KR101905016B1

KR101905016B1 - 홍합에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101905016B1
Application number: KR1020160184073A
Authority: KR
Inventors: 서정길; 이기영; 조상만; 이인아
Original assignee: 군산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-10-05
Also published as: KR20180078853A

Abstract

본 발명은 홍합 아가미에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 홍합의 아가미로부터 유래하는 펩타이드로서 용혈 활성이 낮아 인체에 대한 독성이 낮고 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드이다.

Description

홍합에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도{Antimicrobial Peptide Derived From The Mytilus coruscus And Its Use}

본 발명은 홍합(Mytilus coruscus) 아가미에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물, 식중독 예방 또는 치료용 조성물, 화장료 조성물, 사료첨가제 또는 위생용품에 관한 것이다.

인간을 비롯한 대부분의 척추동물 및 무척추동물들은 세균, 바이러스, 곰팡이 등과 같은 외부물질의 침입으로부터 자신을 방어하기 위한 면역 체계를 가지고 있다(Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415:389-95). 이러한 면역체계는 침입자에 관계없이 1차 방어역할을 하는 선천면역 (innate immunity)과 침입자에 대해 특이적인 반응을 하는 적응면역 (host defense)으로 나눌 수 있다. 척추동물에는 선천면역과 적응면역이 각각 잘 발달되어 있지만 무척추동물에서는 선천면역만을 포함하고 있다(Tincu, J.A., Taylor, S.W. Antimicrobial peptides from marine invertebrates, Antimicrob. Agents Chemother. 2004;48:3645-3654). 특히, 선천면역은 외부 침입물질에 대한 초기방어 및 적응 면역의 유도를 담당하므로 그 기능과 역할에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 선천면역을 담당하는 대표적인 면역관련 물질로는 lectin, prophenoloxidase activating factor, cytokines, enzymes, antimicrobial peptide/protein등이 있다. 이들은 외부로부터 생체 내에 비자기 물질들이 침입하면 1차적으로 그것을 제거하는 역할을 직접, 간접적으로 담당한다. 특히, 여러 가지의 선천면역 요소들 중에서 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)는 병원균이 자기 방어를 위한 내성획득을 어렵게 하는 성질이 있으며 비특이적이고 빠른 반응성을 가지는 특징을 가지고 있기 때문에 새로운 항생제 개발을 위한 연구에 있어 가장 주목 받고 있는 후보물질들 중의 하나다(Pasupuleti, M., Schmidtchen, A., Malms-ten, M. Antimicrobial peptides: key compo-nents of the innate immune system. Crit Rev Biotechnol. 2012;32:143-71).

현재까지 식물이나 육상 생물에 대한 AMP 연구는 활발히 진행 중이지만, 해양 무척추동물로부터의 연구는 미흡한 실정이다. 실제로 해양무척추동물의 대부분은 외부침입에 대한 방어수단으로서 innate immune system에 대부분 의존하고 있기 때문에 AMP의 역할이 더욱 중요하게 작용하고 있다. 육상 환경과 달리 해양환경에 서식하는 해양생물들은 bacteria, viruses, parasites, fungi과 같은 병원성 감염원에 항상 노출되어 있으며, 이러한 환경적인 상황을 극복하기 위해서 감염원에 대한 효율적인 방어기작을 포함하고 있을 가능성이 높다(Seo, J.K., Crawford, J.M., Stone, K.L., Noga, E.J. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster, Crassos-trea virginica. Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 2005;338:1998-2004).

그 동안 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생물질을 찾기 위해 다양한 생물체에서 펩타이드성 항생물질이 분리되어 시험되었다. 그러나 실제 제품화되고 있는 사례는 극히 드문데, 이는 펩타이드 항생제가 생체 내에 주입되었을 때의 안정성이나 인체에 대한 안전성의 문제가 제기되었기 때문이다.

이러한 난점을 해결하기 위해서는 항균 활성을 갖는 펩타이드들의 아미노산 서열과 구조를 비교 분석하여 인체에는 위해를 가하지 않으면서 효율적으로 미생물을 사멸시킬 수 있는 구조를 알아내야 한다. 이를 위해서는 지금까지 보고된 것 이상의 다양한 항균 펩타이드의 아미노산 서열과 구조에 대한 정보가 필요한 실정이다.

최근의 연구에서는 굴, 전복 및 군부 등의 아가미 또는 외투막에는 외부 감염원에 대한 효율적인 방어 기작의 하나로서 항균활성 펩타이드가 중요한 역할을 담당한다는 것이 보고가 되고 있다. 이러한 보고는 외부 환경에 대한 일차방어 역할을 담당하는 아가미 및/또는 외투막이 조개류의 면역 기작에서 중요한 역할을 담당하는 기관으로서 선천 면역의 기능을 수행하는 항균활성 물질의 탐색 및 정제에 대한 연구에 중요한 대상이 됨을 의미하는 것이지만, 이를 주요 대상으로 하여 신규 항균 펩타이드를 개발하려는 노력은 많이 부족한 실정이다.

본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1374267호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1은 신규한 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 관한 것이고, 보다 상세하게는 전복으로부터 분리된 항생 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 뛰어난 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 특허문헌 1에서는 전복에서 분리한 항균용 펩타이드에 관한 내용만이 개시되어 있을 뿐, 홍합으로부터 정제되는 펩타이드로부터 유래되는 항균 펩타이드에 관하여는 어떠한 개시 또는 암시조차 되어 있지 않다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-1374267호

본 발명은 홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한, 용혈활성이 낮고 항균 활성이 뛰어난 항균 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 위생용품을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드에 관한 것이다.

상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 대장균(E. coli)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태일 수 있다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 위생용품에 관한 것이다.

본 발명은 홍합의 아가미로부터 유래하며 용혈 활성이 낮아 인체에 독성이 낮고 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드로서, 항균용 약학 조성물, 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물, 화장료 조성물, 사료 첨가제 또는 위생용품의 제조에 활용될 수 있다.

도 1은 실험예 1에서 실시예 1의 추출물을 이용하여 펩타이드성 물질의 구성분포와 그들의 항균활성 유무를 확인하기 위해서 Acid Urea-PAGE와 bug-blot을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예 1의 추출물로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 역상 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1의 추출물로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 양이온 교환 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1의 추출물로부터 역상 HPLC를 이용한 항균 펩타이드의 최종 정제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실험예 2에서 실시예 2의 항균 펩타이드의 분자량을 MALDI-TOF 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 최종 정제된 본 발명의 항균 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 3에서 실시예 2의 항균 펩타이드의 2차 구조를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2의 펩타이드의 DNA와의 결합력을 EMSA법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 2의 항균 펩타이드의 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 2의 항균 펩타이드의 용혈 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 항균 펩타이드는 홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이다.

상기 서열번호 1의 항균 펩타이드는 용혈활성을 보이지 않아 세포 독성의 문제가 없는 항균용 펩타이드이며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 대장균(E. coli)에 대하여 항균 활성을 나타낸다.

본 발명의 항균용 약학 조성물은 홍합(Mytilus coruscus)으로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.

상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 항균 활성을 보이는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 대장균(E. coli)으로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에 이러한 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하여 상기 질병들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 항균용 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태일 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 항균용 식품 첨가제 또는 사료첨가제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 물티슈, 손 소독제, 구강청정제, 구강소독제, 치약첨가제와 같은 위생용품의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1: 홍합의 조직 추출>

실험에 사용된 홍합은 전북 군산시 해망동 수산물종합센터에서 살아있는 상태로 구입한 후, 실험실로 옮겨서 즉시 조직 채취 및 추출과정을 수행하였으며, 얻어진 각각의 추출물들은 사용 전까지 -70℃에서 보관하였다.

항균활성 측정을 위한 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, TSB)와 아가로스 타입 I(Low EEO Agar)는 Merck사(Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 물과 아세토니트릴(CH₃CN)은 Tedia사(Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.

홍합의 아가미 조직을 채취한 후 즉시 약산을 이용한 추출과정을 수행하였다. 채취된 조직을 4배의 조직 부피에 해당하는 1% 초산(v/v)에 첨가하고 열을 가해서 5분 동안 끓인 후에 얼음에 보관하면서 완전히 냉각을 시켰다. 냉각된 조직을 homogenizer를 이용해서 완전히 파쇄를 시킨 후에 원심 분리를 하였다. 상층액을 취해서 항균활성 탐색 및 펩타이드 정제에 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.

<실험예 1: 펩타이드성 물질의 분포도 확인>

실시예 1의 추출물 내의 펩타이드성 물질의 분포도를 확인하기 위해서 Acid Urea-PAGE 및 bug-blot을 수행하였다.

먼저, AU-PAGE를 수행하기 위해서는 Acetic acid와 urea를 포함하는 gel에 각 추출물 20㎕를 2×sample buffer와 혼합한 후에 gel에 도입시킨 후에 150V로 50분 동안 전기영동을 수행하였다(Marker로는 human histone H1(~21 kDa) 1㎍, lysozyme(~11 kDa, 2㎍), aprotinin(~6.5 kDa, 3㎍) 및 synthetic peptide piscidin 1(~2.5 kDa, 1㎍)을 사용하였다). 전기영동 후, gel은 coomassie brilliant blue(CBB) R-250 dye로 염색을 한 후에 결과를 확인하였다.

또한, bug-blot을 수행하기 위해서는 전기영동 후에 염색과정을 수행하지 않고 gel을 린스한 후에 E. coli D31을 포함하고 있는 LB plate 위에 blot시키고 3시간 동안 37℃에서 1차 배양한 후 gel을 제거하고 16-18시간 동안 37℃에서 2차 배양한 후에 생성된 clearing zone과 염색된 gel의 결과를 비교하였다.

상기의 AU-PAGE 및 bug-blot의 수행 결과를 도 1에 함께 나타내었다.

상기 AU-PAGE 및 bug-blot의 수행 결과, 본 발명에 따른 홍합 아가미 추출물은 저분자 물질과 고분자 물질 부분에서 강한 항균 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 홍합 아가미 추출물에는 positive net-charge를 가진 다양한 크기의 단백질성 항균 물질이 존재하고 있다는 것을 의미하는 것이다.

<실시예 2: 항균 펩타이드의 분리 및 정제>

실시예 1의 홍합 아가미 추출물은 HPLC(YL9100 HPLC system, 영린기기, Korea)를 이용하여 활성물질을 분리 정제하였다. 양이온 교환 HPLC를 위해서는 TSKgel SP-5PW(7.5 x 75 mm)를 사용해서 10mM phosphate buffer(PB)(pH 6.0)와 1.0 M NaCl을 포함하는 PB(pH 6.0)로 0℃에서 1.0 M NaCl까지 100분 동안 농도구배를 주어서 1 mL/min의 유속으로 220nm에서 분리과정을 수행하였다. 또한 역상 HPLC를 수행하기 위해서 95% A 용매(0.1% TFA in HPLC grade water)와 5% B 용매(0.1% TFA in HPLC CH₃CN)로 평형화시킨 CapCell-Pak C18 column(4.6 mm×250 mm, Shiseido, Japan)에 시료를 주입한 후, 60분간 용매 B(5-65%)의 농도구배로 용출시켰다. 이때, 유속은 1.0 mL/min로 유지하였으며, 각각의 분리된 획분은 URDA 방법으로 B. subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성을 측정하였다. 활성 peak들은 동일한 조건으로 최종 단계를 진행한 후에 단일 peak로 정제하였다.

상기 정제과정을 거친 추출물을 CapCell-Pak C₁₈ column(4.6mm×250mm, Shiseido, Japan)에 도입하였으며, 분리된 각각의 분획들은 B. subtilis 에 대해서 URDA법으로 항균활성을 측정하였다. 도 2는 홍합 아가미 추출물로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 역상 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 2에서, 14분에 용출된 분획에서 항균 활성이 나타났으며, 이러한 B. subtilis KSTC1021에 대해 항균활성을 나타낸 peak는 화살표로 나타내었다.

상기의 활성분획을 모아서 양이온 교환 column인 TSK-gel SP-5PW column(7.5mm×75mm, Tosoh, Japan)에 도입하고, 분리과정을 수행하였다. 도 3은 홍합 아가미 추출물로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 양이온 교환 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 3에서, B. subtilis KSTC1021에 항균활성을 나타낸 peak는 화살표로 나타내었다. 상기 실험 결과, 항균활성은 0.83M NaCl 농도에서 용출된 분획에서 확인되었다.

상기 항균활성이 확인된 양이온 교환 column으로부터 얻은 활성분획을 모아 항균 펩타이드를 최종적으로 정제하기 위해서 CapCell-Pak C₁₈ column(4.6mm×250mm)에 도입하여 순수한 항균 물질을 정제하였다. 도 4는 홍합 아가미 추출물로부터 역상 HPLC를 이용한 항균 펩타이드의 최종 정제 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 4에서, B. sutilis KCTC1021에 항균활성을 나타낸 peak는 화살표로 나타내었다.

<실험예 2: 펩타이드의 분자량 및 서열 확인>

실시예 2의 항균 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF/TOF 5800 system(AB SCIEX)을 이용하여 측정하였다. 이때, 사용된 matrix는 5 mg/mL(0.1% TFA/50% acetonitrile)의 농도로 녹여진 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)이다. 상기 분자량 측정시, 10 μL의 0.1% TFA 용매로 펩타이드를 녹인 후, matrix와 1:1(v/v)로 섞어 기기에 도입시키고, MS Reflector(Positive) operation mode로 분자량을 측정하였으며 standard는 Calmix 2를 사용하였다.

분자량 측정 결과, 정제된 펩타이드의 분자량은 5540.4 Da인 것으로 확인되었다. 도 5는 홍합 아가미로부터 최종 정제된 펩타이드의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 펩타이드의 분자량은 pulsed smart beam II가 장착된 UltrafleXtreme MALDI-TOF mass spectrometer를 사용한 linear mode로 측정을 하였다.

상기 홍합 아가미 추출물로부터 최종 정제된 항균 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하기 위해서 한국기초과학지원 연구원에 있는 Procise 491 HT protein sequencer(Applied Biosystems, USA)를 사용하고, Edman 분해법으로 분석하였다. 그 결과, 상기 펩타이드는 56개의 아미노산으로 구성된 것이 밝혀졌다.

도 6은 최종 정제된 항균 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.

<실험예 3: 펩타이드의 2차 구조>

실시예 2의 항균 펩타이드의 2차 구조는 EMBOSS GUI (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/)의 Garnier method를 사용하여 예측되었다. 그 결과 정제된 펩타이드는 부분적으로 turn 구조를 포함하면서 α-helix 구조를 주요하게 취하는 것으로 예측되었다(도 7 참조).

<실험예 4: 펩타이드의 상동성 확인>

정제된 펩타이드들의 상동성 확인은 Genome Net의 BLASTP 2.2.10와 TBLASTN 2.2.10을 이용해서 수행되었다. 그 결과 최종 정제된 펩타이드는 현재까지 알려진 항균 펩타이드/단백질과 높은 상동성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 홍합 아가미에서 정제된 본 발명의 펩타이드가 현재까지 보고가 되지 않은 새로운 항균 펩타이드임을 의미하는 것이다.

<실험예 5: DNA-Binding assay>

홍합의 아가미(Gill) 및 외투막(Mantle)으로부터 추출물을 획득한 후, 각 추출물로부터 정제한 각각의 항균 펩타이드의 DNA-Binding ability를 확인하기 위해서 DNA-binding assay를 수행하였다.

각 펩타이드의 DNA-binding assay는 DNA와 펩타이드를 배양한 후 아가로스 겔 전기영동(agarose-gel electrophoresis)에서 DNA 이동을 저해하는 정도로서 확인하였다. 이를 위해서 1 Kb DNA 마커, λ-Hind III-digested DNA(50 ng)(Roche, Basel, Switzerland)와 각 펩타이드(1ug)를 혼합해서 37℃에서 60분 반응시킨 후 0.5μg/mL ethidium bromide(EtBr)를 포함하는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.

실시예 2의 펩타이드(Gill) 및 홍합의 외투막(Mantle) 추출물로부터 정제한 펩타이드의 DNA와의 결합력은 electrophoretic mobility shift assay(EMSA)법을 이용하여 측정하였다(도 8 참조). 구체적으로, 각 펩타이드들의 DNA-Binding ability는 l kb DNA ladder를 piscidin 1, 1 ug 또는 펩타이드 용액 5 uL와 혼합하고 37℃에서 60분 반응 시킨 후에 1% agarose gel에 도입시켜서 전기영동을 실시하여 측정한 것이다.

상기 측정 결과, 상기 실시예 2의 펩타이드(Gill) 및 외투막(Mantle) 추출물로부터 정제한 펩타이드는 DNA의 전기적 이동을 다소 저해하였으며 positive control로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1은 강한 DNA-binding ability를 나타내었다. 이러한 결과는 실시예 2의 펩타이드에는 DNA-binding ability를 가진 물질이 piscidin 1에 비해서는 다소 낮은 정도로 포함되어 있음을 의미하는 것이다.

<실험예 6: 펩타이드의 항균 활성 확인>

실시예 2의 항균 펩타이드의 항균 활성을 확인하기 위해서 E. coli D31과 B. subtilis KCTC1021에 대해서 URDA(ultrasensitive radial diffusion assay)법을 사용하였다.

URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18시간동안 pre-culture 후 colorimeter(Product No. 52-1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T( 1 x 10⁸ CFU/mL)가 되게 맞추었다. 그 후, 9.5 mL의 0.03% TSB, 1% Type agarose 및 10mM phosphate buffer(PB)(pH 6.5)를 포함하는 underlay gel에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 plate에 punch를 사용하여 직경 2.5mm의 well을 뚫은 후에 5μL의 펩타이드 용액(1000ug/mL in 0.01% HAc)을 도입시켰다. 모든 sample은 0.01% acetic acid 5μL를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다. 각 sample(펩타이드 용액)이 배지에 스며들면 3시간 동안 1차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6% TSB, 1% Type agarose 및 10 mM phosphate buffer(pH 6.5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다. 다음날 well 주위에 생긴 clearing zone의 크기를 측정하여 항균활성을 확인하였다.

상기 펩타이드 용액의 항균 활성을 확인한 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 홍합 아가미 추출물로부터 정제한 실시예 2의 항균 펩타이드가 측정에 사용된 두 균주에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다. 또한, 이러한 결과는 상기 실시예 2의 펩타이드가 Gram-(+)와 Gram-(-) bacteria 모두에 대해서 항균활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

<실험예 7: 펩타이드의 용혈 특성 확인>

실시예 2의 항균 펩타이드에 포함된 독성물질의 유무를 확인하기 위해서 상기 펩타이드의 인간 적혈구(혈액형: B형)에 대한 용혈 활성(hemolytic activity)을 측정하였다(도 10 참조).

구체적으로는, 사람 혈액에 동량의 phosphate buffered saline(PBS, 50mM sodium phos-phate, 150mM NaCl, pH 7.4)을 넣고 혼합한 후 8000 x g, 4℃, 1 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이러한 세척과정을 3회 반복한 후 얻어진 적혈구를 3% hematocrit이 되도록 PBS를 첨가하였다. 용혈활성을 측정하기 위해서 3% hematocrit 90μL를 e-tube에 도입시키고 10μL의 각 농도의 펩타이드 용액을 첨가하였다. 각각의 e-tube를 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 4℃에서 10분간 13,000 x g로 원심분리를 하였다. 얻어진 각각의 상층액에서 70μL를 취해서 96-well microtiter plate로 옮긴 후 542 nm에서 헤모글로빈 유출 정도를 측정하였다. 적혈구의 100% 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100(0.1%)을 사용하였으며, 다음 식을 사용하여 용혈활성 정도를 계산하였다.

% Hemolysis = [(Abs 542nm in the peptide solution - Abs 542nm in buffer) / (Abs 542nm in 0.1% Triton X-100 - Abs 542nm in buffer)] x 100

비교물질로는 piscidin 1을 사용하였으며 100% hemolysis의 표준물질로는 0.1% Triton-X 100을 사용하였다. 측정 결과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1은 낮은 농도(50㎍/mL)에서도 70% 이상의 강한 용혈활성을 나타낸 반면, 홍합 아가미 추출물에서 정제된 실시예 2의 항균 펩타이드 및 홍합 외투막 추출물에서 정제된 펩타이드는 용혈활성을 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과는 상기 펩타이드가 세포독성을 나타내는 물질을 거의 포함하고 있지 않다는 것을 의미하는 것이다.

하기 본 발명의 펩타이드를 위한 제조예를 예시한다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 펩타이드 20mg

유당 20mg

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 펩타이드 10mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 펩타이드 10mg

결정성 셀룰로오스 3mg

락토오스 14.8mg

스테아린산 마그네슘 0.2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 액제의 제조

본 발명의 펩타이드 20mg

이성화당 10g

만니톨 5g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

<1-5> 주사제의 제조

본 발명의 펩타이드 10㎍/㎖

묽은 염산 BP pH7.6이 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP중에 본 발명의 펩타이드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH7.6으로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입Ⅰ 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클레이브 살균하여 주사액제를 제조하였다.

<제조예 2> 화장품의 제조

<2-1> 유연화장수(스킨)

본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 [표 1]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
본 발명의 펩타이드	0.1~30%
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유	0.2
에탄올	8.0
구연산	0.02
구연산나트륨	0.06
방부제	미량
향료	미량
정제수	To 100

<2-2> 영양화장수(로션)

본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 [표 2]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
본 발명의 펩타이드	0.1~30%
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
스쿠알란	10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄	2.0
유창목오일	0.1~30%
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유	0.2
에탄올	8.0
구연산	0.02
구연산나트륨	0.06
방부제	미량
향료	미량
정제수	To 100

<2-3> 세안제(클렌징폼)

본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 [표 3]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
본 발명의 펩타이드	0.1~30%
N-아실글루타민산나트륨	20.0
글리세린	10.0
PEG-400	15.0
프로필렌글리콜	10.0
POE(15) 올레일알코올에테르	3.0
라우린유도체	2.0
메틸파라벤	0.2
EDTA-4Na	0.03
향료	0.2
정제수	To 100

<2-4> 영양크림

본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기 위해 하기 [표 4]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.

성분	함량(중량%)
본 발명의 펩타이드	0.1~30%
바셀린	7.0
유동파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	2.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
스쿠알란	3.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
산탄검	0.5
토코페닐아세테이트	0.1
향, 방부제	미량
정제수	To 100

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, KUNSAN NATIONAL UNIVERSITY <120> Antimicrobial Peptide Derived From The Mytilus coruscus And Its Use <130> HPC-6798 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Mytilus coruscus <400> 1 Ala Ala Thr Lys Gly Arg Gly Arg Pro Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Ala Ala Lys Ala Lys Ala Pro Lys Lys Ser Pro Lys Lys 20 25 30 Gly Ala Lys Lys Ala Val Lys Arg Ala Gly Ala Lys Lys Thr Ala Lys 35 40 45 Lys Ala Gly Lys Gly Lys Lys Lys 50 55

Claims

홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 대장균(E. coli)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학 조성물.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.
홍합(Mytilus coruscus) 아가미로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 위생용품.