KR102394213B1 - 참담치 유래 항균 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참담치(M. coruscus) 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 서열번호 5 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 항균 펩타이드를 제공한다.

Description

참담치 유래 항균 펩타이드 및 그의 용도{Antimicrobial peptide derived from from the marine bivalve, Mytilus coruscus and uses thereof}

본 발명은 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 참담치 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

홍합, 조개, 굴 및 가리비와 같은 연체동물(mollusk)은 해양 무척추 동물(marine invertebrate)의 주요 계통(phylum)이며 필터 공급으로 해수에서 영양분을 얻는다. 해양 연체동물인 담치류는(mussels)은 발 중간에 단백질성 족사(proteinous byssus)로 서로 붙어 있거나 바위에 붙어 있어 움직일 수 없기 때문에 두 개의 출수관(exhalant)과 입수관(inhalant)을 사용하여 물, 플랑크톤 및 미생물을 섭취한다. 출수관으로 들어가는 영양 유기물은 아가미에 갇히고 점액에 의해 응집되어 입으로 이동한다. 이러한 이유로 연체동물은 미생물이 많은 환경에 노출되며 미생물 감염을 예방하기 위한 효과적인 면역 시스템이 요구된다(J.A. Tincu, et al., Agents Chemother. 48. 3645-3654. 2004). 종래 보고된 바와 같이 연체동물과 같은 무척추 동물의 후천성 면역계(acquired immune system)는 덜 발달된 반면 선천성 면역계(innate immune system)는 잘 발달되어 있고 병원체 미생물로부터 자신을 방어하기 위해 세포 및 체액 성분에 의한 선천적 면역 시스템에 주로 의존한다(C. Zannella, et al., Mar. Drugs. 15. 182. 2017). 선천성 면역은 특이성을 갖지 않는 숙주 방어 시스템의 최선방의 방어체계이고, 감염 직후의 적응 면역계 또는 식균작용(phagocytosis)전에 다양한 침입 미생물 체액의 성장을 즉시 억제한다(A. Charles, et al., Immunobiology, fifth ed, Garland publishing, New York, 2001). 이러한 방어 시스템 중에서 항균 펩타이드(AMP)는 연체동물의 선천성 면역시스템의 주요한 인자로 알려져있다(D. Destoumieux, et al., J. Biol. Chem. 272, 28398-28406. 1997).

항균 펩타이드는 알파-나선 또는 베타-시트 폴딩 구조를 갖는 숙주 방어 펩타이드이며, 유전자로 인코딩된 짧은 올리고 펩타이드(약 100개 아미노산 미만)이다. 소수성 및 양이온성 아미노산을 갖는 양친매성 분자(amphipathic molecules)이기 때문에 박테리아, 진균, 기생충 및 심지어 특정 바이러스(enveloped viruses)에 대한 광범위한 항균 활성을 나타낸다(M. Zasloff. et al., Nature. 415. 389-395. 2002). 양이온성 항균 펩타이드의 작용은 자체 2차 구조, 전체 순전하(overall net charge), 양친매성, 소수성(hydrophobicity), 크기 및 소수성 및 극성 영역 사이의 균형에 따라 달라진다(K.R. Reddy, et al., Int. J. Antimicrob. Agents 24. 536-547. 2004). 그리고 항균 펩타이드는 세포벽, 막 또는 세포질과 같은 표적화된 분자의 영역에 따라 비-막 표적화 펩타이드 및 막 표적화 펩타이드로 분류된다(C.B. Park et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 6;244(1). 253-257. 1998). 1,000개 이상의 항균 펩타이드가 여러 병원체에 대해 항균활성을 갖는다는 것이 보고되었지만, 해양 담치류 유래의 항균 펩타이드에 관한 연구는 일부 종에서만 연구되었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래 항균 펩타이드와 달리 용혈활성은 감소되고 항균활성은 증가하여 다양한 지표균주에 대해 우수한 항균활성 및 항-기생충 활성을 나타내는 참담치 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 5 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 항균 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카 섬모충 방제용 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 참담치 유래의 항균 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균에 대해서 우수한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라 항-기생충 활성까지 나타내므로 항생제의 대체물질로 효과적으로 활용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1a는 참담치(M. coruscus) 외투막 추출물 유래 정제된 펩타이드의 정제 및 항균활성을 분석한 것으로, 고초균(B. subtilis)에 대한 정제된 피크(30-32 분)의 항균 활성을 분석한 그래프이다. 산성화된 추출물을 1.0 mL/분의 유속에서 60분에 걸쳐 0.1% TFA에서 5-65% ACN의 구배로 CapCell-Pak C18 역상 컬럼에 주입하였다.
도 1b는 참담치(M. coruscus) 외투막 추출물 유래 정제된 펩타이드의 정제 및 항균활성을 분석한 것으로, 고초균(B. subtilis)에 대한 정제된 피크(31-33분)의 항균활성을 분석한 그래프이다. 활성 분획을 TSK- 겔 ODS-80TM C18 역상 컬럼에 적용하였고 0.2 mL/분의 유속에서 60% 동안 0.1% TFA에서 5% → 65% ACN(pH 2.2)의 선형 구배로 용리를 수행하였으며 용리는 220 nm에서 모니터링 되었다.
도 1c는 참담치(M. coruscus) 외투막 추출물 유래 정제된 펩타이드의 정제 및 항균활성을 분석한 것으로, Edman 분해에 의해 측정된 11,182.003 Da 및 N- 말단 서열(23 아미노산)을 갖는 단일 질량의 질량 분석 그래프이다.
도 2는 본 발명의 재조합 myticusin-beta의 cDNA 서열 및 유래 아미노산 서열을 나타내는 그림이다. ORF의 감소된 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열 아래에 제시되어 있고 별표는 정지 코돈을 나타내고 외곽선은 myticusin-beta의 신호 펩타이드를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 재조합 myticusin-beta 및 동형 단백질의 다중 서열 정렬을 나타내는 그림이다. myticusin-beta는 MC1 및 2개의 동형 단백질인 MC2, MC3을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 재조합 myticusin-beta의 과발현 및 정제를 나타내는 겔 사진이다. TrxA 융합 재조합 단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 레인 M, 분자 마커; 레인 1, 비유도 단백질; 레인 2, 유도 단백질; 레인 3, 가용성 단백질; 레인 4, 봉입체; 레인 5, 정제된 myticusin-beta 단백질 (빨간색 화살표로 표시), 레인 6, 정제된 myticusin-beta 단백질을 사용한 웨스턴 블롯의 결과.
도 5는 넙치의 적혈구에 대한 본 발명의 재조합 myticusin-beta의 피시딘 1의 용혈활성을 분석한 것으로, 각 샘플의 농도를 100 μg/mL로 분석한 그래프이고(A), 농도에 따른 용혈의 영향(100, 50, 25, 12.5, 6.25 μg/mL)을 분석한 그래프이다(B).
도 6은 WST-1 시약을 사용하여 재조합 myticusin-beta의 항-스쿠치카 섬모충 활성을 분석한 것으로, 상이한 농도의 재조합 myticusin-beta(0-200 μg/mL)로 처리된 기생충의 응집을 관찰한 현미경 사진이고(A), 재조합 myticusin-beta(0-200 μg/mL)의 농도에 의한 기생충(스쿠치카 섬모충)의 생존율(%)을 분석한 그래프이다(B). 오차 막대는 3회 반복 실험의 평균 표준편차를 나타내었다.
도 7은 본 발명의 정제된 재조합 myticusin-beta의 항균 활성 및 스펙트럼을 분석한 그림이다. 균주에 대한 항균활성의 값은 투명 구역의 직경으로 나타내었다 (웰의 직경; 2.2 mm).
도 8은 참담치 조직에서 myticusin-beta 발현의 정량 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 3회 반복 실험의 평균 표준편차를 나타낸다. ADD; 폐각근, FOO;발, GIL;아가미, HEM; 혈구, HEP; 간췌장, MAN: 외투막, SIO; 출수관.
도 9는 본 발명의 재조합 myticusin-beta 유사 펩타이드의 나선형 휠 묘사(Helical wheel depiction)를 나타내는 그림이다. 화살표는 펩타이드에서 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다. 상기 아미노산 잔기를 순 전하 및 소수성 증가로 치환 하였다. 소수성 잔기는 청색, 산성 잔기는 적색, 염기성 잔기는 주황색, 하전 되지 않은 잔기는 자주색이다.

용어의 정의:

본 명세서에서 사용되는 용어 "참담치(Mytilus coruscus)"는 우리나라 전 연안에 분포하며, 대표적인 부유물 여과섭지자이다. 크기는 각장 150mm, 각고 50mm 정도이고, 껍질이 지중해담치 보다 두껍고 보라색을 띠는 검은색이다. 성장면이 거칠며 해조나 따개비가 많이 부착한다. 각정은 왼쪽 끝에서 아래로 휘어져 있으며 배면은 직선에 가깝고 앞면도 직선상이고 패각의 내면은 백색과 짙은 보라색에 약한 푸른빛을 띤다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "스쿠티카 섬모충(Scuticociliate)"은 넙치, 해마, 연어 등의 해양생물에 감염하여 기생하는 단세포 원생생물이다. 숙주의 표피층에 일차적 감염이 발생하고, 표피를 투과하여 조직내에 침투하게 되면 면역세포를 포함하여 뇌, 신장 등 숙주의 다양한 조직을 포식하여 손상을 일으켜 사멸하게 한다. 넙치는 한국, 일본, 중국에서 사육되는 주요 양식원으로 치어가 스쿠티카 섬모충이 감염할 경우 대량 폐사를 유발하여 막대한 산업적 피해를 일으킨다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 5 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 항균 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

상기 항균 조성물에 있어서, 상기 그람 음성균은 Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Edwardsiella tarda, Proteus mirabilis, Providencia stuartii 또는 Pseudomonas aeruginosa일 수 있고 상기 그람 양성균은 Bacillus cereus, B. subtilis, Enterococcus faecalis, Streptococcus mutans, Streptococcus iniae, Staphylococcus aureous, Streptococcus vestibularis, Streptococcus parauberis 또는 Lactococcus garvieae일 수 있으며 상기 진균은 Candida albicans일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카 섬모충 방제용 조성물이 제공된다.

항균 펩타이드(AMP)는 알파-나선 또는 베타-시트 폴딩 구조를 갖는 숙주 방어 펩타이드 및 유전자로 인코딩된 짧은 올리고 펩타이드(약 100개 아미노산 미만)이다. 소수성 및 양이온성 아미노산을 갖는 양친매성 분자(amphipathic molecules)인 항균 펩타이드는 박테리아, 진균, 기생충 및 심지어 특정 바이러스(enveloped viruses)에 대한 광범위한 항균 활성을 나타낸다. 1000개 이상의 항균 펩타이드가 여러 병원체에 대해 항균활성을 갖는다는 것이 보고되었지만, 해양 담치류 유래의 항균 펩타이드에 관한 연구는 일부 종에서만 연구되었다. 담치류에서 동정된 항균 펩타이드들은 defensin, mytilin, myticin, mytimycin, mytimacin, big defencin, mytichitin-CBD, 및 myticusin을 포함한 8개 그룹으로 분류된다. 해양 홍합, 특히 Mytilus edulis 및 Mytilus galloprovinvialis에 중점을 둔 여러 항균 펩타이드가 정제되었고 동정되었지만 Mytilus coruscus의 항균 펩타이드에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다(J.A. Tincu, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 48. 3645-3654. 2004).

한편 M. coruscus("하드쉘 홍합"이라고도 함)는 Mytilidae 과의 쌍각조개 연체동물(bivalve mollusk)에 속하며 동아시아에서 전통적인 건강식품으로 오랫동안 양식이 되었고 한국에서도 경제적으로 중요한 해산물로 취급된다. M. coruscus 유래 항균 펩타이드인 mytichitin-CBD 및 myticusin는 M. coruscus의 혈림프(hemolymph) 및 족부 근육 추출물에서 동정되었다(C.L. Qin, et al., Fish shellfish Immunol. 41. 362-370. 2014). 상기 펩타이드는 그람 양성균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내고 선천적 면역 방어의 중요한 성분을 구성한다.

본 발명자들은 담치류(mussel) 유래 일부종에서만 항균 펩타이드에 관해 일부 연구가 수행되었다는 사실에 주목하고 참담치의 외투막(mantle)에서 항균 펩타이드를 분리하고 정제하였다. 상기 펩타이드를 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였고 이는 고초균(Bacillus subtilis)대한 항균활성을 나타내었다. 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 시간비행형 질량분석기(MALDI-TOF/MS)에 의한 총 분자질량은 11,182 Da로 나타났고 정제된 피크의 23개의 N-말단 아미노산 서열은 Edman 분해로부터 수득하였으며, 참담치의 myticusin-1과 82%의 상동성을 나타내었다. 또한, cDNA 클로닝 및 cDNA 말단의 빠른 증폭(RACE)에 의해 표적 펩타이드의 완전한 서열을 결정하였다. 신호 펩타이드의 24개 아미노산 및 성숙한 펩티드의 104개 아미노산을 인코딩하는 387bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 갖는 574 bp로 구성된 완전한 서열의 펩타이드를 myticusin-beta로 명명하였고 myticusin-beta의 두 가지 추가적인 신규 동형 단백질(isoforms)을 발견하였다. 상기 myticusin-beta 유래의 짧은 항균성 펩타이드 유사체는 myticusin-beta의 서열을 기반으로 설계되어 합성되었으며 이의 유사체(analogs)의 항균활성을 측정한 결과 그람 양성균(Bacillus cereus, B. subtilis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureous, Streptococcus iniae, Streptococcus mutans) 및 그람 음성균 (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio alginolyticus, Klebsiella pneumoniae)에 대해 항균 활성을 나타내었고 상이한 농도로 항-기생충 활성도 나타내었다. 본 발명의 실시예에 따라 제조된 myticusin-beta의 발현 수준은 외투막에서 가장 높은 수준으로 검출되었고 이어서 혈구(hemocyte)에서 검출되었다. 결론적으로 본 발명자들은 M. coruscus의 외투막에서 myticusin-beta 항균 펩타이드를 분리, 정제 및 특성화하였으며, 상기 결과에 따라 myticusin-beta는 항생제 및 면역계 관련 펩타이드의 대체 물질로서 활용될 수 있음을 시사한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 조직 추출

본 발명에서 사용한 참담치(M. coruscus)은 부산 수산시장(한국)에서 구매하여 담수로 부드럽게 세척하였고 주사기로 폐각근(adductor muscle)에 Vibrio parahaemolyticus를 주사하여 인위감염시켰다. 그 후 외투막(mantle)을 무균 조건하에서 분리하였고, 4 부피의 예열된 1% 아세트산(HAc)으로 5분 동안 가열하였다. 상기 가열한 조직을 원심분리하였고(4000 rpm, 30분, 4℃), 그 상등액을 0.45 μm의 공극 크기의 주사기 필터로 여과한 다음 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2: 초고감도 방사상 확산분석(URDA)

본 발명자들은 초고감도 방사상 확산분석(URDA)에 의한 항균 분석을 수행하였다. 구체적으로, 그람 양성, 음성균 및 진균을 참조 독성 미생물로 사용하여 항균 활성을 확인하였다(R.I. Lehrer, et al., J. Immunol. Meth. 137. 167-173. 1991). 먼저, 19개의 박테리아 균주를 각각 적절한 배지 및 온도(25℃, 30℃ 및 37℃)에서 배양하였고 기준 세균 및 진균을 ~ 10⁸ CFU/mL 또는 ~ 10⁶ CFU/mL에 상응하는 McFarland 탁도 표준(turbidity standard) 0.1로 희석하였다. 상기 희석된 미생물 배양 배지 0.5 mL을 1.2% 유형 I 아가로스를 함유하는 9.5 mL의 언더레이 겔에 첨가하였고, 직경이 2.2 mm 웰을 갖는 1 mm 두께의 언더레이 겔에 부었다. 그 후 샘플을 웰에 첨가하였고, 세균 또는 진균 현탁액을 1.2% 유형 Ⅰ 아가로스 및 10 mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)을 함유하는 10 mL의 오버레이 겔로 오버레이하였으며 25, 30 및 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후 투명구역(clear zone)을 측정하였다. 상기 URDA 분석에 사용한 병원성 균주에 관한 정보를 하기 표 1에 요약하였다.

URDA 분석에 사용한 병원성 균주

균주	참조	배지	온도(℃)
그람 양성균
Bacillus cereus	KCTC 1012	NB	30
Bacillus subtilis	KCTC 1021	TSB	37
Clostridium perfringens	ECa	TSB	37
Enterococcus faecalis	KCTC 3206	BHI	37
Staphylococcus aureus	KCCM 11335	TSB	37
Streptococcus iniae	KCTC 3657	BHI+1% Nacl	37
Streptococcus mutans	KCTC 3065	BHI	37
Streptococcus vestibularis	KCTC 3650	TSB+0.3%YE	37
Streptococcus parauberis	KCTC 3651	TSB+0.3%YE	37
Lactococcus garviae	KCTC 3772	MRS	30
그람 음성균
Escherichia coli	KCCM 40271	NB	37
Enterobacter cloacae	KCTC 2361	NB	37
Klebsiella pneumoniae	KCTC 12385	NB	37
Proteus mirabilis	KCTC 2510	NB	37
Providencia stuartii	KCTC 2569	NB	37
Pseudomonas aeruginosa	KCTC 1636	NB	37
Vibrio alginolyticus	KCTC 2472	BHI	37
Vibrio harveyi	KCCM 40866	BHI+1% Nacl	25
Vibrio parahaemolyticus	KCCM 41664	BHI+1% Nacl	37
진균
Candida albicans	KCCM 11282	YM	30

실시예 3: 펩타이드의 HPLC 정제

본 발명자들은 참담치 외투막 조직을 분리하였고, 이를 균질화후 정제하여 산성화시켰다. 산성화 외투막 추출물을 URDA에 적용하였고 E. coli 및 Psuodomonas aeruginosa을 포함하는 그람 음성균 및 Bacillus cereus, B. subtilis 및 Streptococcus mutans을 포함하는 그람 양성균에 대한 항균활성을 나타내었다. 초기 스크리닝 결과에 기반하여, 추출물에 대한 높은 감수성을 나타내는 고초균이 항균 분석의 참조 균주(reference strain)로 선택되었고 산성화 외투막 추출물의 분리 및 정제를 위해 RP-HPLC에 적용하였다.

구체적으로, 본 발명의 정제 공정은 2가지 유형의 역상 컬럼인 CapCell-Pak C18 역상 컬럼(5 μm, 120A, 4.6 x 250 mm) 및 TSK-겔 ODS-80TM C18 역상 컬럼(4.6 x 150 mm; 일본 TOSOH)을 사용하여 역상 HPLC 시스템(DIONEX UltiMate 3000 HPLC 시스템, Thermo Fisher Scientific, USA)으로 수행되었다. 첫 번째 단계에서, 산성화된 추출물을 1.0 mL/분의 유속으로 60분에 걸쳐 0.1% 트리플루오로 아세트산(TFA) 중 5-65% 아세토니트릴(ACN)의 구배를 갖는 CapCell-Pak C18 역상 컬럼에 주입하였다. 두 번째 단계에서, 수집된 분획을 0.2 mL/분의 유속에서 1시간에 걸쳐 0.1% TFA에서 5-65% ACN의 구배로 TSK-겔 ODS-80TM C18 역상 컬럼에 적용하였다. 그 후, 용리된 분획을 220 nm에서 모니터링 하였고 추가 특성화를 위해 진공 건조시켰으며 항균 활성을 확인하기 위해 각각의 용리된 피크를 URDA 방법을 적용하여 Bacillus subtilis(KCTC 1021)에 대해 평가 하였다.

그 결과, CapCell-Pak C18 역상 컬럼에 의해 가장 활성이 강한 분획을 30-32분에 용리시켰다(도 1a). 또한 상기 분획을 수집하여, 농축 후, 추가 정제공정을 위해 TSK-겔 ODS-80TM C18 역상 컬럼에 적용하였고 최종적으로 정제된 활성분획을 31-33분에 용리시키고, 단백질성 물질을 확인하기 위해 트립신(trypsin)으로 처리하였다. 상기 반응 후 고초균(B. subtilis)에 대해 항균활성이 완전히 사라졌음을 확인하였다(도 1b). 상기 결과는 정제된 피크가 항균 활성을 갖는 단백질성 성분이라는 것을 시사한다.

종래 연구에서 참담치 종에서 발견된 항균 펩타이드는 대부분 혈구, 또는 혈림프에서 분리되었고, defensin은 M. edulis 및 M. galloprovincialis에서, mytilin isoforms A, B는 M. edulis에서, mytilin isoforms C, D, 및 G1은 M. galloprovincialis에서, myticins A, B, mytimycin은 M. galloprovincialis에서, mytichitin-CBD는 M. coruscus에서, myticusin-1은 M. coruscus에서 분리 및 보고되었다(M. Gerdol, et al., Dev. Comp. Immunol. 36: 390-399, 2012). 그러나 본 발명의 항균성 펩타이드는 독특하게도 참담치의 외투막(mantle)로부터 정제되었으며 이의 용리된 분획은 기존에 알려진 M. coruscus의 myticusin-1과는 달리 그람 양성균인 고초균에 대한 항균 활성을 나타냈다(Z. Liao et al., Fish shellfish Immunol. 34: 610-616, 2013).

실시예 4: 프로테아제로 정제된 펩타이드의 소화

최종적으로 단백질성 화합물을 확인하기 위하여 정제된 단일 피크를 37℃에서 1시간 동안 2 μL(1,000 μg/mL)의 트립신과 반응시켰다. 상기 트립신은 펩타이드 결합 및 소화된 단백질을 아르기닌(arginine) 및 라이신(lysine) 잔기의 카르복실 말단을 분해하며 펩타이드로 가수분해시킨다. 그 후, 상기 샘플을 트립신의 불-활성화(inactivation)를 위해 4℃에서 배양하였고 프로테아제 반응 후 정제된 단일 피크는 URDA 테스트를 수행하였으며, 항균활성을 트립신 무처리 펩타이드와 비교하였다.

실시예 5: 정제된 펩타이드의 서열 동정

상기 정제된 펩타이드의 분자량을 측정하기 위해 Ultraflex Ⅲ 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 시간비행형 질량분석기(MALDI-TOF/MS, Bruker Daltonik GmbH, Germany)를 사용하였다. 구체적으로, 정제된 펩타이드를 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA) 매트릭스 용액(0.1% TFA/50% ACN 중 10 mg/mL, 1:1,v/v)에 용해시켰고 MALDI 플레이트에 로딩하였다. 또한, N-말단 아미노산 서열은 펄스 액체 자동 시퀀서(모델 473A; Applied Biosystems, USA)를 사용한 Edman 분해 방법으로 수득하였다.

그 결과, 정제된 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF/MS 분석을 통해 11,182.003 Da임을 확인하였고 정제된 펩타이드의 23개의 아미노산 잔기는 Edman 분해에 의해 수득되었다: S-D-H-Q-M-A-Q-S-A-C-M-G-L-A-Q-D-A-A-Y-A-S-A-I(도 1c, 서열번호 5). N-말단 부분 서열의 확인된 23개의 잔기는 M. galloprovincialis의 가상 단백질 부분(OPL33655)과 91% 일치하였고 M. coruscus의 myticusin alpha 전구체(AFJ04410)와 82% 일치하였다(M. Murgarella, et al., PLoS One. 11(3): e0151561, 2016). 이러한 이유로 상기 정제된 펩타이드의 명칭을 myticusin-beta로 명명하였다.

다양한 생물에서 발견되는 항균 펩타이드 중에서 아미노기 말단에 Xaa-Xaa-His(상기 Xaa는 아미노 임)의 아미노산 서열로 알려진 트리펩타이드를 갖는 아미노-말단 구리 및 니켈(ATCUN)을 포함하는 펩타이드(ATCUN-AMPs)들이 보고되었다(M. D. J. Libardo, et al., Biochimie. 113: 143-155, 2015). 담치류의 항균 펩타이드 아미노-말단 구리 및 니켓 (ATCUN) 부위를 공통적으로 가지는 ATCUN-AMPs 펩타이드도 알려져 있다. 담치류에서 분리된 항균 펩타이드들은 TDH(threonine-aspartic acid-histidine), HPH(hisditine-proline-histidine) 및 HSH(histidine-serine-histidine)의 말단을 가지는 항균 펩타이드들로 밝혀졌다. 예를 들어, M. coruscus 유래 myticusin-1의 ATCUN 모티프 영역은 TDH(Thr-Asp-His), M. galloprovincialis 유래 Myticin B는 His-Pro-His(HPH), M. galloprovincialis 유래 myticin A는 His-Ser-His(HSH)이다. 본 발명의 myticusin-beta는 펩타이드의 N-말단에 serine-aspartic acid-histidine(SDH)을 갖는다. 보고된 다른 항균 펩타이드와 마찬가지로, myticusin-beta 항균 펩타이드는 N-말단의 히스티딘이 들어간 3개의 아미노산 잔기를 갖는 ATCUN-AMP의 특징을 잘 보여주고, M. galloprovincialis의 가상 단백질 부분(OPL33655)은 펩타이드의 N-말단에서 serine-aspartic acid-histidine(SDH)을 포함한다. 이러한 항균 펩타이드의 항균활성의 스펙트럼은 ATCUN의 의해 결정될 수 있다.

실시예 6: RNA 추출, cDNA 준비 및 뉴클레오티드 시퀀싱

이에 본 발명자들은 상기 실시예 5에서 확인된 myticusin-beta을 암호화하는 유전자를 클로닝하였다. 구체적으로 먼저 RNA를 TRI 시약(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 홍합 외투막(mantle)으로부터 추출하여 정제하였고, 분광 광도계(Nanovue plus spectrophotometer, USA)로 RNA의 순도를 측정하였다. 그 후 완전한 DNA 서열을 결정하기 위해 M. coruscus 유래 myticusin-beta의 cDNA를 SMARTer^ㄾ RACE5'/3'키트(Clontech, USA)로 합성하였다. 이어서, 제1 가닥 cDNA를 폴리(A) 폴리머라제(Takara, Japan)로 합성하였다. 5'-RACE-Ready cDNA 합성 반응은 RNA 1.0 μL, 5'-DNS 프라이머 A 1.0 μL를 포함하는 최종 부피 11 μL에서 수행되었다. 또한, 3'-RACE-Ready cDNA 합성 반응은 3'-RACE-Ready cDNA의 제조를 위해 RNA 1.0 μL, 3'-DNS 프라이머 A 1.0 μL를 포함하는 12 μL의 최종 부피에서 수행되었다. 그 후 튜브를 72℃에서 3분 동안 배양하였고 2분 동안 42℃로 냉각시켰다. 이어서 5'-RACE cDNA 합성 반응에 1.0 μL의 올리고뉴클레오티드를 첨가하였으며 마스터 믹스(master mix)를 5'-및 3'-RACE-Ready cDNA 합성 반응으로부터 변성된 RNA에 첨가하였으며 42℃에서 90분 그 후 70℃에서 10분 동안 배양하였다. 상기 3'- 및 5'-RACE-Ready cDNA 샘플은 사용을 위해 영하 20℃에서 보관하였고 2개의 유전자 특이적 올리고 뉴클레오티드 프라이머쌍(Myticusin-3RACE: 서열번호 1 및 Myticusin-5RACE: 서열번호 2)을 제조하였다. 또한 Myicusin-beta를 pGEM^ㄾ T-easy 벡터 시스템(Promega, USA)에 클로닝하였고 클로닝된 벡터로 E. coli XL-1 blue 숙주세포를 형질전환 시켰다. 그 후, 플라스미드를 DNA-스핀 플라스미드 정제 키트(인트론, 한국)를 사용하여 분리 및 정제하였고, 3130XL 유전자 분석기(Applied Biosystems, USA)로 서열을 분석하였다. 그 후, 국립생명공학정보센터(NCBI, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 아미노산 서열을 검색하였고 BioEdit 버전 7.2.5 및 GENETYX 버전 4.0 프로그램을 사용하여 서열을 정렬하여 비교 및 분석하였다. 아울러, 상기 정제된 펩타이드의 이론적 분자량 및 pI 값은 Expasy-online 툴을 이용하여 평가하였다(www.expasy.org/rools/protparam.html). 상기 제조한 프라이머 및 본 발명에서 사용한 프라이머에 관한 정보를 하기 표 2에 요약하였다.

프라이머의 염기서열 정보

명칭	염기서열(5'-->3')	서열번호
Myticusin-3RACE	GATTACGCCAAGCTT GAC CAC CAG ATG GCA CAG TCG GCC TGC	1
Myticusin-5RACE	GATTACGCCAAGCTT TAT TGC GGA TGC ATA TGC IGC GTCTG	2
BamHI-linker F	GGATCC ATG TCA GAC CAT CAG ATG GCA	3
XhoI-linker R	CTCGAG TTA AAC GAT ACA ACA GCA GAA GTT	4

실시예 7: 재조합 플라스미드의 구축

본 발명자들은 myticusin-beta의 서열을 동정하기 위해 cDNA 클론을 스크리닝하였다. 특이적 프라이머는 M. coruscus로부터 myticusin-beta의 cDNA를 증폭시키고 완전 cDNA를 증폭시키도록 설계되었다. 구체적으로 발현 플라스미드의 구축을 위해, 센스 BamHI-링커 프라이머(서열번호 3) 및 안티센스 XhoI- 링커 프라이머(서열번호 4)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 표적 유전자를 증폭시켰다. 구체적으로, DNA 주형 1.0 μl, MgCl₂를 함유하는 1X PCR 완충액, 0.2 mmol/L의 dNTP, 0.6 U의 Taq 폴리머라제 및 1.0 pmol의 각 프라이머를 함유하는 최종 부피의 50 μL에서 PCR을 수행하였다. 증폭 조건은 PCR thermal cycler TP600(Takara, Japan)를 사용하여 94℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 25 싸이클, 이어서, 7분 동안 72℃에서 최종 연장(final extension)으로 수행하였다. 그 후, 증폭산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였고 QIAquick^ㄾ PCR 정제 키트(QIAGEN, Germany)를 사용하여 정제하였으며 최종 생성물을 BamH I, Xho I 부위 및 N-말단 6X His-tagged(C. H. Kim, et al., FEBS. 3332-3338. 2017)을 포함하는 pET-28a(+)-티오레독신 A(TrxA) 융합 벡터에 클로닝하였다. 마지막으로 myicusin-beta 유전자를 인코딩하는 재조합 플라스미드를 분리하였고 E. coli DH5α 및 BL21(DE3) 숙주세포(competent cell)로 형질전환시켰다.

그 결과, 상기 myticusin-beta의 완전 서열은 574 bp이고 387 bp의 ORF 서열로 구성됨을 확인하였다(도 2). 128개 아미노산을 코딩하는 정제된 펩타이드는 SIGNALP 4.0 온라인 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)을 사용하여 밝혀진 24개 아미노산의 신호 펩타이드를 개시한다. 활성부위의 펩타이드는 10개의 염기성 잔기를 포함하였다; 4 Lys, 4 Arg 및 2 His 총 소수성 비(hydrophobic ratio)는 39%로 나타났다. 신호 펩타이드의 분비를 위한 절단 부위(cleavage site)는 glycine²⁴와 serine²⁵ 사이에 있다. 104개 아미노산으로 이루어진 활성 펩타이드는 M. coruscus의 myticusin-1과 87%의 상동성을 갖고 M. galloprovincialis의 가설 단백질(hypothetical protein)과 88%의 상동성을 갖는다. 또한, M. coruscus의 외투막에서 myticusin-beta의 두 가지 이상의 동형 단백질(isoform)을 동정하였고 아미노산 서열을 비교한 결과, myticusin-beta(MC1) 및 2개의 동형 단백질인 myticusin-beta 2(MC2) 및 myticusin-beta 3(MC3)의 128개 아미노산 서열을 myticusin-1과 비교하여 아미노산의 74.2% 상동성을 확인하였다(도 3). Myticusin-beta는 2개의 동형 단백질과 매우 근접한 아미노산 서열 유사성을 나타내었고, 비교된 상동성은 각각 MC2 및 MC3에서 98.4% 및 99.2%로 나타났다. myticusin-beta 및 동형 단백질을 갖는 myticusin-1의 128개 아미노산 서열 비교에 따르면, myticusin-1의 threonine⁷⁴는 alanine⁷⁴ 및 glycine⁷⁴로 대체되었고 histidine¹¹⁸은 serine¹¹⁸ 및 asparagine¹¹⁸로 대체되었다. 결과적으로, 2가지 유형의 동형 단백질이 myticusin-beta로 수행되었다.

아미노산 서열의 차이는 단백질 기능의 다양한 특성으로 이어질 수 있으므로, 항균활성 및 합성 펩타이드의 구조적 특성에 대한 추가 분석이 요구된다. 상기 활성형 펩타이드의 104개 아미노산에 대해 11,082.53 Da의 계산된 분자량을 수득하였고, 검출된 분자량은 질량 분광 분석에 의해 분자량 11,182.003 Da으로 나타났다(도 1c). 상기 분자량의 결과는 거의 동일하며 0.527 Da 차이는 다양한 사후 변형으로 인해 발생할 수 있다. 상기 차이는 allysine(lose 1.03 Da), amidation(lose 0.98 Da), 2,3-didehydroalanine(lose 18.02 Da), 2,3-didehydrobutyrine(lose 18.02 Da), 3-oxoalanine cysteine (lose 18.08 Da), 3-oxoalanine serine (lose 2.02 Da), 2-oxobutanoic acid (lose 17.03 Da), pyrrolidone carboxylic acid (lose 18.02 Da), 분자 질량을 감소시키는 것으로 알려져 있는 pyrrolidone carboxylic acid(lose 17.03 Da) 및 pyruvic acid(lose 33.10 Da)와 같은 번역 후 변형(post-translational modifications)으로 발생할 수 있다(C. Zannella, et al., immunology and antimicrobial defense, Mar. Drugs. 15. 182. 2017).

실시예 8: 재조합 단백질의 발현 및 정제

본 발명자들은 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 37℃에서 50 μg/mL의 카나마이신을 포함하는 300 mL의 Luria-Bertain(LB) 액체 배지를 사용하였고 600 nm에서 광학밀도가 최대 0.4에 도달할 때까지 세포를 배양하였다. 37℃에서 4시간 동안 이소프로필-D-1 티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도발현을 실시하였고 상기 세포를 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였으며 펠릿을 40 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 현탁시켰다. 상기 현탁된 세포를 빙수조(ice-water bath)에서 초음파 처리하여 분쇄하였고 4℃에서 10분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 Ni-NTA His Bind174; SuperflowTM (Novagen, USA)를 이용하여 정제하였고 정제 후, 용리된 분획을 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 투석하였으며 10% 아스파르트산염으로 구성된 EzWay-PAG 겔(KOMABIOTECH, 한국)로 분석하였다. 상기 정제된 표적 단백질의 정량분석을 위해 브래드 포드 분석(Bradford assay)을 수행하였으며 상술한 균주를 대상으로 본 발명의 정제된 재조합 단백질을 이용하여 URDA 방법으로 항균활성을 측정하였다.

본 발명자들은 RACE 방법을 이용한 cDNA 시퀀싱을 기반으로 myticusin-beta 유전자를 증폭시켰고 TrxA 융합 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하였다(C.H Kim, et al., FEBS. 3332-3338. 2017). E. coli 유래 TrxA 단백질과 융합된 N-말단 6X his-tag를 포함하는 pET-28a(+)-TrxA 융합 벡터는 E. coli 세포질에서 가용성 단백질의 높은 수준의 생산에 유용한 발현 벡터로 사용되었다. 상기 구축된 플라스미드의 발현을 위해 E. coli BL21에 형질전환 시켰고 상기 유도된 재조합 단백질 발현은 EzWay-PAG 겔로 분석하였으며 단백질 발현은 상등액 및 펠렛에서 확인되었다. 그 후 12 kDa의 티오레독신(thioredoxin)을 갖는 표적 단백질을 정제하였고, 상기 결과는 티오레독신과 표적 단백질의 계산된 분자량과 일치하였다. 그 후, 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고 예상되는 단백질의 분자량에 상응하는 명확한 단일 밴드를 관찰하였다(도 4). 최종적으로, 정제된 재조합 펩타이드를 탈염(desalted)하고 동결건조시켜 항균활성을 평가하였다.

E. coli를 숙주로서 사용하는 단백질 발현 시스템은 작은 양이온성 항균 펩타이드(cationic peptides)의 발현에 몇 가지 문제점을 갖고 있다. 목적의 재조합 단백질 유전자는 외부로부터 도입된 불필요한 단백질로 인식되어 불용성 응집(insoluble aggregation)형태로 발현되었다. 그리고 불용성 응집은 활성을 위한 리폴딩 과정을 통해 정확한 형태로 리폴딩 되어야 한다(Y Shan, et al., J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 58(6) (2015) 807-812. 2015). E. coli 발현 방법의 단점을 극복하기 위해 다양한 방법들이 시도되었고, 그 중에서도 발현과 접힘 과정을 도와주는 단백질과 융합 발현되는 기술이 목적으로 하는 단백질의 고 수율 발현에 가장 적합한 것으로 보고되었다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 myticusin-beta를 pET-28a(+)-TrxA 융합 벡터에 라이게이션 하였고 이는 양이온성 펩타이드 발현에 적합하였다(K.L. Piers, et al., Gene. 134(1). 7-13. 1993). 다양한 융합 단백질을 통한 발현방법은 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST), N-utilization substance(NusA), 말토오스 결합 단백질(MBP) 및 Trx 들이 주로 사용되었고(S. Costa, et al., the novel Fh8 system. 5(63). 1-20. 2014) 상기 융합 단백질들에 의해서 목적 단백질의 발현과 활성형으로 발현되는 정도가 향상시키는 것으로 보고되었다. 상기 융합 파트너 중에서 GST(20 kDa), NusA(55 kDa) 및 MBP(43 kDa)는 항균 펩타이드보다 크기가 너무 큰 단백질이기 때문에 이들의 공동 발현(co-expression)은 유보하였다. 그러나 TrxA 단백질은 12kDa으로 크기가 작고, 발현 및 활성형태로 생산을 유도하는 효과가 있어 본 연구에 적합하였다(S. Costa, et al., the novel Fh8 system. 5(63). 1-20. 2014). 상기 연구에서 myticusin-beta는 수용성의 형태로 발현되었고, 티오레독신 유전자(trxA) 융합 발현 시스템은 E. coli 세포질에서 봉입체(inclusion body) 형성을 회피함으로써 항균 펩타이드 발현에 유용하였고 적절한 정제단계를 취할 수 있다.

실시예 9: 웨스턴 블로팅(Western blotting)

본 발명자들은 샘플을 100℃에서 10분 동안 가열하였고 웨스턴 블롯을 위해 10% 아스파르트산염(aspartate) 겔로 분리하였다. 그 후 제조사의 지침에 따라 WesternBreeze^ㄾ 발색성 Western Blot Immunodetection 키트(Invitrogen, USA)를 사용하여 밴드를 수득하였고 상기 겔을 세척한 후, 니트로셀룰로오스(NC) 막 상에서 15V로 1시간 동안 트랜스-블로팅(trans-blotted)을 수행하였다. NC 막을 항-his 항체(1:5000, Invitrogen, USA)와 배양하였고 알칼리성 포스파타제-결합된 2차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였으며 발색 기질(chromogenic substrate)을 사용하여 단백질 밴드를 확인하였다.

실시예 10: myticusin-beta 발현의 정량분석

본 발명의 myticusin-beta의 mRNA 발현 수준은 real-time qPCR로 분석 하였고 폐각근(adductor muscle), 족부근육, 아가미, 혈구, 간췌장, 외투막 및 출수공 등의 조직에서 myticusin-beta 유전자의 전사수준(transcriptional level)을 측정하였다. 발현정도 분석을 위한 기준으로(internal reference gene) β-액틴 유전자를 사용하였으며, myticusin-beta 및 β-액틴에 대한 증폭 특이성은 용융곡선(melting curve)으로 분석하였다. 구체적으로, 정량분석을 위해 참담치는 V. parahaemolyticus를 감염하여 면역체계를 활성화 시킨 후, myticusin-beta의 조직-특이적 발현 수준은 정량적 실시간 PCR(qRT-PC)으로 측정하였다. 구체적으로, TRI 시약을 사용하여 폐각근(adductor muscle), 발, 아가미, 혈구, 간췌장(hepatopancreas), 외투막 및 출수관(excurrent siphon)으로부터 총 RNA를 추출하였다(Sigma-Aldrich, USA). cDNA는 cDNA Synthesis Kit(Roche, Germany)를 사용하여 전사체 제1 가닥으로 합성하였고 이를 주형으로 사용하였다. 희석된 cDNA 1.0 μL, 2X Fast SYBR Green Master Mix(ABI, USA) 10 μL, 각 프라이머 0.5 μL(10 pmol/μL) 및 DW 8 μL를 포함하는 최종 부피 20 μL에서 증폭을 수행하였고 증폭조건은 하기와 같다: ABI 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, USA)에서 95℃에서 10분 동안 1사이클, 이어서 95℃에서 15초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 30초 동안 40 사이클. 그 후, 정확한 특이적 증폭을 입증하기 위해 용융 곡선(melting curve)을 수행 후 분석하였고 발현 수준을 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 18S rRNA 발현 수준과 비교하였으며 상대적인 발현(평균 ± 표준 편차)으로 제시하였다(K.K. Livak, et al., Methods. 25. 402-408. 2001).

그 결과, myticusin-beta의 유전자 발현은 외투막, 혈구, 폐각근, 발, 간췌장, 아가미 및 출수공을 포함한 모든 조직에서 발현되었다(도 8). myticusin-beta의 mRNA가 외투막에서 가장 높게 발현되었고, 이어서 혈구에서 발현이 측정되었다. myticucin-beta 발현은 폐각근 및 아가미에서 중간활성을 나타내었으며, 발, 간췌장 및 출수관에서 낮게 나타났다. 연체동물인 담치류는 개방 순환 시스템(open circulatory system)을 갖추고 있어 항균 펩타이드가 생산되면 혈림프를 통해 모든 조직으로 운반된다. 따라서 혈구에서 발현된다고 알려진 M. coruscus 유래 myticusin-1은 혈구에서 분리되었다(Z. Liao, et al., Fish shellfish Immunol. 34. 610-616. 2013). 그러나, 세균 감염 후 외투막 조직에서 mycusin-beta mRNA의 가장 높은 발현 수준이 검출되었다(도 8). 따라서, 상기 결과는 myticusin-beta가 조직 특이적 방식으로 생성되고 M. coruscus의 면역체계와 관련이 있음을 시사한다.

실험예 1: 항-스쿠치카 섬모충(scuticociliate) 활성

스쿠치카 섬모충(Scuticociliates)은 scuticociliatosis 질병의 원인 병원체로 간주되는 기생충으로 양식산업에서 대량 폐사와 막대한 경제적 손실을 야기한다(M.C. Piazzon, et al., Dev. Comp. immunol. 41. 248-256. 2013). 양식 어류의 scuticociliatosis 질병 발생이 세계적으로 증가하고 있으며 이를 해결하기 위한 항-스쿠치카 섬모충과 관련된 물질 개발이 필요하다. 일부 해양 항균 펩타이드는 원생동물(protozoa)에 대해 생육을 억제한다고 알려져 있는데 예컨대, Psuedosciaena corcea 유래 양이온성 펩타이드인 Pc-Pis는 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대해 항균활성을 갖고 피시딘(piscidin) 과(family)와 유전적으로 관련이 있는 것으로 나타났다(S.F. Niu, et al., Fish Shellfish Immunol. 35 (2) 513-524. 2010). 따라서 본 발명자들은 정제된 재조합 펩타이드의 스쿠치카 섬모충에 대한 항-스쿠치카 섬모충 활성을 조사하였고 본 발명의 정제된 재조합 단백질의 항-스쿠치카 섬모충 활성은 WST-1 용액 분석에 의해 치사율, 형태 및 기생충 수로 평가하였다.

그 결과, 24시간 후 재조합 단백질의 최고 농도인 200 μg/mL에서 기생충의 약 50%가 감소하는 것으로 나타났다. 스쿠치카 섬모충의 방추(spindle) 모양이 부풀어 오르거나 파열되었음을 현미경으로 관찰하였고(도 6A) 빨리 움직이는 스쿠치카 섬모충의 이동이 느려지거나 멈춰있는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 재조합 단백질로 처리된 스쿠치카 섬모충은 무처리군보다 낮은 생존력을 나타내었는데 WST-1 세포 증식 분석을 통해 재조합 단백질의 농도로 인해 스쿠치카 섬모충의 생존율이 감소하는 것을 관찰하였다(도 6B). 상기 결과는 재조합 myticusin-beta가 스쿠티카 섬모충에 대해 우수한 항-기생충 활성을 나타냄을 시사한다.

실험예 2: 항균 활성(antimicrobial activities)

본 발명자들은 상기 표 1의 다양한 지표 균주를 이용한 URDA 방법을 이용하여 본 발명의 myticusin-beta의 항균활성을 관찰하였다. 그 결과, 재조합 myticusin-beta는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에 대해 항균활성을 나타내었다(도 7). 구체적으로 Myticusin-beta는 B. subtils, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus 및 S. mutans를 포함한 그람 양성균 및 P. aeuruginosa, Vibro alginolyticus를 포함한 그람 음성균에 대해 강한 활성을 나타내었으며 B. cereus 및 Klebsiella pneumoniae에 대해서는 중간정도의 활성을, Streptococcus iniae 및 E. coli에 대해 다소 약한 활성을 나타내었다. 특이하게 그람 양성균은 그람 음성균 보다 myticusin-beta에서 더 높은 감수성을 나타냈다.

Denfensins, mytilins, mytichitin-CBD, myticusin-1 및 myticin과 같은 담치류 유래의 항균펩타이드들은 세균과 곰팡이에 대한 항균활성이 보고되었으며 mytimycin은 곰팡이에 대한 항균활성만 알려져 있다(G. Mitta, et al., Dev. Comp. Immunol. 24. 381-393. 2000). 종래 보고된 항균 펩타이드 중에서, myticin, mytichitin-CBD 및 myticusin-1은 그람 음성균 및 곰팡이에 대해 매우 낮은 활성을 나타내었다(Z. Liao, et al., Fish shellfish Immunol. 34. 610-616. 2013). 또한 본 발명자들은 myticusin-beta는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 갖지만 곰팡이에 대한 활성은 없음을 확인하였고 종래 보고된 대부분 연체동물 항균 펩타이드는 그람 음성균 보다 그람 양성균에 대해 더 강한 활성을 나타내었다. 이러한 균주에 대한 항균 펩타이드의 활성 차이는 균주들의 세포막과 세포벽의 구성성분에 따라서 발생한다. 그람 양성균은 세포벽에 여러 층의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 갖고, 그람 음성균의 막은 침투성 장벽으로 균을 보호하는 LPS를 함유하는 외부 막으로 둘러싸인 펩티도글리칸의 단일층을 갖는다(V. Teixeira, et al., Prog. Lipid. Res. 51(2). 149-177. 2012). 항균 펩타이드는 세포 외피(cell envelopes)와 상호작용하거나 통과하여 세포 내 표적물질에 도달한다. 곰팡이 세포벽은 키틴 및 글루칸과 같은 복잡한 다당류가 포함되어 있으며 세포질 막까지 단단하게 구성되어 있다. 이와 같이 항균 펩타이드의 활성범위는 넓거나 좁으며 강하거나 약하기 때문에 단독으로 사용할것인지, 여러 펩타이드를 섞어서 사용할 것인지를 고려해야 된다. 그리고 이러한 방법으로 효과적으로 유해 균주를 제어할 수 있으며 이를 위해서는 다양한 활성을 가지는 항균 펩타이드의 개발과 연구가 필요하다.

실험예 3: myticusin-beta 펩타이드 유사체의 항균 활성

본 발명자들은 myticusin-beta를 사용하여 합성 단가가 낮고 활성과 확산이 향상되도록 짧은 길이의 항균 화합물로서 유사체(analogs)를 설계하였다. 신호 펩타이드를 포함하는 myticusin-beta의 고유 서열을 기반으로 짧은 항균성 펩타이드 유사체를 고안하였고 일부 아미노산을 대체하여 유사체를 제조하였다. 상기 유사체의 특성을 분석하기 위해 Schiffer-Edmundson helical wheel projection은 EMBOSS Pepwheel(European Bioinformatics Institute, UK)과 함께 수행하였다. 펩타이드의 항균활성과 양이온을 증가시키기 위해 아르기닌(Arg)과 류신(Leu) 아미노산을 대체하였다. 순 전하(net charge), 분자량, Boman 지수(잠재적 단백질 상호 작용 지수), pI 값 및 소수성의 정보는 항균성 펩타이드 데이터베이스 v2.34 (APD2; http://aps.unmc.edu/AP/main.php)를 이용하여 계산하였다(G, Wang, et al., Nucleic Acids Res. 37. D933-D937. 2009). 항생제의 대체물로서 짧은 항균 펩타이드의 개발을 위해 펩타이드의 길이, 전하, 소수성, Boman 지수 및 아미노산의 잔기구조를 고려하여 myticusin-beta의 활성형 펩타이드에서 펩타이드 단편 VDAFHIYSRR(서열번호 6)을 선택하여 합성하였다(표 3 참조). 본 발명의 펩타이드 변이체의 물리화학적 특성을 하기 표 3에 요약하였다.

펩타이드 유사체의 물리화학적 특성

	천연	유사체
서열	VDAFHIYSRR	VRAFHILLRL
길이	10	10
전하	+1	+2
분자량(Da)	1,263.42	1,237.56
보만지수(kcal/mol)	3.3	0.59
pI	8.72	11.8
소수성 비율(%)	40	70
소수성(kcal/mol)	1.01	-1.09
영역	84-93
변형		D→R, Y→L S→L, R→L
서열번호	6	7

또한 합성 펩타이드의 2차 구조에서 소수성 및 친수성 영역을 예측하기 위해 Schiffer-Edmundson helical wheel projection을 수행했다(도 9). 인접한 아미노산과 잔기들 사이의 상호 작용과 효과를 예측할 수 있는 EMOSS pepwheel 프로그램을 이용하여 천연 및 유사체 펩타이드의 2차 구조에서 소수성 및 친수성 영역을 나타냈다. 본 발명자들은 항균활성을 향상시키기 위해 일차 구조상 앞ㅇ뒤의 인접한 아미노산뿐만 아니라 이차구조인 알파 나선상의 상부과 하부의 아미노산을 고려하여 양이온성 항균 펩타이드를 설계했다. myticusin-beta의 천연 형태의 아르기닌(Arg), 티로신 (Tyr), 아스파르트 산(Asp) 및 세린(Ser) 잔기는 유사체에서 Arg 또는 Leu로 변형되었다. 상기 재형성된 유사체 펩타이드는 소수성 및 친수성 영역이 서로 반대 위치에 자리하며, 이러한 양친매성이 항균활성에 기여한다. 상기 양이온성 항균 펩타이드는 음으로 하전된 박테리아 막과 상호작용하고 막 관통 기공(transmembrane pores)을 형성하는 전체 양전하를 갖는 양친매성 펩타이드이다(B.H. Nam, et al., Drugs. 12. 5240-5257. 2014). 증가된 순 전하(+1 내지 +4), 기본 pI 값(> 10), 감소된 Boman 지수값(≤1), 및 전환된 구조는 좀 더 광범위한 균주에 항균활성을 기록하였다.

본 발명의 펩타이드 유사체의 항균활성을 측정한 결과 모든 지표 균주(9 그람 양성균, 9 그람 음성균 및 진균 Candida albicans)에 대해 향상된 항균활성을 나타내는 반면, 변형 전 천연형태의 항균 펩타이드는 B. subtilis, S. aureus, 및 C. albicans에 대해서만 항균활성을 나타내었다(표 4 참조). 상기 합성 유사체 펩타이드는 낮은 Boman 지수, 증가된 순 전하로 인해 그람 양성균, 음성균 및 곰팡이에 대해 향상된 활성을 유도하였다. 따라서 유사체의 총 소수성 비율(hydrophobic ratio)과 합성 유사체 펩타이드에 대한 연구는 항균 펩타이드가 활성화 될 수 있고 새로운 항생제 대체물 연구에 크게 기여할 수 있음을 시사한다. 상기 펩타이드 천연 및 유사체의 항균활성을 하기 표 4에 요약하였다.

펩타이드 변이체의 항균활성

	천연	유사체
억제 지름 영역(mm)
그람 양성균
B. cereus	-	4.9
B. subtilis	4.5	7.9
E. faecalis	-	5.1
S. mutans	-	8.0
S. iniae	-	5.1
S. aureus	2.5	7.2
S. vestibularis	-	2.5
S. parauberis	-	13.1
L. garvieae	-	7.9
그람 음성균
V. alginolyticus	-	6.6
V. parahaemolyticus	-	7.6
E. coli	-	11.7
E. cloacae	-	8.6
K. pneumoniae	-	9.9
E. tarda	-	4.3
P. mirabilis	-	6.6
P. stuartii	-	9.1
P. aeruginosa	-	9.2
진균
C. albicans	2.5	9.3

*웰의 직경: 2.2 mm

실험예 4: 용혈 활성(hemolytic activity)

본 발명자들은 본 발명의 재조합 펩타이드의 독성을 결정하기 위해, 넙치(Paralichthys olivaceus)의 적혈구(erythrocytes)에 대해 용혈 활성을 측정하였다. 용혈 활성 분석을 위해 넙치 혈액 세포를 수집한 후 인산나트륨 완충액(150 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨 pH 7.4)으로 희석하였고 5,000 rpm, 4℃에서 1분 동안 원심분리하였다. 그 후 혈액세포를 세척하여 버피 코트(buffy coat) 및 혈장을 제외한 적혈구를 수집하였고 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중 90 μL의 3% 적혈구를 10 μL의 샘플과 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS에서 100 μL의 3% 적혈구 및 샘플을 5,000 rpm, 4℃에서 1분 동안 원심분리하였고, 70 μL의 상층액을 96웰 플레이트에 주입하였다. 그 후, VICTOR3 1420 플레이트 리더(Perkin Elmer, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 용혈을 모니터링하였고 1% Triton X-100 및 피시딘 1(1 mg/mL)을 양성 대조군으로 사용하였으며 0.01% HAc 및 PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 용혈 활성 백분율은 하기와 같이 계산하였다: 용혈활성(%)= [(Abs_{405 nm} 테스트-Abs_{405 nm} 버퍼)/(Abs_{405 nm} 1% Triton X-100-Abs_{405 nm} 버퍼)] x 100.

그 결과, 양성 대조군인 Piscidin 1 및 Triton X-100은 강한 용혈 활성을 나타내었지만, 본 발명의 재조합 myticusin-beta 펩타이드는 용혈 활성을 나타내지 않았다(도 5A). 또한, 상기 Piscidin 1은 고농도에서 매우 높은 용혈 활성을 보였으며 저농도에서는 급격히 감소한 반면, myticusin-beta 펩타이드는 농도 의존적 용혈 활성을 나타내지 않았다(도 5B). 상기 결과는 본 발명의 재조합 펩티드가 용혈 활성을 나타내지 않는다는 것을 입증하는 것이다.

일부 항균 펩타이드는 숙주 세포에 대한 용혈 활성과 같은 세포독성이라는 단점을 갖는데 항균 펩타이드는 정전기적 상호작용을 통해 간접적으로 박테리아 표면에 결합하거나 숙주 세포와 직접 상호작용하며 세포막의 투과성을 증가시켜 막 파괴(membrane disruption)를 유발한다(G. Diamond, et al., Curr. Pharm. Des. 15. 2377-2392. 2009). 따라서 항균 펩타이드를 대체 항생제로 사용하려면 비-용혈성 항균 펩타이드가 필요하므로 상기 결과는 재조합 단백질인 myticusin-beta가 항생제의 대체물로서 낮은 용혈활성과 적용성을 나타냄을 시사한다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험에가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여

정해져야 할 것이다.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Antimicrobial peptide derived from from the marine bivalve, Mytilus coruscus and uses thereof <130> PD19-5841 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myticusin-3RACE <400> 1 gattacgcca agcttgacca ccagatggca cagtcggcct gc 42 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myticusin-5RACE <400> 2 gattacgcca agctttattg cggatgcata tgcgcgtctg 40 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-linker F <400> 3 ggatccatgt cagaccatca gatggca 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI-linker R <400> 4 ctcgagttaa acgatacaac agcagaagtt 30 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myticusin-beta <400> 5 Ser Asp His Gln Met Ala Gln Ser Ala Cys Met Gly Leu Ala Gln Asp 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Ala Ser Ala Ile 20 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myticusin-beta peptiede fragment <400> 6 Val Asp Ala Phe His Ile Tyr Ser Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myticusin-beta peptiede analogs <400> 7 Val Arg Ala Phe His Ile Leu Leu Arg Leu 1 5 10

Claims (8)

1. 서열번호 5 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 항균 펩타이드.
2. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   그람 음성균, 그람 양성균 또는 진균에 대한 항균활성을 갖는, 항균 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 그람 음성균은 Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Edwardsiella tarda, Proteus mirabilis, Providencia stuartii 또는 Pseudomonas aeruginosa인, 항균 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 그람 양성균은 Bacillus cereus, B. subtilis, Enterococcus faecalis, Streptococcus mutans, Streptococcus iniae, Staphylococcus aureous, Streptococcus vestibularis, Streptococcus parauberis 또는 Lactococcus garvieae인, 항균 조성물.
6. 제3항에 있어서,
   상기 진균은 Candida albicans인, 항균 조성물.
7. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 사료 첨가제.
8. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카 섬모충 방제용 조성물.

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