KR102094079B1 - Composition for extracting viral RNA using silica-coated magnetic beads and method for extracting viral RNA using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출용 조성물에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 비용문제로 샘플을 풀링(pooling) 하는 단계를 생략함으로 써 정밀한 바이러스 발생 감시를 가능하게 할 뿐만 아니라 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.The present invention relates to a method for extracting viral RNA using a silica-coated magnetic bead, and effectively removes various contaminants from a sample, enabling more sensitive diagnosis of a virus derived from a sample, and using a cheap reagent compared to a composition for extracting RNA. Therefore, by omitting the step of pooling samples due to cost problems, it is possible not only to enable precise virus outbreak monitoring, but also to expand the scale of virus diagnosis experiments and various surveillance projects that mediate disease, and accordingly public health. Can contribute to

Figure R1020180087986
Figure R1020180087986

Description

실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법{Composition for extracting viral RNA using silica-coated magnetic beads and method for extracting viral RNA using the same}Composition for extracting viral RNA using silica-coated magnetic beads and method for extracting viral RNA using the same}

본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for viral RNA extraction using silica-coated magnetic beads and a method for extracting viral RNA using the same.

기존 바이러스 RNA 추출 키트는 무세포(cell-free), 세포 배양 플루이드(cell culture fluid), 플라스마(plasma) 등 비교적 깨끗한 샘플로부터 핵산을 추출하는 것에 최적화 되어있다. 대게는 고가의 제품군에선 카오트로픽 염(Chaotropic salt)를 사용하는 경향이 있고 저가의 제품군에선 페놀, 클로로포름 등을 사용하는 경향이 있다. Existing viral RNA extraction kits are optimized for extracting nucleic acids from relatively clean samples such as cell-free, cell culture fluid, and plasma. Usually, high-priced products tend to use chaotropic salts, while low-priced products tend to use phenol and chloroform.

카오트로픽 염 같은 경우 단백질 분자 주변의 물을 강하게 빼앗아 단백질을 변형시키며 카오트로픽 염 중 하나인 구아니딘 티오시안산염(guanidine thiocyanate)의 경우 단백질을 시안화하여 영구히 변형을 시키는데 이 원리를 기반으로 RNA를 분해하는 강력한 효소인 리보뉴클레아제(Rnase)를 완전히 불활성화 시킴으로써 RNA를 온전히 뽑을 수 있도록 돕는다. In the case of the chaotropic salt, the protein is strongly deprived by taking water around the protein molecule, and in the case of one of the chaotropic salts, guanidine thiocyanate, cyanide the protein to permanently deform the protein. By completely inactivating the powerful enzyme ribonuclease (Rnase), it helps to extract RNA completely.

페놀 기반 제품의 경우 페놀의 단백질 용해능을 이용하여 샘플로부터 RNA와 단백질을 분리하고, 클로로포름을 이용하여 RNA층과 단백질층을 나눠 순도 높은 RNA를 추출할 수 있도록 돕는다. In the case of phenol-based products, RNA and protein are separated from the sample using the protein soluble ability of phenol, and chloroform is used to divide the RNA layer and the protein layer to help extract high-purity RNA.

두 제품군 모두 인체유래 또는 동물유래 샘플에 사용하기에 적합하나 주변환경에 존재하는 바이러스를 검출하고 신종바이러스의 발생을 미리 예측하는 과업인 벡터 감시(vector surveillance) 분야의 경우 바이러스 샘플이 다양한 생물(곰팡이, 식물, 선충, 세균 등)에 의해 오염되어있고 굉장히 많은 양의 샘플로부터 바이러스를 검출해야 한다는 특징이 있다. Both products are suitable for use in human-derived or animal-derived samples, but in the field of vector surveillance, a task that detects viruses present in the surrounding environment and predicts the occurrence of new viruses in advance, various virus samples are found in various organisms (fungi). , Plants, nematodes, bacteria, etc.), and the virus has to be detected from a very large sample.

이러한 상황에서 카오트로픽 염 기반의 제품은 너무 고가이며 너무 강력한 lysis 활성을 가지고 있으므로 고가임에도 불구하고 오히려 바이러스 진단율이 떨어지고 인체질병을 진단하도록 고안된 방법이기 때문에 처리 과정이 복잡하다는 한계가 있다. In this situation, the chaotropic salt-based product is too expensive and has too strong lysis activity, but despite the high price, the virus diagnosis rate is low and the method is designed to diagnose human disease, which limits the complexity of the processing.

저가의 페놀 기반 제품의 경우 다시 상 분리 타입(phase separation type)과 고체상 추출 타입(solid phase extraction type)으로 나눠지는데, 이 또한 카오트로픽 염 기반 제품과 마찬가지로 강력한 케미칼(chemical)을 사용하기 때문에 민감도가 떨어짐과 동시에 사용 중 유독한 페놀 등이 대기 중으로 방출되므로 제품을 사용하는 실험자가 이를 흡입하므로 굉장히 많은 샘플을 처리하는 벡터 감시(vector surveillance)에서 실험자의 신체를 영구적으로 손상시킬 위험성이 있다. In the case of low-cost phenol-based products, it is further divided into phase separation type and solid phase extraction type, which, like chaotropic salt-based products, uses strong chemicals, making it sensitive. At the same time as the dropping, toxic phenol and the like are released into the atmosphere during use, so the experimenter who uses the product inhales it, so there is a risk of permanently damaging the experimenter's body in vector surveillance processing a large number of samples.

언급한 두 가지 형태의 주요제품 모두 가장 큰 문제점은 바로 동물샘플에서만 효과적으로 바이러스 RNA를 추출할 수 있다는 점이다. 바이러스는 동물뿐만 아니라 식물에서도 큰 문제를 일으키고 있는데, 카오트로픽 염 기반 제품의 경우 식물 바이러스 RNA 추출 전용키트를 따로 판매하고 있다. 이는 식물이 포함하고 있는 다양한 다당류(polysaccharide), 글루코즈(glucose), 엽록소(chlorophyll) 등을 제거하는 단계와 세척 버퍼(wash buffer)가 추가적으로 포함되기 때문이다. The main problem with both types of major products mentioned above is that they can effectively extract viral RNA only from animal samples. Viruses are causing major problems in plants as well as animals. In the case of chaotropic salt-based products, kits for plant RNA extraction are sold separately. This is because the steps of removing various polysaccharides, glucose, chlorophyll, and the like contained in the plant and a washing buffer are additionally included.

페놀 기반의 제품 중 일반적으로 상 분리 타입의 경우에는 분자진단에 사용할 수 있는 품질의 RNA를 거의 추출하지 못한다. 최종적으로 처리된 RNA에 다당류, 폴리페놀 등이 풍부하게 포함되어 PCR을 강력하게 저해하기 때문이다.In the case of phase-separation type of phenol-based products, it is hard to extract RNA of a quality that can be used for molecular diagnosis. This is because the final processed RNA is rich in polysaccharides and polyphenols, which strongly inhibits PCR.

또한, 바이러스 감시에 사용되는 핵산추출키트는 인체질병진단을 목표로 개발되어 가격대가 높아, 따라서 샘플 처리량이 많을수록 큰 지출이 요구된다. In addition, the nucleic acid extraction kit used for virus monitoring has been developed with the goal of diagnosing human diseases, so the price is high, so the larger the sample throughput, the greater the expenditure.

트리졸을 이용한 액체상 상분리 RNA 추출 기법은 단백질이 페놀에 용해된다는 점과 페놀이 클로로포름에 용해된다는 점, DNA가 RNA에 비하여 산성 조건에서 쉽게 분리가 된다는 점에 착안하여, 원심분리를 통해 단백질층(페놀층>1.49 g/cm3), DNA층(1.03>중간층>1.49 g/cm3), RNA층(1 g>수층>1.03 g/cm3)으로 나누고, 상층액을 이소프로판올로 침전시켜 순수한 RNA를 추출할 수 있도록 한다. 가격이 저렴하기 때문에 샘플의 양이 많거나 숫자가 많을 때 이를 처리하기 위한 목적으로 사용된다. 그러나 숙련된 실험 테크닉이 필요하고 페놀, 클로로포름 같은 휘발성 독성물질을 사용하기 때문에 적절한 유해물질 노출 방지 설비가 구축되어 있지 않은 경우 실험자의 건강에 위해를 끼칠 수 있게 된다.The liquid phase separation RNA extraction technique using trisol is based on the fact that proteins are soluble in phenol, phenol is dissolved in chloroform, and DNA is easily separated under acidic conditions compared to RNA. It is divided into phenol layer> 1.49 g / cm 3 ), DNA layer (1.03> intermediate layer> 1.49 g / cm 3 ), RNA layer (1 g> water layer> 1.03 g / cm 3 ), and the supernatant is precipitated with isopropanol to obtain pure RNA. So that it can be extracted. Because of its low cost, it is used for the purpose of processing large samples or large numbers of samples. However, since skilled experimentation techniques are required and volatile toxic substances such as phenol and chloroform are used, it is possible to harm the health of the experimenter if proper hazardous substance exposure prevention equipment is not constructed.

숙련자 기준 샘플 준비 단계부터 핵산추출 단계까지 3시간 이상 소요되며, 핵산 품질 및 신뢰도는 핵산추출시간에 종속인 관계로, 숙련자와 비숙련자간의 핵산추출시간의 차이는 핵산의 품질 및 신뢰도를 낮춰 나쁜 실험 결과를 도출하는 문제가 있다.It takes more than 3 hours from the sample preparation stage to the nucleic acid extraction stage of the expert, and the quality and reliability of the nucleic acid are dependent on the nucleic acid extraction time, so the difference in the nucleic acid extraction time between the skilled and unskilled people lowers the quality and reliability of the nucleic acid, so it is a bad experiment. There is a problem that results.

환경모니터링은 다양한 오염인자가 포함된 샘플을 처리해야 하나, 현재 상용화된 바이러스 핵산추출키트는 플라즈마(plasma), 소변(urine), 혈청(serum) 같은 무세포(cell-free) 시료를 목적으로 설계되어, 추출된 핵산으로부터 진단을 수행할 때 위양성 결과 도출 비율이 높은 문제점이 있으며, 인체질병매개 모기, 진드기와 식물바이러스 매개체로부터 바이러스 RNA 분리용 저가 및 고효율 분리 키트 전무한 실정이다.Environmental monitoring requires processing of samples containing various contaminants, but currently commercialized viral nucleic acid extraction kits are designed for cell-free samples such as plasma, urine, and serum. As a result, when performing diagnosis from the extracted nucleic acid, there is a problem in that the rate of deriving false positive results is high, and there is no situation of a low-cost and high-efficiency separation kit for isolating viral RNA from human disease-mediated mosquitoes, ticks and plant virus vectors.

이에 본 발명자들은 기존 스핀-컬럼 방식은 컬럼이라는 매체의 기본가격 때문에 비용을 낮추기가 쉽지 않았다. 최근 국내 및 중국에서 개발되어 대량생산 중인 실리카 코팅 자성 나노 입자(silica coated magnetic bead)는 컬럼에 비하여 가격이 100배 이상 저렴하다. 추가적으로 나성 나노 입자에 적합한 조성의 저가, 고효율 버퍼 시스템을 개발하여 비용 문제를 해결하였다.Therefore, the present inventors had difficulty in lowering the cost of the existing spin-column method because of the basic price of a medium called a column. Silica coated magnetic beads, which have been developed and produced in Korea and in mass production in recent years, are more than 100 times cheaper than columns. In addition, a low-cost, high-efficiency buffer system with a composition suitable for bare nanoparticles was developed to solve the cost problem.

또한, 비용문제로 인해 다양한 기관, 연구소, 대학, 국가에선 트리졸(Trizol)을 사용하거나 페놀 기반 RNA추출 버퍼 시스템을 사용하고 있다. 또한, 상용제품 중에 리보뉴클레아제를 불활성화 시키기 위해 베타-머캅토페놀(beta-mercaptoethanol)을 사용하는데 이러한 물질은 인체에 매우 유독하다. 따라서 사용자에게 반드시 악영향을 끼치게 되는 문제점이 있어, 본 발명에서는 인체에 무해한 화합물만 사용하여 사용자의 건강을 보호할 수 있게 고안하였다.In addition, due to cost problems, various institutions, research institutes, universities, and countries use Trizol or a phenol-based RNA extraction buffer system. In addition, beta-mercaptophenol (beta-mercaptoethanol) is used to inactivate ribonuclease in commercial products, and these substances are very toxic to the human body. Therefore, there is a problem that must have an adverse effect on the user, the present invention was designed to protect the user's health by using only compounds that are harmless to the human body.

이에, 본 발명의 목적은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for viral RNA extraction using silica-coated magnetic beads.

본 발명의 다른 목적은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a viral RNA extraction method using silica-coated magnetic beads.

본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for viral RNA extraction using silica-coated magnetic beads and a method for extracting viral RNA using the same.

본 발명의 조성물은 저가이며 사용자에게 무해하고 실험단계가 기존 상용제품에 비하여 간단하고, 특히, 샘플을 균질화한 이후 불용성 오염물질을 제거하는 단계가 쉽고 제거조건이 마일드하다. The composition of the present invention is inexpensive, harmless to the user, and the experimental step is simple compared to conventional commercial products, and in particular, the step of removing insoluble contaminants after homogenizing the sample is easy and the removal conditions are mild.

또한, 기존 스핀 컬럼(spin column)을 이용한 RNA 추출 방법과 달리 본 발명의 방법은 자성 나노 입자에도 적용할 수 있으므로, 추출자동화 시스템의 적용이 가능하며 대량의 샘플을 처리할 때 더욱 효과적으로 처리할 수 있다.In addition, unlike the existing RNA extraction method using a spin column (spin column), the method of the present invention can be applied to magnetic nanoparticles, so it is possible to apply an extraction automation system and more effectively when processing large samples. have.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 바이러스 RNA 추출용 조성물에 관한 것이다:One aspect of the present invention relates to a composition for viral RNA extraction comprising:

(a) 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(v/v)의 NaCl(sodium chloride)을 포함하는 균질화 용액;(a) a homogenizing solution containing 1 to 30 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1 to 2.0% (v / v) sodium chloride (NaCl) relative to the total amount of the homogenizing solution;

(b) 용해 버퍼 총량에 대하여 0.1 내지 1.5 M 농도의 NaCl 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼;(b) a lysis buffer comprising 0.1 to 1.5 M NaCl and 0.1 to 10.0% (v / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) relative to the total amount of lysis buffer;

(c) 1차 세척 버퍼 총량에 대하여 0.1 내지 5.0 M 농도의 소듐 클로라이드(sodium chloride)을 포함하는 1차 세척 버퍼; 및(c) a primary wash buffer containing sodium chloride at a concentration of 0.1 to 5.0 M relative to the total amount of primary wash buffer; And

(d) 1차 세척 버퍼 총량에 대하여 50 내지 80 %(v/v) 농도의 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼.(d) Secondary washing buffer containing an aqueous ethanol solution at a concentration of 50 to 80% (v / v) relative to the total amount of primary washing buffer.

상기 바이러스 RNA 추출용 조성물을 통해 추출한 바이러스 RNA를 이용하여 시료의 바이러스 보유 여부를 진단할 수 있다.The virus RNA extracted through the composition for extracting the viral RNA may be used to diagnose whether the sample has a virus.

기존의 바이러스 RNA 추출 키트들은 가격대가 높은 시약인 구아니딘 티오시안산염, 소듐 아이오다이드, 구아니딘 염산염 등을 이용하고 있다. 따라서, 개체수가 많은 곤충에 대하여 기존의 바이러스 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하고, 바이러스 보유 여부를 진단하는 실험을 수행하는 경우, 경제적인 부담이 크며, 키트에 포함된 구아니딘 염과 같은 강한 카오트로픽 염 또는 트리졸에 포함된 페놀, 클로로포름과 같은 실험 재료는 인체에 유해하기 때문에 장기간 노출 시 실험자의 건강에 위해를 끼친다.Existing viral RNA extraction kits use guanidine thiocyanate, sodium iodide, and guanidine hydrochloride, which are high-priced reagents. Therefore, in the case of extracting RNA using an existing viral RNA extraction kit for a large number of insects and conducting an experiment for diagnosing whether or not the virus is retained, the economical burden is high, and strong cao such as the guanidine salt included in the kit Experimental materials such as tropic salts or phenols and chloroform contained in trisols are harmful to the human body, and thus, for long periods of exposure, they harm the health of the experimenter.

또한, 기존의 바이러스 RNA 추출 키트와 추출 방법들은 인체 유래 시료 또는 세포 배양액에서 바이러스를 추출하는 것을 기준으로 하기 때문에, 초기 샘플 자체에 오염 물질이 많이 존재하지 않는다. 그러나 곤충 개체의 경우에는 야외에서 채집되는 경우가 많기 때문에 다양한 오염원(예를 들어, 곰팡이, 세균, 꽃가루 등)이 존재하게 된다.In addition, since the existing viral RNA extraction kits and extraction methods are based on extracting virus from a human-derived sample or cell culture, there are not many contaminants present in the initial sample itself. However, because insects are often collected outdoors, various pollutants (eg, fungi, bacteria, pollen, etc.) exist.

기존의 바이러스 RNA 추출 키트의 경우, 강력한 카오트로픽 염을 이용하기 때문에 곤충의 RNA와 바이러스 유래 RNA　뿐만 아니라, 오염원인 곰팡이, 세균, 식물성 물질(예를 들어, 꽃가루 등)의 RNA를 모두 추출하게 되며, PCR 인히비터(inhibitor)를 제거하는 단계가 없다. In the case of the existing viral RNA extraction kit, since it uses a powerful chaotropic salt, it extracts not only insect RNA and virus-derived RNA, but also RNA from contaminants such as fungi, bacteria, and vegetable substances (for example, pollen). , There is no step to remove the PCR inhibitor.

이러한 다양한 오염원으로부터 유래된 RNA와 PCR 인히비터는 결과적으로 진단 실험에서 실시하는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 과정에서 억제제로 작용하여 바이러스 보유 진단의 민감도를 낮추게 된다.As a result, RNA and PCR inhibitors derived from various contaminants act as inhibitors in the PCR (Polymerase Chain Reaction) process performed in diagnostic experiments, thereby reducing the sensitivity of virus retention diagnosis.

본 발명은 카오트로픽 염을 이용하여 시료로부터 바이러스 RNA를 추출할 때 발생하는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 곰팡이, 꽃가루 등과 같은 오염원의 용해도는 낮고, 바이러스 용해도는 높은 용해 버퍼를 이용하여 RNA를 추출하여 상기 문제점을 해결하였다. The present invention is to solve the problem that occurs when extracting viral RNA from a sample using a chaotropic salt, RNA is extracted using a lysis buffer having a low solubility in a contaminant such as mold and pollen, and a high virus solubility. The above problem was solved.

또한, 원심분리를 통해 오염원(예를 들어, small RNA, 단백질, DNA, 탄수화물 등)을 최대한 제거하여, 시료의 바이러스 보유 여부 진단 시 진단 실험의 민감도를 높였으며, 기존 바이러스 RNA 추출 키트와 비교하여 가격이 저렴한 화학물질을 사용함으로써 RNA 추출 비용을 현저히 낮추었다. In addition, the contaminants (for example, small RNA, protein, DNA, carbohydrate, etc.) are removed as much as possible through centrifugation to increase the sensitivity of the diagnostic experiment when diagnosing the sample for virus retention, compared to the existing viral RNA extraction kit. By using low-cost chemicals, RNA extraction costs were significantly lowered.

또한, PCR 인히비터를 원심분리를 통한 층분리를 통해 RNA를 정제하고 회수하는 Trizol법의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 층분리를 위한 클로로포름(chloroform), 페놀(phenol)을 사용하지 않아 유해성을 회피하였으며, 기존 트리졸(Trizol)법에서 필요한 15분 이상의 냉장고속원심 분리를 필요로 하지 않으므로, 본 기술을 사용하여 바이러스 RNA추출 시 사용자의 위해도를 줄일 수 있으며 추출 시간 또한 단축된다.In addition, to solve the problem of the Trizol method for purifying and recovering RNA through layer separation through centrifugation of a PCR inhibitor, avoiding harmfulness by not using chloroform and phenol for layer separation In addition, since it does not require centrifugation in the refrigerator for more than 15 minutes required by the existing Trizol method, the user's risk of viral RNA extraction can be reduced using this technology and the extraction time is also reduced.

현재 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업이 경제적인 이유로 제한되어 있다. 그 중 모기로부터 RNA를 추출하는 과정이 가장 비용이 많이 든다. 이 과정을 본 발명을 통해 더욱 저렴하게 수행할 수 있다면 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고, 그에 따라 공중보건에 기여하는 역할을 할 수 있을 것이라 예상된다.Currently, virus diagnostic experiments and various surveillance projects that mediate disease are limited for economic reasons. Among them, the process of extracting RNA from mosquitoes is the most expensive. If this process can be performed more inexpensively through the present invention, it is expected that the scale of the surveillance business can be further expanded, and accordingly, it can play a role in contributing to public health.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 시료로부터 바이러스 RNA를 추출하는 것일 수 있다.The composition for extracting viral RNA of the present invention may be to extract viral RNA from a sample.

상기 시료는 액체인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The sample may be liquid, but is not limited thereto.

상기 액체는 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The liquid may be sea water, tap water, bottled water, or farm water, but is not limited thereto.

상기 시료는 동물로부터 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The sample may be obtained from an animal, but is not limited thereto.

상기 동물은 절지동물인 것을 수 있으며, 예를 들어, 곤충류, 거미류 또는 다지류인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The animal may be an arthropod, and may be, for example, an insect, arachnid, or multipod, but is not limited thereto.

상기 곤충류는 벌, 모기, 파리, 나비, 나방, 개미, 잠자리, 바퀴벌레, 사마귀, 대벌레, 메뚜기, 매미 또는 딱정벌레일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The insects may be bees, mosquitoes, flies, butterflies, moths, ants, dragonflies, cockroaches, warts, larvae, grasshoppers, cicadas, or beetles, but are not limited thereto.

상기 거미류는 거미, 전갈 또는 진드기인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The arachnid may be a spider, a scorpion or a mite, but is not limited thereto.

상기 다지류는 지네, 노래미 또는 그리마인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The multi- branch may be centipede, songmi or grima, but is not limited thereto.

상기 시료가 동물인 경우, 상기 시료는 동물의 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. When the sample is an animal, the sample may be an animal, tissue, organ, or cell, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 야외에서 채집한 것일 수 있으며, 예를 들어, 야외에서 채집한 곤충류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. According to an embodiment of the present invention, the animal may be collected outdoors, for example, insects collected outdoors, but is not limited thereto.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 균질화 용액을 포함할 수 있다. The composition for viral RNA extraction of the present invention may include a homogenization solution.

상기 용어 "균질화"는 시료를 파쇄하여 균질한 용액으로 만드는 것으로, 예를 들어, 바이러스 RNA를 추출하기 위해 채집한 시료를 균질화 용액에 혼합하고 균질기를 이용하여 파쇄하여 균질화하는 것을 의미한다. The term "homogenization" refers to crushing a sample into a homogeneous solution, for example, mixing a sample collected to extract viral RNA into a homogenization solution and homogenizing by crushing using a homogenizer.

상기 균질화 용액은 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 NaCl(sodium chloride)을 포함할 수 있다. The homogenization solution may include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and sodium chloride (NaCl).

상기 균질화 용액에서 EDTA는 1 내지 30 mM, 1 내지 28 mM, 1 내지 25 mM, 1 내지 22 mM, 3 내지 30 mM, 3 내지 28 mM, 3 내지 25 mM, 3 내지 22 mM, 5 내지 30 mM, 5 내지 28 mM, 5 내지 25 mM, 5 내지 22 mM, 8 내지 30 mM, 8 내지 28 mM, 8 내지 25 mM, 8 내지 22 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 28 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 22 mM, 12 내지 30 mM, 12 내지 28 mM, 12 내지 25 mM, 12 내지 22 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 28 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 22 mM, 18 내지 30 mM, 18 내지 28 mM, 18 내지 25 mM, 18 내지 22 mM 또는 19 내지 21 mM 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 20 mM 농도로 포함될 수 있다. EDTA in the homogenization solution is 1 to 30 mM, 1 to 28 mM, 1 to 25 mM, 1 to 22 mM, 3 to 30 mM, 3 to 28 mM, 3 to 25 mM, 3 to 22 mM, 5 to 30 mM , 5 to 28 mM, 5 to 25 mM, 5 to 22 mM, 8 to 30 mM, 8 to 28 mM, 8 to 25 mM, 8 to 22 mM, 10 to 30 mM, 10 to 28 mM, 10 to 25 mM , 10 to 22 mM, 12 to 30 mM, 12 to 28 mM, 12 to 25 mM, 12 to 22 mM, 15 to 30 mM, 15 to 28 mM, 15 to 25 mM, 15 to 22 mM, 18 to 30 mM , 18 to 28 mM, 18 to 25 mM, 18 to 22 mM, or 19 to 21 mM, and may be included, for example, 20 mM.

상기 NaCl은 균질화 용액에 0.1 내지 2.0 %(w/v), 0.1 내지 1.8%(w/v), 0.1 내지 1.5%(w/v), 0.1 내지 1.2%(w/v), 0.1 내지 1%(w/v), 0.3 내지 2%(w/v), 0.1 내지 1.8%(w/v), 0.3 내지 1.5%(w/v), 0.3 내지 1.2%(w/v), 0.3 내지 1%(w/v), 0.5 내지 2%(w/v), 0.5 내지 1.8%(w/v), 0.5 내지 1.5%(w/v), 0.5 내지 1.2%(w/v), 0.5 내지 1%(w/v), 0.8 내지 2%(w/v), 0.8 내지 1.8%(w/v), 0.8 내지 1.5%(w/v), 0.8 내지 1.2%(w/v), 0.8 내지 1%(w/v) 또는 0.8 내지 0.9%(w/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.9%(w/v) 농도로 포함될 수 있다. The NaCl is 0.1 to 2.0% (w / v), 0.1 to 1.8% (w / v), 0.1 to 1.5% (w / v), 0.1 to 1.2% (w / v), 0.1 to 1% in the homogenization solution. (w / v), 0.3 to 2% (w / v), 0.1 to 1.8% (w / v), 0.3 to 1.5% (w / v), 0.3 to 1.2% (w / v), 0.3 to 1% (w / v), 0.5 to 2% (w / v), 0.5 to 1.8% (w / v), 0.5 to 1.5% (w / v), 0.5 to 1.2% (w / v), 0.5 to 1% (w / v), 0.8 to 2% (w / v), 0.8 to 1.8% (w / v), 0.8 to 1.5% (w / v), 0.8 to 1.2% (w / v), 0.8 to 1% (w / v) or 0.8 to 0.9% (w / v) concentration, for example, 0.9% (w / v) concentration.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 용해 버퍼를 포함할 수 있다. The composition for viral RNA extraction of the present invention may include a lysis buffer.

상기 용해 버퍼는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 NaCl(sodium chloride)를 포함할 수 있다. The lysis buffer may include sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium chloride (NaCl).

상기 용해 버퍼에서 SDS는 0.1 내지 10.0%(v/v), 0.1 내지 9.0%(v/v), 0.1 내지 8.0%(v/v), 0.1 내지 7.0%(v/v), 0.5 내지 10.0%(v/v), 0.5 내지 9.0%(v/v), 0.5 내지 8.0%(v/v), 0.5 내지 7.0%(v/v), 1.0 내지 10.0%(v/v), 1.0 내지 9.0%(v/v), 1.0 내지 8.0%(v/v), 1.0 내지 7.0%(v/v), 2.0 내지 10.0%(v/v), 2.0 내지 9.0%(v/v), 2.0 내지 8.0%(v/v), 2.0 내지 7.0%(v/v), 3.0 내지 10.0%(v/v), 3.0 내지 9.0%(v/v), 3.0 내지 8.0%(v/v), 3.0 내지 7.0%(v/v), 4.0 내지 10.0%(v/v), 4.0 내지 9.0%(v/v), 4.0 내지 8.0%(v/v), 4.0 내지 7.0%(v/v), 5.0 내지 10.0%(v/v), 5.0 내지 9.0%(v/v), 5.0 내지 8.0%(v/v) 또는 5.0 내지 7.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 6.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.SDS in the lysis buffer is 0.1 to 10.0% (v / v), 0.1 to 9.0% (v / v), 0.1 to 8.0% (v / v), 0.1 to 7.0% (v / v), 0.5 to 10.0% (v / v), 0.5 to 9.0% (v / v), 0.5 to 8.0% (v / v), 0.5 to 7.0% (v / v), 1.0 to 10.0% (v / v), 1.0 to 9.0% (v / v), 1.0 to 8.0% (v / v), 1.0 to 7.0% (v / v), 2.0 to 10.0% (v / v), 2.0 to 9.0% (v / v), 2.0 to 8.0% (v / v), 2.0 to 7.0% (v / v), 3.0 to 10.0% (v / v), 3.0 to 9.0% (v / v), 3.0 to 8.0% (v / v), 3.0 to 7.0% (v / v), 4.0 to 10.0% (v / v), 4.0 to 9.0% (v / v), 4.0 to 8.0% (v / v), 4.0 to 7.0% (v / v), 5.0 to 10.0% (v / v), 5.0 to 9.0% (v / v), 5.0 to 8.0% (v / v) or 5.0 to 7.0% (v / v) concentration, for example, 6.0% (v / v) v) concentration.

종래 연구에 따르면 등에 따르면 작업용액(working solution)에서 SDS 농도가 최종적으로 2.0 %(v/v) 정도면 시료로부터 RNA를 추출하는데 충분한 것으로 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12): 3975-3981). 실험을 통해 SDS를 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 농도로 사용하였을 때도 문제없이 RNA가 추출되는 것으로 확인되었으나 아래와 같은 문제가 발생하였다.According to conventional studies, it is known that if the SDS concentration in the working solution is finally about 2.0% (v / v), it is sufficient to extract RNA from the sample (Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77 (12): 3975-3981). Through experiments, it was confirmed that RNA was extracted without problems even when SDS was used at concentrations of 1.0% (v / v) and 1.5% (v / v), but the following problems occurred.

DNA와 단백질 등을 제거하는 SDS 및 NaCl을 이용한 침전반응 시 SDS 농도가 낮으면 침전된 펠릿의 크기가 작아 상층액을 분리하기 어려웠으며 이보다 농도가 높을 경우 거품이 많이 생기고 실험 직전에 녹이는 과정이 어려워 실험을 수행하기에 용이하지 않았을 뿐만 아니라 비드에 결합하는 RNA의 수율이 낮아지는 문제가 발생하여 최종적으로 용해 버퍼(LnB)에서 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.In the precipitation reaction using SDS and NaCl, which removes DNA and protein, when the SDS concentration is low, the size of the precipitated pellet is small, making it difficult to separate the supernatant. Not only was it not easy to perform the experiment, but a problem in which the yield of RNA binding to the beads was lowered, finally, the SDS concentration in the lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).

추가적으로 RNA를 분해하는 효소인 RNAase를 제거하는 RNAse ZAP의 경우, 주성분인 SDS의 농도가 1.0 내지 5.0 %(v/v) 정도인 것으로 추정되는데, 이를 기초로 판단하였을 때 SDS의 최종농도가 1.0%(v/v) 이상이어야 RNAse를 효과적으로 불활성화 시킬 수 있을 것으로 판단하였고, 사용상의 간편함과 RNA의 보호라는 측면에서 최종적으로 RNA를 포함하는 용액을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킬 때 SDS의 농도가 약 1.0%(v/v) 이상이 되도록 용해 버퍼(LnB)의 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.In the case of RNAse ZAP, which removes RNAase, an enzyme that degrades RNA, it is estimated that the concentration of SDS as a main component is about 1.0 to 5.0% (v / v), and the final concentration of SDS is 1.0% when judged based on this. It was judged that RNAse could be effectively inactivated when it was higher than (v / v), and the concentration of SDS was weak when the solution containing RNA was finally contacted with a silica-coated magnetic bead in terms of ease of use and protection of RNA. The SDS concentration of the lysis buffer (LnB) was determined to be 1.0% (v / v) or higher at 4.0% (v / v).

상기 용해 버퍼에서 NaCl은 0.5 내지 1.0 M, 0.5 내지 0.9 M, 0.5 내지 0.8 M, 0.5 내지 0.75 M, 0.6 내지 1.0 M, 0.6 내지 0.9 M, 0.6 내지 0.8 M, 0.6 내지 0.75 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.7 내지 0.9 M, 0.7 내지 0.8 M, 0.7 내지 0.75 M 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.75 M 농도로 포함될 수 있다. NaCl in the lysis buffer is 0.5 to 1.0 M, 0.5 to 0.9 M, 0.5 to 0.8 M, 0.5 to 0.75 M, 0.6 to 1.0 M, 0.6 to 0.9 M, 0.6 to 0.8 M, 0.6 to 0.75 M, 0.7 to 1.0 M , 0.7 to 0.9 M, 0.7 to 0.8 M, may be included in a concentration of 0.7 to 0.75 M, for example, may be included in a concentration of 0.75 M.

상기 용해 버퍼에서 NaCl이 1.0 M 이상 포함되는 경우, SDS가 불용성(insoluble) 형태가 되어 석출되며, 0.5 M 미만 포함되는 경우 삼투압이 낮아 균질화된 용액 내 곤충 세포를 효과적으로 용해시킬 수 없다. In the lysis buffer, if NaCl is 1.0 M or more, SDS is precipitated in an insoluble form, and if it is less than 0.5 M, the osmotic pressure is low, so that insect cells in the homogenized solution cannot be effectively dissolved.

상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화된 시료에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있다. The lysis buffer is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), and 0.6 to 1.0 times the homogenized sample by adding a homogenizing solution to the sample. (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 times (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, 1.0 times (v / v) may be mixed.

핵산을 실리카 코팅 자성입자에 바인딩하기 위해 사용하는 이소프로판올과 혼합액의 최종 희석비율이 1:2(v/v)가 되도록 하기 때문에(일반적으로 멤브레인 컬럼 방식의 경우 DNA 또는 RNA 침전 시 최종 50%(v/v) 농도로 수행한다) 원심분리 상층액, 용해 버퍼 및 5 M NaCl 수용액의 총 혼합액이 100 ul 일 때, 이소프로판올은 100 ul를 사용하여, 용해 버퍼는 균질화된 시료에 대하여 1.0배(v/v) 혼합하는 것으로 결정하였다. Because the final dilution ratio of the isopropanol and the mixed solution used to bind the nucleic acid to the silica-coated magnetic particles is 1: 2 (v / v) (generally, in the case of the membrane column method, the final 50% (v / v) concentration) When the total mixture of centrifuged supernatant, lysis buffer and 5 M NaCl aqueous solution is 100 ul, 100 ul of isopropanol is used, and the lysis buffer is 1.0 times (v / v) It was decided to mix.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample in the same amount (v / v) by adding a homogenization solution to the sample.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 NaCl을 첨가할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, NaCl may be added to the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer.

상기 첨가되는 NaCl은 NaCl 수용액 상태인 것일 수 있다.The added NaCl may be in a NaCl aqueous solution.

상기 NaCl 수용액은 1 내지 10 M, 1 내지 8 M, 1 내지 7 M, 1 내지 6 M, 2 내지 10 M, 2 내지 8 M, 2 내지 7 M, 2 내지 6 M, 3 내지 10 M, 3 내지 8 M, 3 내지 7 M, 3 내지 6 M, 4 내지 10 M, 4 내지 8 M, 4 내지 7 M 또는 4 내지 6 M 농도 일 수 있으며, 예를 들어, 5 M NaCl 수용액일 수 있다. The NaCl aqueous solution is 1 to 10 M, 1 to 8 M, 1 to 7 M, 1 to 6 M, 2 to 10 M, 2 to 8 M, 2 to 7 M, 2 to 6 M, 3 to 10 M, 3 It may be a concentration of 8 M, 3-7 M, 3-6 M, 4-10 M, 4-8 M, 4-7 M or 4-6 M, for example, 5 M NaCl aqueous solution.

상기 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 대하여, 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다. The NaCl aqueous solution is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), and 0.6 to 1.0 for a mixture of a homogenized sample and a lysis buffer. Times (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 Times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 Pear (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, may be mixed in the same amount (v / v).

상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 첨가되는 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.The NaCl aqueous solution added to the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample in the same amount (v / v).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 균질화된 시료 100 ul에 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액 100 ul를 혼합할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, 100 ul of the lysis buffer may be mixed with 100 ul of the homogenized sample, and then 100 ul of a 5 M NaCl aqueous solution may be mixed.

균질화된 시료 100 ul에 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액을 50 ul 첨가한 경우, SDS가 분리되지 않아서 이후 세척 단계에서 거품이 일어나는 것이 관찰되었다. 거품이 일어날 경우 잘 세척되지 않아 실리카 코팅 자성 비드에 결합된 오염물이 세척단계에서 분리되지 않을 수 있다. 5 M NaCl 수용액은 200 ul까지 첨가할 수 있는데 200 ul 이상 첨가할 경우, 이소프로판올을 혼합하는 다음 과정에서 NaCl이 석출될 수 있다. When 100 ul of the lysis buffer was mixed with 100 ul of the homogenized sample, and then 50 ul of a 5 M NaCl aqueous solution was added, it was observed that SDS did not separate and foaming occurred in the subsequent washing step. In the case of foaming, contaminants bound to the silica-coated magnetic beads may not be separated in the washing step due to poor washing. The 5 M NaCl aqueous solution can be added up to 200 ul. If more than 200 ul is added, NaCl may be precipitated in the next process of mixing isopropanol.

상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물을 원심분리하여 얻은 상층액에 이소프로판올을 혼합할 수 있다. Isopropanol may be mixed with the supernatant obtained by centrifuging the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer.

상기 이소프로판올은 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.1 내지 1.3배(v/v), 0.1 내지 1.2배(v/v), 0.1 내지 1.1배(v/v), 0.1 내지 1.0배(v/v), 0.1 내지 0.9배(v/v), 0.1 내지 0.8배(v/v), 0.1 내지 0.7배(v/v), 0.1 내지 0.6배(v/v), 0.2 내지 1.3배(v/v), 0.2 내지 1.2배(v/v), 0.2 내지 1.1배(v/v), 0.2 내지 1.0배(v/v), 0.2 내지 0.9배(v/v), 0.2 내지 0.8배(v/v), 0.2 내지 0.7배(v/v), 0.2 내지 0.6배(v/v), 0.3 내지 1.3배(v/v), 0.3 내지 1.2배(v/v), 0.3 내지 1.1배(v/v), 0.3 내지 1.0배(v/v), 0.3 내지 0.9배(v/v), 0.3 내지 0.8배(v/v), 0.3 내지 0.7배(v/v), 0.3 내지 0.6배(v/v), 0.4 내지 1.3배(v/v), 0.4 내지 1.2배(v/v), 0.4 내지 1.1배(v/v), 0.4 내지 1.0배(v/v), 0.4 내지 0.9배(v/v), 0.4 내지 0.8배(v/v), 0.4 내지 0.7배(v/v), 0.4 내지 0.6배(v/v), 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.5배(v/v) 혼합되는 것일 수 있다. The isopropanol is 0.1 to 1.3 times (v / v), 0.1 to 1.2 times (v / v), 0.1 to 1.1 times (v / v), and 0.1 to 1.0 times (v / v) with respect to the supernatant obtained by centrifugation. , 0.1 to 0.9 times (v / v), 0.1 to 0.8 times (v / v), 0.1 to 0.7 times (v / v), 0.1 to 0.6 times (v / v), 0.2 to 1.3 times (v / v) , 0.2 to 1.2 times (v / v), 0.2 to 1.1 times (v / v), 0.2 to 1.0 times (v / v), 0.2 to 0.9 times (v / v), 0.2 to 0.8 times (v / v) , 0.2 to 0.7 times (v / v), 0.2 to 0.6 times (v / v), 0.3 to 1.3 times (v / v), 0.3 to 1.2 times (v / v), 0.3 to 1.1 times (v / v) , 0.3 to 1.0 times (v / v), 0.3 to 0.9 times (v / v), 0.3 to 0.8 times (v / v), 0.3 to 0.7 times (v / v), 0.3 to 0.6 times (v / v) , 0.4 to 1.3 times (v / v), 0.4 to 1.2 times (v / v), 0.4 to 1.1 times (v / v), 0.4 to 1.0 times (v / v), 0.4 to 0.9 times (v / v) , 0.4 to 0.8 times (v / v), 0.4 to 0.7 times (v / v), 0.4 to 0.6 times (v / v), may be mixed, for example, 0.5 times (v / v) mixed May be

일반적으로 RNA를 수용액에서 분리할 때 이소프로판올을 사용한다(www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html). 에탄올을 사용할 경우에는 RNA가 녹아있는 희석액의 2.5배를 사용해야 하나 이소프로판올은 RNA가 녹아있는 희석액의 동량만 섞으면 된다고 알려져 있다. 그러나 실리카 코팅 자성입자를 이용한 바이러스 핵산추출 시 따라서, 원심분리 후 얻은 상층액 1 볼륨(volume)에 0.5 볼륨의 이소프로판올을 넣고 혼합하였을 경우 PCR 진단율이 가장 높았다.In general, isopropanol is used to separate RNA from aqueous solutions (www.thermofisher.com/kr/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html) . It is known that when using ethanol, 2.5 times of the diluted solution in which the RNA is dissolved should be used, but isopropanol needs to be mixed with the same amount of the diluted solution in which the RNA is dissolved. However, when extracting viral nucleic acids using silica-coated magnetic particles, the PCR diagnostic rate was highest when 0.5 volume of isopropanol was added to 1 volume of the supernatant obtained after centrifugation and mixed.

상기 원심분리하여 얻은 상층액에 이소프로판올을 혼합한 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시켜 혼합물 내에 포함된 바이러스 RNA를 바인딩시킬 수 있다. The mixture of isopropanol mixed with the supernatant obtained by centrifugation may be contacted with a silica-coated magnetic bead to bind viral RNA contained in the mixture.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 포함하는 1차 세척 버퍼를 포함할 수 있다. The composition for extracting viral RNA of the present invention may include a primary washing buffer containing sodium chloride.

상기 1차 세척 버퍼는 소듐 클로라이드를 0.1 내지 5.0 M, 0.1 내지 4.5 M, 0.1 내지 4.0 M, 0.1 내지 3.5 M, 0.5 내지 5.0 M, 0.5 내지 4.5 M, 0.5 내지 4.0 M, 0.5 내지 3.5 M, 1.0 내지 5.0 M, 1.0 내지 4.5 M, 1.0 내지 4.0 M, 1.0 내지 3.5 M, 1.5 내지 5.0 M, 1.5 내지 4.5 M, 1.5 내지 4.0 M, 1.5 내지 3.5 M, 2.0 내지 5.0 M, 2.0 내지 4.5 M, 2.0 내지 4.0 M, 2.0 내지 3.5 M, 2.5 내지 5.0 M, 2.5 내지 4.5 M, 2.5 내지 4.0 M, 2.5 내지 3.5 M 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3.0 M 농도로 포함하는 것일 수 있다.The primary wash buffer contains 0.1 to 5.0 M, 0.1 to 4.5 M, 0.1 to 4.0 M, 0.1 to 3.5 M, 0.5 to 5.0 M, 0.5 to 4.5 M, 0.5 to 4.0 M, 0.5 to 3.5 M, 1.0 To 5.0 M, 1.0 to 4.5 M, 1.0 to 4.0 M, 1.0 to 3.5 M, 1.5 to 5.0 M, 1.5 to 4.5 M, 1.5 to 4.0 M, 1.5 to 3.5 M, 2.0 to 5.0 M, 2.0 to 4.5 M, 2.0 To 4.0 M, 2.0 to 3.5 M, 2.5 to 5.0 M, 2.5 to 4.5 M, 2.5 to 4.0 M, and 2.5 to 3.5 M, for example, may be included in a concentration of 3.0 M.

상기 1차 세척 버퍼의 pH는 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 6.0 또는 5.0 내지 6.0 일 수 있으며, 예를 들어, 5.5 일 수 있다.The pH of the primary washing buffer may be 4.0 to 6.0, 4.5 to 6.0 or 5.0 to 6.0, for example, 5.5.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼를 포함할 수 있다.The composition for extracting viral RNA of the present invention may include a secondary washing buffer containing an aqueous ethanol solution.

상기 2차 세척 버퍼는 60 내지 90 %(v/v), 65 내지 90 %(v/v), 70 내지 90 %(v/v), 75 내지 90 %(v/v), 60 내지 85%(v/v), 65 내지 85 %(v/v), 70 내지 85 %(v/v), 75 내지 85 %(v/v) 에탄올 수용액, 예를 들어, 80 %(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다. The secondary washing buffer is 60 to 90% (v / v), 65 to 90% (v / v), 70 to 90% (v / v), 75 to 90% (v / v), 60 to 85% (v / v), 65 to 85% (v / v), 70 to 85% (v / v), 75 to 85% (v / v) ethanol aqueous solution, e.g. 80% (v / v) ethanol It may be an aqueous solution.

상기 2차 세척 버퍼로 실리카 코팅 자성 비드를 세척하여 앞서 사용한 버퍼 성분을 제거할 수 있다. The silica-coated magnetic beads can be washed with the secondary washing buffer to remove the previously used buffer component.

상기 세척한 실리카 코팅 자성 비드에 용출 버퍼를 접촉하여 RNA를 용출시킬 수 있다. RNA may be eluted by contacting the washed silica-coated magnetic beads with an elution buffer.

상기 용출 버퍼는 RNA 분해효소가 없는 물일 수 있다. The elution buffer may be water without RNA degrading enzyme.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 다음 단계를 통해 실시하여 바이러스 RNA를 추출할 수 있다: According to one embodiment of the present invention, the composition for extracting viral RNA of the present invention can be performed through the following steps to extract viral RNA:

시료를 균질화하는 균질화 단계;A homogenization step of homogenizing the sample;

균질화된 시료에 용해 버퍼를 혼합하는 제1 혼합 단계;A first mixing step of mixing the lysis buffer with the homogenized sample;

용해 버퍼 혼합물을 원심분리하는 원심분리 단계; A centrifugation step of centrifuging the lysis buffer mixture;

원심분리 상층액에 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하는 제2 혼합 단계;A second mixing step of mixing isopropanol in the centrifuged supernatant;

제2 혼합물과 실리카 코팅 자성 비드를 혼합하는 비드 혼합 단계;Bead mixing step of mixing the second mixture and the silica-coated magnetic beads;

실리카 코팅 자성 비드를 세척 버퍼로 세척하는 세척단계; 및A washing step of washing the silica coated magnetic beads with a washing buffer; And

RNA를 용출시키는 용출 단계.Elution step of eluting RNA.

(a) 시료의 균질화(a) homogenization of the sample

시료로부터 바이러스의 RNA를 추출하기 위해 먼저 시료를 균질화한다. To extract viral RNA from the sample, the sample is first homogenized.

상기 시료는 동물 또는 액체일 수 있다.The sample may be an animal or liquid.

상기 동물은 절지동물인 것을 수 있으며, 예를 들어, 곤충류, 거미류 또는 다지류인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The animal may be an arthropod, and may be, for example, an insect, arachnid, or multipod, but is not limited thereto.

상기 액체는 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The liquid may be sea water, tap water, bottled water, or farm water, but is not limited thereto.

상기 곤충류는 벌, 모기, 파리, 나비, 나방, 개미, 잠자리, 바퀴벌레, 사마귀, 대벌레, 메뚜기, 매미 또는 딱정벌레일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The insects may be bees, mosquitoes, flies, butterflies, moths, ants, dragonflies, cockroaches, warts, larvae, grasshoppers, cicadas, or beetles, but are not limited thereto.

상기 거미류는 거미, 전갈 또는 진드기인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The arachnid may be a spider, a scorpion or a mite, but is not limited thereto.

상기 다지류는 지네, 노래미 또는 그리마인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The multi- branch may be centipede, songmi or grima, but is not limited thereto.

상기 시료가 동물인 경우, 상기 시료는 동물의 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. When the sample is an animal, the sample may be an animal, tissue, organ, or cell, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 야외에서 채집한 것일 수 있으며, 예를 들어, 야외에서 채집한 곤충류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. According to an embodiment of the present invention, the animal may be collected outdoors, for example, insects collected outdoors, but is not limited thereto.

상기 균질화는 시료를 파쇄하여 균질한 용액 상태로 만드는 것으로, 예를 들어, 바이러스 RNA를 추출하기 위해 채집한 시료를 균질화 용액에 혼합하고 균질기를 이용하여 파쇄하여 균질화할 수 있다.The homogenization is to break the sample into a homogeneous solution state. For example, the sample collected to extract viral RNA can be mixed into a homogenization solution and crushed using a homogenizer to homogenize.

상기 균질화는 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM 농도의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 균질화 용액 총량에 대하여 0.1 내지 2.0 %(v/v) 농도의 NaCl을 포함하는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 실시할 수 있다. The homogenization can be carried out by adding a homogenizing solution containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) at a concentration of 1 to 30 mM with respect to the total amount of homogenizing solution and NaCl at a concentration of 0.1 to 2.0% (v / v) with respect to the total amount of homogenizing solution to the sample. have.

상기 EDTA는 균질화 용액에 1 내지 30 mM, 1 내지 28 mM, 1 내지 25 mM, 1 내지 22 mM, 3 내지 30 mM, 3 내지 28 mM, 3 내지 25 mM, 3 내지 22 mM, 5 내지 30 mM, 5 내지 28 mM, 5 내지 25 mM, 5 내지 22 mM, 8 내지 30 mM, 8 내지 28 mM, 8 내지 25 mM, 8 내지 22 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 28 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 22 mM, 12 내지 30 mM, 12 내지 28 mM, 12 내지 25 mM, 12 내지 22 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 28 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 22 mM, 18 내지 30 mM, 18 내지 28 mM, 18 내지 25 mM, 18 내지 22 mM 또는 19 내지 21 mM 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 20 mM 농도로 포함될 수 있다. The EDTA is 1 to 30 mM, 1 to 28 mM, 1 to 25 mM, 1 to 22 mM, 3 to 30 mM, 3 to 28 mM, 3 to 25 mM, 3 to 22 mM, 5 to 30 mM in the homogenization solution. , 5 to 28 mM, 5 to 25 mM, 5 to 22 mM, 8 to 30 mM, 8 to 28 mM, 8 to 25 mM, 8 to 22 mM, 10 to 30 mM, 10 to 28 mM, 10 to 25 mM , 10 to 22 mM, 12 to 30 mM, 12 to 28 mM, 12 to 25 mM, 12 to 22 mM, 15 to 30 mM, 15 to 28 mM, 15 to 25 mM, 15 to 22 mM, 18 to 30 mM , 18 to 28 mM, 18 to 25 mM, 18 to 22 mM, or 19 to 21 mM, and may be included, for example, 20 mM.

상기 NaCl은 균질화 용액에 0.1 내지 2.0%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.1 내지 1.5%(v/v), 0.1 내지 1.2%(v/v), 0.1 내지 1.0%(v/v), 0.3 내지 2%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.3 내지 1.5%(v/v), 0.3 내지 1.2%(v/v), 0.3 내지 1.0%(v/v), 0.5 내지 2.0%(v/v), 0.5 내지 1.8%(v/v), 0.5 내지 1.5%(v/v), 0.5 내지 1.2%(v/v), 0.5 내지 1.0%(v/v), 0.8 내지 2.0%(v/v), 0.8 내지 1.8%(v/v), 0.8 내지 1.5%(v/v), 0.8 내지 1.2%(v/v), 0.8 내지 1.0%(v/v) 또는 0.8 내지 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있다. The NaCl is 0.1 to 2.0% (v / v), 0.1 to 1.8% (v / v), 0.1 to 1.5% (v / v), 0.1 to 1.2% (v / v), 0.1 to 1.0% in the homogenization solution. (v / v), 0.3 to 2% (v / v), 0.1 to 1.8% (v / v), 0.3 to 1.5% (v / v), 0.3 to 1.2% (v / v), 0.3 to 1.0% (v / v), 0.5 to 2.0% (v / v), 0.5 to 1.8% (v / v), 0.5 to 1.5% (v / v), 0.5 to 1.2% (v / v), 0.5 to 1.0% (v / v), 0.8-2.0% (v / v), 0.8-1.8% (v / v), 0.8-1.5% (v / v), 0.8-1.2% (v / v), 0.8-1.0% (v / v) or 0.8 to 0.9% (v / v) concentration, for example, 0.9% (v / v) concentration.

(b) 원심분리 상층액에 용해 버퍼를 혼합(b) Mixing the lysis buffer in the centrifuged supernatant

원심분리하여 얻은 상층액에 용해 버퍼를 혼합한다. The lysis buffer is mixed with the supernatant obtained by centrifugation.

상기 용해 버퍼는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 NaCl(sodium chloride)를 포함할 수 있다. The lysis buffer may include sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium chloride (NaCl).

상기 용해 버퍼의 SDS 농도는 0.1 내지 10.0%(v/v), 0.1 내지 9.0%(v/v), 0.1 내지 8.0%(v/v), 0.1 내지 7.0%(v/v), 0.5 내지 10.0%(v/v), 0.5 내지 9.0%(v/v), 0.5 내지 8.0%(v/v), 0.5 내지 7.0%(v/v), 1.0 내지 10.0%(v/v), 1.0 내지 9.0%(v/v), 1.0 내지 8.0%(v/v), 1.0 내지 7.0%(v/v), 2.0 내지 10.0%(v/v), 2.0 내지 9.0%(v/v), 2.0 내지 8.0%(v/v), 2.0 내지 7.0%(v/v), 3.0 내지 10.0%(v/v), 3.0 내지 9.0%(v/v), 3.0 내지 8.0%(v/v), 3.0 내지 7.0%(v/v), 4.0 내지 10.0%(v/v), 4.0 내지 9.0%(v/v), 4.0 내지 8.0%(v/v), 4.0 내지 7.0%(v/v), 5.0 내지 10.0%(v/v), 5.0 내지 9.0%(v/v), 5.0 내지 8.0%(v/v) 또는 5.0 내지 7.0%(v/v)인 것일 수 있으며, 예를 들어, 6.0%(v/v)인 것일 수 있다.SDS concentration of the lysis buffer is 0.1 to 10.0% (v / v), 0.1 to 9.0% (v / v), 0.1 to 8.0% (v / v), 0.1 to 7.0% (v / v), 0.5 to 10.0 % (v / v), 0.5 to 9.0% (v / v), 0.5 to 8.0% (v / v), 0.5 to 7.0% (v / v), 1.0 to 10.0% (v / v), 1.0 to 9.0 % (v / v), 1.0 to 8.0% (v / v), 1.0 to 7.0% (v / v), 2.0 to 10.0% (v / v), 2.0 to 9.0% (v / v), 2.0 to 8.0 % (v / v), 2.0 to 7.0% (v / v), 3.0 to 10.0% (v / v), 3.0 to 9.0% (v / v), 3.0 to 8.0% (v / v), 3.0 to 7.0 % (v / v), 4.0 to 10.0% (v / v), 4.0 to 9.0% (v / v), 4.0 to 8.0% (v / v), 4.0 to 7.0% (v / v), 5.0 to 10.0 % (v / v), 5.0 to 9.0% (v / v), 5.0 to 8.0% (v / v) or 5.0 to 7.0% (v / v), for example, 6.0% (v / v).

종래 연구에 따르면 등에 따르면 작업용액(working solution)에서 SDS 농도가 최종적으로 2.0%(v/v) 정도면 시료로부터 RNA를 추출하는데 충분한 것으로 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12): 3975-3981). 실험을 통해 SDS를 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 농도로 사용하였을 때도 문제없이 RNA가 추출되는 것으로 확인되었으나 아래와 같은 문제가 발생하였다.According to a conventional study, it is known that if the SDS concentration in the working solution is finally 2.0% (v / v), it is sufficient to extract RNA from the sample (Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77 (12): 3975-3981). Through experiments, it was confirmed that RNA was extracted without problems even when SDS was used at concentrations of 1.0% (v / v) and 1.5% (v / v), but the following problems occurred.

DNA와 단백질 등을 제거하는 SDS 및 NaCl을 이용한 침전반응 시 SDS 농도가 낮으면 침전된 펠릿의 크기가 작아 상층액을 분리하기 어려웠으며 이보다 농도가 높을 경우 거품이 많이 생기고 실험 직전에 녹이는 과정이 어려워 실험을 수행하기에 용이하지 않았을 뿐만 아니라 비드에 결합하는 RNA의 수율이 낮아지는 문제가 발생하여 최종적으로 용해 버퍼(LnB)에서 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.In the precipitation reaction using SDS and NaCl, which removes DNA and protein, when the SDS concentration is low, the size of the precipitated pellet is small, making it difficult to separate the supernatant. If the concentration is higher than this, a lot of bubbles are formed and the process of melting immediately before the experiment is difficult. Not only was it not easy to perform the experiment, but a problem in which the yield of RNA binding to the beads was lowered, finally, the SDS concentration in the lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).

추가적으로 RNA를 분해하는 효소인 RNAase를 제거하는 RNAse ZAP의 경우, 주성분인 SDS의 농도가 1.0 내지 5.0%(v/v) 정도인 것으로 추정되는데, 이를 기초로 판단하였을 때 SDS의 최종농도가 1.0%(v/v) 이상이어야 RNAse를 효과적으로 불활성화 시킬 수 있을 것으로 판단하였고, 최종적으로 RNA를 포함하는 용액을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킬 때 SDS의 농도가 약 1.0%(v/v)이상이 되도록 용해 버퍼(LnB)의 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.In the case of RNAse ZAP, which removes RNAase, an enzyme that degrades RNA, it is estimated that the concentration of SDS as a main component is about 1.0 to 5.0% (v / v), and based on this, the final concentration of SDS is 1.0% It was judged that RNAse could be effectively inactivated when it was at least (v / v), and finally, when the solution containing RNA was contacted with a silica-coated magnetic bead, the concentration of SDS was about 1.0% (v / v) or more. The SDS concentration of lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).

상기 용해 버퍼의 NaCl의 농도는 0.5 내지 1.0 M, 0.5 내지 0.9 M, 0.5 내지 0.8 M, 0.5 내지 0.75 M, 0.6 내지 1.0 M, 0.6 내지 0.9 M, 0.6 내지 0.8 M, 0.6 내지 0.75 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.7 내지 0.9 M, 0.7 내지 0.8 M, 0.7 내지 0.75 M인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.75 M인 것일 수 있다. NaCl의 농도가 1.0 M 이상인 경우에는 SDS가 불용성(insoluble) 형태가 되어 석출되며, 0.5 M 미만인 경우에는 삼투압이 낮아 균질화된 용액 내 곤충 세포를 효과적으로 용해시킬 수 없다. The concentration of NaCl in the lysis buffer is 0.5 to 1.0 M, 0.5 to 0.9 M, 0.5 to 0.8 M, 0.5 to 0.75 M, 0.6 to 1.0 M, 0.6 to 0.9 M, 0.6 to 0.8 M, 0.6 to 0.75 M, 0.7 to It may be 1.0 M, 0.7 to 0.9 M, 0.7 to 0.8 M, 0.7 to 0.75 M, for example, 0.75 M. When the concentration of NaCl is 1.0 M or more, the SDS is precipitated in an insoluble form, and when it is less than 0.5 M, the osmotic pressure is low, so that insect cells in the homogenized solution cannot be effectively dissolved.

상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화 시료에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v), 0.9 내지 1.0배(v/v), 1.7 내지 1.9배(v/v) 또는 2.0 내지 2.5배(v/v) 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있다. The lysis buffer is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 with respect to the homogenized sample homogenized by adding a homogenization solution to the sample. Times (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 Times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 Pear (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v), 0.9 to 1.0 times (v / v), 1.7 to 1.9 times (v / v) or 2.0 to 2.5 times (v / v) mixing There is, for example, may be to be mixed 1.0 times (v / v).

핵산을 바인딩하기 위해 사용하는 이소프로판올과 혼합액의 최종 희석비율이 1:2(v/v)가 되도록 하기 때문에(일반적으로 DNA 또는 RNA 침전 시 최종 50%(v/v) 농도로 수행한다) 원심분리 상층액, 용해 버퍼 및 5 M NaCl 수용액의 총 혼합액이 100 ul 일 때, 이소프로판올은 50 ul를 사용한다. 따라서 용해 버퍼는 균질화된 시료에 대하여 2.0배(v/v) 혼합하는 것으로 결정하였다. Centrifugation because the final dilution ratio of isopropanol used for binding nucleic acids and the mixed solution is 1: 2 (v / v) (generally performed at the final 50% (v / v) concentration when DNA or RNA is precipitated) When the total mixture of the supernatant, lysis buffer and 5 M NaCl aqueous solution is 100 ul, isopropanol is used 50 ul. Therefore, it was determined that the lysis buffer was mixed 2.0 times (v / v) with respect to the homogenized sample.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.According to the exemplary embodiment of the present invention, the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample homogenized by adding a homogenization solution to the sample (v / v).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 NaCl을 첨가할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, NaCl may be added to the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer.

상기 첨가되는 NaCl은 NaCl 수용액 상태인 것일 수 있다.The added NaCl may be in a NaCl aqueous solution.

상기 NaCl 수용액은 1 내지 10 M, 1 내지 8 M, 1 내지 7 M, 1 내지 6 M, 2 내지 10 M, 2 내지 8 M, 2 내지 7 M, 2 내지 6 M, 3 내지 10 M, 3 내지 8 M, 3 내지 7 M, 3 내지 6 M, 4 내지 10 M, 4 내지 8 M, 4 내지 7 M 또는 4 내지 6 M 농도 일 수 있으며, 예를 들어, 5 M NaCl 수용액일 수 있다. The NaCl aqueous solution is 1 to 10 M, 1 to 8 M, 1 to 7 M, 1 to 6 M, 2 to 10 M, 2 to 8 M, 2 to 7 M, 2 to 6 M, 3 to 10 M, 3 It may be a concentration of 8 M, 3-7 M, 3-6 M, 4-10 M, 4-8 M, 4-7 M or 4-6 M, for example, 5 M NaCl aqueous solution.

상기 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 대하여, 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다. The NaCl aqueous solution is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), and 0.6 to 1.0 for a mixture of a homogenized sample and a lysis buffer. Times (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 Times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 Pear (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, may be mixed in the same amount (v / v).

균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 첨가되는 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.The NaCl aqueous solution added to the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample in the same amount (v / v).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 균질화된 시료 100 ul와 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액 100 ul를 혼합할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, 100 ul of the homogenized sample and 100 ul of the lysis buffer may be mixed, and then 100 ul of a 5 M NaCl aqueous solution may be mixed.

(d) 원심분리 (d) centrifugation

상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물을 원심분리하여 상층액으수득한다. The mixture of the homogenized sample and the lysis buffer is centrifuged to obtain a supernatant.

(e) 원심분리 상층액에 이소프로판올을 혼합(e) Mixing isopropanol in the centrifuged supernatant

원심분리하여 얻은 상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤 이소프로판올을 혼합한다. The supernatant obtained by centrifugation is transferred to a new tube and isopropanol is mixed.

상기 이소프로판올은 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v), 1.1 내지 2.0배(v/v) 또는 2.1 내지 2.5배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 2.0배(v/v)로 혼합되는 것일 수 있다. The isopropanol is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), and 0.6 to 1.0 times (v / v) with respect to the supernatant obtained by centrifugation. , 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 times (v / v) , 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 times (v / v) , 0.9 to 1.1 times (v / v), 1.1 to 2.0 times (v / v) or 2.1 to 2.5 times (v / v) may be mixed, for example, 2.0 times (v / v) mixed May be

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원심분리하여 얻은 상층액과 혼합되는 이소프로판올은 2:1의 부피비로 혼합되는 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, isopropanol mixed with the supernatant obtained by centrifugation may be mixed in a volume ratio of 2: 1.

(f) 이소프로판올 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉(f) contact of the isopropanol mixture with the silica coated magnetic beads

원심분리하여 얻은 상층액과 이소프로판올을 혼합한 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킨다. The mixture of the supernatant obtained by centrifugation and isopropanol is brought into contact with the silica-coated magnetic beads.

(g) 실리카 코팅 자성 비드세척(g) Silica coated magnetic bead washing

실리카 코팅 자성 비드에 1차 세척 버퍼를 첨가하여 세척한다. The silica-coated magnetic beads are washed by adding a primary washing buffer.

상기 1차 세척 버퍼는 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 포함하는 것일 수 있다. The primary washing buffer may be one containing sodium chloride.

상기 소듐 클로라이드의 농도는 0.1 내지 5.0 M, 0.1 내지 4.5 M, 0.1 내지 4.0 M, 0.1 내지 3.5 M, 0.5 내지 5.0 M, 0.5 내지 4.5 M, 0.5 내지 4.0 M, 0.5 내지 3.5 M, 1.0 내지 5.0 M, 1.0 내지 4.5 M, 1.0 내지 4.0 M, 1.0 내지 3.5 M, 1.5 내지 5.0 M, 1.5 내지 4.5 M, 1.5 내지 4.0 M, 1.5 내지 3.5 M, 2.0 내지 5.0 M, 2.0 내지 4.5 M, 2.0 내지 4.0 M, 2.0 내지 3.5 M, 2.5 내지 5.0 M, 2.5 내지 4.5 M, 2.5 내지 4.0 M, 2.5 내지 3.5 M인 것일 수 있으며, 예를 들어, 3.0 M인 것일 수 있다.The concentration of the sodium chloride is 0.1 to 5.0 M, 0.1 to 4.5 M, 0.1 to 4.0 M, 0.1 to 3.5 M, 0.5 to 5.0 M, 0.5 to 4.5 M, 0.5 to 4.0 M, 0.5 to 3.5 M, 1.0 to 5.0 M , 1.0-4.5 M, 1.0-4.0 M, 1.0-3.5 M, 1.5-5.0 M, 1.5-4.5 M, 1.5-4.0 M, 1.5-3.5 M, 2.0-5.0 M, 2.0-4.5 M, 2.0-4.0 M , 2.0 to 3.5 M, 2.5 to 5.0 M, 2.5 to 4.5 M, 2.5 to 4.0 M, 2.5 to 3.5 M, for example, may be 3.0 M.

상기 1차 세척 버퍼의 pH는 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 6.0 또는 5.0 내지 6.0 일 수 있으며, 예를 들어, 5.5 일 수 있다.The pH of the primary washing buffer may be 4.0 to 6.0, 4.5 to 6.0 or 5.0 to 6.0, for example, 5.5.

상기 1차 세척 버퍼로 세척한 실리카 코팅 자성 비드를 2차 세척 버퍼로 추가적으로 세척한다.The silica-coated magnetic beads washed with the primary washing buffer are additionally washed with a secondary washing buffer.

상기 2차 세척 버퍼는 60 내지 90 %(v/v), 65 내지 90 %(v/v), 70 내지 90 %(v/v), 75 내지 90 %(v/v), 60 내지 85%(v/v), 65 내지 85 %(v/v), 70 내지 85 %(v/v), 75 내지 85 %(v/v) 에탄올 수용액, 예를 들어, 80 %(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다. The secondary washing buffer is 60 to 90% (v / v), 65 to 90% (v / v), 70 to 90% (v / v), 75 to 90% (v / v), 60 to 85% (v / v), 65 to 85% (v / v), 70 to 85% (v / v), 75 to 85% (v / v) ethanol aqueous solution, e.g. 80% (v / v) ethanol It may be an aqueous solution.

상기 2차 세척 버퍼로 실리카 코팅 자성 비드를 2차 세척하여 앞서 사용한 버퍼 성분을 제거할 수 있다. The silica-coated magnetic beads may be second washed with the second washing buffer to remove the previously used buffer component.

(h) RNA 용출(h) RNA elution

세척한 실리카 코팅 자성 비드로부터 RNA를 용출시킨다. RNA is eluted from the washed silica coated magnetic beads.

RNA 용출은 실리카 코팅 자성 비드에 용출 버퍼를 접촉시켜 수행하는 것일 수 있다. RNA elution may be performed by contacting the elution buffer with the silica-coated magnetic beads.

상기 용출 버퍼는 RNA 분해효소가 없는 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는일 수 것은 아니다.The elution buffer may be water without RNA degrading enzyme, but is not limited thereto.

본 명세서의 용어 중 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (w/w)%, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v)%이다.The term "%" used to indicate the concentration of a specific substance in the terms of the present specification is (w / w)% for solids / solids, (w / v)% for solids / liquids, and liquid / The liquid is (v / v)%.

본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출용 조성물에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 비용문제로 샘플을 풀링(pooling) 하는 단계를 생략함으로 써 정밀한 바이러스 발생 감시를 가능하게 할 뿐만 아니라 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.The present invention relates to a composition for extracting viral RNA using a silica-coated magnetic bead and a method for extracting viral RNA using the same, which effectively removes various contaminants from a sample, enabling more sensitive diagnosis of a virus derived from a sample, and extracting existing RNA Because it uses less expensive reagents than the solvent composition, it eliminates the step of pooling samples due to cost problems, thereby enabling precise virus outbreak monitoring as well as virus diagnosis experiments that mediate disease and the scale of various surveillance projects. It can expand and consequently contribute to public health.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 과정을 도식화환 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 방법이 모기 매개 바이러스 보유감시를 위해 수행되는 분자진단 과정에서 사용되는 단계를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 21은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 23은 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 시료에서 플라비바이러스 유래 RNA 탐지하여 그 용해 곡선을 분석한 결과를 보여주는 사진이다.1 is a schematic diagram of a viral RNA extraction method according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a schematic wreath diagram of the viral RNA extraction process according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the steps used in the molecular diagnostic process is carried out for monitoring the retention of mosquito-mediated virus RNA viral extraction method according to an embodiment of the present invention.
4 is a photograph showing the results of analyzing the lysis curve by detecting flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from the sample extracted using the composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 6 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from the sample extracted using the composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 7 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 8 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from a sample extracted using the composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 9 is a photograph showing the results of analyzing flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 10 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 11 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from the sample extracted using the composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 12 is a photograph showing a result of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 13 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 14 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 15 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 16 is a photograph showing the results of analyzing the flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
17 is a photograph showing the results of analyzing the lysis curve by detecting RNA derived from flavivirus in a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 18 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 19 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 20 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
FIG. 21 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.
22 is a photograph showing a result of analyzing the lysis curve by detecting RNA derived from flavivirus in a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 23 is a photograph showing the results of analyzing a flavivirus-derived RNA from a sample extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment of the present invention and analyzing its lysis curve.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

1. 실시예1. Examples

1-1. 균질화 단계1-1. Homogenization step

핵산을 추출하는데 있어서 시료가 균질화 되어 바이러스 추출 용액 전체에 분산되어야 한다. 분산된 조직은 추출 용액에 의해 RNA가 버퍼로 용해되며 동시에 버퍼 구성요소에 의해 Rnase 등 핵산분해효소가 불활성화되어 핵산을 보호할 수 있다.In extracting nucleic acids, the sample must be homogenized and dispersed throughout the virus extraction solution. In the dispersed tissue, RNA is dissolved as a buffer by an extraction solution, and at the same time, nucleases such as Rnase are inactivated by a buffer component to protect the nucleic acid.

구체적으로, 곤충 100 mg당 1ml의 EDTA-NaCl(0.9% NaCl, 20mM EDTA)을 넣은었다. 후, 비드 균질기(Bead homogenizer)를 이용하여 균질화하였다.Specifically, 1 ml of EDTA-NaCl (0.9% NaCl, 20 mM EDTA) was added per 100 mg of insects. Then, it was homogenized using a bead homogenizer.

1-2. 제1 혼합 단계1-2. First mixing step

균질화된 시료 100 ul에 65℃가 되도록 가열한 표 1의 용해 버퍼(Lysis and binding buffer, LnB) 100 ul 넣고 섞은 다음, 100 ul의 5.0 M NaCl 수용액을 넣고 볼텍싱(Vortexing)하였다. 100 ul of the homogenized sample was added to 100 ul of the lysis buffer (Lysis and binding buffer, LnB) in Table 1 heated to 65 ° C., and then mixed with 100 ul of 5.0 M NaCl aqueous solution and vortexed.

성분ingredient 용량Volume 최종 농도Final concentration 20% SDS 용액20% SDS solution 10 ml10 ml 4%4% 5 M NaCl5 M NaCl 7.5 ml7.5 ml 0.75 M0.75 M 증류수Distilled water 32.5 ml32.5 ml --

1-3. 원심분리 단계1-3. Centrifugation step

그 다음, 용해 버퍼 혼합물을 3,500 rpm, 상온 조건으로 15분 동안 또는 13,000rpm 상온 조건으로 4분 동안 원심분리하는 과정을 통해 단백질 및 DNA를 제거하였다. 이 단계에서 외부 요인의 오염원이 제거된다. 상기 외부 요인의 오염원은 곤충 체외의 비표적 생물(nontarget organism)을 의미한다.Then, the protein and DNA were removed by centrifuging the lysis buffer mixture at 3,500 rpm for 15 minutes at room temperature or for 4 minutes at 13,000 rpm at room temperature. At this stage, contaminants from external factors are eliminated. The contaminant of the external factor refers to a nontarget organism outside the insect body.

0.5 내지 6.0%(v/v) 농도의 SDS와 0.4 M 농도 이상의 NaCl수용액을 혼합하면 SDS가 분리되어 침전된다. 이 과정에서 SDS와 결합했던 단백질과 DNA가 함께 침전되어 상층액에서 대부분 제거된다. When SDS at a concentration of 0.5 to 6.0% (v / v) and NaCl aqueous solution at a concentration of 0.4 M or more are mixed, the SDS is separated and precipitated. In this process, proteins and DNA that have been associated with SDS are precipitated together and are mostly removed from the supernatant.

1-4. 제2 혼합 단계1-4. Second mixing step

원심분리 후 얻은 침전물을 제외한 상층액 100ul를 바인딩 플래이트에 옮긴 후 동량의 이소프로판올을 넣고 혼합하였다. After centrifugation, 100 ul of the supernatant, excluding the obtained precipitate, was transferred to the binding plate, and the same amount of isopropanol was added and mixed.

1-5. 바인딩 단계1-5. Binding steps

원심분리 상층액 및 이소프로판올의 혼합액을 깨끗한 자성 홀더(magnetic holder)의 어댑터를 이용하여 혼합액을 위아래로 섞어주었다. 96 웰 자성 홀더에 어댑터를 끼운 후 비드를 회수하였다.The mixed solution of the centrifuged supernatant and isopropanol was mixed up and down using an adapter of a clean magnetic holder. The beads were recovered after fitting the adapter into a 96 well magnetic holder.

1-6. 1차 세척 단계1-6. 1st washing step

표 2의 조성을 가진 1차 세척 버퍼(wash buffer)가 담긴 1차 세척 플래이트로 옮긴 자성 홀더를 분리하고 혼합액을 위아래로 섞어주었다. 이 과정을 통해 곤충 색소, 단백질, DNA, 탄수화물 등을 제거하였다. The magnetic holder transferred to the primary washing plate containing the primary washing buffer having the composition of Table 2 was separated, and the mixed solution was mixed up and down. In this process, insect pigments, proteins, DNA, and carbohydrates were removed.

성분ingredient 용량Volume 최종 농도Final concentration pHpH 소듐 클로라이드(sodium acetate)Sodium acetate 12.3 g12.3 g 1 M1 M -- 에틸 알코올(ethyl alcohol)Ethyl alcohol 30ml30ml 60%60% 증류수Distilled water 세척 버퍼 최종 부피가 50 ml이 되도록 첨가함. Add the final volume of wash buffer to 50 ml. -- 5.55.5

1-7. 2차 세척단계 1-7. 2nd washing step

다시 자성 홀더를 결합시킨 후, 표 3의 조성을 가진 2차 세척 버퍼를 포함하는 2차 세척 플레이트로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼압액을 위아래로 섞어주었다. 이 단계를 통해 상기 실험과정에서 사용한 용해 버퍼, 1차 세척 버퍼 성분을 제거하였다. After the magnetic holders were combined again, they were transferred to a secondary washing plate containing a secondary washing buffer having the composition shown in Table 3, and then the magnetic holders were separated and the mixed solution was mixed up and down. Through this step, the lysis buffer and the primary washing buffer components used in the above experimental process were removed.

성분ingredient 용량Volume 최종 농도Final concentration 99% 에탄올99% ethanol 40 ml40 ml 80%80% 증류수Distilled water 10 ml10 ml --

1-8. 용출 단계1-8. Elution step

다시 자성 홀더를 결합시키고 그대로 들어서 비드를 회수하고 스탠드에 거치해 놓은 상태로 1 내지 5분간 비드를 자연 건조시켰다. 50 내지 180 ul의 증류수 또는 Tris-EDTA를 혼합하여 RNA가 용출되도록 한 다음, 제3 원심분리하여 RNA를 수득하였다. 이를 통해 PCR 등의 분자진단과정에 사용할 수 있다.Again, the magnetic holder was combined and lifted to collect the beads, and the beads were naturally dried for 1 to 5 minutes while being placed on a stand. RNA was eluted by mixing 50 to 180 ul of distilled water or Tris-EDTA, and then centrifuged to obtain RNA. Through this, it can be used for molecular diagnostic processes such as PCR.

실험예 1. 바이러스 RNA 추출Experimental Example 1. Virus RNA extraction

2017년 1년간 채집된 모기로부터 본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물과 방법을 통해 바이러스 RNA를 추출하고 채집된 모기가 보유한 플라비바이러스를 PCR을 통해 검출하였다.Virus RNA was extracted from the mosquitoes collected for one year in 2017 through the composition and method for extracting viral RNA of the present invention, and flaviviruses possessed by the collected mosquitoes were detected by PCR.

구체적으로, 바이러스 매개 모기인 빨간집모기 (Culex pipiens)를 광주광역시 북구 임동에서 BG sentinel trap과 드라이아이스를 이용하여 유인 채집하였다. 채집된 빨간집모기 100mg당 1ml의 EDTA-NaCl(0.9% NaCl, 20mM EDTA)을 넣어 시료를 준비하였다. 비드 균질화기를 이용하여 균질화한다. 3500rpm 이상으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 상층액 200ul에 70℃로 가열해놓은 용해 버퍼 200ul를 넣고 짧게 교반하였다. 그 다음, 5.0 M NaCl 200ul를 넣고 1분간 기다린 후, 3500RPM, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하였다. Specifically, virus-borne mosquitoes (Culex pipiens) were collected using BG sentinel trap and dry ice in Im-dong, Buk-gu, Gwangju. Samples were prepared by adding 1 ml of EDTA-NaCl (0.9% NaCl, 20 mM EDTA) per 100 mg of collected red gnats. Homogenize using a bead homogenizer. Centrifugation was performed at 3500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. In 200ul of the supernatant, 200ul of the lysis buffer heated to 70 ° C was added and stirred briefly. Then, 200ul of 5.0 M NaCl was added, waited for 1 minute, and then centrifuged for 15 minutes at 3500 RPM, 4 ° C.

원심분리가 끝난 상층액 100ul를 바인딩 플래이트(이소프로판올 50ul, 자성 비드 5ul)에 옮겼다. 깨끗한 빈 어댑터로 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 96 웰 자성 홀더에 어댑터를 끼운 후 비드를 회수하였다. 1차 세척 플래이트(70% Et-OH 180ul)로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 다시 자성 홀더를 결합시키고 2차 세척 플래이트(70% Et-OH 180ul)로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 다시 자성 홀더를 결합시키고 그대로 들어서 스탠트에 거치해 놓은 상태로 1 내지 5분간 비드를 건조시켰다. 다시 자성 홀더를 용출 플래이트(D.W 50ul)에 넣은 후 비드가 D.W에 잘 풀리게 한 후, 다시 자성 홀더로 비드를 회수하였다. 추출된 RNA를 5ul씩 검출용 PCR에 사용한 후, 남은 용액은 플래이트채로 봉인 후 -80'C에 보관하였다.100ul of the supernatant after centrifugation was transferred to a binding plate (50ul of isopropanol, 5ul of magnetic beads). The mixture was mixed up and down with a clean empty adapter. The beads were recovered after fitting the adapter into a 96 well magnetic holder. After transferring to the primary washing plate (70% Et-OH 180ul), the magnetic holder was separated and the mixture was mixed up and down. The magnetic holder was again combined and transferred to a second washing plate (70% Et-OH 180ul), after which the magnetic holder was separated and the mixture was mixed up and down. The magnetic holder was again combined and lifted as it was, and the beads were dried for 1 to 5 minutes while being placed on a stand. After placing the magnetic holder in the elution plate (D.W 50ul), the beads were well released in D.W, and then the beads were recovered with the magnetic holder. After the extracted RNA was used for PCR for 5ul detection, the remaining solution was sealed with a plate and stored at -80'C.

실험예 2. 플라비바이러스 유래 RNA 탐지Experimental Example 2. Flavivirus-derived RNA detection

2-1. qRT-PCR2-1. qRT-PCR

Extracted RNA 5ul, AccuPower® GreenStar? RT-qPCR Master Mix 10ul, Primer 1ul (최종 3pmole/rxn 내지 20pmole/rxn), DEPC treated water up to 20ul를 준비하여, cDNA synthesis 50℃ 15분, Thermo-start activation 95℃ 5분, Denaturation 95℃에서 15초 40사이클 및 Annealing/Extension 60℃ 60초(Data collection) 조건에서 수행하였다.Extracted RNA 5ul, AccuPower® GreenStar? RT-qPCR Master Mix 10ul, Primer 1ul (final 3 pmole/rxn to 20 pmole/rxn), DEPC treated water up to 20ul prepared, cDNA synthesis 50 ℃ 15min, Thermo-start activation 95 ℃ 5min, Denaturation 95 ℃ 15 seconds 40 cycles and Annealing / Extension 60 ℃ 60 seconds (Data collection) conditions were performed.

2-2. 융해 곡선 분석2-2. Fusion curve analysis

Denaturation 95℃ 30초, 시작 온도 60℃ 30초 및 융해 단계 60℃에서 90℃ (0.5℃?씩 사이클마다 승온)Denaturation 95 ℃ 30sec, start temperature 60 ℃ 30sec and melting step 60 ℃ to 90 ℃ (heated every 0.5 ℃? Cycle)

양성의심시료 전기영동 및 PCR 산물을 확인하였다. 융해 곡선(melting peak) 온도가 85℃ 이상일 경우 양성 의심 판정하였으며, 후 아가로즈 겔을 이용한 전기영동을 통해 PCR 산물의 밴드 사이즈를 확인하였다.Electrophoresis and PCR products of positive suspicious samples were confirmed. When the melting peak temperature was 85 ° C or higher, positive suspicion was determined, and then the band size of the PCR product was confirmed through electrophoresis using an agarose gel.

구체적으로, 1% 아가로즈 겔 (0.5x TBE buffer) 제조하였다. 그 다음, PCR 산물 20ul에 6x DNA 로딩 염료 4ul를 혼합하였다. PCR 산물 5ul를 겔에 로딩 후 100v/20분 조건으로 전기영동하였다. 이미지 장비(Gel documentation)를 이용하여 겔 밴드를 촬영하고 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 4 내지 23에 나타내었다.Specifically, 1% agarose gel (0.5x TBE buffer) was prepared. Then, 4 ul of 6x DNA loading dye was mixed with 20 ul of PCR product. After loading 5ul of the PCR product on the gel, electrophoresis was performed under 100v / 20 minutes. Gel bands were taken and analyzed using an imaging device (Gel documentation). The results are shown in Figs. 4 to 23.

도 4 내지 23에서 확인할 수 있듯이, 본 방법을 사용함으로써 flavivirus의 일종인 일본뇌염바이러스, 모기특이적인 플라비바이러스(Aedes flavivirus, Culex flavivirus) 그리고 차오양바이러스의 존재유무를 야외에서 채집된 모기로부터 바이러스 RNA를 추출하고 추출된 RNA로부터 PCR법을 사용하여 바이러스 유래 유전물질을 증폭하고 그 결과를 전기영동, 실시간 PCR, 서열분석, 계통분석 등 다양한 downstream analysis를 할 수 있음을 확인하였다. 본 방법을 통해 환경에 분포되어있는 바이러스를 감시하고 스크리닝 하는 업무에 있어서 기존 기술대비 보다 간편하며 사용자에게 무해하게 바이러스 RNA를 추출하고 이를 PCR 기반 분자진단에 사용할 수 있음을 보였다.As can be seen in Figures 4 to 23, by using this method, a type of flavivirus, Japanese encephalitis virus, mosquito specific flavivirus (Aedes flavivirus, Culex flavivirus), and the presence or absence of chaoyang virus virus RNA from mosquitoes collected outdoors Was extracted and amplified virus-derived genetic material using PCR method from the extracted RNA, and it was confirmed that various downstream analysis such as electrophoresis, real-time PCR, sequencing, and phylogenetic analysis can be performed. Through this method, it was shown that in the task of monitoring and screening the virus distributed in the environment, it is simpler than the existing technology and extracts viral RNA harmlessly to the user and can use it for PCR-based molecular diagnosis.

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Claims (7)

하기의 단계를 포함하는 곤충류 시료로부터 바이러스 RNA 추출 방법:
균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM의 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(w/v)의 NaCl (sodium chloride)을 포함하는 균질화 용액을 첨가하여 시료를 균질화하는 균질화 단계;
균질화된 시료에 0.1 내지 1.5 M의 NaCl 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼를 혼합하는 제1 혼합 단계;
균질화된 시료를 원심분리하는 원심분리 단계;
원심분리 상층액에 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하는 제2 혼합 단계;
실리카 코팅 자성 비드에 상층액을 접촉시키는 바인딩 단계;
실리카 코팅 자성 비드를 0.1 내지 5.0 M의 NaCl을 포함하는 1차 세척 버퍼로 세척하는 1차 세척단계;
실리카 코딩 자성 비드를 60 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼로 세척하는 2차 세척 단계; 및
RNA를 용출시키는 용출 단계.Method for extracting viral RNA from an insect sample comprising the following steps:
A homogenization step of homogenizing the sample by adding a homogenization solution containing 1 to 30 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1 to 2.0% (w / v) NaCl (sodium chloride) relative to the total amount of the homogenization solution;
A first mixing step of mixing a lysis buffer containing 0.1 to 1.5 M NaCl and 0.1 to 10.0% (v / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) into the homogenized sample;
A centrifugation step of centrifuging the homogenized sample;
A second mixing step of mixing isopropanol in the centrifuged supernatant;
A binding step of bringing the supernatant into contact with the silica-coated magnetic beads;
A first washing step of washing the silica coated magnetic beads with a first washing buffer containing 0.1 to 5.0 M NaCl;
A second washing step of washing the silica-coated magnetic beads with a second washing buffer containing 60 to 80% (v / v) ethanol aqueous solution; And
Elution step of eluting RNA. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 제1 혼합 단계는 1 내지 10 M의 NaCl 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.The method according to claim 1, wherein the first mixing step further comprises adding and mixing 1 to 10 M of a NaCl aqueous solution to mix, and extracting viral RNA. 다음을 포함하는 곤충류 시료로부터 바이러스 RNA 추출용 조성물:
(a) 1 내지 30 mM의 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(v/v)의 NaCl (sodium chloride)을 포함하는 균질화 용액;
(b) 0.1 내지 1.5 M의 NaCl 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼;
(c) 0.1 내지 5.0 M의 NaCl(sodium chloride)을 포함하는 1차 세척 버퍼;
(d) 60 내지 90 %(v/v)의 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼; 및
(e) 실리카 코팅 자성 비드.Composition for viral RNA extraction from insect samples, including:
(a) a homogenizing solution containing 1 to 30 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1 to 2.0% (v / v) sodium chloride (NaCl);
(b) a lysis buffer comprising 0.1 to 1.5 M NaCl and 0.1 to 10.0% (v / v) sodium dodecyl sulfate (SDS);
(c) a primary wash buffer containing 0.1 to 5.0 M of sodium chloride (NaCl);
(d) a second wash buffer containing 60-90% (v / v) aqueous ethanol solution; And
(e) Silica coated magnetic beads.
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