KR102390586B1 - Pharmaceutical composition for combination therapy with anticancer drug - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암제 병용 투여용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안드로겐 수용체 발현 고형암에서 선택적 세포사멸 촉진 효과를 보여주는 안드로겐 수용체 억제제와 PLK1 활성 억제제의 병용 투여 시 상승적인 항암 효과를 나타내는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for combined administration of an anticancer agent, and more particularly, to a pharmaceutical composition that exhibits a synergistic anticancer effect when an androgen receptor inhibitor and a PLK1 activity inhibitor, which show a selective apoptosis promoting effect in androgen receptor-expressing solid cancer, are administered in combination. will be.

Description

항암제 병용 투여용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR COMBINATION THERAPY WITH ANTICANCER DRUG}Pharmaceutical composition for combined administration of anticancer drugs {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR COMBINATION THERAPY WITH ANTICANCER DRUG}

본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating solid cancer comprising a PLK1 activity inhibitor as an active ingredient and administered in combination with an androgen receptor inhibitor.

탁솔류의 약물이나 빈카 알카로이드 계통의 항암제들은 세포 분열을 억제하는 항암제로 오랫동안 광범위하게 사용되고 있는 약물이다. 많은 항암제들은 약물의 긍정적인 효과에도 불구하여 이들 약물들을 장기간 사용할 때 내성 형성 및 고농도에서의 독성은 여전히 약물의 사용에 제약을 주고 있다. 탁솔류는 진행성 난소암, 전립선암, 유방암, 비소세포폐암 등에 치료제로 다른 항암제와 함께 정통 약물치료법으로 구축되어 사용되고 있다. 탁솔을 비롯하여 탁솔 유도체는 임상적으로 활용도가 높은 항암제임에도 불구하고 최근 이들 약물을 장기간 사용할 경우 탁솔에 대한 내성 및 교차 내성이 문제점으로 이를 대체할 다른 약물의 필요성이 요구되고 있다. Taxols or vinca alkaloid anticancer drugs have been widely used for a long time as anticancer drugs that inhibit cell division. In spite of the positive effects of many anticancer drugs, resistance formation and toxicity at high concentrations when these drugs are used for a long period of time still limit the use of the drugs. Taxols have been established and used as orthodox drug therapy along with other anticancer drugs as a treatment for advanced ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, and non-small cell lung cancer. Although Taxol derivatives, including Taxol, are anticancer drugs with high clinical utility, recently, when these drugs are used for a long time, resistance and cross-resistance to Taxol are problems, and the need for other drugs to replace them is required.

최근 PLK1 (Polo-Like Kinase 1)에 대한 억제제가 항암제 개발의 타겟으로 인식되면서 Plk1 억제성 항암제 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. PLK1은 세포분열기에 작용하는 Ser/Thr 인산화 효소로서 생체에서 세포의 성장이 빠르게 일어나고 있는 조직인 골수, 고환, 비장 등에서 발현이 잘 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 암화 과정 및 암세포의 성장과정에서 그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으면서 비소세포 폐암, 두부경부암, 후두암, 유방암, 간암, 자궁내막암, 대장암, 난소암, 췌장암, 전립선암 등에서 그 발현이 증가되어 있음이 보고되었다 [비특허문헌 1]. 임상적으로 PLK1의 발현은 비소세포폐암, 두부 경부암이나 후두암 환자의 생존율과 반비례 관계를 보여주고 있다. 즉 PLK1의 발현이 높은 환자군의 생존율이 낮다는 연구결과이다. 또한 말기 암의 환자로 갈수록 PLK1의 발현이 높게 나타나고 있다. 따라서 PLK1의 발현은 환자의 예후를 예측하는데 하나의 지표로 유의한 마커로 알려져 있다. Recently, as inhibitors of PLK1 (Polo-Like Kinase 1) have been recognized as targets for anticancer drug development, research on the development of Plk1-inhibiting anticancer drugs is being actively conducted. PLK1 is a Ser/Thr kinase that acts during cell division and is known to be well expressed in bone marrow, testis, and spleen, tissues where cells grow rapidly in the living body. In addition, while its expression is known to be increased during the cancerous process and the growth process of cancer cells, its expression is increased in non-small cell lung cancer, head and neck cancer, laryngeal cancer, breast cancer, liver cancer, endometrial cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, etc. It has been reported that [Non-Patent Document 1]. Clinically, the expression of PLK1 has been shown to be inversely related to the survival rate of patients with non-small cell lung cancer, head and neck cancer, or laryngeal cancer. That is, the study result showed that the survival rate of patients with high PLK1 expression was low. In addition, the expression of PLK1 is shown to be higher as the patients with terminal cancer increase. Therefore, the expression of PLK1 is known as a significant marker as an index for predicting the patient's prognosis.

이러한 PLK1 타겟 항암제 중 하나인 제니스테인의 항암 효과가 본 발명자들에의해 p53 돌연변이성 고형암 및 탁솔 내성 고형암 치료제로서의 제니스테인의 항암제 용도가 밝혀진 바 있으며, 제니스테인의 병용 투여에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 또한 탁솔 내성 암 치료 약물에 대한 집중적인 연구는 잘 되고 있지 않은 실정이다.The anticancer effect of genistein, one of these PLK1 target anticancer drugs, has been revealed by the present inventors for the use of genistein as a therapeutic agent for p53 mutant solid cancer and taxol-resistant solid cancer, but the co-administration of genistein is not well known. In addition, intensive research on drugs for the treatment of taxol-resistant cancer has not been conducted well.

국내 특허 등록 제 1678791호Domestic Patent Registration No. 1678791

Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39

이에, 본 발명자들은 항암제 내성 고형암에 효과적인 병용 투여용 항암제 개발에 노력한 결과, 이소플라본 성분인 제니스테인이 PLK1 단백질 인산화 효소의 강력한 억제제로 효과를 보여주었으며 특히 안드로겐 수용체가 과발현된 탁솔 내성 전립선암에서 보다 민감하고 선택적인 사멸 효과를 보여주었으며, 특히 제니스테인을 포함하는 PLK1 활성 억제제와 AR 억제제의 병용 투여에서 단독 투여 보다 월등한 항암 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, as a result of the present inventors' efforts to develop an anticancer drug for effective co-administration in anticancer drug-resistant solid cancer, genistein, an isoflavone component, showed an effect as a strong inhibitor of PLK1 protein kinase. and showed a selective apoptosis effect, and in particular, the present invention was completed by confirming the superior anticancer effect in the combined administration of the PLK1 activity inhibitor including genistein and the AR inhibitor.

따라서, 본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating solid cancer, comprising a PLK1 activity inhibitor as an active ingredient and administered in combination with an androgen receptor inhibitor.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating solid cancer, comprising administering the composition to a subject other than a human.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 안드로겐 수용체 억제제와 병용 투여되는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating solid cancer, comprising a PLK1 activity inhibitor as an active ingredient and administered in combination with an androgen receptor inhibitor.

본 발명에서 용어 "PLK1 활성 억제제"는 PLK1 타겟 항암제로도 지칭되며, 세포 증식에 필수적인 세포순환스위치 Polo-like kimase-1의 억제제로, 세포분열을 억제하여 암세포가 없어지게 하는 항암제로서, BI2536, 볼라설팁(volasertib), 제니스테인 등이 있다. In the present invention, the term "PLK1 activity inhibitor" is also referred to as a PLK1 target anticancer agent, an inhibitor of the cell circulation switch Polo-like kimase-1 essential for cell proliferation, and an anticancer agent that suppresses cell division to eliminate cancer cells, BI2536, These include volasertib and genistein.

본 발명에서 용어 "안드로겐 수용체 억제제"는 안드로겐에 길항하는 약제로 항안드로겐제로도 칭하며, 비칼루타마이드, 카소덱스, 플루타마이드 등을 포함한다. In the present invention, the term "androgen receptor inhibitor" is a drug that antagonizes androgens, also called an anti-androgen agent, and includes bicalutamide, casodex, flutamide, and the like.

본 발명에서 용어 "병용 투여"는 치료요법의 개별성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능 보다 치료학적으로 우수하면서 상승 효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.In the present invention, the term "combination administration" can be achieved by administering the individual components of a treatment regimen simultaneously, sequentially, or separately. To obtain a combination treatment effect by administering two or more drugs simultaneously or sequentially, or by alternately administering at regular or indeterminate intervals, the combination treatment method is not limited thereto, but includes, for example, the degree of reaction, reaction rate , defined as being able to provide a synergistic effect while being therapeutically superior to the efficacy that can be obtained by administering one or the rest of the components of the combination therapy at conventional doses, measured through the period to disease progression or survival can

본 발명에서 용어 "고형암(solid cancer)"은 혈액암과는 구별되는 특징을 지니고, 방광, 유방, 장, 신장, 폐, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부 등의 여러 고형 장기(solid organ)에 서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 암으로, 본 발명의 조성물은 이에 한정되지는 않으나 탁솔 내성 고형암 치료 시에 유용하게 사용될 수 있다.In the present invention, the term "solid cancer" has characteristics distinguishing it from blood cancer, and includes bladder, breast, intestine, kidney, lung, liver, brain, esophagus, gallbladder, ovary, pancreas, stomach, cervix, and thyroid gland. It is a cancer consisting of a mass caused by abnormal cell growth in various solid organs such as , prostate and skin.

본 발명에서 용어 "탁솔 내성 고형암"은 난소암, 유방암, 폐암 등의 고형암 치료에 주로 사용되어 오고 있는 항암제인 탁솔(taxol; 파클리탁셀(paclitaxel))을 반복적으로 장기간 사용함에 따라 유발되는 암으로, 암세포의 세포 분열을 억제하여 처음에는 뚜렷한 치료효과를 보이는 탁솔을 암환자에게 장기간 지속적으로 투여하게 되면, 그 치료효과가 감소하게 되는데, 이는 생체 내에서 항암제인 탁솔에 대하여 내성의 암세포가 출현하기 때문이며, 암세포가 항암제에 대해 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 경향을 보이게 된다. 본 발명에서 탁솔에 대한 내성을 지닌 고형암으로는, 이에 제한되지는 않으나, 폐암과 전립선암 등을 포함할 수 있다.As used herein, the term “taxol-resistant solid cancer” refers to a cancer induced by repeated and long-term use of taxol (paclitaxel), an anticancer agent that has been mainly used for the treatment of solid cancers such as ovarian cancer, breast cancer, and lung cancer. When Taxol, which initially shows a clear therapeutic effect by inhibiting cell division of As cancer cells acquire resistance to anticancer drugs, they tend to lose their therapeutic effect. In the present invention, examples of solid cancer resistant to taxol include, but are not limited to, lung cancer and prostate cancer.

본 발명에서 상기 PLK1 활성 억제제와 안드로겐 수용체 억제제를 병용 투여하는 경우, 고형암 치료의 효과를 상승시킬 수 있는 효과를 부여할 수 있다. 보다 바람직하게는 탁솔 내성 고형암에 대한 시너지 항암 효과를 부여할 수 있다.In the present invention, when the PLK1 activity inhibitor and the androgen receptor inhibitor are co-administered, an effect capable of enhancing the treatment effect of solid cancer can be imparted. More preferably, it can impart a synergistic anticancer effect to taxol-resistant solid cancer.

본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 고형암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 고형암의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term "prevention" refers to any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of solid cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, and "treatment" refers to any act of inhibiting or delaying the occurrence, spread, and recurrence of solid cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to any action that improves or changes the symptoms of the suspected and affected individual.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” means exhibiting non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition. The carrier may be used without limitation as long as it is known in the art, such as buffers, preservatives, pain relievers, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, and the like.

또한 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. there is. Furthermore, it may be used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel, or external preparation for skin in the form of a gel. Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to simple diluents such as water and liquid paraffin, which are commonly used. there is. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.On the other hand, the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, and the effective dose level depends on the patient's health condition, Cancer type, severity, drug activity, sensitivity to drug, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including drugs used in combination or concomitantly, and other factors well known in the medical field. can The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, body weight, disease severity, drug form, administration route and period, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/kg or 0.001 to 0.001 per day It can be administered at 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.The route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred. As used herein, the term "parenteral" includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrabursar, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating solid cancer, comprising administering the composition to a subject other than a human.

본 발명에서 용어 "대상체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 포유 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 고형암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.As used herein, the term "subject" refers to all mammals including monkeys, cows, horses, sheep, pigs, cats, dogs, mice, rats, rabbits, or guinea pigs, including humans, which have or can develop the cancer. And, it is possible to effectively prevent or treat solid cancer by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in parallel with a conventional therapeutic agent.

본 발명의 일 실시예에서, 이소플라본 성분인 제니스테인이 PLK1 단백질 인산화 효소의 강력한 억제제로 효과를 확인하였으며 특히 안드로겐 수용체가 과발현된 탁솔 내성 고형암에서 보다 민감하고 선택적인 사멸 효과를 보여주었으며, 다른 항암제와의 병용 투여에서 단일 약물 사용 보다 병용에 의한 약효 상승 효과가 뛰어난 성분임을 확인하였다. 또한, 탁솔 내성 고형암의 성장 억제 작용이 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 탁솔 내성 고형암은 PLK1의 발현이 증가되어 있어 그 억제 효과가 나타난다는 기전을 발견하여 제니스테인이 각종 고형암뿐만 아니라 탁솔에 내성을 지닌 고형암 치료에 단독으로 항암 효과가 있을 뿐만 아니라 병용 투여로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, genistein, an isoflavone component, was confirmed to be effective as a strong inhibitor of PLK1 protein kinase. In particular, it showed a more sensitive and selective killing effect in taxol-resistant solid cancer in which androgen receptor overexpression was expressed. It was confirmed that in the combined administration of the drug, the synergistic effect of the combination was superior to the use of a single drug. In addition, it was confirmed that there is a growth inhibitory action of taxol-resistant solid cancer. In addition, by discovering the mechanism that PLK1 expression is increased in such taxol-resistant solid cancers, the inhibitory effect appears, so that genistein has an anticancer effect alone in the treatment of various solid cancers as well as solid cancers resistant to taxol, and is useful as a combination administration It was confirmed that it can be used.

본 발명은 항암제 내성 고형암에서 PLK1 인산화효소 억제 효과를 통해 제니스테인의 항암 효과를 확인하고, 안드로겐 수용체 발현 고형암에서 선택적 세포사멸 촉진 효과를 보여주는 안드로겐 수용체 억제제와 PLK1 활성 억제제의 병용 투여 시 상승적인 항암 효과를 나타내는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention confirmed the anticancer effect of genistein through the PLK1 kinase inhibitory effect in anticancer drug-resistant solid cancer, and showed a synergistic anticancer effect when an androgen receptor inhibitor and a PLK1 activity inhibitor are co-administered, which shows a selective apoptosis promoting effect in androgen receptor-expressing solid cancer. It relates to the pharmaceutical composition shown.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 LNCaP 또는 H460 탁솔 저항세포에서 PLK1의 RNA 발현 및 활성화 형태의 단백질 발현을 관찰한 결과이다.
a: 항암제 내성 마커로 알려진 MDR1(ABCB1)의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
b: 항암제 내성 마커로 알려진 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
c: PLK1의 mRNA 발현을 관찰한 결과이다.
d: LNCaP, H460 및 LNCaP 탁솔 저항 세포(LNCaPTXR), H460 탁솔 저항 세포(H460TXR)에서 활성형 PLK1(PLK1-T210 인산화)의 단백질 변화를 관찰한 결과이다.
e: (d)의 단백질 밴드의 감도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 탁솔 저항 세포에서 AR (androgen receptor)의 mRNA 변화와 PSA(prostate-specific antigen)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
a: 대조군 및 탁솔 저항 세포에 PLK1 억제제로 알려진 BI2536, Volasertib를 처리 했을 때, 50% 세포생존억제율(GI50)값과 Genistein에 의한 GI50을 측정한 그래프이다.
b: 전립선 선암세포 LNCaP 또는 소량의 AR을 갖는 것으로 알려진 비소세포폐암 H460에서 탁솔에 저항을 가질 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
c: 전립선 선암세포 LNCaP 또는 탁솔 저항 세포(LNCaPTXR)에 Bicalutamide를 처리하였을 때의 50% 세포생존억제율(GI50)값을 나타낸 그래프이다.
d: 전립선 선암세포 LNCaP 및 탁솔 저항 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
e: 전립선 선암세포 LNCaP 및 탁솔 저항 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PSA의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 3은 AR의 발현이 낮은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에서 Genistein의 효과를 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR의 탁솔 처리에 따른 50% 세포생존억제율(GI50)값을 측정한 그래프이다.
b: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR의 AR mRNA 발현 변화를 측정한 그래프 및 agarose gel으로 시각화 한 결과이다.
c: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에서 항암제 내성 마커 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현 변화와 PLK1의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
d: 왼쪽은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에서 PLK1 억제제로 알려진 BI2536, Volasertib를 처리하였을 때, 50% 세포생존 억제율(GI50)값을 나타낸 그래프이다. 오른쪽은 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에 Genistein 또는 Bicalutamide를 처리하였을 때 50% 세포생존 억제율(GI50)을 나타낸 그래프이다.
e: 왼쪽은 전립선 선암세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, AR의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다. 오른쪽 그래프는 PSA의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 전립선 선암세포에서 Genistein 효과에 따른 PLK1의 억제효과를 나타낸 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에서 Genistein 처리에 따른 세포 주기 변화를 유세포 분석기(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용하여 관찰한 결과이다.
b: (a)의 결과에서, 세포사멸을 의미하는 G1 phage의 변화를 도식화한 그래프이다.
c: 전립선 선암 세포 DU145 또는 탁솔 저항 DU145TXR에서 Genistein 처리에 따른 세포 주기 변화를 유세포 분석기(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용하여 관찰한 결과이다.
d: (c)의 결과에서, 세포사멸을 의미하는 G1 phage의 변화를 도식화한 그래프이다.
e: 25 μM Genistein이 처리된 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR를 cleaved-caspase 3와 DAPI를 이용하여 면역 형광법 (Immunofluorescence)을 진행하고, cleaved-caspase 3가 검출되는 세포수를 백분율로 나타낸 그래프이다.
f: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에서 Genistein 처리에 따른 활성형 PLK1(p-PLK1 T210)의 발현변화 및 그의 기질인 TCTP의 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 5는 PLK1 억제제가 항암제 저항성 인자를 감소시키는 것을 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, MRP1(ABCC1)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
b: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, MDR1(ABCB1)의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
c: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PLK1의 mRNA 변화를 관찰한 결과이다.
d: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), Bicalutamide(BC)를 처리하였을 때, PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 인산화와 단백질 변화를 관찰한 결과이다.
도 6는 본 발명의 실시예에 따른 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536(BI) 또는 Volasertib(VL) 또는 Genistein(GS)을 Bicalutamide와 함께 처리하였을 때의 세포사멸 효과를 관찰한 결과이다.
a: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 BI2536을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
b: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Volasertib을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
c: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Genistein을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
d: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Bicalutamide을 농도 의존적으로 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
e: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, BI2536을 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
f: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, Volasertib를 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
g: 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에 Bicalutamide를 0, 2.5 μM, 5.5 μM으로 고정하여 처리하고, Genistein을 농도 의존적으로 함께 병용 처리하였을 때의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7는 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR에서 BI2536, Volasertib, Genistein, Bicalutamide 단독 처리 및 병용처리시의 inhibitory concentration(IC50)과 combination index(CI)값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 마우스 모델에서의 탁솔 내성에 대한 병용 투여 효과를 나타낸 결과이다.
a: 마우스 모델의 실험 방법 및 계획을 나타낸 모식도이다.
b: 마우스 모델에서 얻은 전립선 선암 세포 LNCaP 및 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR의 종양 크기를 분석한 결과이다.
c:　탁솔 저항 세포 LNCaPTXR가 투여된 마우스 모델에서 약물의 단독 투여 및 병용투여에 의한 효과를 종양 크기 측정을 통해 분석한 결과이다.1 is a result of observing the RNA expression of PLK1 and the protein expression of an activated form in LNCaP or H460 taxol-resistant cells according to an embodiment of the present invention.
a: It is the result of observing the mRNA expression of MDR1 (ABCB1), which is known as an anticancer drug resistance marker.
b: It is the result of observing the mRNA expression of MRP1 (ABCC1), which is known as an anticancer drug resistance marker.
c: The result of observing the mRNA expression of PLK1.
d: LNCaP, H460 and LNCaP Taxol-resistant cells (LNCaP TXR ), H460 Taxol-resistant cells (H460 TXR ) is the result of observing the protein changes of active PLK1 (PLK1-T210 phosphorylation).
e: It is a graph showing the sensitivity of the protein band of (d) numerically.
Figure 2 is the result of observing the mRNA change of AR (androgen receptor) and PSA (prostate-specific antigen) mRNA change in taxol-resistant cells according to an embodiment of the present invention.
a: It is a graph measuring 50% cell viability (GI 50 ) value and GI 50 by Genistein when BI2536, Volasertib, known as a PLK1 inhibitor, was treated in control and taxol-resistant cells.
b: Results of observation of changes in the mRNA expression of AR when resistant to taxol in prostate adenocarcinoma LNCaP or non-small cell lung cancer H460 known to have a small amount of AR.
c: It is a graph showing the 50% cell survival inhibition (GI 50 ) value when Bicalutamide is treated in prostate adenocarcinoma cells LNCaP or Taxol-resistant cells (LNCaP TXR ).
d: Results of observation of changes in AR mRNA expression when BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC) were treated in LNCaP and Taxol-resistant LNCaP TXR in prostate adenocarcinoma cells.
e: Results of observing changes in PSA mRNA expression when prostate adenocarcinoma cells LNCaP and taxol-resistant LNCaP TXR were treated with BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC).
Figure 3 is the result of observing the effect of Genistein in the low AR expression prostate adenocarcinoma cells DU145 or taxol-resistant DU145 TXR .
a: It is a graph measuring the 50% cell viability (GI 50 ) value of prostate adenocarcinoma cells DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR according to Taxol treatment.
b: A graph measuring the change in AR mRNA expression of DU145 or taxol-resistant DU145 TXR in prostate adenocarcinoma cells and visualization with agarose gel.
c: Results of observation of changes in the mRNA expression of anticancer drug resistance markers MDR1 (ABCB1) and MRP1 (ABCC1) and PLK1 mRNA expression in prostate adenocarcinoma cells DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR .
d: The left is a graph showing 50% cell survival inhibition (GI 50 ) values when treated with BI2536, Volasertib, known as a PLK1 inhibitor, in prostate adenocarcinoma cells DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR . On the right is a graph showing 50% cell survival inhibition (GI 50 ) when Genistein or Bicalutamide was treated in prostate adenocarcinoma cells DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR .
e: The left is the result of observing the change in AR mRNA expression when BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC) were treated in prostate adenocarcinoma DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR . The graph on the right is the result of observing the change in the mRNA expression of PSA.
4 is a result showing the inhibitory effect of PLK1 according to the Genistein effect in prostate adenocarcinoma cells according to an embodiment of the present invention.
a: Results of observation of cell cycle changes according to Genistein treatment in LNCaP prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells using flow cytometry (Fluorescence-activated cell sorting, FACS).
b: In the result of (a), it is a graph schematically showing the change of G1 phage, which means apoptosis.
c: Results of observation of cell cycle changes according to Genistein treatment in prostate adenocarcinoma cells DU145 or Taxol-resistant DU145 TXR using a flow cytometer (FACS).
d: In the result of (c), it is a graph schematically showing the change in G1 phage, which means apoptosis.
e: 25 μM Genistein-treated prostate adenocarcinoma cells LNCaP and Taxol-resistant cells LNCaP TXR were subjected to immunofluorescence using cleaved-caspase 3 and DAPI, and the number of cells in which cleaved-caspase 3 was detected was expressed as a percentage. It is a graph.
f: Results of observation of changes in the expression of active PLK1 (p-PLK1 T210) and TCTP, its substrate, according to Genistein treatment in LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells.
5 is a result of observing that the PLK1 inhibitor decreases the anticancer drug resistance factor.
a: When BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC) were treated in LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells, the mRNA change of MRP1 (ABCC1) was observed.
b: It is the result of observing the mRNA change of MDR1 (ABCB1) when BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC) were treated in LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells.
c: Results of observing changes in PLK1 mRNA when BI2536 (BI), Volasertib (VL), Genistein (GS), and Bicalutamide (BC) were treated in LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells.
d: When BI2536(BI), Volasertib(VL), Genistein(GS), and Bicalutamide(BC) were treated in LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells, phosphorylation and protein changes of TCTP, known as a substrate for PLK1, were observed. is a result
Figure 6 is the result of observing the apoptosis effect of BI2536 (BI) or Volasertib (VL) or Genistein (GS) in prostate adenocarcinoma cells LNCaP and Taxol-resistant cells LNCaP TXR according to an embodiment of the present invention, when treated with Bicalutamide am.
a: It is a graph showing the cell viability when BI2536 was treated in a concentration-dependent manner in LNCaP of prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR of taxol-resistant cells.
b: It is a graph showing the cell viability when the prostate adenocarcinoma cells LNCaP and taxol-resistant cells LNCaP TXR were treated with Volasertib in a dose-dependent manner.
c: It is a graph showing the cell viability when Genistein was treated in a concentration-dependent manner in LNCaP of prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR of taxol-resistant cells.
d: A graph showing the cell viability when Bicalutamide was dose-dependently treated to LNCaP in prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR in taxol-resistant cells.
e: It is a graph showing the cell viability when LNCaP of prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR of taxol-resistant cells were treated with Bicalutamide fixed at 0, 2.5 μM, and 5.5 μM, and BI2536 was co-treated together in a concentration-dependent manner.
f: It is a graph showing the cell viability when LNCaP of prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR of taxol-resistant cells were treated with Bicalutamide fixed at 0, 2.5 μM, and 5.5 μM, and Volasertib was concurrently treated in a concentration-dependent manner.
g: It is a graph showing the cell viability of prostate adenocarcinoma cells LNCaP and taxol-resistant cells LNCaP TXR treated with Bicalutamide fixed at 0, 2.5 μM, 5.5 μM, and Genistein concentration-dependently co-treated together.
7 shows the results of calculating the inhibitory concentration (IC50) and combination index (CI) values of BI2536, Volasertib, Genistein, and Bicalutamide alone and in combination treatment in LNCaP of prostate adenocarcinoma cells and LNCaP TXR of taxol-resistant cells.
8 is a result showing the effect of co-administration on taxol tolerance in a mouse model according to an embodiment of the present invention.
a: It is a schematic diagram showing the experimental method and plan of the mouse model.
b: Results of tumor size analysis of prostate adenocarcinoma cells LNCaP and taxol-resistant cells LNCaP TXR obtained from a mouse model.
c: Results of analysis of the effects of single and combined administration of the drug in a mouse model administered with taxol-resistant cells LNCaP TXR through tumor size measurement.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention, but the following examples are merely illustrative of the present invention, and it is common in the art that various changes and modifications are possible within the scope and spirit of the present invention. It is obvious to a person skilled in the art, and it goes without saying that such variations and modifications fall within the scope of the appended claims.

실시예 1: 탁솔 내성 세포의 PLK1 발현 및 활성형 PLK1 변화 관찰Example 1: Observation of PLK1 Expression and Active PLK1 Changes in Taxol-Resistant Cells

전립선 선암 LNCaP 및 비소세포폐암 H460 세포를 이용하여 탁솔 내성 세포주를 구축하기 위하여 2주일 간격으로 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM으로 탁솔을 처리하였다. 본 실험에서는 20 nM, 30주차 세포를 사용하였다. In order to construct a taxol-resistant cell line using prostate adenocarcinoma LNCaP and non-small cell lung cancer H460 cells, 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, and 20 nM of Taxol were treated every 2 weeks. In this experiment, 20 nM, 30-week-old cells were used.

먼저, 탁솔 저항 LNCaPTXR, H460TXR세포가 항암제 저항성을 갖는지 평가하기 위하여, 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 4×104 cells/ml으로 배양하고 비소세포폐암 세포주 H460, H460TXR를 5×104 cells/ml으로 48시간 배양하였다. 48시간 후, 세포의 RNA를 수취하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통해 항암제 저항성 마커로 알려진 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 mRNA 발현과 PLK1의 mRNA 발현을 관찰하였다. First, in order to evaluate whether taxol-resistant LNCaP TXR and H460 TXR cells have anticancer drug resistance, prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR were cultured at 4 × 10 4 cells/ml, and non-small cell lung cancer cell lines H460 and H460 TXR were cultured at 5 × 10 4 Cells/ml were incubated for 48 hours. After 48 hours, RNA from cells was collected and mRNA expression of MDR1 (ABCB1) and MRP1 (ABCC1), known as anticancer drug resistance markers, and mRNA expression of PLK1 were observed through real-time PCR.

도 1a와 1b에 나타낸 바와 같이 각 세포주의 대조군에 비하여 탁솔 저항성 세포주는 MDR1(ABCB1)과 MRP1(ABCC1)의 발현이 증가되어 있음을 보여준다. 또한 도 1c에서 나타낸 바와 같이 대조군에 비하여 탁솔 저항성 세포주가 PLK1의 발현이 높아져 있음을 보여준다.As shown in FIGS. 1A and 1B , the taxol-resistant cell line showed increased expression of MDR1 (ABCB1) and MRP1 (ABCC1) compared to the control of each cell line. In addition, as shown in FIG. 1c , it shows that the expression of PLK1 in the taxol-resistant cell line is higher than that of the control.

다음으로 전립선 선암 LNCaP, LNCaPTXR 및 비소세포폐암 H460, H460TXR 세포에서 PLK1의 단백질 발현 수준과 활성형 PLK1(p-PLK1 T210)의 단백질 발현 수준을 관찰하고자 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 4×104 cells/ml으로 배양하고 비소세포폐암 세포주 H460, H460TXR를 5×104 cells/ml으로 배양한 후 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 PLK1과 p-PLK1(T210) 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하였다. 면역블랏 진행 후, LI-COR Odyssey 소프트웨어를 이용하여 단백질 수준을 수치화하고 분석하였다. Next, to observe the protein expression level of PLK1 and the protein expression level of active PLK1 (p-PLK1 T210) in prostate adenocarcinoma LNCaP, LNCaP TXR , and non-small cell lung cancer H460 and H460 TXR cells, the prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR were treated with 4× The cells were harvested after culturing at 10 4 cells/ml and culturing the non-small cell lung cancer cell lines H460 and H460 TXR at 5×10 4 cells/ml. The harvested cells were mixed with 100 μl of a trituration solution (0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, After treatment with 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A, 100 μg/ml PMSF, 1 μg/ml antipain), protein was quantified. After electrophoresis of the quantified protein through SDS-PAGE, immunoblot was performed using PLK1 and p-PLK1 (T210) antibodies. After immunoblotting, protein levels were quantified and analyzed using LI-COR Odyssey software.

도 1d에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포주에 비하여 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 증가뿐만 아니라 활성형 PLK1의 발현도 증가하였으며, 도 1e에서 보여주는 바와 같이 검출된 단백질 수준을 actin을 기준으로 수치화하여 분석하였을 때, 전립선 선암 세포주 LNCaPTXR 뿐만 아니라 비소세포폐암 세포주 H460TXR 모두에서 PLK1과 활성형 PLK1이 증가되었음을 관찰하였다.As shown in Figure 1d, compared to the control cell line, not only the increase in PLK1 but also the expression of active PLK1 was increased in Taxol-resistant cells. It was observed that PLK1 and active PLK1 were increased in both the prostate adenocarcinoma cell line LNCaP TXR as well as the non-small cell lung cancer cell line H460 TXR .

도 1의 결과를 종합하였을 때, 전립선 선암 탁솔 저항 세포주 LNCaPTXR와 비소세포폐암 탁솔 저항 세포주 H460TXR는 PLK1의 mRNA, 단백질 수준 모두 증가되어있으며, 특히 PLK1의 활성이 대조군에 비하여 더욱 증가되어 있음을 증명하였다.When the results of FIG. 1 were combined, it was found that both the PLK1 mRNA and protein levels were increased in the prostate adenocarcinoma taxol-resistant cell line LNCaP TXR and the non-small cell lung cancer taxol-resistant cell line H460 TXR , and in particular, the PLK1 activity was further increased compared to the control group. proved.

실시예 2: 탁솔 내성 전립선 선암 LNCaP 및 비소세포폐암 H460의 제니스테인 효과와 안드로겐 수용체(AR) 및 PSA(prostate-specific antigen) 변화 관찰Example 2: Observation of genistein effect and androgen receptor (AR) and prostate-specific antigen (PSA) changes in taxol-resistant prostate adenocarcinoma LNCaP and non-small cell lung cancer H460

탁솔 저항 세포에서 PLK1이 증가되었음을 토대로 탁솔 저항 세포에 PLK1 억제제를 처리하여 세포의 변화를 관찰하였다.Based on the increase in PLK1 in the taxol-resistant cells, the taxol-resistant cells were treated with a PLK1 inhibitor to observe changes in the cells.

먼저, PLK1을 억제하는 것으로 보고된 BI2536, volasertib, 제니스테인을 처리하여 세포사멸 정도를 측정하고자 MTT assay를 진행하였다. First, MTT assay was performed to measure the degree of apoptosis by treating BI2536, volasertib, and genistein, which are reported to inhibit PLK1.

구체적으로 96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 3×104 cells/ml, 비소세포폐암 세포주 H460, H460TXR를 2×104 cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536, volasertib, genistein을 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 Thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI50)의 값을 계산하였다.Specifically, in a 96 well plate, 3×10 4 cells/ml of prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR and 2×10 4 cells/ml of non-small cell lung cancer cell lines H460 and H460 TXR were cultured, and the next day, BI2536, volasertib, and genistein were incubated in a concentration-dependent manner. was treated for 48 hours. After 48 hours, 2.5 mg/ml of Thiazolyl blue tetrazolium bromide reagent was treated with 20 ul/well and incubated at 37°C in an incubator for 1 hour. The supernatant was removed and formazan was dissolved in 100 ul of DMSO, measured at a wavelength of 540 nm using a spectrometer, and the value of 50% cell viability (GI 50 ) was calculated.

그 결과, 도 2a에서 나타낸 바와 같이 BI2536과 volasertib를 처리한 실험에서 GI50의 값이 대조군에 비하여 탁솔 저항 세포주가 더 높았다. 그러나 제니스테인을 처리한 전립선 선암 세포 LNCaP의 경우, 탁솔 저항 LNCaPTXR 세포의 GI50(16.3 μM)가 대조군(32.0 μM)에 비하여 낮게 관찰되었으며, 비소세포폐암의 탁솔 저항 세포주에서는 GI50값이 대조군에 비하여 높게 관찰되었다.As a result, as shown in FIG. 2a , in the experiment treated with BI2536 and volasertib, the value of GI 50 was higher in the taxol-resistant cell line than in the control group. However, in the case of genistein-treated prostate adenocarcinoma cells LNCaP, the GI 50 (16.3 μM) of the taxol-resistant LNCaP TXR cells was lower than that of the control (32.0 μM), and the GI 50 value of the taxol-resistant cell line of non-small cell lung cancer was higher than that of the control. was observed to be higher than

다음으로 제니스테인 효과에 의하여 전립선 선암 세포의 특징인 안드로겐 수용체(AR)의 발현 변화를 관찰하였다. 추가적으로 소량의 AR을 갖는 것으로 알려진 비소세포폐암 H460에서도 AR의 변화를 관찰하였다.Next, a change in the expression of androgen receptor (AR), a characteristic of prostate adenocarcinoma cells, was observed due to the genistein effect. Additionally, changes in AR were also observed in non-small cell lung cancer H460, which is known to have a small amount of AR.

구체적으로, 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 4×104 cells/ml, 비소세포폐암 세포주 H460, H460TXR를 5×104 cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA를 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 AR의 mRNA 발현을 분석하였다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 세포주간의 AR mRNA 발현양을 관찰하였다. Specifically, the prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR were cultured at 4 × 10 4 cells/ml, and the non-small cell lung cancer cell lines H460 and H460 TXR were cultured at 5 × 10 4 cells/ml, and then RNA was collected. The received RNA was synthesized into cDNA, and mRNA expression of AR was analyzed through real-time PCR. In addition, the AR mRNA expression level of the cell line was observed using agarose gel for the reaction product of real-time PCR.

그 결과, 도 2b에서 나타낸 바와 같이 전립선 선암 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 대조군에 비하여 AR의 발현이 17배 증가하였고, 비소세포폐암 탁솔 저항 H460TXR에서도 대조군에 비하여 2배 증가하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 관찰한 결과에서도 탁솔 저항 세포에서 AR이 증가됨을 증명하였으며 LNCaP에 비하여 현저히 낮지만 H460에도 AR이 발현되고 있음을 관찰하였다.As a result, as shown in FIG. 2b, AR expression was increased 17-fold in prostate adenocarcinoma taxol-resistant LNCaP TXR compared to the control group, and non-small cell lung cancer taxol-resistant H460 TXR also increased 2-fold compared to the control group. The results of observation of the reaction product of real-time PCR using agarose gel also proved that AR was increased in taxol-resistant cells, and it was observed that AR was also expressed in H460 although it was significantly lower than that of LNCaP.

AR의 발현이 높은 전립선 선암 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 AR의 길항제(antagonist)로 알려진 bicalutamide를 처리하고 50% 세포생존 억제율(GI50)을 측정하고자 MTT assay를 진행하였다. In prostate adenocarcinoma taxol-resistant LNCaP TXR with high AR expression, bicalutamide, known as an antagonist of AR, was treated and MTT assay was performed to measure 50% cell survival inhibition (GI 50 ).

96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 3×104 cells/ml으로 배양하고 다음날 bicalutamide를 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI50)의 값을 계산하였다.Prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR were cultured at 3×10 4 cells/ml in a 96 well plate, and then treated with bicalutamide in a concentration-dependent manner for 48 hours the next day. After 48 hours, 2.5 mg/ml of thiazolyl blue tetrazolium bromide reagent was treated at 20 ul/well and incubated at 37° C. in an incubator for 1 hour. The supernatant was removed and formazan was dissolved in 100 ul of DMSO, measured at a wavelength of 540 nm using a spectrometer, and the value of 50% cell viability (GI 50 ) was calculated.

그 결과 도 2c에 나타낸 바와 같이, bicalutamide에 의한 GI50값이 대조군 LNCaP 세포에서 15.0 μM, LNCaPTXR에서 9.1 μM으로 AR이 높은 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 bicalutamide의 효과가 높음을 증명하였다.As a result, as shown in Figure 2c, the GI 50 value of bicalutamide was 15.0 μM in control LNCaP cells and 9.1 μM in LNCaP TXR , which proved that the effect of bicalutamide was high in taxol-resistant LNCaP TXR with high AR.

다음으로 bicalutamide를 비롯한 PLK1 억제제 처리에 의한 AR 또는 PSA (prostate-specific antigen)의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다. Next, changes in the mRNA expression of AR or PSA (prostate-specific antigen) by PLK1 inhibitor treatment including bicalutamide were observed.

LNCaP, LNCaPTXR를 4×104 cells/ml으로 배양하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS), bicalutamide(BC)의 GI50 농도를 48시간 처리하여 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 분석하였다. LNCaP, LNCaP TXR were cultured at 4×10 4 cells/ml and treated with GI 50 concentrations of BI2536 (BI), volasertib (VL), genistein (GS), and bicalutamide (BC) for 48 hours to receive RNA and real-time polymerase Chain reaction (real-time PCR) analysis was performed.

그 결과 도 2d와 2e에서 나타낸 바와 같이, 약물처리를 하지 않은 군에 비하여 약물처리를 한 세포는 AR과 PSA의 발현이 감소하였다. 그러나 BI2536과 volasertib를 처리한 군에서 LNCaP 보다 LNCaPTXR의 AR 및 PSA mRNA 수준이 높게 관찰되었다. 반면에 genistein과 bicalutamide를 처리한 LNCaPTXR는 AR 및 PSA mRNA 수준이 대조군 LNCaP 보다 감소하였다.As a result, as shown in FIGS. 2d and 2e, the expression of AR and PSA was decreased in the cells treated with the drug compared to the group not treated with the drug. However, AR and PSA mRNA levels of LNCaP TXR were higher than that of LNCaP in the group treated with BI2536 and volasertib. On the other hand, in LNCaP TXR treated with genistein and bicalutamide, AR and PSA mRNA levels were decreased compared to control LNCaP.

도 2의 결과를 종합했을 때, PLK1 타겟 억제제로 알려진 genistein은 AR의 발현이 높은 탁솔 저항 세포의 AR을 비롯한 PSA의 발현을 감소시킴을 증명하였다.When the results of FIG. 2 were taken together, it was demonstrated that genistein, known as a PLK1 target inhibitor, reduced the expression of PSA, including AR, in taxol-resistant cells with high AR expression.

실시예 3: AR 발현이 낮은 전립선 선암 세포 DU145와 탁솔 저항 DU145Example 3: Prostate adenocarcinoma cells with low AR expression DU145 and Taxol-resistant DU145 TXRTXR 에서 genistein의 효과 관찰Observation of the effect of genistein in

본 발명자는 AR이 낮게 발현되는 것으로 알려진 전립선 선암 세포 DU145의 탁솔 저항 세포 DU145TXR에서 PLK1 억제제와 bicalutamide의 AR 및 PSA 억제 효과를 관찰하였다. 본 발명에서는 20 nM의 탁솔이 25주 동안 처리된 DU145TXR를 사용하였다.The present inventors observed the AR and PSA inhibitory effects of a PLK1 inhibitor and bicalutamide in the taxol-resistant cells DU145 TXR of prostate adenocarcinoma cells DU145, which are known to have low AR expression. In the present invention, DU145 TXR treated with 20 nM Taxol for 25 weeks was used.

먼저, 탁솔 저항성을 평가하기 위해서 DU145와 DU145TXR에 탁솔을 농도의존적으로 48시간 동안 처리하고 MTT assay를 진행하여 50% 세포생존억제율(GI50)을 측정하였다.First, in order to evaluate Taxol resistance, DU145 and DU145 TXR were treated with Taxol in a concentration-dependent manner for 48 hours, followed by MTT assay to measure 50% cell viability (GI 50 ).

도 3a에 나타낸 바와 같이 DU145의 GI50은 10.7 nM, DU145TXR GI50은 223.5 nM으로 DU145TXR GI50가 20배 이상 높게 분석되었고 이러한 결과는 DU145TXR가 탁솔 내성이 구축되었음을 증명하였다.As shown in Figure 3a, the GI 50 of DU145 was 10.7 nM, DU145 TXR GI 50 was 223.5 nM, and the DU145 TXR GI 50 was analyzed more than 20 times higher .

다음으로 DU145TXR의 AR mRNA 발현 정도를 관찰하기 위하여 DU145 또는 DU145TXR를 5×104 cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA는 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 AR의 mRNA 발현을 분석하였다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 세포주간의 AR mRNA 발현양을 관찰하였다. Next, in order to observe the AR mRNA expression level of DU145 TXR , DU145 or DU145 TXR was cultured at 5×10 4 cells/ml, and then RNA was collected. The received RNA was synthesized into cDNA, and mRNA expression of AR was analyzed through real-time PCR. In addition, the AR mRNA expression level of the cell line was observed using agarose gel for the reaction product of real-time PCR.

그 결과, 도 3b에서 나타낸 바와 같이 탁솔 저항 DU145TXR에서 대조군 DU145에 비하여 AR의 발현이 8배 이상 증가하였고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 반응물을 agarose gel을 이용하여 관찰한 결과에서도 탁솔 저항 세포에서 AR이 증가됨을 증명하였으며 LNCaP에 비하여 DU145의 AR이 낮게 발현되고 있음을 관찰하였다.As a result, as shown in FIG. 3b, AR expression was increased more than 8 times in taxol-resistant DU145 TXR as compared to control DU145, and the reaction product of real-time PCR was observed using agarose gel. It was also demonstrated that AR is increased in taxol-resistant cells, and it was observed that AR of DU145 was lower than that of LNCaP.

탁솔 저항 DU145TXR에서 항암제 내성 마커인 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1)과 PLK1의 mRNA 발현을 관찰하기 위하여 도 3와 동일하게 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 MDR1, MRP1, PLK1의 mRNA 발현을 분석하였다.In order to observe the mRNA expression of anticancer drug resistance markers MDR1 (ABCB1), MRP1 (ABCC1) and PLK1 in Taxol-resistant DU145 TXR , RNA was received in the same manner as in FIG. 3 and MDR1 through real-time PCR , mRNA expression of MRP1 and PLK1 was analyzed.

도 3c에서 나타낸 바와 같이, DU145TXR에서도 앞선 LNCaPTXR, H460TXR 세포와 일관되게 MDR1, MRP1, PLK1의 mRNA 발현이 대조군 세포에 비하여 증가되었음을 증명하였다.As shown in Figure 3c, DU145 TXR also demonstrated that the mRNA expression of MDR1, MRP1, PLK1 was increased compared to the control cells, consistent with the previous LNCaP TXR and H460 TXR cells.

탁솔 저항 DU145TXR에서 PLK1 억제제와 bicalutamide를 처리하고 50% 세포생존억제율(GI50)을 측정하고자 MTT assay를 진행하였다. In Taxol-resistant DU145 TXR , PLK1 inhibitor and bicalutamide were treated, and MTT assay was performed to measure 50% cell viability (GI 50 ).

96 well plate에 DU145, DU145TXR를 4×104 cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536 또는 volasertib 또는 genistein 또는 bicalutamide를 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존억제율(GI50)의 값을 계산하였다.DU145 and DU145 TXR were cultured in a 96-well plate at 4×10 4 cells/ml, and the next day, BI2536 or volasertib or genistein or bicalutamide was treated for 48 hours in a concentration-dependent manner. After 48 hours, 2.5 mg/ml of thiazolyl blue tetrazolium bromide reagent was treated at 20 ul/well and incubated at 37° C. in an incubator for 1 hour. The supernatant was removed and formazan was dissolved in 100 ul of DMSO, measured at a wavelength of 540 nm using a spectrometer, and the value of 50% cell viability (GI 50 ) was calculated.

그 결과 도 3d에 나타낸 바와 같이, DU145TXR의 약물에 의한 GI50값이 BI2536과 volasertib의 경우 DU145에 비하여 증가 하였다. 반면에 genistein, bicalutamide를 처리한 경우, DU145에 비하여 DU145TXR의 GI50값이 감소하였음을 증명하였다.As a result, as shown in Fig. 3d, the GI 50 value of DU145 TXR by the drug increased in the case of BI2536 and volasertib compared to DU145. On the other hand, when genistein and bicalutamide were treated, it was proved that the GI 50 value of DU145 TXR was decreased compared to that of DU145.

다음으로 본 발명자는 DU145 및 DU145TXR에서 bicalutamide를 비롯한 PLK1 억제제 처리에 의한 AR 또는 PSA(prostate-specific antigen)의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다. Next, the present inventors observed changes in the mRNA expression of AR or PSA (prostate-specific antigen) by treatment with a PLK1 inhibitor including bicalutamide in DU145 and DU145 TXR .

DU145 또는 DU145TXR를 5×104 cells/ml으로 배양하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS), bicalutamide(BC)의 GI50 농도를 48시간 처리하여 RNA를 수취하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 분석하였다. DU145 or DU145 TXR was cultured at 5×10 4 cells/ml and treated with GI 50 concentration of BI2536 (BI), volasertib (VL), genistein (GS), and bicalutamide (BC) for 48 hours to receive RNA and real-time polymerase Chain reaction (real-time PCR) analysis was performed.

그 결과 도 3e에서 나타낸 바와 같이, 약물처리를 하지 않은 군에 비하여 약물처리를 한 세포는 AR과 PSA의 발현이 감소하였으나, BI2536과 volasertib를 처리한 군에서 DU145보다 DU145TXR의 AR 및 PSA mRNA 수준이 높게 관찰되었다. 반면에 genistein과 bicalutamide를 처리한 DU145TXR는 AR 및 PSA mRNA 수준이 대조군 DU145 보다 감소하였다.As a result, as shown in FIG. 3e, the expression of AR and PSA was decreased in the cells treated with the drug compared to the group not treated with the drug, but AR and PSA mRNA levels of DU145 TXR than that of DU145 in the group treated with BI2536 and volasertib. was observed to be high. On the other hand, AR and PSA mRNA levels were decreased in DU145 TXR treated with genistein and bicalutamide than in control DU145.

도 3의 결과를 종합했을 때, PLK1 타겟 억제제로 알려진 genistein은 탁솔 저항 세포의 AR을 비롯한 PSA의 발현을 감소시킴을 증명하였다.When the results of FIG. 3 were taken together, it was demonstrated that genistein, known as a PLK1 target inhibitor, reduces the expression of PSA including AR in taxol-resistant cells.

실시예 4: 탁솔 내성 전립선 선암 세포에서 genistein 효과에 따른 PLK1 발현 변화와 그에 따른 세포 주기 및 사멸 관찰Example 4: Observation of PLK1 expression changes according to the genistein effect in taxol-resistant prostate adenocarcinoma cells, and cell cycle and death

genistein의 PLK1 억제 효과에 따른 세포주기 변화를 관찰하고자 FACS analysis를 진행하였다. 본 실험에서는 AR의 발현이 높은 전립선 선암 세포 LNCaP과 AR의 발현이 매우 낮은 전립선 선암 세포 DU145 사용하였다.FACS analysis was performed to observe the cell cycle changes according to the PLK1 inhibitory effect of genistein. In this experiment, LNCaP, a prostate adenocarcinoma cell with high AR expression, and DU145, a prostate adenocarcinoma cell with very low AR expression, were used.

구체적으로, LNCaP 또는 LNCaPTXR를 4×104 cells/ml, DU145 또는 DU145TXR를 5×104 cells/ml으로 6well plate에 배양하고, 다음날 25 μM genistein을 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후, 각 웰에 있던 상층액을 모으고 1×PBS으로 세포를 세척한 다음, trypsin을 이용하여 세포를 떼어 수취하였다. 수취한 세포는 4℃, 1000 xg, 5분간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 차가운 75% 에탄올을 분주하여 -20℃에서 16시간 고정하였다. 고정된 세포 시료는 4℃, 1000 xg, 5분간 원심분리하여 에탄올을 제거하고 30 μg/ml의 PI(Propidium iodide)으로 30분간 염색하여 세포주기를 분석하였다.Specifically, 4×10 4 cells/ml of LNCaP or LNCaP TXR and 5×10 4 cells/ml of DU145 or DU145 TXR were cultured in a 6 well plate, and the next day, 25 μM genistein was treated for 48 hours. After 48 hours, the supernatant in each well was collected, and the cells were washed with 1×PBS, and then the cells were removed and harvested using trypsin. The collected cells were centrifuged at 4°C, 1000 xg, for 5 minutes, the supernatant was removed, and cold 75% ethanol was dispensed and fixed at -20°C for 16 hours. The fixed cell sample was centrifuged at 4° C., 1000 x g, for 5 minutes to remove ethanol, and then stained with 30 μg/ml of PI (Propidium iodide) for 30 minutes to analyze the cell cycle.

그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, 25 μM genistein을 처리하였을 때에 LNCaP, LNCaPTXR 모두 대조군 처리에 비하여 G2/M phase가 증가 하였고, 탁솔 저항 세포 LNCaPTXR는 LNCaP에 비하여 G2/M phase가 더 많이 증가되었다. 도 4a를 기반으로 세포사멸을 의미하는 subG1 phase 세포수를 분석하였을 때, 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 가장 높았고, genistein의 세포사멸효과가 탁솔 저항 세포에서 의미가 있음을 증명하였다. LNCaP 뿐만 아니라 도 4c에 나타낸 DU145에서도 genistein 처리에 의하여 DU145, DU145TXR 모두 G2/M phase가 증가하였고, DU145TXR에서 G2/M phase가 가장 높게 분석되었다. 또한 도 4c를 기반으로 subG1 phase을 분석한 결과에서도 DU145TXR에서 세포사멸이 가장 많이 일어나고 있음을 증명하였다.As a result, as shown in Figure 4a, when 25 μM genistein was treated, both LNCaP and LNCaP TXR increased G2/M phase compared to control treatment, and taxol-resistant cells LNCaP TXR increased G2/M phase more than LNCaP. became When the number of cells in subG1 phase indicating apoptosis was analyzed based on FIG. 4a, it was the highest in Taxol-resistant LNCaP TXR , and it was demonstrated that the apoptosis effect of genistein was meaningful in Taxol-resistant cells. G2/M phase was increased in both DU145 and DU145 TXR by genistein treatment in DU145 shown in FIG. 4c as well as in LNCaP, and the highest G2/M phase was analyzed in DU145 TXR . In addition, the result of analyzing the subG1 phase based on FIG. 4c also demonstrated that apoptosis occurred the most in DU145 TXR .

다음으로, 본 발명자는 세포를 cleaved-caspase 3와 DAPI으로 염색하여 세포사멸정도를 관찰하였다. Next, the present inventors stained the cells with cleaved-caspase 3 and DAPI to observe the degree of apoptosis.

먼저 커버글라스를 넣은 24well에 4×104 cells/ml으로 LNCaP, LNCaPTXR을 배양하고, 다음날 25 μM의 genistein을 48시간 처리하였다. 48시간 후, 배지를 제거하고 1×PBS으로 세척한 다음 차가운 4% paraformaldehyde으로 10분간 고정하였다. 10분 후, 1×PBS으로 7분간 2회 세척하고 차가운 100% 메탄올을 1분간 처리하여 세포막의 항체투과율을 높여주었다. 메탄올을 제거하고 1×PBS으로 7분간 3회 세척하였다. 3% BSA를 이용하여 실온에서 30분간 blocking하고 제거한 다음, 커버글라스 위에 cleaved-caspasae 3 항체를 4℃에서 16시간 결합시켜주었다. 1차 항체 제거 후, 1×PBST으로 7분씩 3회 세척하고 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켜준 뒤, 1xPBS으로 7분간 3회 세척하였다. 핵을 염색하기 위해서 DAPI를 5분간 염색하고 1xPBS으로 또다시 7분간 5회 세척하였다. 커버슬립에 100% 글리세롤을 한방울 떨어뜨린 뒤, 세척이 끝난 커버글라스를 올려 압착한 다음, 형광 현미경으로380 nm와 520 nm에서 촬영하여 DAPI와 cleaved-caspase3가 염색된 세포를 세어 수치화하였다. First, LNCaP and LNCaP TXR were cultured at 4×10 4 cells/ml in 24 wells with cover glasses, and the next day, 25 μM of genistein was treated for 48 hours. After 48 hours, the medium was removed, washed with 1×PBS, and fixed with cold 4% paraformaldehyde for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were washed twice with 1×PBS for 7 minutes and treated with cold 100% methanol for 1 minute to increase the antibody permeability of the cell membrane. Methanol was removed and washed 3 times for 7 minutes with 1×PBS. After blocking and removal at room temperature for 30 minutes using 3% BSA, the cleaved-caspasae 3 antibody was bound on a cover glass at 4° C. for 16 hours. After removing the primary antibody, it was washed 3 times for 7 minutes with 1x PBST, reacted with the secondary antibody for 2 hours at room temperature, and washed 3 times for 7 minutes with 1xPBS. To stain the nuclei, DAPI was stained for 5 minutes and washed 5 times with 1xPBS for another 7 minutes. After dropping a drop of 100% glycerol on the coverslip, the washed cover glass was placed and pressed, and then the cells stained with DAPI and cleaved-caspase3 were counted and quantified by photographing at 380 nm and 520 nm under a fluorescence microscope.

그 결과 도 4e에 나타낸 바와 같이, genistein 처리한 세포군에서 세포사멸을 의미하는 cleaved-caspase3가 높게 발현되었으며, LNCaP세포보다 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 cleaved-caspase3가 발현되는 세포가 많았고 이러한 결과는 genistetin의 LNCaP세포보다 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 더 높은 세포사멸효과가 있음을 증명하였다. As a result, as shown in Figure 4e, cleaved-caspase3, which means apoptosis, was highly expressed in the genistein-treated cell group, and there were more cells expressing cleaved-caspase3 in Taxol-resistant LNCaP TXR than in LNCaP cells. It was demonstrated that there was a higher apoptosis effect in taxol-resistant LNCaP TXR than in cells.

본 발명자는 genistein에 의해서 PLK1이 억제되었을 때에 PLK1의 발현뿐만 아니라 활성 또한 억제되는지 관찰하고자 PLK1 활성형 항체(p-PLK1 T210)와 PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 항체를 이용하여 genistein에 대한 PLK1 기능 억제 효과를 관찰하였다. In order to observe whether PLK1 expression as well as activity is inhibited when PLK1 is inhibited by genistein, the present inventors used a PLK1-activated antibody (p-PLK1 T210) and an antibody of TCTP, known as a PLK1 substrate, to inhibit PLK1 function against genistein. The effect was observed.

그 결과 도 4f에 나타낸 바와 같이, genistein을 처리한 세포군은 처리하지 않은 세포군에 비하여 모두 PLK1의 활성이 감소하였고 PLK1의 기질로 알려진 TCTP의 인산화 역시 감소하였다. 특히, LNCaP세포 보다 탁솔 저항 LNCaPTXR에서 genistein의 PLK1 활성 억제 효과가 더욱 두드러지게 작용하였다. 이러한 결과는 genistein이 PLK1의 발현 억제뿐만 아니라 PLK1의 활성과 그 기능도 억제한다는 것을 증명하였다.As a result, as shown in FIG. 4f , in the cell group treated with genistein, the activity of PLK1 was decreased and phosphorylation of TCTP, known as a substrate of PLK1, was also decreased in the cell group treated with genistein compared to the cell group untreated. In particular, the PLK1 activity inhibitory effect of genistein was more pronounced in taxol-resistant LNCaP TXR than in LNCaP cells. These results demonstrated that genistein not only suppressed the expression of PLK1, but also suppressed the activity and function of PLK1.

실시예 5: PLK1 억제제에 따른 항암제 저항성 감소 관찰Example 5: Observation of decrease in anticancer drug resistance according to PLK1 inhibitor

본 발명자는 PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 항암제 저항성을 감소시키는지 관찰하기 위하여 전립선 선암 세포 LNCaP, LNCaPTXR에 PLK1 억제제 10 nM BI2536(BI), 15 nM volasertib(VL), 30 μM genistein(GS)와 AR 억제제 14 μM bicalutamide(BC)를 처리하고 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1), PLK1의 mRNA 발현을 관찰하였다.In order to observe whether PLK1 inhibitors reduce anticancer drug resistance in taxol-resistant cells, the present inventors added PLK1 inhibitors 10 nM BI2536 (BI), 15 nM volasertib (VL), and 30 μM genistein (GS) to LNCaP and LNCaP TXR in prostate adenocarcinoma cells. After treatment with AR inhibitor 14 μM bicalutamide (BC), mRNA expression of MDR1 (ABCB1), MRP1 (ABCC1), and PLK1 was observed.

구체적으로 LNCaP 또는 LNCaPTXR를 4×104 cells/ml으로 배양한 후 RNA를 수취하였다. 수취한 RNA는 cDNA으로 합성하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 MDR1(ABCB1), MRP1(ABCC1), PLK1의 mRNA 발현을 분석하였다.Specifically, RNA was collected after culturing LNCaP or LNCaP TXR at 4×10 4 cells/ml. The received RNA was synthesized as cDNA, and mRNA expression of MDR1 (ABCB1), MRP1 (ABCC1), and PLK1 was analyzed through real-time PCR.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 항암제 저항성 인자인 MRP1(ABCC1)의 발현이 모든 약물 처리군에서 감소하였으며(도 5a), 또 다른 항암제 저항성 인자인 MDR1(ABCB1)의 mRNA발현역시 LNCaPTXR 약물처리군에서 모두 감소하였다(도 5b). 그러나 PLK1 mRNA 발현의 경우, LNCaPTXR세포에서 약물처리하지 않은 군에 비하여 약물처리군의 PLK1 mRNA 발현이 모두 감소하였으나 BI2536(BI), volasertib(VL), bicalutamide(BC)의 경우 LNCaP의 PLK1 발현보다는 높은 발현이 유지되었다. Genistein의 경우, LNCaP세포에 비하여 LNCaPTXR세포에서 PLK1 mRNA 감소 효과가 보여졌다. 이러한 결과는 PLK1 억제제를 비롯한 AR 억제제는 탁솔 저항 세포의 항암제 저항 인자를 감소시키는 효과가 있으나, genistein만이 LNCaP에 비하여 LNCaPTXR PLK1의 발현까지 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다.As a result, as shown in FIG. 5, the expression of MRP1 (ABCC1), an anticancer drug resistance factor, was decreased in all drug treatment groups (FIG. 5a), and mRNA expression of MDR1 (ABCB1), another anticancer drug resistance factor, was also treated with LNCaP TXR drug It decreased in all groups (Fig. 5b). However, in the case of PLK1 mRNA expression, all PLK1 mRNA expression in the drug-treated group was decreased in LNCaP TXR cells compared to the untreated group. High expression was maintained. In the case of Genistein, the PLK1 mRNA reduction effect was shown in LNCaP TXR cells compared to LNCaP cells. These results demonstrate that AR inhibitors, including PLK1 inhibitors, have the effect of reducing anticancer drug resistance factors in taxol-resistant cells, but only genistein can reduce the expression of LNCaP TXR PLK1 compared to LNCaP.

PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 기능을 억제하는지 관찰하기 위하여 PLK1의 기질로 보고된 TCTP의 인산화 형태를 단백질 수준에서 분석하였다.In order to observe whether PLK1 inhibitors inhibit the function of PLK1 in taxol-resistant cells, the phosphorylated form of TCTP reported as a substrate of PLK1 was analyzed at the protein level.

구체적으로 LNCaP 또는 LNCaPTXR를 4×104 cells/ml으로 배양하고 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량 하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 TCTP와 p-TCTP 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하였다. 면역블랏 진행 후, LI-COR Odyssey 소프트웨어를 이용하여 단백질 수준을 수치화하고 분석하였다. Specifically, LNCaP or LNCaP TXR was cultured at 4×10 4 cells/ml and the cells were harvested. The harvested cells were mixed with 100 μl of a trituration solution (0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, After treatment with 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A, 100 μg/ml PMSF, 1 μg/ml antipain), protein was quantified. After electrophoresis of the quantified protein through SDS-PAGE, immunoblot was performed using TCTP and p-TCTP antibody. After immunoblotting, protein levels were quantified and analyzed using LI-COR Odyssey software.

그 결과 도 5d에서 보여주는 바와 같이, LNCaP 또는 LNCaPTXR에 PLK1 억제제를 처리하자 p-TCTP가 억제되었으나 AR 억제제인 bicalutamide 처리하였을 때에는 PLK1 억제제 처리에 비하여 p-TCTP의 감소가 적었고 LNCaPTXR에서는 증가되었다. 이러한 결과는 genistein을 포함한 PLK1 억제제가 탁솔 저항 세포에서 PLK1의 발현뿐만 아니라 활성을 억제하는 것을 증명하였다.As a result, as shown in FIG. 5d , when a PLK1 inhibitor was treated with LNCaP or LNCaP TXR , p-TCTP was inhibited, but when the AR inhibitor bicalutamide was treated, the decrease in p-TCTP was small compared to the PLK1 inhibitor treatment, and it was increased in LNCaP TXR . These results demonstrated that PLK1 inhibitors including genistein suppressed PLK1 expression as well as activity in taxol-resistant cells.

실시예 6: PLK1 억제제와 bicalutamide의 병용 처리에 따른 세포사멸 효과 분석 Example 6: Analysis of apoptosis effect according to the combined treatment of PLK1 inhibitor and bicalutamide

PLK1 억제제와 AR 억제제인 biclautamide의 병용 투여에 따른 탁솔 저항 세포의 사멸 효과를 증명하고자, bicalutamide의 농도를 20% 세포 생존 억제 농도 2.5 μM, 30% 세포 생존 억제 농도 5.5 uM으로 고정하고 BI2536(BI), volasertib(VL), genistein(GS)를 농도의존적으로 처리하여 inhibitory concentration(IC50)과 CI (combination index)값을 산출하였다.In order to prove the apoptosis effect of taxol-resistant cells following the co-administration of PLK1 inhibitor and AR inhibitor biclautamide, the concentration of bicalutamide was fixed at a concentration of 2.5 μM for 20% inhibition of cell survival and at a concentration of 5.5 μM for inhibition of 30% cell survival, and BI2536(BI) , volasertib (VL), and genistein (GS) were treated in a concentration-dependent manner to calculate inhibitory concentration (IC 50 ) and CI (combination index) values.

구체적으로, 96 well plate에 전립선 선암 세포주 LNCaP, LNCaPTXR를 3×104 cells/ml으로 배양하고 다음날 BI2536, volasertib, genistein을 농도의존적으로 48시간 처리하였다. 48시간 후, 2.5 mg/ml의 Thiazolyl blue tetrazolium bromide 시약을 20 ul/well으로 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상층액을 제거하고 formazan을 100 ul의 DMSO으로 녹여 분광기를 이용하여 540 nm의 파장에서 측정하고 50% 세포생존 억제율(GI50)의 값을 계산하였다.Specifically, the prostate adenocarcinoma cell lines LNCaP and LNCaP TXR were cultured at 3×10 4 cells/ml in a 96 well plate, and the next day, BI2536, volasertib, and genistein were treated for 48 hours in a concentration-dependent manner. After 48 hours, 2.5 mg/ml of Thiazolyl blue tetrazolium bromide reagent was treated with 20 ul/well and incubated at 37°C in an incubator for 1 hour. The supernatant was removed and formazan was dissolved in 100 ul of DMSO, measured at a wavelength of 540 nm using a spectrometer, and the value of 50% cell survival inhibition (GI 50 ) was calculated.

그 결과, 도 6a-d와 도 7에서 나타낸 바와 같이, LNCaP 세포에서 GI50값은 BI2536 8.4 nM, volasertib 14.1 nM, genistein 32 μM, bicalutamide 15 μM으로 측정되었고, LNCaPTXR에서 GI50값은 BI2536 23.8 nM, volasertib 43.9 nM, genistein 16.3 μM, bicalutamide 9.1 μM으로 분석되었다. As a result, as shown in FIGS. 6a-d and 7 , the GI 50 value in LNCaP cells was BI2536 8.4 nM, volasertib 14.1 nM, genistein 32 μM, and bicalutamide 15 μM, and the GI 50 value in LNCaP TXR was 23.8 BI2536 23.8. nM, volasertib 43.9 nM, genistein 16.3 μM, and bicalutamide 9.1 μM.

또한 도 6e-f와 도 7에 나타낸 바와 같이, bicalutamide와 병용 처리에 따른 GI50값과 CI값 분석에서 PLK1 억제제의 단독 처리 보다 병용 처리가 생존율 억제 효과에 더 의미있는 것으로 증명되었다. 구체적으로 LNCaP 세포 5.5 uM bicalutamide 고정 처리에서 CI 분석 값은, BI2536 0.7002, volasertib 0.5868, genistein 0.6762로 상가 효과가 관찰되었고, LNCaPTXR 5.5 uM bicalutamide 고정 처리에서 CI 분석 값은, BI2536 0.7262, volasertib 0.6818, genistein 0.8441으로 탁솔 저항 세포역시 PLK1과 AR 억제제에 따른 상가 효과가 관찰되었다.In addition, as shown in FIGS. 6e-f and 7 , in the analysis of the GI 50 and CI values according to the treatment in combination with bicalutamide, it was proved that the combination treatment was more meaningful than the PLK1 inhibitor alone treatment in the survival rate inhibitory effect. Specifically, in the LNCaP cells 5.5 uM bicalutamide fixed treatment, the CI analysis values were BI2536 0.7002, volasertib 0.5868 , and genistein 0.6762, and an additive effect was observed. An additive effect of PLK1 and AR inhibitors was also observed in taxol-resistant cells at 0.8441.

종합적으로 도 6과, 도 7의 결과에서 PLK1 억제제는 AR 억제제와 상가 효과가 보여지며, 일반적 암세포뿐만 아니라 탁솔 저항 세포에서도 상가 효과가 나타남을 증명하였다.Overall, in the results of FIGS. 6 and 7 , the PLK1 inhibitor showed an additive effect with the AR inhibitor, demonstrating that the additive effect was shown not only in general cancer cells but also in taxol-resistant cells.

실시예 7: 마우스모델에서 PLK1 억제제와 AR 억제제 병용 처리에 따른 종양 억제 효과Example 7: Tumor suppression effect of PLK1 inhibitor and AR inhibitor combination treatment in mouse model

PLK1 억제제와 AR 억제제인 biclautamide의 병용 투여에 따른 탁솔 저항 세포의 사멸 효과를 마우스 모델을 통하여 증명하고자, 9주령 수컷 BALB-c/누드 마우스 허벅다리 안쪽에 전립선 선암 세포주 LNCaP 또는 LNCaPTXR를 2×106 cells/100 ㎕(50 ㎕ DMEM + 50 ㎕ matrigel)으로 주사하여 종양을 형성하였다. 도 8a에 도식화한 바와 같이, 세포 주사 10일 후 LNCaP 또는 LNCaPTXR 주입 마우스에 10 mg/kg genistein 또는 45 mg/kg bicalutamide를 복강 투여하였고, LNCaPTXR 주입 마우스에 10 mg/kg genistein과 45 mg/kg bicalutamide 병용 투여하였다. 약물 투여는 3.5일 간격으로 3주간 진행하였고 3주 후, 세포주입부위를 절개하여 종양 크기를 분석하였다.To prove the apoptosis effect of taxol-resistant cells following the co-administration of a PLK1 inhibitor and an AR inhibitor biclautamide through a mouse model, 2×10 of the prostate adenocarcinoma cell line LNCaP or LNCaP TXR was applied to the inner thigh of a 9-week-old male BALB-c/nude mouse. Tumors were formed by injection with 6 cells/100 μl (50 μl DMEM + 50 μl matrigel). As illustrated in Figure 8a, 10 days after cell injection, 10 mg/kg genistein or 45 mg/kg bicalutamide was intraperitoneally administered to LNCaP or LNCaP TXR -injected mice, and 10 mg/kg genistein and 45 mg/kg to LNCaP TXR -injected mice. kg bicalutamide was co-administered. Drug administration was carried out at intervals of 3.5 days for 3 weeks, and after 3 weeks, the cell injection site was incised to analyze the tumor size.

그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 LNCaP을 주입한 종양(5.3 ㎣)에 비하여 LNCaPTXR를 주입한 종양(7.8 ㎣)의 부피가 더 크게 생성되었고, 약물 투여를 한 종양은 LNCaP, LNCaPTXR 모두에서 종양 크기가 줄어든 것을 관찰하였다. 또한 도 8c에서 보여진 바와 같이, LNCaPTXR 세포를 주입한 종양에서 약물의 단일 투여와 더불어 병용투여에서 종양의 크기가 감소한 것을 관찰하였다. 특히, 병용투여 요법에서는 단일 투여 보다 종양 억제 효과가 증가함을 증명하였다.As a result, as shown in FIG. 8b , the volume of the LNCaP TXR -injected tumor (7.8 mm 3 ) was larger than that of the LNCaP-injected tumor (5.3 mm 3 ), and the drug-administered tumor was found in both LNCaP and LNCaP TXR . A reduction in tumor size was observed. In addition, as shown in FIG. 8c , it was observed that the size of the tumor was reduced in the combined administration with the single administration of the drug in the tumor injected with LNCaP TXR cells. In particular, the combination therapy demonstrated that the tumor suppressive effect increased compared to the single administration.

종합적으로 도 8의 결과에서 PLK1의 억제제는 전립선 선암과 탁솔 저항이 있는 종양에서 종양 억제 효과가 있으며, AR 억제제와 병용 투여 시 효과가 증가함을 증명하였다.Overall, from the results of FIG. 8 , it was demonstrated that the PLK1 inhibitor had a tumor suppressive effect in prostate adenocarcinoma and taxol-resistant tumors, and that the effect was increased when administered in combination with an AR inhibitor.

Claims (8)

다음 화학식 1로 표시되는 화합물(BI2536) 또는 볼라설팁(volasertib)의 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 비칼루타마이드와 병용 투여되는 전립선암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
Figure 112021152320381-pat00009

A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of prostate cancer, comprising the compound (BI2536) represented by the following formula (1) or a PLK1 activity inhibitor of volasertib as an active ingredient and administered in combination with bicalutamide.
[Formula 1]
Figure 112021152320381-pat00009

 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서,
전립선 암은 탁솔 내성 전립선 암인 약학 조성물.
The method of claim 1,
A pharmaceutical composition wherein the prostate cancer is taxol-resistant prostate cancer.
 다음 화학식 1로 표시되는 화합물(BI2536) 또는 볼라설팁(volasertib)의 PLK1 활성 억제제를 유효성분으로 하고 비칼루타마이드와 병용 투여되는 약학 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료 방법.
[화학식 1]
Figure 112021152320381-pat00010

A pharmaceutical composition comprising the compound (BI2536) represented by the following formula (1) or a PLK1 activity inhibitor of volasertib as an active ingredient and administered in combination with bicalutamide to a subject other than a human. Prevention or treatment methods.
[Formula 1]
Figure 112021152320381-pat00010

 삭제delete 삭제delete 제 5 항에 있어서,
전립선 암은 탁솔 내성 전립선 암인 방법.6. The method of claim 5,
The method wherein the prostate cancer is taxol-resistant prostate cancer.
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