KR102400060B1 - 인간 항 il-33 중화 단일클론 항체 - Google Patents

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Abstract

IL-33에 대하여 길항제 작용을 갖는 항체, 특히 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 생식 계열 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열이며, 단리된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 또는 항체 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다. 복수의 항 IL-33 단일클론 항체에 관하여 에피토프를 동정하고 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 취득하고, 그 상보성 결정 영역에 변이를 도입함으로써, IL-33에 결합성이 높은 상보성 결정 영역을 특정했다. 특정된 상보성 결정 영역을 이용함으로써 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 생식 계열 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 취득했다.

Description

인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 {HUMAN ANTI-IL-33 NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODY}
본원 발명은 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 및 그 항체에 경합하는 항체, 및 이들 항체를 포함 사이토카인 발현 억제 및 IL-33 관련 질환의 치료, 예방 또는 완화용 약학 조성물에 관한다.
인터루킨-33 (IL-33)은 염증성 상태에서 역할을 하는 인터루킨-1 패밀리에 속하는 사이토카인이다. IL-33은 상피 세포나 혈관 내피 세포의 핵 내에서 항상 발현 하고 있으며, 감염이나 물리적·화학적 스트레스에 의한 조직 손상에 의해 세포 파괴 와 함께 방출되어 알라민(alarmin) 역할을 한다. 또한 IL-33 의 발현은 리포 다당류 등의 자극에 의해 상승되고, 분비되는 메커니즘도 있다고 생각되고 있다. 세포 밖으로 방출된 IL-33은 세포 상에 발현하는 IL-33 수용체에 결합하여 세포 내 신호를 활성화 할 수 있다. IL-33 수용체는 다양한 면역 세포나 상피 세포 등에서 발현되어, 이들 세포에 있어서 IL-33 유도성 세포 내 신호 전달이 생긴다.
IL-33은 IL-33 수용체를 발현하는 면역 체계 세포 중 Th2 세포, 비만세포, 호산구, 호염기구, NK(natural killer) T세포나 2형 선천성 림프구(group 2 innate lymphocyte)에서 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등)의 생산을 유도함으로써 알레르기 성 염증(천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 등)을 유도하는 것으로 생각되고있다(비특허문헌1：Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p1203). 또한 IL-33 수용체를 발현하는 면역 체계 세포 중 비만세포(mast cell)와 대식세포는 IL-33 자극에 의해 IL-1β, IL-6, TNF(tumor necrosis factor)-α의 생산이 유도 되고, 이것이 자가 항체 유도 관절염(류마티스 관절염의 모델)의 발병에 관여 하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌2：Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620). IL-33의 길항제가 급성 신손상에 효과적이라는 것이 시사되어 있다(비특허문헌3：Ali Akcay et al., Journal of American Society Nephrology, 2011, Vol.22, p2057). 인간에서는 IL-33의 발현 증가가 각종 염증성 질환(류마티스 관절염, 천식, 전신성 경화증, 간 섬유증, 폐 섬유증 등 의 섬유증, 건선, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 강직성 척추염 등)으로 인정 받고 있으며, IL-33이 각종 질병의 발병·유지에 관여 하고 있다고 생각되고있다(비특허문헌4：Yasushi Matsuyama et al., Journal of Rheumatology, 2010, Vol. 37, p18；비특허문헌5：David Pre´fontaine et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, Vol. 125, p752；비특허문헌6：Koichi Yanaba et al., Clinical Rheumatology, 2011, Vol. 30, p825；비특허문헌7：A. L. Rankin et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p1526；비특허문헌8：Tamar Mchedlidze et al., Immunity, 2013, Vol. 39, p357；비특허문헌9：Liang-An Hu et al., Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, Vol. 14, p2563；비특허문헌10：Luca Pastorelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p8017）.
이처럼 다양한 질환, 특히 염증성 질환에 관한 IL-33의 관여가 알려져 있기 때문에 IL-33의 작용제와 길항제의 개발이 이루어지고 있다(특허문헌 1 내지 4). 그 중에서도 그 특이성이나 작용 강도의 점에서 IL-33에 대한 항체가 주목되고 있다. 그러나 지금까지 개발되어 온 항체는 에피토프의 특정이 없는 마우스 항체(특허문헌 1) 또는 카스파제에 의한 IL-33의 절단 부위를 특정하고 활성형이 비절단 IL-33임을 특정한 것에 기초하여 이러한 절단 부위를 포함하는 영역(서열목록 서열번호 226의 잔기 155에서 잔기 198)을 에피토프로 한 항체(특허문헌2)나 시판의 염소 다클론 항체가 알려져 있다. 2014년 1월 10일에 AnaptysBio사가 자사의 홈페이지에서 독자적인 체세포 초변이 기술(SHM-XEL) 플랫폼을 이용하여 IL-33에 대한 치료 개발 후보 항체 ANB020의 제작에 성공했다고 보고했다(비특허문헌11：Hamza Suria, 'AnaptysBio announces development of novel anti-IL-33 therapeutic antibody’, [on line], 2014, [retrieved on 11 January 2014], Retrieved from Internet:<URL: http://www.anaptysbio.com/anti-IL-33/>). 또한 Murphy 등은 인간 항체의 가변 영역 유전자를 도입한 마우스인 VelocImmune 마우스를 이용하여 20 종류의 인간 항 IL-33 단일클론 항체를 취득했다(특허문헌 5). 그러나 그 항체 에피토프는 공개되지 않았고 20 종류의 인간 항 IL-33 단일클론 항체의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 2 아미노산 잔기 이상 인간 생식 계열의 아미노산 서열과 다르다. 그러므로 이들 항체를 인간에게 투여한 경우 해당 항체에 대한 면역 반응이 야기되고 인간 항 인간 면역 글로불린 항체(HAHA)의 유도에 의하여 작용 효과의 감소, 염증이나 기타 부작용을 유발한다는 문제점이 있다.
국제 공개공보 제2005/079844호 국제 공개공보 제2008/132709호 국제 공개공보 제2011/031600호 국제 공개공보 제2008/144610호 국제 공개공보 제2014/164959호
Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p120 Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620 Ali Akcay et al., Journal of American Society Nephrology, 2011, Vol.22, p2057 Yasushi Matsuyama et al., Journal of Rheumatology, 2010, Vol. 37, p18 David Pre´fontaine et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, Vol. 125, p752 Koichi Yanaba et al., Clinical Rheumatology, 2011, Vol. 30, p825 A. L. Rankin et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p1526 Tamar Mchedlidze et al., Immunity, 2013, Vol. 39, p357 Liang-An Hu et al., Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, Vol. 14, p2563 Luca Pastorelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p8017 Hamza Suria, 'AnaptysBio announces development of novel anti―IL―33 therapeutic antibody', [on line], 2014, [retrieved on 11 January 2014], Retrieved from Internet:<URL: http://www.anaptysbio.com/anti―il―33/>
최근 IL-33과 질환과의 관계가 밝혀지고 있어, IL-33의 길항제 작용을 갖는 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 요구되고 있다. 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 작용은 그 항체가 결합하는 에피토프 영역과 밀접하게 관련되어 있다. IL-33은 세포 파괴와 함께 세포 외부로 방출되기 때문에 리소좀 유래의 단백질 분해 효소 등에 의해 절단될 가능성이 높아, 이른바 성숙형 IL-33, 또한 성숙형 IL-33 에서 파생된 IL- 33의 활성을 갖는 다수의 단편이 발생할 수 있다. IL-33의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체는 단편이 상기 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프를 포함하는 경우에는 불연속적인 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체보다 상기 단편의 1개의 연속 아미노산 서열에 강하게 결합하여 상기 단편과 IL-33 수용체와의 결합을 저해하는 점에서 유리하다. 그러나 원하는 길항제 작용을 갖는 IL-33 단일클론 항체를 생성하기 위해 이러한 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프를 특정 하는 것은 여전히 어려웠다.
IL-33의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 인간 등에 투여 한 경우 항원성이 낮은 것이 바람직하다. 인간 항체이면 인간에 투여한 경우 항원성이 낮고, 또한 프레임워크 영역이 인간 생식 계열의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 그러나 인간 항체 유전자 라이브러리에 포함된 인간 항체에 SHM-XEL 플랫폼 등을 적용한 경우에는 상보성 결정 영역뿐 아니라 프레임워크 영역에도 아미노산 서열의 변이가 생겨버린다. 또한 인간 항체 유전자를 도입한 마우스를 인간 IL-33 단백질로 면역하여 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 취득 하는 경우에도 상기 IL-33 중화 단일클론 항체의 프레임워크 영역에 아미노산 서열의 변이가 생기는 것을 방지할 수 없다. 따라서 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 인간 생식 계열의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인 IL-33에 대한 단리된 인간 단일클론 항체의 취득은 여전히 어려웠다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 종래에 바람직한 에피토프라고 생각되었던 155~198 위치에 존재하는 에피토프에 강하게 결합하는 항체가 거의 길항제 작용을 갖지 않는 반면, 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 존재하는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프, 특히 111~130 위치, 131~150위치, 231~250위치, 또는 251~270위치에 존재하는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가 상기 에피토프에 결합하는 항체 길항제 작용의 관점에서 중요하다는 것을 발견하고 본 발명에 이르렀다.
또한 본 발명자들은 인간 항체 라이브러리에서 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 단리하고, 또한 그 상보성 결정 영역에만 변이를 도입함으로써 결합성이 높고, 물성이 좋은 상보성 결정 영역를 특정했다. 이에 따라 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 변이를 포함하지 않는 인간 항체이며, 인간 IL-33 에 결합하여 그 기능을 중화하는 인간 항체를 얻을 수 있었다. 따라서 본 발명은 이하의 발명에 관한다：
[1] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체.
[2] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가 서열목록의 서열번호 226의 111위치~130위치, 131위치~150위치, 231위치~250위치 또는 251위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인, 항목 1에 기재된 항체.
[3] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가 P118, I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129, N130, D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, D244, N245, H246, K266, L267, S268 및 E269으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인, 항목 1 또는 2에 기재된 항체.
[4] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가 서열목록의 서열번호 226의 111위치~130위치, 131위~150위치, 231위치~250위치 또는 251위치~270위치의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인, 항목 1~3 중 어느 하나에 기재된 항체.
[5] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가 서열목록의 서열번호 226의 138위치~147위치 또는 139위치~147위치의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인, 항목 1~4 중 어느 하나에 기재된 항체.
[6] 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 IL-33의 길항제인, 항목 1~5 중 어느 하나에 기재된 항체.
[7] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 IL-33 수용체와 IL-33과의 결합을 저해하는, 항목 1~6 중 어느 하나에 기재된 항체.
[8] 항목 1~7 중 어느 하나에 기재된 항체를 포함하는 IL-33 관련 질환의 치료, 예방 또는 완화용 약학 조성물.
[9] 항목 1~7 중 어느 하나에 기재된 항체를 포함하는 사이토카인 발현 억제제.
[10] TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현을 억제하는, 항목 9에 기재된 억제제.
[11] IFN-γ, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현을 억제하는, 항목 9 또는 10에 기재된 억제제.
[12]
1) 항목 1~5 중 어느 하나에 기재된 에피토프,
2) 상기 에피토프의 연속 아미노산으로 이루어진 서열에 대하여 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 에피토프, 및
3) 상기 에피토프의 연속 아미노산으로 이루어진 서열에 대하여 최소 90 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프
로 이루어진 군에서 선택되는 에피토프.
[13] 항목 12에 기재된 에피토프를 이용하여 생성 또는 스크리닝된 항체.
[14] 서열목록 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항목 1~7 중 어느 하나에 기재된 항체.
[15] 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 인간 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인, 항목 14에 기재된 항체.
[16] 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 401의 잔기 3에서 잔기 12이며, 또한, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 67에서 잔기 98 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 67 내지 잔기 98, 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15인, 항목 15에 기재된 항체.
[17] 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 401의 잔기 3 잔기 12이며, 또한, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 368의 잔기 67에서 잔기 98 및, 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15인, 항목 15 또는 16에 기재된 항체.
[18] 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 1의 C1 내지 C30에 표시된 조합으로부터 선택되는, 단리된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[표 1]
Figure 112016061442918-pct00001
[19] 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열의 조합은 표 1의 C1 내지 C28에 표시된 조합으로부터 선택되는, 항목 18에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[20] 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3) 각각의 아미노산 서열의 조합은 표 1의 C1, C8, C15, C17 및 C18에 표시된 조합으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항목 18 또는 19에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[21] 항체의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 생식 계열 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인, 항목 18~20 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[22] 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 401의 잔기 3 잔기 12이며, 또한, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3 의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 67에서 잔기 98 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 67에서 잔기 98, 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15인, 항목 18~21 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[23] 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1에서 V30로 표시된 조합으로부터 선택되는, 항목 18~22 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[표 2]
Figure 112016061442918-pct00002
[24] 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1에서 V28로 표시된 조합으로부터 선택되는, 항목 23에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[25] 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1, V8, V15, V17 및 V18으로 표시된 조합으로부터 선택되는, 항목 23 또는 24에 기재된 인간 항 IL- 33 중화 단일클론 항체.
[26] 경쇄가 λ 사슬인, 항목 18~25 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[27] 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 IgG인, 항목 18~26 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[28] 항원이 인간 IL-33 및 원숭이 IL-33인, 항목 18~27 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
[29] 항목 18~28 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자.
[30] 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3) 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 조합이 표 3의 CN1에서 CN30으로 표시된 조합으로부터 선택되는, 항목 29에 기재된 핵산 분자.
[표 3]
Figure 112016061442918-pct00003
[31] 항목 29 또는 30에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
[32] 항목 31에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
[33] 항목 18~28 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 제조 방법으로서, 제32항에 기재된 숙주 세포를 배양하여 제조하는 방법.
[34] 항목 18~28 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 사이토카인 발현 억제제.
[35] TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현을 억제하는, 항목 34에 기재된 억제제.
[36] IFN-γ, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현을 억제하는, 항목 34 또는 35에 기재된 억제제.
[37] 항목 18 내지 28 중 어느 하나에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 의약 조성물.
[38] IL-33 관련 질환의 예방, 치료 또는 완화용인, 항목 37에 기재된 의약 조성물.
[39] IL-33 관련 질환이 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 38에 기재된 의약 조성물.
[40] IL-33와의 결합이 항목 20 또는 25에 기재된 항체와 경합하는, 항 IL-33 중화 단일 클론 항체.
[41] IL-33 관련 질환을 앓는 환자를 치료, 예방 또는 경감하기 위한 방법이며, 항목 1~7 및 18~28 의 어느 하나에 기재된 항체를 대상에 투여 하는 것을 포함하는, 방법.
[42] IL-33 관련 질환이, 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 41에 기재된 방법.
[43] IL-33 관련 질환을 치료, 예방 또는 경감하기 위한 의약의 제조를 위한, 항목 1~7 및 18~28 중 어느 하나에 기재된 항체의 사용.
[44] IL-33 관련 질환이, 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 43에 기재된 사용.
[45] IL-33 관련 질환을 치료, 예방 또는 경감하기 위한 항목 1~7 및 18~28 중 어느 하나에 기재된 항체의 사용.
[46] IL-33 관련 질환이, 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 45에 기재된 사용.
[47] 이토카인 발현 억제를 필요로 하는 환자를 치료, 예방 또는 경감하기 위한 방법이며, 항목 1~7 및 18~28 중 어느 하나에 기재된 항체를 상기 대상에 투여 하는 것을 포함하는 방법.
[48] 상기 사이토카인이, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 또는 IL-13인 항목 47 에 기재된 방법.
[49] 사이토카인 발현을 억제제의 제조를 위한 항목 1~7 및 18~28 의 어느 하나에 기재된 항체의 사용.
[50] 상기 사이토카인이, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 또는 IL-13인 항목 49에 기재된 사용.
본 발명의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 것으로 인해, IL-33가 분해되어 단편화된 경우에도 1 개의 연속 아미노산 서열에 강하게 결합하기 때문에 중화 작용이 발휘되기 쉽다.
본 발명의 단일클론 항체는 인간에 투여한 경우에 항체의 프레임워크 영역 및/또는 상보성 결정 영역에 대한 인간 항 인간 면역 글로불린 항체(HAHA)를 유도하기 어렵다. HAHA에 의해 저해되지 않기 때문에 생체 내에서 IL-33을 중화하는 효과가 지속된다. 또한 HAHA와 결합하는 것에 기인하는 염증을 야기하지 않기 때문에 안전한 항체이다. 본 발명의 단일클론 항체는 인간 IL-33에 결합하여 그 기능을 중화시킬 수 있기 때문에 IL-33 관련 질환에 대한 새로운 진단, 예방, 치료 또는 경감약으로 이용할 수 있다.
도 1은 IL-33 단백질의 각 도메인 및 절단 부위를 설명하는 도면이다.
도 2는 인간 IL-33 단백질(잔기 112에서 잔기 270) 및 각 부분 펩티드 단편 (PEP11~26)에 대한 각 항체의 결합 활성을 나타내는 도면이다.
도 3은 성숙형 인간 IL-33(잔기 117에서 잔기 270) (도면에서는 "S117-T270"라고 기재함)와 인간 ST2(hST2)의 복합체 입체 구조를 모델링 하여 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3의 입체 구조 모델링에서 인간 IL-33의 PEP12 에피토프의 일부(서열목록 서열번호 226의 117위치~130위치) (도면에서는 "S117-N130"라고 기재하며, 이하 동일하게 기재함)와 인간 ST2 만을 표시한 도면이다.
도 5는 도 3의 입체 구조 모델링에서 인간 IL-33의 PEP14 에피토프와 인간 ST2 만을 표시한 도면이다.
도 6은 도 3의 입체 구조 모델링에서 인간 IL-33의 PEP24 에피토프와 인간 ST2 만을 표시한 도면이다.
도7은 도3의 입체 구조 모델링에서 인간 IL-33의 PEP26 에피토프와 인간 ST2 만을 표시한 도면이다.
도 8은 인간 IL-33의 복강 내 투여에 의해 유도되는 염증에 대한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 A25-3H04의 작용을 염증 관련 지표(비장 질량, 혈청 내 IL-5 농도, 혈중 호산구 수, 혈중 호염기구 수, 혈중 호중구 수, 혈청 내 IgA 농도, 혈청 내 IgE 농도)에 기초하여 나타낸 도면이다.
도 9는 인간 IL-33의 복강 내 투여에 의해 유도되는 염증에 대한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 및 A26-1F02의 작용을 염증 관련 지표(비장 질량, 혈청 내 IL-5 농도, 혈중 호산구 수, 혈중 호염기구 수, 혈중 호중구 수, 혈청 내 IgA 농도, 혈청 내 IgE 농도)에 기초하여 나타낸 도면이다.
도 10은 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체(A23-1A05, A25-3H04, A26-1F02, A10-1C04, A25-2C02)의 마우스 혈장 내 농도 추이를 표시한 도면이다.
도 11은 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체(A10-1C04, A23-1A05)의 원숭이 혈청 내 농도 추이를 표시한 도면이다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 이하에 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다.
[에피토프]
본 발명에서 에피토프는 항체가 인식하는 항원의 부분을 말한다. 본 발명에 서 에피토프는 항체의 인식에 필요한 연속 아미노산으로 이루어진 서열에 관한다.
[결합한다]
본 발명에서 단일클론 항체가 에피토프에 "결합한다"는 것은 단일클론 항체가 에피토프인 펩타이드에 연결되어 하나의 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 단일클론 항체와 에피토프의 결합은 이온 결합, 수소 결합, 소수성 결합, 반데르발스힘 등에 의하지만, 이에 한정 되지 않는다. 단일클론 항체가 에피토프에 결합하는지는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 펩타이드 어레이 스캔이나 KinExA를 이용하여 알아낼 수 있다.
[항체]
본 발명에서 “항체” 라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용하는 것으로 하며, 원하는 특이적 결합성이 나타나는 한 단일클론 항체, 다클론 항체를 포함하는 것으로 한다. 본 발명의 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫(rat) 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등 임의의 동물 유래의 항체일 수 있다.
[단일클론 항체]
발명의 항체 중 단일클론 항체는 설계상의 아미노산 서열에서 단일클론(단일 분자 종) 만으로 이루어진 항체 집단의 항체를 말한다. 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중특이적 항체 및 인공 항체 및 이들의 기능 변경 항체, 및 이들의 콘쥬게이트 항체, 및 이들의 단편을 포함하는 것으로 한다. 본 발명의 단일클론 항체는 하이브리도마 법, 파지디스플레이 법 및 유전 공학적 기법 등 임의의 공지의 방법을 이용하여 생성할 수 있다.
[키메라 항체]
키메라 항체는 경쇄, 중쇄 또는 이들 모두가 비-인간 유래의 가변 영역 및 인간 유래의 불변 영역으로 구성된 항체를 말한다.
[인간화 항체]
인간화 항체는 비-인간 유래 항체의 상보성 결정 영역과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어진 가변 영역 및 인간 항체 유래의 불변 영역으로 이루어진 항체를 말한다.
[인간 항체]
인간 항체는 경쇄, 중쇄 모두 인간 유래인 항체를 말한다. 인간 항체는 중쇄의 불변 영역의 차이에 따라, γ 사슬의 중쇄를 갖는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 를 포함), μ 사슬의 중쇄를 갖는 IgM, α 사슬의 중쇄를 갖는 IgA (IgA1, IgA2 포함), δ 사슬의 중쇄를 갖는 IgD 또는 ε 사슬의 중쇄를 갖는 IgE 를 포함한다. 또한 원칙적으로 경쇄는 κ 사슬 및 λ 사슬 중 하나 이상을 포함한다.
[다중 특이적 항체]
다중 특이적 항체(multispecific antibody)는 2 개 이상의 서로 다른 항원 특이성을 갖는 2 개 이상의 독립적인 항원 인식 부위를 갖는 비대칭 항체이며, 2 개의 항원 특이성을 갖는 이중 특이적 항체(bispecific antibody), 3 개의 항원 특이성을 갖는 삼중 특이적 항체(trispecific antibody) 등을 들 수 있다. 본 발명의 다중 특이적 항체가 인식하는 하나 이상의 항원은 IL-33 분자이다.
[인공 항체]
인공 항체는 예를 들어 단백질 스캐폴드이며, 항체의 구조를 갖지 않지만, 항체와 같은 기능을 갖는 인공 항체이다. 단백질 스캐폴드로는 인간의 세린프로테아제 억제제의 Kunitz 도메인이나 인간의 피브로넥틴(fibronectin)의 세포 외 도메인, 안키린(ankyrin), 리포칼린(lipocalin) 등이 이용되며, 스캐폴드의 표적 결합 부위의 배열을 변경하면 본 발명의 에피토프에 결합하는 단백질 스캐폴드를 생성할 수 있다(Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48).
[기능 변경 항체]
본원에서 기능 변경 항체는 주로 항체의 Fc 영역의 아미노산과 당쇄를 변경 함으로써 항체가 가진 항원 결합 기능 이외의 세포 살상 기능, 보체 활성화 기능이나 혈중 반감기 등을 조절한 항체를 말한다.
[콘쥬게이트 항체]
본원에서 콘쥬게이트 항체는 항체에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체를 말한다.
[단편]
본원에서 항체의 단편(fragment)은 항체의 일부분을 포함하는 단백질이며, 항원에 결합 할 수 있는 것을 말한다. 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 조각, Fab' 단편 또는 scFv를 들 수 있다.
또한 이러한 항체의 단편은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자 공학으로 결합하고 있어도 좋다.
[IL-33]
IL-33은 IL-1 패밀리에 속하는 사이토카인이며, 인간 IL-33은 서열목록의 서열번호 226과 같이 270 아미노산으로 이루어진다. IL-33은 N 말단 측에 크로마틴 결합 도메인을 가지며, C 말단에 12 개의 β 가닥을 가진 분자량 18kDa 의 IL-1 유사 사이토카인 도메인을 가지고 있으며, 또한 95 위치 및 109 위치에 카텝신 G 절단 부위, 99 위치에 엘라스타제 절단 부위 및 178 위치에 카스파제 절단 부위를 가지고 있다(도 1). IL-33은 세포가 괴사(necrosis)를 일으키는 과정에서 리소좀 등에서 유래하는 엘라스타제, 카텝신 G 또는 프로테나제 3 등의 효소에 의해 절단되어, 성숙형 IL-33, 예를 들어 IL-33 (잔기 95에서 잔기 270) (서열목록 서열번호 226의 N 말단으로부터 95 위치에서 270 위치의 아미노산 서열로 표시되는 IL-33을 "IL-33(잔기 95에서 잔기 270)”로 표기함. 이하 동일하게 표기함), IL-33 (잔기 99에서 270), IL-33 (잔기 109에서 잔기 270), IL-33 (잔기 112에서 잔기 270 위치) 등 다양한 단편이 되어, 사이토카인의 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 한편, 세포사(cell death)가 세포 사멸(apoptosis)인 경우 세포 사멸 과정에서 활성화되는 카스파제에 의해 IL-33은 178 위치에서 절단되어 불활성형 IL-33, 예를 들어 IL-33 (잔기 179에서 잔기 270)가 된다고 생각되고 있다.
IL-33은 사이토카인으로서 세포 밖으로 방출되면 IL-33 수용체와 결합하여 당해 IL-33 수용체를 발현하는 세포에서 세포내 신호 전달을 개시시키는 기능을 갖는다. IL-33에 의해 유도되는 신호는 비한정적으로 NF-κB 경로와 MAPKKs 경로가 있고, 최종적으로 각종 사이토카인과 케모카인, 염증 매개체(inflammatory mediator)의 생산을 야기한다. IL-33에 의해 유도되는 사이토카인의 예로는 TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등을 들 수 있고, 특히 IFN -γ, IL-5, IL-6 및 IL-13이 유도된다. IL-33에 의해 유도되는 케모카인의 예로는 CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, CCL24 등을 들 수 있다. IL-33에 의해 유도된 염증 매개체의 예로 PGD2, LTB4 등을 들 수 있다. IL-33에 의해 유도되는 사이토카인이나 케모카인, 염증 매개체는 면역계 세포의 이동(migration), 사이토카인 생산, 탈과립에 관여하여 염증을 야기한다. 본 발명에서 IL-33은 후술하는 IL-33 수용체에 결합하여 작용하는 것이라면, 전장(全長) IL-33 또는 그 활성형 단편 중 어느 것을 의미 할 수도 있고, 그 유도체 또는 돌연변이이어도 좋다. 또한 인간 IL-33이거나 다른 생물 유래의 IL-33이어도 좋다. 그 중에서도 서열목록의 서열번호 226 의 아미노산 서열로 표시되는 인간 IL-33 이 바람직하다.
IL-33이 결합하는 IL-33 수용체는 ST2 와 IL-1RAcP (IL-l receptor accessory protein)과 이종 이합체로 구성된다. IL-33 수용체에서 IL-33을 특이적으로 인식하여 결합하는 부위는 ST2 의 세포 외 도메인에 존재한다. IL-33 수용체는 다양한 면역 세포 (Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포, NKT 세포, 2형 선천성 림프구(group 2 innate lymphocyte) (innate helper cell), 뉴오사이트(nuocyte), Ih2 (innate helper type 2) 세포 등)과 상피 세포 등에서 발현하고 있지만, 이들 세포에 한정되지 않는다.
[IL-33 관련 질환]
본원에서 IL-33 관련 질환은 IL-33이 과도하게 세포 외로 방출 되기 때문에 야기되는 질환을 의미하며, IL-33 관련 질환은 IL-33 의 기능을 저해할 수 있는 약물에 의해 예방, 치료 또는 경감 할 수 있다. IL-33 관련 질환으로, 예를 들면 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암을 들 수 있다.
[프레임워크 영역]
프레임워크 영역은 면역 글로불린 분자의 가변 영역 중 상보성 결정 영역 이외의 부분을 말한다. 프레임워크 영역은 경쇄, 중쇄 각각 4 개의 프레임워크 영역 (프레임워크 영역 1, 프레임워크 영역 2, 프레임워크 영역 3 및 프레임워크 영역 4)이있다. 본원에서는 면역 글로불린 분자의 프레임워크 영역은 카밧(Kabat) 넘버링 시스템 (Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)에 따라 결정된다.
[생식 계열]
생식 계열이란 정자나 난자 등의 무리의 생식 세포를 의미하며, 특별한 언급이 없는 한 인간의 생식 계열의 것을 말한다. 항체를 생산하는 B 림프구와 달리 생식 세포의 면역 글로불린 유전자는 변이가 발생하지 않는다. 따라서 "생식 계열 프레임워크 영역의 아미노산 서열"이라고 기재한 경우에는 면역 글로불린의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 변이가 발생하지 않는 아미노산 서열을 의미하고, "생식 계열 프레임워크 영역의 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열"이라고 기재한 경우에는 4 개의 프레임워크 영역의 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 다른 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열인 것을 의미한다. 인간 면역 글로불린 경쇄 가변 영역의 유전자는 κ 사슬로 Vκ 세그먼트와 Jκ 세그먼트 및 λ 사슬로 Vλ 세그먼트와 Jλ 세그먼트로 나누어져 있으며, Vκ 세그먼트와 Vλ 세그먼트에 프레임워크 영역 1 에서 프레임 영역 3 가 Jκ 세그먼트와 Jλ 세그먼트에 프레임워크 영역 4가 존재한다. 인간 면역 글로불린 중쇄 가변 영역의 유전자는 VH 세그먼트, DH 세그먼트, JH 세그먼트로 나누어져 있으며, VH 세그먼트에 프레임워크 영역 1 에서 프레임 영역 3이, JH 세그먼트에 프레임워크 영역 4가 존재한다. 인간 면역 글로불린의 Vκ, Vλ, VH, Jκ, Jλ, JH 의 각 세그먼트의 생식 계열 아미노산 서열을 표 4에 나타낸다.
[표 4-1]
Figure 112016061442918-pct00004
[표 4-2]
Figure 112016061442918-pct00005
[표 4-3]
Figure 112016061442918-pct00006
[표 4-4]
Figure 112016061442918-pct00007
[인간 단일클론 항체]
인간 단일클론 항체는 인간 생식 계열 면역 글로불린의 서열에서 유래하는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 단일클론 항체를 말한다. 본원에서 인간 단일클론 항체의 가변 영역은 별도의 사람 단일클론 항체의 가변 영역의 일부 또는 전부의 재조합체이어도 좋고 재조합체에서는 항체의 결합에 영향을 주지 않는 관점에서 프레임워크 영역과 상보성 결정 영역과의 경계에서 재조합이 생겨도 좋고, 면역원성을 증가시키지 않는 관점에서 프레임워크 영역 1에서 프레임워크 영역 4 의 프레임워크 영역의 각 영역이, 별도의 인간 단일클론 항체 프레임워크 영역 1 에서 프레임워크 영역 4 의 프레임워크 영역의 각 영역과 재조합이 발생하고 있어도 좋다. 또한, 본 발명에서 인간 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체의 돌연변이어도 좋고, 항원에 대한 결합성을 유지 또는 개선하면서 면역원성을 감소시키기 위해 인간 단일클론 항체의 상보성 결정 영역에 변이가 있는 상보성 결정 영역의 아미노산 서열과 프레임워크 영역에 변이가 없는 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론 항체가 바람직하다.
[단리된]
단리된 항체의 “단리된”이란, 동정되고, 또한 분리된 및/또는 자연 상태의 성분으로부터 회수되었다 의미이다. 자연 상태에서의 불순물은 그 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해 할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함한다. 일반적으로 항체를 단리하려면 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제하면 좋고, 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제된 항체를 “단리된 항체" 라고 할 수 있다.
[중화]
본원에서 “중화”란 목적하는 표적에 결합하고 또한 그 표적 중 하나 이상의 기능을 저해 할 수 있는 작용을 말한다. 즉 "항 IL-33 중화 단일클론 항체"는 그 IL-33에 대한 결합이 IL-33 폴리펩티드에 의해 유도된 생물 활성의 저해를 가져오는 단일클론 항체를 의미한다. IL-33의 생물학적 활성의 저해는 IL-6 등의 IL-33 유도성 사이토카인의 생산 저해를 포함하나 이에 한정되지 않는다. IL-33의 생물학적 활성의 지표는 당해 분야에 공지된 일부 in vitro 또는 in vivo 분석 중 하나 이상에 의해 평가할 수 있다. 덧붙여 "인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체”라고 기재 한 경우에는 IL-33에 결합하여 IL-33 중 하나 이상의 기능을 저해하는 인간 단일클론 항체를 의미한다.
[길항제]
본원에서 "길항제" 는 목적하는 표적에 대해 중화 작용을 갖는 물질의 총칭을 의미한다. 즉 "IL-33 의 길항제" 는 IL-33 에 결합하여 IL-33 중 하나 이상의 기능을 저해할 수 있는 물질이며, 예를 들면 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 포함된다.
[상보성 결정 영역]
상보성 결정 영역은 면역 글로불린 분자의 가변 영역 중 항원 결합 부위를 형성하는 영역을 말하며, 초가변 영역이라고도 하며, 면역 글로불린 분자별로 특히 아미노산 서열의 변화가 큰 부분을 말한다. 상보성 결정 영역은 경쇄, 중쇄에 각각 3 개의 상보성 결정 영역(상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2 및 상보성 결정 영역 3)이 있다. 본원에서는 면역 글로불린 분자의 상보성 결정 영역은 카밧토 (Kabat) 넘버링 시스템 (Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)에 따라 결정된다.
[경합하는]
본 발명에서 단일클론 항체 와 "경합하는"이란, 본 명세서에 기재된 표면 플라스몬 공명(SPR)법에 의해 측정한 경우에, 상기 단일클론 항체의 존재에 의해 상당한 차이로 IL-33과의 결합이 저하되는 것을 말한다.
본 발명에서 "경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체"란 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 다중 특이적 항체 및 인공 항체, 및 이들의 기능 변경 항체, 및 이들의 콘쥬게이트 항체, 및 이들의 단편을 포함 한다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 설명 한다. 또한, 이하의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명은 실시예에만 한정 되지 않는다.
본 발명은 IL-33의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 이 에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 인간 IL-33의 활성을 중화할 수 있는 것으로, 상기 에피토프는 서열목록의 서열번호 226로 표시되는 인간 IL-33 의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 아미노산 서열인 것이 바람직하고, 서열목록의 서열번호 226의 111위치~130위치(PEP12), 131위치~150위치(PEP14), 231위치~250위치(PEP24) 또는 251위치~270위치(PEP26)에 포함되는 아미노산 서열인 것이 보다 바람직하다. IL-33은 세포 밖으로 방출될 때 절단되는 경우가 많다. IL-33의 1차서열 상에서 떨어져 있는 아미노산 잔기가 단백질의 폴딩(folding) 등에 기초하여 에피토프를 형성하는 경우, IL-33의 절단에 의해 폴딩이 붕괴되거나, 상기 에피토프를 구성하는 떨어져 있는 아미노산 잔기가 단편에서 결실되는 것에 의하여 상기 단편과의 친화성이 현저하게 감소할 수 있다. 따라서, 항 IL-33 단일클론 항체의 결합 에피토프는 연속 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 중화 작용을 발휘하기 위해서는, 예를 들어 IL-33의 IL-33 수용체에 대한 결합을 방해하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명에서 바람직한 에피토프는 단순히 IL-33 단백질의 표면에 위치하는 것 뿐만 아니라 IL-33 수용체에 근접하여 존재하는 것이 바람직하다. 이에 본 발명자들은 아래의 실시예에 기재하는 것과 같이 비특허 문헌 11 에 표시된 결정 구조 해석 데이터에 기초하여 입체 구조 모델링을 하고, 가장 근접한 IL-33 수용체를 구성하는 원자와 사이의 원자 간 거리가 5ÅA 이내인 IL-33 원자(계면 원자)를 포함하는 아미노산을 특정했다. 계면 원자를 포함하는 아미노산으로는 PEP12 의 P118 (서열목록의 서열번호 226의 118 위치의 프롤린 잔기를 "P118"로 표기함. 이후 동일하게 표기함), I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129, N130, PEP14의 D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, PEP24의 D244, N245, H246, PEP26의 K266, L267, S268, E269 들 수 있다. IL-33을 중화할 수 있는 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 기능적인 에피토프로는 계면 원자를 포함하는 아미노산을 갖는 에피토프가 바람직하다. 기능적인 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 중화 작용은 기능적인 에피토프에 존재하는 계면 원자의 수나 계면 원자의 입체 구조에서의 위치 등에 의존한다고 생각할 수 있지만, 이러한 이론에 구속되는 것을 의도하지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프가, 서열목록의 서열번호 226의 111위치~130위치(PEP12), 131위치~150위치(PEP14), 231위치~250위치(PEP24) 또는 251위치~270위치(PEP26)의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인 단일클론 항체를 들 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예로서, 상기 에피토프가 서열목록의 서열번호 226의 138위치~147위치 또는 139위치~147 위치의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프인 단일클론 항체를 들 수 있다.
본 발명자들은 PEP14와 결합하는 2 종류의 단일클론 항체를 이용하여 에피토프를 구성하는 최소한의 아미노산 서열을 조사하여, IL-33 의 에피토프로 서열목록의 서열번호 226의 138~147위치 및 139~147위치의 연속 아미노산 서열을 특정하였다. 따라서, 본 발명은 서열목록의 서열번호 226의 138~147위치 및 139~147위치의 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 관한다.
단일클론 항체가 본 발명의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체인지는 ELISA 법, 면역침강법, 표면 플라스몬 공명(SPR)법, KinExA법 등 당해 기술 분야에서 일반적으로 실시되는 방법에 의하여 조사할 수 있다. 예를 들어, SPR법을 이용한 본원 실시예에 기재된 펩타이드 어레이 스캔법에서는 본 발명의 에피토프 펩타이드를 이용하여 시험한 경우 단일클론 항체의 에피토프에 결합 RU 값의 유의적인 증가로서 측정 할 수 있다. 또한 KinExA 법을 이용한 본원 실시예에 기재된 방법으로는 해리 상수 (Kd)을 측정 할 수 있으나, 에피토프 펩타이드에 대한 해리 상수는 낮은 것이 바람직하며, 예를 들어 10μM 이하, 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하 100pM 이하 10pM 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 의약 조성물에 존재한다. 또한, 본 발명 의 단일클론 항체를 투여하는 것을 포함하는 IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감 방법과, IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감용 의약의 제조를 위한 본 발명의 단일클론 항체의 사용에 관한 것이다.
IL-33 관련 질환의 예로는 비제한적으로, 천식, 아토피성 피부염, 두드러기, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산 부비강염 포함), 알레르기성 뇌 척수염, 과호산구 증후군(hypereosinophilic syndrome), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatic), 류마티스 심장질환, 다발성 경화증, 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염, 연소성 관절염, 건선성 관절염, 변형관절증(arthrosis deformans), 라이터 증후군 등), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus)(원판성 루푸스를 포함함), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 건선, 강직성 척추염, 간염(예를 들어, 자가면역성 간염, 만성 활동성 간염 등), 염증성 장 질환(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병, 글루텐 민감성 장질환 등), 쇼그렌 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 염증성 안질환, 자가면역성 신생아 혈소판 감소증, 자가면역성 호중구 감소, 면역성 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판 감소증, 자가면역성 갑상선염, 다발성 근염, 피부근염, 중증 근무력증, 아드레날린 작용제 내성(adrenergic agonist resistance), 원형 탈모증(alopecia greata), 항 인지질 증후군, 부신 자가면역 질환(예를 들어, 자가면역 애디슨병 등), 실리악스프루-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역 기능 장애 증후군(CFIDS), 한랭 응집소병, 원발성 혼합 한랭 글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통-섬유근염, 사구체 신염(예를 들어, IgA 신증(nephrophathy) 등), 그레이브스 병, 갑상선 기능 항진증(즉, 하시모토 갑상선염), 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP), 혼합 결합 조직증, 1 형 또는 면역 개입 당뇨병, 악성 빈혈, 다발성 연골 피부염(polychrondritis), 다선성증후군(polyglandular syndrome), 스티프맨 증후군, 백반증, 유육종증, 다발성 내분비증후군(polyendocrinopathy), 기타 내분비 부전, 동맥 경화증, 간 섬유증(예를 들어, 원발성 담즙성 간경변 등), 폐섬유증(예를 들어, 돌발성 폐섬유증 등), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 피부 경화증 (CREST 증후군, 레이노 증후군 등 포함), 세뇨관 간질성 신염, 조밀침착병(dense deposit disease), 급성 신손상(acute kidney injury), 심근염, 심근증, 신경염 (예를 들어, 길랭바레 증후군 등), 결절성 다발동맥염, 심장 절개 증후군(cardiotomy syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), IgA 신경 장애, 편평 태선, 메니에르병, 심근 경색후(post-MI) 증후군, 포도막염, 포도막염안염(Uveitis Opthalmia), 혈관염, 원발성 무감마글로불린혈증, 암(예를 들어, 뇌종양, 후두암, 구순 및 구강암, 하인두암, 갑상선암, 식도암, 유방암, 폐암, 위암, 부신피질암, 담관암, 담낭암, 간암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 고환암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 유윙종양, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종 등), 면역 체계에 의한 배제에 저항을 나타내는 감염(예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)), 강독성 인플루엔자 감염에 따른 치명적인 사이토카인 폭풍, 및 패혈증을 들 수 있으며, 바람직하게는 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 사이토카인, 케모카인 또는 염증 매개체의 발현 억제제도 존재한다.
본 발명의 사이토카인, 케모카인 또는 염증 매개체 발현 억제제에 의해 억제되는 사이토카인은 IL-33에 의해 유도된 사이토카인이며, 예를 들면, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-13 등을 들 수 있다. 또한 상기 억제제에 의해 억제되는 케모카인은 IL-33에 의해 유도된 케모카인이며, 예를 들어, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, CCL24 등을 들 수 있다. 상기 억제제에 의해 억제되는 염증 매개체는 IL-33에 의해 유도되는 염증 매개체이며, 예를 들어, PGD2, LTB4 등을 들 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 형태는 항 IL-33 단일클론 항체를 포함 IFN-γ, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현 억제제이며, 보다 바람직하게는 IL-6의 생산 억제제이다.
본 발명의 또 다른 형태에서, 항 IL-33 단일클론 항체가 결합하는 에피토프에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 에피토프는 항체의 인식에 필요한 6~20의 아미노산으로 이루어진 서열에 관한다. 다른 측면에서는 특정된 서열 주위의 아미노산 또는 입체 구조 근방의 아미노산을 포함하여, 추가적인 에피토프를 구성하고 있어도 좋지만, 불연속적인 아미노산 서열을 포함하지 않는 연속 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 에피토프를 구성하는 연속 아미노산 서열의 아미노산 잔기 수는 적어도 5, 바람직하게는 6, 보다 바람직하게는 적어도 7, 더욱 바람직하게는 적어도 8, 더욱 더 바람직하게는 9 이다. 또한, 보다 충분한 항원성을 발휘하는 관점에서 적어도 10, 보다 바람직하게는 15, 더욱 바람직하게는 적어도 20 이다. 한편, 에피토프에 포함된 서열이 길어지면 항체에 의해 인식되는 부분이 복수 포함될 가능성이 생기며, 이러한 경우 소망하는 중화 작용을 갖는 항체의 생성 또는 스크리닝을 할 수 없게될 가능성이 생긴다. 따라서, 본 발명의 에피토프에 결합하는 항체가 소망하는 중화 작용을 발휘하는 것을 담보하는 관점에서 에피토프 서열의 길이는 30 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20 이하, 더욱 더 바람직하게는 15 이하인 것이 바람직하다. 에피토프에 포함된 연속 아미노산 서열의 잔기 수로서는, 예를 들어 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 및 20 개 중 하나에서 선택 되는 잔기 수이다.
에피토프는 항원성을 변화시키지 않는 범위 내에서 1 또는 복수 개의 아미노산 변이, 즉 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 도입되어 있어도 좋다. 도입되는 변이의 수는 바람직하게는 5 이하, 보다 바람직하게는 3 이하, 가장 바람직하게는 1이다. 또한 에피토프는 수식(modification), 예를 들어 원래의 단백질을 가지고 당쇄 등의 수식이나 말단 수식 등이 추가되어도 좋다. 또 다른 측면에서는 그 항원성을 변화시키지 않는 범위 내에서 본 발명에서 특정된 에피토프의 연속 아미노산의 배열에 대해 최소 90 %,보다 바람직하게는 적어도 95 %, 더욱 바람직하게는 적어도 97 % 더욱 바람직하게는 98 %, 가장 바람직하게는 99 %의 배열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프이어도 좋다. 에피토프 펩티드는 예를 들면 미끼(bait)로 사용하는 경우 히스티딘과 비오틴 등의 태그가 추가 되어도 좋고, 백신으로 사용되는 경우는 KLH 등의 운반 단백질(carrier protein)과 결합해도 좋다.
여기에서 동정한 참조 폴리펩티드 배열에 관한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위해 필요하다면 간극을 도입하고, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 생각하지 않기로 한 후의 특정 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하는 목적을 위한 정렬은 당업자의 기량의 범위에 있는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용할 수 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용함으로써 달성 가능하다. 당업자라면 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 모든 알고리즘을 포함한 배열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나 여기서의 목적을 위해서는 %아미노산 서열 동일성은 짝정렬에 있어서, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용함으로써 얻을 수 있다.
아미노산 서열 비교 BLAST가 사용되는 상황에서는 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B와의 % 아미노산 서열 동일성은 다음과 같이 계산된다 :
분율 X/Y의 100 배
여기서 X는 서열 정렬 프로그램 BLAST의 A와 B의 프로그램 정렬에 의해 동일하다고 일치하는 점수의 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 다른 경우, A의 B에 대한 % 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 % 아미노산 서열 동일성과 다르다는 것은 이해될 것이다. 특별히 배제하지 않는 한, 여기에서 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 바로 위 문단에 나타낸 바와 같이 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명에 의해 발견된 에피토프는 IL-33 의 중화 항체가 특이적으로 결합하는 기능적인 에피토프이다. 따라서, 본 발명의 기능적인 에피토프를 이용하는 것으로서, 예를 들어 새로운 IL-33의 길항제 작용을 갖는 항체를 효율적으로 얻을 수 있다. 즉 전장 IL-33 또는 성숙형 IL-33 에 대한 단일클론 항체군에 대하여, 본 발명의 기능적인 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하여 길항제 작용을 갖는 단일클론 항체를 얻을 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 다른 형태에서, 본 발명은 IL-33 의 기능적인 에피토프를 이용한 길항제 작용을 갖는 항체 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 파지 디스플레이 기술 등으로 나이브 항체 라이브러리(naive antibody library)에서 IL-33 길항제 작용을 갖는 항체 클론을 농축하는 경우 먼저 전장 또는 성숙형 IL-33 단백질을 미끼(bait)로 하여 라이브러리 선택을 수행하고, IL- 33 표면 상의 다양한 에피토프에 결합하는 항체 클론을 농축하고, 다음에 본 발명에서 발견한 기능적인 에피토프 펩티드를 미끼로 하여 라이브러리 선택을 함으로써 기능적인 에피토프에 특이적으로 결합하는 IL- 33 길항제 작용을 갖는 항체를 효율적으로 스크리닝할 수 있게 된다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 20잔기 길이의 에피토프에 대한 결합성이 확인된 단일클론 항체군에 대한 항체 농도를 바꾸어 사용하여 IL-33 길항제 활성을 조사하였다. 이에 의하여 길항제 작용을 갖는 항체를 생성하거나 스크리닝하는데에 적합한 에피토프를 결정했다. 이 결과에 따르면, 서열목록의 서열번호 226의 111~130위치(PEP12), 131~150위치(PEP14), 231~250위치(PEP24) 및 251~271위치(PEP26)로 이루어진 군에서 선택되는 에피토프에 결합하는 항체가 항체 농도에 따른 길항제 작용의 증가가 명확하게 인정된 것으로부터, 길항제 작용을 갖는 항체를 생성 또는 스크리닝에 적합한 기능적인 에피토프인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서는 서열목록 서열번호 226의 111위치~130위치, 131위치~150위치, 231위치~250위치 및 251~271위치로 이루어진 군에서 선택되는 영역 중 적어도 6, 바람직하게는 적어도 10, 보다 바람직하게는 적어도 15개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 에피토프에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열목록의 서열번호 226의 111위치~130위치, 131위치~150위치, 231위치~250위치 및 251위치~270위치로 이루어진 군에서 선택되는 에피토프에 관한 것이다.
에피토프는 일반적으로 행해지는 펩타이드 합성 기술을 이용하여 제조 가능하다. 제조된 정제된 에피토프는 동물의 면역이나, 상기 에피토프에 대한 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한 다른 방법으로는 정제된 에피토프를 파지디스플레이 법에 이용함으로써 상기 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 생성하거나 스크리닝 할 수 있다. 또한 에피토프를 보조제와 함께 백신으로 사용할 수도 있다.
본 발명은 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중특이적 항체 및 인공 항체, 및 이들의 기능 변경 항체, 및 이들의 콘쥬게이트 항체, 및 이들의 단편을 포함하는 것으로 한다. 본 발명의 단일클론 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫(rat) 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등 임의의 동물 유래의 항체이어도 좋다. 본 발명의 단일클론 항체는 하이브리도마법 파지디스플레이법 및 유전자 공학적 방법 등 모든 공지의 방법을 이용하여 생성할 수 있다.
하이브리도마법에서는 면역원성을 이용하여 면역한 동물, 특히 랫 또는 마우스의 비장 또는 림프절에서 채취한 B 세포와 불멸화 세포, 예를 들어 골수종(myeloma) 세포를 융합시켜 하이브리도마를 만들고, 원하는 결합성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하고 스크리닝된 하이브리도마를 이용하여 생성 할 수 있다. 또한 인간 항체 유전자를 도입한 마우스를 사용하여 인간 항체를 얻을 수 있다. 하이브리도마에서 단일클론 항체를 얻기 위해서는, 상기 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하여 그 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유 동물에 투여하여 증식시키고, 그 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량 생산에 적합하다. 단일클론 항체를 제조하는 기술은 공지의 기술을 이용하면 좋고, 예를 들면 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. 의 Chapter 2 의 기재에 따라 생성할 수 있다.
파지 디스플레이 방법에서는 임의의 파지 항체 라이브러리에서 선별한 파지를 목적하는 면역원성을 이용하여 스크리닝을 실시하여 면역원성에 대한 소망의 결합성을 갖는 파지를 선택한다. 그런 다음, 파지에 포함되는 항체 대응 서열을 분리 또는 서열 결정하고 고립된 서열 또는 결정된 서열 정보를 바탕으로 단일클론 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 구축한다. 그리고 이러한 발현 벡터를 트랜스펙션된 세포주를 배양하여 단일클론 항체를 생산시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리로 인간 항체 라이브러리를 사용하여 원하는 결합성을 갖는 인간 항체를 생성할 수 있다.
유전자 공학적 방법으로는 항체를 코딩하는 유전자 서열에 있어서, 상보성 결정 영역(CDR)에 대응하는 서열 또는 그 이외의 서열에 변이를 도입하고, 이러한 서열을 발현 벡터에 통합시키고, 이를 숙주 세포에 형질 전환하여 재조합 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990참조）.
본 발명은 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키거나 다른 기능을 추가하는 것 등을 목적으로 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 다중특이적 항체, 인공 항체 도 사용할 수 있으며, 이 항체는 알려진 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체는 비인간 항체 가변 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 통합시켜 통합 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻어질 수 있다(EP 125023, WO 92/19759 참조). 이 알려진 방법을 이용하여 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.
인간화 항체는 비인간 유래 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 그 외의 부분의 인간 항체 영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, 이를 발현 벡터에 넣어 통합 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻을 있다.
다중특이적 항체는 2 개 이상의 서로 다른 항원 특이성을 갖는 2 개 이상의 독립적인 항원 인식 부위를 가진 비대칭 항체이다. 이중특이적 항체 등 의 다중특이적 항체는 2 개 이상의 단일클론 항체의 항원 결합 영역을 이용하여 유전자 공학적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 유전자 공학적인 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다. 예를 들어, 2 종류의 단일클론 항체의 항원 결합 영역을 직렬로 연결한 DVD-Ig (Wu 등, Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007))의 기술과 항체의 Fc 영역을 변경함으로써 다른 항원에 결합하는 2 종류의 항체의 중쇄가 결합되는 ART-Ig 기술(Kitazawa 등, Nature Medicine 18 (10), 1570(2012))을 이용하면 원하는 이중특이적 항체를 얻을 수 있다.
인공 항체는 예를 들어 단백질 스캐폴드이며, 항체의 구조를 가지고 있지 않지만, 항체와 같은 기능을 갖는 인공 항체이다. 단백질 스캐폴드로는 인간의 세린 프로테아제 억제제의 Kunitz 도메인과 인간 피브로넥틴(fibronectin)의 세포 외 도메인, 안키린, 리포칼린 등이 이용되며, 스캐폴드의 표적 결합 부위의 서열을 변경하면 본 발명의 에피토프에 결합하는 단백질 스캐폴드를생성 할 수 있다 (특허 문헌 4, Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48).
본 발명의 단일클론 항체의 Fc 영역 등의 아미노산 서열과 당쇄를 변경함으로써 항체가 가진 항원 결합 기능 이외의 세포 살상 기능, 보체 활성화 기능과 혈중 반감기 등을 조절할 수 있다(Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685). 이러한 기능 변경 항체는 예를 들어 다음과 같은 방법으로 준비된다. 단일클론 항체를 숙주 세포로 α1,6-푸코실트랜스페라제(FUT8) 유전자를 파괴한 CHO 세포를 이용하여 제조하면 당쇄의 푸코스(fucose) 함량이 저하되어 세포 살상 기능이 높아진 항체를 얻을 수 있고, FUT8 유전자를 도입한 CHO 세포를 숙주 세포로 제조하면 세포 살상 기능이 낮은 항체를 얻을 수 있다(국제공개공보 제2005/035586호, 국제공개공보 제2002/31140호, 국제공개공보 제00/61739호). 또한 Fc 영역의 아미노산 잔기를 변경하여 보체 활성화 기능을 조절할 수 있다(미국특허 제6737056호, 미국특허 제7297775호, 미국특허 제7317091호). 또한 Fc 수용체의 하나인 FcRn에 대한 결합을 높인 Fc 영역의 돌연변이를 사용하여 혈중 반감기의 연장을 도모 할 수 있다(하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol .82 (8), p710). 이러한 기능 변경 항체는 유전자 공학적으로 제조할 수 있다.
본 발명에 사용하는 단일클론 항체는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머, 방사성 물질, 톡신(toxin) 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체 일 수 있다. 이러한 콘쥬게이트 항체는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 또한 화학적 수식 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 이러한 콘쥬게이트 항체도 포함된다(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681, ).
본 발명은 상기와 같은 전체 항체와는 별도로 에피토프 결합성이 있고 길항제 활성을 발휘하는 한, 단일클론 항체의 단편이나 그 수식물이 될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편으로는 Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편 또는 H 사슬 및 L 사슬 Fv를 적절한 링커로 연결시킨 단일 체인 Fv(scFv)를 들 수 있다.
또한 이러한 항체 단편은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자 공학으로 결합하고 있어도 좋다.
단일클론 항체 생산을 위한 생산 시스템은 in vitro 또는 in vivo의 생산 시스템 중 하나를 사용할 수 있다. in vitro의 생산 시스템으로는 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포, 식물 세포, 또는 진균 세포를 사용하는 생산계나 원핵 세포, 예를 들면 대장균, 고초균 등의 세균 세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다. 사용되는 동물 세포로는 포유 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS, 골수종(myeloma), BHK, HeLa, Vero 등 일반적으로 사용되는 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 이용하여도 좋다. in vivo의 생산 시스템으로서는, 동물을 사용하는 생산 시스템이나 식물을 사용하는 생산 시스템을 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 예를 들어 포유류 동물, 곤충을 이용하는 생산 시스템 등이 있다. 포유류 동물로서는, 예를 들어 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한 곤충으로는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들어 담배를 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이 in vitro 또는 in vivo 의 생산 시스템에서 단일클론 항체를 생산하는 경우, 단일클론 항체 중쇄(H 사슬) 또는 경쇄(L 사슬)을 코딩하는 DNA를 별도로 발현 벡터에 통합시켜 숙주를 동시 형질 전환 시켜도 좋고, 또는 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 DNA를 단일 발현 벡터에 통합하여 숙주를 형질 전환시켜도 좋다(국제공개공보 제WO94/11523호 참조).
얻어진 단일클론 항체는 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 단일클론 항체의 분리 정제는 보통 단백질에서 사용되고있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택 조합하면, 단일클론 항체를 분리 정제할 수 있으나(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1988), 이에 한정되는 것은 아니다. 친화 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼을 들 수 있다. 예를 들어 단백질 A 컬럼을 사용한 컬럼으로 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다.
본 발명의 서열목록의 서열번호 226의 101위치~154위치 또는 199위치~270위치에 포함되는 연속 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 단일클론 항체는 인간에 투여한 경우의 항원성이 낮은 점에서 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체가 바람직하고, 인간 항체가 가장 바람직하다. 또한 인간 항체 중에서도 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 인간 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열 인 것이 바람직하다. 따라서 본 발명은 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로서, 상기 항체의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인 인간 항 IL -33 중화 단일클론 항체 에 관한 것이다.
이 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 가변 영역의 프레임워크 영역이 인간 생식 계열 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열을 포함하는 점에서 이 영역에 기인하는 면역원성이 전혀 없거나 현저하게 적다는 특징을 갖는 반면, IL-33에 결합하여 그 기능을 방해 할 수 있다. 따라서 상기 항체는 의약으로 사용되는 경우에 인간 항 사람 면역 글로불린 항체 (HAHA)를 유도 하기 어렵고, 그로 인하여 생체 내에서 제거 되지 않고 그 결과 IL-33을 중화 하는 효과가 길고, 또한 HAHA와 결합하는 것에 기인하는 염증을 야기하지 않기 때문에 안전한 항체이다.
인간의 생식 계열의 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간의 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, NCBI 등의 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi)에 등록되어 있는 인간 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 DNA 배열에 코딩되는 아미노산 서열과 표 4에 기재된 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 사용된다. 경쇄 가변 영역은 λ 사슬 가변 영역이어도 좋고, κ 사슬 가변 영역이어도 좋다. 인간 생식 계열의 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역으로는 생체 내에서의 출현 빈도가 높고, 많이 사용되는 프레임워크 영역이 바람직하고, 이러한 인간 중쇄 프레임워크 영역으로 VH3-23, VH3 -30 VH4-39, VH4-34 등의 프레임워크 영역 1, 프레임워크 영역 2 및 프레임워크 영역 3을 들 수 있고, JH4 등의 프레임워크 영역 4를 들 수 있다. 또한 생체 내에서의 출현 빈도가 높은 인간 경쇄 프레임워크 영역으로 Vλ1-47, Vλ2-14, Vκ3-20, Vκ1-39 등의 프레임워크 영역 1, 프레임워크 영역 2 및 프레임워크 영역 3을 들 수 있고, Jλ2 등의 프레임워크 영역 4가를 들 수 있다. 중쇄 프레임워크 영역은 인간 중쇄 프레임워크 영역이라면 조합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 VH3-23 프레임워크 영역 1 및 프레임워크 영역 2와 VH3-30 프레임워크 영역 3 를 선택하고 중쇄 프레임워크 영역으로 사용할 수 있다. 또한 경쇄 프레임워크 영역뿐만 아니라 인간 경쇄 프레임워크 영역이라면 어떤 조합으로도 사용할 수 있다.
본원에서 바람직한 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 VH3-23, VH3-30, JH4, Vλ1-47, Jλ2 프레임워크 영역의 아미노산 서열이다. 구체적으로는 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 401의 잔기 3에서 잔기 12이며, 또한 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30 또는 서열목록의 서열번호 368의 잔기 1 에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49 또는 서열목록의 서열번호 368의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임 작업 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 67에서 잔기 98 또는 서열목록의 서열번호 368의 잔기 67에서 잔기 98 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15 인 프레임워크 영역이 바람직하고, 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 401의 잔기 3에서 잔기 12이며, 또한 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 368 잔기 67에서 잔기 98 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15 인 프레임워크 영역이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면으로는 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열은 표 1에 나타난 상보성 결정 영역의 조합 아미노산 서열이며, 단리된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 관한 것이다.
더 바람직한 구체예에서는 표 1에 나타내는 C1에서 C30의 상보성 결정 영역의 조합을 갖는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 중에서도 특히 IL-33 수용체에 결합하여 활성을 발휘하는 성숙형 IL-33, 예를 들어 IL-33 (잔기 95에서 잔기 270), IL-33 (잔기 99에서 잔기 270), IL-33 (잔기 109에서 잔기 270), IL- 33 (잔기 112에서 잔기 270) 등에 대해 결합성 및 중화 활성을 가진다. 보다 바람직하게는 표 1에 나타나는 C1에서 C30의 상보성 결정 영역의 조합을 갖는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 (잔기 131에서 잔기 150)에 결합성을 갖는다.
본 발명은 결합성 및/또는 물성면에서 향상된 상보성 결정 영역의 조합인 것이 바람직한 형태이다. 특히 바람직하게는 인간 IL-33에 대한 해리 속도 상수(koff)의 상한값가 약 3.5 × 10-5/sec 이하이며, 더 바람직하게는 약 2.0 × 10-5/sec 이하, 보다 바람직하게는 약 1.5 × 10-5/sec 이하, 보다 더 바람직하게는 약 1.0 × 10-5/sec 이하이며, 하한값은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10-7/sec 이상, 더 바람직하게는 10-6/sec 이상, 보다 바람직하게는 약 5 × 10-6/sec 이상인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 들 수 있다.
인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 중에서도 인간 IL-33에 대한 해리 상수 (Kd)가 낮은 것이 보다 바람직하고, 상한값으로서 예를 들어 10-9M 이하, 더 바람직하게는 10-10M 이하, 보다 바람직하게는 10-12M 이하이며, 하한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10-14M 이상, 보다 바람직하게는 10-13 이상인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 자극 시 HUVEC에서의 IL-6의 생산을 저해하고 특히 그 저해 효과가 강한 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 형태로서, 후술하는 실시예 10에 기재하는 바와 같이, 1μg/mL의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 첨가에 의해, 100ng/mL의 IL-33로 자극했을 때의 HUVEC에서 IL-6의 생산이 저해되는 비율(저해율)이 약 50 % 이상, 보다 바람직하게는 약 70 % 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90 % 이상인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 자극시 KU-812 세포에서의 IL-5, IL-6 및/또는 IL-13의 생산을 저해한다. 특히 그 저해 효과가 강한 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 형태로서, 후술하는 실시예 11에 기재하는 바와 같이, 3μg/mL의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 첨가에 의해, 100ng/mL의 IL-33로 자극했을 때의 KU-812 세포에서 IL-5, IL-6 및/또는 IL-13의 생산이 저해되는 비율(저해율)이 약 30 % 이상, 보다 바람직하게는 약 50 % 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 70 % 이상인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체이다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 자극시의 인간 말초 혈액 단핵구에서의 IFN-γ의 생산을 저해한다. 특히 그 저해 효과가 강한 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 형태로서, 후술하는 실시예 12에 기재하는 바와 같이 10μg/mL의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 첨가에 의해, 10ng/mL의 IL-33로 자극했을 때 인간 말초 혈액 단핵구에서의 IFN-γ의 생산이 저해되는 비율(저해율)이 약 80 % 이상, 보다 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 95 % 이상인 인간 항 IL- 33 중화 단일클론 항체이다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 마우스에 인간 IL-33을 투여했을 때의 염증을 억제한다. 특히, 항염증 효과가 강한 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 형태로서, 후술하는 실시예 13에 기재하는 바와 같이, 10mg/kg 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 7 일간 연속 복강 투여하는 것에 의해, 0.4μg/개체의 인간 IL-33의 7 일간 연속 투여에 의한 비장 무게, 혈청 IgA 농도, IgE 농도, 호중구 수, 호염기구 수, 호산구 수 및/또는 혈청 IL-5 농도의 증가가 억제되는 비율이 약 30 % 이상, 보다 바람직하게는 약 50 % 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 80 % 이상인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 항체의 물성이 뛰어난 것이 바람직하다. 특히 동적 광산란에 의한 평가에서 입자 크기 분포의 형상이 바이모달(bimodal)을 나타내지 않고, 응집성이 현저히 낮은 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 바람직하고, 콜로이드 안정성 지표인 상호 작용 매개 변수(kD)가 높은 것이 바람직하며, 예를 들어 -12.4mL/g 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 -10mL/g 이상이며, 보다 바람직하게는 -8.5mL/g 이상이다.
　본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 열역학적 안정성이 뛰어난 항체인 것이 바람직하며, 예를 들면 면역 글로불린 도메인의 폴딩이 붕괴하는 온도 (Tm)가 65 ℃ 이상, 바람직하게는 68 ℃ 이상 더욱 바람직하게는 70 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 73 ℃ 이상인 열역학적 안정성을 나타내는 항체가 바람직하다.
또한, 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 항체의 안정성이 뛰어난 것이 바람직하다. 항체의 안정성은 보존 안정성 시험이나 강제 산화 시험 등의 일반적인 방법에 의해 측정 할 수 있다. 보존 안정성 시험으로, 예를 들어 본 발명의 바람직한 형태로서, 후술하는 실시예 21에 기재하는 바와 같이, 40 ℃에서 4 주간 보존 한 경우에 항체 분자 단량체의 비율이 90 % 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 % 이상이며, 또한 인간 IL-33 단백질에 대한 결합 활성이 95 % 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 99 % 이상이다.
또한 본원 실시예 22에서 기재하는 바와 같이 1 %의 과산화수소 37 ℃, 24 시간의 조건에서 강제 산화한 경우에 인간 IL-33 단백질에 결합 활성이 80 % 이상, 보다 바람직하게는 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상 유지하는 것이 바람직하다.
상기를 감안하면, 본 발명에 있어서는, 표 1의 C1에서 C28의 상보성 결정 영역의 조합에서 선택되는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 보다 바람직한 항체이다. 또한, 본 발명의 보다 바람직한 구체예로는 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 조합(표 1의 C1, C8, C15, C17 또는 C18)을 갖는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 들 수 있다.
상기의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합에 의해 특정되는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항원 결합성이 담보되는 범위 내에서 임의의 프레임워크 영역이라도 좋다. 인체에 대한 면역원성을 저하시키는 관점에서는 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 생식 계열 프레임워크 영역의 각 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열 인 것이 바람직하지만, 보다 바람직하게는 인간 생체에서 많이 이용되는 생식 계열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이다.
본 발명에서 바람직한 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4 의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 401의 잔기 3에서 잔기 12이며, 또한, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49 또는 서열목록의 서열번호 368의 잔기 36 에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 67에서 잔기 98 또는 서열목록의 서열번호 368의 잔기 67 에서 잔기 98 및, 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15이다. 본 발명에서 보다 바람직한 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열은이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 그리고 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 401의 잔기 3에서 잔기 12이며, 한편, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 368의 잔기 67에서 잔기 98 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15이다.
따라서, 본 발명에서 바람직한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 조합은 예를 들어 표 2에 나타낸다.
본 발명의 바람직한 양태는 표 2의 V1에서 28의 가변 영역의 조합을 갖는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체이다.
본 발명의 더 바람직한 양태는 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 조합(표 2의 V1, V8, V15, V17 또는 V18)을 갖는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체이다.
인간 면역 글로불린 분자는 중쇄의 불변 영역의 차이에 따라 γ 사슬, μ 사슬, α 사슬, δ 사슬, 또는 ε 사슬의 중쇄를 가지는, 각각 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함), IgM, IgA (IgA1, IgA2 포함), IgD 또는 IgE가 존재하지만, 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 불변 영역으로서는 그 모두를 포함한다. 또한 경쇄는 그 염색체상의 위치에 따라 κ 사슬, λ 사슬이 존재하지만, 그 모두를 포함하는 것으로 한다. 항체 의약을 제조하는 경우, 응집성의 관점에서 κ 사슬이 바람직하지만, λ 사슬은 κ 사슬과 다른 아미노산 서열을 가지며, 게다가 κ 사슬처럼 다양하다는 점에서 λ 사슬 경쇄를 갖는 항체도 유용하다. 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 혈중 안정성의 관점에서, 경쇄가 λ 체인이며, 중쇄가 γ 사슬인 IgG 인 것이 바람직하고, 경쇄가 λ 체인이고 중쇄가 γ1 사슬인 IgG1 인 것이 보다 바람직하다.
IL-33의 아미노산 서열은 동물 종에 따라 다르므로 서열목록의 서열번호 226로 나타나는 인간 IL-33과 서열목록의 서열번호 227로 나타나는 원숭이 IL-33에서도 아미노산 서열에 차이가 있다. 일반적으로 항체 의약의 약리 시험 및 안전성 시험에서는 원숭이가 실험 재료로 사용되기 때문에, 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 원숭이 IL-33에 결합하는 것이 바람직하고, 인간 IL -33와 같은 정도의 친화성으로 원숭이 IL-33에 결합하는 것이보다 바람직하다. 특히 바람직하게는, 원숭이 IL-33에 대한 koff의 인간 IL-33에 대한 koff의 비율이 약 20 배 이내이며, 더욱 바람직하게는 약 10 배 이내, 더욱 바람직하게는 약 5 배 이내인 인간 항 IL-33의 중화 단일클론 항체이다.
본 발명의 항체 단편으로는 예시적으로 Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, Fab'단편 및 scFv을 들 수 있고, 또한 이러한 항체 단편은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 결합하고 있어도 좋다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 그 자체에 IL-33 이외의 다른 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 결합함으로써 이중특이적 항체 등의 다중특이적 항체를 제조할 수 있다. IL-33 이외의 다른 항원으로는 비 제한적으로 TNF-α, IL-6 수용체, CD3, CD20, α4 인테그린, BLys, Thymic Stromal Lymphopoietin, IgE, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, IL-23, IL-25 등을 들 수 있다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 및 그 항체의 단편에 있어서는 그 Fc 영역 등을 변경함으로써 세포 살상 기능이나 보체 활성화 기능, 혈중 반감기 등의 기능을 조절한 기능 변경 항체를 얻을 수 있다(시타라시 켄야, 약학 잡지, 2009, Vol.129(1), p3; 이시이 아키코 등, 일본 약리학 잡지, 2010, Vol.136(5), p280; 하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol.82(8), p710 Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685）.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 및 그 항체 단편은 다른 기능 분자를 결합하여 콘쥬게이트 항체로 할 수 있고, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 비펩타이드성 폴리머 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 알부민, 사이토카인, 효소 등의 기능 분자를 결합하여 새로운 기능을 추가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프레임워크 영역이 생식 계열의 아미노산 서열인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자, 해상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함 숙주 세포, 그리고 그 숙주 세포를 배양하는 것에 의한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 제조 방법을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 조성물에 관한다. IL-33은 염증 등을 야기하기 때문에 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감의 용도가 기대된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감용 약학 조성물에 존재한다. 또 다른 양태에서는 IL-33이 사이토카인, 케모카인, 염증 매개체 등을 유도하기 때문에 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 사이토카인, 케모카인 또는 염증 매개체 발현 억제제에 관한다.
본 발명의 사이토카인, 케모카인 또는 염증 매개체 발현 억제제에 의해 억제되는 사이토카인은 IL-33에 의해 유도된 사이토카인이며, 예를 들면, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-13 등을 들 수 있다. 또한 상기억제제에 의해 억제되는 케모카인은 IL-33에 의해 유도된 케모카인이며, 예를 들어, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, CCL24 등을 들 수 있다. 상기 억제제에 의해 억제되는 염증 매개체는 IL-33에 의해 유도된 염증 매개체이며, 예를 들어, PGD2, LTB4 등을 들 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 형태는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하는 IFN-γ, IL-5, IL-6 또는 IL-13의 발현 억제제이며, 보다 바람직하게는 IL-6의 생산 억제제이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 단일클론 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체를 투여하는 것을 포함하는 IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감시키는 방법과, IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감용 의약의 제조를 위한 본 발명의 단일클론 항체의 사용에 관한 것이다.
IL-33 관련 질환의 예로는 비제한적으로, 천식, 아토피성 피부염, 두드러기, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산 부비강염 포함), 알레르기성 뇌 척수염, 과호산구 증후군(hypereosinophilic syndrome), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatic), 류마티스 심장질환, 다발성 경화증, 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염, 연소성 관절염, 건선성 관절염, 변형관절증(arthrosis deformans), 라이터 증후군 등), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus)(원판성 루푸스를 포함함), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 건선, 강직성 척추염, 간염(예를 들어, 자가면역성 간염, 만성 활동성 간염 등), 염증성 장 질환(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병, 글루텐 민감성 장질환 등), 쇼그렌 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 염증성 안질환, 자가면역성 신생아 혈소판 감소증, 자가면역성 호중구 감소, 면역성 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판 감소증, 자가면역성 갑상선염, 다발성 근염, 피부근염, 중증 근무력증, 아드레날린 작용제 내성(adrenergic agonist resistance), 원형 탈모증(alopecia greata), 항 인지질 증후군, 부신 자가면역 질환(예를 들어, 자가면역 애디슨병 등), 실리악스프루-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역 기능 장애 증후군(CFIDS), 한랭 응집소병, 원발성 혼합 한랭 글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통-섬유근염, 사구체 신염(예를 들어, IgA 신증(nephrophathy) 등), 그레이브스 병, 갑상선 기능 항진증(즉, 하시모토 갑상선염), 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP), 혼합 결합 조직증, 1 형 또는 면역 개입 당뇨병, 악성 빈혈, 다발성 연골 피부염(polychrondritis), 다선성증후군(polyglandular syndrome), 스티프맨 증후군, 백반증, 유육종증, 다발성 내분비증후군(polyendocrinopathy), 기타 내분비 부전, 동맥 경화증, 간 섬유증(예를 들어, 원발성 담즙성 간경변 등), 폐섬유증(예를 들어, 돌발성 폐섬유증 등), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 피부 경화증 (CREST 증후군, 레이노 증후군 등 포함), 세뇨관 간질성 신염, 조밀침착병(dense deposit disease), 급성 신손상(acute kidney injury), 심근염, 심근증, 신경염 (예를 들어, 길랭바레 증후군 등), 결절성 다발동맥염, 심장 절개 증후군(cardiotomy syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), IgA 신경 장애, 편평 태선, 메니에르병, 심근 경색후(post-MI) 증후군, 포도막염, 포도막염안염(Uveitis Opthalmia), 혈관염, 원발성 무감마글로불린혈증, 암(예를 들어, 뇌종양, 후두암, 구순 및 구강암, 하인두암, 갑상선암, 식도암, 유방암, 폐암, 위암, 부신피질암, 담관암, 담낭암, 간암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 고환암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 유윙종양, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종 등), 면역 체계에 의한 배제에 저항을 나타내는 감염(예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)), 강독성 인플루엔자 감염에 따른 치명적인 사이토카인 폭풍, 및 패혈증을 들 수 있으며, 바람직하게는 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염(호산구성 부비강염을 포함함), 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증(원발성담즙성간경변을 포함함), 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염 및 암 등을 들 수 있다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함한 의약 조성물은 활성 성분인 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 및 그 염 외에 약리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함 할 수도 있다. 또한 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체 이외의 다른 활성 성분, 예를 들면 항염증성 약물이나 면역 억제제 등을 포함 할 수 있다. 이러한 조성물은 비경구 투여 또는 경구에 적합한 제형으로 제공되나, 항체 의약으로 사용되는 관점에서 비경구 투여가 바람직하다. 비경구 투여로는, 예를 들어 정맥 내, 동맥 내, 피하, 국소, 복강 내, 근육 내, 비강, 점안, 경피, 경점막, 수막 내, 직장 내, 근육 내, 뇌내 투여 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
의약 조성물은 그 투여 경로에 따라 적절히 제형화 할 수 있으며, 예를 들어 주사제, 분말제, 수액제재, 과립제, 정제, 좌제 등 어떠한 것이라도 좋지만, 비경구 투여하는 관점에서는 주사제, 수액 제재, 사용시 용해성인 분말제 등이 바람직하다. 또한 이러한 제제는 의약용으로 사용되는 각종 보조제, 즉 담체 및 기타 보조제, 예를 들면, 안정제, 방부제, 진통제, 유화제 등의 첨가제를 함유하고 있어도 좋다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 예를 들어, 1 일, 1 주, 1 개월에 1 회 혹은 1 년에 1 내지 7 회 간격으로 지속 주입에 의하거나 또는 투약에 의해 제공될 수 있다. 투약은 정맥 내, 피하, 국소, 경구, 경비, 경직장, 근육 내, 뇌실 내 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 투여 프로토콜은 중대한 원하지 않는 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투약 빈도를 포함하는 것이다. 전체 주(週) 복용량은 일반적으로 적어도 약 0.05μg/kg보다 일반적으로 적어도 약 0.2μg/kg, 가장 일반적으로 적어도 약 0.5μg/kg, 대표적으로는 적어도 약 1μg/kg, 대표적으로는 적어도 약 10μg/kg, 가장 대표적으로는 적어도 약 100μg/kg, 바람직하게는 약 0.2mg/kg, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1.0mg/kg, 가장 바람직하게는 적어도 약 2.0mg/kg, 최적으로는 적어도 약 10mg/kg, 보다 최적으로는 적어도 약 25mg/kg, 그리고 가장 최적으로는 적어도 약 50mg/kg이다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 예를 들어, IL-33 관련 질환 환자의 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 IL-33의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에 유용하다. 진단 용도로는 일반적으로 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 검출 가능한 부분으로 표지된 콘쥬게이트 항체인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태로는 특정의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 조합 (표 1의 C1, C8, C15, C17 또는 C18) 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열의 조합 (표 2의 V1, V8, V15, V17 또는 V18)의 아미노산 서열을 포함하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 대하여, IL-33와의 결합이 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 관한 것이다.
상기와 같은 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열의 조합 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 대하여, IL-33와의 결합이 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 파지 디스플레이 등의 유전자 공학적인 방법과 하이브리도마법 등에 의해 취득한 항 IL-33 항체, 예를 들면 이하의 표면 플라스몬 공명(SPR)법에 의해 스크리닝함으로써 취득 할 수 있다.
아비딘이 고정된 센서 칩에 비오틴화 된 인간 IL-33 단백질(4μg/mL)을 리간드로서 로드하여 1300에서 1600RU 상당의 인간 IL-33 단백질을 고정한다. 다음 임의의 항 IL-33 항체(15μg/mL)을 분석물(analyte)로서 로드하고, 센서 칩에 고정된 인간 IL-33 단백질에 결합시킨다. 이것을 여러 번 반복하여 센서 칩의 인간 IL-33 단백질의 모든 분자에 임의의 항 IL-33 항체가 결합되어있는 상태(포화 상태)을 만들고 포화 상태에서의 결합량(포화결합량 1)을 구한다.
동일한 실험을 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로도 실시하고 포화 상태에서의 결합량(포화결합량 2)을 구한다.
이어, 센서 칩의 인간 IL-33 단백질을 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로 포화시킨 후 임의의 항 IL-33 항체 (15μg/mL)을 분석물(analyte)로서 로드하고 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열의 조합 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로 포화된 인간 IL-33 단백질에 추가되는 형태로 결합 여부를 조사한다.
임의의 항 IL-33 항체가 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로 포화된 인간 IL-33 단백질에 추가되는 형태로 위에서 산출한 임의의 항 IL-33 항체의 포화결합량 1을 보이면서 결합할 경우, 그 항체는 "경합하지 않는다"고 판단된다. 한편, 임의의 항 IL-33 항체가 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로 포화된 인간 IL-33 단백질에 추가되는 형태로 결합 할 수 없는 경우에는 그 항체는 "경합한다"고 판단된다. 또한 임의의 항 IL-33 항체가 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체로 포화 된 인간 IL-33 단백질에 추가되는 형태로 결합할 경우 추가되는 결합량이 상당한 차이를 가지고 포화결합량 1에 미달하는 경우에는 그 항체는 "경합한다"고 판단된다. 유의차는 일반적인 검정 방법(예를 들어, student의 t 검정)에서 확인할 수 있는 유의 수준은 5 % 또는 1 % 이하로한다.
상기의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 대해 IL-33와의 결합이 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등 임의의 동물 유래의 항체이어도 좋고, 이들의 항체의 조합인 키메라 항체 또는 인간화 항체이어도 좋다.
상기의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 대해 IL-33와의 결합이 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것이 바람직하고, 인간 항체가 가장 바람직하다.
상기의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열 조합의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 대해 IL-33와의 결합이 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체로는 항체의 단편이 있다. 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편 또는 scFV를 들 수 있지만, PEG 등이 결합된 항체의 단편이 바람직하다.
이하에 본 발명의 항 IL-33 중화 단일클론 항체 등의 제조 방법을 설명한다. 유전자 공학적 기술을 이용하면 원하는 상보성 결정 영역의 조합 및 프레임워크 영역의 조합을 포함하고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 발현 벡터에 통합하고, 이를 숙주 세포에 형질 전환하여 해당 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 제조 할 수 있다(예를 들어, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990참조). 또한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 각각 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 배열에 연결하여 중쇄의 전장 및 경쇄의 전장을 코딩하는 DNA 서열을 제작할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 중쇄 전장 및 경쇄 전장을 코딩하는 DNA 서열은 예를 들어 경쇄로 λ 사슬을 갖는 IgG1이며 이하의 표 5에 나타낸다. 단, 유전자 공학적 기법에 의해 동물 세포를 이용하여 그 항체를 제조하는 경우 중쇄의 C 말단의 리신 잔기가 제거 될 수 있으며 표 5에 나타난 중쇄 핵산 서열 (서열목록의 서열번호 254~277)의 3 '말단을 구성하는 3 뉴클레오티드 "aag"는 각 중쇄 핵산 서열에서 제외되어도 좋다.
[표 5]
Figure 112016061442918-pct00008
항체 생산을 위한 생산 시스템은 in vitro의 생산 시스템을 이용할 수 있다. in vitro의 생산 시스템으로는 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포, 식물 세포 또는 진균 세포를 사용하는 생산 시스템이나 원핵 세포, 예를 들면 대장균, 고초균 등의 세균 세포를 사용하는 생산 시스템 등을 들 수 있다. 사용되는 동물 세포로는 포유 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS, 흑색종(myeloma), BHK, HeLa, Vero, 293 NS0, Namalwa, YB2/0 등 일반적으로 사용되는 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등이 이용될 수 있으나, 293 세포 및 CHO 세포가 바람직하다.
상술 한 바와 같이 in vitro의 생산 시스템에서 항체를 생산하는 경우, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 발현 벡터에 통합하여 숙주를 동시 형질 전환 시켜도 좋고, 또는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA를 단일 발현 벡터에 통합하여 숙주를 형질 전환시킬 수 있다(국제공개 94/11523호 참조). 동물 세포에서 사용될 수 있는 벡터로는, 예를 들어 pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA3.1, pREP4 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
얻어진 항체는 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리 정제는 보통 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면된다. 예를 들어 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 결합하여 항체를 분리 정제 할 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 이에 한정되는 것은 아니다. 친화 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼 등을 들 수 있다. 예를 들어 단백질 A 컬럼으로, Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(Amersham Biosciences)등을 들 수 있다.
본원에 따른 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체에 IL-33 이외의 별도의 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 결합함으로써 이중특이적 항체 등의 다중특이적 항체를 제조할 수 있다. 이중특히적 항체의 제조 방법은 이미 공지되어 있는 화학적 방법(Nisonoff,A. et al., Archives of biochemistry and biophysics., 1961, Vol.90, p.460-462, Brennan, M.et al., Science, 1985, Vol. 299, p.81-83)이 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 먼저 2 종류의 항체를 효소에 의해 각각 가수분해한 후 항체의 중쇄의 이황화 결합을 환원제로 절단 한 다음 이종 항체를 혼합하여 재산화하여 이가 반응성(bivalent) 항체를 얻는 것이다. 최근에는 글루타르알데히드나 카르보디이미드 등의 가교제를 이용한 제조 방법도 개시되어있다(특개평2-1556호 공보). 유전자 공학적으로 이중특이적 항체 등의 다중특이적 항체를 제작하는 방법도 이 분야에서 이미 확립된 방법이다. 예를 들어, 2 종류의 단일클론 항체의 항원 결합 영역을 직렬로 연결한 DVD-Ig(Wu등, Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007))의 기술과 항체의 Fc 영역을 변경함으로써 다른 항원에 결합하는 2 종류의 항체의 중쇄가 결합되는 ART-Ig기술 (Kitazawa등, Nature Medicine 18(10), 1570(2012))을 이용하면 원하는 이중특이적 항체를 얻을 수 있다.
인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 기능 변경 항체와 콘쥬게이트 항체는 다음과 같은 방법으로 제조된다. 예를 들어, 본원 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 숙주 세포로 α1,6-푸코실트랜스페라제(FUT8) 유전자를 파괴한 CHO 세포를 이용하여 제조하면 당쇄의 푸코스(fucose) 함량이 저하되어 세포 살상 기능이 높아진 항체를 얻을 수 있고, FUT8 유전자를 도입한 CHO 세포를 숙주 세포로 제조하면 세포 살상 기능이 낮은 항체를 얻을 수 있다(국제공개공보 제2005/035586호, 국제공개공보 제2002/31140호, 국제공개공보 제00/61739호). 또한 Fc 영역의 아미노산 잔기를 변경하여 보체 활성화 기능을 조절할 수 있다(미국특허 제6737056호, 미국특허 제7297775호, 미국특허 제7317091호). 또한 Fc 수용체의 하나인 FcRn에 대한 결합을 높인 Fc 영역의 돌연변이를 사용하여 혈중 반감기의 연장을 도모 할 수 있다(하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol .82 (8), p710). 이러한 기능 변경 항체는 유전자 공학적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 다른 기능 분자를 결합하여 콘쥬게이트 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 기능 분자로서 PEG를 결합하는 경우 PEG는 비 제한적인 분자량 2000에서 100000Da, 더욱 바람직하게는 10000에서 50000Da인 것을 사용할 수 있으며, 직쇄형이어도 좋고, 분지형의 것이어도 좋다. PEG는 예를 들어, NHS 활성기를 이용하여 항체의 아미노산의 N 말단 아미노기 등에 결합 될 수 있다. 기능 분자로서 방사성 물질을 사용하는 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등이 이용된다. 방사성 물질은 클로라민 T 법(chloramines T method) 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 기능 분자로서 독소를 사용하는 경우, 세균 독소(예를 들어, 디프테리아 독소), 식물 독소(예를 들면, 리신), 저분자 독소(예를 들어, 겔다나마이신), 메이탄시노이드 및 칼리키아마이신 등이 사용된다. 기능 분자로서 저분자 화합물을 사용하는 경우, 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 네오카르지노스타틴, 빈데신, 및 FITC 등의 형광 색소 등을 들 수 있다. 기능 분자로 효소를 이용하는 경우 루시페라아제(예를 들어, 반딧불 루시페라아제 및 세균 루시페라아제; 미국 특허 제4737456호), 말산탈수소효소, 우레아제, 과산화효소(예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소 (HRPO)), 알칼리성 인산 가수 분해 효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다아제(예를 들어, 글루코스옥시다아제, 갈락토스옥시다아제, 및 글루코스-6-포스페이트디히드로게나아제), 헤테로사이클릭옥시다아제(예를 들어, 유리카아제 및 크산틴옥시다아제 등), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제 등이 사용된다. 독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로는 두 라디칼 (예를 들면, 알킬, 아릴, 헤테로아릴렌), -(CR2)nO(CR2)n- (R은 임의의 치환기)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들어, 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM) 및 이산에스테르 및 아미드(석시네이트, 석신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프라미드 등을 들 수 있음)을 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 이 분야에서 이미 확립 되어 있다(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).
본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 조합(표 1의 C1, C8, C15, C17 또는 C18) 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열의 조합(표 2의 V1, V8, V15, V17 또는 V18)의 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체와 IL-33과의의 결합에 경합하는 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫 항체, 토끼 항체 염소 항체, 낙타 항체 등, 임의의 동물 유래의 항체이어도 좋고, 이러한 항체가 결합 된 키메라 항체 또는 인간화 항체 이어도 좋다. 이러한 항 IL-33 중화 단일클론 항체는 하이브리도마법, 파지 디스플레이법 등의 유전자 공학적 기법 등 모든 공지의 방법을 이용하여 얻을 수 있지만, 특히 바람직하게는 유전자 공학적인 방법에 의해 취득할 수 있다.
키메라 항체는 비인간 유래 항체 가변 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고 이것을 발현 벡터에 통합하여 숙주 세포에 형질 전환하여 생산함으로써 얻어질 수 있다(유럽 공개 제125023호, 국제공개 92/19759호 참조).
인간화 항체는 비인간 유래 항체의 상보성 결정 영역과 그 외의 부분의 인간 항체 영역을 코딩하는 DNA를 연결하고 이를 발현 벡터에 통합하여 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻을 수 있다.
인간 항체는 예를 들어, 다음에 제공되는 실시예에 기재된 절차를 사용하여 제조된다. 또한 인간 항체는 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor들은 1983 Immunol Today 4 : p72) 및 인간 단일클론 항체를 생성하는 EBV 하이브리도마 기술(Cole 등, 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., p. 77) 등을 사용하여 제조할 수도 있다. 또한 인간 항체 유전자를 도입한 형질 전환 마우스에 항원 단백질을 면역하여 하이브리도마를 제작하여 인간 항체를 생성할 수도 있다. 형질 전환 마우스로는 HuMab(등록 상표) 마우스(Medarex), KMTM 마우스(Kirin Pharma), KM FCγRIIb-KO) 마우스, VelocImmune 마우스(Regeneron) 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 형태로서, 본 발명의 특정 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 조합(표 1의 C1, C8, C15, C17 또는 C18) 또는 특정 가변 영역 아미노산 서열의 조합(표 2의 V1, V8, V15, V17 또는 V18)의 아미노산 서열을 포함한 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체와 IL-33와의 결합이 경합하는 인공 항체를 들 수 있다. 인공 항체로는, 예를 들어 인간 피브로넥틴(fibronectin) 타입 III 도메인의 10 번째 유닛 (FNfn10)을 사용 할 수 있고, 상기 단위 BC, DE 및/또는 FG 루프에 변이를 넣음으로써 원하는 표적에 결합하는 인공 항체를 얻을 수 있다. 인공 항체로는 피브로넥틴(fibronectin)의 세포 외 도메인 외에 세린 프로테아제 억제제의 Kunitz 도메인과 안키린, 리포칼린 등의 펩티드가 유효하다. 이러한 인공 항체는 상기 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 대장균이나 효모 또는 동물 세포 등에 도입하고 상기 숙주 세포를 배양한 배양상청으로부터 정제하여 유전자 공학적으로 제조할 수 있다.
인공 항체로는 상기와 같은 특정 단백질 또는 그 일부의 아미노산 서열을 이용하는 것이 아니라, 아미노산을 무작위로 조합한 랜덤 서열 라이브러리에서 항체와 같이 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 저분자 펩티드 분자로서 탐색 할 수도 있다(예를 들어, Hipolito et al., Current Opinion in Chemical Biology 2012 Vol 16 : 196 Yamagishi et al., Chemistry & Biology 2011 Vol 18 : 1562). 이러한 펩티드는 유전자 공학적인 방법 이외에 플루오레닐메틸옥시카르보닐 법, t-부틸옥시카르보닐 법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
[항체 서열 조합]
본원에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합인 표 1의 C1에서 C30, 가변 영역의 아미노산 서열의 조합인 표 2의 V1에서 V30, 상보성 결정 영역의 핵산 서열의 조합인 표 5의 CN1에서 CN30 및 항체의 핵산 서열의 조합인 표 5의 IGN1에서 IGN30은 각각 동일한 클론의 서열에 해당하며, 대응 관계를 하기 표 6에 나타낸다. 예를 들어, 클론 A10-1C04의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 C1의 6 개의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합이며, 이 상보성 결정 영역의 아미노산 서열의 조합은 CN1의 6 개의 핵산 서열 따라 코딩 될 수 있다. 또한, 상기 클론의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 V1의 2 개의 아미노산 서열이며, V1의 가변 영역을 포함하는 λ 체인의 경쇄 및 γ 사슬의 중쇄의 아미노산 서열은 IGN1의 2 개의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
[표 6]
Figure 112016061442918-pct00009
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 특별히 언급하지 않는 한, 본 발명은 이하에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 항 IL-33 항체의 취득 및 에피토프 펩티드의 동정
[항체의 취득]
인간 IL-33 단백질을 동물에 면역하고, 면역 동물의 비장 세포로부터 하이브리도마를 제작하여 단일클론 항체를 취득했다. 또한 면역 동물의 비장 세포에서 회수한 RNA를 이용하여 제작한 동물의 항체 라이브러리와 인간 나이브 항체 라이브러리에서 인간 IL-33 단백질에 결합하는 항체를 파지 디스플레이 기술에 의해 클로닝했다. 이렇게 8 종류(항체 A~H)의 항 IL-33 단일클론 항체를 취득했다.
[펩티드 어레이 스캔]
취득한 IL-33 항체의 에피토프를 식별하기 위해 인간 IL-33의 부분 펩티드 (20 잔기 길이)와 각 항체와의 결합성을 조사하는 펩타이드 어레이 스캔을 실시했다. 주요한 성숙형 인간 IL-33 분자를 커버하도록 N 말단부터 101위치의 발린(V101)에서 270위치 트레오닌(T270) 까지의 범위에서 10 아미노산마다 시작 위치를 이동하면서 총 16 종류의 20 아미노산 길이 펩타이드(PEP11에서 PEP26)를 합성 하였다. 이들 펩티드의 서열과 위치 관계를 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure 112016061442918-pct00010
N 말단을 비오틴화한 각 펩티드를 Surface Plasmon Resonance(SPR) 장치(Bio-Rad, ProteOn XPR36)의 뉴트로 아비딘 센서 칩에 리간드로 고정했다. 또한 양성 대조군으로 성숙형 인간 IL-33(잔기 112에서 잔기 270)의 N 말단에 아비태그(Avitag) 서열을 부가, 비오틴 리가아제 반응에 의해 아비태그 서열 특이적으로 비오틴화 된 단백질(hIL-33)을 SPR 센서 칩에 리간드로 고정했다. 리간드를 고정화한 센서 칩에 분석물(analyte)로, 피험 항체, 인간 IL-33 수용체 백질(재조합 인간 ST2 Fc 키메라)(Enzo Life Science, ALX-201-367-C050) 또는 버퍼(0.05 % Tween20/PBS)만을 흘려(항체 농도: 10μg/ml; 유속: 100μμl/min) 결합시키고, 세척 후 센서 칩에 리간드에 결합하고 있는 분석물량(항체량)를 RU 값으로 표시 했다. 결과를 도 2에 나타내었다.
인간 IL-33 단백질의 N 말단 측에 에피토프를 갖는 항체부터 항체 A와 항체 B가 PEP12에 결합했다. 항체 C와 항체 D가 PEP14에 결합했다. 항체 E가 PEP16과 PEP17 모두에 결합했다. 항체 F는 PEP24에 결합했다. 항체 G와 항체 H는 PEP26에 결합했다. 시판의 항 인간 IL-33 다클론 항체 (R & D Systems, AF3625)는 검토에 사용된 16 종류의 인간 IL-33 펩타이드의 대부분에 결합했다. 한편, 인간 IL-33 수용체 (ST2)는 인간 IL-33 단백질에 결합했지만, 인간 IL-33 펩타이드(PEP11~PEP26)에 거의 결합하지 않았고, IL-33의 어떤 부분이 ST2와의 결합에 중요한 것지는 본 시험에서 알 수 없었다. 또한 버퍼만이나 마우스 IgG (R & D Systems, MAB002)로는 리간드에 대한 결합은 인정되지 않았다. hIL-33(잔기 112에서 잔기 270)에 대한 결합성을, 사용한 항체간에 비교한 결과, hIL-33(잔기 112에서 잔기 270)에 대한 결합이 강한 것으로부터, 항체 G, 항체 H, 항체 D, 항체 E, 항체 B, 항체 A, 항체 C, 항체 F의 순이었다.
실시예 2: 항 IL-33 단일클론 항체의 IL-33 중화 활성의 평가-1
고체화 인간 ST2와 인간 IL-33의 결합에 대한 저해 작용을 지표로서 항체 A 항체, B 항체, E 항체 F의 IL-33 중화 활성의 측정을 실시했다. 96 웰 마이크로 플레이트(NuncTM, #442404)에 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 희석한 재조합 인간 ST2 Fc 키메라(Enzo Life Science, ALX-201-367-C050) (1μg/mL, 50μL/웰)를 분주하여 4 ℃에서 하룻밤 방치했다. 다음날 상기 플레이트를 1 % BSA 함유 PBS (PBS-B)로 1 회 세척 후, 이 용액(250μL/웰)을 첨가하여 실온에서 2 시간 블로킹했다. 그 후, PBS-B로 희석 한 피험 항체(최종 농도 10μg/mL) 및 재조합 인간 IL-33 단백질(ATGen, ILC0701)(최종 농도 1μg/mL)의 혼합 용액 (50μL/웰)을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 배양 하였다. 마이크로플레이트를 0.1 % Tween 20 함유 PBS(PBS-T)로 5 회 세척한 후 PBS-B로 희석한 염소 항 인간 IL-33 항체(R&D Systems : AF3625, 최종 농도 1μg/mL, 50μL/웰)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 5 회 세척 후 PBS-B에서 2000 배 희석한 HRP 표지 토끼 항 염소 IgG 항체(Invitrogen : 61-1620,50μL/웰)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 5 회 세척 후 SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL : 52-00-01,50μL/웰)을 첨가하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. TMB Stop Solution(KPL : 50-85-05,50μL/웰)로 반응을 정지시키고 플레이트 리더(SPECTRA MAX 190, Molecular Devices)를 이용하여 파장 450nm 및 620nm의 흡광도의 차이를 측정했다. ST2와 IL-33의 결합에 대한 항체에 의한 저해 작용(IL-33/ST2 결합계 경합 저해율)는 인간 IL-33 대신에 인간 IL-1β(PeproTech, 200-01B)(최종 농도 1μg/mL)를 첨가한 샘플을 배경으로 인간 IL-33(최종 농도 1μg/mL)을 단독으로 첨가한 샘플에 대한 저해율(%)을 구했다. 그 결과, 항체 A(에피토프는 PEP12)이 66 % 억제 항체 B(에피토프는 PEP12)이 55 % 억제 항체 E(에피토프는 PEP16-17)이 0 % 억제 항체 F(에피토프는 PEP24)가 39 % 억제되고, 검토한 4 종류의 항체 중 항체 E를 제외한 모든 항체(항체 A, 항체 B, 항체 F)가 최종 농도 10μg/mL에서 30 % 이상의 저해율을 보였다.
[표 8]
Figure 112016061442918-pct00011
실시예 3: 항 IL-33 단일클론 항체의 IL-33 중화 활성의 평가-2
정상 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)(LONZA, CLC2517A)을 이용한 인간 IL-33 유도 IL-6 생산에 대한 저해 작용을 지표로 피험 항체(항체 A~H)의 IL-33 중화 활성의 측정을 실시했다. HUVEC을 96 웰 마이크로플레이트(IWAKI, MT4940-010)에 접종하여(6 × 103/0.1mL/웰) 세포가 밀집(confluent)되어 있는 것을 확인했다. 배지(EGM-2 배지(LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176))에 항 IL-33 항체(최종 농도 10μg/mL) 및 재조합 인간 IL-33(ATGen, ILC0701, 최종 농도 100ng/mL)를 첨가하고(0.2mL/웰) 37 ℃에서 24 시간 동안 배양 하였다. 24 시간 후에 배지 내의 IL-6 농도를 시판 ELISA 키트(Thermo Scientific, EH2IL6))를 이용하여 측정하였다. 또한 세포 카운트 키트(Dojindo, 345-06463)를 이용하여 배지 채취시의 세포 생존율을 측정하고, IL-6 생산 억제 작용이 생존 세포 수의 감소에 기인하지 않는 것을 확인했다. 피험 항체 IL-33 중화 활성(HUVEC 계 IL-6 생산 저해율)로 재조합 인간 IL-33 단독 처리에 의한 IL-6 생산에 대한 저해율(%)을 산출했다. 그 결과, 항체 A(에피토프는 PEP12)이 51 % 억제 항체 B(에피토프는 PEP12)이 48 % 저해, 항체 C (에피토프는 PEP14)이 33 % 저해, 항체 D (에피토프는 PEP14)이 38 % 저해, 항체 E (에피토프는 PEP16-17)이 0 % 저해, 항체 F (에피토프는 PEP24)이 38 % 저해, 항체 G (에피토프는 PEP26)이 48 % 저해, 항체 H (에피토프는 PEP26)이 56 % 저해되어, 8 종류의 항체 중 항체 E를 제외한 모든 항체가 30 % 이상의 저해율을 나타내었다(표 9). 이러한 항체 중 서열번호 1의 111위치~130위치, 131위치~150위치, 231위치~250위치 및 251~270위치로 이루어진 군에서 선택되는 에피토프에 결합하는 항체는 항체 농도를 3, 10 및 30μg/mL로 한 경우의 중화 활성의 증가가 크고(예를 들어, 항체 D는 각각 23, 42, 61 % 저해), 길항제 작용을 갖는 항체를 생성하는 데 적합한 에피토프인 것으로 나타났다.
[표 9]
Figure 112016061442918-pct00012
항체 E는 hIL-33에 결합에도 불구하고(도 2), 기능적 중화 능력을 나타내지 않았다(표 8, 표 9). 특허 문헌 2(WO2008/132709)는 에피토프 1(155~198 위치), 에피토프 2 (165~188 위치), 에피토프 3 (175~178 위치)의 3 종류의 에피토프가 기재되어 있지만, 이들 에피토프는 이번 IL-33의 중화 활성이 없는 것이 확인된 항체 E의 에피토프 펩티드(151~180 위치)와 중복되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과에서 특허 문헌 2의 에피토프에 대한 항체는 IL-33 수용체 ST2의 결합을 충분히 억제할 수 없고, IL-33의 중화 활성이 없거나 설령 있다 하더라도 매우 낮다고 생각되었다.
항체 E가 IL-33의 중화 활성을 나타내지 않은 이유로서, 이론적으로는 에피토프의 우열 이외에 친화성 부족의 가능성이 존재한다. 그러나 항체 D, 항체 G, 항체 H와 같은, 항체 E 보다 hIL-33에 대한 결합이 항체 E보다 약한 경향임에도 불구하고 명확한 IL-33의 중화 활성을 나타내는 클론의 존재에 의해, 이 가능성은 낮은 것으로 생각된다. 이러한 점에서 사이토카인인 IL-33을 중화하는 것을 목적으로 한 경우, 특허 문헌 2에 기재된 에피토프는 IL-33에 결합 및 IL-33의 중화 활성이 관련되지 않은 에피토프인 반면, 이번에 우리가 발견한 4 개의 에피토프(PEP12, PEP14, PEP24, PEP26)은 IL-33에 대한 결합과 IL-33의 중화 활성이 관련하는 기능적인 에피토프라고 생각된다. 기능적인 에피토프에 결합하는 항체는 IL-33에 대한 길항제 작용이 높은 반면, 비기능적인 에피토프에 결합하는 항체는 IL-33에 대한 길항제 작용이 낮거나 전혀 없다고 생각된다.
실시예 4: 에피토프 펩타이드의 인간 IL-33 입체 구조에 대한 매핑
상기의 4 가지 에피토프 펩타이드에 대해 또한 길항제 작용을 갖는 항체의 생성에 바람직한 에피토프인 계면 원자(ST2를 구성하는 원자에서 최단 5ÅA 범위 내의 IL-33의 원자)를 특정하기 위해 인간 IL-33·인간 ST2 복합체의 입체 구조 상에 에피토프 펩타이드를 매핑했다. 인간 IL-33·인간 ST2 복합체의 X 선 결정 구조(Research Collaboratory for Structual Bioinformatics : PDB ID 4KC3)에서 IL-33 단백질의 일부 구조가 결여되어 있었기 때문에 이번에 동정한 모든 에피토프 펩타이드의 위치를 나타낼 수가 없었다. 따라서 상기 X 선 결정 구조(4KC3)를 주형으로 하여 상동 모델을 제작하여(도 3, Accelrys 사의 Discovery Studio 3.5을 사용), 이번 중화 활성이 인정된 항체의 에피토프 펩티드(PEP12, PEP14, PEP24, PEP26)를 매핑하였다(도 4~7). 그림 4~7에서는 인간 IL-33 및 에피토프 펩티드는 짙은 회색, 이들과 결합하는 ST2는 연한 회색으로 나타냈다. IL-33 단백질 표면의 수용체와의 접촉면의 위치를 명시하기 위해 계면 원자를 큼직한 공에 강조하여 표시했다. 그 결과 이러한 에피토프 펩티드(PEP12, PEP14, PEP24, PEP26)는 각각 계면 원자를 포함하는 아미노산을 갖는 것을 알 수 있었다. 계면 원자를 포함하는 아미노산으로는 PEP12의 P118, I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129, N130, PEP14의 D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, PEP24의 D244, N245, H246, PEP26의 K266, L267, S268, E269를 들 수 있다. 길항제 작용을 갖는 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프로는 계면 원자를 포함하는 아미노산을 갖는 에피토프가 바람직하다고 생각된다.
실시예 5: 인간 항 IL-33 항체( 모클론 )의 취득
인간 scFv의 파지 디스플레이 라이브러리(BioInvent n-CoDeR)(Soderlind et al., Nature biotechnology 2000 Vol.18 (8), p852)를 이용하여 성숙형 IL-33(잔기 112에서 잔기 270)에 결합하고 IL-33과 ST2의 결합을 저해하고, 또한 후술하는 정상적인 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 IL-33 의존적 IL-6 생산을 지표로 하여 IL-33의 활성을 저해하는 2 종류의 모클론(scFv)(분자 모양이 scFv임을 의미함, 이하 동일하게 표기함)을 취득하였다(클론명: A00-0070, A00-0036). 이들 항체의 염기 서열을 결정하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 결정했다. A00-0070 및 A00-0036의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 조합은 각각 표 2의 V29과 V30였다..
실시예 6: 상보성 결정 영역을 개선하기 위해 아미노산 치환의 결정
2 종류의 모클론의 IL-33에 대한 친화성 향상 및 물성 개선(표면 소수성의 저감에 의한 응집성 저감 및 용해도 향상)을 목적으로 Fab 리보좀 디스플레이 및 Fab 파지 디스플레이 의한 상보성 결정 영역 개선을 실시했다. 상보성 결정 영역의 개선은 2 단계로 실시하여, 제1단계에서 IL-33에 대한 친화성 향상 및 물성 개선을 위한 1 아미노산 치환을 결정하고, 제2단계에서 이러한 1 아미노산 치환의 여러 조합을 결정했다(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012 Vol. 428 (3), p395).
2 종류의 모클론의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 이용하여 Fab 리보좀 디스플레이 벡터를 구축했다. 이를 주형으로 한 site-directed mutagenesis PCR 및 overlap extension PCR에 의한 다단계 PCR 반응에 의해 항체의 6 개의 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, HCDR3)를 구성하는 모든 아미노산 잔기를 1 개씩 총 20 종류의 천연 아미노산으로 한, 포괄적 1 아미노산 치환 돌연변이 라이브러리를 구축했다. 재구축형 무세포 번역계 PURE system(Genefrontier, PUREfrex)(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 2001Vol 19 (8), p751)을 이용한 Fab 리보좀 디스플레이법(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012 Vol. 428 (3), p395)에 의해 재조합 인간 IL-33 단백질 (ATGen, ILC0701)를 미끼로 하여 포괄적 1 아미노산 치환 돌연변이 라이브러리의 농축을 몇 라운드 반복했다. 농축 전(구축 직후)의 라이브러리 및 농축 후의 라이브러리에 포함된 각 클론(Fab)(분자 모양이 Fab임을 의미함, 이하 동일하게 표기함)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 차세대 시퀀서(Roche 454)를 이용하여 결정하였다. 농축 전후의 각 라이브러리에서 수천 리드(read)의 서열 데이터를 검색하여 상보성 결정 영역에 있어서 모든 1 아미노산 치환 돌연변이의 존재 빈도를 산출했다. 그다음 농축 전의 라이브러리와 농축 후의 라이브러리의 모든 1 아미노산 치환 돌연변이의 존재 빈도의 변화 배율(농축 비율)을 산출하고, 라이브러리 농축에 의한 농축 비율의 크기를 지표로 하여 인간 IL-33 단백질 대한 친화성을 향상시키는 데 유용하다고 생각되는 아미노산 치환을 결정했다. 또한 이들 중 아미노산 치환 수와 아미노산 서열에서의 분포 상태를 고려하여 제2단계에서 구축하는 사용자 지정 라이브러리(custom library)에서 아미노산 치환을 도입하는 위치를 결정했다.
모클론 A00-0070에서는 LCDR1(서열목록의 서열번호 2)의 12 번째 아스파라긴, LCDR2(서열목록의 서열번호 11)의 4 번째의 글루타민, LCDR3(서열목록의 서열번호 23)의 2 번째 세린, 3 번째의 티로신, 6 번째 세린, HCDR1(서열목록의 서열번호 43)의 1 번째 아스파르트산, 5 번째 아스파라긴, HCDR2(서열목록의 서열번호 64)의 4 번째 세린, 5 번째 세린, 7 번째 세린, 9 번째 이소류신으로 아미노산 치환을 도입하기로 결정했다. 모클론 A00-0036에서는 LCDR1(서열목록의 서열번호 6)의 9 번째 아스파라긴, 13 번째 아스파라긴, LCDR2(서열목록의 서열번호 20)의 6 번째 아르기닌, 7 번째 류신, LCDR3(서열목록의 서열번호 40)의 1 번째 알라닌, 9 번째 알라닌, 10 번째 발린, HCDR1(서열목록의 서열번호 47)의 1 번째 아스파라긴, HCDR2 (서열목록의 서열번호 64)의 4 번째 세린, 5 번째 세린, 6 번째 세린, 7 번째 세린, 8 번째의 티로신, 9 번째 류신, 10 번째 티로신, 11 번째의 티로신, 13 번째 아스파르트산, 16 번째 리신, HCDR3(서열목록의 서열번호 78)의 2 번째 글리신, 5 번째 히스티딘, 6 번째의 아스파라긴산으로 아미노산 치환을 도입하기로 결정했다.
물성 개선을 위해 단백질 구조 해석 프로그램(Accelrys, Discovery Studio)를 사용하여 2 종류의 모클론의 상동 모델을 작성하고, 상보성 결정 영역에서 표면 소수성이 높은 영역을 예측했다. 다음 이러한 영역의 표면 소수성을 감소시키기 위해 모클론 A00-0070은 LCDR3(서열목록의 서열번호 23)의 3 번째의 티로신, HCDR2 (서열목록의 서열번호 64)의 7 번째의 세린, 9 번째 이소류신으로, 또한 모클론 A00-0036은 LCDR2 (서열목록의 서열번호 20)의 6 번째 아르기닌, 7 번째 류신, HCDR2(서열목록의 서열번호 64)의 7 번째 세린, 8 번째의 티로신, 9 번째 이소류신으로 아미노산 치환을 도입하기로 결정했다. 이 부위에 있어서 인간 IL-33 단백질과의 결합 기능을 유지하면서 표면 소수성의 저감을 도모하기 위해 유용한 것으로 생각되는 아미노산 치환을, 포괄적 1 아미노산 치환 돌연변이 라이브러리를 이용한 변이 분석의 농축 비율 데이터를 고려하여 결정했다.
실시예 7: 상보성 결정 영역을 개량한 인간 항 IL-33 항체의 제조
친화성 향상 및 물성 개선을 목적으로 한 상기의 유용한 아미노산 치환을 복수 조합하여 본격적인 상보성 결정 영역 개선용 사용자 지정 라이브러리를 설계했다. Fab 리보좀 디스플레이 및 Fab 파지 디스플레이 벡터를 구축하고 Fab 리보좀 디스플레이 벡터를 주형으로 한 site-directed mutagenesis PCR 및 overlap extension PCR에 의한 다단계의 PCR 반응 및 Fab 파지 디스플레이 벡터를 주형으로 한 쿤켈법에 의한 부위 특이적 변이 도입법(Fellouse et al., J. Mol. Biol. 2007 Vol. 373, p924)을 실시하여 상보성 결정 영역을 상기 설계에 따라 랜덤화한 상보성 결정 영역 개선용 사용자 정의 라이브러리를 구축했다. 인간 IL-33 단백질 및 게잡이원숭이(cynomolgus monkey) IL-33 단백질(GenBank : EHH57404 서열목록의 서열번호 227의 잔기 112의 Ser에서 잔기 269의 Glu)를 미끼로 하여 Fab 리보좀 디스플레이 및 Fab 파지 디스플레이 의한 라이브러리 농축을 몇 라운드 반복했다. 후반 라운드에서 IL-33 단백질에 결합 전에 Octyl Sepharose(GE Healthcare) 또는 Phenyl Sepharose(GE Healthcare) 등 소수성 컬럼 담체를 이용한 네거티브 선택을 실시하는 것에 의하여, IL-33 단백질에 친화성이 높으면서 표면 소수성이 낮은 Fab을 농축 하였다.
미끼로 사용한 재조합 단백질은 다음과 같이 제조하였다. 성숙형 인간 IL-33(잔기 112에서 잔기 270) 및 성숙형 게잡이원숭이 IL-33(서열목록의 서열번호 227의 잔기 112에서 잔기 269)는 N 말단 측에 6His 태그-Avi 태그를 추가한 것을 pET30a(-)에 삽입하여 발현 벡터를 구축하여 재조합 단백질을 제조하였다. 발현 벡터를 보유하는 대장균 BL21(DE3)주를 LB 배지 5mL에서 전배양 후 전배양액 1mL를 50mL 발현 배지(Merck, Overnight Express; 카나마이신 첨가)에 접종하고 30 ℃/200rpm으로 약 18 시간 발현 배양하였다. 회수한 균체를 세척 후 BagBuster(Novagen)에서 용균하여 상청을 회수했다. 상청 중에 포함되는 6His 태그 -Avi 태그-게잡이원숭이 IL33 (잔기 112에서 잔기 269)은 Ni-NTA Agarose(QIAGEN)를 이용하여 정제하고, 시판되는 비타민 B 복합체 리가아제(Avidity, BirA)를 이용하여 Avi 태그 부분 특이적으로 비오틴 수식을 도입했다.
농축 후의 라이브러리를 사용하여 Fab을 분비 발현하는 대장균 라이브러리를 구축하고 수백 클론 대장균의 배양 상청을 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 해리 속도 상수 (koff)의 측정을 실시하였다(Bio -Rad, ProteOn XPR36). 센서 칩 (Bio-Rad, NLC sensor chip)에 비오틴화 된 상기 인간 IL-33 단백질(4μg/mL) 및 상기 게잡이원숭이 IL-33 단백질 (4μg/mL)을 리간드로 하여 로드하고 1300에서 1600RU 상당의 인간 IL-33 단백질 및 1100에서 1500RU 상당의 게잡이원숭이 IL-33 단백질을 고정했다. 다음 대장균의 배양 상청을 분석물로서 로드하고, 결합상 1 분, 해리상 10~30 분의 센서 그램을 취득했다. SPR 데이터 분석 프로그램(Bio-Rad, ProteOn Manager v3.1.0)를 이용하여 센서 그램의 인터스팟 보정 및 공백 보정을 실시하고 Langmuir off-rate analysis에 의해 koff를 구했다.
상보성 결정 영역을 개량 한 클론(Fab) 중에서 인간 IL-33 단백질에 대한 친화성이 향상하고, 게잡이원숭이 IL-33 단백질에 대한 결합성을 갖는 클론을 실시예 8 이후의 고차 평가를 진행할 28 클론으로서 결정했다(표 2의 V1에서 V28). 표 10에 나타낸 바와 같이, 이러한 클론(Fab)는 모클론(Fab)에 비해 인간과 게잡이원숭이 IL-33 단백질에 높은 친화성(낮은 Koff 값)을 나타내었다. 이들 클론의 가변 영역 중의 프레임워크 영역의 아미노산 치환은 없었다. 상보성 결정 영역 중 동일한 1 아미노산 치환도 그 친화성 향상 효과는 1 아미노산 치환 돌연변이의 경우와 복수개 아미노산 치환 돌연변이의 경우에서 변화하기 때문에, 제1단계에서의 포괄적 1 아미노산 치환 돌연변이 라이브러리에서 농축 비율이 작음에도 불구하고, 고차 평가 28 클론의 서열 중의 빈도가 높은 아미노산 치환이나, 반대로 제1단계의 농축 비율이 큼에도 불구하고 고차 평가 28 클론의 서열 중의 빈도가 낮은 아미노산 치환이 존재했다.
[표 10]
Figure 112016061442918-pct00013
실시예 8: IgG 항체의 제조
취득한 항 IL-33 항체 7 클론(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070, A00-0036)에 관하여, 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 CMV 프로모터의 하류에 삽입함으로써 IgG를 발현하는 포유 세포용 발현 벡터를 구축했다. 각 클론의 경쇄 DNA 서열은 각각 서열목록의 서열번호 228, 232, 239, 241, 242, 230 및 253를 사용하고, 중쇄의 DNA 서열은 각각 서열목록의 서열번호 254, 261, 262, 264, 265, 276 및 277을 사용하였다. 유전자 도입 시약 NeoFection-293-1(Astec)을 사용하여 상기 발현 벡터를 FreeStyle 293-F 세포(Life Technologies)에 도입했다. 유전자 도입 후 5 일간 배양 한 후 배양 상청을 취득했다. CHO 세포에 의한 안정 발현주는 pConPlus 벡터와 CHO K1SV 세포를 이용한 GS 시스템(Lonza)에서 수립했다. CHO 세포 안정 발현주는 WAVE Bioreactor SYSTEM 20/50 EHT(GE Healthcare 사)를 이용하여 0.3 × 106 cells/mL에서 배양을 시작하고 분비된 IgG을 포함한 배양액을 회수했다. AKTA explorer 100(GE Healthcare)을 사용하여 Protein A 수지(GE Healthcare, HiTrap MabSelect SuRe)를 이용한 친화 크로마토그래피에 의해 배양 상청에서 IgG를 정제하였다. Protein A 수지에 결합한 IgG를 pH3.2의 용출 buffer로 용출하고 신속하게 중화하여 pH를 중성 부근으로 한 후 PBS(pH7.2)으로 투석했다. 정제 순도를 높일 목적으로 Protein A 컬럼 정제 후 IgG를 CHT(ceramic hydroxyapatiteTypeI 수지)(BIORAD)로 정제하였다. CHT에 결합한 IgG를 NaCl 농도의 그레디언트로 용출하여 원하는 분획을 회수한 후 PBS(pH7.2)으로 투석했다. 본 정제법으로 얻은 항체를 "중성 정제 항체"라 했다.
상기 정제법의 Protein A 수지에서 용출 공정 전에 6 Column Volume의 100mM 탄산나트륨 buffer(pH11.0)에 의한 6 분간의 세정 조작을 가한 정제법을 실시했다. 본 정제 법으로 얻은 항체를 "알칼리 정제 항체"라고 했다. 알칼리 정제 항체의 각 공정의 회수율을 표 11에 나타내었다. 정제 후 알칼리 정제 항체는 VIVASPIN Turbo15 30000MWCO(Sartoeius)에서 원심 농축했다.
[표 11]
Figure 112016061442918-pct00014
실시예 9: IL-33 단백질에 대한 친화성
피험 항체(IgG)(분자 모양이 IgG임을 의미함, 이하 동일하게 표기함)의 인간 IL-33 단백질에 대한 친화력 kinetic exclusion assay(KinExA)에 의해 PBS 중에서의 해리 상수(Kd)를 측정하는 것으로 결정했다(Sapidyne, KinExA3200). 일정 농도(최종 농도에서 수십 pM에서 수백 pM)의 피험 항체에 대해 인간 IL-33 단백질(ATGen, ILC0701)의 농도를 광범위(최종 농도의 상한을 수 nM에서 수십 nM로 하여 12 단계의 2 배 희석 계열로 2048 배의 농도 범위)하게 적정(titrate)한 꽉 혼합 샘플을 준비하여 항원 항체 반응이 평형에 도달 할 때까지 상온에서 배양했다. 평형 도달 후 KinExA3200를 이용하여 자유 항 IL-33 항체의 존재 비율을 측정했다. KinExA 데이터 분석 프로그램(Sapidyne, KinExA Pro Software v3.5.3)을 이용하여 인간 IL-33 단백질에 결합하지 않은 항 IL-33 항체의 존재 비율(세로축)과 항원 농도(가로축)의 플롯을 이론식에 적용하여 Kd를 산출했다. 항 IL-33 항체 캡쳐 비즈는 50mg의 Azlactone beads(Sapidyne)를 1mL 코트 용액(10μg/mL 인간 IL-33 단백질 (ATGen, ILC0701), 50mM 탄산나트륨 pH9.6)에 현탁하여 실온에서 1 시간 배양하여 제조했다. 검출용 항체는 anti-human F(ab)'2-DyLight649(Jackson, 309-495-006)을 사용했다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 중성 정제 항체를 이용한 경우 상보성 결정 영역을 개량한 항체 (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)의 인간 IL-33 단백질에 대한 친화성은 가장 약한 A23-1A05에서 Kd=231pM 가장 강한 A25-2C02에서 Kd=720fM였다.
동일하게 하여 알칼리 정제 항체의 인간 IL-33 단백질(잔기 112-잔기 270)(ATGen, ILC0701) 또는 전장 인간 IL-33 단백질에 대한 친화성을 KinExA으로 측정하였다(표 12). 인간 IL-33 단백질 (잔기 112 잔기 270)에 대한 친화성는 A10-1C04에서 Kd=100.3pM, A23-1A05에서 Kd=195.3pM, A25-2C02에서 Kd=700fM, A25-3H04 에서 Kd=7.7pM, A26-1F02에서 Kd=5.3pM였다. 전장 인간 IL-33 단백질에 대한 친화성은 A10-1C04에서 Kd=179.8pM, A26-1F02에서 Kd=10.4pM였다.
리간드로서 사용된 재조합 단백질은 다음과 같이 제조하였다. 전장 인간 IL-33 단백질은 N 말단 측에 NusA 태그-6His 태그-TEV Protease 절단 서열을 부가 한 것을 pET30a(+)에 삽입하여 발현 벡터를 구축하여 재조합 단백질을 제조하였다. 발현 벡터를 보유하는 BL21(DE3)주를 전 배양 후, 50mL의 LB 배지에 OD=0.5의 밀도로 접종하고, 37 ℃에서 4 시간 진탕 배양 하였다. 4 시간 후 배양 온도를 13 ℃로 변경하여 30 분간 진탕 배양한 후 IPTG를 최종 농도 0.1mM이 되도록 첨가하여 계속 13 ℃에서 72 시간 배양하여 전장 IL- 33 발현 대장균을 얻었다. 전장 IL-33 발현 대장균을 BugBuster Master Mix(Novagen)에서 용균 후 원심 분리하여 상청 분획을 얻었다. 회수 후의 상청을 HisTrap FF Crude 컬럼(GE Healthcare)에 의한 IMAC 정제 및 CaptoQ Impress 컬럼(GE Healthcare)에 의한 음이온 교환 정제를 하여, 단백질 순도를 높였다. 음이온 교환 후 샘플을 VIVASPIN6(5,000MWCO)에 의해 여과하여 원심 농축했다. 농축액 1750μL에 대해 Turbo TEV protease(나카라이 테스쿠)을 100μL, 및 1M DTT를 4.5μL 첨가하여 4 ℃에서 배양하는 것에 의하여 NusTag 및 HisTag를 절단했다. 태그 절단 후 샘플에 포함된 NusTag 및 Turbo TEV protease(HisTag 융합)를 제거하기 위해 Ni Sepharose Excel 컬럼(GE Healthcare)에 통과시켜 그 투과분획(flow-through fraction)을 회수했다. 투과분획에 최종 농도가 3.3mM이 되도록 DTT를 첨가하여 전장 인간 IL-33 단백질로로서 KinExA에서의 측정에 사용했다.
[표 12]
Figure 112016061442918-pct00015
*: 표 내의 수치는 특정 방법으로 제조된 항 IL-33 단일클론항체(IgG)의 각종 리간드에 대한 해리정수(Kd: 단위 pM)을 나타냄.
실시예 10: HUVEC를 이용한 in vitro에서의 인간 IL-33의 중화 활성의 평가
피험 항체 (IgG)의 in vitro에서의 인간 IL-33의 중화 활성을 HUVEC의 IL-33 의존적 IL-6 생산을 지표로 하여 평가했다. 양성 대조군으로 시판 다클론 항 IL-33 항체(R&D Systems, AF3625)를 사용했다. HUVEC(LONZA, CLC2517A)를 EGM-2 배지 (LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176)에 현탁하여 96 웰 마이크로 플레이트(IWAKI)에 접종하고(6x103/웰), 세포가 밀집(confluent)되어 있는 것을 확인했다. 매체에 항 IL-33 항체(최종 농도 1μg/mL(약 6.7nM)) 및 재조합 인간 IL-33(ATGen, ILC0701)(최종 농도 100ng/mL(약 5nM))의 혼합 용액을 첨가하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배지를 채취하여 배양 상층액 중 IL-6 농도를 시판 ELISA 키트(Thermo Scientific, EH2IL6)를 이용하여 측정하였다. 또한 세포 카운트 키트(Dojindo, 345-06463)를 이용하여 배지 채취시의 세포 생존율을 측정하고, IL-6 생산의 억제 작용이 생존 세포 수의 저하에 기인하지 않는 것을 확인했다. 피험 항체 IL-33 중화 활성은 IL-33 단독 처리에 의한 IL-6 생산에 대한 저해율(%)로 계산되었다. 중성 정제 항체를 이용한 경우 A10-1C04이 67 % 저해, A23-1A05이 74 % 저해, A25-2C02이 96 % 저해, A25-3H04이 97 % 저해, A26-1F02이 96 % 억제와 강한 중화 활성을 나타낸 반면, 모클론인 A00-0070이 4 % 저해, A00-0036이 -2 %로 매우 약한 중화 활성에 그쳤다. 10μg/mL로 농도를 증가킴으로써 A00-0070 42 % 저해, A00-0036이 38 % 저해 및 중간 정도의 중화 활성을 나타내었다. 한편, 시판 다클론 항체(R&D Systems, AF3625)는 최종 농도 1μg/mL로 첨가 한 경우에 30 % 저해 및 중간 정도의 중화 활성을 나타내었다.
마찬가지로 HUVEC에 알칼리 정제 피험 항체(최종 농도 0.1~10μg/mL(약 0.67~67nM)) 및 재조합 인간 IL-33(ATGen, ILC0701)(최종 농도 100ng/mL(약 5nM))의 혼합 용액을 첨가하여 항체의 중화 활성을 IL-33 단독 처리에 의한 IL-6 생산에 대한 억제 효과(IC50 값)으로 산출하였다. A10-1C04가 IC50=0.35μg/mL, A23-1A05가 I IC50=0.27μg/mL, A25-2C02가 IC50=0.19μg/mL, A25-3H04가 IC50= 0.21μg/mL, A26-1F02이 IC50=0.23μg/mL였다.
또한 HUVEC에 알칼리 정제 피험 항체(최종 농도 0.1~3μg/mL) 및 재조합 게잡이원숭이 IL-33(실시예 7에 기재된 방법으로 제조한 것을 비오틴화하지 않고 사용)(최종 농도 100ng/mL)의 혼합 용액을 첨가하고, 항체의 중화 활성을 IL-33 단독 처리에 의한 IL-6 생산에 대한 억제 효과(IC50 값)으로 산출하였다. A10-1C04의 IC50은 0.43μg/mL이며, A10-1C04는 인간 IL-33와 게잡이원숭이 IL-33를 유사한 강도로 무력화시킴을 확인했다.
실시예 11: KU-812 세포를 이용한 in vitro에서 인간 IL-33의 중화 활성의 평가
피험 항체 (IgG)의 in vitro에서의 인간 IL-33의 중화 활성을 KU-812 세포의 IL-33 의존적인 IL-5, IL-6, IL-13의 생산을 지표로 하여 평가했다. 양성 대조군으로 시판 다클론 항 IL-33 항체(R&D Systems, AF3625)를 사용했다. 인간 호염기구 세포주 KU-812 세포(ECACC, EC90071807)를 96 웰 마이크로 플레이트(Falcon)에 접종하였다(1x104/웰). 이어 피험 항체(최종 농도 3μg/mL(약 20nM)) 및 재조합 인간 IL-33(ATGen, ILC0701)(최종 농도 100ng/mL(약 5nM))의 혼합 용액을 첨가하고, 37 ℃, 24 시간 배양했다. 10 % FBS를 포함한 RPMI-1640 배지 중의 IL-5, IL-6, IL-13의 농도를 BDTM Cytometric Bead Array(BD Biosciences)의 Human IL-5 Flex set, Human IL-6 Flex set 및 Human IL -13 Flex set를 이용하여 측정 하였다. 또한 세포 카운트 키트(Dojindo, 345-06463)를 이용하여 배지 채취시의 세포 생존율을 측정하고, IL-5, IL-6, IL-13의 생산 억제 작용이 생존 세포 수의 저하에 기인하지 않는다는 것을 확인했다. 중성 정제 항체를 이용한 경우, 이 평가계에서 A26-1F02는 IL-5, IL-6, IL-13의 생산을 각각 70 %, 82 %, 72 % 저해하고, 어느 사이토카인 생산에 대해서도 시판 폴리클로날 항체(각각 47 %, 51 %, 41 % 저해)보다 강한 중화 활성을 나타내었다.
마찬가지로 KU-812 세포에 알칼리 정제 피험 항체(최종 농도 100~0.01μg/mL(약 667~0.067nM)) 및 재조합 인간 IL-33(ATGen, ILC0701)(최종 농도 3ng/mL(약 0.15nM)), 인간 IL-3(PeproTech, 200-03, 최종 농도 10ng/mL(약 0.67nM)), 인간 보체 C5a(Sigma-Aldrich, C5788)(최종 농도 1nM)의 혼합 용액을 첨가하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양했다. 10 % FBS를 포함한 RPMI-1640 배지 중의 IL-5, IL-13의 농도를 측정했다. 또한 세포 카운트 키트를 사용하여 배지 채취시의 세포 생존율를 측정하고, IL-5, IL-13의 생산 억제 작용이 생존 세포 수의 감소에 기인하지 않는 것을 확인했다. 이 평가계에서 알칼리 정제 피험 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)는 IL-5 및 IL-13 생산에 대해 최종 농도 1μg/mL에서 50 % 이상의 저해 효과를 나타내었다.
실시예 12: 인간 말초 혈액 단핵구를 이용한 in vitro에서 인간 IL-33의 중화 활성의 평가
피험 항체 (IgG)의 in vitro에서의 인간 IL-33의 중화 활성을 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 IL-33 의존적인 IFN-γ 생산을 지표로 하여 평가했다. 양성 대조군으로 시판 다클론 항 IL-33 항체(R&D Systems, AF3625)를 사용했다. PBMC를 준비하고 96 웰 마이크로 플레이트에 접종하고(2x105/웰), 재조합 인간 IL-12(와코 순약　공업)(최종 농도 10ng/mL)을 첨가하였다. 피험 항체 및 재조합 인간 IL-33 단백질(10ng/mL)의 혼합물을 첨가하고, 37 ℃, 48 시간 배양했다. 그 후, 배양 상청을 채취하여 배지 내의 IFN-γ 생산량을 AlfaLISA TM human IFN-γimmunoassay kit(PerkinElmer)를 이용하여 측정하고 IL-33의 중화 활성을 평가했다. 이 평가계에서 알칼리 정제 항체를 최종 농도 10μg/mL로 작용시킨 경우의 저해율은 A10-1C04에서 96.9 % 저해, A23-1A05에서 97.5 % 저해, A25-2C02 98. 75 % 저해, A25-3H04에서 97.9 % 저해, A26-1F02에서 98.25 % 저해였다.
실시예 13: 인간 IL-33의 복강 내 투여에 의해 유도되는 염증에 대한 작용의 평가
인간 IL-33을 마우스 복강 내 투여함으로써 다양한 염증성 변화가 유도되었다. 즉 혈중 IgE, IgA, IL-5의 증가, 호중구, 호산구, 호염기구의 증가, 비장 세포의 증가(비장 중량 증가) 및 각종 점막 장기의 병리 변화가 발생하였다. 이러한 변화를 지표로 하여 피험 항체(IgG)의 in vivo에서 항염증 작용을 평가했다.
수컷 C57BL6(6~8 주령)(일본 찰스 리버)에 대해 인간 IL-33 단백질(R&D Systems, 3625-IL-010)를 0.4μg/개체 7 일(Day0-Day6) 복강 투여를 실시했다. 또한 피험 항체 (IgG)를 7 일(Day0-Day6) 복강 내 투여했다. 투여 개시로부터 7 일 후(Day7) 인간 IL-33 단백질 대신 PBS(도면 중에서는 “vehicle”이라 표기하고 있음)을 투여 한 군의 비장 중량이 평균 76 ± 4mg이었던 반면, IL-33 단백질 투여군의 비장 중량이 평균 90 ± 7mg이었다. 또한 IL-33 단백질 투여 이외에 인간 control IgG(MP Biomedicals, 55908)을 10mg/kg(그림 중에서는 "mpk”라 표기하고 있음)로 복강 내 투여 한 군의 비장 중량이 평균 93 ± 4mg 이었던 반면, IL-33 단백질 투여 이외에 중성 정제 항체인 A26-1F02을 10mg/kg 복강 내 투여한 군의 비장 중량이 평균 66 ± 3mg였다.
다음으로 알칼리 정제 항체를 인간 IL-33 단백질 투여 전날 (Day-1)에 1회 피하투여(sc, one shot)하여 평가했다. 투여 개시로부터 7 일 후(Day7) 인간 IL-33 단백질 대신 PBS를 투여한 군의 비장 중량이 평균 70mg이었던 반면, IL-33 단백질 투여 이외에 상기 인간 control IgG를 피하 투여(10mg/kg)한 군의 비장 중량이 평균 152mg이었다. 이에 대해 도 8에 나타나는 바와 같이, IL-33 단백질 투여여 더하여 A25-3H04을 피하 투여(1,3,5,10mg/kg)한 군의 비장 중량이 각각 143, 106, 109, 78mg이며, A25-3H04는 염증에 의한 비장 중량의 증가를 농도 의존적으로 억제했다. 이러한 비장 무게에 대한 항염증 작용과 마찬가지로, 인간 IL-33 투여에 의해 증가하는 혈청 IgA 농도, 혈청 IgE 농도, 혈중 호중구 수, 호염기구 수, 호산구 수, 혈청 IL -5 농도도 A25-3H04에 의해 억제되는 것이 확인되었다(도 8). 이상의 결과에서 IL-33로 유도되는 in vivo의 염증 반응에 대하여 A25-3H04이 억제 작용을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 투여 개시로부터 7 일 후(Day7)의 A25-3H04 마우스 혈중 농도를 측정 한 결과, 1, 3, 5, 10mg/kg 투여 각각에 대해 0.6, 3.7, 6.5, 20.3μg/ml이었다.
그 이외의 피험 항체 (IgG)의 in vivo에서 항염증 작용도 피하 투여(10mg/kg)에서 마찬가지의 프로토콜로 평가했다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 인간 control IgG를 피하 투여한 군의 비장 중량이 평균 181mg이었던 반면, IL-33 단백질 투여 이외에 각 알칼리 정제 항체(A10-1C04, A23- 1A05, A25-2C02, A26-1F02)를 피하 투여한 군의 비장 중량이 각각 82mg, 92mg, 100mg, 77mg이며, 염증에 의한 비장 중량의 증가를 억제하고 있었다. 이러한 비장 중량에 대한 항염증 작용과 마찬가지로, 인간 IL-33 단백질 투여에 의해 증가하는 혈청 IgA 농도, 혈청 IgE 농도, 혈중 호중구 수, 호염기구 수, 호산구 수도 알칼리 정제 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A26-1F02)가 억제하는 것을 확인 하였다(도 9). 이상의 결과에서 IL-33로 유도되는 in vivo의 염증 반응에 대하여 A25-3H04 뿐만 아니라 다른 피험 항체 (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A26-1F02)도 항염증 작용을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 14: 인간 IL-33 기관 내 투여에 의해 유도된 폐 손상에 대한 작용의 평가
마우스에 대하여 인간 IL-33 단백질을 기관 내 투여한 후 기관지 폐포 세척액(BALF)을 채취하면, BALF 중 총 세포 수와 호산구 수, 호중구 수가 증가하고 기관 상피 점액 증가 발생도 보인다. 또한 BALF에서의 IL-4, 5, 6, 13 라는 사이토카인도 생산한다. 이 계에 피험 항체(IgG)를 복강 내, 피하 또는 정맥 내 투여하여 그 폐 손상에 대한 피험 항체의 작용을 평가할 수 있다.
실시예 15: 인간 IL-33 비강 투여에 의해 유도되는 기도과민성에 대한 작용의 평가
IL-33 단백질을 마우스의 비강 내 투여하면, 그 후에 흡입 메타코린에 대한 기도 과민성이 생긴다. 이 평가 시스템에 피험 항체 (IgG)를 복강 내, 피하 또는 정맥 내 투여하는 것에 의하여 기도과민성(airway hyperresponsiveness) 대한 피험 항체의 작용을 평가할 수 있다.
실시예 16: 인간 IL-33 노크인 마우스를 이용한 IL- 33에 대한 작용의 평가
인간 IL-33 노크인(knockin) 마우스에 진드기 항원 또는 papain을 점비(nasal dripping) 또는 기관 내 투여하면 기도 염증이 유발되며, 이 마우스에서 BALF를 회수하면 BALF 중의 총 세포 수가 증가한다. 진드기 항원 또는 papain에 의한 기도 염증은, 진드기 항원 또는 papain 프로테아제 활성에 의해 기도 상피 세포에서 IL-33가 방출되는 것이 야기된다는 점이 알려져 있다(Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581). 이 평가계에 피험 항체(IgG)를 복강 내, 피하 또는 정맥 내 투여하여 프로테아제에 의한 기도 염증에 대한 피험 항체의 작용 및 in vivo에서 유도된 IL-33에 대한 피험 항체의 작용을 평가할 수 있다.
실시예 17: LPS 복강 내 투여 패혈증 모델에서의 염증에 대한 작용의 평가
인간 IL-33 노크인 마우스에 LPS를 복강 내 투여하면 패혈증이 유발되는데(Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581), LPS 투여 전에 피험 항체(IgG)를 복강 내, 피하 또는 정맥 내 투여해 두고, 그 후 사망률에 대한 피험 항체의 작용을 평가할 수 있다. 또한 LPS 투여 수시간 내에 IL-6와 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인이 혈중에 고농도로 검출되는데, 이들의 농도를 측정함으로써 피험 항체의 항염증 작용을 평가할 수 있다.
실시예 18 : 담암 마우스를 이용한 in vivo에서 암에 대한 작용의 평가
마우스에 마우스 암세포주와 인간 암세포주를 각 암세포주에 따라 적절한 세포수로 같은 곳, 피하 또는 정맥 내에 이식하여 인간 IL-33을 투여한다. 이 마우스에 피험 항체(IgG)를 복강 내, 피하 또는 정맥 주사하고 암세포주를 이식한 후에 원발소의 암 부위와 전이소인 장기에 있어서의 암 세포 수를 부피나 세포 수로 평가하면, 피험 항체의 암에 대한 작용을 평가할 수 있다.
실시예 19: 항체의 콜로이드 안정성 평가
피험 항체 (IgG)의 콜로이드 안정성을 동적 광산란에 의한 응집물의 유무로 평가했다. 각 알칼리 정제 항체를 VIVASPIN 또는 VIVASPIN TURBO(sartorius 10000 50000 MWCO)으로 50mg/mL 부근까지 농축하였다. 원심은 4 ℃에서 실시하고, 회전 수, 시간에 관해서는 각각 적절히 변경했다. 피험 항체 용액을 순차적으로 희석하면서 200부터 250μL의 샘플을 이용하여 동적 광산란(닛키소, Nanotrac UPA UT-151)를 측정하고, 농도 범위로 하여 1mg/mL 부근에서 50mg/mL 부근에 있어서의 데이터를 취득했다. 항체 단백질의 입자경 분포를 200 초 동안의 누적 데이터에서 산출하고, 응집물의 유무를 평가했다. 피험 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)는 입자경 분포에 있어서 10nm 부근의 피크가 항체 농도의 증가에 따라 높은 입자경 측으로 이동하는 정도가 매우 경미하고, 또한 항체 농도에 의존하지 않는 불가역적인 응집물에서 유래하는 것으로 생각되는 입자경 수십 nm 이상의 피크는 존재하지 않았다. 이상의 결과에 의해 피험 항체의 양호한 콜로이드 안정성을 확인했다.
콜로이드 안정성을 정량적으로 평가하기 위해 상호 작용 매개 변수(kD)의 산출을 실시했다. 확산 계수(입자경과 반비례)의 농도 의존성을 나타내는 상호 작용 매개 변수는 항체 등의 단백질 고농도 제제의 처방 설계에 이용되는 중요한 지표이다. 상호 작용 매개 변수의 값은 -12.4 mL/g 보다 높은 값이면 척력적인 상호 작용으로 콜로이드 안정성이 뛰어나고, 자기회합성이 낮은 것이라고 보고되고 있다(Saito et al., Pharm.Res., 2013. Vol.30 p1263). PBS(pH 7.2)에 용해시킨 피검 항체 용액을 한외 여과막에서 수10mg/mL가 되도록 농축하고, 동 용매에서 순차적으로 2 배 희석한 시료의 입도 측정을 동적 광산란 측정 장치(Nanotrac UPA UT151 닛키소)를 이용하여 수행 하였다. 얻어진 입자의 확산 계수를 이하의 Stokes-Einstein의 식으로 산출했다.
[식 1]
Figure 112016061442918-pct00016
위 식에서, D는 확산 계수(cm2/sec), KB는 볼츠만 상수(J/K), T는 열역학적 온도 (K), π는 원주율, η는 희석액 점도 P(poise), d는 입자경(nm)이다. 확산 계수의 농도 의존성을 플로팅하여, 이하의 계산식에 적용하여 상호 작용 매개 변수를 구했다.
[식 2]
Figure 112016061442918-pct00017
D는 Stokes-Einstein 식으로 얻어진 확산 계수이고, D0는 무한 희석 시의 확산 계수, c는 측정시 피험 항체의 농도(g/mL)이다. 이 식에서 피팅 직선의 기울기인 상호 작용 매개 변수(kD)를 산출했다. 그 결과 A10-1C04이 kD = -8.1mL/g (분석 범위는 0.41-63.7mg/mL), A23-1A05이 kD = -5.6mL/g (분석 범위는 0.40-61 .8mg/mL), A25-2C02이 kD = -6.2mL/g (분석 범위는 0.43-66.3mg/mL), A25-3H04이 kD = -7.5mL/g (분석 범위는 0 .34-56.5mg/mL), A26-1F02이 kD = -6.7mL/g (분석 범위는 0.35-62.7mg/mL)이며, 모든 항체의 상호 작용 매개 변수가 -12. 4mL/g 보다 높고, 콜로이드 안정성이 우수했다.
실시예 20: 항체의 열역학적 안정성 평가
피험 항체 (IgG)의 열역학적 안정성을 면역 글로불린 도메인의 폴딩이 붕괴하는 온도(Tm)로 평가했다. 수10μg/mL의 피험 항체 용액에 Protein Thermal Shift Dye(Life Technologies)를 첨부 문서에 따라 첨가하여 실시간 PCR 7500 Fast(Life Technologies)으로 약 1 ℃/min로 온도를 상승시키면서 형광 강도를 측정했다. 얻어진 데이터를 Protein Thermal Shift(Life Technologies)로 해석함으로써 Tm을 결정했다. 또한 복수의 Tm이 인정되는 경우, 온도가 낮은 쪽으로부터 Tm1, Tm2으로 하였다. 그 결과 중성 정제 항체를 이용한 경우 A10-1C04이 Tm = 73.9 ℃, A23-1A05가 Tm1 = 69.3 ℃℃, Tm2 = 77.6 ℃, A25-2C02가 Tm1 = 69.3 ℃, Tm2 = 80.3 ℃, A25-3H04가 Tm1 = 70.0 ℃, Tm2 = 76.4 ℃, A26-1F02이 Tm = 74.5 ℃이었다. 또한 알칼리 정제 항체를 이용한 경우 A10-1C04이 Tm = 73.7 ℃, A23-1A05가 Tm1 = 69.5 ℃℃, Tm2 = 77.5 ℃, A25-2C02가 Tm1 = 69.5 ℃, Tm2 = 80.4 ℃, A25-3H04가 Tm1 = 70.1 ℃, Tm2 = 76.4 ℃, A26-1F02이 Tm = 74.4 ℃였다. 모든 항체의 Tm가 65 ℃ 이상이며, 양호한 열역학적 안정성을 나타냈다.
실시예 21: 항체의 보존 안정성 평가
피험 항체 (IgG)의 보존 안정성을 평가하기 위해 각 알칼리 정제 항체를 약 10 mg/mL의 농도에서 구연산 버퍼(50 mM 구연산, 150 mM NaCl(pH 6.3))에 용해하여 40 ℃에서 4 주간 보존하였다. 보존 후 항체 모노머 순도 평가를 위한 겔 여과 분석(SEC) 및 마이크로칩 모세관 SDS 전기 영동(mCE-SDS)에 의한 모노머 순도의 측정 및 표면 플라스몬 공명을 이용한 항원 결합 활성 측정을 실시했다.
TSKgel G3000SWXL(토소)을 2 연결한 컬럼을 HPLC 장치(Beckman System Gold 126 solvent manager, 166 detector, 508 auto sampler)에 장착하여 겔 여과 분석을 실시했다. 이동상 용매로 0.1 M 황산 나트륨을 포함하는 0.1 M 인산 완충액(pH 6.7)을 이용하여 0.5 mL/min의 유량으로 분리하고, 검출은 UV 215 nm에서 실시하였다. 약 10 mg/mL의 항체 저장 용액을 100 배 희석하여 분석용 샘플로 하고, 그 50μL를 인젝트 하였다. 겔 여과 분석에서 얻어진 모노머 순도를 표 13에 나타내었다. 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 40 ℃ 4 주 보존 후에 있어서 90 % 이상의 모노머 순도를 유지하고 있어, 양호한 보존 안정성을 나타내었다.
Lab Chip GX II (PerkinElmer)를 사용하여 모세관 SDS 전기 영동을 실시했다. 이 장치 전용 시약 키트 HT Protein Express Reagent(PerkinElmer)를 사용하여 제조 업체의 표준 프로토콜에 따라 변성 조건 하에서 환원을 실시했다. 분석용 샘플로 약 10mg/mL의 항체 저장 용액을 2μL 첨가하였다. 영동에 사용하는 시약을 상술한 키트 전용 칩 HT Protein Express Lab Chip, version 2(PerkinElmer)에 첨가하여 항체 분석을 위한 내장 프로토콜 HT Antibody 200로 측정을 실시했다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 변성·환원 조건에서도 어느 피검 항체 (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 40 ℃ 4 주 보존 후에 있어서 90 % 이상의 모노머 순도를 유지하고 있어, 양호한 보존 안정성을 보여 주었다.
보존 후의 항체 농도에 의존하지 않는 비가역적인 응집체 형성의 유무를 조사하기 위해 입자경 측정을 실시했다. 항체 보존 용액을 구연산 버퍼(50 mM 구연산, 150 mM NaCl(pH 6.3))로 10 배 희석(최종 농도 : 약 1 mg/mL)한 분석용 샘플에 대해 동적 광산란법(닛키소, Nanotrac UPA UT-151)에 의해 입자경 측정을 실시했다. 적산 시간은 200 초로 측정했다. 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070, A00-0036)도 40 ℃ 4 주 보존 후에서 응집체는 감지되지 않고, 보존 안정성이 뛰어난 항체를 얻을 수 있었다
보존 후 항원 결합 기능의 유무를 알아보기 위해 표면 플라스몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용한 항원 결합 활성 측정을 실시했다. 아민 커플 링 키트(GE Healthcare)를 이용하여 인간 IL-33 단백질(ATGen, ILC0701)을 Sensor Chip CM5(GE Healthcare)에 고정하였다(고정화량 약 3000에서 6000RU). 다음으로 항체 보존용액을 구연산 버퍼(50mM 구연산, 150mM NaCl(pH 6.3))로 10 배 희석하여 미량 분광 광도계 Astragene II(Astranet)를 이용하여 용액의 총 단백질 농도를 측정 하였다(단백질 농도 : 약 1mg/mL). 총 단백질 농도를 측정한 항체 용액을 HBS-EP 버퍼(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05 %(v/v) Surfactant P20(pH7.4))를 이용하여 1000 배 희석하여 분석물 용액으로 하였다. 측정은 25 ℃에서 실시했다. 각종 분석물 용액을 36 초간 첨가하여 결합상의 센서 그램을 얻었다. 유속은 5μL/min, 100 μL/min으로하고 2 종류의 유속에서 얻어진 센서 그램에 대하여 데이터 분석 프로그램(GE Healthcare, Biacore T200 Evaluation Software v1.0)을 이용한 Calibration Free Concentration Analysis에 의하여 항원 결합 활성을 갖는 항체의 농도를 구했다. 대조로서, 4 ℃에서 4 주간 보존된 각종 피험 항체의 항원 결합 활성을 동일하게 측정하고 40 ℃ 4 주 보존한 피검 항체의 항원 결합 활성의 비율을 산출했다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 40 ℃ 4 주 저장 후에서 90 % 이상의 항원 결합 활성을 유지하고 있어, 양호한 저장 안정성을 나타냈다.
[표 13]
Figure 112016061442918-pct00018
실시예 22: 항체 강제 산화에 의한 안정성 평가
피검 항체 (IgG)의 산화에 의한 항원 결합 활성의 영향을 조사했다. 최종 농도 약 1mg/mL의 각종 알칼리 정제 항체 과산화수소(최종 농도 1 %)를 첨가하여 37 ℃에서 24 시간 산화시켰다. 그 후, 80 mM 메티오닌 용액을 첨가하여 산화를 종료시켰다. 다음은 피험 항체 용액을 탈염 컬럼 Zebaspin(Thermo Scientific)를 이용하여 PBS로 치환했다. 산화처리 된 피검 항체의 항원 결합 활성을 상기 실시예 21과 동일하게 표면 플라스몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)를 이용하여 조사하였다. 산화처리 되지 않은 각종 피험 항체의 항원 결합 활성에 대한 산화 처리 후 항원 결합 활성의 비율을 산출 한 결과, A10-1C04가 83 %, A23-1A05가 95 %, A25-2C02이 100.5 %, A25 -3H04이 98.7 %, A26-1F02가 89.5 %의 결합 활성을 유지하고 있었다. 이들 결과에 의해 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 1 % 과산화수소 처리에 의한 강제 산화에 있어서 80 % 이상의 항원 결합 활성을 유지하는 안정성을 나타내었다.
실시예 23: 물리적 스트레스( 교반 )에 의한 응집체 형성 평가
피험 항체 (IgG)를 PBS로 0.2mg/mL로 희석하고 Aggregates Sizer(시마즈 제작소)에 장착한 회분셀(Batch cell)에서 교반하여 물리적 스트레스를 가했다. 실온에서 교반자를 30 분간 상하 운동(190 회/분)시킨 후, Aggregates Sizer에서 40nm에서 20μm의 응집체 농도를 측정했다. 알칼리 정제 항체를 이용한 경우 교반에 의해 생긴 응집체 농도는 A10-1C04가 17.2μg/mL, A23-1A05가 16.4μg/mL, A25-2C02가 13.3μg/mL, A25-3H04 가 23.4μg/mL, A26-1F02가 17.0μg/mL이며, 어느 항체도 물리적 스트레스로 유도 된 응집체 형성이 15 % 이하로, 어느 피검 항체도 물리적 스트레스에 대해 안정적이었다.
실시예 24: 항체 마우스 혈중 농도 추이 평가
수컷 C57BL6 마우스(8~10 주령)(일본 찰스 리버)에 형광 표지된 피험 항체(IgG)를 마우스에 정맥 주사(3mg/kg) 한 후 혈장의 형광을 검출함으로써 피험 항체의 농도를 측정했다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 알칼리 정제 항체를 이용한 경우 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 소실 반감기가 100 시간 이상으로, 양호한 혈중 안정성을 나타내었다.
실시예 25 : 원숭이 혈중 농도 추이 평가
수컷 게잡이원숭이 (2-3 세) (Hamri)에 피험 항체(IgG)를 정맥 주사(1mg/kg)한 후 Human Therapeutic IgG1 EIA Kit(Cayman Chemical, 500910)fmf 이용하여 혈청 피검 항체의 농도를 측정했다. 알칼리 정제 항체 A10-1C04를 2 마리의 게잡이원숭이(No.201, 202)에 투여하고, 알칼리 정제 항 A23-1A05를 1 마리의 게잡이원숭이 (No.301)에 투여했다. 도 11에 나타나는 바와 같이, A10-1C04의 소실 반감기는 16.56 일 (No.201) 및 11.40 일 (No.202)이며, 클리어런스 값은 3.598mL/day/kg (No. 201) 및 5.451mL/day/kg (No.202)였다. 또한 A23-1A05의 소실 반감기는 10.87 일이며, 클리어런스 값은 10.07mL/day/kg이었다. 어느 피검 항체도 게잡이원숭이에서 양호한 혈중 안정성을 보여 주었다.
실시예 26: 항체의 면역원성 평가
피험 항체 (IgG)의 면역원성을 평가하기 위해 in vitro T 세포 분석을 실시했다(Lonza). 대상이 되는 인구 집단의 대표를 나타내기 위해 제공자 수는 50 명으로 하고, 기증자로부터 채취한 인간 말초 혈액 유래 수지상 세포에 50μg/mL의 각종 알칼리 정제 항체를 첨가하여 수지상 세포에 포함시켰다. 한편, 동일한 기증자로부터 채취한 인간 말초 혈액 유래의 CD4 양성 T 세포를 분리 하였다. 그 후에 양 자, 즉 피험 항체를 캡처한 수지상 세포를 CD4 양성 T 세포와 함께 공배양하여 CD4 양성 T 세포 반응(증식)을 측정했다. 대조군으로서 피험 항체를 포함하지 않는 버퍼(PBS)에서 동일하게 실시하여 얻은 CD4 양성 T 세포의 반응과 비교하여 항체를 인간에게 투여했을 때 면역원성 위험을 평가했다. 그 결과 어느 피험 항체(A10-1C04, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02)도 대조군과의 사이에 T 세포의 반응에 있어서 차이는 인정되지 않았다.
실시예 27: 인간 조직 교차 반응성의 평가
피험 항체 (IgG)의 인간 조직(1 기증자, FDA 및 EMA의 가이드 라인을 충족 35 조직의 동결 절편)에 대한 교차 반응성을 면역 조직 화학 염색법에 의해 평가하였다(Covance Laboratories Ltd.). 35 조직에는 부신, 방광, 혈액 세포, 골수, 유방, 소뇌, 대뇌 피질, 결장, 내피 세포(혈관), 안구, 나팔관, 위장관(평활근 포함), 심장, 신장(사구체, 세뇨관), 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 상피 소체, 귀밑샘, 말초신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 피부, 척수, 비장,　횡문근, 정소, 흉선, 갑상선, 편도선, 요관, 자궁(자궁 경부, 자궁 내막)이 포함된다. 그 결과, 알칼리 정제 항체를 이용한 경우 어느 피검 항체(A10-1C04, A23-1A05, A26-1F02, A25-2C02)도 IL-33의 발현이 널리 알려진 혈관 내피 세포(성 대조)에서 강한 염색성이 확인되었다. 또한 상피·간질 세포·신경 조직·근육 조직·혈구 등의 다양한 조직에 있어서 세포질 또는 핵에 대한 교차 가능성이 확인되었지만, 어느 조직에서도 세포막에 대한 교차 반응은 보이지 않았다 했다. ICH S6 (R1) 지침 및 기타 논문 (Toxicologic Pathology 2010, 38 (7) : 1138-1166)에 의하면, in vivo에서 항체가 도달 할 가능성이 낮은 세포질과 핵에 대한 교차 반응성은 독성학적 의의가 낮다고 생각되고 있다. 따라서, 어떤 피험 항체(A10-1C04, A23-1A05, A26-1F02, A25-2C02)도 독성 우려는 발견되지 않았다.
실시예 28: A10- 1C04 및 A25- 3H04의 에피토프 영역 축소
항 IL-33 단일클론 항체 A10-1C04 및 A25-3H04는 상기 실시예 1에 기재한 PEP14 에피토프에 결합했다. 20 아미노산 잔기로 이루어진 PEP14에 포함된 짧은 연속 아미노산 서열에 대해, 이와 같은 아미노산 서열을 제시하는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용한 실험을 통해, 2 종류의 에피토프(LEDESYEIYV(서열목록의 서열번호 426) 및 EDESYEIYV(서열목록의 서열번호 427))를 발견했다. 펩타이드 LEDESYEIYV은 서열목록의 서열번호 226에 나타내는 인간 IL-33의 잔기 138에서 잔기 147에 해당하고, 펩티드 EDESYEIYV은 서열목록의 서열번호 226에 나타내는 인간 IL-33의 잔기 139 잔기 147 에 해당한다. 이러한 펩티드를 합성하고 실시예 1과 동일한 KinExA 실험에 의해 알칼리 정제 항체와의 친화성을 Kd로 산출하였다(표 14).
[표 14]
Figure 112016061442918-pct00019
본 발명의 중화 작용을 갖는 항체는 IL-33 관련 질환의 진단, 치료, 예방 또는 경감용 의약 조성물로 사용할 수 있다.
<110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation <120> Human Anti-IL-33 Neutralizing Monoclonal Antibody <130> IF16P124/JP <150> JP2013-270551 <151> 2013-12-26 <150> JP2014-078223 <151> 2014-04-04 <160> 427 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-1 <400> 1 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Val Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-2 <400> 2 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Val Tyr Asn Val His 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-3 <400> 3 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-4 <400> 4 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-5 <400> 5 Ser Gly Ser Cys Ser Asn Ile Gly Arg Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccgccg ttgggtgttc 300 ggcggaggaa ccaagctgac ggtcctaggt caacccaagg ccgctcccag cgtgaccctg 360 ttccccccca gcagcgagga gctgcaggcc aacaaggcca ccctggtgtg tctgatcagc 420 gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480 ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540 ctgagcctga ccccagagca gtggaagagc cacaggagct acagctgcca ggtcacccac 600 gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc ccaaccgagt gctcc 645 <210> 232 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-LC-5 <400> 232 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcacgata 60 tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taagctggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gccagtaaca tgagagtcat tggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgga gcatgggatg acagccagaa ggctcttgtt 300 ttcggcggag gaaccaagct tacggtccta ggtcaaccca aggccgctcc cagcgtgacc 360 ctgttccccc 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95 Ala Arg <210> 392 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 393 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 <210> 394 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 394 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 395 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 395 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 396 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 396 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 397 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 397 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 398 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 398 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 399 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 399 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 400 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 400 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 401 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 401 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 402 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 402 Asn Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 403 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 403 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 404 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 404 Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 405 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 405 Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 406 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 406 Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 407 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 407 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 408 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 408 Asn Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 409 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 409 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 Thr Val Ser Ser 20 <210> 410 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 410 Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser Ile Thr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Pro Ile Thr 20 <210> 411 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 411 Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ser Thr Tyr Asn 20 <210> 412 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 412 Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe 1 5 10 15 Ala Leu Glu Asp 20 <210> 413 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 413 Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr 1 5 10 15 Val Glu Asp Leu 20 <210> 414 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 414 Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys 1 5 10 15 Asp Lys Val Leu 20 <210> 415 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 415 Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser 1 5 10 15 Gln His Pro Ser 20 <210> 416 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 416 Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Val Asp Gly Lys 20 <210> 417 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 417 Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu 1 5 10 15 Ser Pro Thr Lys 20 <210> 418 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 418 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 1 5 10 15 Asn Asn Lys Glu 20 <210> 419 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His 1 5 10 15 Lys Cys Glu Lys 20 <210> 420 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 420 His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala 1 5 10 15 Phe Phe Val Leu 20 <210> 421 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 421 Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn 1 5 10 15 Cys Val Ser Phe 20 <210> 422 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 422 His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro 1 5 10 15 Gly Val Phe Ile 20 <210> 423 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 423 Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ile 20 <210> 424 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 424 Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu 1 5 10 15 Asn Leu Cys Thr 20 <210> 425 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 425 Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Thr 20 <210> 426 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 426 Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 427 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 427 Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val 1 5

Claims (40)

  1. 경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 1의 C1 내지 C30에 표시된 조합으로부터 선택되는, 단리된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
    [표 1]
    Figure 112019121861553-pct00034
  2. 제1항에 있어서,
    경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열의 조합은 표 1의 C1 내지 C28에 표시된 조합으로부터 선택되는, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3)의 각각의 아미노산 서열의 조합은 표 1의 C1, C8, C15, C17 및 C18에 표시된 조합으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    항체의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 생식 계열 프레임워크 영역의 아미노산 서열 또는 그 조합의 아미노산 서열인, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    경쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 1에서 잔기 22, 경쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 36에서 잔기 50, 경쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 317의 잔기 58에서 잔기 89, 및 경쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 401의 잔기 3 잔기 12이며, 또한, 중쇄 프레임워크 영역 1의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 1에서 잔기 30 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 1에서 잔기 30, 중쇄 프레임워크 영역 2의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 36에서 잔기 49 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 36에서 잔기 49, 중쇄 프레임워크 영역 3 의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 367의 잔기 67에서 잔기 98 또는 서열목록 서열번호 368의 잔기 67에서 잔기 98, 및 중쇄 프레임워크 영역 4의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 407의 잔기 5에서 잔기 15인, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1에서 V30로 표시된 조합으로부터 선택되는, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
    [표 2]
    Figure 112019121861553-pct00035
  7. 제6항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1에서 V28로 표시된 조합으로부터 선택되는, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각의 아미노산 서열의 조합이 표 2의 V1, V8, V15, V17 및 V18으로 표시된 조합으로부터 선택되는, 인간 항 IL- 33 중화 단일클론 항체.
  9. 제1항에 있어서,
    경쇄가 λ 사슬인, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  10. 제1항에 있어서,
    인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체가 IgG인, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  11. 제1항에 있어서,
    항원이 인간 IL-33 및 원숭이 IL-33인, 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체.
  12. 제1항에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    경쇄의 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2 (LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3 (LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2 (HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (HCDR3) 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 조합이 표 3의 CN1에서 CN30으로 표시된 조합으로부터 선택되는, 핵산 분자.
    [표 3]
    Figure 112019121861553-pct00036
  14. 　제12항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 　제14항에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체의 제조 방법으로서, 제15항에 기재된 숙주 세포를 배양하여 제조하는 방법.
  17. 삭제
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  21. IL-33 관련 질환의 예방, 치료 또는 완화용 의약 조성물로서,
    상기 조성물은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간 항 IL-33 중화 단일클론 항체를 포함하고,
    상기 IL-33 관련 질환은 IL-33의 과도한 세포 외 방출에 의해 야기되며,
    IL-33 관련 질환이 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 쇼크, 부비강염, 크론병, 궤양성 대장염, 관절염, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 피부 경화증(scleroderma), 강직성 척추염, 간 섬유증, 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 신손상(acute kidney injury), 혈관염, 암 및 쇼그렌 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는, 의약 조성물.
  22. 삭제
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