KR102381237B1 - 항체-사이토카인 생착된 단백질 및 면역 관련 장애를 위한 사용 방법 - Google Patents

항체-사이토카인 생착된 단백질 및 면역 관련 장애를 위한 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고친화성 인터루킨 수용체에 결합하고, 이를 통한 세포내 신호전달을 자극하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항-염증성 세포 반응을 향상시키고, 제1형 당뇨병과 같은 면역 관련 장애의 치료, 개선 및 예방에서 염증 유발 효과를 감소시키는 데 사용된다.

Description

항체-사이토카인 생착된 단백질 및 면역 관련 장애를 위한 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2017년 5월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 62/510,514의 이익을 주장한다.
기술분야
본 발명은 인터루킨-2(IL2) 고친화성 수용체에 결합하는 항체-사이토카인 생착된 단백질, 및 자가면역 및 면역 관련 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2018년 3월 30일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 PAT056491-WO-PCT_SL.txt이며, 크기가 115,255 바이트이다.
IL2는 1983년에 처음 클로닝되었다(Taniguchi et al., Nature 1983, 302:305-310, Devos et al., Nucleic Acid Res. 1983, 11(13):4307-4323, Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1983, 115:1040-1047). IL2 단백질은 아미노산 1-20의 신호 펩타이드를 갖는 153개 아미노산의 길이를 가지며, 4개의 역-평행, 양친매성 알파-헬릭스의 구조로 접힌다(Smith K.A., Science 1988, 240:1169-1176).
IL2는 고친화성 또는 저친화성 수용체를 통해 신호전달함으로써 그의 생물학적 효과를 매개한다(Kreig et al., PNAS 2010, 107(26)11906-11911). 고친화성 수용체는 IL2-Rα(CD25), IL2-Rβ(CD122) 및 IL2-Rγ(CD132)로 구성된 삼량체이다. 저친화성 수용체는 IL2-Rβ(CD122) 및 IL2-Rγ(CD132) 사슬로만 구성된 이량체이다. 저친화성 수용체는 IL2에 결합하지만, 삼량체, 고친화성 수용체보다 10 내지 100배 적은 친화력을 가지며, 이는 IL2-Rα(CD25)가 친화도 증가에 중요하지만 신호전달 성분이 아님을 나타낸다(Kreig et al., 위 참조). IL2 수용체의 발현도 또한 뚜렷하다. 고친화성 IL2 수용체는 활성화된 T 세포 및 CD4+/Foxp3+ T 조절 세포(Treg) 상에서 발현된다. 대조적으로, 저친화성 IL2 수용체는 CD8+ T 기억 세포, T 컨벤션 세포(Tcon) 및 자연 살해 세포(NK)에서 발견된다.
재조합 IL2(rhIL2)는 1992년에 임상용으로 처음 승인되었다(Coventry et al., Cancer Mgt Res. 2012 4:215-221). Proleukin®(Aldesleukin)은 비글리코실화되고 N-말단 알라닌이 없고 아미노산 125에서 시스테인으로 대체된 세린을 갖는(C125S), 변형된 IL2이다. Proleukin®은 처음에 악성 흑색종 및 신장 세포 암종에 대한 요법으로 표시되었지만 결장직장, 유방, 폐 및 중피종과 같은 다른 암 유형에 사용되었다(Coventry et al., 위 참조). 1986년부터 2006년까지 259명의 신장 세포 암종 환자를 대상으로 한 연구에 따르면 23명의 환자가 완전한 반응을 보였으며, 30명은 부분 반응을 보였다(Klapper et al., Cancer 2008 113(2):293-301). 이것은 신장 세포 암 환자의 7%에서 완전한 종양 퇴행과 함께 20%의 전체 객관적인 반응률을 설명하였다(Klapper et al., 위 참조).
그러나, 암의 IL2 치료는 부작용이 있었다. 259명의 환자 연구에서 모세 혈관/혈관 누출, 혈관확장 및 소변감소증이 나타났다. 또한, 호중구 기능장애로 인한 카테터 및 일반적인 감염 모두 3등급 및 4등급 감염이 있었다(Klapper et al., 위 참조). Proleukin® 문헌에 따르면, Proleukin®은 자가면역 질환 및 면역 관련 장애, 예컨대 크론 병, 경피증, 갑상선염, 염증성 관절염, 당뇨병, 안구형-연수 중증 근무력증, 반월상 IgA 사구체신염, 담낭염, 뇌척수염, 스티븐-존슨 증후군 및 수포성 유사천포창의 악화와 관련이 있다.
Treg 세포가 고친화성 IL2 수용체를 구성적으로 발현하고 생존 및 기능을 위해 IL2에 의존한다는 발견은 Treg 세포를 모의하는 방법으로서 IL2에 초점을 둔 작업으로 이어진다(D'Cruz et al., Nat. Immuno. 2005, 6:1152-1159). 저용량 IL2는 제1형 당뇨병 환자에게 안전하고 효과적인 치료법인 것으로 나타났다(Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1:295-305). C형 간염 바이러스는 혈관염(Saadoun et al., N. Eng. J. Med. 2011, 365:2067-2077) 및 만성 이식편 대 숙주 질환(Koreth et al., N. Eng. J. Med. 2011 365:2055-2066)을 유발시켰다. 그러나, IL2는 신체에서 반감기가 매우 짧으므로 여러 번 투여해야 한다. 이는 IL2 저 수용체에 대한 활성이 감소되고 약동학이 개선된 고친화성 수용체를 통해 Treg를 자극하기 위한 선택성을 갖는 IL2 치료제의 필요성을 설명한다.
본 발명은 임상에서 공지되어 사용되는 분자보다 바람직한 치료적 프로파일을 갖는 항체의 CDR 서열에 생착된 IL2 분자를 갖는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 특히, 제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 CD8+ T 세포, Tcon 또는 NK 세포의 활성을 증가시키지 않으면서, Treg 활성을 증가 또는 유지시킨다. 또한, 제공된 조성물은 Proleukin®과 같은 재조합 인간 IL2 제형에 비해 개선된 반감기, 안정성 및 생산성을 전달한다. 이들 조성물의 바람직한 특성은 임상에서 이전에 사용되거나, 문헌에 기재된 것보다 바람직한 치료 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 일부 실시형태는 바람직하게는 IL2 고친화성 수용체 대 IL2 저친화성 수용체에 결합하여 이를 통한 신호전달을 촉진하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 본원에 개시된 일부 실시형태는 바람직하게는 Treg 대 CD8+ T 세포, Tcon 또는 NK 세포를 활성화시키는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다.
본 발명의 실시형태는 하기를 포함하는 항체-사이토카인 생착된 단백질을 제공한다:
(a) 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
(b) LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(c) VH 또는 VL의 CDR에 생착된 인터루킨 2(IL2) 분자.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 중쇄 CDR에 생착된 IL2 분자를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 IL2 분자가 상보성 결정 영역 1(HCDR1), 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 또는 상보성 결정 영역 3(HCDR3)으로부터 선택된 영역으로 생착된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 HCDR1에 생착된 IL2 분자를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 경쇄 CDR에 생착된 IL2 분자를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 IL2 분자가 상보성 결정 영역 1(LCDR1), 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 상보성 결정 영역 3(LCDR3)으로부터 선택된 영역으로 생착된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 저친화성 IL2 수용체에 대한 IL2 분자의 친화도를 감소시키는 돌연변이를 함유하는 IL2 분자를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin® 이상으로 Treg 세포 증식을 자극한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin® 미만으로 CD8 T 효과기 증식을 자극한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin®보다 긴 반감기를 갖는다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 IL2 분자가 서열 번호:4로 구성된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 IL2 분자가 서열 번호:6으로 구성된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG 부류 항체 중쇄를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG 부류 항체 중쇄가 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 CDR의 결합 특이성이 생착된 IL2 분자에 의해 감소된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 CDR의 결합 특이성이 생착된 IL2 분자의 존재하에 유지된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 CDR의 결합 특이성이 IL2 분자의 결합 특이성과 구별된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 가변 도메인의 결합 특이성이 비-인간 항원에 대한 것이다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 비-인간 항원이 바이러스이다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 바이러스가 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)이다.
항체 사이토카인 생착된 단백질로서, 상기 RSV는 RSV 서브그룹 A 및 RSV 서브그룹 B로부터 선택된다.
항체 사이토카인 생착된 단백질의 항체 스캐폴드 부분이 인간화되거나 인간이다.
본 발명의 실시형태는 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다:
(i) (a) 서열 번호:17의 HCDR1, (b) 서열 번호:18의 HCDR2, (c) 서열 번호:19의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (d) 서열 번호:30의 LCDR1, (e) 서열 번호:31의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:32의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) (a) 서열 번호:43의 HCDR1, (b) 서열 번호:44의 HCDR2, (c) 서열 번호:45의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호:56의 LCDR1, (e) 서열 번호:57의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:58의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iii) (a) 서열 번호:69의 HCDR1, (b) 서열 번호:70의 HCDR2, (c) 서열 번호:71의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호:82의 LCDR1, (e) 서열 번호:83의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:84의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iv) (a) 서열 번호:95의 HCDR1, (b) 서열 번호:96의 HCDR2, (c) 서열 번호:97의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호:108의 LCDR1, (e) 서열 번호:109의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:110의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 실시형태는 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다:
(i) 서열 번호:20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:33을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) 서열 번호:46을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:59를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(iii) 서열 번호:72를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:85를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iv) 서열 번호:98을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:111을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체가 감소된 효과기 기능에 상응하는 변형된 Fc 영역을 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 변형된 Fc 영역이 D265A, P329A, P329G, N297A, L234A, 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 상기 변형된 Fc 영역이 D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이 조합을 포함한다.
본 발명의 실시형태는 서열 번호:17의 HCDR1, 서열 번호:18의 HCDR2, 서열 번호:19의 HCDR3, 서열 번호:30의 LCDR1, 서열 번호:31의 LCDR2, 서열 번호:32의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공하며, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Proleukin®과 비교할때 Treg 세포의 활성화가 더 크다.
본 발명의 실시형태는 서열 번호:43의 HCDR1, 서열 번호:44의 HCDR2, 서열 번호:45의 HCDR3, 서열 번호:56의 LCDR1, 서열 번호:57의 LCDR2, 서열 번호:58의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공하며, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Proleukin®과 비교할때 Treg 세포의 활성화가 더 크다.
본 발명의 실시형태는 서열 번호:69의 HCDR1, 서열 번호:70의 HCDR2, 서열 번호:71의 HCDR3, 서열 번호:82의 LCDR1, 서열 번호:83의 LCDR2, 서열 번호:84의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공하며, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Proleukin®과 비교할때 Treg 세포의 활성화가 더 크다.
본 발명의 실시형태는 서열 번호:95의 HCDR1, 서열 번호:96의 HCDR2, 서열 번호:97의 HCDR3, 서열 번호:108의 LCDR1, 서열 번호:109의 LCDR2, 서열 번호:110의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공하며, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Proleukin®과 비교할때 Treg 세포의 활성화가 더 크다.
본 발명의 실시형태는 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다:
(i) 서열 번호:23의 중쇄; 및 서열 번호:36의 경쇄;
(ii) 서열 번호:49의 중쇄; 및 서열 번호:62의 경쇄;
(iii) 서열 번호:75의 중쇄; 및 서열 번호:88의 경쇄; 또는
(iv) 서열 번호:101의 중쇄; 및 서열 번호:114의 경쇄.
본 발명의 실시형태는 단백질의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 본원에 개시된 핵산, 및 선택적으로 분비 신호를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생산에 적합한 재조합 숙주 세포를 제공한다.
재조합 숙주 세포는 포유동물 세포주이다.
본 발명의 실시형태는 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시형태는 개체에게 치료적 유효량의 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 면역 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법으로서, 상기 면역 관련 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군.
상기 방법으로서, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 약제학적 조성물은 또 다른 치료제와 조합하여 투여된다.
상기 방법으로서, 상기 치료제는 또 다른 항체 사이토카인 생착된 단백질이다.
본 발명의 실시형태는 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, Treg 세포를 이를 필요로 하는 환자에서 확장시키는 방법을 제공한다.
상기 방법으로서, 상기 Treg 세포가 확장되고, CD8 T 효과기 세포가 확장되지 않는다.
상기 방법으로서, 상기 Treg 세포가 확장되고, NK 세포가 확장되지 않는다.
상기 방법으로서, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 약제학적 조성물은 또 다른 치료제와 조합하여 투여된다.
상기 방법으로서, 상기 치료제는 또 다른 항체 사이토카인 생착된 단백질이다.
본 발명의 실시형태는 치료제로서 사용하기 위한 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다.
면역 관련 장애의 치료에 있어서 상기 용도로서, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 하기를 포함한다: (i) (a) 서열 번호:17의 HCDR1, (b) 서열 번호:18의 HCDR2, (c) 서열 번호:19의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (d) 서열 번호:30의 LCDR1, (e) 서열 번호:31의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:32의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (ii) (a) 서열 번호:43의 HCDR1, (b) 서열 번호:44의 HCDR2, (c) 서열 번호:45의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호:56의 LCDR1, (e) 서열 번호:57의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:58의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
상기 용도로서, 면역 관련 장애는 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 용도로서, 상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 또 다른 치료제와 조합하여 투여된다.
본 발명의 실시형태는 치료를 필요로 하는 개체에서의 면역 관련 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질의 용도를 제공한다.
상기 용도로서, 면역 관련 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군.
특정 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG 부류 항체 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 서브클래스 Fc 영역으로부터 선택된다. 항체, 항체 단편 또는 항원 결합 분자는 선택적으로 Fc 수용체에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 조절(즉, 증가 또는 감소)시키는 하나 이상의 변형을 함유한다. 면역글로불린 중쇄는 변형된 효과기 기능을 부여하는 변형을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄는 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는, 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 또한 분자의 IL2 부분의 변이를 포함한다. 변이는 단일 아미노산 변화, 단일 아미노산 결실, 다중 아미노산 변화 및 다중 아미노산 결실일 수 있다. 분자의 IL2 사이토카인 부분에서의 이러한 변화는 저-친화성 IL2 수용체에 대한 사이토카인 생착된 단백질의 친화도를 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 적어도 중쇄 및/또는 경쇄 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생산에 적합한 숙주 세포를 추가로 제공한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 경쇄 및/또는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 발현, 형성 및 분비에 적합한 조건하에 본원에 기재된 바와 같은 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 항체 사이토카인 생착된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 제조 방법이 제공된다. 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 투여하기 위한 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 면역 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 관련 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 환자는 면역 관련 장애, 예를 들어 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군을 갖는다. 일부 적응증의 경우, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 스테로이드(예를 들어, 메틸프레드니솔론, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 부데소니드, 덱사메타손)와 공동-투여된다.
정의
"항체"는 사량체 구조 단위를 포함하는 면역글로불린 계열의 분자를 지칭한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 디설파이드 결합을 통해 연결된, 하나의 "경"쇄(약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄(약 50~70 kD)를 갖는다. 인식된 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ, δ, ε, 및 μ 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 κ 또는 λ로 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ, 또는 ε로 분류되며, 이는 차례로 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 각각 정의한다. 항체는 임의의 이소형/부류(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)일 수 있다.
경쇄 및 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 구조적으로 및 기능적으로 이용된다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변(V) 영역 또는 도메인을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 경쇄 및 중쇄의 이들 영역을 지칭한다. VH 및 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다 V 영역 이외에, 중쇄 및 경쇄는 모두 불변(C) 영역 또는 도메인을 함유한다. 면역글로불린 C 영역의 분비된 형태는 3개의 C 도메인, CH1, CH2, CH3, 선택적으로 CH4(Cμ), 및 힌지 영역으로 구성된다. 면역글로불린 C 영역의 막-결합된 형태는 또한, 막 및 세포내 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 N-말단에 VL를 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인(C)을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3)은 분비, 태반 통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례상, 불변 영역 도메인의 넘버링은 불변 영역 도메인이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가된다. N 말단은 가변 영역이고, C 말단은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시 말단 도메인을 포함한다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체"는 통상적인 항체 구조 및 항체의 변이를 포함한다. 따라서, 이 개념의 범위 내에는 항체 사이토카인 생착된 단백질, 전장 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 및 이의 항체 단편이 있다.
항체는 온전한 면역글로불린 쇄로서, 또는 다양한 펩티다제에 의한 소화로 생성된 다수의 잘-특성화된 항체 단편으로서 존재한다. 용어 "항체 단편"은 본 명세서에 사용된 바와 같이, 6개의 CDR을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역에서 디설파이드 결합 아래의 항체를 분해하여 디설파이드 결합에 의해 자체가 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab'의 이량체인, F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에서 환원되어, 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 끊어 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(Paul et al., Fundamental Immunology 3d ed. (1993)). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화 측면에서 정의되지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체 단편"은 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체의 하나 이상의 부분, 또는 결합 특이성 및 기능적 활성을 보유하는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로 합성된 것들을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv 단편, 단일 사슬 항체(ScFv), Fab, Fab', Fd(Vh 및 CH1 도메인), dAb(Vh 및 단리된 CDR); 및 동일한 결합 특이성을 갖는 이들 단편의 다량체 버전(예를 들어, F(ab')2)을 포함한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 또한 원하는 결합 특이성 및 활성을 달성하는데 필요한 항체 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "Fab" 도메인은 중쇄 가변 도메인, 불변 영역 CH1 도메인, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역 CL 도메인을 포함한다. 도메인의 상호작용은 CH1과 CL 도메인 사이의 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. 일부 실시형태에서, Fab의 중쇄 도메인은 N-말단에서 C-말단, VH-CH의 순서이며, Fab의 경쇄 도메인은 N-말단에서 C-말단, VL-CL의 순서이다. 일부 실시형태에서, Fab의 중쇄 도메인은 N-말단에서 C-말단, CH-VH의 순서이며, Fab의 경쇄 도메인은 CL-VL의 순서이다. Fab 단편은 온전한 면역글로불린의 파파인 소화에 의해 역사적으로 확인되었지만, "Fab"는 전형적으로 임의의 방법에 의해 재조합적으로 생성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이며, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다.
“상보성-결정 도메인" 또는 "상보성-결정 영역"("CDR")은 상호교환적으로 VL 및 VH의 초가변 영역을 지칭한다. CDR은 표적 단백질에 대한 특이성을 보유하는 항체 쇄의 이러한 표적 단백질-결합 부위이다. 각각의 인간 VL 또는 VH에는 3개의 CDR(N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된 CDR1 내지 3)이 존재하고, 이들은 가변 도메인의 약 15 내지 20%를 구성한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 대해 구조적으로 상보적이며, 따라서 결합 특이성의 직접적인 원인이 된다. VL 또는 VH의 나머지 스트레치(stretch), 소위 프레임워크 영역(FR)은 아미노산 서열의 보다 적은 변이를 보인다(Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당 업계에서 잘 알려진 다양한 정의, 예를 들어, Kabat, Chothia, 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997) 참고). 항원 결합 부위의 정의는 또한 하기에 기재되어 있다: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); 및 Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); (ImMunoGenTics (IMGT) numbering) Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); and Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
Kabat 하에서, VH 내의 CDR 아미노산 잔기는 31~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 넘버링된다. Chothia 하에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26~32(HCDR1), 52~56(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 아미노산 잔기는 26~32(LCDR1), 50~52(LCDR2), 및 91~96(LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat 및 Chothia 둘 모두의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체 가변 경쇄" 또는 "항체 가변 중쇄"는 각각 VL 또는 VH를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 내인성 VL은 유전자 세그먼트 V(가변) 및 J(접합)에 의해 암호화되고, 내인성 VH는 V, D(다양성), 및 J에 의해 암호화된다. VL 또는 VH 각각은 CDR 뿐만 아니라 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 용어 "가변 영역" 또는 "V-영역"은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 상호교환적으로 지칭한다. V-영역은 자연 발생, 재조합 또는 합성일 수 있다. 본원에서, 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄는 총괄적으로 “항체 사슬”로 지칭될 수 있다. 본원에 제공되고 추가로 기재된 바와 같이, "항체 가변 경쇄" 또는 "항체 가변 중쇄" 및/또는 "가변 영역" 및/또는 "항체 사슬"은 선택적으로 CDR에 포함된 사이토카인 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
예를 들어, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 본원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부분은 "Fc" 도메인이다. 본원에 사용된 바와 같은 "Fc 영역"은 제1 불변 영역(CH1) 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 지칭한다. Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이러한 도메인의 N-말단에 있는 가요성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1과 Cγ사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 카르복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 넘버링은 Kabat et al.에서와 같은 EU 지수에 따른 것으로 당업계에서 이해된다 (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). "Fc 영역”은 단리된 이러한 영역, 또는 항체 또는 항체 단편과 관련된 이러한 영역을 지칭할 수 있다. "Fc 영역"은 예를 들어 효과기 기능을 조절하는 변형을 포함하여, 예를 들어, CH2 및 CH3 영역에서 Fc 영역의 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. Fc 영역은 또한 생물학적 기능을 변경시키지 않는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 기능의 실질적인 손실없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, C-말단 리신은 변형되고 대체되거나 제거된다. 특정 실시형태에서, Fc 영역내 하나 이상의 C-말단 잔기가 변경되거나 제거된다. 특정 실시형태에서, Fc 중 하나 이상의 C-말단 잔기(예를 들어, 말단 리신)가 결실된다. 다른 특정 실시형태에서, Fc 중 하나 이상의 C-말단 잔기는 대체 아미노산으로 치환된다(예를 들어, 말단 리신이 대체됨). 상기 변이체는 활성에 최소한의 영향을 미치도록 당 업계에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택된다(예를 들어, Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990 참고). Fc 도메인은 FcR과 같은 세포 수용체에 의해 인식되고 보체-활성화 단백질인 C1q가 결합하는 면역글로불린(Ig)의 부분이다. CH2 엑손의 5' 부분에 암호화된 하부 힌지 영역은 FcR 수용체에 결합하기 위한 항체내 유연성을 제공한다.
"키메라 항체"는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전적으로 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 및 약물에 연결되도록 변경되거나, 대체되거나 또는 교환되거나; (b) 가변 영역, 또는 이의 일부가, 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경되거나, 대체되거나 또는 교환된, 항체 분자이다.
"인간화된" 항체는 인간에서 면역원성이 적으면서 비인간 항체의 반응성(예를 들어, 결합 특이성, 활성)을 유지하는 항체이다. 이것은 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 유지하고 항체의 나머지 부분을 인간 대응물로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)를 참조한다.
"인간 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 기원의 서열들로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역 또한, 이러한 인간 서열, 예를 들어, 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다(예를 들어, Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000 참조). 인간 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제작을 촉진하기 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다.
용어 "상응하는 인간 생식계열 서열"은 인간 생식계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 암호화되는 모든 다른 공지된 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열과 가장 높게 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 생식계열 서열은 또한, 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열과 아미노산 서열 동일성이 가장 높은 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위 서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식계열 서열은 프레임워크 영역 단독, 상보성 결정 영역 단독, 프레임워크 및 상보성 결정 영역, (위에 정의된 바와 같은) 가변 절편, 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위 서열의 기타 조합일 수 있다. 본 설명에 기술된 방법을 이용하여, 예를 들어, 2개의 서열을 BLAST, ALIGN, 또는 당해 분야에 공지된 또 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 정렬하여, 서열 동일성을 결정할 수 있다. 상응하는 인간 생식계열 핵산 또는 아미노산 서열은 기준 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "원자가”는 폴리펩타이드내 잠재적 표적 결합 부위의 수를 지칭한다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자상의 특정 부위에 특이적으로 결합한다. 폴리펩타이드가 둘 이상의 표적 결합 부위를 포함하는 경우, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 분자, 예를 들어, 상이한 항원, 또는 동일한 분자상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음). 예를 들어, 종래의 항체는 2개의 결합 부위를 가지고 2가이며; "3가" 및 "4가"는 항체 분자에서 각각 3개의 결합 부위 및 4개의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 1가(즉, 하나의 표적 분자에 결합), 2가 또는 다가(즉, 둘 이상의 표적 분자에 결합)일 수 있다.
표적(예를 들어, 단백질)과 항체, 항체 사이토카인 생착된 단백질 사이의 상호 작용을 기술하는 맥락에서 사용될 때 어구 "특이적으로 결합한다" 또는 "결합 특이성"은 단백질 및 기타 생물제제의 비균질 집단, 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플 내의 표적의 존재를 결정짓는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 특정한 지정된 조건 하에, 특정한 결합 특이성이 있는 항체 사이토카인 생착된 단백질은 특정 표적에 배경값의 적어도 2배로 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 표적에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 일 실시형태에서, 지정된 조건 하에, 특정한 결합 특이성이 있는 항체 사이토카인 생착된 단백질은 특정 항원에 배경값의 적어도 10배로 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 표적에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서의 항체 사이토카인 생착된 단백질에 대한 특이적인 결합은 이 항체 사이토카인 생착된 단백질이 특정 표적 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선별되었음을 요구할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 특이적 결합은 인간 IL2 고친화성 수용체에 선택적으로 결합하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하고, 예를 들어, 다른 사이토카인 수용체 수퍼패밀리 구성원과 교차-반응하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 인간 IL2 고친화성 수용체에 선택적으로 결합하고 비-인간 영장류 IL2R(예를 들어, 사이노몰구스 IL2R)과 교차-반응하는 항체 사이토카인 생착된 단백질이 선택된다. 일부 실시형태에서, 인간 IL2 고친화성 수용체에 선택적으로 결합하고 추가의 표적 항원과 반응하는 항체 생착된 단백질이 선택된다. 특정 표적 항원 단백질과 특이적으로 반응성인 항체 사이토카인 생착된 단백질을 선택하기 위해 다양한 형식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질과 특이적으로 면역반응성을 나타내는 항체를 선별하는데 통상적으로 사용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역검정 형식 및 조건에 대한 설명은 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 전형적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호에 비해 적어도 2배, 더욱 전형적으로는 배경보다 적어도 10 내지 100배의 신호를 생성할 것이다.
용어 "평형 해리 상수(KD, M)"는 결합 속도 상수(ka, 시간-1, M-1)로 나눈 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 지칭한다. 당해 분야의 임의의 공지된 방법을 이용하여 평형 해리 상수를 측정할 수 있다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 일반적으로 평형 해리 상수가 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어, 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 실시형태에서는 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만일 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프" 또는 "결합 영역"은 항체 CDR과 항원 단백질 사이의 특이적 결합을 담당하는 항원 단백질의 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체-사이토카인 결합 영역"은 생착된 사이토카인과 그의 수용체(예를 들어, IL2 고친화성 수용체) 사이의 특이적 결합을 담당하는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생착된 사이토카인 부분의 도메인을 지칭한다. 각각의 항체 사이토카인 생착된 단백질에 존재하는 하나 이상의 상기 수용체-사이토카인 결합 영역이 있으며, 각각의 결합 영역은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "작용제"는 수용체를 활성화시켜 전체 또는 부분 수용체-매개 반응을 유도할 수 있는 항체를 상호교환적으로 지칭한다. 예를 들어, IL2 고친화성 수용체의 작용제는 IL2 고친화성 수용체에 결합하고, IL2-매개된 세포내 신호전달, 세포 활성화 및/또는 Treg 세포의 증식을 유도한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질 작용제는 일부 양태에서 천연 IL2 리간드와 유사하게 IL2 고친화성 수용체를 통한 신호전달을 자극한다. IL2의 고친화성 수용체에 대한 IL2의 결합은 Jak1 및 Jak2 활성화를 유도하여 STAT5 인산화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질 작용제는 IL2 고친화성 수용체에 결합하고, STAT5 인산화, 및/또는 Treg 세포의 증식을 유도하는 능력에 의해 확인될 수 있다.
용어 "IL2" 또는 "IL-2" 또는 "인터루킨 2" 또는 "인터루킨-2"은 알파 나선형 사이토카인 패밀리 구성원을 상호교환적으로 지칭하며, 여기서 천연 단백질은 염증 과정의 조절 및 유지에 작용한다. IL2의 특성은 N 및 C-말단이 공간에서 서로 근접하여, IL2 사이토카인 단백질이 항체 생착에 적합하게 한다는 것이다. 전장 고유 인간의 잔기 21~153을 포함하는 IL2는 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질의 맥락에서 이용된다. 본원에 개시된 바와 같은 인간 IL2는 그의 전체 길이에 걸쳐, 아미노산 서열 번호:2와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가지며, 본 명세서에 기재된 항체 사이토카인 생착된 단백질의 우선적 작용제 활성을 보유하며, GenBank 수탁 번호: Np_000577로 공개되었다. 서열 번호:1은 인간 IL2 cDNA 서열이다. 본원에 개시된 바와 같은 IL2 단백질을 암호화하는 인간 IL2 핵산은 그의 전체 길이에 걸쳐, 서열 번호:1의 핵산 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가지며, GenBank 수탁 번호: Nm_000586로 공개되었다.
용어 "항체 사이토카인 생착된 단백질" 또는 "항체 사이토카인 생착" 또는 "생착된"은 적어도 하나의 사이토카인이 항체의 CDR 내에 직접 통합되어, CDR의 서열을 방해함을 의미한다. 사이토카인은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 또는 LCDR3내에 통합될 수 있다. 사이토카인은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 또는 LCDR3 내에 통합될 수 있으며, CDR의 N-말단 서열 또는 CDR의 C-말단 서열로 통합될 수 있다. CDR 내에 통합된 사이토카인은 원래 표적 단백질에 대한 항체 부분의 특이적 결합을 감소시킬 수 있거나, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 그의 표적 단백질에 대한 그의 특이적 결합을 유지할 수 있다. 예시적인 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, 및 TNF-β를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 사이토카인을 항체의 하나의 "아암"의 특정 CDR에 생착하고, 또 다른 상이한 사이토카인을 항체의 다른 "아암"의 CDR에 생착할 수도 있다. 예를 들어, 항체의 하나의 "아암"의 HCDR1에 IL2를 생착시키고, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 다른 "아암"의 LCDR1에 IL-7을 생착시키는 것은 이중 기능 항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성할 수 있다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질에 자연 상태와 관련된 다른 세포 성분이 본질적으로 없음을 의미한다. 바람직하게는 균질한 상태이다. 건조 또는 수용액 중 하나일 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자를 측면에 두고 관심있는 유전자 이외의 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 기본적으로 하나의 밴드를 생성함을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 것을 의미한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려져 있는 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 명시적으로 지시된 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "폴리펩타이드", “펩타이드” 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 이 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화되는 것들뿐만 아니라 추후에 변형된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α-탄소가 있는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, GCA, GCC, GCG 및 GCU 코돈 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 이 코돈은 암호화되는 폴리펩타이드를 바꾸지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이고, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 본 설명의 모든 핵산 서열은 또한, 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 그리고 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이가 각각의 기술된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 관해, 당업자는 변경으로 인해 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환이 초래되는 경우, 암호화된 서열내 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체”임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 대해 부가적이고, 이를 배제하지 않는다. 다음의 8개 군이 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, Creighton, Proteins (1984) 참조).
"서열 동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 상기 비교 창에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위해 첨가 또는 결실을 포함하지 않는 기준 서열(예를 들어, 폴리펩타이드)과 비교하여 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창에서 총 위치의 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정하였을 때, 비교창 또는 지정된 영역에 걸친 최대 상응성을 비교 및 정렬한 경우, 2개의 서열에 소정의 백분율(즉, 소정의 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 참고 서열의 전체 서열에 걸쳐, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 있으면 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 본 발명은 본원에 예시된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 각각 실질적으로 동일한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다(예를 들어, 서열 번호:20, 서열 번호:33, 서열 번호:46, 서열 번호:59, 서열 번호:72, 서열 번호:85, 서열 번호:98, 또는 서열 번호:111 중 어느 하나에 예시된 가변 영역. 동일성은 적어도 약 15, 25 또는 50개 뉴클레오타이드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게 100 내지 500 또는 1000개 이상 뉴클레오타이드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐, 존재한다. 아미노산 서열과 관련하여, 동일성 또는 실질적 동일성은 적어도 5, 10, 15 또는 20개 아미노산 길이, 선택적으로 적어도 약 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100개 아미노산 길이, 선택적으로 적어도 약 150, 200 또는 250개 아미노산 길이, 또는 기준 서열의 전체 길이의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 더 짧은 아미노산 서열, 예를 들어, 20개 이하 아미노산의 아미노산 서열과 관련하여, 본 명세서에 정의된 보존적 치환에 따라 하나 또는 2개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환될 때 실질적인 동일성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다.
본 설명에서 사용된 "비교창"은 20개 내지 600개, 일반적으로는 약 50개 내지 약 200개, 더욱 일반적으로는 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접한 위치의 개수 중 임의의 하나의 절편에 대한 조회를 포함하고, 여기에서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 인접한 위치의 개수가 동일한 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지(미국 위스콘신 주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재 Genetics Computer Group)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 2개 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 ltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개 이용 가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드(word)와 정렬될 때 약간의 양의 값의 역치 점수 T와 매칭(matching)되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치라 지칭된다(Altschul et al., 위 참조). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색 개시를 위한 시드(seed)로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 워드 히트는 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 뉴클레오타이드 서열에 대해, 파라미터 M(한 쌍의 매치되는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매치된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열에 대해서는, 득점 매트릭스는 누적 점수를 계산하는 데 사용된다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 채점 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 되거나; 또는 어느 한쪽 서열의 끝에 도달했을 때, 각 방향으로의 워드 히트의 확장이 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X가 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4, 및 2개 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 기댓값(E)을 사용하고, BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 참조) 정렬 (B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한, 2개의 서열들 사이에서 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어 Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 참조). BLAST 알고리즘이 제공하는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 아래에 기술된 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 제2 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성을 나타낸다는 점이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 펩타이드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 아래에 기술된 바와 같이, 2개의 분자 또는 이들의 상보물이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 점이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 서열을 증폭시키는 데 동일한 프라이머가 사용될 수 있다는 점이다.
결합 영역이 항체 사이토카인 생착된 단백질 내에 어떻게 연결되는지를 설명하는 맥락에서 사용될 때 용어 "링크"는 영역을 물리적으로 결합시키는 모든 가능한 수단을 포함한다. 다수의 결합 영역은 화학 결합, 예컨대 공유 결합(예를 들어, 펩타이드 결합 또는 디설파이드 결합) 또는 비-공유 결합에 의해 종종 결합되며, 이는 직접 결합(즉, 두 결합 사이에 링커가 없음) 또는 간접 결합(즉, 둘 이상의 결합 영역 사이에 적어도 하나의 링커 분자의 도움으로)일 수 있다.
"면역 관련 장애" 또는 "면역 질환"은 신체 자체의 면역계가 건강한 조직을 공격하는, 면역계의 기능장애를 지칭한다. 기능장애는 면역 세포의 구성요소에 있을 수 있으며, 과활성 및 저활성 면역계를 모두 포함한다.
용어들 "대상체", "환자" 및 "개체"는 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류 포유동물을 상호교환적으로 지칭한다. 포유동물은 또한, 실험실 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 농업용 포유동물(예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타) 또는 가정용 포유동물(예를 들어, 개, 고양이)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애를 “치료하다”, “치료하는” 또는 임의의 질환 또는 장애의 “치료”라는 용어는 일 실시 형태에서 질환 또는 장애를 개선시키는 것(즉, 질환 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 발생을 늦추거나 저지하거나 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 실시 형태에서, “치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”는 환자가 식별하지 못할 수도 있는 것을 비롯하여 적어도 하나의 신체 파라미터를 완화시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, “치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”는 물리적으로(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화) 또는 둘 모두로 질환 또는 질병을 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, “치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”는 질환 또는 장애의 발병 또는 발달 또는 진행을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다.
용어 "치료적으로 허용가능한 양" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은 원하는 결과(즉, 염증 감소, 통증 억제, 염증 예방, 염증 반응의 억제 또는 예방)를 달성하기에 충분한 양을 상호교환적으로 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료적으로 허용가능한 양은 바람직하지 않은 부작용을 유도하거나 야기하지 않는다. 치료적으로 허용가능한 양은, 먼저 낮은 용량을 투여한 후, 원하는 효과가 달성될 때까지 그 용량을 점증적으로 증가시켜 결정할 수 있다. IL2 항체 사이토카인 생착된 단백질의 "예방적으로 효과적인 투여량" 및 "치료적으로 효과적인 투여량”은 각각 면역 관련 장애와 관련된 증상을 포함한 질병 증상의 발병을 방지하거나 이의 중증도의 감소를 초래할 수 있다.
용어 "동시 투여(co-administer)"는 개체내에 2종(또는 이상)의 활성제의 동시적인 존재를 지칭한다. 동시 투여되는 활성제는 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
본 설명에서 사용된 어구 "본질적으로 ~로 구성된"은 방법 또는 조성물에 포함된 활성 약제의 종류뿐만 아니라 방법 또는 조성물의 의도된 목적을 위한, 임의의 불활성 담체 또는 부형제도 지칭한다. 일부 실시형태에서, 어구 "본질적으로 ~로 구성된"은 IL2 항체 사이토카인 생착된 단백질 이외의 1종 이상의 추가 활성제의 포함을 명백하게 배제한다. 일부 실시형태에서, 어구 "본질적으로 ~로 구성된"은 IL2 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 제2 동시-투여된 제제 이외의 이상의 추가 활성제의 포함을 명백하게 배제한다.
단수 형태("a", "an" 및 "the")에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조물이 포함된다.
도 1은 IgG.IL2D49A.H1이 재조합 IL2(Proleukin®)와 비교하여 Treg를 우선적으로 확장한다는 것을 보여주는 항체 사이토카인 생착된 작제물의 표이다.
도 2는 항체 사이토카인 생착된 단백질과 재조합 IL2(Proleukin®)를 비교하는 표이다. STAT5 인산화에 의해 측정되는 바와 같이, IgG.IL2D49A.H1 분자는 Treg 세포 상에서 IL2 수용체를 자극하지만, T 효과기 세포(Teff) 또는 NK 세포 상에서는 자극하지 않는다는 사실에 유의한다. 이 분자는 또한, Proleukin®보다 반감기가 길며, 생체내 Treg 세포의 더 큰 확장을 유발한다.
도 3은 등몰 용량의 항체 사이토카인 생착된 단백질이 Proleukin®과 비교되는 경우 상이한 면역조절 세포 유형의 패널에서의 배수 변화의 표이다.
도 4는 Proleukin®과 비교되는 바와 같이, 및 STAT5 인산화에 의해 측정되는 바와 같이, 항체 사이토카인 생착된 단백질에 의한 IL2 저친화성 또는 고친화성 수용체의 차등 활성화에 대한 실험 데이터를 보여준다. IgG.IL2D49A.H1이 Treg 세포 상에서 발현되지만 CD4+ 또는 CD8+ Tcon 세포 상에서는 발현되지 않는 고친화성 IL2 수용체를 자극한다는 것을 유의한다.
도 5는 항체 사이토카인 생착된 단백질(예를 들어, IgG.IL2D49A.H1)에 의해 확장된 Treg이 T 효과기 세포(Teff)의 보다 우수한 억제제인 실험 데이터를 보여준다(상부 패널 참조). 하부 패널은 항체 사이토카인 생착된 단백질에 의해 확장된 Treg 세포가 Foxp3 단백질 발현에 의해 및 Foxp3 메틸화에 의해 안정하다는 실험 데이터를 보여준다.
도 6은 항체 사이토카인 생착된 단백질이 IL2 저친화성 수용체를 발현하는 NK 세포 상에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 실험 데이터를 보여준다. 대조적으로, Proleukin®은 pSTAT5 활성화에 의해 측정된 바와 같이, NK 세포를 자극한다.
도 7은 사이노몰구스 원숭이에서 Proleukin®과 비교하여 항체 사이토카인 생착된 단백질의 약동학(PK), 약역학(PD) 및 독성 프로파일에 대한 실험 데이터를 보여준다. 예를 들어, IgG.IL2D49A.H1은 Proleukin®보다 훨씬 감소된 호산구증가증 독성 프로파일을 갖는다.
도 8은 IgG.IL2D49.H1의 연장된 반감기를 나타내는 그래프이다.
도 9는 마우스 GvHD 모델에서 항체 사이토카인 생착된 단백질 분자에 대한 실험 데이터를 보여준다. 이는 이 모델에서 항체 사이토카인 생착된 단백질에 의한 치료가 CD4+/CD8+ Teff 세포 또는 NK 세포에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않으면서, Proleukin®보다 Treg를 더 잘 확장한다는 것을 보여준다.
도 10은 GvHD 마우스 모델에서, Proleukin® 치료와 관련된 체중 감량에 대한 실험 데이터를 도시한 반면, IgG.IL2D49.H1의 투여와 관련된 체중 감량은 거의 없다.
도 11은 당뇨병 전(NOD) 마우스 모델에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질을 Proleukin®과 비교하는 실험 데이터를 보여주며, IgG.IL2D49A.H1이 이 모델에서 제1형 당뇨병을 예방한다는 것을 입증한다.
도 12는 당뇨병 전 NOD 마우스 모델에서, Treg의 비율을 CD8 T 효과기 세포와 비교하는 실험 데이터를 보여준다.
도 13a는 1.3 mg/kg 용량으로 NOD 마우스 모델에서 IgG.IL2D49A.H1의 약동학에 대한 실험 데이터를 보여준다. 도 13b는 0.43 mg/kg 용량으로 NOD 마우스 모델에서 IgG.IL2D49A.H1의 약동학에 대한 실험 데이터를 보여준다.
도 14는 당뇨병 전 NOD 마우스 모델에 사용된 용량 범위의 표이며, 등몰량의 Proleukin®을 비교한다.
도 15a는 백반증 특허로부터 취하여 시험관내에서 IgG.IL2D49.H1에 의해 치료되고 Proleukin®과 비교된 인간 PBMC에서의 pSTAT5 활성화의 양을 도시하는 일련의 그래프를 보여준다. 도 15b는 제1형 당뇨병 특허로부터 취하여 시험관내에서 IgG.IL2D49.H1 및 Proleukin®에 의해 치료된 인간 PBMC에서의 pSTAT5 활성화의 양을 도시하는 일련의 그래프를 보여준다.
도 16은 IL2이 항-RSV 항체의 CDRH1에 생착될때, RSV 결합이 유지됨을 나타내는 ELISA 데이터의 그래프를 보여준다. 그러나, IL2가 CDRL3에 생착될 때 RSV에 대한 결합이 감소된다. IL2가 다른 항체 백본(Xolair)에 생착될 때 RSV에 대한 결합은 없다.
도 17은 단일 용량의 IgG.IL2D49A.H1 후 사이노몰구스 원숭이에서의 Treg 확장에 대한 실험 데이터를 보여준다.
도 18은 GFTX3b_IL-2-H1-D49A의 선택적 활성에 대한 증가된 농도의 가교제 항-인간 IgG 항체의 효과에 대한 실험 데이터를 보여준다.
도 19는 GFTX3b_IL-2-H1-D49A를 갖는 상이한 자가면역 환자 PBMC에서의 선택적 신호전달에 대한 실험 데이터를 보여준다.
도 20은 인간 PBMC에서 T 효과기 세포에 걸쳐 Treg에서의 신호전달을 위해 Proleukin보다 높은 선택성을 갖는 GFTX3b_IL-2-H1-D49A에 대한 실험 데이터를 보여준다.
IL2 고친화성 수용체를 표적으로 하는 항체 사이토카인 생착된 단백질
항체의 상보성 결정 영역(CDR)으로 생착된 IL2를 포함하는 단백질 작제물이 본원에 제공된다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 환자에서 사용하기에 적합한 특성을 나타내며, 예를 들어 천연 또는 재조합 인간 IL2와 유사한 면역자극 활성을 보유한다. 그러나, 부정적인 영향, 예를 들어 NK 세포의 자극이 감소된다. 다른 활성 및 특성도 명세서 전체에 걸쳐 설명되어 있다. 따라서, 이전에 공지된 IL2 및 변형된 IL2 치료제, 예컨대 Proleukin®에 비해 개선된 치료 프로파일을 갖는 항체 사이토카인 생착된 단백질, 및 치료법에 있어서 제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질의 사용 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명은 선택적 활성 프로파일을 갖는 IL2 고친화성 수용체의 작용제인, 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 면역글로불린 중쇄 서열 및 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질이 제공된다. 각각의 면역글로불린 중쇄 서열은 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2, 및 CH3 불변 영역으로 구성된다. 각각의 면역글로불린 경쇄 서열은 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 각각의 항체 사이토카인 생착된 단백질에서 IL2 분자는 항체의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)에 통합된다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 중쇄 CDR에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1)에 통합된다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2)에 통합된다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)에 통합된다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 경쇄 CDR에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1)에 통합된다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2)에 통합된다. 특정 실시형태에서, IL2 분자는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)에 통합된다.
일부 실시형태에서, 생착된 항체 사이토카인은 CDR에 통합된 IL2 분자를 포함하고, 이에 의해 IL2 서열은 CDR 서열에 삽입된다. 삽입은 CDR의 N-말단 영역에 또는 근처에, 또는 CDR의 중간 영역에, 또는 CDR의 C-말단 영역에 또는 근처에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 생착된 항체 사이토카인은 CDR에 통합된 IL2 서열을 포함하고, 이에 의해 IL2 서열은 CDR 서열의 전부 또는 일부를 대체한다. 대체는 CDR의 N-말단 영역에, 또는 CDR의 중간 영역에, 또는 CDR의 C-말단 영역에 또는 근처에 있을 수 있다. 대체는 CDR 서열의 1 또는 2개의 아미노산, 또는 전체 CDR 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, IL2 분자는 펩타이드 링커없이 CDR에 직접 생착되며, CDR 서열과 IL2 서열 사이에 추가 아미노산이 없다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG 부류 항체 중쇄의 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, IgG 중쇄는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 서브클래스 중 임의의 하나이다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 공지된 임상적으로 이용된 면역글로불린 서열로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간화된 서열인 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 서열인 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 생식계열 면역글로불린 서열로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IL2 분자의 결합 특이성과는 구별되는 표적에 대한 면역글로불린 가변 도메인의 결합 특이성을 갖는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 가변 도메인의 그의 표적에 대한 결합 특이성은 생착된 사이토카인의 존재하에 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 보유된다. 특정 실시형태에서, 보유된 결합 특이성은 비-인간 표적에 대한 것이다. 특정 실시형태에서, 보유된 결합 특이성은 바이러스, 예를 들어, RSV에 대한 것이다. 다른 실시형태에서, 결합 특이성은 IL2 요법과 함께 치료적 유용성을 갖는 인간 표적에 대한 것이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린의 결합 특이성을 표적으로 하는 것은 IL2 성분에 추가적인 치료적 이점을 전달한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린의 그의 표적에 대한 결합 특이성은 IL2와의 상승 작용을 전달한다.
또 다른 실시형태에서, 면역글로불린의 그의 표적에 대한 결합 특이성은 IL2 분자의 생착에 의해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 감소된다.
제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 서열은 서열 번호:4의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:4의 서열로 구성된다. 제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 서열은 서열 번호:4의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:4의 서열로 구성된다.
제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 서열은 서열 번호:6의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:6의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:6의 서열로 구성된다. 제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)에 통합된 IL2 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 서열은 서열 번호:6의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:6의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL2 분자는 서열 번호:6의 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 생착된 항체 사이토카인은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®에 대하여 우수한 항-염증 특성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교되는 바와 같이, 감소된 비례적 염증 유발 활성을 제공하면서 Treg 세포에 대해 증가된 활성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 고친화성 IL2 수용체®의 우선적인 자극을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Teff 세포, Tcon 세포, 및/또는 NK 세포에 비해 Treg 세포의 우선적인 활성화를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Teff 세포, Tcon 세포, 및/또는 NK 세포에 비해 Treg 세포의 우선적인 확장을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 CD8 T 효과기 세포 또는 NK 세포의 확장없이, Treg 세포의 증가된 확장을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상인 Treg 세포:NK 세포의 확장 비율을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상인 Treg 세포:CD8 T 효과기 세포의 확장 비율을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상인 Treg 세포:CD4 Tcon 세포의 확장 비율을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여 CD4 Tcon 세포에서 감소된 IL-2R 신호전달 효능을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여 CD8 Teff 세포에서 감소된 IL-2R 신호전달 효능을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여 NK 세포에서 감소된 IL-2R 신호전달 효능을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®보다 약 1,000배, 약 2,000배, 약 3,000배, 약 4,000배, 약 5,000배, 약 6,000배, 약 7,000배, 약 8,000배, 약 9,000배, 약 10,000배 이상인 CD4 T 효과기 세포에 대한 Treg 세포의 특이적 활성화를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®보다 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 약 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 약 1,000배 이상인 CD8 T 효과기 세포에 대한 Treg 세포의 특이적 활성화를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®보다 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 약 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 약 1,000배 이상인 CD8 T 효과기/기억 세포에 대한 Treg 세포의 특이적 활성화를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여, 호산구증가증 확장과 같은 독성 감소를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여 증가된 반감기, 예컨대 4시간 초과, 6시간 초과, 8시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여, 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 환자에서와 같이 감소된 체중 감소를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인간 IL2, 재조합 인간 IL2 또는 Proleukin®과 비교하여, 제1형 당뇨병 발생에 대해 보다 우수한 보호를 제공한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 변형된 효과기 기능을 부여하는 변형된 Fc를 갖는 변형된 면역글로불린 IgG를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형된 Fc 영역은 D265A, P329A, P329G, N297A, L234A, 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄는 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 (i) 서열 번호:20의 중쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열 번호:33의 경쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 면역글로불린 사슬은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택된 IgG 부류이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린은 선택적으로 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 (i) 서열 번호:46의 중쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열 번호:58의 경쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 면역글로불린 사슬은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택된 IgG 부류이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린은 선택적으로 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 (i) 서열 번호:71의 중쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열 번호:84의 경쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 면역글로불린 사슬은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택된 IgG 부류이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린은 선택적으로 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 (i) 서열 번호:97의 중쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열 번호:110의 경쇄 가변 영역에 대하여 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 면역글로불린 사슬은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택된 IgG 부류이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린은 선택적으로 임의의 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A로부터 선택되는 감소된 효과기 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다.
조작된 및 변형된 항체 사이토카인 생착된 단백질
특정 양태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 면역글로불린 스캐폴드의 CDR 영역으로 IL2 서열을 생착함으로써 생성된다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬은 둘다 최종 항체 생착된 단백질을 생성하기 위해 생산된다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Treg 세포에서 바람직한 치료 활성을 제공하지만, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 또는 재조합 인간 IL2(rhIL2 또는 Proleukin®)와 비교하여 염증 유발 활성을 감소시켰다.
항체 사이토카인 생착된 단백질을 조작하기 위해, 특정 뮤테인을 함유하는 IL2 서열(서열 번호:4 또는 서열 번호:6)이 면역글로불린 사슬 스캐폴드 단백질의 CDR 루프에 삽입된다. 생착된 작제물은 임상 환경에서 이용된 임의의 다양한 공지된 면역글로불린 서열, 현재 발견 및/또는 임상 개발 중에 있는 공지된 면역글로불린 서열, 인간 생식계열 항체 서열 및 신규한 항체 면역글로불린 사슬의 서열을 사용하여 제조될 수 있다. 관련 서열을 암호화하는 재조합 DNA를 사용하여 표준 분자 생물학 방법론을 사용하여 작제물을 제조한다. GFTX3b로 지칭되는 예시적인 스캐폴드에서의 IL2의 서열은 표 2에 도시되어 있다. 삽입 지점은 이용가능한 구조적 또는 상동성 모델 데이터에 기초하여 루프의 중간-지점이 되도록 선택되었지만, 삽입 지점은 CDR 루프의 N 또는 C-말단 쪽으로 조정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 이종 항체 단백질 또는 폴리펩타이드에 재조합적으로 삽입된 IL2 단백질을 포함하는 고친화성 IL2 수용체에 특이적으로 결합하여 항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성하는, 항체 사이토킨 생착된 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 또는 임의의 다른 관련 스캐폴드 항체 폴리펩타이드(예를 들어, 완전 항체 면역글로불린 단백질, Fab 단편, Fc 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인, VL CDR, 등) 및 이종성 사이토카인 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드, 예를 들어, IL2를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,336,603호, 제5,622,929호, 제5,359,046호, 제5,349,053호, 제5,447,851호 및 제5,112,946호; 유럽 특허 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 WO 96/04388 및 WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341을 참조한다. 또한, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(통합해서 "DNA 셔플링"으로 지칭됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제조하고/하거나 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 친화도가 높고 분리율이 낮은 항체 또는 이의 단편)의 활성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313을 참조한다(이들 특허 및 공개는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 항체 및 이의 단편, 또는 암호화된 항체 및 이의 단편은 재조합 이전에, 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이생성 처리됨으로써 변경될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 제조를 위해, 관심 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종성 사이토카인 분자, 예를 들어 IL2의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
항체 Fab는 사이토카인 단백질에 대한 잠재적인 삽입 부위로서 작용할 수 있는 6개의 CDR 루프를, 경쇄내에 3개(CDRL1, CDRL2, CDRL3) 및 중쇄내에 3개(CDRH1, CDRH2, CDRH3) 함유한다. 어느 CDR 루프(들)이 사이토카인에 삽입할지 결정하기 위해, 구조적 및 기능적 고려사항들이 고려된다. CDR 루프 크기 및 입체형태는 상이한 항체에 따라 크게 다르므로, 삽입을 위한 최적 CDR은 각각의 특정 항체/단백질 조합에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 또한, 사이토카인 단백질은 CDR 루프에 삽입될 것이므로, 사이토카인 단백질의 구조에 추가적인 제약을 가할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 단백질의 아미노 및 카르복시 말단은 공간에서 비교적 가깝게 (~25 Å) 제한될 수 있어야 한다. 또한, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 생물학적 활성을 위해 올리고머화에 의존해서는 안된다. 이용가능한 단백질 데이터베이스 구조의 분석은 IL2를 포함한 많은 사이토카인 단백질이 이 범주에 속함을 나타낸다.
면역글로불린 사슬의 CDR은 본원에 기재된 것들을 포함하여 당 업계에 공지된 잘 알려진 넘버링 시스템에 의해 결정된다. 예를 들어, CDR은 (1) Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), NIH publication No. 91-3242에 기재된 넘버링 시스템; 및 (2) Chothia 넘버링 시스템(Al-Lazikani et al., (1997) "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," J.Mol.Biol. 273:927-948 참조)을 사용하여, 식별 및 정의되어왔다. 20개 미만의 아미노산 길이의 확인된 CDR 아미노산 서열의 경우, 원하는 특이적 결합 및/또는 작용제 활성을 여전히 유지하면서 1개 또는 2개의 보존적 아미노산 잔기 치환이 허용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 항체는 변형된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 조작하기 위한 시작 물질로서 본원(예를 들어, 표 2)에 제시된 하나 이상의 CDR 및/또는 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 시작 항체 생착된 단백질로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 대안적으로, 임의의 공지된 항체 서열은 변형된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 조작하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 공지된 임상적으로 이용되는 항체는 항체 생착된 단백질의 제조를 위한 시작 물질 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 공지된 항체 및 상응하는 면역글로불린 서열은 예를 들어 팔리비주맙, 알리로쿠맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 디누툭시맙, 세쿠키누맙, 에볼로쿠맙, 블리나투모맙, 펨브롤리주맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 실툭시맙, 오블리누투주맙, 트라스투주맙, 락시바쿠맙, 퍼투주맙, 벨리무맙, 이필리무맙, 데노수맙, 토실리주맙, 오파투무맙, 카나키누맙, 골리무맙, 우스테키누맙, 세르톨리주맙, 카투막소맙, 에쿨리주맙, 라니비주맙, 파니투무맙, 나탈리주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 에팔리주맙, 오말리주맙, 토시투모맙, 이브리투모맙, 티욱세탄, 아달리무맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙, 다클리주맙, 리툭시맙, 아브식시맙, 무로모납 또는 이들의 변형들을 포함한다. 공지된 항체 및 면역글로불린 서열은 또한, 생식계열 항체 서열을 포함한다. 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식 계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스뿐만 아니라 Kabat, E. A., et al., 1991 sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예에서, 초기 발견 및/또는 약물 개발에 있을 수 있는 다른 공지된 개체로부터의 항체 및 상응하는 면역글로불린 서열은 변형된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 조작하기 위한 시작 물질과 유사하게 조정될 수 있다.
광범위하게 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는, 생성된 폴리펩타이드가 사이토카인(예를 들어, IL2)의 혼입을 수용하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 이디오타입(idiotype)의 인간 면역글로불린, 또는 이의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화된 및/또는 인간 양태를 갖는, 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 신규 항체, 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 당업자에 의해 계속해서 발견 및 개발된다.
항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 단클론성 항체의 제조를 위해, 당업계에 공지된 임의의 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985 참조). 단일 사슬 항체의 생산 기술(미국 특허 번호 제4,946,778호)은 항체 사이토카인 생착된 단백질에 사용하기 위한 항체를 생성하도록 조정될 수 있다. 또한, 형질전환 마우스 또는 다른 포유동물과 같은 다른 유기체를 사용하여 영장류화 또는 인간화 또는 인간 항체를 발현 및 동정할 수 있다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술은 항체 사이토카인 생착된 단백질에 사용하기 위해 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이종 Fab 단편을 동정하는데 사용될 수 있다(예를 들어, McCafferty et al., 위 참조; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992) 참조).
비-인간 항체를 영장류화 또는 인간화하는 방법은 당 업계에 잘 알려져있다. 일반적으로, 영장류화 또는 인간화 항체는 비-영장류 또는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-영장류 또는 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로 지칭되며, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 Winter 및 동료의 방법에 따라 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조). 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이며, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 영장류화 또는 인간화 항체는 전형적으로 일부 상보성 결정 영역("CDR") 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크("FR") 잔기가 결합 특이성을 부여하기 위해, 기원 종(예를 들어, 설치류 항체)의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 영장류 또는 인간 항체이다.
대안적으로 또는 추가로, 비인간 항체의 결합 특징과 비례하여 동일한 결합 특징을 유지하거나 더 양호한 결합 특징을 제공하면서도, 항체 내의 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하기 위한 생체내 방법은 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20050008625, 미국 특허 공개 번호 2005/0255552를 참고한다. 대안적으로, 인간 V 세그먼트 라이브러리는 참조 항체 V 세그먼트의 일부만이 처음에 인간 서열의 라이브러리로 대체되는 순차적 카세트 대체에 의해 생성될 수 있으며; 잔류 기준 항체 아미노산 서열의 맥락에서 결합을 지지하는 동정된 인간 "카세트"는 제 2 라이브러리 스크린에서 재조합되어 완전한 인간 V 세그먼트를 생성한다(미국 특허 공개 번호 2006/0134098 참조).
항체 사이토카인 생착된 단백질의 제조에 사용하기 위한 다양한 항체 또는 항원-결합 단편은 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 변형에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 방법론(예를 들어, 단일 사슬 Fv)을 사용하여 합성될 수 있거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 동정될 수 있다(예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990 참조). 예를 들어, 미니바디는 당 업계에 기술된 방법, 예를 들어, Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 생착 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)를 참조한다. 단일 사슬 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리, 유전자 셔플 라이브러리를 사용하여 동정될 수 있다. 이러한 라이브러리는 합성, 반합성 또는 천연 및 면역적격 공급원으로부터 구축될 수 있다. 따라서, 선택된 면역글로불린 서열은 본원에 제공된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질 작제물의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체, 항원-결합 분자 또는 항체 사이토카인 생착된 분자는 이중특이적 항체를 추가로 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 다른 항원-결합 단편 또는 항체 부분은 2가 scFv(디아바디), 항체 분자가 2개의 상이한 에피토프를 인식하는 이중특이성 scFv 항체, 단일 결합 도메인(dAb) 및 미니바디를 포함한다. 따라서, 선택된 면역글로불린 서열은 본원에 제공된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질 작제물의 제조에 사용될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, Fab 단편, scFv는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 작제하기 위한 빌딩 블록으로서 사용될 수 있으며, 선택적으로 다가 포맷을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 다가 분자는 항체의 불변 영역(예를 들어, Fc)을 포함한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체의 하나 또는 둘 모두의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내에서, 및 사이토카인 생착 또는 사이토카인 생착의 제조에 사용되는 상기 적응된 VH 및/또는VL 영역 서열에서 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유에서, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체들 사이에서 CDR 외부의 서열보다 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하며, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 생착된 특이적 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예를 들어, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; Winter의 미국 특허 제5,225,539호 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조). 소정의 경우, 항체의 항원 결합 능력을 유지시키거나 증강시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이화하는 것이 유익하다(예컨대 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
일부 양태에서, VH 및/또는 VL CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기의 돌연변이에 의해, "친화도 성숙”으로 알려진 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성들(예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이 예를 들어, 사이토카인 생착된 단백질과 관련하여 항체의 항원 결합을 최적화하는데 유익할 수 있다. 부위-특이적 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합 또는 다른 관심 기능적 특성에 미치는 효과는 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 검정법 및/또는 당 업계에 공지된 대안적 또는 추가 검정법에서 평가될 수 있다. 보존적인 변형들이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
조작된 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 항체의 특성을 향상시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 저하하기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식선 서열로 변경시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 수행한 항체는, 항체가 유래된 생식선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식선 서열과 비교함으로써 식별될 수 있다. 프레임워크 영역 서열들을 이들의 생식선 배치로 복귀시키기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 생식선 서열로 "복귀돌연변이화될" 수 있다. 추가의 프레임워크 변형은, 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이화시켜, T 세포 에피토프를 제거하여, 이로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 단계를 수반한다. 이러한 접근법은 또한, "탈면역화"로 지칭되고, Carr 등의 미국 특허 공개 20030153043에 더 상세히 기재되어 있다.
항체 사이토카인 생착된 단백질의 제조에 사용되는 항체 또는 항체 단편의 불변 영역은 적절하게 임의의 유형 또는 하위유형일 수 있고, 본 방법에 의해 치료될 대상체의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물, 예를 들어 농업용 포유동물(예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타), 가정용 포유동물(예를 들어, 개, 고양이) 또는 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질에 사용되는 항체는 인간화된 또는 Humaneered® 항체를 생성시키기 위해 조작된다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질에 사용되는 항체는 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 불변 영역 아이소타입은 IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4이다. 특정 실시형태에서, 불변 영역 아이소타입은 IgG1이다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG1 Fc를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IgG2 Fc를 포함한다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도 또는 대안적으로, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 제조에 이용되는 항체 또는 항체 단편은 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 나아가, 다시 항체 사이토카인 생착된 단백질의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위하여, 항체, 항체 단편, 또는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 화학적으로 변형할 수 있거나(예를 들어, 1종 이상의 화학적 모이어티를 항체에 부착할 수 있음), 이의 글리코실화가 변경되도록 변형할 수 있다.
일 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 저하되도록 변형된다. 예를 들어, 이 접근법은 Bodmer 등의 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기재되어 있으며, 여기서 CH1의 힌지 영역내 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체 사이토카인 생착된 단백질의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 또 다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생물학적 반감기를 변경하도록 돌연변이화된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체 사이토카인 생착된 단백질이 본래의 Fc-힌지 도메인 SpA와 비례하여 저하된 스타필로콕킬(Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 중간면(interface) 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 Ward 등의 미국 특허 제6,165,745호에 더 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 생체내에서 연장된 반감기를 갖는, IL2 고친화성 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 항체 사이토카인 생착된 단백질은 또한, 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인 또는 이의 FcRn 결합 단편(바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편) 내로 도입하여 발생될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같이, T252L, T254S, T256F. 예를 들어, 국제 공개 WO 98/23289; 국제 공개 WO 97/34631; 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조한다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체 사이토카인 생착된 단백질은, Presta 등의 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프들로부터 취해진 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 효과기 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체 사이토카인 생착된 단백질이 효과기 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 효과기 리간드는 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체 사이토카인 생착된 단백질이 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 Idusogie 등의 미국 특허 제6,194,551호에 더 상세히 기재되어 있다.
상기 돌연변이를 함유하는 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체-의존적 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 감소시키거나 전혀 매개하지 않는다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 Ala234 및 Ala235로 치환된다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 N267은 Ala267로 치환된다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어, 항체 사이토카인 생착된 단백질이 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 더 상세히 기재되어 있다.
보다 다른 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체 사이토카인 생착된 단백질의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 Presta의 PCT 공개 WO 00/42072에 더 상세히 기재되어 있다. 게다가, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1의 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다(Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604 참고).
또 다른 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체 사이토카인 생착된 단백질이 제조될 수 있다(즉, 항체 사이토카인 생착된 단백질에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여, 이로써 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 더 상세히 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체 사이토카인 생착된 단백질, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화된(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분면(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 항체 의존성 세포독성(ADCC) 능력을 증가시키는 것으로 언급되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 사이토카인 생착된 단백질을 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 숙주 세포 내에 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 세포는, 당업계에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체 사이토카인 생착된 단백질을 발현시켜 이로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 방해된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 이러한 세포주에서 발현된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 하이포푸코실화를 나타낸다. Presta의 PCT 공개 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 하이포푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고 있다(또한 Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참고). Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예컨대 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 조작된 세포주에서 발현된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 증가된 이등분면 GlcNac 구조를 나타내며 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래한다(또한 Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180 참고).
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 하나 이상의 도메인 또는 영역은 링커, 예를 들어 당 업계에 널리 공지된 것과 같은 펩타이드 링커를 통해 연결된다(예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, RJ., et al. (1994) Structure 2:1121-1123 참고). 펩타이드 링커는 길이가 다양할 수 있으며, 예를 들어, 링커는 1 내지 100개의 아미노산 길이일 수 있고, 전형적으로 링커는 5 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 아미노산 길이이다.
일부 실시형태에서, IL2는 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커 서열과 함께 CDR 서열에 생착된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 펩타이드 링커는 독립적으로 (Glyn-Ser)m 서열(서열 번호:115), (Glyn-Ala)m 서열(서열 번호:116), 또는 (Glyn-Ser)m/(Glyn-Ala)m 서열(각각 서열 번호:115 및 116)의 임의의 조합으로부터 선택되며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 5의 정수이며, 각각의 m은 0 내지 10의 정수이다. 링커의 예는 글리신-기반 링커 또는 gly/ser 링커 G/S 예컨대 (GmS)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10과 동일한 양의 정수이고, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10과 동일한 정수임)(서열 번호:117)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 G4S 반복(서열 번호:118), 예를 들어, Gly-Ser 링커(G4S)n(여기서, n은 1 이상의 양의 정수임)(서열 번호:118)를 포함한다. 예를 들어 n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 일부 실시형태에서, Ser는 Ala 예를 들어, 링커 G/A, 예컨대 (GmA)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10과 동일한 양의 정수이고, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10과 동일한 정수임)(서열 번호:119)로 대체될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 G4A 반복(서열 번호:120), (G4A)n(여기서, n은 1 이상의 양의 정수임)(서열 번호:120)을 포함한다. 예를 들어 n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 일부 실시형태에서, 링커는 링커의 다중 반복을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 G4S(서열 번호:118) 및 G4A(서열 번호:120)의 조합 및 배수를 포함한다.
링커의 다른 예는 링커 및 접합부로부터 발생하는 면역원성을 최소화하기 위해 항체에서 자연적으로 발생하는 가요성 링커 서열에 기초한 것을 포함한다. 예를 들어, 항체 분자 구조에서 가변 도메인과 CH1 불변 도메인 사이에 자연적인 유연한 연결이 존재한다. 이러한 자연적 결합은 V 도메인의 C-말단으로부터의 4~6개 잔기 및 CH1 도메인의 N-말단으로부터의 4~6개 잔기에 의해 기여되는 대략 10~12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 예를 들어, 링커로서 CH1의 말단 5~6개 아미노산 잔기 또는 11~12개 아미노산 잔기를 포함하는 링커를 사용할 수 있다. CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 첫 번째 5~6개 아미노산 잔기는 강한 이차 구조없이 루프 형태를 채택하고, 따라서 유연한 링커로서 작용할 수 있다. CH1 도메인의 N-말단 잔기는 가변 도메인이 Ig 서열의 일부이기 때문에 가변 도메인의 자연적인 연장이며, 따라서 링커 및 접합부로부터 잠재적으로 발생하는 임의의 면역원성을 광범위하게 최소화시킨다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 힌지 서열에 기초한 변형된 펩타이드 서열을 포함한다.
또한, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드(서열 번호:121), 예컨대 특히 pQE 벡터에 제공된 태그(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)이며, 이들 중 많은 것들이 상업적으로 입수 가능하다. Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘(서열 번호:121)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는, 인플루엔자 혈구 응집소 바이러스 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구 응집소 바이러스("HA"; 헤마글루티닌) 태그(문헌[Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "플래그(flag)" 태그를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
항체는 또한, 표적 항원의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
항체 사이토카인 생착된 단백질 활성에 대한 분석
항체 사이토카인 생착된 단백질을 확인하기 위한 분석법은 당 업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IL2 고친화성 수용체에 결합하고, 세포내 신호전달을 촉진, 유도, 자극하여 Treg 효과 및 면역자극 효과를 초래한다.
IL2 고친화성 수용체에 대한 항체 사이토카인 생착된 단백질의 결합은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, IL2 고친화성 수용체에 대한 결합은 ELISA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIAcore), 및 유세포 분석을 포함하는 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
IL2 고친화성 수용체를 통한 세포 내 신호전달은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, IL2를 통한 활성화는 STAT5 활성화 및 신호전달을 촉진한다. STAT5 활성화를 측정하는 방법은 당 업계에서 표준이다(예를 들어, STAT5 단백질의 인산화 상태, 리포터 유전자 분석, 하류 신호전달 분석 등). IL2 고친화성 수용체를 통한 활성화는 Treg 효과를 증가시켰다. 또한, IL2 저친화성 수용체의 감소된 결합은 자연 살해(NK) 세포 및 CD 8 T 효과기 세포 증식을 감소시킨다. 세포의 증식을 측정하는 방법은 관련 기술 분야에서 표준이다(예를 들어, 3H-티미딘 통합 분석, CFSE 라벨링). 사이토카인 생성을 측정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져있다(예를 들어, ELISA 분석법, ELISpot 분석법). 시험관내 분석을 수행할 때, 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질과 접촉된 시험 세포로부터의 시험 세포 또는 배양 상청액은 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질과 접촉되지 않은 대조군 세포로부터의 대조군 세포 또는 배양 상청액 및/또는 재조합 인간 IL2와 접촉한 대조군 세포로부터의 대조군 세포 또는 배양 상청액과 비교될 수 있다 (예를 들어, Proleukin®).
항체 사이토카인 생착된 단백질의 활성은 또한, 생체외 및/또는 생체내에서 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 처리되지 않은 대조군 동물 및/또는 Proleukin®으로 유사하게 처리된 동물과 비교하여 항체 사이토카인 생착된 단백질로 처리된 동물로부터 생체 외에서 다양한 세포 유형에 걸친 STAT5 활성화를 측정하는 방법은 세포 유형에 걸친 작용제 항체 생착된 단백질의 차별적 활성을 나타내는데 사용될 수 있다. 바람직한 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Treg 세포를 활성화 및 확장시키는 능력을 갖는다. 예를 들어, Treg 세포의 생체내 활성화 및 확장은 당 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질은 면역 관련 장애, 예를 들어: 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군을 예방, 감소, 억제 또는 제거에 치료적으로 유용할 수 있다. 제1형 당뇨병 및 SLE에서 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질의 효능은 치료적 유효량의 항체 사이토카인 생착된 단백질을 대상체에게 투여하고, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 투여 전 및 후에 대상체를 비교함으로써 결정될 수 있다. 제1형 당뇨병 및 SLE에 대한 요법에서 작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질의 효능은 또한 치료적 유효량의 항체 사이토카인 생착된 단백질을 시험 대상체에게 투여하고, 시험 대상체를 투여되지 않은 대조군 대상체 및/또는 Proleukin®으로 유사하게 처리된 대상체와 비교함으로써 결정될 수 있다.
작용제 항체 사이토카인 생착된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
또 다른 양태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 재조합 발현, 화학적 합성 및 항체 사량체의 효소적 소화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 재조합 발현은 당해 분야에 공지된 임의의 적당한 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 일어날 수 있다.
서열 번호:21, 서열 번호:34, 서열 번호:47, 서열 번호:60, 서열 번호:73, 서열 번호:86, 서열 번호:99, 및 서열 번호:112 중 어느 하나에 예시된 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 사이토카인 생착된 단백질의 경쇄 및/또는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 본원에 기재된 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 세그먼트를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 양태에서, 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 21, 서열 번호:47, 서열 번호:73 및 서열 번호:99로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 34, 서열 번호:60, 서열 번호:86 및 서열 번호:112로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:23의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:36의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:49의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:62의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:75의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:88의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:101의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:114의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
폴리뉴클레오타이드는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 가변 영역 서열만을 암호화할 수 있다. 이들은 또한, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 가변 영역 및 불변 영역 둘다를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부는 항체 사이토카인 생착된 단백질 중 하나의 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 영역들을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드는 항체 단백질 생착물 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩타이드 세그먼트를 암호화한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA를 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 RNA를 포함하며, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 하나 이상의 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 핵산, 및 선택적으로 분비 신호를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 하나의 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 벡터 및 분비 신호를 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 2개의 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 하나 이상의 벡터 및 분비 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 2개의 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 단일 벡터 및 분비 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2개의 벡터, 즉 각각 분비 신호를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 중쇄 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 한 벡터 및 항체 사이토카인 생착된 단백질의 경쇄 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 또 다른 벡터를 포함한다. 재조합 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포주이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포주이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포주는 항체 생산을 위한 CHO 세포주이다.
항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) 항체 사이토카인 생착된 단백질의 발현, 형성 및 분비에 적합한 조건 하에서 항체 사이토카인 생착된 단백질의 면역글로불린 단백질 사슬을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 항체 사이토카인 생착된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 기존의 서열(예를 들어, 본원에 기재된 서열)의 드 노보(de novo) 고체-상(phase) DNA 합성 또는 PCR 돌연변이생성에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979의 포스포트리에스테르 방법; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979의 포스포디에스테르 방법; Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992]; [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
상기 기재된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 또한 제공된다. 항체 사이토카인 생착된 단백질의 면역글로불린 폴리펩타이드 사슬 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터와 비 바이러스 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에서 면역글로불린 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트와 함께 플라스미드, 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체를 포함한다(예를 들어, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997 참고). 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 항체 사이토카인 생착된 단백질 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현에 유용한 비 바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C(Invitrogen, 미국 캘리포니아 주 샌디에고 소재), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현을 위한, 당해 분야에 공지된 다수의 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 한 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스를 기반으로 한 벡터, 우두 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스(SFV)를 포함한다. 상기 Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; and Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992를 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터, 및 항체 사이토카인 생착된 단백질의 면역글로불린 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터가 유도 조건 하인 경우를 제외하고는 삽입된 서열의 발현을 방지하도록 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 허용되는 암호화 서열에 대해 집단을 편향시키지 않으면서, 형질전환된 유기체의 배양물을 비 유도 조건 하에 증식시킬 수 있다. 프로모터 이외에, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 면역글로불린 사슬 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 요구될 수 있거나 바람직할 수 있다. 이러한 요소들은 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 사용되는 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함하는 것에 의해 발현 효율을 증진시킬 수 있다(예를 들어, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 세포 밖으로 그리고 배양 배지로 배출되는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 삽입된 면역글로불린 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결된다. 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 수령하는 데 사용되는 벡터는 이따금 또한, 불변 영역 또는 이의 일부를 암호화한다. 이러한 벡터는 가변 영역이 불변 영역과의 생착된 단백질로서 발현되게 하고, 이에 의해 온전한 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 이의 단편을 생산할 수 있게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간이다.
항체 사이토카인 생착된 단백질 사슬을 보유하고 발현하기 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 대장균(E. coli)은 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및 발현에 유용한 원핵생물 숙주 중 하나이다. 사용하기에 적절한 기타 미생물 숙주는 바실루스(bacillus), 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 기타 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵생물 숙주에서, 숙주 세포와 상용할 수 있는 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 전형적으로 함유하는 발현 벡터 또한, 제조할 수 있다. 또한, 다수의 다양한 주지된 프로모터, 예컨대 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어하고, 전사 및 번역 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가지고 있다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한, 항체 사이토카인 생착된 단백질 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 또한, 곤충 세포가 배큘로바이러스 벡터와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 포유동물 숙주 세포는 항체 사이토카인 생착된 단백질 폴리펩타이드를 발현하고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이들은 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸성 동물 또는 인간 세포 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸성 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하는, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩타이드 발현을 위하여 포유동물 조직 세포 배양을 사용하는 것이, 에를 들어, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987에 일반적으로 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터들은 보통 포유동물 유전자로부터 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정 가능 또는 조절 가능한 프로모터일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당해 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염은 원핵 세포에 보편적으로 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공은 다른 세포성 숙주에 사용될 수 있다(일반적으로 상기 Sambrook 등 참조). 기타 방법은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 탄도 방법, 비로솜(virosome), 이뮤노리포솜(immunoliposome), 다가 양이온:핵산 접합체, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 생착(Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), 작용제에 의해 강화된 DNA 흡수, 및 생체 외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위하여, 안정적인 발현이 종종 바람직할 것이다. 예를 들어, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별 가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 항체 사이토카인 생착된 단백질 면역글로불린 사슬을 안정적으로 발현하는 세포주를 제조할 수 있다. 벡터 도입 후, 선별 배지로 전환되기 전에 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있다. 선별 가능한 마커의 목적은 선별에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선별 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 저항성 세포를 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 조성물
약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 선택적으로, 약제학적 조성물은 주어진 장애를 치료 또는 예방하는데 적합한 다른 치료제를 추가로 함유한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 증강시키거나 안정화시키거나, 조성물의 제조를 용이하게 한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 생리학적으로 화합성인 용매, 분산 배지, 코팅제, 항박테리아 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함한다.
약제학적 조성물은 당업계에 공지된 여러 가지 방법들에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 요망되는 결과에 따라 다르다. 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 척수강내, 동맥내 또는 피하 중 임의의 것으로부터 선택됨)에 의한 투여 또는 표적 부위에 근접하여 투여되는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 정맥내, 근육내, 복강내, 척수강내, 동맥내, 피하, 비강내, 흡입, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 생착) 중 임의의 하나 이상에 의한 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 예를 들어, 항체 사이토카인 생착된 단백질은, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 이러한 화합물을 보호하기 위해 물질 내에서 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 피하 투여를 위해 제형화된다.
단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 흡입을 통해 투여되도록 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다(즉, "분무화될 수 있다"). 에어로졸 제형은 가압되는 허용가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 및 유체이다. 적절한 유체성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 소듐 클로라이드를 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 유발될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적절한 부형제(예를 들어, 수크로스)를 사용하여 동결건조된 형태로 저장하기 위해 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 당업계에 잘 공지되고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제형화하고 적절한 용량화 및 스케쥴링을 결정하는 적용가능한 방법은, 예를 들어, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005); and in Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., and in Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 약제학적 조성물은 바람직하게는, GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, 치료적 유효량 또는 유효량의 항체 사이토카인 생착된 단백질이 약제학적 조성물에 사용된다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약제학적으로 허용가능한 투여량 형태로 제형화된다. 투여량 양생법은 요망되는 반응(예컨대 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 치료적 또는 예방적 유효 용량을 결정함에 있어서, 바람직하지 않은 부작용을 최소화하거나 없는, 원하는 반응이 달성될 때까지 저용량을 투여한 다음 점진적으로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 여러 번 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태 내에서 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이 투여 단위 형태는, 치료되는 대상체에 대한 유니타리(unitary) 투여량으로서 맞춰진 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하는 것으로 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양해질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 특정 조성물 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 이용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 질환, 일반적인 건강 상태 및 과거 병력 및 유사한 인자들을 포함하여 여러 가지 약물동력학적 인자들에 따라 다르다.
제2 제제와의 공동-제형화
일부 실시형태에서, 약리학적 조성물은 항체 사이토카인 생착된 단백질과 하나 이상의 추가 약리학적 제제(들)의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 항체 사이토카인 생착된 단백질과의 혼합물에 포함시키기 위한 예시적인 제2 제제에는 항염증제, 면역조절제, 아미노살리실레이트 및 항생제가 제한없이 포함된다. 적절한 선택은 바람직한 제형, 투여량 및/또는 전달 방법에 의존할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항염증제와 함께 공동-제형화된다(즉, 혼합물로서 제공되거나 혼합물로 제조됨). 특정 실시형태에서, 코르티코스테로이드 항염증제는 항체 사이토카인 생착된 단백질과 함께 사용될 수 있다. 사용하기 위한 코르티코스테로이드는 메틸프레드니솔론, 하이드로코르티손, 프레드니손, 부데니소니드, 메살라민 및 덱사메타손 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 적절한 선택은 제형화, 및 전달 선호도에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 면역조절제와 공동-제형화된다. 특정 실시형태에서, 면역 조절제는 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스 및 메토트렉세이트 중 임의의 것으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 면역조절제는 항-TNF 제제(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙), 나탈리주맙 및 베돌리주맙으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 아미노살리실레이트제와 공동-제형화된다. 특정 실시형태에서, 아미노살리실레이트는 설파살라진, 메살라민, 발살라지드, 올살라진 또는 5-아미노살리실산의 다른 유도체로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항균제와 공동-제형화된다. 예시적인 항균제는 술폰아미드(예를 들어, 술파닐아미드, 술파디아진, 술파메톡사졸, 술피속사졸, 술파세타미드), 트리메토프림, 퀴놀론(예를 들어, 날리딕산, 시녹사신, 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파플록사신, 플레록사신, 펄록사신, 레보플록사신, 가레녹사신 및 게미플록사신), 메테나민, 니트로푸란토인, 페니실린(예를 들어, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 암피실린, 아목시실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린, 및 피페라실린), 세팔로스포린(예를 들어, 세파졸린, 세팔렉신, 세파드록실, 세폭시틴, 세파클로르, 세프프로질, 세푸록심, 세푸록심 아세틸, 로라카르베프, 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세피부텐, 세프디니르, 세프디토렌 피보륵실, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 및 세페파인), 카르바페넴(예를 들어, 이미페넴, 아즈트레오남), 및 아미노글리코시드(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 토라마이신, 네틸미신, 및 아미카신)를 제한없이 포함한다.
제조 물품/키트
일부 양태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 제조 물품(즉, 키트)에 제공된다. 제공된 항체 사이토카인 생착된 단백질은 일반적으로 바이알 또는 용기에 있다. 따라서, 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 용액 백 등을 포함한다. 적절하게는, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 액체 또는 건조된(예를 들어, 동결건조된) 형태일 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 또 른 조성물과 조합되어, 면역 관련 장애를 치료, 예방 및/또는 개선하기 위한 조성물을 제조하는데 효과적인 조성물을 보유한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 면역 관련 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용되는 것을 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 제조 물품(키트)은 선택적으로 하나 이상의 추가 제제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 제조 물품(키트)은 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 희석제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 동일한 제형(예를 들어, 혼합물)에서 하나 이상의 추가 활성제와 함께 제조 물품(키트)에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 별도의 제형으로(예를 들어, 별도의 용기에) 제2 또는 제3 제제와 함께 제조 물품(키트)에 제공된다. 특정 실시형태에서, 제조 물품(키트)은 항체 사이토카인 생착된 단백질의 분취량을 함유하며, 여기서 분취량은 하나 이상의 용량을 제공한다. 일부 실시형태에서, 투여량이 균일하거나 다양한 다중 투여를 위한 분취량이 제공된다. 특정 실시형태에서, 다양한 투여 레지멘은 적절하게 증가 또는 감소하고 있다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 제2 제제의 투여량은 독립적으로 균일하거나 독립적으로 변한다. 특정 실시형태에서, 제조 물품(키트)은 항염증제, 면역조절제, 아미노살리실레이트 및 항생제 중 임의의 것으로부터 선택된 추가 제제를 포함한다. 하나 이상의 추가 제제의 선택은 투여량, 전달 및 치료될 질환 상태에 따라 달라질 것이다.
면역 관련 장애의 치료를 위한 조성물의 치료 방법 및 사용
치료 및 예방될 병태
항체 사이토카인 생착된 단백질은 면역 관련 장애의 치료, 개선 또는 예방에 사용된다. 일 양태에서, 본 발명의 실시형태는 개체에게 치료적 유효량의 본원에 개시된 항체 사이토카인 생착된 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 면역 관련 장애의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 일 양태에서 치료제로서 사용하기 위한 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 개체에서 면역 관련 장애의 치료 또는 예방에서 치료제로서 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질의 사용은 면역 관련 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 치료를 필요로 하는 개인에게 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 면역 관련 장애의 치료 또는 개선에 사용하기 위한 이러한 항체 사이토카인 생착된 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
치료 대상 병태는 면역 관련 장애를 포함한다. 치료 목적으로, 개체는 면역 관련 장애를 가질 수 있다. 방지 또는 예방 목적으로, 개체는 면역 관련 장애의 활성 상태로부터 완화될 수 있거나 장래 발병을 예상할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 면역 관련 장애가 있거나, 면역 관련 장애가 있는 것으로 의심되거나, 또는 면역 관련 장애로부터의 완화 상태에 있다. 항체 사이토카인 생착된 단백질로 치료되는 면역 관련 장애는 Treg 세포에서 IL2 수용체 신호전달의 활성화로부터 이익을 얻는다. 치료되는 면역 관련 장애에는 하기가 포함된다: 제1형 당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 백반증, 만성 이식편 대 숙주 질환(cGvHD), 예방 급성 이식편 대 숙주 질환(pGvHD), HIV-유도 혈관염, 원형 탈모증, 전신 경화증 경피증, 및 일차 항-인지질 증후군.
항체 사이토카인 생착된 단백질의 투여
의사 또는 수의사는, 약제학적 조성물에 이용되는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 용량을 요망되는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 용량보다 낮은 수준에서 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지, 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 조성물의 유효량은 치료될 특정 질환 또는 병태, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 요인에 따라 변한다. 치료 용량은 전형적으로 안전성과 효능을 최적화하기 위해 적정이 필요하다. 항체 사이토카인 생착된 단백질을 투여하는 경우, 투여량은 숙주 체중의 0.0001 내지 100 mg/kg 및 보다 통상 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1~10 mg/kg의 범위내에 있다. 투여는 필요 또는 요망에 따라 매일, 매주, 격주로, 매월 또는 더 자주 또는 덜 자주 될 수 있다. 예시적인 치료 요법은 주 1회, 2주마다 1회 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.
항체 사이토카인 생착된 단백질은 단일 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 필요 또는 요망에 따라 주별, 격주, 월별 또는 년간일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 항체 사이토카인 생착된 단백질의 혈중 수준을 측정함으로써 가리켜진 바와 같이 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 μg/ml, 일부 방법에서는 25 내지 300 μg/ml의 혈장 항체 사이토카인 생착된 단백질 농도를 달성하기 위해 조정된다. 대안적으로, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우, 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체 사이토카인 생착된 단백질의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 항체 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 재조합 사이토카인, 예컨대 Proleukin®보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 투여량 및 투여 빈도는, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다. 일반적으로 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 빈도로 투여된다. 일반적으로 치료적 적용에서, 질병 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지, 비교적 높은 투여량이 비교적 짧은 간격에서 이따금 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 섭생으로 투여받을 수 있다.
제2 제제와의 공동-투여
용어 "병용 요법"은 본 개시에 기술된 치료 병태 또는 장애를 치료하기 위한 2종 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 이들 치료제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 고정된 비율의 유효 성분을 갖는 단일한 캡슐로 공-투여하는 것을 포괄한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 활성 성분을 위한 다수의 또는 별도의 용기(예를 들어, 캡슐, 분말 및 액체)에서의 공동 투여를 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 재구성될 수 있거나 원하는 용량으로 희석될 수 있다. 추가적으로, 이러한 투여는 또한 대략 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 각 유형의 치료제를 순차적인 방식으로 사용하는 것을 포괄한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본 설명에 기술된 상태 또는 장애를 치료하는데 있어서 약물 조합의 유익한 효과를 제공할 것이다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 하나 이상의 추가의 약리학적 제제(들)과 공동-투여된다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 추가의 하나 이상의 제제(들)은 혼합물로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질 및 추가의 하나 이상의 제제(들)은 별도의 제형으로서 투여된다. 별도의 제형이 사용되는 특정 실시형태에서, 투여는 동시적이다. 별도의 제형이 사용되는 특정 실시형태에서, 투여는 순차적이다. 별도의 제형이 사용되는 특정 실시형태에서, 투여는 동일한 경로를 통한다. 별도의 제형이 사용되는 특정 실시형태에서, 투여는 상이한 경로를 통한다. 항체 사이토카인 생착된 단백질과 공동-투여하기 위한 예시적인 추가의 제제에는 항염증제, 면역조절제, 아미노살리실레이트 및 항생제가 제한없이 포함된다. 적절한 선택은 바람직한 제형, 투여량 및/또는 전달 방법에 의존할 수 있다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 또한 면역 관련 장애 병태를 치료하기 위한 추가의 확립된 절차, 예를 들어 수술과의 병용 요법에서 사용된다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항-염증제와 공동-투여된다. 특정 실시형태에서, 코르티코스테로이드 항염증제는 항체 사이토카인 생착된 단백질과 함께 사용될 수 있다. 사용하기 위한 코르티코스테로이드는 메틸프레드니솔론, 하이드로코르티손, 프레드니손, 부데니소니드, 메살라민 및 덱사메타손 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 적절한 선택은 제형화, 및 전달 선호도에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 면역조절제와 공동-투여된다. 특정 실시형태에서, 면역 조절제는 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스 및 메토트렉세이트 중 임의의 것으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역조절제는 항-TNF 제제(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙), 나탈리주맙 및 베돌리주맙으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 아미노살리실레이트와 공동-투여된다. 특정 실시형태에서, 아미노살리실레이트는 설파살라진, 메살라민, 발살라지드, 올살라진 또는 5-아미노살리실산의 다른 유도체로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 항균제와 공동-투여된다. 예시적인 항균제는 술폰아미드(예를 들어, 술파닐아미드, 술파디아진, 술파메톡사졸, 술피속사졸, 술파세타미드), 트리메토프림, 퀴놀론(예를 들어, 날리딕산, 시녹사신, 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파플록사신, 플레록사신, 펄록사신, 레보플록사신, 가레녹사신 및 게미플록사신), 메테나민, 니트로푸란토인, 페니실린(예를 들어, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 암피실린, 아목시실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린, 및 피페라실린), 세팔로스포린(예를 들어, 세파졸린, 세팔렉신, 세파드록실, 세폭시틴, 세파클로르, 세프프로질, 세푸록심, 세푸록심 아세틸, 로라카르베프, 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세피부텐, 세프디니르, 세프디토렌 피보륵실, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 및 세페파인), 카르바페넴(예를 들어, 이미페넴, 아즈트레오남), 및 아미노글리코시드(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 토라마이신, 네틸미신, 및 아미카신)를 제한없이 포함한다.
일부 실시형태에서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 치료 표준과 함께 공동-투여된다. 예를 들어, 제1형 당뇨병의 치료에서, 치료 표준은 인슐린 또는 인슐린 요법의 투여이다. 본원에 개시된 바와 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질은 인슐린이 주로 정상 당 수준을 회복함에 따라 면역 내성을 촉진시키는데 여전히 잘 작용할 것이다.
실시예
실시예 1: IL2 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생성
IL2 서열을 다양한 면역글로불린 스캐폴드의 CDR 영역으로 조작함으로써 항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성한 다음, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬 둘 다를 사용하여 최종 항체 사이토카인 단백질을 생성하였다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 IL2의 바람직한 치료적 특성을 부여한다; 그러나, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 rhIL2와 비교하여 증가된 NK 세포 활성과 같은 바람직하지 않은 효과를 감소시켰다.
항체 사이토카인 생착된 단백질을 생성하기 위해, 뮤테인(서열 번호:4 또는 6)을 함유하는 IL2 서열을 면역글로불린 사슬 스캐폴드의 CDR 루프에 삽입하였다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 생식계열 항체 서열뿐만 아니라 임상 환경에서 이용된 다양한 공지된 면역글로불린 서열을 사용하여 제조되었다. GFTX3b로 지칭되는 예시적인 스캐폴드에서의 IL2의 서열은 표 2에 도시되어 있다. 삽입 지점은 이용가능한 구조적 또는 상동성 모델 데이터에 기초하여 루프의 중간 지점이 되도록 선택되었다. 관련 서열을 암호화하는 재조합 DNA를 사용하여 표준 분자 생물학 방법론을 사용하여 항체 사이토카인 생착된 단백질을 제조하였다.
사이토카인 생착을 위해 CDR이 선택되는 선별은 필수 생물학, 생체물리학적 특성 및 유리한 발달 프로파일의 파라미터에서 선택된다. 모델링 소프트웨어는 어느 CDR 및 CDR 내의 어느 위치가 원하는 파라미터를 제공할 것인지를 예측하는데 부분적으로 유용하므로, 6개의 가능한 항체 사이토카인 생착편이 제조되고 생물학적 분석에서 평가된다. 필요한 생물학적 활성이 달성되면, 항체 사이토카인 생착된 분자가 각각의 사이토카인 수용체와 상호작용하는 방법에 대한 구조적 해결책과 같은 생체물리학적 특성이 해결된다.
항체 IL2 생착된 분자의 경우, 사이토카인 생착을 위해 고려된 항체 후보의 구조가 초기에 해결되었다. 이 구조로부터, 에피토프와 상호작용하는 항체의 일부인 파라토프는 항체 "아암"의 극단 N-말단에 있었고, 이 위치로 생착된 사이토카인이 그의 각각의 수용체에 대한 사이토카인을 나타냄을 주목한다. 생착 기술로 인해, 각각의 항체 IL2 생착된 단백질은 상이한 길이, 서열 및 구조적 환경의 CDR 루프에 의해 제한된다. 이와 같이, IL2는 LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3 and HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3에 상응하는 6개의 CDR 모두에 생착되었다. 도 1은 다양한 점 돌연변이를 포함하고 IL2 삽입 점을 CDR 루프의 N 또는 C 부분(nH1, cH1, nH2, cH2)으로 이동시키는 IL2 항체 사이토카인 생착편의 상이한 예시적인 버전을 보여준다. 도 1의 표로부터, 항체 사이토카인 생착된 단백질은 CDR2의 경쇄(IgG.IL2.L2)에 생착된 IL2가 발현하지 않은 것을 포함하여 그들의 활성이 모두 상이하다는 것이 명백하다. 변경된 Fc 기능을 갖는 IL2 항체 사이토카인 생착편(예를 들어, Fc 침묵)이 더 양호한 프로파일을 갖는 것이 또한 관찰되었다.
HCDR-1은 원하는 생물학적 특성을 향상시키는데 포함된 특성(생체물리학적 및 생물학적) 및 IL2 점 돌연변이의 최상의 조합을 갖기 때문에 선택되었다. 삽입 점의 선택을 위해, CDR 루프의 구조적 중심은 어느 한쪽에서 (선형 크기 3.8 Å x 잔기 수의) 가장 많은 공간을 제공하고 어떠한 이론에도 구속되지 않고, IL2가 보다 쉽게 독립적으로 접히게 함으로써 안정한 분자를 제공하기 때문에 선택되었다. 생착 스캐폴드 GFTX3b의 구조는 이미 알려져 있으므로, 각 CDR의 구조 중심도 알려져 있다. 이것은 Chothia 넘버링 형식을 사용하여 정의된 CDR 루프 서열의 중심과 일치하였다. 상기 언급한 바와 같이, IL-2 생착편의 삽입 점은 CDR 루프의 중심으로부터 멀어지고, N 또는 C 말단 부분쪽으로 이동되었다. 그러나, CDR 루프 내에서 IL2를 이동시키는 것은 생물학적 활성에 유의한 차이를 만들지 않았다.
요약하면, CDR로의 생착이 IL2 수용체의 개별 서브유닛에 일정한 수준의 입체 장애를 제공할 것이라는 가설과 함께, 각각의 CDR에서의 삽입 점은 구조적 기초에 의해 선택되었다. 특정 사이토카인에 가장 적합한 CDR 생착편의 최종 선택은 원하는 생물학 및 생체물리학적 특성에 기초하였다. 사이토카인 수용체의 성질, 사이토카인/수용체 상호작용 및 신호전달 메카니즘도 또한 역할을 수행하였으며, 이는 각각의 개별 항체 사이토카인 분자를 그들 각의 특성에 대해 비교함으로써 수행되었다.
[표 1]
Figure 112019131529151-pct00001
Figure 112019131529151-pct00002
Figure 112019131529151-pct00003
[표 2]
Figure 112019131529151-pct00004
Figure 112019131529151-pct00005
Figure 112019131529151-pct00006
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실시예 2: 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Treg 세포에서 더 큰 활성 및 증가된 반감기를 나타낸다
IgG.IL2D49A.H1 및 IgG.IL2.L3은 이들이 Proleukin®에 대한 원하는 생물학적 효과를 달성함에 따라 선택되었다(도 1은 상대적 변화를 요약함). 이러한 효과에는 하기가 포함된다: Treg 대 Tcon 및 NK 세포에서 IL-2R에 대한 선택성, 마우스에서 Treg 대 Tcon 및 NK 세포의 더 큰 반감기 확장.
고친화성 IL-2 수용체 자극에 대한 평가에서, Proleukin® 및 IgG.IL2D49A.H1 생착편은 둘다 Treg 세포에서 유사한 신호 효능을 보여주었지만, IgG.IL2D49A.H1은 Proleukin®과 달리 CD8 Teffector 세포 및 NK 세포 모두에서 활성이 없는 것으로 감소되었다. CDRL3으로 생착된 IL2(IgG.IL2.L3)는 Proleukin®보다 Treg에서 더 적은 신호 효능을 보였지만, NK 세포에서는 활성이 없었다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(hPBMC)를 HemaCare Corp.에서 구입하고, IL-2 고친화성 수용체에 대한 선택적 활성을 평가하기 위해 Proleukin®, IgG.IL2D49A.H1 또는 IgG.IL2.L3으로 시험관내에서 시험하였다. 세포를 무혈청 시험 배지에 놓고, 각 웰에 첨가하였다. 항체 사이토카인 생착된 단백질 또는 천연 인간 IL-2를 웰에 첨가하고 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 20분 후, 세포를 고정시키고, 표면 마커로 염색하고, 제조업체의 지시에 따라 STAT5 항체(BD Biosciences)로 투과시키고 염색하였다.
혈장에서 IgG.IL2D49A.H1 또는 IgG.IL2.L3의 약동학은 단 1회 투여 후 Proleukin®에 비해 연장된 반감기를 나타냈다. Proleukin® 또는 생착편으로 1회의 치료 후 8일 후에 전-당뇨병 NOD 마우스의 비장에서 세포 확장을 평가하였다. IgG.IL2D49A.H1은 Teffector 세포 및 NK 세포에 비해 우수한 Treg 확장을 달성하였고, 전-당뇨병 마우스에서 Proleukin®보다 더 잘 견뎌냈다. IgG.IL2D49A.H1 및 IgG.IL2.L3의 STAT5 자극 요약, PK/PD가 도 2에 도시되어 있다. 이는 항체 사이토카인 생착된 단백질이 Proleukin®보다 반감기가 클 뿐만 아니라 Teffector 및 NK 세포의 원치 않는 자극없이 표적화된 Treg 세포의 자극을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 3: 항체 사이토카인 생착된 단백질은 Treg 세포에서 더 큰 활성을 나타낸다
비-비만 당뇨병(NOD) 마우스는 제1형 당뇨병을 자발적으로 발생시키고, 종종 인간 제1형 당뇨병을 위한 동물 모델로서 사용된다. 전-당뇨병 NOD 마우스는 등몰 Proleukin®(주3회) 및 상이한 항체 사이토카인 생착된 단백질(1x/주)을 투여받았다. 첫 치료 8일 후, 비장을 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, RPMI(10% FBS)로 세척하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충액(Sigma # R7757)으로 용해시키고 세포 수 및 생존력을 계수하였다. FACS 완충액(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05% 나트륨 아지드)를 사용하여 표준 프로토콜하에 FACS 염색을 수행하였다. 세포를 표면 항체로 염색하고: 랫트 항-마우스 CD3-BV605(BD Pharmingen #563004), 랫트 항-마우스 CD4-퍼시픽 블루(BD Pharmingen #558107), 랫트 항마우스 CD8-PerCp(BD Pharmingen #553036), CD44 FITC(Pharmingen #553133) 랫트 항-마우스 CD25-APC(Ebioscience #17-0251), 및 후속해서 항-마우스/랫트 FoxP3 염색 세트 PE(Ebioscience #72-5775)에 따라 FoxP3에 고정/투과시키고, 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 또는 BD FACS LSR II® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 도 3은 IgG.IL2D49A.H1 및 IgG.IL2D113A.H1을 Proleukin®과 비교하여, 각 비장으로부터 절대 값으로서 계산된 배수 값 및 비율을 나타낸다. IgG.IL2D49A.H1에 의해 CD8 T 효과기 세포 또는 NK 세포의 확장없이 Treg 세포의 증가된 확장이 상단 열에 도시되어 있다. 이는 저용량 및 고용량 Proleukin®과 대조적으로 모든 세포 유형의 확장으로 이어진다.
실시예 4: IL-2R 신호전달 효능은 CD4 Tcon 및 CD8 Teff에서 감소하지만, Treg에서는 시험관내에서 감소하지 않았다
Proleukin® 및 IgG.IL2D49A.H1 둘다를 인간 및 사이노몰구스 원숭이 PBMC 둘 다에서 IL-2R 상에서, 신호 효능에 대해 시험관내에서 시험하였다. 등몰의 IL2 농도에서 IgG.IL2D49A.H1 및 Proleukin®은 고친화성 IL-2R을 발현하는 Treg 세포에서 유사한 신호 효능을 나타냈지만, IgG.IL2D49A.H1만이 저친화성 IL-2 수용체를 발현하는 기존의 CD4 및 CD8 T 효과기 세포에서 감소된 효능을 나타냈다. 이러한 결과는 인간 및 사이노몰구스 PBMC 둘 다에서 관찰되었다. 분석을 위해, PBMC 세포를 무혈청 시험 배지에 놓고, 각 웰에 첨가하였다. IgG.IL2D49A.H1 또는 Proleukin®을 웰에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 20분 후, 세포를 고정시키고, 표면 마커로 염색하고, 제조업체의 지시에 따라 STAT5 항체(BD Biosciences)로 투과시키고 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다.
도 4에 도시된 결과가 특히 분명하였다. 인간 및 사이노몰구스 PBMC 둘 다에서, IgG.IL2D49A.H1에 의한 pSTAT5 활성화는 Treg에서 발견되었으며, CD8 T 효과기에서는 거의 없었다.
실시예 5: IgG.IL2D49A.H1은 시험관내에서 기능적이고 안정적인 Treg를 확장시킨다
Treg에 대한 개선된 선택성은 기능적 효과를 동반한다. IgG.IL2D49A.H1에 의해 확장된 Treg는 Proleukin® 확장된 Treg보다 Teffector와 동일하거나 더 나은 억제제이다. 이 분석을 위해, 인간 PBMC를 Ficoll-Hypaque 구배(GE HealthCare cat#17-1440-03)를 통한 원심분리에 의해 전혈로부터 정제하였다. PBMC는 RBC 용해하였다(Amimed cat # 3-13F00-H). EasySep CD4+ T-세포 농축 키트(StemCell Technologies cat#19052)를 사용하여 CD4+ T세포를 농축하였다. 농축된 CD4+를 V500 항-CD4(클론 RPAT4), PerCP-Cy5.5 항-CD127 (및 APC 항-CD25)로 염색하고, CD4+CD127-CD25+ 자연 조절 T 세포(nTreg) and CD4+CD127+CD25- T 반응기(Tresp)를 분리하도록 분류하였다. 상기 분류된 Treg를 배지를 채운 96-웰 둥근-바닥 마이크로플레이트에서 복제물로 플레이팅하고(1x105/100 μl/웰), 등몰 농도의 1nM 또는 0.3nM Proleukin® 또는 IgG.IL2D49A.H1의 존재하에 3:1 비드-세포 비율의 마이크로비드로 자극하였다. 37℃에서 24시간 배양 후, 동일한 IL2 농도를 함유하는 100 μl 배지를 웰에 다시 채웠다. 3일째에, 배양액을 현탁시키고, 반으로 나누고, 동일한 IL2 농도를 함유하는 100 μl 배지를 다시 채웠다. 6일째에, 배양액을 3일째와 같이 처리하였다. 8일째에, 세포를 수확하고, 튜브에 풀링하고, 멀티스탠드 자석 상에 튜브를 1~2분 동안 놓아 비드를 제거하였다. 세포를 함유하는 상청액을 수집하고 실온에서 5분 동안 200 g에서 원심분리하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 원래 IL2 농도의 1/5을 함유하는 배지를 채운 48-웰 편평-바닥 마이크로플레이트에 약 5x105/ml으로 다시 플레이팅하였다. 2일 휴식후, 세포를 수확하고, 계수하고, 분석하거나, 억제 분석에 사용하였다. 확장된 Treg 및 새로 해동된 CD4+CD127+CD25- T 반응기(Tresp) 세포를 각각 0.8 μM CTViolet(Life Technologies cat# C34557) 및 1 μM CFSE(Life Technologies cat# C34554)로 제조업체의 지침에 기재된 바와 같이 표지하였다. 확장된 Treg의 억제 특성을 평가하기 위해, 3x104 CFSE-표지된 Tresp를 단독으로 또는 CTViolet-표지된 Treg(상이한 Tresp:Treg 비율)로 삼중 플레이팅하고, 1:8 비드-세포 비율로 Dynabead로 자극하였다(최종 부피 200 μl/웰). 4~5일 후, 세포를 수집하고, 반응기 세포의 증식을 유세포측정에 의해 평가하였다.
메틸화 상태를 Tresp 세포와 비교하여 신선하고 확장된 Treg에서 평가하였다. Qiagen의 Allprep® DNA/RNA Mini(cat #80204)를 사용하여 >5.0 x 105 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 분리하였다. 이어서, Sigma의 Imprint® DNA 변형 키트(cat #MOD50)를 사용하여 200 ng의 gDNA를 처리하여, 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 전환시켰다(메틸화된 시토신은 변하지 않은 채로 유지함). 그런 다음, EpiTect MethyLight® PCR+ROX(Qiagen cat #59496), Epitect 제어 DNA(Qiagen cat #59695), 표준 메틸화된 플라스미드(Life Technologies, cat #12AAZ7FP) 및 메틸화되지 않은 플라스미드(Life Technologies, cat #12AAZ7FP), Treg-특이적 탈메틸화된 영역(TSDR) 메틸화된 및 메틸화되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브(MicroSynth)를 사용한, 서열-특이적 프로브-기반 실시간 PCR을 사용하여 8 ng의 비설파이트 전환된 gDNA 상에서 정량적 메틸화를 평가하였다. EpiTect MethyLight® PCR 핸드북에 기재된 바대로 메틸화 백분율을 계산하였다.
도 5는 Proleukin® 및 IgG.IL2D49A.H1 확장된 Treg에 의한 Foxp3 유전자좌의 안정한 탈메틸화를 그래프로 보여준다. 시험관내에서 IgG.IL2D49A.H1로 확장된 인간 Treg는 Foxp3 발현 및 탈메틸화에 의해 안정적이며, 이는 안정적인 Treg 세포를 초래한다.
실시예 6: IgG.IL2D49.H1에 의해 시험관내에서 인간 NK에서 IL-2R 신호전달에 대한 효능이 감소한다
IgG.IL2D49A.H1은 등몰 농도의 Proleukin®과 비교하여 NK 세포에서 감소된 신호전달 효능을 나타냈다. PBMC 세포를 무혈청 시험 배지에 놓고, 각 웰에 첨가하였다. IgG.IL2D49A.H1 또는 Proleukin®을 웰에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 20분 후, 세포를 1.6% 포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 표면 마커로 염색하였다. 실온에서 30분 후, 샘플을 세척하고, 재현탁된 세포 펠렛을 -20℃ 메탄올로 투과시키고, 세척하고 STAT5 및 DNA 인터칼레이터로 염색하였다. 세포를 Cytof 상에서 실행시키고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 결과는 도 6에 도시되며, 여기서 IgG.IL2D49A.H1은 NK 세포에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, Proleukin® 치료는 Proleukin® 치료의 바람직하지 않은 부작용으로 NK 세포에서 pSTAT5 활성을 증가시켰다.
실시예 7: 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 피하 투여시 IgG.IL2D49A.H1의 약동학(PK), 약력학(PD) 및 독물학 효과의 평가.
사이노몰구스 원숭이에서의 IgG.IL2D49A.H1은 확장된 약동학, Teffector 세포에 대한 우수한 Treg 확장 및 저용량 Proleukin®보다 낮은 독성을 보여주었다. 이 비임상 실험실 연구는 Novartis 동물 관리 및 사용위원회-승인 일반 프로토콜 번호 TX 4039, 이 프로토콜 및 시설 표준 운영 절차(SOP)에 따라 수행하였다.
연구 첫날에 동물에게 IgG.IL2D49A.H1 또는 Proleukin®을 피하 투여하였다. 연구시 각 용량 수준에서 모든 동물로부터 혈액을 수집하였다. 투여전 1일, 투여후 1시간, 6시간 및 12시간, 및 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 및 12일째. 약동학 및 약력학에 대한 모든 혈액 샘플은 원심분리하고, 혈장 샘플을 수득하였다. 생성된 혈장 샘플을 단일 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 대략 -70℃ 이하에서 동결시켰다. 모든 샘플을 분석하고, 혈장 중 IgG.IL2D49A.H1 및 Proleukin®의 농도를 면역 분석법을 사용하여 측정하였다. 반감기와 같은 약동학적 파라미터를 계산하고, 약력학에 대해 FACS에 의해 세포를 면역표현형화하였다. IL-2/IL-2 자이로(Gyros) 분석 프로토콜은 하기와 같다. 1:20으로 희석된 5 μL의 샘플이 필요한 각 중복 분석에서 각 샘플을 이중으로 실행했다. 포획 항체는 염소 항-인간 IL-2 비오티닐화 항체(R&D Systems BAF202)이며, Alexa 647 항-인간 IL-2, 클론 MQ1-17H12(Biolegend 500315) LOQ: 0.08 ng/ml로 검출하고, 모든 면역분석은 Gyros CD-200s®이 장착된 Gyrolab Bioaffy200®을 사용하여 수행하였다.
도 7은 IgG.IL2D49A.H1과 Proleukin® 사이의 대조를 나타낸다. IgG.IL2D49A.H1은 12시간의 반감기를 갖는 반면, Proleukin®은 3시간의 반감기를 갖는다. IgG.IL2D49A.H1의 반감기가 연장되면 Treg 활성이 증가하고 호산구 증가증이 크게 감소한다.
실시예 8: IgG.IL2D49A.H1은 Proleukin®에 비해 연장된 반감기를 나타낸다
IgG.IL2D49A.H1은 단일 투여 후 4시간의 Proleukin® 반감기와 비교하여 대략 12시간의 반감기를 나타냈다. 나이브 CD-1 동물을 정맥내 또는 피하로 투여하고, 투여 전, 투여 후 1시간, 3, 7, 24, 31, 48, 55 및 72시간에 모든 동물로부터 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 원심분리하여, 혈장 샘플을 수득하였다. 생성된 혈장 샘플을 단일 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, -80℃에서 동결시켰다. 모든 샘플을 분석하고, 혈장 중 IgG.IL2D49A.H1의 농도를 면역분석을 사용하여 측정하였다. IL-2/IL-2 자이로(Gyros) 분석 프로토콜은 하기와 같다. 1:20으로 희석된 5 μL의 샘플이 필요한 각 중복 분석에서 각 샘플을 이중으로 실행했다. 포획 항체는 염소 항-인간 IL-2 비오티닐화 항체(R&D Systems BAF202)이며, Alexa 647 항-인간 IL-2, 클론 MQ1-17H12(Biolegend 500315) LOQ: 0.08 ng/ml로 검출하고, 모든 면역분석은 Gyros Cd-200s®이 장착된 Gyrolab Bioaffy200®을 사용하여 수행하였다. 이 분석은 실시예 7의 반감기 결정에 따라 확장된다. 이 분석의 결과는 도 8에 도시되어 있으며, IgG.IL2D49A.H1의 반감기가 4시간의 반감기를 갖는 Proleukin®과 대조적으로 12~14시간인 것으로 결정된다.
실시예 9: xeno-GvHD를 갖는 마우스에서 인간 Treg가 확장되지만, Teffector 또는 NK 세포는 확장되지 않는다
IgG.IL2D49A.H1은 xeno-GvHD 모델에서 Teffectors 또는 NK 세포보다 Treg를 선택적으로 확장하지만, Proleukin®은 그렇지 않다. NOD-scid IL2R 감마 널 마우스(NSG)에 복강내 주사(HemaCare Corp)를 통해 건강한 공여체로부터의 hPBMC를 주사하였다. 주사 24시간 후, 동물에게 연구 기간 동안 매주 IgG.IL2D49A.H1 1x/주 또는 Proleukin® 5x/주를 투여하였다. 연구 기간 동안 체중을 주 2회 모니터링하였다. 제1 투여 28일 후 그룹당 4마리 마우스를 수확하고, 비장을 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하고 RPMI(10% FBS)로 세척하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충액으로 용해시키고 세포 수 및 생존력을 계수하였다. FACS 완충액(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05% 나트륨 아지드)을 사용하여 표준 프로토콜하에 FACS 염색을 수행하였다. 세포를 표면 항체로 염색한 후, 항-마우스/랫트 FoxP3 염색 세트 PE(Ebioscience #72-5775)에 따라 FoxP3에 대해 고정/투과시키고 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 배수 값과 비율은 각 비장 절대 수에서 계산된 상대 수를 기준으로 한다. 도 9는 IgG.IL2D49A.H1이 이 마우스 모델에서 Proleukin®보다 Treg 세포를 훨씬 더 잘 확장시키고, 또한 Tcon 및 NK 세포의 바람직하지 않은 확장을 감소시킨다는 것을 보여준다.
제노-GvHD 마우스를 IgG.IL2D49.H1로 처리하고, 인간 PBMC(외래 세포)를 주사한 경우, 처리 과정 동안 정상 체중을 유지하였다. 대조적으로, Proleukin®으로 처리된 마우스는 심각한 체중 손실을 겪었다. 연구 기간 동안 1주일에 2회 체중을 모니터링하였고, 등록시 동물의 초기 체중을 고려하여 체중 백분율을 계산하였다. 이 개선은 IgG.IL2D49A.H1이 이 모델에서 Treg 향상에 미치는 영향과 관련이 있으며, 데이터는 도 10에 그래프로 표시되어 있다. 이 데이터는 IgG.IL2D49A.H1 및 기타 항체 사이토카인 생착된 단백질이 더 큰 치료 지수 및 안전을 위한 마진을 가짐을 나타낸다.
실시예 10: IgG.IL2D49A.H1은 당뇨병의 NOD 마우스 모델에서 제1형 당뇨병 발생을 예방한다
전-당뇨병성 NOD 암컷은 복강내 주사에 의해 등몰량의 Proleukin®(매주 3x) 및 IgG.IL2D49A.H1(1x/매주)을 투여받았다. 연구 기간 동안(처음 투여 4개월 후), 마우스를 일주일에 두 번 혈당 및 체중에 대해 모니터링하였다. 도 11은 IgG.IL2D49A.H1 처리된 마우스가 낮은 혈당 값을 유지함을 보여준다. 이와 같이, IgG.IL2D49A.H1로 처리된 마우스는 명시적인 제1형 당뇨병(T1D)으로 진행되지 않았다. 대조적으로, Proleukin® 처리된 마우스는 낮은 혈당 값으로 시작했지만 시간이 지남에 따라 증가하여 제1형 당뇨병 증상이 나타났다.
실시예 11: 전-당뇨병성 NOD 마우스에서 IgG.IL2D49A.H1 대 저용량 Proleukin®
IgG.IL2D49A.H1은 NOD 마우스 모델에서 3회 용량의 Proleukin®과 비교하여, 1회 용량으로 우수한 Treg 확장, 더 우수한 내약성을 나타냈으며, 부작용을 나타내지 않았다. 전-당뇨병성 NOD 암컷은 복강내 주사에 의해 저용량 등몰량의 Proleukin®(매주 3x) 및 IgG.IL2D49A.H1(1x/매주)을 투여받았다. 제1 투여 4일 후 그룹당 4마리 마우스를 테이크다운하고, 비장을 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하고 RPMI(10% FBS)로 세척하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충액으로 용해시키고 세포 수 및 생존력을 계수하였다. FACS 완충액(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05% 나트륨 아지드)을 사용하여 표준 프로토콜하에 FACS 염색을 수행하였다. 세포를 표면 항체로 염색하고: 랫트 항-마우스 CD3-BV605(BD Pharmingen #563004), 랫트 항-마우스 CD4-퍼시픽 블루(BD Pharmingen #558107), 랫트 항마우스 CD8-PerCp(BD Pharmingen #553036), CD44 FITC(Pharmingen #553133) 랫트 항-마우스 CD25-APC(Ebioscience #17-0251), 및 후속해서 항-마우스/랫트 FoxP3 염색 세트 PE(Ebioscience #72-5775)에 따라 FoxP3에 고정/투과시키고, 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 또는 BD FACS LSR II® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 배수 값과 비율은 각 비장 절대 수에서 계산된 상대 수를 기준으로 한다. 단일 용량의 IgG.IL2D49A.H1의 투여는 도 12에 도시된 바와 같이 NOD 마우스 모델에서 Proleukin®의 반복 투여보다 Treg의 더 큰 확장을 나타냈다.
실시예 12: NOD 마우스 모델에서 유효 용량의 IgG.IL2D49A.H1의 약동학
1.3 mg/kg 및 0.43 mg/kg의 IgG.IL2D49A.H1의 약동학을 1용량 후 최대 48시간 혈장에서 분석하였다. 전-당뇨병성 10주령 NOD 마우스에 IgG.IL2D49A.H1을 2가지 상이한 농도로 복강내 투여하고, 투여후 1시간, 3, 7, 24 및 48시간에 모든 동물로부터 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 원심분리하여, 혈장 샘플을 수득하였다. 생성된 혈장 샘플을 단일 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, -80℃에서 동결시켰다. 각 샘플을 분석하여 자이로(Gyros) 플랫폼에 적합한 3가지 다른 방법을 사용하여 IgG.IL2D49A.H1 혈장 농도를 검출했다: 1) IL2-기반 포획 및 검출, 2) IL2-기반 포획 및 hFc-기반 검출, 및 3) hFc-기반 포획 및 검출.
1:20으로 희석된 5 μL의 샘플이 필요한 각 중복 분석에서 각 샘플을 이중으로 실행했다. Gyros IL-2/IL-2 분석은 포획 염소 항-인간 IL-2 비오티닐화 항체(R&D Systems BAF202)를 사용하고, Alexa 647 항-인간 IL-2, 클론 MQ1-17H12(Biolegend 500315)로 검출했다. IL-2/Fc 검출을 위해, 포획 염소 항-인간 IL-2 비오티닐화 항체(R&D Systems BAF202)를 사용하고, 검출을 위해, Alexa 647 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적(Jackson ImmunoResearch 109-605-098) 항체를 사용하였다. 인간 Fc/Fc 분석을 위해, 포획 비오티닐화 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch #109-065-098)를 사용하였다. 검출 단계는 Alexa 647 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch #109-605-098)를 사용하였다. 모든 면역분석은 Gyros Cd-200s®이 장착된 Gyrolab Bioaffy200®을 사용하여 수행하였다. 이 마우스 모델에서 정량 한계(LOQ)는 도 13a에 도시된 바와 같이 48시간이다. 이것은 도 13b에서 Proleukin® 및 IL2-Fc 융합 단백질과 비교된다. 이 그래프는 LOQ가 IgG.IL2D49.H1과 같은 항체 사이토카인 생착된 단백질에 대해 더 높다는 것을 보여준다.
실시예 13: 전-당뇨병성 NOD 마우스에서의 용량 범위 결과
IgG.IL2D49A.H1은 동일한 등몰 농도에서 Proleukin®과 비교할 때 CD4 Tcon 및 CD8 Teffector 둘 다에 비해 우수한 Treg 확장을 나타냈다. 사망률과 같은 부작용은 가장 높은 Proleukin® 그룹에서 발견되었으며, IgG.IL2D49.H1의 임의의 용량으로 처리된 마우스에서는 사망률이 관찰되지 않았다.
전-당뇨병성 NOD 암컷은 복강내 주사에 의해 저용량 등몰량의 IL-2(매주 3x) 및 IgG.IL2D49A.H1(1x/매주)을 투여받았다. 그룹당 3마리 마우스를 첫 번째 투여후 8일 후 안락사시키고 비장을 수확하였다. 비장을 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, RPMI(10% FBS)로 세척하였다. 혈액을 수집하고, 적혈구를 적혈구 용해 완충액으로 용해시키고 세포 수 및 생존력을 계수하였다. FACS 완충액(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05% 나트륨 아지드)을 사용하여 표준 프로토콜하에 FACS 염색을 수행하였다. 세포를 표면 항체로 염색한 후, 항-마우스/랫트 FoxP3 염색 세트 PE(Ebioscience #72-5775)에 따라 FoxP3에 대해 고정/투과시키고 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 비율은 각 비장에서 계산된 상대 세포 수를 기준으로 한다. 이 데이터가 도 14에 제공되어 있다. 표는 항체 사이토카인 생착된 단백질에 대한 용량 범위 형식을 제공한다. 또한 투여가 더 넓은 범위에 걸쳐 잘 견딜 수 있기 때문에 IgG.IL2D49A.H1은 Proleukin®보다 더 큰 치료 지수를 가짐을 입증한다. 대조적으로, 더 높은 용량으로 Proleukin®을 투여하면 마우스에서 이환율 및 사망률이 생성되었다. 가장 높은 용량의 Proleukin®은 이 용량에서의 치료를 중단해야 하는 충분한 이환율과 사망률을 생성했다.
실시예 14: 인간 PBMC 상의 STAT5 신호전달
IgG.IL2D49A.H1은 건강한 공여체 인간 PBMC 및 자가면역 공여체로부터의 PBMC에서 Tcon 및 NK에 대한 Treg 활성화에 대해 선택적이었다. STAT5 신호전달의 효력은 IgG.IL2D49.H1으로 시험관내 처리한 후 Tcon에서 감소하였으나 Treg는 아니었다. 건강한 및 자가면역 환자(Hemacare Corp) 세포로부터의 인간 PBMC를 무혈청 시험 배지에 놓고 각 웰에 첨가하였다. IgG.IL2D49A.H1을 웰에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 20분 후, 세포를 고정시키고, 표면 마커로 염색하고, 제조업체의 지시에 따라 STAT5 항체(BD Biosciences)로 투과시키고 염색하였다. 세포를 BD LSR Fortessa® 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어로 분석하였다. 도 15a의 데이터는 백반증을 갖는 인간 환자로부터 취한 PBMC의 IgG.IL2D49A.H1 처리에서 Treg 활성을 유지하면서 NK, CD4 Tcon 또는 CD8 T 효과기 세포의 활성화가 매우 적었음을 나타낸다. 이 결과는 SLE 및 하시모토 병 환자로부터 얻은 PBMC에서도 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 도 15b는 제1형 당뇨병(T1D)을 갖는 인간 환자로부터 취하여 IgG.IL2D49A.H1 및 Proleukin®으로 치료된 PBMC가 NK 세포, CD8 T 효과기 세포 또는 CD4 Tcon 세포에서 pSTAT5 활성을 상당히 감소시켰음을 보여준다. IgG.IL2D49A.H1 치료는 정상적인 PBMC에서 효과적이었고 T1D 환자로부터 얻은 PBMC에서 잘 견딜 수 있었기 때문에, 항체 사이토카인 단백질은 환자가 인슐린 요법을 받고 있어도 T1D의 치료에 유용할 것임을 나타낸다. 이는 IgG.IL2D49A.H1이 이러한 면역 관련 장애를 갖는 환자에서 내약성이 우수하고, 이러한 면역 관련 장애를 다루는 데 효과적임을 나타낸다.
실시예 15: 항체 사이토카인 생착된 단백질의 결합
뮤테인(서열 번호: 4 또는 6)을 함유하는 IL2 서열을 면역글로불린 사슬 스캐폴드의 CDR 루프에 삽입하였다. 항체 사이토카인 생착된 단백질은 생식계열 항체 서열뿐만 아니라 임상 환경에서 이용된 다양한 공지된 면역글로불린 서열을 사용하여 제조되었다. 사용된 항체 중 하나는 그의 항원으로서 RSV를 갖는다. 이 항체의 CDR에 IL2를 생착하는 것이 RSV에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는지를 결정하기 위해, ELISA 분석을 PBS 또는 카보네이트 완충액 중의 RSV 단백질에 대해 수행하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 이는 IL2 생착에 대해 CDR이 선택된 것에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 예를 들어, IgG.IL2D49A.H1은 생착되지 않은(변형되지 않은) 원래 항체와 유사한 RSV 결합을 갖는다. 대조적으로, IL2를 CDR3의 경쇄(CDR-L3) 또는 CDR-H3에 생착하는 것은 결합을 감소시킨다. 예상한 바와 같이, 관련없는 항체(Xolair)에 생착된 IL2는 결합을 일으키지 않는다. 이는 항체 사이토카인 생착된 단백질이 항체 스캐폴드의 원래 표적에 대한 결합을 유지할 수 있거나, 이 결합이 감소될 수 있음을 입증한다.
실시예 16: 비-인간 영장류에서의 Treg 확장
IgG.IL2D49A.H1을 2개의 용량 그룹(3M/그룹) 사이에서 교대로 4주 투여 자유 간격으로 제공된 2개의 단일 상승 피하 용량으로 사이노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 이어서 6개의 피하 용량(2주일 동안 격일로)의 완충제 또는 5 mg/kg IgG.IL2D49A.H1을 수용하는 2개의 그룹(3M/그룹)에서 2-주 다중 용량 단계가 이어졌다. "단일 용량 단계"(29일 간격으로 2회 용량)로부터 유세포 분석(면역표현형 분석)에 의해 평가된 림프구 집단의 변화가 도 17에 도시되어 있다. 125 및 375 μg/kg 용량에서, Tcon 또는 NK 세포에 대한 분명한 영향 없이, Treg의 절대 수가 3~4배 및 최대 5.5배 증가하는 것이 관찰되었다. 최대 Treg 확장은 4일째에 나타났으며, Treg 수는 10일까지 기준선 근처로 돌아왔다. IgG.IL2D49A.H1은 안전하고 잘 견디며, 사망률, 임상 징후 또는, 체중, 음식 소비, 사이토카인 수준 또는 임상 병리학에 있어서의 변화가 없었다. 또한, 2.4 mg/kg까지의 단일 용량 또는 2주 동안 5 mg/kg에서 2일마다 다중 투여 후 연구에서 심혈관 효과(ECG 또는 혈압)가 관찰되지 않았다. 혈관 누출이나 다른 CV 관련 결과는 나타나지 않았다.
실시예 17: 항-약물 항체 효과의 위험
GFTX3b_IL-2-H1-D49A의 선택적 프로파일에 대한 항-약물 항체 효과의 위험을 결정하기 위해, 용량 반응에서 Fc 가교 항체의 존재하에 신호전달 분석을 수행하였다.
인간 PBMC를 3x106 세포/ml로 RPMI 완전 배지에 재현탁시키고, 3x105 세포/웰(100 ul)로 플레이팅하고, 2시간 동안 휴지시켰다. 별도의 96-웰 플레이트에서, 최고 농도의 Proleukin, GFTX3b_IL-2-H1-D49A 및 GFTX3b_IL-2-H1-D49A + 몰 과량의 염소 F(ab')2 항-인간 IgG, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG 단독(Southern Biotech Cat#2042-01, Lot#J1715-PI77) 및 적정 곡선을 배지에서 2X 최종 농도로 제조하였다. 모든 조건에서, IL2 당량의 최고 농도는 200nM이었다. 최고 농도를 제조하고, 10-pt 희석 곡선을 Proleukin 및 GFTX3b_IL-2-H1-D49A에 대해 최고 농도(내삽 1:2 희석) 미만으로 제조하였다. 추가로, 200 nM에서 GFTX3b_IL-2-H1-D49A 최고 농도(등가 IL-2) 및 0.5x, 1x, 2.5x, 5x 및 10x GFTX3b_IL-2-H1-D49A에서 사망률을 기준으로 항-인간 IgG에 의해 적정 곡선을 작성하였다. 각 조건에 대한 최고 농도 미만으로 10-pt, 1:10 희석 곡선을 작성하였다. 항-인간 IgG + GFTX3b_IL-2-H1-D49A 적정을 제조하고, PBMC에 첨가하기 전에 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
제조된 조건(또는 배지 단독)을 100 ul/웰의 최종 부피로 PBMC에 첨가하였다. PBMC를 37℃, 5% CO2에서 25분 동안 자극시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 신속하게 고정시키고, 바코딩되도록 처리하고, 표면에 대해 염색하고, pSTAT5 및 Foxp3에 대해 침투시키고 염색하였다. 세포를 Cytof 상에서 판독하고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 가교제 항-인간 IgG 항체의 농도 증가는 GFTX3b_IL-2-H1-D49A의 선택적 활성을 방해하지 않는다(도 18).
실시예 18: 상이한 자가면역 환자에서 보존된 선택적 신호전달
자가면역 환자(Hemacare Corp) 세포로부터의 인간 PBMC를 무혈청 시험 배지에 놓고 각 웰에 첨가하였다. 별도의 플레이트에서, 최고 농도의 Proleukin 또는 GFTX3b_IL-2-H1-D49A를 제조하고, 적정 곡선을 배지에서 4배 최종 농도로 작성하였다. 최고 농도(200nM의 IL-2 당량)를 제조하고, 4-pt 희석 곡선(또는 AD의 경우 10 pt)를 GFTX3b_IL-2-H1-D49A 또는 천연 인간 IL-2(Proleukin)의 최고 농도 미만으로 작성하였다. 제조된 조건을 웰에 첨가하고, 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 25분 후, 세포를 고정시키고, 표면 마커로 염색하고, 제조업체의 지시에 따라 Cytof(Fluidigm의 모든 항체)에서 수집하기 위해, 세포내 항체(pSTAT5, Foxp3)로 투과시키고 염색하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
GFTX3b_IL-2-H1-D49A는 제1형 당뇨병, SLE, 백반증 및 아토피성 피부염을 포함하는 몇몇 시험된 자가면역 적응증에서 CD4 Tcon 및 CD8 Teff에 대한 Treg에 대해 선택적이었다(도 19). IL-2R 신호전달의 효능은 Tcon 및 Teff에서 감소되었지만 시험관내에서 Treg는 감소되지 않았다.
실시예 19: 인간 PBMC에서 T 효과기 세포에 대한 Treg에서의 신호전달에 대한 선택성
PBMC 세포를 RPMI 배지에 놓고, 각 웰에 첨가하였다. IL-2 생착편 D49A 또는 천연 인간 IL-2를 웰에 첨가하고 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 25분 후, 세포를 1.6% 포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 표면 마커로 염색하였다. 실온에서 30분 후, 샘플을 세척하고, 재현탁된 세포 펠렛을 -20℃ 메탄올로 투과시키고, 세척하고 STAT5 및 DNA 인터칼레이터로 염색하였다. 세포를 Cytof 상에서 실행시키고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
GFTX3b_IL-2D49A는 등몰 농도의 IL-2에서 T 효과기에 대한 Treg에서 신호전달을 위해 Proleukin에 비해 높은 특이성을 나타냈다(도 20).
본 명세서에 기술된 실시예 및 실시형태는 설명의 목적을 위한 것이며, 그에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제시될 것이며, 본원의 정신 및 범위 및 본 발명의 범위 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공보, 서열 수탁 번호, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> ANTIBODY-CYTOKINE ENGRAFTED PROTEINS AND METHODS OF USE FOR IMMUNE RELATED DISORDERS <130> PAT056491-WO-PCT <140> <141> <150> 62/510,514 <151> 2017-05-24 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 822 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60 caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120 tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180 gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 240 taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 300 actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 360 cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 420 attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 480 taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 540 acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 600 gtttgctacc 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Ile Leu Asn Gly 20 25 30 Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys 35 40 45 Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu 50 55 60 Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser 65 70 75 80 Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val 85 90 95 Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr 100 105 110 Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr 115 120 125 Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Tyr Pro Phe Thr 130 135 140 <210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 108 Gln Leu Ser Val Gly Tyr 1 5 <210> 109 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 109 Asp Thr Ser 1 <210> 110 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 113 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Ala Pro Thr Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 100 105 110 Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu 115 120 125 Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 130 135 140 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu 145 150 155 160 Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp 165 170 175 Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 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cctacagcct gagcagcacc ctgaccctga gcaaggccga ctacgagaag 960 cataaggtgt acgcctgcga ggtgacccac cagggcctgt ccagccccgt gaccaagagc 1020 ttcaacaggg gcgagtgc 1038 <210> 115 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(11) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(17) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(23) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(29) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(41) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> 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Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala 50 55 60 <210> 117 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(21) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(43) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(54) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(65) <223> /note="This region may encompass 0-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(76) <223> /note="This region may encompass 0-10 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Gly Gly Ala 100 105 110 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 120 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 121 His His His His His His 1 5

Claims (46)

  1. 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질:
    (a) 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    (b) LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (c) 상기 HCDR1에 생착된 인터루킨 2(IL2) 분자,
    여기서 항체 사이토카인 생착된 단백질은 하기를 포함한다:
    (i) (a) 서열 번호:17의 HCDR1, (b) 서열 번호:18의 HCDR2, (c) 서열 번호:19의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (d) 서열 번호:30의 LCDR1, (e) 서열 번호:31의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:32의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (ii) (a) 서열 번호:43의 HCDR1, (b) 서열 번호:44의 HCDR2, (c) 서열 번호:45의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호:56의 LCDR1, (e) 서열 번호:57의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호:58의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin® 초과로 Treg 세포 증식을 자극하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin® 미만으로 CD8 T 효과기 세포 증식을 자극하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 사이토카인 생착된 단백질은 천연 IL2 또는 Proleukin®보다 긴 반감기를 갖는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    IgG 부류 항체 중쇄를 추가로 포함하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 IgG 부류 항체 중쇄는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 선택되는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    표적에 대한 CDR의 결합 특이성은 생착된 IL2 분자에 의해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 감소되는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    표적에 대한 CDR의 결합 특이성은 생착된 IL2 분자의 존재하에 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 보유되는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    항체 사이토카인 생착된 단백질의 항체 스캐폴드 부분이 인간화되거나 인간인, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  10. 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질:
    (i) 서열 번호:20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:33을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (ii) 서열 번호:46을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호:59를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    감소된 효과기 기능에 상응하는 변형된 Fc 영역을 추가로 포함하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 변형된 Fc 영역은 D265A, P329A, P329G, N297A, L234A, 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 변형된 Fc 영역은 D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이 조합을 포함하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  14. 서열 번호:17의 HCDR1, 서열 번호:18의 HCDR2, 서열 번호:19의 HCDR3, 서열 번호:30의 LCDR1, 서열 번호:31의 LCDR2, 서열 번호:32의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하며, Proleukin®과 비교할때 NK 세포의 더 적은 확장을 자극하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  15. 서열 번호:43의 HCDR1, 서열 번호:44의 HCDR2, 서열 번호:45의 HCDR3, 서열 번호:56의 LCDR1, 서열 번호:57의 LCDR2, 서열 번호:58의 LCDR3, 돌연변이 D265A/P329A를 함유하는 변형된 Fc 영역을 포함하며, Proleukin®과 비교할때 NK 세포의 더 적은 확장을 자극하는, 항체 사이토카인 생착된 단백질.
  16. 하기를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질을 암호화하는 단리된 핵산:
    (i) 서열 번호:23의 중쇄; 및 서열 번호:36의 경쇄; 또는
    (ii) 서열 번호:49의 중쇄; 및 서열 번호:62의 경쇄.
  17. 단백질의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제16항의 핵산, 및 선택적으로 분비 신호를 포함하는 항체 사이토카인 생착된 단백질의 생산에 적합한 단리된 재조합 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    포유동물 세포주인, 단리된 재조합 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 포유동물 세포주가 CHO 세포주인, 단리된 재조합 숙주 세포.
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