KR102418172B1

KR102418172B1 - 피부상재균을 이용한 캐비어 발효 오일의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102418172B1
Application number: KR1020210152921A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 한현탁; 손주현; 조사랑; 김주연; 김태현; 정수경; 윤석균; 이예린; 강승현; 박명삼; 노윤화; 한상훈; 한제희
Original assignee: 코스맥스 주식회사; 주식회사 알마스캐비아
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-08-11
Also published as: WO2023085612A1

Abstract

본 발명은 캐비어와 식물성 오일을 피부상재균으로 발효하여 아민그룹을 지닌 지질 발효 대사산물의 함량을 향상시킨 발효오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 항노화, 장벽 강화, 보습 및 분화 효과를 향상시켜 피부에 유익한 효과를 최대화할 수 있다.

Description

피부상재균을 이용한 캐비어 발효 오일의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물{PREPARATION METHOD OF FERMENTED CAVIAR OIL USING SKIN FLORA AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THEREOF}

본 발명은 피부상재균으로 캐비어와 식물성오일을 발효함으로써, 아민 그룹을 지닌 지질 발효 대사산물의 함량을 향상시킨 발효오일 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 표피, 진피, 피하지방층으로 이루어져 있다. 이 중, 표피는 가장 바깥층에 존재하면서 피부의 보호막 역할을 하며, 피부의 면역 기능을 담당하고 있다. 피부에는 피부상재균이 서식하고 있으며, 이 미생물은 표피의 가장 외곽층과 모낭의 윗부분(상위층)에서 주로 발견된다. 피부상재균으로는 약 1000여종의 미생물이 존재하며, 이 중 호기성 미생물은 표피층의 지질을 이용할 수 있는 지방분해효소를 분비할 수 있다.

피부의 표피층은 주로 각질형성세포로 이루어져 있으며, 각질세포 사이는 지질성분으로 이루어져 있고, 가장 바깥층은 단백질로 구성되어 있다. 표피의 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하며 인체의 최외곽에 존재함으로써 체외로의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터 물질의 과잉 침투를 차단한다. 이들 각질층 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막으로 둘러쌓여 수분의 증발을 예방할 수 있다. 이러한 각질층을 구성하고 있는 세포에는 수용성 성분인 고농도의 자연보습인자 (Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하며 피부의 유연성 및 적절한 수분 유지의 역할을 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성일 뿐만 아니라 효과적으로 수분과 결합하여 피부의 수분이 건조되는 것을 억제한다.

한편, 철갑상어의 알은 아미노산, 지방 등의 영양소가 풍부하며 표피 지질막 재생, 노화방지의 효과를 나타내는 것으로 알려짐에 따라 화장품의 원료로 포함되기도 한다.

피부는 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 환경 오염과 같은 외부 환경의 변화 또는 생활 패턴의 변화와 같은 각종 자극으로 인한 스트레스, 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 윤기를 잃게 되면 미용적, 피부 건강학적으로 부정적인 영향을 받게 되므로 피부 보습제의 필요성이 증가하고 있는 실정이다.

본 발명에서는 피부 상재균과 식물성 오일을 발효할 때, 질소원으로 캐비어를 활용하여 아민 그룹을 지닌 지질 발효 대사산물을 생성하고 피부 건강을 향상시킬 수 있는 발효오일 제조 방법 및 그 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 피부상재균으로 캐비어와 식물성 오일을 발효하여 아민 그룹을 함유하는 지질 발효 대사산물의 함량을 향상시킨 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 배양하여 종균배양물을 제조하는 종균배양 단계;

상기 종균배양물을 배양하여 전배양물을 제조하는 전배양 단계; 및

캐비어 추출물을 포함하는 배지에 상기 전배양물을 투입하여 발효물을 제조하는 본 발효 단계를 포함하는, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계의 배지 또는 상기 전배양 단계의 배지는 카제인 가수분해물, 이스트 추출물, 글루코스, 가용성 전분, K₂HPO₄, MgSO₄, 피루브산나트륨 및 카제인펩톤을 포함할 수 있다.

구체적으로 예를 들면, 상기 종균배양 단계의 배지 또는 상기 전배양 단계의 배지는 카제인 가수분해물 0.1 내지 5 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, K₂HPO₄ 0.1 내지 5 g/L, MgSO₄0.1 내지 10 g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L 및 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계의 배지는 글리세롤, 이스트 추출물, 카제인 펩톤, K₂HPO₄, KH₂PO₄, 암모늄 아세테이트를 포함할 수 있다.

구체적으로 예를 들면, 상기 본 발효 단계의 배지는 글리세롤 1 내지 100 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 10 g/L, K₂HPO₄ 0.5 내지 50 g/L, KH₂PO₄ 0.3 내지 30 g/L, 암모늄 아세테이트 0.005 내지 0.1 g/L 및 캐비어 추출물 5 내지 250 g/L를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계의 배지는 식물성 오일을 더 포함할 수 있다.

구체적으로 예를 들면, 상기 식물성 오일의 함량은 5 내지 500 g/L일 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 35℃의 호기 조건에서 진탕배양하는 단계를 포함하고,

상기 전배양 단계는 상기 종균배양물 10 내지 500g/L을 투입하고, 15 내지 35℃, 5 내지 20 NL/min, 10 내지 100 rpm의 호기 조건으로 배양하는 단계를 포함하고,

상기 전배양 단계는 600nm 파장에서 5% 배양액의 분광광도계의 흡광도가 0.2 내지 0.8인 시점에 배양을 종료할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계는 상기 전배양물 10 내지 500g/L을 투입하여 15 내지 35℃, 100 내지 500 NL/min, 100 내지 300 rpm의 호기 조건으로 50 내지 150시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 피부 항노화, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습용 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 방법으로 제조되는 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 상재균을 이용하여 캐비어와 식물성 오일의 발효를 통하여 유효물질의 활성 및 함량을 향상시킴으로 인하여 항노화, 장벽 강화, 보습 및 분화 효과를 향상시켜 피부에 유익한 효과를 최대화할 수 있다.

도 1은 발효물을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 2는 MMP1 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 3은 COL1A1의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 4는 HAS3의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 5는 Aquaporin3의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 6은 Claudin의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 7은 Filaggrin의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 8은 Involucrin의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 9는 Loricrin의 발현 정도를 분석한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대하여 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명에 따른 캐비어 발효 오일 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물여 상세히 설명한다.

본 발명은, 피부에 서식하고 있는 다양한 미생물들 중, 피부에 유익한 영향을 주면서 공생하고 있는 피부상재균을 이용하여 캐비어추출물과 식물성오일의 발효를 통하여 발효오일을 생성하는 발효 대사 산물의 증가에 따른 피부 효능, 효과를 향상시킨 조성물을 제공한다.

구체적으로 본 발명은,

본 발명의 피부상재균은 에피더미디박테리움 케라티니 속(Epidermidibacterium keratini sp.) 균주이다.

캐비어(caviar)는 철갑상어의 알을 소금에 절인 것으로, 세계 3대 진미로 불리는 고급스러운 식재료로 잘 알려져 있다. 단백질, 지방, 당, 비타민 등의 각종 영양소와, 류신(leucine), 아르기닌(arginine) 등과 같은 필수 아미노산뿐만 아니라, 글루탐산(glutamic acid), 세린(serine), 알라닌(alanine) 등 각종 아미노산들이 풍부하다. 또한, 캐비어에 함유된 지방은 대부분 콜레스테롤과 레시틴으로 구성되어 표피의 지질막을 재생시키는데 도움을 줄 수 있고, 오메가-3 지방산이 풍부하여 노화 방지 효과가 탁월하다. 본 발명의 캐비어 추출물은 캐비어 가수분해물을 포함할 수 있다. 캐비어 가수분해물은 단백질 분해효소를 이용하여 제조할 수 있다.

캐비어와 식물성오일을 기질로 하여 피부상재균으로 발효하면, 캐비어 발효 오일을 수득할 수 있다. 캐비어 발효 오일은 아민기를 가진 피부 유사 지질류, 발효 유화물질, 불포화지방산과 그 외 다양한 대사산물을 포함한다.

구체적으로, 상기 종균배양 단계의 배지 또는 상기 전배양 단계의 배지가 카제인 가수분해물 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, K₂HPO₄ 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 예를 들면 0.1 내지 0.5 g/L, MgSO₄ 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 예를 들면 0.1 내지 0.5 g/L 및 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L 를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계의 배지는 글리세롤, 이스트 추출물, 카제인 펩톤, K₂HPO₄, KH₂PO₄, 암모늄 아세테이트(Ammonium acetate) 및캐비어 추출물을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 본 발효 단계의 배지는 글리세롤 1 내지 100 g/L, 예를 들면 1 내지 50 g/L, 예를 들면 1 내지 30 g/L, 예를 들면 1 내지 20 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 예를 들면 0.01 내지 0.5 g/L, 예를 들면 0.05 내지 0.3 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.5 내지 3 g/L, K₂HPO₄ 0.5 내지 50 g/L, 예를 들면 0.5 내지 30 g/L, 예를 들면 1 내지 10 g/L, KH₂PO₄ 0.3 내지 30 g/L, 예를 들면 0.3 내지 20 g/L, 예를 들면 1 내지 10 g/L, 예를 들면 1 내지 5 g/L, 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 0.005 내지 0.1 g/L, 예를 들면 0.001 내지 0.05 g/L, 예를 들면 0.01 내지 0.1g/L 및 캐비어 추출물 5 내지 250 g/L, 예를 들면 50 내지 250 g/L, 예를 들면 50 내지 200 g/L를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발효 단계의 배지는 식물성 오일을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 식물성 오일의 함량은 5 내지 500 g/L, 예를 들면 100 내지 500 g/L, 예를 들면 200 내지 300 g/L, 예를 들면 300 내지 500 g/L 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 식물성 오일은 마카다미아 오일, 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트 열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨 등의 식용 가능 또는 인체 친화적인 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 상기한 종류에 특별히 한정되지는 않는다.

일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 35℃, 예를 들면 15 내지 30℃의 호기 조건에서 진탕 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 전배양 단계는 상기 종균배양물 10 내지 500 g/L, 예를 들면 50 내지 300 g/L, 50 내지 200 g/L, 50 내지 150 g/L을 투입하고, 15 내지 35℃, 예를 들면 15 내지 25℃, 5 내지 20 NL/min, 예를 들면 10 내지 20 NL/min, 10 내지 100 rpm, 예를 들면 30 내지 80 rpm의 호기 조건으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 전배양 단계는 5%로 희석한 배양액을 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 0.2 내지 0.8, 예를 들면 0.2 내지 0.4인 시점에 배양을 종료할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발효 단계는 상기 전배양물 10 내지 500 g/L, 예를 들면 50 내지 300 g/L, 50 내지 200 g/L, 50 내지 150 g/L을 투입하여 15 내지 35℃, 예를 들면 15 내지 25℃, 100 내지 500 NL/min, 예를 들면 100 내지 300 NL/min, 200 내지 400 NL/min, 100 내지 300 rpm, 예를 들면 100 내지 200 rpm의 호기 조건으로 50 내지 150시간, 예를 들면 50 내지 100시간, 60 내지 80시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발효 단계 이후에 분리 및 정제 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발효물을 원심분리하여 오일층과 수층을 분리한 후, 오일층을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 잔존 수분과 불순물을 제거하기 위하여 MgSO₄를 첨가하여 필터를 사용한 여과법을 적용할 수 있으나, 정제를 위해 적용되는 방법은 상기한 기재에 제한되지는 않는다.

본 발명은 상기한 바와 같은 구성으로 캐비어에 함유된 유효물질의 효과를 극대화할 수 있다. 본 발명이 포함하는 유효물질은 피부 세포에 유익한 도움을 줄 수 있으므로, 피부 항노화, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습용 조성물의 적용에 적합하다. 구체적으로, 본 발명은 손상된 피부 세포, 예를 들면 각질 형성 세포(keratinocyte), 멜라닌 세포 (melanocyte)와 진피에 존재하며 콜라겐 및 엘라스틴의 생합성을 담당하는 섬유아세포의 재생을 도와 건강한 피부를 유지할 수 있도록 한다.

일구현예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 안정화제, 용해제, 비타민, 안료, 향료, 보조제, 담체 등 화장료 조성물에 통상적으로 이용하는 성분들을 포함할 수 있다.

또한, 당업계에서 통상적으로 제조되며, 피부학적으로 적용이 가능한 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.

피부학적으로 적용이 가능하다는 것은 적용 대상에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 할 수 있는 조성물로서, 피부에 적용할 수 있는 외용제를 포함할 수 있으며, 상기 조성물로부터 기인하는 부작용이 유효 성분의 효능을 저하시키기 않고, 적용 대상에 심각한 자극을 유발하지 않으면서 유효성분들의 활성 및 물성을 손상시키지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 피부학적으로 적용이 가능한 화장료 조성물로는 예를 들어, 용액, 현탁액, 유액, 유탁액, 페이스트, 겔, 팩, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 모발 화장료 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 겔, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 엠플, 영양에센스, 팩, 비누, 헤어샴푸, 풋샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형 등으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

제조예 1: 캐비어 추출물 제조

캐비어 가수분해물을 제조하기 위하여 캐비어(알마스캐비어 구입)를 믹서기로 분쇄하였다. 분쇄한 캐비어와 0.1M 인산 나트륨(sodium phosphate)(pH 7.0)을 1:1(w/v)으로 혼합하였다. 혼합물의 온도를 35℃로 승온한 후, 단백질 분해효소인 브로멜라인(bromelain)을 0.05% 투입하여 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 90℃에서 15분 동안 효소의 활성을 상실시켜 캐비어 추출물을 제조하였다.

실시예 1: 캐비어 발효 오일 제조

종균배양

피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 종균배양하였다. R2A(BD Difco, USA)배지에 접종하여 25℃의 호기적인 조건에서 진탕배양을 진행하여 종균배양물을 제조하였다. 구체적으로, 배지 조성은 카제인 가수분해물(Casein acid hydrolysate) 0.5 g/L, 이스트 추출물(yeast extract) 0.5 g/L, 글루코스(glucose) 0.5 g/L, 가용성 전분(soluble starch) 0.5 g/L, K₂HPO₄ 0.3 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, 피루브산나트륨(sodium pyruvate) 0.3 g/L 및 카제인펩톤(casein peptone) 0.5 g/L이다.

전배양

상기 종균배양 단계와 같은 조성의 배지에 종균배양물 100 g/L을 투입하고, 20℃, 15 NL/min, 50 rpm 호기적인 조건으로 배양을 진행하여 전배양물을 제조하였다.

전배양물에 대하여 탁도 측정법으로 본 발효의 접종시점을 설정하였다. 구체적인 방법으로, 전배양물을 샘플링하여 0.85% NaCl 용액으로 5% 희석한 후, 분광광도계(Spectrophotometer, BioTek, USA)를 이용하여 600nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 범위는 0.2 내지 0.4를 기준으로 하여 전배양 종료시점 및 본 발효 접종시점을 설정하였다.

본 발효

표 1과 같은 조성의 배지에 그 온도가 20℃일 때, 전배양물 100 g/L를 투입하고, 20℃, 300 NL/min, 150 rpm 호기적인 조건으로 72시간 동안 발효를 진행하여 발효물(발효오일)을 제조하였다. 표 1의 캐비어 추출물은 제조예 1로부터 제조된 것이다.

구분 (g/L)	비교예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3
Glycerol	10.0	10.0	10.0	10.0
Yeast extract	0.1	0.1	0.1	0.1
Casein peptone	1.0	1.0	1.0	1.0
K₂HPO₄	4.5	4.5	4.5	4.5
KH₂PO₄	3.0	3.0	3.0	3.0
Ammonium acetate	0.02	0.02	0.02	0.02
캐비어 추출물	-	50.0	100.0	200.0
마카다미아 오일	500.0	500.0	500.0	500.0
정제수	481.38	431.38	381.38	281.38

분리 및 정제

상기 발효물로부터 발효 오일을 수득하기 위하여, 발효물을 원심분리하여 오일층을 분리하였다. 오일층을 회수하고, 잔존하는 수분 및 불순물을 제거하기 위하여 MgSO₄ 100g/L를 첨가한 후 교반하였다. 2시간 동안 교반한 후, 필터프레스(filter press)에 여과패드(CH-ST-150, 현대마이크로, Korea)를 이용하여 여과하였다. 여과한 오일은 최종적으로 제균여과(0.2um filter)하여 캐비어 발효 오일을 수득하였다.

본 발효 전의 전배양물, 정제 전의 본 발효물 및 최종 수득물인 캐비어 발효 오일의 육안 관찰 사진을 도 1에 나타내었다.

실험예 1: MMP-1 저해능 평가

자외선에 의해 증가하는 기질 금속 단백 분해 효소(MMP-1)에 대하여 캐비어 발효 오일의 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다.

기질 금속 단백 분해 효소(Matrix metalloproteinases, MMPs)는 기질단백질을 분해하는 대표적인 효소이다. 진피는 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하는데, 기질단백질은 대부분 진피에 존재하며, MMP에 의해 기질단백질이 분해되면 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등이 발생한다. MMP는 한 번의 자외선 조사에도 그 활성이 증가되므로 피부의 노화를 촉진하는 주요 요인으로 작용한다.

MMP-1 저해능을 평가하기 위하여 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3x10⁵cell/well의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 20 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 실시예 1에 따른 캐비어 발효 오일을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 EGCG 1 μM을 사용하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 primer와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다.

Primer의 서열과 반응 조건은 표 2와 같고, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

Primer		서열	반응 조건
MMP-1	F	5'-CGAATTGCCGACAGAGATGA-3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
MMP-1	R	5'-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 UVB 조사에 의해 MMP-1 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 캐비어 발효 오일 처리군에서 그 발현량이 감소함을 확인하였다.

실험예 2: Procollagen 발현 확인

실시예 1에 따른 캐비어 발효 오일에 대한 주름 억제 효과를 확인하기 위하여 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3x10⁵cell/well의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 20 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 캐비어 발효 오일을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 EGCG 1 μM을 사용하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 procollagen 주형(primer)과 시아닌 염료인 사이버그린 (SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 type 1 procollagen(Col1A1) 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 표 3과 같고, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

Primer		서열	반응 조건
type 1 procollagen	F	5'-CTCGAGGTGGACACCACCCT-3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
type 1 procollagen	R	5'-CAGCTGGATGGCCACATCGG-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 피부 세포에 캐비어 발효 오일 처리시 type 1 procollagen(Col1A1) 생성이 증가한 것을 확인하였으며 이를 통해 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 확인하였다.

실험예 3: 보습 효과 확인

실시예 1에 따른 캐비어 발효 오일의 보습 효과를 확인하였다. HaCaT 세포에서 발생하는 히알루론산 합성 효소의 발현 정도를 히알루론산 합성효소3(Hyaluronic acid synthase3, HAS3)으로 확인하고, 세포 내 수분 채널 발현 정도를 아쿠아포린(Aquaporin3, AQP3) 유전자 발현 측정을 통해 평가하였다.

아쿠아포린(aquaporins)은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질(major intrinsic protein family)로 피부의 수분 흡수를 증가시키는 기작을 가진다. 포유동물에서는 13가지 종류가 알려져 있으며, 이들 중 아쿠아포린 3(aquaporin 3)은 피부의 각질 형성세포에서 발현하며 아쿠아포린 3을 통한 물과 글리세롤의 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부의 보습 및 탄력을 증가시킨다.

보습 효과를 확인하기 위하여 각질형성세포 HaCaT을 6 well plate에 4x10⁵cell/well의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 상기 캐비어 발효 오일을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 retinoic acid(RA) 1 μM을 사용하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국).

합성된 cDNA에 타겟 단백질인 HAS3 또는 AQP3 주형(primer)과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 HAS 유전자와 AQP3 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 표 4와 같고, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

Primer		서열	반응 조건
HAS3	F	5'-CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC-3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
HAS3	R	5'-GTTCGTGGGAGATGAAGGAA-3'
AQP3	F	5'-GTCACTCTGGGCATCCTCAT-3'
AQP3	R	5'-CTATTCCAGCACCCAAGAAGG-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 4 및 5와 같이 캐비어 발효 오일 처리 세포에서 HAS3와 AQP3 발현 증가가 촉진된 것을 확인하였고, 이를 통해 캐비어 발효 오일의 피부 보습 효과를 확인하였다.

실험예 4: 장벽 강화 효과 확인

실시예 1에 따른 캐비어 발효 오일의 장벽강화 효과를 확인하기 위해 각질형성세포에서 각질층의 결합력 및 주요 구성 성분인 Claudin1, Filaggrin의 유전자 발현 측정을 통해 평가하였다.

각질형성세포 HaCaT을 6 well plate에 4x10⁵cell/well의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 캐비어 발효 오일을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 retinoic acid 1 μM을 사용하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국).

합성된 cDNA에 타겟 단백질인 Claudin1, Filaggrin의 주형(primer)과 시아닌 염료인 사이버그린 (SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 Claudin1 유전자와 Filaggrin 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 표 5와 같고, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

Primer		서열	반응 조건
Claudin1	F	5'-GCTCTAGAATTCCGAGCGAGTCATGGCCAACGC-3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
Claudin1	R	5'-GCTCTAGAATTCTCACACGTAGTCTTTCCCGCT-3'
Filaggrin	F	5'-AGTGCACTCAGGGGGCTCACA-3'
Filaggrin	R	5'-CCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 6 및 7과 같이 캐비어 발효 오일 처리 세포에서 Claudin1, Filaggrin 발현 증가가 촉진된 것을 확인하였고, 이를 통해 캐비어 발효 오일의 피부 장벽강화 효과를 확인하였다.

실험예 5: 각질형성세포의 분화 확인

실시예 1에 따른 캐비어 발효 오일에 대한 각질형성세포의 분화 효과를 확인하였다. 각질형성세포가 분화될 때 과발현되는 Involucrin, Loricrin의 유전자 발현 측정을 통해 분화 정도를 평가하였다.

합성된 cDNA에 타겟 단백질인 Involucrin, Loricrin의 주형(primer)과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 Involucrin 유전자와 Loricrin 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 표 6과 같고, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

Primer		서열	반응 조건
Involucrin	F	5'-TGAAACAGCCAACTCCACTG -3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
Involucrin	R	5'-GGAGCTCCAACAGTTGCTCT-3'
Loricrin	F	5'-AATAGATCCCCCAGGGTACCA-3'
Loricrin	R	5'-CGGTGCCCCTGGAAAAC-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 8 및 9와 같이 캐비어 발효 오일 처리 세포에서 Involucrin, Loricrin 발현 증가가 촉진된 것을 확인하였고, 이를 통해 캐비어 발효 오일의 피부 분화 효과를 확인하였다.

실험예 6: 캐비어 발효 오일의 아미노기(amino group) 확인

실시예 1의 캐비어 발효 오일에 대하여 닌히드린 반응시험법을 이용하여, 아미노기를 가진 발효 지질 대사산물 생성여부를 확인하였다. 구체적으로 캐비어 발효 오일을 클로로포름-메탄올(2:1, v/v)으로 추출한 시료를 0.1% Nihydrin 용액(용매: 에탄올)과 반응시켰다. 혼합비율은 샘플 2: 0.1% Ninhydrin 용액 1로 혼합하였고, 반응조건은 90℃ 수조(Water Bath)에서 10분간 가온하였다. 이후 실온에서 10분간 방랭하여 분광광도계(Spectrophotometer, BioTek, USA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

	비교예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3
O.D 570nm	0.070	0.515	0.778	0.850

그 결과, 실시예 1 내지 3에서는 비교예 1 대비 닌히드린(Ninhydrin) 발색력이 높게 나타났다. 질소원인 캐비어 추출물에 의해 아미노기를 가진 지질 발효 대사산물의 생성이 향상되었고, 이는 스핑고 지질 대사 및 세라마이드 합성에 연관된 물질이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 캐비어 발효 오일을 포함하는 조성물은 피부 섬유아세포 내 MMP-1 발현을 억제하고, COL1A1 발현을 촉진하여 노화를 개선하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각질형성세포에 본 발명에 따른 조성물을 처리하여 피부 보습 인자인 Hyaluronan Synthase 3와 Aquaporin 3의 발현 증가를 통해 보습 효과가 있음을 확인하였고, Claudin과 Filaggrin의 발현 촉진을 통해 피부 장벽 개선 효과를 확인하였다. 또한, Involucrin과 Loricrin의 발현 촉진을 통해 캐비어 발효 오일의 우수한 피부 세포 분화 효과를 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 상기 기재된 특정한 실시예에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11843P

20160608

<110> United Active Inc. COSMAX, INC. ALMASCAVIAR Co., Ltd. <120> PREPARATION METHOD OF FERMENTED CAVIAR OIL USING SKIN FLORA AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THEREOF <130> DPA-1920 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 forward primer <400> 1 cgaattgccg acagagatga 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 reverse primer <400> 2 gtccctgaac agcccagtac tt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin forward primer <400> 3 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin reverse primer <400> 4 gagaccttca acaccccagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type 1 procollagen forward primer <400> 5 ctcgaggtgg acaccaccct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type 1 procollagen reverse primer <400> 6 cagctggatg gccacatcgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS3 forward primer <400> 7 cttaagggtt gcttgcttgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS3 reverse primer <400> 8 gttcgtggga gatgaaggaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 forward primer <400> 9 gtcactctgg gcatcctcat 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 reverse primer <400> 10 ctattccagc acccaagaag g 21 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin1 forward primer <400> 11 gctctagaat tccgagcgag tcatggccaa cgc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin1 reverse primer <400> 12 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin forward primer <400> 13 agtgcactca gggggctcac a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin reverse primer <400> 14 ccggcttggc cgtaatgtgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Involucrin forward primer <400> 15 tgaaacagcc aactccactg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Involucrin reverse primer <400> 16 ggagctccaa cagttgctct 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loricrin forward primer <400> 17 aatagatccc ccagggtacc a 21 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loricrin reverse primer <400> 18 cggtgcccct ggaaaac 17

Claims

피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 배양하여 종균배양물을 제조하는 종균배양 단계;
상기 종균배양물을 배양하여 전배양물을 제조하는 전배양 단계; 및
캐비어 가수분해 추출물을 포함하는 배지에 상기 전배양물을 투입하여 발효물을 제조하는 본 발효 단계를 포함하는, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계의 배지 또는 상기 전배양 단계의 배지가 카제인 가수분해물, 이스트 추출물, 글루코스, 가용성 전분, K₂HPO₄, MgSO_4,피루브산나트륨 및 카제인펩톤을 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계의 배지 또는 상기 전배양 단계의 배지가 카제인 가수분해물 0.1 내지 5 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, K₂HPO₄ 0.1 내지 5 g/L, MgSO₄ 0.1 내지 10 g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L 및 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L를 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 본 발효 단계의 배지가 글리세롤, 이스트 추출물, 카제인 펩톤, K₂HPO₄, KH₂PO₄ 및 암모늄 아세테이트를 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 본 발효 단계의 배지가 글리세롤 1 내지 100 g/L, 이스트 추출물 0.01 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 10g/L, K₂HPO₄ 0.5 내지 50 g/L, KH₂PO₄ 0.3 내지 30 g/L, 암모늄 아세테이트 0.005 내지 0.1 g/L 및 캐비어 추출물 5 내지 250 g/L를 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 본 발효 단계의 배지가 식물성 오일을 더 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 식물성 오일의 함량이 5 내지 500 g/L인 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계가 15 내지 35℃의 호기 조건에서 진탕배양하는 단계를 포함하고,
상기 전배양 단계가 상기 종균배양물 10 내지 500g/L을 투입하고, 15 내지 35℃, 5 내지 20 NL/min, 10 내지 100 rpm의 호기 조건으로 배양하는 단계를 포함하고,
상기 전배양 단계가 5% 배양액을 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 0.2 내지 0.8인 시점에 배양을 종료하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 본 발효 단계가 상기 전배양물 10 내지 500g/L을 투입하여 15 내지 35℃, 100 내지 500 NL/min, 100 내지 300 rpm의 호기 조건으로 50 내지 150시간 동안 발효하는 단계를 포함하는 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 피부 항노화, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습용 조성물인 것인, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 캐비어 발효 오일을 포함하는 화장료 조성물.