KR102390586B1 - 항암제 병용 투여용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 병용 투여용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안드로겐 수용체 발현 고형암에서 선택적 세포사멸 촉진 효과를 보여주는 안드로겐 수용체 억제제와 PLK1 활성 억제제의 병용 투여 시 상승적인 항암 효과를 나타내는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

항암제 병용 투여용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR COMBINATION THERAPY WITH ANTICANCER DRUG}

본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

탁솔류의 약물이나 빈카 알카로이드 계통의 항암제들은 세포 분열을 억제하는 항암제로 오랫동안 광범위하게 사용되고 있는 약물이다. 많은 항암제들은 약물의 긍정적인 효과에도 불구하여 이들 약물들을 장기간 사용할 때 내성 형성 및 고농도에서의 독성은 여전히 약물의 사용에 제약을 주고 있다. 탁솔류는 진행성 난소암, 전립선암, 유방암, 비소세포폐암 등에 치료제로 다른 항암제와 함께 정통 약물치료법으로 구축되어 사용되고 있다. 탁솔을 비롯하여 탁솔 유도체는 임상적으로 활용도가 높은 항암제임에도 불구하고 최근 이들 약물을 장기간 사용할 경우 탁솔에 대한 내성 및 교차 내성이 문제점으로 이를 대체할 다른 약물의 필요성이 요구되고 있다.

최근 PLK1 (Polo-Like Kinase 1)에 대한 억제제가 항암제 개발의 타겟으로 인식되면서 Plk1 억제성 항암제 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. PLK1은 세포분열기에 작용하는 Ser/Thr 인산화 효소로서 생체에서 세포의 성장이 빠르게 일어나고 있는 조직인 골수, 고환, 비장 등에서 발현이 잘 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 암화 과정 및 암세포의 성장과정에서 그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으면서 비소세포 폐암, 두부경부암, 후두암, 유방암, 간암, 자궁내막암, 대장암, 난소암, 췌장암, 전립선암 등에서 그 발현이 증가되어 있음이 보고되었다 [비특허문헌 1]. 임상적으로 PLK1의 발현은 비소세포폐암, 두부 경부암이나 후두암 환자의 생존율과 반비례 관계를 보여주고 있다. 즉 PLK1의 발현이 높은 환자군의 생존율이 낮다는 연구결과이다. 또한 말기 암의 환자로 갈수록 PLK1의 발현이 높게 나타나고 있다. 따라서 PLK1의 발현은 환자의 예후를 예측하는데 하나의 지표로 유의한 마커로 알려져 있다.

이러한 PLK1 타겟 항암제 중 하나인 제니스테인의 항암 효과가 본 발명자들에의해 p53 돌연변이성 고형암 및 탁솔 내성 고형암 치료제로서의 제니스테인의 항암제 용도가 밝혀진 바 있으며, 제니스테인의 병용 투여에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 또한 탁솔 내성 암 치료 약물에 대한 집중적인 연구는 잘 되고 있지 않은 실정이다.

국내 특허 등록 제 1678791호

Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39

이에, 본 발명자들은 항암제 내성 고형암에 효과적인 병용 투여용 항암제 개발에 노력한 결과, 이소플라본 성분인 제니스테인이 PLK1 단백질 인산화 효소의 강력한 억제제로 효과를 보여주었으며 특히 안드로겐 수용체가 과발현된 탁솔 내성 전립선암에서 보다 민감하고 선택적인 사멸 효과를 보여주었으며, 특히 제니스테인을 포함하는 PLK1 활성 억제제와 AR 억제제의 병용 투여에서 단독 투여 보다 월등한 항암 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "PLK1 활성 억제제"는 PLK1 타겟 항암제로도 지칭되며, 세포 증식에 필수적인 세포순환스위치 Polo-like kimase-1의 억제제로, 세포분열을 억제하여 암세포가 없어지게 하는 항암제로서, BI2536, 볼라설팁(volasertib), 제니스테인 등이 있다.

본 발명에서 용어 "안드로겐 수용체 억제제"는 안드로겐에 길항하는 약제로 항안드로겐제로도 칭하며, 비칼루타마이드, 카소덱스, 플루타마이드 등을 포함한다.

본 발명에서 용어 "병용 투여"는 치료요법의 개별성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능 보다 치료학적으로 우수하면서 상승 효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.

본 발명에서 용어 "고형암(solid cancer)"은 혈액암과는 구별되는 특징을 지니고, 방광, 유방, 장, 신장, 폐, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부 등의 여러 고형 장기(solid organ)에 서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 암으로, 본 발명의 조성물은 이에 한정되지는 않으나 탁솔 내성 고형암 치료 시에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "탁솔 내성 고형암"은 난소암, 유방암, 폐암 등의 고형암 치료에 주로 사용되어 오고 있는 항암제인 탁솔(taxol; 파클리탁셀(paclitaxel))을 반복적으로 장기간 사용함에 따라 유발되는 암으로, 암세포의 세포 분열을 억제하여 처음에는 뚜렷한 치료효과를 보이는 탁솔을 암환자에게 장기간 지속적으로 투여하게 되면, 그 치료효과가 감소하게 되는데, 이는 생체 내에서 항암제인 탁솔에 대하여 내성의 암세포가 출현하기 때문이며, 암세포가 항암제에 대해 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 경향을 보이게 된다. 본 발명에서 탁솔에 대한 내성을 지닌 고형암으로는, 이에 제한되지는 않으나, 폐암과 전립선암 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 PLK1 활성 억제제와 안드로겐 수용체 억제제를 병용 투여하는 경우, 고형암 치료의 효과를 상승시킬 수 있는 효과를 부여할 수 있다. 보다 바람직하게는 탁솔 내성 고형암에 대한 시너지 항암 효과를 부여할 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 고형암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 고형암의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "대상체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 포유 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 고형암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 이소플라본 성분인 제니스테인이 PLK1 단백질 인산화 효소의 강력한 억제제로 효과를 확인하였으며 특히 안드로겐 수용체가 과발현된 탁솔 내성 고형암에서 보다 민감하고 선택적인 사멸 효과를 보여주었으며, 다른 항암제와의 병용 투여에서 단일 약물 사용 보다 병용에 의한 약효 상승 효과가 뛰어난 성분임을 확인하였다. 또한, 탁솔 내성 고형암의 성장 억제 작용이 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 탁솔 내성 고형암은 PLK1의 발현이 증가되어 있어 그 억제 효과가 나타난다는 기전을 발견하여 제니스테인이 각종 고형암뿐만 아니라 탁솔에 내성을 지닌 고형암 치료에 단독으로 항암 효과가 있을 뿐만 아니라 병용 투여로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 항암제 내성 고형암에서 PLK1 인산화효소 억제 효과를 통해 제니스테인의 항암 효과를 확인하고, 안드로겐 수용체 발현 고형암에서 선택적 세포사멸 촉진 효과를 보여주는 안드로겐 수용체 억제제와 PLK1 활성 억제제의 병용 투여 시 상승적인 항암 효과를 나타내는 약학 조성물에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 LNCaP 또는 H460 탁솔 저항세포에서 PLK1의 RNA 발현 및 활성화 형태의 단백질 발현을 관찰한 결과이다.
a: 항암제 내성 마커로 알려진 MDR1(ABCB1)의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
b: 항암제 내성 마커로 알려진 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
c: PLK1의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
d: LNCaP, H460 및 LNCaP 탁솔 저항 세포(LNCaP^TXR), H460 탁솔 저항 세포(H460^TXR)에서 활성형 PLK1(PLK1-T210 인산화)의 단백질 변화를 관찰한 결과이다.
e: (d)의 단백질 밴드의 감도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 탁솔 저항 세포에서 AR (androgen receptor)의 mRNA 변화와 PSA(prostate-specific antigen)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
a: 대조군 및 탁솔 저항 세포에 PLK1 억제제로 알려진 BI2536, Volasertib를 처리 했을 때, 50% 세포생존억제율(GI₅₀)값과 Genistein에 의한 GI₅₀을 측정한 그래프이다.
b: 전립선 선암세포 LNCaP 또는 소량의 AR을 갖는 것으로 알려진 비소세포폐암 H460에서 탁솔에 저항을 가질 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
c: 전립선 선암세포 LNCaP 또는 탁솔 저항 세포(LNCaP^TXR)에 Bicalutamide를 처리하였을 때의 50% 세포생존억제율(GI₅₀)값을 나타낸 그래프이다.
d: 전립선 선암세포 LNCaP 및 탁솔 저항 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
e: 전립선 선암세포 LNCaP 및 탁솔 저항 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PSA의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 3은 AR의 발현이 낮은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에서 Genistein의 효과를 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR의 탁솔 처리에 따른 50% 세포생존억제율(GI₅₀)값을 측정한 그래프이다.
b: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR의 AR mRNA 발현 변화를 측정한 그래프 및 agarose gel으로 시각화 한 결과이다.
c: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에서 항암제 내성 마커 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현 변화와 PLK1의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
d: 왼쪽은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에서 PLK1 억제제로 알려진 BI2536, Volasertib를 처리하였을 때, 50% 세포생존 억제율(GI₅₀)값을 나타낸 그래프이다. 오른쪽은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에 Genistein 또는 Bicalutamide를 처리하였을 때 50% 세포생존 억제율(GI₅₀)을 나타낸 그래프이다.
e: 왼쪽은 전립선 선암세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다. 오른쪽 그래프는 PSA의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 전립선 선암세포에서 Genistein 효과에 따른 PLK1의 억제효과를 나타낸 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에서 Genistein 처리에 따른 세포 주기 변화를 유세포 분석기(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용하여 관찰한 결과이다.
b: (a)의 결과에서, 세포사멸을 의미하는 G1 phage의 변화를 도식화한 그래프이다.
c: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145^TXR에서 Genistein 처리에 따른 세포 주기 변화를 유세포 분석기(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용하여 관찰한 결과이다.
d: (c)의 결과에서, 세포사멸을 의미하는 G1 phage의 변화를 도식화한 그래프이다.
e: 25 μM Genistein이 처리된 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR를 cleaved-caspase 3와 DAPI를 이용하여 면역 형광법 (Immunofluorescence)을 진행하고, cleaved-caspase 3가 검출되는 세포수를 백분율로 나타낸 그래프이다.
f: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에서 Genistein 처리에 따른 활성형 PLK1(p-PLK1 T210)의 발현변화 및 그의 기질인 TCTP의 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 5는 PLK1 억제제가 항암제 저항성 인자를 감소시키는 것을 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, MRP1(ABCC1)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
b: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, MDR1(ABCB1)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
c: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PLK1의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
d: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 인산화와 단백질 변화를 관찰한 결과이다.
도 6는 본 발명의 실시예에 따른 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536(BI) 또는 Volasertib(VL) 또는 Genistein(GS)을 Bicalutamide와 함께 처리하였을 때의 세포사멸 효과를 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 BI2536을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
b: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Volasertib을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
c: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Genistein을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
d: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Bicalutamide을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
e: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, BI2536을 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
f: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, Volasertib를 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
g: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, Genistein을 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7는 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR에서 BI2536, Volasertib, Genistein, Bicalutamide 단독 처리 및 병용처리시의 inhibitory concentration(IC50)과 combination index(CI)값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 마우스 모델에서의 탁솔 내성에 대한 병용 투여 효과를 나타낸 결과이다.
a: 마우스 모델의 실험 방법 및 계획을 나타낸 모식도이다.
b: 마우스 모델에서 얻은 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR의 종양 크기를 분석한 결과이다.
c:　탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR가 투여된 마우스 모델에서 약물의 단독 투여 및 병용투여에 의한 효과를 종양 크기 측정을 통해 분석한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1: 탁솔 내성 세포의 PLK1 발현 및 활성형 PLK1 변화 관찰

전립선 선암 LNCaP 및 비소세포폐암 H460 세포를 이용하여 탁솔 내성 세포주를 구축하기 위하여 2주일 간격으로 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM으로 탁솔을 처리하였다. 본 실험에서는 20 nM, 30주차 세포를 사용하였다.

먼저, 탁솔 저항 LNCaP^TXR, H460^TXR세포가 항암제 저항성을 갖는지 평가하기 위하여, 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양하고 비소세포폐암 세포주 H460, H460^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 48시간 배양하였다. 48시간 후, 세포의 RNA를 수취하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통해 항암제 저항성 마커로 알려진 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현과 PLK1의 mRNA 발현을 관찰하였다.

도 1a와 1b에 나타낸 바와 같이 각 세포주의 대조군에 비하여 탁솔 저항성 세포주는 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 발현이 증가되어 있음을 보여준다. 또한 도 1c에서 나타낸 바와 같이 대조군에 비하여 탁솔 저항성 세포주가 PLK1의 발현이 높아져 있음을 보여준다.

다음으로 전립선 선암 LNCaP, LNCaP^TXR 및 비소세포폐암 H460, H460^TXR 세포에서 PLK1의 단백질 발현 수준과 활성형 PLK1(p-PLK1 T210)의 단백질 발현 수준을 관찰하고자 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양하고 비소세포폐암 세포주 H460, H460^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 배양한 후 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 PLK1과 p-PLK1(T210) 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하였다. 면역블랏 진행 후, LI-COR Odyssey 소프트웨어를 이용하여 단백질 수준을 수치화하고 분석하였다.

도 1d에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포주에 비하여 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 증가뿐만 아니라 활성형 PLK1의 발현도 증가하였으며, 도 1e에서 보여주는 바와 같이 검출된 단백질 수준을 actin을 기준으로 수치화하여 분석하였을 때, 전립선 선암 세포주 LNCaP^TXR 뿐만 아니라 비소세포폐암 세포주 H460^TXR 모두에서 PLK1과 활성형 PLK1이 증가되었음을 관찰하였다.

도 1의 결과를 종합하였을 때, 전립선 선암 탁솔 저항 세포주 LNCaP^TXR와 비소세포폐암 탁솔 저항 세포주 H460^TXR는 PLK1의 mRNA, 단백질 수준 모두 증가되어있으며, 특히 PLK1의 활성이 대조군에 비하여 더욱 증가되어 있음을 증명하였다.

실시예 2: 탁솔 내성 전립선 선암 LNCaP 및 비소세포폐암 H460의 제니스테인 효과와 안드로겐 수용체(AR) 및 PSA(prostate-specific antigen) 변화 관찰

탁솔 저항 세포에서 PLK1이 증가되었음을 토대로 탁솔 저항 세포에 PLK1 억제제를 처리하여 세포의 변화를 관찰하였다.

먼저, PLK1을 억제하는 것으로 보고된 BI2536, volasertib, 제니스테인을 처리하여 세포사멸 정도를 측정하고자 MTT assay를 진행하였다.

구체적으로 96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 3×10⁴ cells/ml, 비소세포폐암 세포주 H460, H460^TXR를 2×10⁴ cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536, volasertib, genistein을 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 Thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI₅₀)의 값을 계산하였다.

그 결과, 도 2a에서 나타낸 바와 같이 BI2536과 volasertib를 처리한 실험에서 GI₅₀의 값이 대조군에 비하여 탁솔 저항 세포주가 더 높았다. 그러나 제니스테인을 처리한 전립선 선암 세포 LNCaP의 경우, 탁솔 저항 LNCaP^TXR 세포의 GI₅₀(16.3 μM)가 대조군(32.0 μM)에 비하여 낮게 관찰되었으며, 비소세포폐암의 탁솔 저항 세포주에서는 GI₅₀값이 대조군에 비하여 높게 관찰되었다.

다음으로 제니스테인 효과에 의하여 전립선 선암 세포의 특징인 안드로겐 수용체(AR)의 발현 변화를 관찰하였다. 추가적으로 소량의 AR을 갖는 것으로 알려진 비소세포폐암 H460에서도 AR의 변화를 관찰하였다.

구체적으로, 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml, 비소세포폐암 세포주 H460, H460^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA를 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 AR의 mRNA 발현을 분석하였다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 세포주간의 AR mRNA 발현양을 관찰하였다.

그 결과, 도 2b에서 나타낸 바와 같이 전립선 선암 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 대조군에 비하여 AR의 발현이 17배 증가하였고, 비소세포폐암 탁솔 저항 H460^TXR에서도 대조군에 비하여 2배 증가하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 관찰한 결과에서도 탁솔 저항 세포에서 AR이 증가됨을 증명하였으며 LNCaP에 비하여 현저히 낮지만 H460에도 AR이 발현되고 있음을 관찰하였다.

AR의 발현이 높은 전립선 선암 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 AR의 길항제(antagonist)로 알려진 bicalutamide를 처리하고 50% 세포생존 억제율(GI₅₀)을 측정하고자 MTT assay를 진행하였다.

96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 3×10⁴ cells/ml으로 배양하고 다음날 bicalutamide를 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI₅₀)의 값을 계산하였다.

그 결과 도 2c에 나타낸 바와 같이, bicalutamide에 의한 GI₅₀값이 대조군 LNCaP 세포에서 15.0 μM, LNCaP^TXR에서 9.1 μM으로 AR이 높은 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 bicalutamide의 효과가 높음을 증명하였다.

다음으로 bicalutamide를 비롯한 PLK1 억제제 처리에 의한 AR 또는 PSA (prostate-specific antigen)의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다.

LNCaP, LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS), bicalutamide(BC)의 GI₅₀ 농도를 48시간 처리하여 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 분석하였다.

그 결과 도 2d와 2e에서 나타낸 바와 같이, 약물처리를 하지 않은 군에 비하여 약물처리를 한 세포는 AR과 PSA의 발현이 감소하였다. 그러나 BI2536과 volasertib를 처리한 군에서 LNCaP 보다 LNCaP^TXR의 AR 및 PSA mRNA 수준이 높게 관찰되었다. 반면에 genistein과 bicalutamide를 처리한 LNCaP^TXR는 AR 및 PSA mRNA 수준이 대조군 LNCaP 보다 감소하였다.

도 2의 결과를 종합했을 때, PLK1 타겟 억제제로 알려진 genistein은 AR의 발현이 높은 탁솔 저항 세포의 AR을 비롯한 PSA의 발현을 감소시킴을 증명하였다.

실시예 3: AR 발현이 낮은 전립선 선암 세포 DU145와 탁솔 저항 DU145 ^TXR 에서 genistein의 효과 관찰

본 발명자는 AR이 낮게 발현되는 것으로 알려진 전립선 선암 세포 DU145의 탁솔 저항 세포 DU145^TXR에서 PLK1 억제제와 bicalutamide의 AR 및 PSA 억제 효과를 관찰하였다. 본 발명에서는 20 nM의 탁솔이 25주 동안 처리된 DU145^TXR를 사용하였다.

먼저, 탁솔 저항성을 평가하기 위해서 DU145와 DU145^TXR에 탁솔을 농도의존적으로 48시간 동안 처리하고 MTT assay를 진행하여 50% 세포생존억제율(GI₅₀)을 측정하였다.

도 3a에 나타낸 바와 같이 DU145의 GI₅₀은 10.7 nM, DU145^TXR GI₅₀은 223.5 nM으로 DU145^TXR GI₅₀가 20배 이상 높게 분석되었고 이러한 결과는 DU145^TXR가 탁솔 내성이 구축되었음을 증명하였다.

다음으로 DU145^TXR의 AR mRNA 발현 정도를 관찰하기 위하여 DU145 또는 DU145^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA는 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 AR의 mRNA 발현을 분석하였다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 세포주간의 AR mRNA 발현양을 관찰하였다.

그 결과, 도 3b에서 나타낸 바와 같이 탁솔 저항 DU145^TXR에서 대조군 DU145에 비하여 AR의 발현이 8배 이상 증가하였고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 관찰한 결과에서도 탁솔 저항 세포에서 AR이 증가됨을 증명하였으며 LNCaP에 비하여 DU145의 AR이 낮게 발현되고 있음을 관찰하였다.

탁솔 저항 DU145^TXR에서 항암제 내성 마커인 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1)과 PLK1의 mRNA 발현을 관찰하기 위하여 도 3와 동일하게 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 MDR1, MRP1, PLK1의 mRNA 발현을 분석하였다.

도 3c에서 나타낸 바와 같이, DU145^TXR에서도 앞선 LNCaP^TXR, H460^TXR 세포와 일관되게 MDR1, MRP1, PLK1의 mRNA 발현이 대조군 세포에 비하여 증가되었음을 증명하였다.

탁솔 저항 DU145^TXR에서 PLK1 억제제와 bicalutamide를 처리하고 50% 세포생존억제율(GI₅₀)을 측정하고자 MTT assay를 진행하였다.

96 well plate에 DU145, DU145^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536 또는 volasertib 또는 genistein 또는 bicalutamide를 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI₅₀)의 값을 계산하였다.

그 결과 도 3d에 나타낸 바와 같이, DU145^TXR의 약물에 의한 GI₅₀값이 BI2536과 volasertib의 경우 DU145에 비하여 증가 하였다. 반면에 genistein, bicalutamide를 처리한 경우, DU145에 비하여 DU145^TXR의 GI₅₀값이 감소하였음을 증명하였다.

다음으로 본 발명자는 DU145 및 DU145^TXR에서 bicalutamide를 비롯한 PLK1 억제제 처리에 의한 AR 또는 PSA(prostate-specific antigen)의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다.

DU145 또는 DU145^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 배양하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS), bicalutamide(BC)의 GI₅₀ 농도를 48시간 처리하여 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 분석하였다.

그 결과 도 3e에서 나타낸 바와 같이, 약물처리를 하지 않은 군에 비하여 약물처리를 한 세포는 AR과 PSA의 발현이 감소하였으나, BI2536과 volasertib를 처리한 군에서 DU145보다 DU145^TXR의 AR 및 PSA mRNA 수준이 높게 관찰되었다. 반면에 genistein과 bicalutamide를 처리한 DU145^TXR는 AR 및 PSA mRNA 수준이 대조군 DU145 보다 감소하였다.

도 3의 결과를 종합했을 때, PLK1 타겟 억제제로 알려진 genistein은 탁솔 저항 세포의 AR을 비롯한 PSA의 발현을 감소시킴을 증명하였다.

실시예 4: 탁솔 내성 전립선 선암 세포에서 genistein 효과에 따른 PLK1 발현 변화와 그에 따른 세포 주기 및 사멸 관찰

genistein의 PLK1 억제 효과에 따른 세포주기 변화를 관찰하고자 FACS analysis를 진행하였다. 본 실험에서는 AR의 발현이 높은 전립선 선암 세포 LNCaP과 AR의 발현이 매우 낮은 전립선 선암 세포 DU145 사용하였다.

구체적으로, LNCaP 또는 LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml, DU145 또는 DU145^TXR를 5×10⁴ cells/ml으로 6well plate에 배양하고, 다음날 25 μM genistein을 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후, 각 웰에 있던 상층액을 모으고 1×PBS으로 세포를 세척한 다음, trypsin을 이용하여 세포를 떼어 수취하였다. 수취한 세포는 4℃, 1000 xg, 5분간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 차가운 75% 에탄올을 분주하여 -20℃에서 16시간 고정하였다. 고정된 세포 시료는 4℃, 1000 xg, 5분간 원심분리하여 에탄올을 제거하고 30 μg/ml의 PI(Propidium iodide)으로 30분간 염색하여 세포주기를 분석하였다.

그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, 25 μM genistein을 처리하였을 때에 LNCaP, LNCaP^TXR 모두 대조군 처리에 비하여 G2/M phase가 증가 하였고, 탁솔 저항 세포 LNCaP^TXR는 LNCaP에 비하여 G2/M phase가 더 많이 증가되었다. 도 4a를 기반으로 세포사멸을 의미하는 subG1 phase 세포수를 분석하였을 때, 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 가장 높았고, genistein의 세포사멸효과가 탁솔 저항 세포에서 의미가 있음을 증명하였다. LNCaP 뿐만 아니라 도 4c에 나타낸 DU145에서도 genistein 처리에 의하여 DU145, DU145^TXR 모두 G2/M phase가 증가하였고, DU145^TXR에서 G2/M phase가 가장 높게 분석되었다. 또한 도 4c를 기반으로 subG1 phase을 분석한 결과에서도 DU145^TXR에서 세포사멸이 가장 많이 일어나고 있음을 증명하였다.

다음으로, 본 발명자는 세포를 cleaved-caspase 3와 DAPI으로 염색하여 세포사멸정도를 관찰하였다.

먼저 커버글라스를 넣은 24well에 4×10⁴ cells/ml으로 LNCaP, LNCaP^TXR을 배양하고, 다음날 25 μM의 genistein을 48시간 처리하였다. 48시간 후, 배지를 제거하고 1×PBS으로 세척한 다음 차가운 4% paraformaldehyde으로 10분간 고정하였다. 10분 후, 1×PBS으로 7분간 2회 세척하고 차가운 100% 메탄올을 1분간 처리하여 세포막의 항체투과율을 높여주었다. 메탄올을 제거하고 1×PBS으로 7분간 3회 세척하였다. 3% BSA를 이용하여 실온에서 30분간 blocking하고 제거한 다음, 커버글라스 위에 cleaved-caspasae 3 항체를 4℃에서 16시간 결합시켜주었다. 1차 항체 제거 후, 1×PBST으로 7분씩 3회 세척하고 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켜준 뒤, 1xPBS으로 7분간 3회 세척하였다. 핵을 염색하기 위해서 DAPI를 5분간 염색하고 1xPBS으로 또다시 7분간 5회 세척하였다. 커버슬립에 100% 글리세롤을 한방울 떨어뜨린 뒤, 세척이 끝난 커버글라스를 올려 압착한 다음, 형광 현미경으로380 nm와 520 nm에서 촬영하여 DAPI와 cleaved-caspase3가 염색된 세포를 세어 수치화하였다.

그 결과 도 4e에 나타낸 바와 같이, genistein 처리한 세포군에서 세포사멸을 의미하는 cleaved-caspase3가 높게 발현되었으며, LNCaP세포보다 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 cleaved-caspase3가 발현되는 세포가 많았고 이러한 결과는 genistetin의 LNCaP세포보다 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 더 높은 세포사멸효과가 있음을 증명하였다.

본 발명자는 genistein에 의해서 PLK1이 억제되었을 때에 PLK1의 발현뿐만 아니라 활성 또한 억제되는지 관찰하고자 PLK1 활성형 항체(p-PLK1 T210)와 PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 항체를 이용하여 genistein에 대한 PLK1 기능 억제 효과를 관찰하였다.

그 결과 도 4f에 나타낸 바와 같이, genistein을 처리한 세포군은 처리하지 않은 세포군에 비하여 모두 PLK1의 활성이 감소하였고 PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 인산화 역시 감소하였다. 특히, LNCaP세포 보다 탁솔 저항 LNCaP^TXR에서 genistein의 PLK1 활성 억제 효과가 더욱 두드러지게 작용하였다. 이러한 결과는 genistein이 PLK1의 발현 억제뿐만 아니라 PLK1의 활성과 그 기능도 억제한다는 것을 증명하였다.

실시예 5: PLK1 억제제에 따른 항암제 저항성 감소 관찰

본 발명자는 PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 항암제 저항성을 감소시키는지 관찰하기 위하여 전립선 선암 세포 LNCaP, LNCaP^TXR에 PLK1 억제제 10 nM BI2536(BI), 15 nM volasertib(VL), 30 μM genistein(GS)와 AR 억제제 14 μM bicalutamide(BC)를 처리하고 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1), PLK1의 mRNA 발현을 관찰하였다.

구체적으로 LNCaP 또는 LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA는 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1), PLK1의 mRNA 발현을 분석하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 항암제 저항성 인자인 MRP1(ABCC1)의 발현이 모든 약물 처리군에서 감소하였으며(도 5a), 또 다른 항암제 저항성 인자인 MDR1(ABCB1)의 mRNA발현역시 LNCaP^TXR 약물처리군에서 모두 감소하였다(도 5b). 그러나 PLK1 mRNA 발현의 경우, LNCaP^TXR세포에서 약물처리하지 않은 군에 비하여 약물처리군의 PLK1 mRNA 발현이 모두 감소하였으나 BI2536(BI), volasertib(VL), bicalutamide(BC)의 경우 LNCaP의 PLK1 발현보다는 높은 발현이 유지되었다. Genistein의 경우, LNCaP세포에 비하여 LNCaP^TXR세포에서 PLK1 mRNA 감소 효과가 보여졌다. 이러한 결과는 PLK1 억제제를 비롯한 AR 억제제는 탁솔 저항 세포의 항암제 저항 인자를 감소시키는 효과가 있으나, genistein만이 LNCaP에 비하여 LNCaP^TXR PLK1의 발현까지 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다.

PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 기능을 억제하는지 관찰하기 위하여 PLK1의 기질로 보고된 TCTP의 인산화 형태를 단백질 수준에서 분석하였다.

구체적으로 LNCaP 또는 LNCaP^TXR를 4×10⁴ cells/ml으로 배양하고 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량 하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 TCTP와 p-TCTP 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하였다. 면역블랏 진행 후, LI-COR Odyssey 소프트웨어를 이용하여 단백질 수준을 수치화하고 분석하였다.

그 결과 도 5d에서 보여주는 바와 같이, LNCaP 또는 LNCaP^TXR에 PLK1 억제제를 처리하자 p-TCTP가 억제되었으나 AR 억제제인 bicalutamide 처리하였을 때에는 PLK1 억제제 처리에 비하여 p-TCTP의 감소가 적었고 LNCaP^TXR에서는 증가되었다. 이러한 결과는 genistein을 포함한 PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 발현뿐만 아니라 활성을 억제하는 것을 증명하였다.

실시예 6: PLK1 억제제와 bicalutamide의 병용 처리에 따른 세포사멸 효과 분석

PLK1 억제제와 AR 억제제인 biclautamide의 병용 투여에 따른 탁솔 저항 세포의 사멸 효과를 증명하고자, bicalutamide의 농도를 20% 세포 생존 억제 농도 2.5 μM, 30% 세포 생존 억제 농도 5.5 uM으로 고정하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS)를 농도의존적으로 처리하여 inhibitory concentration(IC₅₀)과 CI (combination index)값을 산출하였다.

구체적으로, 96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaP^TXR를 3×10⁴ cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536, volasertib, genistein을 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 Thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존 억제율(GI₅₀)의 값을 계산하였다.

그 결과, 도 6a-d와 도 7에서 나타낸 바와 같이, LNCaP 세포에서 GI₅₀값은 BI2536 8.4 nM, volasertib 14.1 nM, genistein 32 μM, bicalutamide 15 μM으로 측정되었고, LNCaP^TXR에서 GI₅₀값은 BI2536 23.8 nM, volasertib 43.9 nM, genistein 16.3 μM, bicalutamide 9.1 μM으로 분석되었다.

또한 도 6e-f와 도 7에 나타낸 바와 같이, bicalutamide와 병용 처리에 따른 GI₅₀값과 CI값 분석에서 PLK1 억제제의 단독 처리 보다 병용 처리가 생존율 억제 효과에 더 의미있는 것으로 증명되었다. 구체적으로 LNCaP 세포 5.5 uM bicalutamide 고정 처리에서 CI 분석 값은, BI2536 0.7002, volasertib 0.5868, genistein 0.6762로 상가 효과가 관찰되었고, LNCaP^TXR 5.5 uM bicalutamide 고정 처리에서 CI 분석 값은, BI2536 0.7262, volasertib 0.6818, genistein 0.8441으로 탁솔 저항 세포역시 PLK1과 AR 억제제에 따른 상가 효과가 관찰되었다.

종합적으로 도 6과, 도 7의 결과에서 PLK1 억제제는 AR 억제제와 상가 효과가 보여지며, 일반적 암세포뿐만 아니라 탁솔 저항 세포에서도 상가 효과가 나타남을 증명하였다.

실시예 7: 마우스모델에서 PLK1 억제제와 AR 억제제 병용 처리에 따른 종양 억제 효과

PLK1 억제제와 AR 억제제인 biclautamide의 병용 투여에 따른 탁솔 저항 세포의 사멸 효과를 마우스 모델을 통하여 증명하고자, 9주령 수컷 BALB-c/누드 마우스 허벅다리 안쪽에 전립선 선암 세포주 LNCaP 또는 LNCaP^TXR를 2×10⁶ cells/100 ㎕(50 ㎕ DMEM + 50 ㎕ matrigel)으로 주사하여 종양을 형성하였다. 도 8a에 도식화한 바와 같이, 세포 주사 10일 후 LNCaP 또는 LNCaP^TXR 주입 마우스에 10 mg/kg genistein 또는 45 mg/kg bicalutamide를 복강 투여하였고, LNCaP^TXR 주입 마우스에 10 mg/kg genistein과 45 mg/kg bicalutamide 병용 투여하였다. 약물 투여는 3.5일 간격으로 3주간 진행하였고 3주 후, 세포주입부위를 절개하여 종양 크기를 분석하였다.

그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 LNCaP을 주입한 종양(5.3 ㎣)에 비하여 LNCaP^TXR를 주입한 종양(7.8 ㎣)의 부피가 더 크게 생성되었고, 약물 투여를 한 종양은 LNCaP, LNCaP^TXR 모두에서 종양 크기가 줄어든 것을 관찰하였다. 또한 도 8c에서 보여진 바와 같이, LNCaP^TXR 세포를 주입한 종양에서 약물의 단일 투여와 더불어 병용투여에서 종양의 크기가 감소한 것을 관찰하였다. 특히, 병용투여 요법에서는 단일 투여 보다 종양 억제 효과가 증가함을 증명하였다.

종합적으로 도 8의 결과에서 PLK1의 억제제는 전립선 선암과 탁솔 저항이 있는 종양에서 종양 억제 효과가 있으며, AR 억제제와 병용 투여 시 효과가 증가함을 증명하였다.

Claims (8)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물(BI2536) 또는 볼라설팁(volasertib)의 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 비칼루타마이드와 병용 투여되는 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   전립선 암은 탁솔 내성 전립선 암인 약학 조성물.
   
5. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물(BI2536) 또는 볼라설팁(volasertib)의 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 비칼루타마이드와 병용 투여되는 약학 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료 방법.
   [화학식 1]
   

   

   
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 5 항에 있어서,
   전립선 암은 탁솔 내성 전립선 암인 방법.

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