 보았을 때, RNase가 과발현되는 특정 식물, 예컨대 고추잎 또는 동등한 특성을 갖는 조직의 경우 제4 버퍼로 우선 균질 후 이후 과정을 진행하는 것이 온전한 RNA를 추출하는데 최선일 것으로 확인되었다.That is, when looking at these results, in the case of a specific plant in which RNase is overexpressed, such as red pepper leaf or tissue having the same characteristics, it was confirmed that it would be best to extract the intact RNA after homogenization with the fourth buffer first and then proceeding with the subsequent process.

비교예 7. 다른 시료를 대상으로 한 추출Comparative Example 7. Extraction with other samples

시료로 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA)의 잎조직을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산을 추출하고 전기 영동하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.The same as in Example 2, except that leaf tissues of mango (MG), strawberry (SB), grape (GV), tomato (TM), peach (PC), banana (BN), and pear tree (PA) were used as samples. Nucleic acid was extracted by the method and electrophoresed, and the results are shown in FIG. 13 .

도 13을 참조하면, RNA의 수율이 낮거나 또는 전혀 없었으며 RNA 이외의 2차 대사물질이 혼합되어 밴드가 희미하게 끌리는 현상이 확인되었다.Referring to FIG. 13 , it was confirmed that the yield of RNA was low or no, and the band was faintly attracted due to the mixing of secondary metabolites other than RNA.

실험예 1. RNA 순도 및 추출량 측정Experimental Example 1. Measurement of RNA purity and extraction amount

전술한 실시예 2, 비교예 1-1 및 비교예 1-2의 방법에 따라 핵산을 추출한 순도와 추출량을 측정하였다. 그리고 그 결과를 각각 도 14 내지 도 16에 나타내었다.According to the method of Example 2, Comparative Example 1-1 and Comparative Example 1-2 described above, the purity and extraction amount of the nucleic acids were measured. And the results are shown in FIGS. 14 to 16, respectively.

RNA와 DNA는 자외선 파장대인 260nm를 강하게 흡수하고, 단백질과 페놀류는 280nm 파장을, 염(salt), 탄수화물 및 페놀류는 230nm 파장을 강하게 흡수한다. 추출한 RNA는 UV spectrometer 장비로 순수한 물을 기준으로 흡광도를 측정할 수 있다. 260nm 흡광도를 230 또는 280로 나눈 값을 각각 A260/A230, 또는 A260/A280이라 정의한다. RNA and DNA strongly absorb a wavelength of 260 nm, which is the ultraviolet wavelength band, proteins and phenols strongly absorb a wavelength of 280 nm, and salts, carbohydrates and phenols strongly absorb a wavelength of 230 nm. The absorbance of the extracted RNA can be measured based on pure water with a UV spectrometer. A value obtained by dividing absorbance at 260 nm by 230 or 280 is defined as A260/A230 or A260/A280, respectively.

260의 흡광도 값이 230 또는 280보다 약 2배 이상 높은 경우 순수한 RNA로 볼 수 있으며, 시료가 오염될수록 해당 값이 낮아진다. 예를 들어, 구아니딘염 또는 페놀에 오염될 경우 230nm 흡광도가 증가하고, 특히 페놀 오염이 증가할 경우 260nm 흡광도가 증가하여 실제 추출된 RNA 양에 비해 overestimate 될 수 있다. 즉, 고순도의 RNA가 추출된 경우 A260/A230, 또는 A260/A280의 값은 2.0 내지 2.2 사이이다.When the absorbance value of 260 is about twice or more higher than that of 230 or 280, it can be considered as pure RNA, and the more contaminated the sample, the lower the value. For example, when contamination with guanidine salt or phenol increases the absorbance at 230 nm, especially when contamination of phenol increases, the absorbance at 260 nm increases, which may be overestimated compared to the actual amount of extracted RNA. That is, when high-purity RNA is extracted, the value of A260/A230 or A260/A280 is between 2.0 and 2.2.

도 14 내지 도 16을 참조하면, 실시예 2에 따를 경우 비교군인 상용 키트 보다 높거나, 적어도 동등 수준의 품질과 회수율을 나타내었다. 참고로 도 14의 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN) 및 배(PA)의 결과는 본 발명과 무관하다.Referring to FIGS. 14 to 16 , according to Example 2, higher or at least the same level of quality and recovery rate than that of a commercial kit as a comparative group. For reference, the results of mango (MG), strawberry (SB), grape (GV), tomato (TM), peach (PC), banana (BN), and pear (PA) in FIG. 14 are irrelevant to the present invention.

실험예 2. RNA 증폭 곡선 및 융해 곡선Experimental Example 2. RNA amplification curve and melting curve

전술한 실시예 2를 통해 추출한 RNA가 qPCR 같은 downstream analysis에 적합한지 평가하기 위해 total RNA 1ug을 reverse transcription하여 cDNA 만든 뒤 각 시료의 house-keeping gene을 PCR 증폭하였다.To evaluate whether the RNA extracted in Example 2 is suitable for downstream analysis such as qPCR, 1ug of total RNA was reverse transcribed to make cDNA, and then the house-keeping gene of each sample was PCR amplified.

cDNA 합성은 AccuPower® CycleScript™ RT PreMix (dN6) (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 사용하여 total RNA 1μg을 첨가하여 제조사 protocol에 따라 합성하였다. 합성된 cDNA는 10배 희석하여 template으로 사용했다. For cDNA synthesis, 1 μg of total RNA was added using AccuPower® CycleScript™ RT PreMix (dN6) (Bioneer, Daejeon, South Korea) according to the manufacturer's protocol. The synthesized cDNA was diluted 10-fold and used as a template.

그리고 문헌 조사를 통해 낮은 발현량을 가진 유전자를 선별하였다. realtime PCR 분석에 사용된 유전자와 그 프라이머 서열은 하기 표 1에 정리하였다.Then, a gene with a low expression level was selected through a literature search. Genes and their primer sequences used for real-time PCR analysis are summarized in Table 1 below.

식물명botanical name Forward 프라이머Forward primer Reverse 프라이머Reverse primer 참고문헌references PepperPepper >ACTTGTTATGGTAGGGATGGGTC
>Histone H3
GACTGATCTGCGTTTCCAGA>ACTTGTTATGGTAGGGATGGGTC
>Histone H3
GACTGATCTGCGTTTCCAGA >ACT
TTCTCTCTATTTGCCTTGGG
>Histone H3
TTGAATGTCCTTGGGCATAA>ACT
TTCTCTCTATTTGCCTTGGG
>Histone H3
TTGAATGTCCTTGGGCATAA (Cheng et al., 2017, Muller et al., 2015)(Cheng et al., 2017, Muller et al., 2015)

기준 유전자에 특이적인 프라이머를 이용해 준비된 cDNA로부터 realtime PCR을 수행하였다. Realtime PCR은 qTower3 (Analytik jena, Jena, Germany) 장비를 사용하였다. PCR mix는 2X SFC green qPCR master mix (SFC Co., Ltd., Chungbuk, South Korea) 10 μl, template 5 μl, primer mix (forward and reverse each 10uM) 2 μl, RNase free water 3 μl를 1 reaction으로 triplicate하였으며 heat activation 및 pre-denuature를 위해 95℃ 5min 간 가열 후 95℃ 15초, 58℃ 15초, 72℃(FAM 형광 검출) 20초로 45 cycle 반복하였다. Real-time PCR was performed from the prepared cDNA using primers specific to the reference gene. Realtime PCR was performed using qTower3 (Analytik jena, Jena, Germany) equipment. PCR mix is 2X SFC green qPCR master mix (SFC Co., Ltd., Chungbuk, South Korea) 10 μl, template 5 μl, primer mix (forward and reverse each 10uM) 2 μl, RNase free water 3 μl in 1 reaction It was triplicated, and after heating at 95°C for 5 min for heat activation and pre-denuature, 45 cycles of 95°C 15 sec, 58°C 15 sec, 72°C (FAM fluorescence detection) 20 sec were repeated.

고추에서 Histone H3와 ACT 같은 housekeeping 유전자를 선택하였다. (Cheng et al., 2017, M

ller et al., 2015)Housekeeping genes such as Histone H3 and ACT were selected from pepper. (Cheng et al. , 2017, M.

ller et al. , 2015)

그리고 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17을 참조하면, 각각의 유전자가 모두 증폭되어 baseline threshold 이상으로 형광값이 측정되었으며, 정상적인 Realtime PCR 증폭과정에서 관찰되는 전형적인 패턴, initiation phase, exponential phase 그리고 linear phase가 관찰되었다.And the results are shown in FIG. 17 . Referring to FIG. 17 , each gene was amplified and fluorescence values were measured above the baseline threshold, and typical patterns observed in the normal realtime PCR amplification process, initiation phase, exponential phase, and linear phase were observed.

PCR 단계 종료 후 융해곡선 분석을 위해 95℃ 1분 가열 후 65℃~95℃까지 0.5℃씩 15초간 hold하며 FAM 형광을 검출하였다. (Ririe et al., 1997) genomic DNA의 오염 또는 비특이적인 PCR 산물 형성을 확인하기 위해 융해곡선 분석을 실시한 결과, 각 PCR 산물의 융해온도는 최저 78.62℃에서 최고 85.48℃ 인 것으로 확인되었으며, 융해곡선의 양상 또한 gDNA의 오염 또는 비특이적인 산물의 형성이 의심되는 peak 없이 모두 단일 peak를 형성하였다.After completion of the PCR step, the FAM fluorescence was detected by heating at 95°C for 1 minute and then holding at 65°C to 95°C for 15 seconds at 0.5°C for analysis of the melting curve. (Ririe et al. , 1997) As a result of melting curve analysis to confirm the contamination of genomic DNA or the formation of non-specific PCR products, it was confirmed that the melting temperature of each PCR product was from a minimum of 78.62°C to a maximum of 85.48°C, and the melting curve Also, all of the single peaks were formed without peaks suspected of gDNA contamination or formation of non-specific products.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. In the above, the embodiment of the present invention has been mainly described, but this is only an example and does not limit the present invention. It will be appreciated that various modifications and applications not exemplified above are possible.

따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Therefore, it should be understood that the scope of the present invention includes changes, equivalents or substitutes of the technical ideas exemplified above. For example, each component specifically shown in the embodiment of the present invention may be implemented by modification. And the differences related to these modifications and applications should be construed as being included in the scope of the present invention defined in the appended claims.

Claims

고추 또는 피망을 포함하는 과수작물로부터 유래한 시료로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,
구아니딘염산(Gu-HCl) 및 Tris-HCl을 포함하는 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계;
염화소듐을 포함하는 제3 버퍼를 혼합하는 단계;
Tris-HCl 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 제1 버퍼를 혼합하는 단계;
황산도데실소듐, 및 EDTA를 포함하는 제2 버퍼를 혼합하고 원심 분리하는 단계; 및
상기 원심 분리된 상층액 중 적어도 일부를 컬럼에 로딩하는 단계를 포함하되, 상기 각 단계들을 순차적으로 수행하는, 방법.A method for extracting nucleic acids from a sample derived from an orchard containing red pepper or green pepper, the method comprising:
mixing a fourth buffer containing guanidine hydrochloride (Gu-HCl) and Tris-HCl with the sample;
mixing a third buffer containing sodium chloride;
Mixing a first buffer containing Tris-HCl and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA);
mixing and centrifuging a second buffer containing dodecyl sodium sulfate and EDTA; and
A method comprising loading at least a portion of the centrifuged supernatant into a column, wherein each step is performed sequentially.

제1항에 있어서,
상기 제1 버퍼는 적어도 구아니딘염, 클로로포름 및 세틸트리메틸암모늄브로마이드를 불포함하는, 핵산을 추출하는 방법.According to claim 1,
The method for extracting nucleic acids, wherein the first buffer does not contain at least guanidine salt, chloroform and cetyltrimethylammonium bromide.

삭제delete

제1항에 있어서,
상기 제1 버퍼는,
0.8M 내지 1.2M의 상기 Tris-HCl, 및
20mM 내지 30mM의 상기 EDTA를 포함하고,
0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v)의 메타중아황산소듐(sodium metabisulfite), 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 또는 황산나트륨 중 하나 이상, 및
1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜 중 하나 이상을 더 포함하는 핵산을 추출하는 방법.According to claim 1,
The first buffer is
0.8M to 1.2M of said Tris-HCl, and
20 mM to 30 mM of the EDTA;
0.3% (w/v) to 0.7% (w/v) at least one of sodium metabisulfite, sodium sulfite, acid sodium sulfite or sodium sulfate, and
1.8% (w/v) to 2.2% (w/v) of polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone, or a method of extracting a nucleic acid further comprising one or more of polyethylene glycol.

제1항에 있어서,
상기 제2 버퍼는,
3%(w/v) 내지 8%(w/v)의 상기 SDS, 및
20mM 내지 30mM의 상기 EDTA를 포함하고,
120mM 내지 180mM의 소듐시트레이트(sodium citrate), 및
15mM 내지 25mM의 Tris-HCl을 더 포함하는, 핵산을 추출하는 방법.According to claim 1,
The second buffer,
3% (w/v) to 8% (w/v) of the SDS, and
20 mM to 30 mM of the EDTA;
120 mM to 180 mM sodium citrate, and
A method for extracting nucleic acids, further comprising 15 mM to 25 mM Tris-HCl.

제1항에 있어서,
상기 제3 버퍼는,
4.2M 내지 4.8M의 상기 염화소듐을 포함하고,
80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄 중 하나 이상, 및
1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함하는, 핵산을 추출하는 방법.According to claim 1,
The third buffer is
4.2M to 4.8M of the sodium chloride,
80 mM to 120 mM of potassium chloride, calcium chloride, ferric chloride, ferrous chloride, ammonium aluminum or ammonium sulfate, and
1.8% (w / v) to 2.2% (w / v) of polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone or polyethylene glycol, further comprising a method of extracting a nucleic acid.

제1항에 있어서,
상기 제4 버퍼는,
3.5M 내지 4.5M의 상기 구아니딘염산, 및
10mM 내지 20mM의 상기 Tris-HCl을 포함하는, 핵산을 추출하는 방법.According to claim 1,
The fourth buffer,
3.5M to 4.5M of said guanidine hydrochloride, and
A method of extracting a nucleic acid comprising the Tris-HCl of 10 mM to 20 mM.

제1항에 있어서,
상기 제4 버퍼와 상기 제3 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2이고,
상기 제4 버퍼와 상기 제1 버퍼의 사용 부피비는 1:0.6 내지 1:0.8이고,
상기 제4 버퍼와 상기 제2 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2이고,
상기 제4 버퍼의 사용 부피는 350㎕ 내지 450㎕인 핵산의 추출 방법.According to claim 1,
The use volume ratio of the fourth buffer and the third buffer is 1:1.1 to 1:1.2,
The use volume ratio of the fourth buffer and the first buffer is 1:0.6 to 1:0.8,
The use volume ratio of the fourth buffer and the second buffer is 1:1.1 to 1:1.2,
The volume of the fourth buffer used is 350 μl to 450 μl.

제1항에 있어서,
상기 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계는,
상기 제4 버퍼, 상기 시료 및 환원제 40㎕ 내지 60㎕를 혼합하는 단계, 및
상기 시료를 파쇄하는 단계를 포함하되,
상기 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 0.3M 내지 0.7M의 TCEP-HCl 또는 0.8M 내지 1.2M의 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함하고,
상기 제4 버퍼와 상기 환원제의 사용 부피비는 1:0.08 내지 1:0.15인 핵산의 추출 방법.According to claim 1,
The step of mixing the fourth buffer with the sample,
mixing 40 μl to 60 μl of the fourth buffer, the sample and the reducing agent, and
Comprising the step of crushing the sample,
The reducing agent includes β-mercaptoethanol, 0.3M to 0.7M of TCEP-HCl, or 0.8M to 1.2M of dithiothreitol (DTT),
The volume ratio of the fourth buffer and the reducing agent used is 1:0.08 to 1:0.15.

제9항에 있어서,
상기 제3 버퍼를 혼합한 후 상기 제1 버퍼를 혼합하기 전에, 혼합물을 55℃ 내지 65℃에서 2분 내지 8분 배양하는 제1 배양 단계;
상기 제1 버퍼를 혼합한 후, 30초 내지 5분 배양하는 제2 배양 단계; 및
상기 제2 버퍼를 혼합한 후, 30초 내지 5분 배양하는 제3 배양 단계를 더 포함하고,
상기 컬럼에 로딩하는 단계는,
원심 분리 단계의 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계를 포함하는 핵산의 추출 방법.10. The method of claim 9,
a first incubation step of culturing the mixture at 55° C. to 65° C. for 2 minutes to 8 minutes after mixing the third buffer and before mixing the first buffer;
After mixing the first buffer, a second incubation step of culturing for 30 seconds to 5 minutes; and
After mixing the second buffer, further comprising a third incubation step of culturing for 30 seconds to 5 minutes,
The step of loading into the column,
A method of extracting nucleic acids comprising the step of loading a mixture of the supernatant of the centrifugation step with isopropanol (isopropanol) on a column.

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제1항에 따른 방법을 수행하도록 구성된, 핵산 추출 키트.A nucleic acid extraction kit configured to perform the method according to claim 1 .