KR102399028B1 - 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 친화성으로 제1 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 폴리펩티드(예: 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드)를 제공한다. 본 발명은 또한 HER2에 특이적으로 결합하고 HER2 활성화를 길항시키는 신규한 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 이러한 항원 결합 폴리펩티드를 제조하기 위한 숙주 세포를 제공한다. 질환(예: 암)을 치료하기 위해 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 사용하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다.

Description

이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드 {BI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING POLYPEPTIDES}
관련 출원
본 출원은 2014년 3월 21일자로 출원된 미국 가출원 제61/968,437호의 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원의 내용은 이의 전체가 참조로서 도입된다.
이중-특이적 항원 결합 폴리펩티드, 예를 들면, 항체 및 항체-유사 분자는 복수의 항원을 동시에 표적화하는 이들의 능력에 기인하여 치료제로서 큰 기대를 유지한다. 그러나, 이들 분자의 제조가 과제이다. 이중-특이적 항체의 경우에는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 페어링 오류(mis-pairing)가 종종 제조 동안에 발생하고, 이는 이중-특이적 항체의 수율을 감소시키고 정제를 곤란하게 한다.
이중-특이적 항체의 제조와 연관된 문제를 극복하기 위해, 항체 불변 또는 가변 영역에서 복잡한 유전자조작이 시도되어 왔다. 예를 들면, 개개 항체의 VH 및 VL이 링커를 통해 유전적으로 융합되어 있는 이중-특이적 항체가 생성되어 왔다[참조: US2010/0254989A1]. 또 다른 접근법에서, 개개 항체는 Fab 교환을 담당하는 인간 IgG4의 잔기에서 Fc의 돌연변이로 생성되어 왔다[참조: Van der Neut at al., Science (2007) 317: 1554]. 또 다른 접근법에서, 마우스 쿼드로마(quadromas)가 이중-특이적 항체를 생성하기 위해 사용되었다. 이러한 접근법에서, 마우스 및 랫트 항체는 주로 본래 VH/VL 페어링을 형성하고, 이중-특이적 항체는 랫트 및 마우스 Fc로 구성된다[참조: Lindhofer et al., J Immunol. (1995) 155: 1246 - 252). 마지막으로, 항원 결합에 관여하지 않는 단일 공통 경쇄를 사용하는 이중-특이적 항체가 생성되어 왔다[참조: Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16: 677-681]. 그러나, 이들 광범위한 항체 유전자조작 노력에도 불구하고, 이중-특이적 항체는 불충분한 안정성 및 낮은 기능적 발현 수율로 계속 시달리고 있다.
따라서, 당해 기술분야에서는 고도로 발현되고 용이하게 정제되는 신규한 항원-결합 폴리펩티드가 요구되고 있다.
본 발명은 고도로 발현되고 용이하게 정제되고 고도로 안정하고 이들의 표적 항원에 대해 높은 친화성을 갖는 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 상기 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 높은 친화성으로 PDGFRβ 및 HER2 둘 다에 결합하고, PDGFRβ 및 HER2 활성을 둘 다 길항시킨다. 특정한 실시형태에서, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 높은 친화성으로 PDGFRβ 및 VEGF 둘 다에 결합하고, PDGFRβ 및 VEGF 활성을 길항시킨다. 본 발명은 또한 HER2에 특이적으로 결합하고 HER2 활성화를 길항시키는 신규한 항원-결합 폴리펩티드(예: VH 도메인)를 제공한다. 이러한 항원-결합 폴리펩티드는 특히 암의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 이러한 항원-결합 폴리펩티드를 제조하기 위한 숙주 세포를 제공한다. 질환(예: 암)을 치료하기 위해 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 사용하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다.
따라서, 한 가지 측면에서 본 발명은, 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 VH 도메인에 C-말단 연결된, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 포함하는 단리된 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 항체 경쇄를 포함하지 않는, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 상기 항체 중쇄는 아미노산 링커를 통해 제2 VH 도메인에 유전적으로 연결되어 있다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 링커는 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 항원에 특이적으로 결합하는 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 추가로 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄는 자연적으로 페어링되어 있다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 VL 도메인은 제1 항원에 결합한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 VL 도메인은 제3 항원에 결합한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제3 항원은 동일한 분자의 상이한 영역내에 존재한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제3 항원은 상이한 분자 상에 존재한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 2개 항원-결합 폴리펩티드의 이량체를 포함하고, 상기 2개 항원-결합 폴리펩티드가 중쇄 불변 영역을 통해 자연적으로 이량체화되어 있는 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 항원은 상이하다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 항원은 동일한 분자의 상이한 영역내에 존재한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 항원은 상이한 분자 상에 존재한다.
특정한 실시형태에서, 상기 제1 항원은 인간 PDGFRβ 또는 HER2이다. 특정한 실시형태에서, 상기 제2 항원은 인간 PDGFRβ 또는 HER2이다.
특정한 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 VH 도메인을 포함하고, 서열번호 1, 4, 7 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 2, 5, 8 또는 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 3, 6, 9 또는 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, VH 도메인 아미노산 서열은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 도메인 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 특정한 실시형태에서, VH 도메인은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 VH 도메인을 포함하고, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 18 또는 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 VL 도메인을 포함하고, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1, 4, 7 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단리된 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 상기 항원-결팝 폴리펩티드는 서열번호 1, 4, 7 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 2, 5, 8 또는 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 3, 6, 9 또는 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인과 동일한 HER2 상의 에피토프에 결하하는 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 VH 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인과 HER2 결합에 대해 경쟁하는 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 VH 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 항원-결합 폴리펩티드가 상기 숙주 세포에 의해 생성되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 암(예: 유방암 및 난소암)이다.
도 1은 본 발명의 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 개략도이다.
도 5는 환원 및 비-환원 조건하에 본 발명의 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 6은 HEK293 세포 배양 상청액에서 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 발현을 검출하는 ELISA 검정의 결과를 나타낸다.
도 7은 HER2 및 PDGFRβ에 대한 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 동시 결합을 측정하는 ELISA 검정의 결과를 나타낸다.
도 8은 세포 표면 발현된 HER2 및 PDGFRβ에 대한 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 동시 결합을 측정하는 FACS-기반 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 9는 본원에 개시된 예시적 항-HER2 VH 도메인의 바이아코어(Biocore) 및 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
도 10은 본원에 개시된 예시적 항-HER2 VH 도메인 및 scFv 유도체의 바이아코어 및 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
도 11은 항-HER2 VH B12, 트라스투주맙, 퍼투주맙 및 이들의 조합이 SK-BR-3 세포의 증식에 미치는 효과를 측정하는 MTS 세포 증식 검정의 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 예시적 항-HER2 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 개략도이다.
본 발명은 고도로 발현되고 용이하게 정제되고 고도로 안정하고 이들의 표적 항원에 대해 높은 친화성을 갖는 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 상기 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 높은 친화성으로 PDGFRβ 및 HER2 둘 다에 결합하고, PDGFRβ 및 HER2 활성을 둘 다 길항시킨다. 특정한 실시형태에서, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 높은 친화성으로 PDGFRβ 및 VEGF 둘 다에 결합하고, PDGFRβ 및 VEGF 활성을 길항시킨다. 본 발명은 또한 HER2에 특이적으로 결합하고 HER2 활성화를 길항시키는 신규한 항원-결합 폴리펩티드(예: VH 도메인)를 제공한다. 이러한 항원-결합 폴리펩티드는 특히 암의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 이러한 항원-결합 폴리펩티드를 제조하기 위한 숙주 세포를 제공한다. 질환(예: 암)을 치료하기 위해 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 사용하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다.
I. 정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정한 용어가 먼저 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PDGFRβ"는 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타를 지칭한다. PDGFRβ 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적 인간 PDGFRβ 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI:4505683에 기재되어 있고, 예시적 마우스 PDGFRβ 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI:226371752로 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "HER2"는 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-2를 지칭한다. HER2 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적 인간 HER2 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI:54792096에 기재되어 있고, 예시적 마우스 HER2 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI:54873610에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF"는, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, 단백질, 및 VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189 및 VEGF206을 포함한 이들의 스플라이싱 변이체를 포함하는 혈관 상피 성장 인자 패밀리의 모든 구성원을 지칭한다. VEGF 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적 인간 VEGF 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI:32699990에 기재되어 있고, 예시적 마우스 VEGF 아미노 서열은 GenBank 기탁 GI: GI:160358815에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드"는 동시에 2개 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항원-결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 결합 부위 또는 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 쇄, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄 뿐만 아니라 이들의 다량체(예: IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(약어 VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(약어 VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역으로 불리우는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 프레임워크 영역(FR)으로 불리우는, 보다 보존된 영역과 함께 산재될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연의, 효소에 의해 수득할 수 있는, 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 임의의 적합한 표준 기법, 예를 들면, 단백질분해 소화 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 부분의 비제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변성 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위(예: 단리된 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들면, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 및 미니바디가 또한 표현 "항원-결합 부분" 내에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인" 및 "VL 도메인"은 각각 FR(프레임워크 영역) 1, 2, 3 및 4 및 CDR(상보성 결정 영역) 1, 2 및 3을 포함하는 단일 항체 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 지칭한다[참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda)].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 이량체화된"은, 중쇄 불변 영역이 천연-존재 사량체 항체 분자와 동일한 방식으로 연관되어 있는 항원 결합 폴리펩티드의 이량체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 페어링"은 천연-존재 사량체 항체 분자와 동일한 방식으로 천연 중쇄/경쇄 상호작용 계면을 통해 연관되어 있는 항체 중쇄 및 경쇄 쌍을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 불연속 항원 결합 부위를 의미한다. 이들 특정 영역은 문헌[참조: Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977). Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), and by MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있고(이들 각각은 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다), 여기서 상기 정의는 서로에 대해 비교하는 경우 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 각각의 상기 인용된 참조문헌에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 기재되어 있다. 바람직하게는, 용어 "CDR"은 서열 비교에 기반하여 카뱃(Kabat)에 의해 정의된 CDR이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크(FR) 아미노산 잔기"는 면역글로불린 쇄의 프레임워크 영역 중의 아미노산을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 가변 영역의 일부이지만 CDR의 일부가 아닌 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, CDR의 카뱃 정의 사용).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전적으로 연결된"은 재조합 DNA 기술을 사용하는 2개 이상의 폴리펩티드의 연결을 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 이는 2개 이상의 폴리펩티드의 융합을 코딩하는 키메라 유전자의 생성을 수반한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "~에 특이적으로 결합하는"는 적어도 약 1×10-6M, 1×10-7M, 1×10-8M, 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M, 1×10-12M 또는 그 이상의 Kd로 항원에 결합하고/하거나 비특이적 항원에 대한 이의 친화성보다 적어도 2배 큰 친화성으로 항원에 결합하는 결합 폴리펩티드의 능력을 지칭한다. 그러나, 이는 결합 폴리펩티드가 서열에서 관련되는 2개 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 인간 항원 및 상기 항원의 비-인간 오솔로그 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이것이 결합되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 환상 이본쇄 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정한 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제 기원 및 에피좀 포유동물 벡터를 갖는 세균 벡터). 다른 벡터(예: 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 이러한 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 이는 이 용어가 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것을 의도하는 것으로 이해되어야 한다. 특정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향 때문에 수대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PDGFRβ-연관 질환 또는 장애"는 PDGFRβ 활성과 연관된 질환 상태 및/또는 증상을 포함한다. 예시적 PDGFRβ-연관 질환 또는 장애는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 연령-관련 황반 변성(AMD) 및 암을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "HER2-연관 질환 또는 장애"는 HER2 활성과 연관된 질환 상태 및/또는 증상을 포함한다. 예시적 HER2-연관 질환 또는 장애는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 암(예: 유방암 및 난소암)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF-연관 질환 또는 장애"는 VEGF 활성과 연관된 질환 상태 및/또는 증상을 포함한다. 예시적 VEGF-연관 질환 또는 장애는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈관신생, 예를 들면, 연령-관련 황반 변성(AMD) 및 암과 연관된 상태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기재된 치료 또는 예방 수단을 지칭한다. "치료"의 방법은, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 중증도를 예방, 치유, 지연, 감소시키거나 이를 완화시키기 위해 또는 이러한 치료의 부재하에 예상되는 것을 초과하여 대상체의 생존율을 연장시키기 위해, 대상체, 예를 들면, 질환 또는 장애(예: 암)를 갖거나 질환 또는 장애를 갖는 성향이 있는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분의 투여를 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은, 대상체에게 투여하는 경우, 질환 또는 장애의 치료, 예후 또는 진단을 실시하기에 충분한 결합 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 치료되는 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여 용량은, 예를 들면, 본 발명에 따른 결합 폴리펩티드 약 1ng 내지 약 10,000mg, 약 1㎍ 내지 약 5,000mg, 약 1mg 내지 약 1,000mg 또는 약 10mg 내지 약 100mg의 범위일 수 있다. 용량 섭생은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 유효량은 또한 결합 폴리펩티드의 임의의 독성 또는 유해 효과(즉, 부작용)이 최소화되고/되거나 유리한 효과가 상회하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
II. 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드
한 가지 측면에서, 본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하고 HER2 활성을 억제하는 항원-결합 폴리펩티드(예: 이중-특이적 항원 결합 폴리펩티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 제공한다. 이러한 결합 폴리펩티드는 HER2-연관 질환 또는 장애(예: 암, 예를 들면, 유방암 및 난소암)을 치료하는데 특히 유용하다.
일반적으로, 본 발명의 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 HER2에 특이적으로 결합하는 중쇄 CDR3(HCDR3) 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩티드에 사용하기에 적합한 비제한적 HCDR3 서열은 서열번호 1, 4,7 또는 10에 기재된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, HCDR3 서열은 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 대하여 적어도 하나(예: 1개, 2개, 3개 등)의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1, 4, 7 또는 10의 변이체이다.
본원에 개시된 HER2-결합 HCDR3 서열을 도입할 수 있는 임의의 폴리펩티드는 제한 없이 이의 항체 또는 단편(예: VH 도메인) 및 면역글로불린-유사 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 면역글로불린-유사 도메인은, 제한 없이, 피브로넥틴 도메인[참조: Koide et al. (2007), Methods Mol . Biol . 352: 95-109, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], DARPin[참조: Stumpp et al. (2008) Drug Discov . Today 13 (15-16): 695-701, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 단백질 A의 Z 도메인[참조: Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 리포칼린[참조: Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 아필린[참조: Ebersbach et al. (2007) J . Mol . Biol . 372 (1): 172-85, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 아피틴[참조: Krehenbrink et al. (2008). J . Mol . Biol . 383 (5): 1058-68, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 아비머[참조: Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol . 23 (12): 1556-61, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 피노머[참조: Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드[참조: Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 예시적 CDR 및 VH 도메인 아미노산 서열은 본원에서 표 1 및 2에 기재되어 있다.
예시적 항-HDR2 VH 도메인의 CDR 아미노산 서열
클론
명칭 		CDR3 서열
번호 		CDR2 서열
번호 		CDR1 서열
번호
B8 WARGSTSPHGLDV 1 WMGWMNPKSGGTYYAQKFQG 2 GNYMH 3
B12 DPRAATFDY 4 WINPNSGGTYYAQKLQG 5 GYYMH 6
E5 GYGGSGSYLFDY 7 GINWNGGSTGYADSVKG 8 DYGMS 9
H6 GFGGNGSYTTPL 10 GINWNGGSTGYADSVKG 11 DYGMS 12
예시적 항-HER2 VH 도메인의 아미노산 서열
클론
명칭 		VH 아미노산 서열 서서열번 호
B8 EVQLVESGAEVKEPGASVKVSCKSSGYSFTGNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPKSGGTYYAQKFQGRVTMTWDTSISTAYMELSGLTSDDTAVYYCARWARGSTSPHGLDVWGQGTLVTVSS 13
B12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPRAATFDYWGQGTLVTVSS 14
E5 QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARGYGGSGSYLFDYWGQGTLVTVSS 15
H6 QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNFLYLQMNSLRAEDTALYHCARGFGGNGSYTTPLRGQGTMVTVSS 16
특정한 실시형태에서, 항-HER2 VH 도메인은, 표 1에 기재된 중쇄 HCDR2 또는 HCDR1 아미노산 서열 중의 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 HCDR2 및/또는 HCDR1 서열과 함께, 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 기재된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 각각 서열번호 1, 2 및 3; 4, 5 및 6; 7, 8 및 9; 및 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 13, 14, 15 또는 16에 기재된 VH 아미노산 서열 중의 적어도 하나를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 CDR 영역 아미노산 서열은 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환(예: 1, 2, 3, 4 또는 5개 보존적 아미노산 치환)을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 동일한 부류의 아미노산에 의해 한 부류 중의 아미노산의 치환을 포함하고, 여기서 부류는, 예를 들면, 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 측정된 바와 같이, 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서 공통 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6개 일반적 부류는 분류되었고, 다음을 포함한다: 부류 I(Cys); 부류 II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III(Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV(His, Arg, Lys); 부류 V(Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI(Phe, Tyr, Trp). 예를 들면, Asp를 또 다른 부류 III 잔기, 예를 들면, Asn, Gln 또는 Glu로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 따라서, 항-PDGFRβ 항체에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 부류의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 배제하지 않는 아미노산 보존적 치환을 동정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), 각각은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다].
특정한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 13, 14, 15 또는 16에 기재된 VH 영역 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 및/또는 VL 영역 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 1.2nM의 Kd로 HER2에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 1,39×105 M-1s-1의 온(on)-속도로 HER2에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 1.67×104 s-1의 오프(off)-속도로 HER2에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 scFv 분자로서 포맷하는 경우 0.87nM의 Kd로 HER2에 결합한다.
특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 트라스투주맙(CAS# 180288-69-1) 및/또는 퍼투주맙(CAS# 380610-27-5)과는 상이한 HER2 상의 에피토프에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙과 동일한 HER2 상의 에피토프에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙과 함께 HER2에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
특정한 실시형태에서, 본원에 개시된 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 HER2에 결합하면 내재화된다. 한 가지 특정 실시형태에서, 내재화 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드는 세포독성 부분(예: 항암제)에 연결된다. 적합한 비제한적 세포독성 부분은 본원에 개시되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER2 상의 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 서열번호 13, 14, 15 또는 16에 기재된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드와 교차 경쟁하는 항-HER2 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 항체는, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(SPR)-기반 경쟁 검정을 포함하는 통상의 경쟁 결합 검정을 사용하여 동정할 수 있다.
III. 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 임의의 2개 항원은 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 사용하여 표적화할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 VH 도메인에 연결된다.
항체 중쇄는 당해 기술분야에서 인식되는 수단(화학적 및/또는 유전적)을 사용하여 제2 VH 도메인에 연결될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 항체 중쇄 및 제2 VH 도메인은 유전적으로 연결되어 있다. 한 가지 실시형태에서, 항체 중쇄의 C-말단 아미노산은 제2 VH 도메인의 N-말단 아미노산에 연결된다. 이러한 연결은 직접 또는 링커를 통해 이루어질 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 항체 중쇄는 서열번호 23에 기재된 서열을 포함하는 아미노산 링커를 통해 제2 VH 도메인의 N-말단 아미노산에 연결된다.
특정한 실시형태에서, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 각각의 항체 중쇄가 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인을 포함하는 2개의 항체 중쇄의 이량체이고, 여기서 각각의 항체 중쇄는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 VH 도메인에 연결된다. 이량체 중의 2개 항체 중쇄는 이러한 연관이 천연에 존재하는 사량체 항체 분자에서 발생하는 것과 동일한 방식으로 천연 중쇄 이량체 계면을 통해 연관된다. 이러한 구조를 갖는 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 본원의 도 2 및 3에 도시되어 있다.
특정한 실시형태에서, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 항체 경쇄를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 경쇄는 이러한 페어링이 천연에 존재하는 사량체 항체 분자에서 발생하는 것과 동일한 방식으로 천연 경쇄/중쇄 이량체 계면을 통해 중쇄와 자연적으로 페어링된다. 이러한 예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 본원의 도 1 및 4에 도시되어 있다.
제1 및 제2 항원은 동일하거나 상이할 수 있다. 항원이 상이한 경우, 이들은 동일한 분자의 상이한 영역에 또는 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제1 및 제2 항원은 세포 표면 수용체이다. 특정한 실시형태에서, 제1 항원은 PDGFRβ 또는 HER2(예: 인간 PDGFRβ 또는 HER2)이다. 특정한 실시형태에서, 제2 항원은 PDGFRβ 또는 HER2(예: 인간 PDGFRβ 또는 HER2)이다. 한 가지 특정 실시형태에서, 제1 항원은 PDGFRβ이고, 제2 항원은 HER2이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 제1 항원은 HER2이고, 제2 항원은 PDGFRβ이다.
특정한 실시형태에서, 하나의 항원(제1 또는 제2 항원)은 세포 표면 수용체이고, 하나의 항원(제1 또는 제2)은 리간드(예: 성장 인자, 예를 들면, VEGF, PDGF 또는 EGF)이다. 특정한 실시형태에서, 제1 항원은 PDGFRβ 또는 VEGF(예: 인간 PDGFRβ 또는 VEGF)이다. 특정한 실시형태에서, 제2 항원은 PDGFRβ 또는 VEGF(예: 인간 PDGFRβ 또는 VEGF)이다. 한 가지 특정 실시형태에서, 제1 항원은 PDGFRβ이고, 제2 항원은 VEGF이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 제1 항원은 VEGF이고, 제2 항원은 PDGFRβ이다. 이러한 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 PDGFRβ-연관 및 VEGF-연관 장애, 예를 들면, AMD 및 암의 치료에 특히 유용하다.
제1 및 제3 항원은 동일한 분자의 상이한 영역 내에 또는 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 경쇄는 제1 항원에 결합하고, 종쇄 및 경쇄는 제2 항원에 대한 단일 결합 부위를 생성하도록 협동한다. 특정한 실시형태에서, 경쇄는 제3 항원에 결합한다. 제1, 제2 및 제3 항원이 상이한 경우, 이는 3개 특이성을 갖는 항원-결합 폴리펩티드의 생성을 가능하게 하는 것에 유의해야 한다. 이러한 분자는 또한 본 발명에 포함된다.
임의의 항체 중쇄, 경쇄, VH 도메인, VL 도메인 또는 CDR 아미노산 서열은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드에 사용할 수 있다. 예시적 항체 중쇄, 경쇄, VH 도메인, VL 도메인 및 CDR 아미노산 서열은 본원의 표 1 내지 4에 기재되어 있다.
특정한 실시형태에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드는 본원에 개시된 항-PDGFRβ VH 도메인(예: 서열번호 24에 기재된 바와 같음) 및 EGFR 패밀리 수용체 단백질에 결합하는 항체의 VH 및 VL 도메인(예: EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4)을 포함한다. VH 및 VL 도메인이 수득될 수 있는 적합한 치료 항체는, 제한 없이, 트라스투주맙(CAS# 180288-69-1), 퍼투주맙(CAS# 380610-27-5) 및 세투주맙(CAS# 205923-56-4)을 포함한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드는 도 4에 기재된 바와 같이 포맷된다.
특정한 실시형태에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드는 본원에 개시된 항-HER2 VH 도메인(예: 서열번호 13 내지 16에 기재된 것들) 및 EGFR 패밀리 멤버에 결합하는 항체의 VH 및 VL(예: EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4)를 포함한다. VH 및 VL 도메인이 수득될 수 있는 적합한 치료 항체는, 제한 없이, 트라스투주맙(CAS# 180288-69-1), 퍼투주맙(CAS# 380610-27-5) 및 세툭시맙(CAS# 205923-56-4)을 포함한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드는 도 12에 기재된 바와 같이 포맷된다.
예시적 항-PDGFRβ VH 및 VL 도메인의 CDR, VH 및 VL 아미노산 서열
식별자 아미노산 서열 서열번호
XB2202 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSS 24
XB2202 HCDR3 HGGDRSY 25
XB2202 HCDR2 GILPILKTPNYAQRFQG 26
XB2202 HCDR1 RHAIS 27
A4 VL DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYEASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYNNVLRTFGQGTKVEIK 28
A4 LCDR3 QQYNNVLRT 29
A4 LCDR3 EASNLET 30
A4 LCDR3 QASQDISNWLN 31
예시적 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
클론
명칭 		아미노산 서열
(신호 서열은 밑줄로 되어 있음) 		서열번호
포맷at -1 및 2
중쇄
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGAEVKEPGASVKVSCKSSGYSFTGNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPKSGGTYYAQKFQGRVTMTWDTSISTAYMELSGLTSDDTAVYYCARWARGSTSPHGLDVWGQGTLVTVSS 17
포맷-1 및 2
중쇄
- 신호 서열
QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGAEVKEPGASVKVSCKSSGYSFTGNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPKSGGTYYAQKFQGRVTMTWDTSISTAYMELSGLTSDDTAVYYCARWARGSTSPHGLDVWGQGTLVTVSS 18
포맷-3
중쇄
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVQLVESGAEVKEPGASVKVSCKSSGYSFTGNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPKSGGTYYAQKFQGRVTMTWDTSISTAYMELSGLTSDDTAVYYCARWARGSTSPHGLDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSS 19
포맷-3
중쇄
- 신호 서열
EVQLVESGAEVKEPGASVKVSCKSSGYSFTGNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPKSGGTYYAQKFQGRVTMTWDTSISTAYMELSGLTSDDTAVYYCARWARGSTSPHGLDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSS 20
Figure 112016100344115-pct00001
특정한 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인 및/또는 제2 VH 도메인을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 VH 도메인은, 표 1에 기재된 중쇄 HCDR2 및/또는 HCDR1 아미노산 서열 중의 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 HCDR2 및/또는 HCDR1 서열과 함께, 서열번호 1, 4, 7 또는 10에 기재된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 VH 도메인은 각각 서열번호 1, 2 및 3; 4, 5 및 6; 7, 8 및 9; 및 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-HER2 VH 도메인은 서열번호 13, 14, 15 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인 및/또는 제2 VH 도메인을 포함한다. PDGFRβ에 결합하는 임의의 VH 도메인은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 적합한 VH 도메인은, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는, 2012년 12월 5일자로 출원된 미국 출원 제13/705,978호에 기재된 것들을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VH 도메인은 서열번호 25에 기재된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VH 도메인은 각각 서열번호 25, 26 및 27에 기재된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VH 도메인은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 VL을 포함한다. PDGFRβ에 결합하는 임의의 VL 도메인이은 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 적합한 VL 도메인은 2012년 12월 5일자로 출원된 미국 특허원 제13/705,978호에 기재된 것들을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VH 도메인은 서열번호 25에 기재된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VL 도메인은 각각 서열번호 29, 30 및 31에 기재된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항-PDGFRβ VL 도메인은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
한 가지 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 18 또는 20에 기재된 중쇄를 포함한다.
한 가지 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 22에 기재된 항체 경쇄를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 적어도 하나 이상의 보존적 아미노산 치환체(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 등, 보존적 아미노산 치환체)를 포함하는 하나 이상의 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환체는 동일한 부류의 아미노산에 의한 한 부류의 아미노산의 치환을 포함하고, 여기서 부류는, 예를 들면, 표준 데이호프 빈도 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 측정된 바와 같이, 천연에서 발견된 상동성 단백질에서 공통 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 고도의 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6개 일반 부류는 분류되어 있고, 다음을 포함한다: 부류 I(Cys); 부류 II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III(Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV(His, Arg, Lys); 부류 V(Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI(Phe, Tyr, Trp). 예를 들면, 또 다른 부류 III 잔기, 예를 들면, Asn, Gln 또는 Glu를 Ap로의 치환은 보존적 치환이다. 따라서, 항-PDGFRβ 항체에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 부류의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 배제하지 않는 아미노산 보존적 치환을 동정하는 방법은 당해 기술분야에 공개되어 있다[참조: Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), 각각은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다].
특정한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다.
IV. 변형된 항원-결합 폴리펩티드
특정한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 하나 이상의 변형체를 포함한다. 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 변형된 형태는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
i) 면역원성 감소
특정한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드(예: 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 당해 기술분야에서 인식된 기술을 사용하여 이들의 면역원성을 감소시키기 위해 변형된다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 키메라화, 인간화 및/또는 탈면역화 (de-immunize)될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라일 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래하는 항체, 예를 들면, 마우스 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; and 4,816,397, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]. "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술[참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)]은 상기 분자의 합성을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 마우스 항-PDGFRβ 항체 분자의 결합 특이성을 코딩하는 유전자 서열은 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 서열과 함께 융합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래하는 분자, 예를 들면, 마우스 모노클로날 항체 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 것들, 예를 들면, 인간화된 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간화된다. 인간화된 항체는 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 항체 분자로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 결합 특이성을 갖는다. 종종, 인간 프레임워크 영역 중의 프레임워크 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변화 및 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이들 프레임워크 치환은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 특정 부분에서 이상 프레임워크 잔기를 동정하기 위해 항원 결합 및 서열 비교에 중유한 프레임워크 잔기를 동정하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 동정된다[참조: Queen et al., 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이는 이들의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]. 항체는, 예를 들면, CDR-그래프팅(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호, 이는 이들의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다], 베니어링 또는 재표면화[참조: EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994), 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다] 및 쇄 셔플링[U.S. 특허 제5,565,332호, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 탈-면역화는 PDGFRβ 항원-결합 폴리펩티드(예: 항체 또는 이의 항원 결합 부분)의 면역원성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "탈-면역화"는 T 세포 에피토프를 변형시키기 위해 폴리펩티드(예: 항체 또는 이의 항원 결합 부분)의 변화를 포함한다[참조: WO9852976A1, WO0034317A2, 이는 이들의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]. 예를 들면, 본 발명의 출발 PDGFRβ-특이적 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터의 VH 및 VL 서열을 분석하고, 인간 T 세포 에피토프 "맵"을 서열 내의 상보성-결정 영역(CDR) 및 기타 키 잔기와 관련하여 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 영역으로부터 생성할 수 있다. T 세포 에피토프 맵으로부터의 개개 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성을 변화시키는 위험이 낮은 대체 아미노산 치환체를 동정하기 위해 분석할 수 있다. 아미노산 치환체의 조합을 포함하는 대체 VH 및 VL 서열의 범위이 설계되고, 이들 서열은 후속적으로 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드의 범위에 도입되며, 이어서 기능에 대해 시험된다. 이어서, 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터에 클로닝되고, 후속 플라스미드는 전체 항체의 생성을 위한 세포주에 도입된다. 이어서, 항체를 적절한 생화학적 및 생물학적 검정으로 비교하고, 최적 변이체를 동정한다.
ii) 효과기 기능 및 Fc 변형
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 일반적으로 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 항체 불변 영역(예를 들면, IgG 불변 영역, 예를 들면, 인간 IgG 불변 영역, 예를 들면, 인간 IgG1, 2, 3 또는 4 불변 영역)을 포함한다. 예를 들면, 항체 불변 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화(opsonisation) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민증에 관여할 수 있다. 추가로, 항체는, 세포 상에서 Fc 수용체(FcR)에 대한 항체 Fc 영역 결합에 대한 Fc 수용체 결합 부위와 함께, Fc 영역을 통해 다양한 세포 상의 수용체에 결합한다.
IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 포함하는 상이한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 흡입 및 파괴, 면역 복합체의 정화, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체 의존성 세포-매개된 세포독성 또는 ADCC라 함), 염증 매개인자의 방출, 면역글로불린 생성의 태반 전이 및 조절을 포함하는 다수의 중요한 및 다양한 생물학적 반응을 유발한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드(예: 항체 또는 이의 항운 결합 단편)은 Fc-감마 수용체에 결합한다. 대체 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 하나 이상의 효과기 기능(예: ADCC 활성)이 전혀 없고/없거나 Fcγ 수용체에 결합할 수 없는 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는, 하나 이상의 불변 영역 도메인 중의 적어도 하나의 아미노산이 결실 또는 달리는 변화되어 감소된 또는 증강된 효과기 기능, 비-공유적으로 이량체화되는 능력, 종양의 부위에서 국지화하는 증가된 능력, 감소된 혈청 반감기, 또는 대략 동일한 면역원성의 전체의 변화되지 않은 항체와 비교할 때에 증가된 혈청 반감기를 제공하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 본원에 기재된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정한 항체 또는 이의 단편은 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 쇄를 포함하지만 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부를 결여하는 도메인 결실된 항체이다. 예를 들면, 특정한 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 수 있고, 예를 들면, CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다.
특정한 다른 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 상이한 항체 이소형으로부터 유래하는 불변 영역(예: 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중의 2개 이상으로부터의 불변 영역)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 키메라 힌지(예: 상이한 항체 이소형의 힌지 도메인, 예를 들면, IgG4 분자의 상부 힌지 도메인 및 IgG1 중간 힌지 도메인으로부터 유래하는 힌지 부분을 포함하는 힌지)를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 상기 분자의 코어 힌지 영역에 인간 IgG4 분자 및 Ser228Pro 돌연변이(EU 넘버링)로부터의 Fc 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
특정한 실시형태에서, Fc 부분은 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 효과기 기능을 증가시키거나 감소시키기 위해 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 기타 수단을 통해)는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시키고, 이에 의해 종양 국지화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 저하시키고, 따라서 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 연관을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 다른 변형은, 증가된 항원 특이성 또는 가요성에 기인하여 증강된 국지화를 가능하게 하는 디설파이드 연결 또는 올리고당 부분을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 수득되는 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 변형체의 기타 생화학적 효과, 예를 들면, 종양 국지화, 생체분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 공지된 면역학적 기술을 사용하여 용이하게 측정 및 정량화할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 항체에 사용된 Fc 도메인은 Fc 변이체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 변이체"는 Fc 도메인이 유래되는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인을 지칭한다. 예를 들면, Fc 도메인이 인간 IgG1 항체로부터 유래하는 경우, 상기 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fc 변이체는 상기 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
Fc 변이체의 아미노산 치환(들)은 Fc 도메인 내의 임의의 위치(즉, 임의의 EU 규칙 아미노산 위치)에 위치할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, Fc 변이체는 힌지 도메인 또는 이의 일부에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 CH2 도메인 또는 이의 일부에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 CH3 도메인 또는 이의 일부에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CH4 도메인 또는 이의 일부에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 효과기 기능 및/또는 FcR 결합의 개선(예: 감소 또는 증강)을 부여하는 것으로 공지되어 있는 당해 기술분야에서 인식되는 임의의 Fc 변이체를 사용할 수 있다. Fc 변이체는, 예를 들면, 이의 전체가 각각 본원에서 참조로서 도입되는, 국제 PCT 공보 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호 및 제7,083,784호에 개시된 아미노산 치환 중의 어느 하나를 포함할 수 있다. 한 가지 예시적 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 EU 위치 268(예: H268D 또는 H268E)에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 EU 위치 239(예: S239D 또는 S239E) 및/또는 EU 위치 332(예: I332D 또는 I332Q)에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 항원-독립적 효과기 기능, 특히 결합 폴리펩티드의 순환 반감기를 변화시키는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 항원-결합 폴리펩티드는, 이들 치환을 결여하는 항원-결합 폴리펩티드로 비교하는 경우, FcRn에 대한 증가된 또는 감소된 결합을 나타내고, 따라서 각각 혈청에서 증가된 또는 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 개선된 친화성을 갖는 Fc 변이체는 보다 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 예상되고, 이러한 분자는, 예를 들면, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된 항원-결합 폴리펩티드의 긴 반감기가 요구되는 경우, 포유동물의 치료 방법에서 유용한 용도를 갖는다. 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 보다 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되고, 이러한 분자는 또한, 예를 들면, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 포유동물에 대한 투여, 예를 들면, 생체내 진단 영상화를 위해, 또는 출발 항체가 연장된 기간 동안 순환에 존재하는 독성 부작용을 갖는 상황에서 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 또한 태반을 통과할 가능성이 적고, 따라서 또한 임신 여성에서 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 또한, 감소된 FcRn 결합 친화성이 요구될 수 있는 다른 용도는 뇌, 신장 및/또는 간의 국지화가 요구되는 용도들을 포함한다. 한 가지 예시적 실시형태에서, 본 발명의 변화된 항원-결합 폴리펩티드는 혈관으로부터 신장 사구체의 상피를 통한 감소된 수송을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 변화된 항원-결합 폴리펩티드는 뇌로부터 혈관 공간으로 혈액 뇌 관문(barrier)(BBB)을 통한 감소된 수송을 나타낸다. 한 가지 실시형태에서, 변화된 FcRn 결합을 갖는 항체는 Fc 도메인의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인을 포함한다. FcRn 결합 루프는 아미노산 잔기 280 내지 299(EU 넘버링에 따라)로 구성되어 있다. FcRn 결합 활성을 변화시킨 예시적 아미노산 치환은 본원에서 참조로서 도입되는 국제 PCT 공개번호 제WO05/047327호에 개시되어 있다. 특정한 예시적 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 하기 치환 중의 하나 이상을 갖는 Fc 도메인을 포함한다: V284E, H285E, N286D, K290E 및 S304D (EU 넘버링).
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드는 글리코실화를 감소 또는 배제하기 위해 변화되는 불변 영역, 예를 들면, IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 또한 항체 Fc의 글리코실화를 변화시키는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 변이체는 감소된 글리코실화(예: N- 또는 O-연결된 글리코실화)를 가질 수 있다. 예시적 실시형태에서, Fc 변이체는 아미노산 위치 297(EU 넘버링)에서 통상 발견된 N-연결된 글리칸의 감소된 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 글리코실화 모티브, 예를 들면 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 함유하는 N-연결된 글리코실화 모티브의 근처 또는 중에 아미노산 치환을 갖는다. 특정한 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 아미노산 위치 299 (EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 변이체를 포함한다. 보다 특정한 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 S228P 및 T299A 돌연변이(EU 넘버링)를 포함하는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을 포함한다.
감소된 또는 변화된 글리코실화를 제공하는 예시적 아미노산 치환은, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 국제 PCT 공개공보 제WO05/018572호에 개시되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 글리코실화를 배제하기 위해 변형된다. 이러한 항원-결합 폴리펩티드는 "어글리(agly)" 항원-결합 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, "어글리" 항원-결합 폴리펩티드는 생체내에서 개선된 안전성 및 안정성 프로파일을 가질 수 있다. 예시적 어글리 항원-결합 폴리펩티드는, Fc-효과기 기능을 결여하여 PDGFRβ를 발현하는 정상 중요 기관에 대한 Fc 매개된 독성의 가능성을 배제하는 IgG4 항체의 비글리코실화된 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 변화된 글리칸을 포함한다. 예를 들면, 항원-결합 폴리펩티드는 Fc 영역의 Asn297에서 N-글리칸 상에 감소된 수의 푸코스 잔기를 가질 수 있고, 즉 비푸코실화된다. 또 다른 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fc 영역의 Asn297에서 N-글리칸 상에 변화된 수의 시알산 잔기를 가질 수 있다.
iii) 공유 결합
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는, 예를 들면, 결합 폴리펩티드가 이의 동족 에피토프에 결합하는 것을 공유 결합이 방해하지 않도록 결합 폴리펩티드에 대한 분자의 공유 결합에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 공지된 보호/차단 그룹, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의한 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 유도체화에 의해 변형될 수 있다. 임의의 다수의 화학적 변형은, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행할 수 있다. 추가로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 추가로 N- 또는 C-말단에서 재조합에 의해 폴리펩티드와 융합될 수 있거나, 기타 조성물에 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접합 포함)될 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사성핵종 또는 독소 등의 검출 검정 및 효과기 분자에서 표지로서 유용한 분자와 재조합에 의해 융합되거나 접합될 수 있다[참조: PCT 공개공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 396,387, 이들 각각은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다].
항원-결합 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생체내 반감기를 증가시키거나 면역검정에 사용하기 위해 이종성 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, PEG는 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드와 접합되어 이들의 생체체 반감기를 증가시킬 수 있다[참조: Leong, S. R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); or Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002), 이들은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다].
더욱이, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는, 이들의 정제 또는 검출을 촉진시키기 위해 마커 서열, 예를 들면, 펩티드와 융합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)에서 제공된 태그 등의 헥사-히스티딘 펩티드이고, 그 중에서도, 다수는 상업적으로 이용가능하다. 문헌[참조: Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) (이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다)]에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 인풀루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래하는 에피토프에 상응하는 "HA" 태그[참조: Wilson et al., Cell 37:767 (1984), 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다] 및 "flag" 태그를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 비-접합된 형태로 사용될 수 있거나, 예를 들면, 분자의 치료 특성을 개선시키고 표적 검출을 촉진시키거나 환자의 영상화 또는 치료를 위해, 적어도 하나의 다양한 분자에 접합될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는, 정제가 수행되는 경우, 정제 전후에 표지되거나 접합될 수 있다. 특히, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 치료제, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제 또는 PEG에 접합될 수 있다.
본 발명은 추가로 진단제 또는 치료제에 접합된 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 항원-결합 폴리펩티드는, 예를 들면, 소정 치료 및/도는 예방 섭생의 효능을 결정하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 면역 세포 장애(예: CLL)의 발증 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 항원-결합 폴리펩티드를 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사활성 물질, 다양한 양성자 방사 단층촬영을 사용한 양성자 방사 금속, 및 비방사활성 상자성 금속 이온을 포함한다[참조: 본 발명에 따른 진단제로서 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대한 미국 특허 제4,741,900호(이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다)]. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테아라제를 포함하고; 적합한 보결 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사활성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.
본원에 개시된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드는 세포독서(예: 방사선동위원소, 세포독성 약물 또는 독소) 치료제, 세포증식 억제제, 생물학적 독소, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제, 면역학적 활성 리간드(예: 림포카인, 또는 수득되는 분자가 T 세포 등의 신생물 세포 또는 효과기 세포 둘 다에 결합하는 기타 항체) 또는 PEG에 접합될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드는 종야 세포 성장을 감소시키는 분자에 접합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 개시된 조성물은 약물 또는 프로드러그에 커플링된 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 리신, 겔로닌, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소 등의 특정한 생물독소 또는 이들의 세포독성 단편에 접합된 항원-결합 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 사용하기 위해 접합되거나 접합되지 않은 항체의 선별은 암의 유형 및 단계, 보조 치료(예: 화학요법 또는 외부 방사선) 및 환자 상태에 의존할 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 본원의 교시에 비추어 이러한 선별을 용이하게 수행할 수 있음이 이해될 것이다.
이전 연구에서, 동위체로 표지된 항-종양 항체는 동물 모델 및 일부 경우에 인간에서 종양 세포를 파괴하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 예시적 방사성동위원소는 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re를 포함한다. 방사선핵종은 핵 DNA에서 복수의 쇄 절단을 유발하여 세포사를 유도하는 이온화 방사선을 생성함으로써 작용한다. 치료학적 접합체를 생성하기 위해 사용된 동위체는 통상 짧은 경로 길이를 갖는 고에너지 알파- 또는 베타-입자를 생성한다. 이러한 방사선핵종은 이들이 근접하여 위치하는 세포, 예를 들면, 접합체가 부착되거나 도입된 신생물 세포를 사멸시킨다. 이들은 비-국지화 세포에 대해 효과가 거의 없거나 전혀 없다. 방사선핵종은 본질적으로 비-면역원성이다.
V. 항원-결합 폴리펩티드의 발현
상기 기재된 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 제공하기 위해 단리된 유전자 물질의 조작 후, 상기 유전자는 통상, 항원-결합 폴리펩티드의 목적하는 양을 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포로 도입하기 위해 발현 벡터에 삽입된다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는, 목적하는 유전자를 세포 내로 도입하고 세포 내에서 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용된 벡터를 의미하기 위해 명세서 및 특허청구범위의 목적상 본원에서 사용된다. 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 일루어진 그룹으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 적합한 벡터는 선별 마커, 목적하는 유전자의 클로닝 및 진핵 세포 또는 세포에 도입 및/또는 복제되는 능력을 촉진시키는 적절한 제한 부위를 포함할 것이다.
다수의 발현 벡터 시스템이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 벡터의 한 가지 부류는 동물 바이러스, 예를 들면, 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 수반한다. 추가로, DNA가 이들의 염색체로 통합된 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양, 살생물제 내성(예: 항생물질) 또는 구리 등의 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 발현되는 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 추가의 요소는 또한 mRNA의 최적 합성에 필요할 수도 있다. 이들 요소는 신호 서열, 스플라이싱 신호, 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상술한 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게는 인간)와 함께 발현 벡터 내로 삽입된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 폴리시스트론 작제물을 사용하여 발현시킬 수 있다. 이러한 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 등의 목적하는 복수의 유전자 생성물은 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생성될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드의 비교적 높은 수준을 제공하기 위해 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 사용한다. 적합한 IRES 서열은, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 이러한 발현 시스템이 본원에 개시된 전체 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생성하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
보다 일반적으로, 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포는 형질전환시킬 수 있다. 숙주 세포 내로 플라스미드의 도입은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다양한 기술에 의해 달성할 수 있다. 이들은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 프로토플라스트 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로프(enveloped) DNA와의 세포 융합, 마이크로주사 및 무손상 바이러스에 의한 감염을 포함한다[참조: Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988), 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]. 가장 바람직하게는, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기천공에 의한 것이다. 형질전환된 세포를 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건하에 성장시키고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 검정한다. 예시적 검정 기술은 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA) 또는 형광-활성화된 세포 분류 분석(FACS), 면역조직화학 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은, 광범위한 측면에서, 유전자형을 변화시키고 결과적으로 수용자 세포에서의 변화를 제공하는 수용자 숙주 세포 내로 DNA의 도입을 지칭하는 것으로 사용된다.
이들 동일한 선상에서, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 코딩하는 벡터로 형질전환된 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 폴리펩티드의 단리를 위한 프로세스의 기재에 있어서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은, 달리 명백하게 특정하지 않는 한, 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 달리 말하면, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 원침된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드 발현에 사용된 숙주 세포주는 포유동물 기원의 것이고; 당해 기술분야의 숙련가는 본원에서 발현되는 목적하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 수 있다. 예시적 숙주 세포주는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁경부암), CVI(원숭이 신장주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), 293(인간 신장)을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 세포주는 이로부터 발현된 항체(예: PER.C6.RTM. (Crucell) 또는 FUT8-녹-아웃 CHO 세포주(Potelligent.RTM. Cells)(Biowa, Princeton, N.J.))의 변화된 글리코실화, 예를 들면, 비푸코실화를 제공한다. 한 가지 실시형태에서, NSO 세포가 사용될 수 있다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스, 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 입수가능하다.
시험관내 생성은 대량의 목적하는 폴리펩티드를 제공하기 위한 확장을 가능하게 한다. 조직 배양 조건하에 포유동물 세포 배양을 위한 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 에어리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁 배양 또는, 예를 들면, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정된 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요에 따라 및/또는 바람직한 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로즈 상에서의 크로마토그래피 및/또는 (면역-) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 또한 비-포유동물 세포, 예를 들면, 세균 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 단세포 비-포유동물 미생물, 예를 들면, 세균, 배양물 또는 발횰 성장시킬 수 있는 것들을 또한 형질전환시킬 수 있음이 이해될 것이다. 형질전환에 감수성인 세균은 엔테로박테리아세아에의 멤버, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 또는 살모넬라의 균주; 바실라세아에, 예를 들면, 바실루스 서브틸리스; 뉴모콕쿠스; 스트렙토콕쿠스 및 헤모필루스 인플루엔자를 포함한다. 추가로, 세균에서 발현되는 경우, 폴리펩티드는 내포체의 일부로 될 수 있음이 이해될 것이다. 폴리펩티드는 단리, 정제 및 이어서 기능성 분자 내로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물도 또한 사용할 수 있다. 다수의 기타 균주가 상업적으로 이용가능하지만, 사카로마이세스 세레비지아에 또는 통상의 빵 효모는 가장 통상적으로 사용되는 진핵 미생물이다. 사카로마이세스에서 발현시키기 위해, 플라스미드 YRp7[참조: Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980), 이들 각각은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]가 통상 사용된다. 이 플라스미드는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여하는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1[참조: Jones, Genetics, 85:12 (1977), 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 함유한다. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의한 형질전환을 검출하는 효과적 환경을 제공한다.
VI. 항원-결합 폴리펩티드의 약제 제형 및 투여 방법.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 제조하고 대상체에게 투여하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있거나, 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정된다. 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내, 동맥내, 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 이들 모든 형태의 투여가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 명백하게 간주되지만, 투여 형태는 주사, 특히 정맥내 또는 동맥내 또는 점액을 위한 용액일 것이다. 통상적으로, 주사에 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예: 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예: 폴리솔베이트), 임의로 안정화제(예: 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시에 적합한 다른 방법에서, 항원-결합 폴리펩티드는 유해 세포 모집단의 부위에 직접 전달되어 치료제에 대한 발명 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유(예: 올리브유) 및 주사가능한 유기 에스테르(예: 에틸 올레에이트)를 포함한다. 수성 담체는, 물, 알콜/수용액, 염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본원 발명에서, 약제학적으로 허용되는 담체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 0.01 내지 0.1M 및 바람직하게는 0.05M 인산염 완충제 또는 0.8% 염수를 포함한다. 기타 통상의 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충액, 전해질 보충액, 예를 들면, 링거 덱스트로즈에 기반한 것들 등을 포함한다. 예를 들면, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 보다 특히, 주사가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산제, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고, 바람직하게는 미생물, 예를 들면, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 똔느 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴 등의 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구된 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등에 의해 달성할 수 있다. 다수의 경우, 등장성제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 발생할 수 있다.
어떤 경우에, 멸균 주사가능한 용액은 본원에 열거된 구성분 중의 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물(예: 항체 자체 또는 기타 활성제와 조합하여)을 도입하고, 필요한 경우, 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 구성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 도입함으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이고, 이는 활성 성분 + 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가 목적하는 구성분의 분말을 제공한다. 주사용 제제는 가공되고, 앰플, 백, 병, 시린지 또는 바이알에 충전되고, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건하에 밀봉된다. 추가로, 상기 제제는, 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 도입되는 공동 계류중인 미국 특허원 제09/259,337호 및 제09/259,338호에 기재된 것들과 같은 키트의 형태로 팩키징되어 판매된다. 이러한 제조 물품은 바람직하게는, 연관된 조성물이 자가면역 또는 신생물 장애를 앓고 있거나 성향이 있는 대상체를 치료하는데 유용함을 나타내는 라벨 또는 첨부 문서를 가질 것이다.
상기 기재된 상태의 치료를 위한 본 발명의 안정화된 항원-결합 폴리펩티드의 유효 용량은, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여된 기타 약제, 및 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부를 포함하는 다수의 상이한 인자에 따라 달라진다. 통상적으로, 환자는 인간이지만, 유전자도입 포유동물을 포함하는 비-인간 포유동물도 또한 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 적정할 수 있다.
본 발명의 항체를 사용한 수동 면역화에 있어서, 용량은, 예를 들면, 약 0.001 내지 100mg/대상체 체중 kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5mg/kg(예: 0.02mg/kg, 0.25mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 2mg/kg 등)의 범위일 수 있다. 예를 들면, 용량은 1mg/체중 kg 또는 10mg/ 체중 kg 또는 1-10mg/kg, 바람직하게는 적어도 1mg/kg일 수 있다. 상기 범위의 중간의 용량도 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
대상체는 이러한 용량을 매일, 격일, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 기타 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 예시적 치료는, 예를 들면, 적어도 6개월의 연장된 기간에 걸쳐 다중 용량의 투여를 수반한다. 추가의 예시적 치료 섭생은 2주마다 1회 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다. 예시적 용량 스케쥴은 연속 일에 1-10mg/kg 또는 15mg/kg 또는 격일에 30mg/kg 또는 매주 60mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 항원-결합 폴리펩티드가 동시에 투여되고, 이 경우, 투여된 각 항체의 용량은 지시된 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 복수회 투여될 수 있다. 단일 용량의 간격은, 예를 들면, 매일, 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 폴리펩티드 또는 표적 분자의 혈액 수준을 측정함으로써 지시된 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 용량은 특정한 혈장 항체 또는 독소 농도, 예를 들면, 1 내지 1000㎍/ml 또는 25 내지 300㎍/ml를 달성하기 위해 조정된다. 대안적으로, 항원-결합 폴리펩티드는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있고, 이 경우 보다 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 환자에서 항원-결합 폴리펩티드의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화된 항원-결합 폴리펩티드, 이어서 키메라 항원-결합 폴리펩티드 및 비-인간 항원-결합 폴리펩티드가 긴 반감기를 나타낸다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 비접합된 형태로 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 접합된 형태로 복수회 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 비접합된 형태로 투여된 다음 접합된 형태로 투여되거나, 그 반대일 수 있다.
투여 용량 및 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 용도에서, 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 환자의 내성을 증강시키기 위해 아직 질환이 없는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"인 것으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태 및 일반 면역성에 의존하지만, 일반적으로 용량당 0.1 내지 25mg, 특히 0.5 내지 2.5mg의 범위이다. 비교적 낮은 용량은 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 이들의 나머지 삶을 위해 치료를 계속 제공받는다.
치료적 용도에서, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 용량(예: 용량당 약 1 내지 400mg/항체 kg, 5 내지 25mg의 용량이 방사선면역접합체의 경우에 통상 사용되고, 보다 높은 용량이 세포독소-약물 접합된 분자의 경우에 사용됨)은 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지 및 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 종종 요구된다. 이어서, 환자는 예방적 섭생을 투여할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 대상체는 (예: 벡터 중의) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 치료할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 용량은 환자당 약 10ng 내지 1g, 100ng 내지 100mg, 1㎍ 내지 10mg 또는 30 내지 300㎍ DNA의 범위이다. 감염성 바이러스 벡터의 용량은 용량당 10 내지 100 또는 그 이상의 비리온으로 달라진다.
치료제는 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입이 본 발명의 항체의 투여에 바람직하다. 일부 방법에서, 치료적 항체 또는 이의 단편은 두개내로 직접 주사된다. 일부 방법에서, 항체 또는 이의 단편은 지속 방출 조성물 또는 MedipadTM 장치 등의 장치로서 투여된다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 임의로 치료(예: 예방적 또는 치료적)를 필요로 하는 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 기타 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 바람직한 추가 제제는 당해 기술분야에서 인식되고 특정 장애에 대해 표준적으로 투여되는 것들이다.
본 발명의 90Y-표지된 항체의 유효 단일 치료 용량(즉, 치료학적 유효량)은 약 5 내지 약 75mCi, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 40mCi의 범위이다. 131I-표지된 항원-결합 폴리펩티드의 유효 단일 치료 비-골수 절제 용량은 약 5 내지 약 70mCi, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 40mCi의 범위이다. 131I-표지된 항체의 유효 단일 치료 절제 용량(즉, 자가 골수 이식을 필요로 할 수 있음)은 약 30 내지 약 600mCi, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 500mCi 미만의 범위이다.
다수의 임상 경험이 131I 및 90Y로 수득되었지만, 기타 방사성표지는 당해 기술분야에 공지되어 있고 유사한 목적을 위해 사용되어 왔다. 기타 방사성동위체는 영상화를 위해 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 범위에 적합한 추가의 방사성동위체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A 및 213Bi를 포함한다. 이와 관련하여, 알파, 감마 및 베타 방사체는 모두 본 발명에서 호환성이 있다. 추가로, 본 개시의 관점에서, 당해 기술분야의 숙련가는 어떠한 방사성핵종이 과도한 실험 없이 선택된 치료 과정과 호환성이 있는지를 용이하게 결정할 수 있음이 언급된다. 이를 위해, 임상 진단에서 이미 사용되어 왔던 추가의 방사성핵종은 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga 및 111In을 포함한다. 항체는 또한 표적화된 면역요법에서 잠재적 사용을 위한 다양한 방사성핵종으로 표지되어 왔다[참조: Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987), 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다]. 이들 방사성핵종은 188Re 및 186Re, 뿐만 아니라 보다 적은 정도로 199Au 및 67Cu를 포함한다. 미국 특허 제5,460,785호는 이러한 방사성동위체에 관한 추가 데이터를 제공하고, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 포유동물 장애의 생체내 치료를 위해 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 항원-결합 폴리펩티드는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제형화될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 무독성 멸균 담체, 예를 들면, 생리학적 염수, 무독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 본원의 목적을 위해, 치료제에 접합되거나 접합되지 않은 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 약제학적 유효량은 표적에 대한 효과적 결합을 달성하고 이익을 달성, 예를 들면, 질환 또는 장애의 증상을 개선시키거나 물질 또는 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 유지된다. 종양 세포의 경우에, 폴리펩티드는 바람직하게는 신생물 또는 면역반응성 세포 상에서 선택된 면역반응성 항원과 상호작용할 수 있고, 이들 세포의 사멸의 증가를 제공할 것이다. 물론, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 폴리펩티드를 제공하기 위해 단일 또는 복수 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시의 범위와 부합하여, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 치료적 또는 예방적 효과를 생성하기에 충분한 양으로 상술한 치료 방법에 따라 인간 또는 기타 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 본 발명의 항체를 약제학적 허용되는 담체 또는 희석제와 공지된 기술에 따라 조합하여 제조한 통상의 용량 형태로 이러한 인간 또는 기타 동물에게 투여될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성이 조합되어야 하는 활성 성분 양, 투여 경로 및 기타 공지된 변수에 의해 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 판명될 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
VII. 질환 또는 장애의 치료 방법
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드는 HER2 및/또는 PDGFRβ 등의 세포 표면 수용체의 활성을 길항시키는데 유용하다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 PDGFRβ- 및/또는 HER2-연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에서, 본원에 개시된 항-PDGFRβ, 항-HER2 및/또는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드(서열번호 13 내지 16, 17 내지 22 및/또는 24에 기재된 것들)는 추가의 치료제와 조합하여 투여된다. 적합한 치료적 분자는, 제한 없이, EGFR 패밀리 수용체 활성의 억제제, 예를 들면, 트라스투주맙(CAS# 180288-69-1), 퍼투주맙(CAS# 380610-27-5), 세툭시맙(CAS# 205923-56-4) 및 에를로티닙(CAS# 183321-74-6)를 포함한다. 한 가지 특정 실시형태에서, 항-PDGFRβ/항-HER2 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드는 트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙과 조합하여 투여된다. 한 가지 특정 실시형태에서, 항-HER2 단일특이적 항원-결합 폴리펩티드는 트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙과 조합하여 투여된다.
치료에 영향을 받는 질환 또는 장애는, 제한 없이, 암, 예를 들면, 유방암 및 난소암을 포함한다.
당해 기술분야의 숙련가는, 통상의 실험에 의해, 어떠한 효과적인 무독성 양의 항체(또는 추가의 치료제)가 PDGFRβ- 및/또는 HER2-연관된 질환 또는 장애를 위한 것일 수 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 활성 양의 폴리펩티드는 질환 상태(예: 단계 I 대 단계 IV), 대상체의 연령, 성별, 합병증(예: 면역억제된 상태 또는 질환) 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 유발하는 항체의 능력 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 용량 섭생은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 분할 용량을 매일 투여할 수 있고, 상기 용량을 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 일반적으로, 유효 용량은 1일 체중 kg당 약 0.05 내지 100mg 및 보다 바람직하게는 1일 체중 kg당 약 0.5 내지 10mg의 범위일 것으로 예상된다.
VIII. 실시예
본 발명은 추가의 제한으로 간주되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본원 전체에 걸쳐 인용된 서열 목록, 도면 및 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허원의 내용은 명백하게 참조로서 본원에 도입된다.
실시예 1. HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 생성
다양한 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드 포맷을 코딩하는 유전자를 합성하고, 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 이어서, 작제물은 표준 프로토콜에 따라 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액을 수거하고, 발현에 대해 시험했다. 이중-특이적 포맷 2(표 4 중의 서열번호 18)의 발현된 이량체의 SDS-PAGE 겔은 도 5에 기재되어 있다. 겔은 비-환원 조건하에, 예상된 125Da의 폴리펩티드가 발현되고(레인 2), 이것이 환원 조건하에 예상된 62.5kDa의 단량체로 해리된다(레인 1)는 것을 나타낸다.
실시예 2. ELISA를 사용한 HER2 / PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드 발현의 평가
ELISA 검정은 세포 상청액에서 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 발현을 검정하기 위해 개발되었다. 요약하면, 2㎍/mL의 항-인간 Fc 항체를 맥시소프 이뮬론(Maxisorp Immulon) 플레이트 상에 밤새 포획하고, 슈퍼블록으로 차단시켰다. 상청액을 유사하게 희석하고, 네가티브 대조군으로 병행하여 부하했다. 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드는 항-인간 Fab 특이적 HRP로 검출했다. 도 6에 기재된 결과는 ELISA 검정이 HEK293 세포 상청액에서 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 검출할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. ELISA를 사용한 HER2 / PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 동시 항원 결합의 검출
ELISA 검정은 HER2 및 PDGFRβ에 대한 HER2/HDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 동시 결함을 검출하기 위해 개발되었다. 요약하면, 2㎍/mL의 인간 Her2-Fc 융합 단백질(His 에피토프 태그 부재)을 맥시소프 이뮬론 플레이트 상에 밤새 고정시키고, 슈퍼블록으로 차단시켰다. 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드를 함유하는 HEK293 세포 상청액을 연속 희석하고, 플레이트 상에 부하했다. 1시간 배양한 후, 플레이트를 세척하고, 100mM의 인간 PDGFRβ-Fc 융합(His 에피토프 태그 존재)을 플레이트에 적용하고, 1시간 동안 인큐베이션했다. Her2 및 PDGFRβ에 대한 이중-특이적 Ab의 결합은 항-His HRP를 사용하여 검출했다. 도 7에 기재된 결과는 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드가 HER2 및 PDGFRβ 둘 다에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. HER2 / PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 FACS -기반 결합 검정
FACS-기반 결합 검정은, 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, HER2 및 PDGFRβ에 대한 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드의 동시 결합을 검출하기 위해 개발되었다. 구체적으로, HER2를 구성적으로 과발현하는 HEK 293 세포 또는 PFGFRβ를 일시적으로 과발현하는 HEK293 세포, 또는 위조 (mock) 형질감염된 대조군 세포 200㎕를 신선한 96웰 플레이트 ml당 1백만 세포로 파종했다. 세포는 수용체 내재화를 회피하기 위해 4℃에서 유지시켰다. 포맷-2 또는 포맷-3 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드(표 4 및 도 2 및 3 참조)를 함유하는 HEK293 세포 상청액을 25nM의 재조합 인간 PDGFRβ-CF647 또는 재조합 인간 Her2-CF647과 함께 인큐베이션하여 이중-특이적/표지된 단백질 복합체를 형성시켰다. 인큐베이션 후, 100㎕의 각 상청액을 적절한 HER2-발현 세포, PDGFRβ-발현 세포 또는 대조군 세포에 첨가하고, 2시간 동안 4℃에서 진탕하에 인큐베이션하여 세포 표면 HER2 및 PDGFRβ에 대한 이중-특이적/표지된 단백질 복합체의 결합을 가능하게 했다. 인큐베이션 후, 세포는 4분 동안 1500rpm에서 원심분리하여 펠렛화하고, 200㎕의 신선한 완전 배지로 1회 세척하고, 신선한 완전 배지에서 200㎕의 최종 용적으로 재현탁시켰다. 세포에 대한 형광 표지된 형광 표지된 PDGFRβ-CF647 또는 Her2-CF647의 결합은 구아바(Guava) 유동 세포계수기(Millipore)를 사용하여 측정했다. X-축 방향의 포지티브 이동은 세포와 표지된 PDGFRβ-CF647 또는 Her2-CF647의 연관을 나타내는 것으로 고려되었다.
이들 실험에서, 항-PDGFR 항체 또는 항-HER2 항체, 배지 단독 및 CF647-표지된 수용체는 네가티브 대조군으로 사용되었다. 25nM CF647-표지된 HER2 항체 또는 50nM CF647-표지된 PDGFRβ 항체는 각각 HER2 및 PDGFRβ 발현 세포에 대한 포지티브 대조군으로 사용되었다.
이들 실험의 결과는 도 8에 기재되어 있다. 이 데이터는 포맷-2 및 포맷-3 HER2/PDGFRβ 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드가 세포 표면 HER2 및 PDGFRβ에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. HER2에 대한 예시적 항-HER2 VH 도메인의 결합의 분석.
HER2에 대한 B8 항-HER2 VH 도메인(서열번호 13)의 결합 동력학은 표면 플라스몬 공명 검정(Biacore)을 사용하여 분석했다. 도 9에 제시된 바와 같이, B8 VH 도메인은 1.2nM의 Kd, 1.39×105M-1s-1의 온-속도 및 1.67×104 s-1의 오프-속도를 나타냈다.
트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙과의 결합에 대해 경쟁하는 B8 VH 도메인의 능력은 FACS-기반 검정을 사용하여 분석했다. 도 9에 기재된 결과는 B8 VH 도메인이 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 동시에 HER2에 결합할 수 있음을 입증했다. 이들 데이터는 항-HER2 VH 도메인이 트라스투주맙 및 퍼투주맙 둘 다보다 HER2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 입증한다.
B8 VH 도메인을 scFc로 재포맷하고, HER2에 대한 결합 친화성을 측정했다. 도 10에 기재된 결과는 B8 scFv가 0.87nM의 Kd를 나타냈음을 보여준다.
실시예 5. 세포 증식 검정
단독으로 또는 조합하여, SK-BR-3 세포의 증식을 억제하는 B12 항-HER2 VH 도메인(서열번호 14), 트라스투주맙 또는 퍼투주맙의 능력은 MTS 세포 증식 검정을 사용하여 측정했다. 도 11에 기재된 결과는 B12 VH, 트라스투주맙 및 퍼투주맙의 조합이 각 제제 단독 또는 트라스투주맙 및 퍼투주맙 단독의 조합으로 수득된 것보다 세포 증식의 보다 큰 억제를 제공했음을 나타냈다. 이들 데이터는 B12 VH가 트라스투주맙 및 퍼투주맙의 세포 증식 억제를 증강시키기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
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Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 465 470 475 480 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala 485 490 495 Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala 500 505 510 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys 515 520 525 Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala 530 535 540 Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser 545 550 555 560 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser 565 570 575 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 580 585 <210> 21 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Asn Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Asn Val Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 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Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Arg His Ala Ile Ser 1 5 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Val Leu Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gln Gln Tyr Asn Asn Val Leu Arg Thr 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp Leu Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 32 His His His His His His 1 5

Claims (44)

  1. 인간 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFRβ) 및 인간 HER2에 결합하는 단리된 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드로서,
    인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 VH 도메인에 C-말단으로 연결된, 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 포함하거나;
    인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 제2 VH 도메인에 C-말단으로 연결된, 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 포함하고,
    폴리펩티드가 항체 경쇄를 포함하지 않고,
    제1 VH 도메인이 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하고, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하고,
    제2 VH 도메인이 인간 HER2에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 1, 2 및 3; 4, 5 및 6; 7, 8 및 9; 및 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함하거나;
    제1 VH 도메인이 인간 HER2에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 1, 2 및 3; 4, 5 및 6; 7, 8 및 9; 및 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함하고,
    제2 VH 도메인이 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하고, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하는, 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 항체 중쇄가 아미노산 링커를 통해 제2 VH 도메인에 유전적으로 연결되어 있는, 항원-결합 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 링커가 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 항원에 특이적으로 결합하는 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 추가로 포함하고, 중쇄 및 경쇄가 자연적으로 페어링(pairing)되어 있는, 항원-결합 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, VL 도메인이 인간 PDGFRβ에 결합하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, VL 도메인이 인간 HER2에 결합하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  7. 제1항의 2개 항원-결합 폴리펩티드의 이량체를 포함하고, 2개 항원-결합 폴리펩티드가 중쇄 불변 영역을 통해 자연적으로 이량체화되어 있는, 항원-결합 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 도메인 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, VH 도메인이 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 서열번호 18 또는 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  12. 제4항에 있어서, 인간 PDGFRβ에 특이적으로 결합하고, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3, 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  15. 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 단리된 항원-결합 폴리펩티드로서, 각각 서열번호 1, 2 및 3; 4, 5 및 6; 7, 8 및 9; 및 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3, HCDR2 및 HCDR1 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 단리된 항원-결합 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 도메인 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, VH 도메인이 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  20. 제19항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항의 숙주 세포를 항원-결합 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 생성되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드의 생산 방법.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원-결합 폴리펩티드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
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