KR102379006B1 - 망막 염증 치료에 사용하기 위한 작용제 - Google Patents

망막 염증 치료에 사용하기 위한 작용제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 망막 염증, 및 더욱 구체적으로, 연령-관련 황반 변성 및 색소성 망막염의 치료에서 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제로서, 상기 작용제는 활성 성분으로서 IL-6 억제제, APOE 억제제 및/또는 Fas 활성제로부터 선택되는 것인, 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.

Description

망막 염증 치료에 사용하기 위한 작용제 {AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF RETINAL INFLAMMATION}
본 발명은 망막 염증, 및 더욱 구체적으로, 연령-관련 황반 변성 및 색소성 망막염의 치료에서 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서 법적 맹의 주된 원인이자, 가장 흔한 노인성 눈 장애이다. AMD는 눈 황반 부위 중 신경상피의 변성을 특징으로 한다. 두 가지 주된 진행형 형태의 AMD: 신생혈관 AMD 및 위축성 AMD가 구별될 수 있다.
"삼출성" 또는 "습성(wet)" AMD로도 또한 지칭되는 신생혈관 AMD는 "맥락막 신생혈관" 또는 "CNV"로도 또한 지칭되는 현상인, 비정상적인 맥락막 (또는 가끔 망막) 혈관의 침습 및 망막 내로의 액 누출을 특징으로 한다. 신생혈관 AMD는 선진 공업국 노인들 사이에서 실명의 주된 원인이며, 여러 치료법이 개발되었고, 특히, 혈관신생 및 혈관투과성의 강력한 자극제인 VEGFA를 표적하는 요법을 통하여 치료받는 환자의 임상적 상황을 개선시키는 것으로 나타났다.
"지도형 위축(geographic atrophy)" 또는 "GA," "말기 건성" AMD 또는 "건성" AMD로도 또한 지칭되는 위축성 AMD는 황반 부위를 이환시키며, 여기서, 망막 색소침착 상피는 큰 전면생장(large confluent) 영역의 자발적 변성으로 인하여 더 이상 광수용체 기능을 지원할 수가 없다. 위축성 AMD 및 신생혈관 AMD의 발생률은 유사하지만, 위축성 병변의 확장 및 관련된 시력 장애 과정은 좀 더 느리다. 현재까지는 주로 적합한 분자 표적의 확인 부족으로 인하여, 지도형 위축을 예방하거나, 치유하기 위한 것으로 현재 승인을 받은 이용가능한 요법은 없다. 일부 연구에서는 비타민 E 및 C, 베타카로테노이드 및 아연 섭취가 위축성 DMLA 발생을 저속화시킬 수 있지만, 불행하게도 상기 질환의 진행은 중단되지 못한다는 것이 입증되었다.
망막 색소침착 상피와 광수용체 외절 사이의 망막하 공간은 면역억제성 망막 색소침착 상피 신호에 의해 매개되는 면역 특권 구역이라는 것이 여러 연구를 통하여 확립되었다. 그럼에도 불구하고, 시력을 위협하는 진행형 형태의 AMD: 즉, CNV 및 지도형 위축에서는 망막하 공간에 (미세아교세포, 단핵구 및 대식세포를 포함하는 세포 패밀리를 포함하는) 단핵성 포식세포가 축적되는 것으로 나타났다. 미세아교세포의 망막하 이동은 시각적 부산물을 제거하는 데, 및 시력을 유지하는 데 필요한 것으로 보이는 반면, 망막하 공간에의 대식세포의 축적 뿐만 아니라, 상기 시각적 부산물의 축적은 가능하게는 AMD 발생에 관여하는 파괴적 염증을 유발하는 것으로 주장되었다 (문헌 [Gupta et al., 2003], 및 [Kohno et al., 2013]).
추가로, AMD를 앓는 환자의 혈청 중에서는 염증 매개인자 단백질, 예컨대, 인터루킨 6 (IL-6)의 수준이 증가되어 있는 것으로 측정되었다 (문헌 [Klein et al., 2008], 및 [Seddon et al., 2005]). 그럼에도 불구하고, 이러한 연구들은 AMD, 및 더욱 구체적으로, 위축성 AMD를 예방 및/또는 치료하기 위한 특이적인 분자 표적을 확인하거나, 또는 심지어는 제안하는 데에도 실패하였다. EP 1　990　060은 신생혈관 형태의 AMD를 치료하기 위한 IL-6 길항제의 용도를 개시한 반면, 상기 문헌에는 IL-6 길항제가 위축성 형태의 AMD를 앓는 환자에 대해서 어떤 유익한 효과를 발휘할 수도 있다는 명시도, 제안도 포함하지 않고 있다. 추가로, WO2004/045507에는, 예컨대, 예를 들어, 습성 AMD와 같은, 병적 혈관신생과 관련된 질환이 맥락막 신생혈관의 비정상적인 발생을 특징으로 하는 바, 상기 병적 혈관신생과 관련된 질환/병태, 예컨대, 예를 들어, 습성 AMD를 치료하기 위한 IL-6 길항제의 용도가 개시되어 있다. 건성 AMD는 신생혈관 결핍 또는 비정상에 의존하지 않기 때문에, WO2004/045507은 건성 AMD 치료를 기술하는 것으로는 결코 간주될 수 없다. 유사하게, EP2116530에는 IL-6 생산에 대하여 억제 활성 및/또는 맥락막 신생혈관에 대하여 억제 효과를 가지는 신규한 피롤 유도체가 개시되어 있으며, 이는 신혈관신생을 포함하지 않는 질환, 예컨대, 건성 AMD의 치료에 관한 것은 결코 아니다.
활성 성분, 예컨대, 이마티닙 메실레이트, 포나티닙, 보수타닙, DAPT 및 벡사로텐을 투여하는 단계를 포함하는 드루젠(drusen) 치료 방법 또한 WO2013/148183에 개시되어 있다. 드루젠은 망막 색소침착 상피와 브루크(Bruch) 막 사이에 축적되는 세포외 침착물이다. 이는 응집된 세포내, 세포외 및 분비된 단백질, 지질 및 세포 성분으로 구성된다. WO2013/148183에 입증되어 있는 바와 같이, APOE가 특히 인간 드루젠의 주요 성분 내의 것에 달한다. WO2013/148183은 상기 열거된 활성 성분으로 세포를 치료하는 것이 그 중에서도 특히 드루젠 중의 APOE 수준을 감소시킨다고 제안하였고, 드루젠 치료와 위축성 AMD 치료 사이의 연관성을 확립하였다. 그럼에도 불구하고, 상기 문헌에서는 시험된 활성 성분의 실제 효과가 드루젠에서 APOE 발현 및 축적에 대하여 수득된다는 것을 실제로 분명하게 입증하는 데에는 실패하였다. 추가로, 상기 문헌에서의 위축성 AMD와 드루젠 사이에 확립된 인과 관계는 상기 분야의 여러 공개 문헌에 의해 명확하게 무효화되었다 (예를 들어, 드루젠은 오직 AMD 발생 위험을 증가시키는 것으로 간주될 수 있지만, 이것이 위축성 AMD의 증상으로서는 결코 간주되서는 안된다는 것을 입증하는 문헌 [Klein et al., 2007] 참조).
그러므로, 이러한 원리들에 비추어 볼 때, 망막 염증, 및 더욱 특히, 위축성 AMD를 예방 및/또는 치료하기 위한 활성 성분을 확인하는 것이 여전히 계속해서 요구되고 있다.
놀랍게도 본 발명자들은 APOE 양의 증가가 IL-6 발현을 유도하고, 이는 결국 세망 색소침착 상피 발현된 FasL을 하향조절한다는 것을 입증하였는 바, 이에 상기 목표는 본 발명에 의해 달성된다. 이어서, 감소된 FasL 발현이 장기간의 망막하 단핵성 포식세포 생존, 연령 의존성 단핵성 포식세포 축적, 및 관련된 광수용체 변성을 가능하게 한다는 것을 입증하였다. 이러한 관찰 결과를 통하여 APOE의 염증유발(pro-inflammatory) 기능이 밝혀졌는데, 상기 기능은 널리 알려져 있는 다른 병적 맥락에서의 그의 항염증성 역할과 완전히 대조를 이루는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 망막 염증, 및 더욱 특히, 건성 AMD 및 색소성 망막염에서 과도한 APOE 및 IL-6을 억제시키는 것이 염증을 예방 및/또는 치료하고, 이로써, 광수용체 변성을 예방한다는 것을 확립하였다.
따라서, 본 발명은 예방제 및/또는 치료제가 활성 성분으로서 IL-6 억제제, APOE 억제제 및/또는 Fas 활성제를 포함하는 것인, 망막 염증 치료에서 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 망막 염증은 위축성 연령-관련 황반 변성 (위축성 AMD) 및 색소성 망막염을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 위축성 연령-관련 황반 변성 (위축성 AMD) 치료에서 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 상기 IL-6 억제제로는 (i) IL-6 활성의 길항제, 예컨대, IL-6을 인식하는 항체, 가용성 IL-6 수용체, 또는 IL-6 번역 억제제, 또는 (ii) IL-6 수용체의 길항제, 예컨대, IL-6R을 인식하는 항체 또는 IL-6R 결합 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 상기 APOE 억제제로는 APOE에 대한 항체, APOE 번역의 억제제 또는 가용성 APOE 수용체 또는 그의 기능성 단편을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 Fas 활성제는 Fas 효능제, 예컨대, FasL 또는 그의 기능성 단편, 또는 FasL-모방 펩티드를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 예방제 및/또는 치료제는 유리체내로 전달된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 예방제 및/또는 치료제는 각각 5 mg/mL 내지 500 mg/mL의 농도로 IL-6 억제제 및/또는 APOE 억제제를 포함한다.
본 발명은 예방제 및/또는 치료제가 활성 성분으로서 IL-6 억제제, APOE 억제제 및/또는 Fas 활성제를 포함하는 것인, 망막 염증 치료에서 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 의미 내에서, "망막 염증"이란, 단핵성 포식세포에 의해 매개되는 망막하 공간의 염증을 의미한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 망막 염증은 위축성 연령-관련 황반 변성 (위축성 AMD) 및 색소성 망막염을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, "망막 염증"이라는 표현은 위축성 연령-관련 변성 및 색소성 망막염은 포함하나, 맥락막 신생혈관 또는 신생혈관 AMD는 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 예방제 및/또는 치료제는 맥락막 신생혈관이 아닌, 위축성 연령-관련 황반 변성 및 색소성 망막염을 치료하는 데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 상기 예방제 및/또는 치료제는 습성 AMD 및 신생혈관과 관련된 질환을 치료하는 데에는 사용되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 예방제 및/또는 치료제는 위축성 연령-관련 황반 변성을 치료하는 데 사용된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 IL-6 억제제를 포함한다.
IL-6은 "B 세포 자극 인자 2" (BSF2) 또는 인터페론 β2로도 또한 알려져 있는 사이토카인으로서, 이는 그의 특이적인 IL-6 수용체 (80 KDa 단백질)의 결합을 통하여 그의 생물학적 활성을 발휘하는 것으로 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 의미 내에서, "IL-6 억제제"란, IL-6을 직접적으로 억제시키는 데 있어서 또는 그의 IL-6 수용체 (IL-6R) 활성의 억제를 통하여 IL-6 매개 전달 신호를 차단하고, IL-6 생물학적 활성을 억제시키는 물질을 의미한다.
직접적인 IL-6 억제제로는 IL-6 또는 그의 단편에 대한 항체 또는 항체 단편, IL-6이 더 이상 IL-6 수용체에 결합할 수 없는 조건 내에서 IL-6에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 또는 IL-6 유전자 및/또는 전사체에 대한 siRNA 또는 ASO를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 직접적인 IL-6 억제제로는 추가로 IL-6에 결합할 수 있고, 천연 IL-6 수용체와 경쟁할 수 있는 그의 능력을 보존하는 가용성 IL-6 수용체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
IL-6 수용체의 억제제로는 IL-6 수용체 또는 그의 단편에 대한 항체, IL-6 수용체에 결합할 수 있고/거나, IL-6 수용체에의 결합에 대하여 IL-6과 경쟁할 수 있는 그의 능력은 보존하지만, IL-6 수용체의 결합을 통하여 신호 전달을 촉진시킬 수 있는 IL-6의 능력은 상실한 IL-6 변이체, IL-6 단편 또는 IL-6 펩티도미메틱 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IL-6 수용체의 억제제로는 추가로 유전자, 및/또는 IL-6 수용체 유전자의 전사체에 대한 siRNA 또는 ASO를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 IL-6에 대한 항체로는 바람직하게 MH166 항체 (문헌 [Matsuda, T. et al., 1988]), SK2 항체 또는 그의 인간화된 유도체 (문헌 [Sato et al. 1996]), 실투맙(Siltumab) (얀센 리서치(Jansson Research)),　아비머(Avimer) TM　C326 (아비디아(Avidia)), 시루쿠맙(Sirukumab) 및 실툭시맙(Siltuximab) (센토코르 인크.(Centocor Inc.)), 올로키주맙(Olokizumab) (UVB 인크.(UVB Inc.)), ALD518 (브리스톨 마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)), VX30 (박시넥스(Vaxinex)), ARGX-109 (arGen-X BV) 및 FM101 (펨타 파마슈티칼즈(Femta Pharmaceuticals))을 포함한다. 바람직하게, 항-IL-6 항체 MAB 406은 본 발명에서 사용하기 위한 것으로 고려된다 (문헌 [Ma et al. 2011]).
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 IL-6 수용체에 대한 항체로는 바람직하게 MR16-1 항체 (문헌 [Tamura, T. et al., 1993]); PM-1 항체 (문헌 [Hirata et al., 1989]); AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 및 AUK146-15 항체 (WO92/19759)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 IL-6 변이체로는 바람직하게 문헌 [Brakenhoff et al., 1994], [Savino et al. 1994], WO 96/18648 및 WO 96/17869에 기술되어 있는 것 뿐만 아니라, 상품명 사릴루맙(Sarilumab) (리제네론(Regeneron)), 토실리주맙(Tocilizumab) (추가이(Chugai), 로슈(Roche)) 및 FE301 (코나리스(Conaris)/페링(Ferring)) 하에 공지되어 있는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드로는 JP-A (고카이(Kokai)) H02-188600, JP-A (고카이) H07-324097, JP-A (고카이) H08-311098, 및 US5210075에 기술되어 있는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 가용성 IL-6 수용체는 바람직하게 본질적으로 세포막 결합 IL-6 수용체의 세포외 영역으로 이루어지고, 상기 것에는 막횡단 및 세포내 영역이 결여되어 있다는 점에서 세포막 결합 IL-6 수용체와 다르다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 APOE 억제제를 포함한다.
아포지질단백질 E (또는 "ApoE")는 트리글리세리드가 풍부한 지질단백질 구성 성분의 정상적인 이화작용에 필수적인 킬로미크론 및 중간 밀도 지질단백질 (IDL)에서 발견되는, 길이가 299개의 아미노산 길이인 아포지질단백질 부류이다. ApoE는 다형성이며: 서로 단 하나 또는 2개의 아미노산이 다른, 3가지 주요 이소형(isoform), 즉, APOE2, APOE3 및 APOE4가 확인되어 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 차이는 APOE 구조 및 기능, 둘 모두를 변경시키는 것으로 보인다.
따라서, 본 발명의 의미 내에서, "APOE 억제제"란, APOE를 직접적으로 억제시키는 데 있어서 또는 수용체를 통한, 또는 수용체에 위치하는 콜레스테롤이 풍부한 지질 뗏목과의 그의 상호작용을 통한 그의 활성 억제를 통하여 APOE 생물학적 활성을 억제시키는 물질을 의미한다.
직접적인 APOE 억제제로는 APOE 또는 그의 단편에 대한 항체, APOE가 더 이상 지질 (예컨대, 콜레스테롤) 및/또는 APOE 수용체에 결합할 수 없는 조건 내에서 APOE에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 또는 APOE 유전자 및/또는 전사체에 대한 siRNA 또는 ASO를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 직접적인 APOE 억제제로는 추가로 APOE에 결합할 수 있고, 천연 APOE 수용체와 또는 지질에 결합할 수 있는 그의 능력과 경쟁할 수 있는 그의 능력을 보존하는 가용성 APOE 수용체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
APOE 수용체의 억제제로는 APOE 수용체 또는 그의 단편에 대한 항체, APOE 수용체에 결합할 수 있고/거나, 지질 및/또는 APOE 수용체에의 결합에 대하여 APOE와 경쟁할 수 있는 그의 능력은 보존하지만, APOE 수용체 결합을 통하여 신호 전달을 촉진시킬 수 있는 그의 능력은 상실한 APOE 변이체, APOE 단편 또는 APOE 펩티도미메틱 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. APOE 수용체의 억제제로는 추가로 유전자, 및/또는 APOE 수용체 유전자의 전사체에 대한 siRNA 또는 ASO를 포함할 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, "APOE"란, APOE의 이소형 전체 또는 그 일부, 즉, APOE2, APOE3 및 APOE4로 이루어진 군에서 선택되는 APOE 이소형 중 적어도 1개, 바람직하게, 적어도 2개, 더욱더 바람직하게, 적어도 3개의 것을 의미한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 APOE 억제제는 항-APOE 항체, 예컨대, AB947 (밀리포어(Millipore)), NB110-60531 (노부스 바이오로지칼즈(Novus Biologicals)), LS-B6780/43356　(라이프스팬 바이오사이언스(Lifespan Bioscience)) 및 EP1373Y　(에피토믹스(Epitomics))이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 APOE4-특이 항체로는 바람직하게 상품명 ApoE4 안티바디(Antibody) (바이오비전(BioVision), 아포리포프로테인(Apolipoprotein) E4 항체 (MBL 인터내셔널(MBL International)), Apo-E4 (5G7) 모노클로날 항체 (코반스(Covance)), Apo-E4 (9D11) 모노클로날 항체 (코반스), 및 ApoE4 (5B5) 항-인간 마우스 IgG MoAb (IBL-아메리카(IBL-America)(이뮤노-바이오로지컬 라보라토리즈(Immuno-Bio logical Laboratories))) 하에 상업적으로 이용가능한 것을 포함한다.
추가로, 본 발명의 특정 실시양태에서, APOE 억제제는 LDL에 대한 가용성 수용체 (LDLR), 예컨대, 재조합 인간 LDL R 2148-LD/CF (R&D 시스템즈(R&D SYSTEMS))이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 Fas 활성제를 포함한다.
Fas는 FAS 수용체 (또는 FasR)로서, 아포프토시스 항원 1 (APO-1 또는 APT)로서, 분화 클러스터 95 (CD95) 또는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리구성원 6 (TNFRSF6)으로도 또한 알려져 있으며, 세포 표면 상에 위치하는 세포 사멸 수용체에 상응하며, 활성화시, 프로그램화된 세포 사멸 (아포프토시스)을 유발할 수 있다. Fas 리간드 (FasL)의 결합을 통한 Fas의 활성화는 특히 사멸 유도 신호전달 복합체 (DISC)의 형성을 유도한다.
본 발명의 의미 내에서, "Fas 활성제"란, Fas 생물학적 활성을 활성화시킬 수 있는, 예컨대, 아포프토시스 경로의 개시를 유도할 수 있는 물질을 의미한다.
Fas 활성제로는 Fas에 결합할 수 있고, DISC의 형성을 활성화시킬 수 있는 단백질 및 펩티드 뿐만 아니라, Fas에 결합할 수 있고, 상응하는 세포의 아포프토시스를 유발할 수 있는 FasL의 능력을 유지하는 FasL 변이체, 단편 또는 펩티도미메틱스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 Fas 활성제로는 FasL 리간드 또는 그의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 Fas 활성제로는 바람직하게, 잠재적으로 아포프토시스 유발성 및 항신생물성 활성을 가지는 인간 아디포넥틴의 이량체 형성 콜라겐 도메인에 융합된, 3개의 인간 Fas 수용체 (Fas L) 세포외 도메인으로 이루어진 재조합, 가용성, 육량체 융합 단백질인 Fas 수용체 효능제 APOO10 (토포타겟(TopoTarget: 덴마트 코펜하겐))를 포함한다. Fas 수용체 효능제 APOOlO는 Fas 수용체를 활성화시켜 감수성인 종양 세포 집단에서 카스파제 의존성 아포프토시스를 유발한다 (문헌 [Verbrugge et al., 2009]). 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 Fas 활성제로는 바람직하게 Fas 효능제 메가 FasL(Mega FasL) (아디포겐(AdipoGen))을 포함한다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 Fas 활성제로는 US6,001,962 및 US6,846,637에 개시된 Fas 효능제 펩티드를 포함한다.
본 발명의 의미 내에서, "항체 단편"이란, 항체로부터 수득된 임의의 결합 단백질을 의미하며, 이는 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 단편 뿐만 아니라, H 및 L 쇄 상의 Fv가 적절한 링커를 통해 연결되어 있는 것인 단일 쇄 Fv (ScFv), 디아바디, 트리아바디, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 테트라바디, 이기능성 하이브리드 항체, 프레임워크 영역, 불변 영역 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 의미 내에서, "siRNA" 또는 "소형 간섭 RNA"란, 약 15개 내지 약 50개의 염기쌍, 예를 들어, 약 21개 내지 약 25개의 염기쌍을 함유하고, 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA와 동일하거나, 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 이중 가닥 구조를 의미한다. siRNA는 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 상호작용에 의해 함께 어닐링된 센스 RNA 가닥 및 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. 센스 가닥은 표적 miRNA 분자 내에 함유되어 있는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 표적 mRNA 내에 함유되어 있는 표적 서열과 "실질적으로 동일"하다는 것은 핵산 서열이 약 3% 이하만큼 표적 서열과 상이하다는 것을 의미한다. siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 2개의 상보적인, 단일 가닥 RNA 분자를 포함할 수 있거나, 또는 2개의 상보적인 부분이 염기쌍을 형성하고, 단일 가닥 "헤어핀" 영역에 의해 공유적으로 연결되어 있는 단일 분자를 포함할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 생물학적으로 제조될 수 있거나, 또는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 통해 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, "안티센스 올리고뉴클레오티드" ("ASO")란, 표적 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 포함하는 작은 데옥시-올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기쌍 형성을 통해 표적 mRNA에 결합하고, 이중 가닥 RNA를 분해하는 효소인 RN아제 H의 결합을 유인함으로써 표적 mRNA를 파괴시킨다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 안구내로 전달된다. 본 발명의 의미 내에서, "안구내 투여"란, 작용제 (agent)를 눈 내부로 직접 주사하는 것을 의미하며, 여기서, 안구 내부란, 안구 내에 위치하는 임의의 부위를 의미하며, 이는 일반적으로 안구 내에서 관찰되는 임의의 기능성 (예컨대, 시력 기능), 또는 구조 조직, 또는 안구 내부에 부분적으로 또는 완전하게 막을 형성하는 조직 또는 세포 층을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 부위의 구체적인 예로는 전방, 후방, 유리체강, 맥락막, 황반, 및 망막, 및 안구 후부 영역 또는 부위에서 혈관을 신생시키거나, 또는 신경을 분포시키는 혈관 및 신경을 포함한다. 한 실시양태에서, 눈의 내부란, 후방, 유리체강, 맥락막, 황반, 및 망막, 및 안구 후부 영역 또는 부위에서 혈관을 신생시키거나, 또는 신경을 분포시키는 혈관 및 신경을 비롯한, 눈의 후안부를 의미한다. 상기 실시양태에 따라, 안구내 투여란, 눈의 후안부 내에, 바람직하게, 유리체 내에 투여하는 것을 의미하고, 안구내 투여는 바람직하게 유리체내 주사이다.
또 다른 실시양태에 따라, 투여 경로는 국소 안구 투여, 예컨대, 예를 들어, 점안제 투여, 또는 본 발명의 조성물 또는 부품의 키트를 포함하는 안과용 액제 중에서의 눈 세정에 의한 투여일 수 있다.
한 실시양태에 따라, 예방제 및/또는 치료제는 바람직하게, 액제(solution), 예컨대, 예를 들어, 멸균 수성 액제, 분산제, 에멀젼, 현탁제, 사용 전 액체 첨가시 액제 또는 현탁제를 제조하는 데 적합한 고체 형태, 예컨대, 예를 들어, 분말, 리포좀 형태 등을 포함하는 군으로부터 선택되는, 주사용으로 적합화된 형태로 제제화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 각각 5 mg/mL 내지 500 mg/mL, 5 mg/mL 내지 100 mg/mL, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도로 IL-6 억제제 및/또는 APOE 억제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 각각 1 ㎍/mL 내지 1mg/mL, 1 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL의 농도로 IL-6 억제제 및/또는 APOE 억제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 예방제 및/또는 치료제는 각각 1 내지 10 ㎍/mL의 인간 안구내 액체, 바람직하게 5 ㎍/mL의 인간 안구내 액체인 농도로 IL-6 억제제 및/또는 APOE 억제제를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 2개월 및 12개월된 C57BL/6 및 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 눈에서의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, β- 액틴 mRNA로 정규화된, ApoE mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=6, * 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test: MWt) 12개월 p=0.0043).
도 2는 2개월 및 12개월된 C57BL/6J, Cx3cr1 GFP / GFP, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/-, 및 ApoE -/- 마우스에서의 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포(MP)의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=10-22, * 일원 ANOVA 본페로니(Bonnferoni) 다중 비교 검정 (ANOVAB) Cx3cr1 GFP / GFP 대 임의의 다른 군 (12개월) p<0.0001).
도 3은 12개월된 C57BL/6J, Cx3cr1 GFP / GFP, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/-, 및 ApoE -/- 마우스에서의 시신경 (0 ㎛)으로부터의 거리 증가에 따른 (-3,000 ㎛: 하위 극, +3,000 ㎛: 상위 극) 광수용체 핵 열을 보여주는 그래프이다.
도 4는 2 및 12개월된 C57BL/6J, Cx3cr1 GFP / GFP, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/-, 및 ApoE -/- 마우스에서의 광수용체 핵 열 계수의 곡선하 면적의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n=7-12, * MWt Cx3cr1 GFP / GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- p=0.026; *ANOVAB Cx3cr1 GFP/GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- (12개월) p<0.0001).
도 5는 대조군 조건하에서 및 오버레잉 망막 외식편의 POS와 접촉한 상태로 24h 동안 배양된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP BMM의, 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 ApoE mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=4, * + 망막 외식편 (+R) 군 사이의 MWt p=0.0286).
도 6은 대조군 조건하에서 및 CX3CL1과 함께 24h 동안 배양된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP/GFP PEM의, 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 ApoE mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=4, * CX3CL1을 포함, 및 포함하지 않는 것 사이의 MWt WT p=0.0286; ‡ MWt CX3CL1 군 p=0.028).
도 7은 24h째에 CX3CL1에 노출된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP PEM으로부터의 등가량의 상청액 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 성체 뇌로부터 새로 추출된, C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP FACS로 분류된 미세아교세포 (MC)의, 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 ApoE mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 9는 CFSE+ TPC의 망막하 주사 후 다른 시점에서의 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n=6, *일원(one-way) ANOVA 던넷(Dunnett's) 다중 비교 검정 (ANOVAD) 각 군 대 12 h 군 p<0.0001).
도 10은 Cx3cr1GFP / GFP CFSE+TPC의 주사 후 24h째에 제조된 눈 세포 현탁액의 SSC-A/CFSE 및 CD11b/F4/80 게이팅형 분석, 및 C57BL/6J 및 Cx3cr1GFP / GFP TPC의 C57BL/6J로의 주사 후 24h째의 눈 세포 현탁액의 세포분석 정량화의 대표적인 세포분석법 영상을 보여주는 사진이다 (군당 n=16-20, * MWt p=0.0024).
도 11은 C57BL/6J, Cx3cr1 GFP / GFP, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/-, 및 ApoE -/- 마우스로부터의 CFSE+ TPC를 C57BL/6J 마우스 내로 망막하 주사한 후 24h째에, 및 C57BL/6J CFSE+ TPC를 C57BL/6J내로 망막하 주사한 후 24h째 및 APOE3을 외부에서 첨가하였을 때의 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본(retinal flatmount) 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도; n=8-20/군, *ANOVAB C57BL/6J 대 Cx3cr1 GFP / GFP 및 Cx3cr1 GFP / GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- p<0.0001; * MWt Cx3cr1 GFP/GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP p=0.0006; ‡ ANOVAD 각 군 대 C57BL/6J p<0.0001).
도 12는 2개월 및 12개월된 C57BL/6 및 Cx3cr1 GFP / GFP 망막 색소 상피/맥락막 총의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, β- 액틴 mRNA로 정규화된 FasL mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=6, * MWt (12개월) p=0.0129).
도 13은 C57BL/6J CFSE+ TPC를 C57BL/6J 및 Fasgld / gld 마우스 내로, 및 Cx3cr1 GFP/GFP 및 Faslpr / lpr TPC를 C57BL/6J 마우스 내로 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n=11-20/군, *ANOVAD 모든 군 대 C57BL/6J 마우스 내로의 C57BL/6J TPC 주사군 p<0.0001).
도 14는 LPS (25 ng/mL)와 함께 또는 그를 포함하지 않고, 지질 무함유 APOA-I (5 ㎍/mL; 8h), APOE3 (5 ㎍/mL; 8, 24h) 및 열 변성된 APOE3 (dAPOE3, 5 ㎍/mL; 24h)과 함께 인큐베이션된 C57BL/6J 휴지 복막 대식세포로부터의 상청액의 마우스 IL-6 ELISA의 결과를 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=4, MWt: *8h APOA-I/LPS 및 APOE/LPS 대 LPS p=0.0284; *8h APOA-I 및 APOE 대 CTL p=0.0284; #24h APOE 대 CTL p=0.005; ‡24h dAPOE3 대 APOE3 군 p=0.0022).
도 15는 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP, 및 CXCL1과 함께 24h 동안 배양된 Cx3cr1 GFP/GFP ApoE -/- PEM의, 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 IL-6 mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (n=5/군, MWt: * C57BL/6J 대 Cx3cr1 GFP/GFP p=0.0159; ‡ Cx3cr1 GFP / GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- p=0.0079).
도 16은 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP, 및 CXCL1과 함께 24h 동안 배양된 Cx3cr1 GFP/GFP ApoE -/- PEM의 상청액의 마우스 IL-6 ELISA 수준의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (n=5/군, MWt: * C57 대 Cx3cr1 GFP / GFP p=0.0159; ‡ Cx3cr1 GFP / GFP 대 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- p=0.0079).
도 17은 C57BL/6J 또는 Cx3cr1 GFP / GFP TPC의 망막하 주사 후 3h째에 12개월된 C57BL/6J 망막 색소 상피/맥락막 총의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, β- 액틴 mRNA로 정규화된 FasL mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (n=7-9/군, * MWt (12개월) p=0.0129).
도 18은 IL-6 및 APOE3의 망막하 주사 후 3h째에 12개월된 C57BL/6J 망막 색소 상피/맥락막 총의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, β- 액틴 mRNA로 정규화된 FasL mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 각각 50 ㎍/mL 및 10 μm; n=17-21/군, * MWt IL-6 대 대조군 (CTL) p=0.0148).
도 19는 IL-6과 함께, 또는 그를 포함하지 않고, C57BL/6J CFSE+ TPC를 C57BL/6J 내로 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 50 ng/mL; n=7-12/군, * MWt p<0.0001).
도 20은 대조군-, 또는 항-IL-6 항체와 함께 Cx3cr1 GFP / GFP CFSE+ TPC를 C57BL/6J 내로 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 50 ㎍/mL; n=8-12/군, * MWt p=0.0036).
도 21은 Fas 효능제 메가FasL(MegaFasL)와 함께, 또는 그를 포함하지 않고 Cx3cr1 GFP/GFP CFSE+ TPC를 C57BL/6J 내로 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 10 ng/mL; n=7-8/군, * MWt p=0.014).
도 22a는 CX3CL1과 함께 24h 동안 배양된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP PEM의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 FAS mRNA 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=4).
도 22b는 메가FasL (10 ng/mL) 및 스타우로스포린(Staurosporin)과 함께 24h 동안 배양된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP / GFP PEM의 TUNEL+ 정량화에 의한 아포프토시스 세포 사멸 수준을 보여주는 히스토그램이다 (대조군에 대한 상대적인 비율(%)로 표시).
도 23은 24h 배양된 BMM, 대식세포 및 PEM에 대한 트랜스제닉 인간화된 APOε3, APOε2 및 APOε4의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 ApoE mRNA 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=6, BMM * MWt ε2 대 ε3 p=0.0047; 상주 대식세포 * MWt ε2 대 ε3 p=0.0022).
도 24는 POS와 함께, 및 그를 포함하지 않고, 3일 (3d) 배양된 BMM에서의 트랜스제닉 인간화된 APOε3, APOε2 및 APOε4의 정량적 RT-PCR에 의해 측정되고, S26 mRNA로 정규화된 ApoE mRNA 수준을 보여주는 히스토그램이다 (군당 n=6, BMM * MWt ε2 대 ε3 p=0.0022).
도 25는 인간화된 APOε3, APOε2 및 APOε4 대식세포로부터의 24h 상청액의 인간 APOE ELISA의 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=6, * MWt ε2 대 ε3 p=0.0041).
도 26은 대조군 조건에서, 또는 APOE3, APOE2, APOE4와 함께 24h 동안 배양되었을 때 C57BL/6J 대식세포의 상청액의 마우스 IL-6 ELISA의 결과를 보여주는 히스토그램이다 (5 ㎍/mL, n=10-12, * MWt CTL 대 APOE3 p<0.001; ‡ MWt CTL 대 APOE2 p<0.0001).
도 27은 APOε3, APOε2 및 APOε4 마우스로부터의 대식세포의 상청액에 관한 마우스 IL-6 ELISA의 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=12/군, * MWt ε2 대 ε3 p<0.0001).
도 28은 APOε3, APOε2 및 APOε4 마우스로부터의 CFSE 염색된 RPC를 C57BL/6J 마우스의 눈으로 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=8-12/군, * MWt p<0.0001).
도 29는 APOε2 CFSE+ RPC로부터의 CFSE 염색된 RPC를 대조군, 또는 항-IL-6 항체 (n=16-20/군, * MWt p=0.0024)와 함께, 및 메가FasL과 함께 또는 그를 포함하지 않고 (n=7-12/군, * MWt p=0.015) 망막하 주사한 후 24h째에 망막 색소 상피 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다.
도 30은 2개월 및 12개월된 APOε3, APOε2 및 APOε4 마우스에서의 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=12/군, *ANOVAB ε2 대 ε3 및 ε4 (12개월) p<0.003).
도 31a는 12개월된 APOε3, APOε2 및 APOε4 마우스에서의 시신경 (0 ㎛)으로부터의 거리 증가에 따른 (-3,000 ㎛: 하위 극, +3,000 ㎛: 상위 극) 광수용체 핵 열을 보여주는 그래프이다.
도 31b는 2 및 12개월된 APOε3, APOε2 및 APOε4 마우스에서의 광수용체 핵 열 계수의 곡선하 면적의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=6, * MWt ε2 대 ε3 at 12개월 p=0.016; *ANOVAB ε2는 ε3 및 ε4 마우스와 상이하다 (12개월) (p=0.0029)).
도 32는 2m- (좌측) 및 12m- (우측)된, 명시된 계통(strain)의 C57BL/6J (WT), Cx3cr1GFP / GFP, Cx3cr1GFP / GFPApoE-/- 및 ApoE-/- 마우스에서의 망막하 IBA-1+ MP의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=10-25/군 ANOVA/던넷 검정: Cx3cr1GFP / GFP 대 임의의 다른 군 * p<0.0001; Cx3cr1GFP / GFP 대 Cx3cr1GFP / GFPApoE-/-의 만 & 휘트니 t 검정(만-휘트니 U 검정) * p<0.0001).
도 33은 C57BL/6J 및 Cx3cr1GFP / GFPCSFE+ Mφ의 망막하 주사 후 상이한 시점에서의 CSFE+F4/80+ Mφ의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=5/군 (12h) 및 n=6/군 (이하); 만 & 휘트니 t 검정, * C57BL/6J 대 Cx3cr1GFP / GFP 1d n=20/군 p<0.0001; 2d n=6/군 p=0.0317).
도 34는 C57BL/6J 및 Cx3cr1GFP / GFP 마우스로부터의 CSFE+ 자기-비드-분류된 골수 유래 단핵구 (Mo)의 C57BL/6J 마우스 내로 망막하 주사한 후 24h째에 RPE 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CSFE+ 세포의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=8-12/군; 만 & 휘트니 t 검정: p=0.0006).
도 35는 C57BL/6J 및 Cx3cr1GFP / GFP 마우스로부터의 CSFE+CD11bFACS로 분류된 뇌 MC의 C57BL/6J 마우스 내로 망막하 주사한 후 24h째에 RPE 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CSFE+ 세포의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=9-12/군; 만 & 휘트니 t 검정: p=0.0087).
도 36은 C57BL/6J CSFE+ Mφ의 C57BL/6J 내로 망막하 주사한 후 24h째, 및 1, 10 또는 100 ㎍/mL의 계산된 안구내 농도로 APOE3을 외부에서 첨가하였을 때의 RPE 및 망막 편평 표본 상에서의 망막하 CSFE+F4/80+ Mφ의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=6-7/군; 일원 ANOVA/던넷 검정: C57BL/6J 대 10 ㎍ p=0.0488; C57BL/6J 대 100 ㎍ p=0.006. 만 & 휘트니 t 검정: C57BL/6J 대 10 ㎍ p=0.0012; C57BL/6J 대 100 ㎍ p=0.0013).
도 37은 대조군 (좌측) 및 4일 광-챌린지된(light-challenge) (우측) 2m된 명시된 계통의 마우스에서의 망막하 IBA-1+ MP의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=6-10/군 ANOVA/던넷 검정 (4d 광-챌린지): C57BL/6J 대 FasLgld / gld 및 C57BL/6J 대 Faslpr / lpr 둘 모두 * p<0.0001; 만 & 휘트니 t 검정 (4d 광-챌린지): C57BL/6J 대 FasLgld / gld *p<0.0001; C57BL/6J 대 Faslpr / lpr *p<0.0001).
도 38은 24h 동안 배양된 명시된 유전자형 (C57BL/6J, Cx3cr1GFP / GFP, Cx3cr1GFP/GFPApoE-/- 및 ApoE-/-)의 Mo 및 Mφ의 시험관내 메가FasL 유도성 아포프토시스의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다. TUNEL+ 정량화는 메가FasL에 노출되지 않은 대조군에 대한 상대적인 비율(%)로서 표시되어 있다.
도 39는 대조군 배지, 지질 무함유 APOE3 (5 ㎍/mL), APOE3 (5 ㎍/mL) 및 폴리믹신 B (25 ㎍/mL), 열 변성된 APOE3 (dAPOE3, 5 ㎍/mL), APOE3 (5 ㎍/mL) 및 래트 IgG1 이소형 대조군 (IgG1, 100 ㎍/mL) 또는 APOE3 (5 ㎍/mL) 및 래트 항-CD14 항체 (aCD14 Ab, 100 ㎍/mL)에서 24h 동안 인큐베이션된 C57BL/6J 복막 Mφ로부터의 상청액의 마우스 IL-6 ELISA의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=5-6/군; 일원 ANOVA/본페로니 다중 비교 검정: *APOE3 대 CTL p<0.0001; # dAPOE3 대 APOE p<0.0001; APOE3 IgG 대 CTL p<0.0001; APOE3 IgG 대 APOE3 aCD14 Ab p<0.0001. 만 & 휘트니 t 검정: *APOE3 대 CTL p=0.0043; # dAPOE3 대 APOE3 p=0.0117; APOE3 IgG 대 CTL p=0.0080; APOE3IgG 대 APOE3 aCD14 Ab p=0.0117). 본 실험은 2회 반복되었으며, 유사한 결과를 얻었다.
도 40은 대조군 IgG, IL-6- 또는 CD14-차단 항체로 처리된 Cx3cr1GFP / GFP 마우스의 병변 주변의 RPE 상에 국재화된 망막하 IBA-1+ MP/충격의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 5 ㎍/ml; n=13-14/군. IgG 대 임의의 다른 군의 일원 ANOVA/던넷 사후 검정 *p<0.001. 만 & 휘트니 검정 * IgG 대 항-IL-6 p=0.0021; IgG 대 항-CD14 p=0.0028).
도 41은 레이저 손상 후 7일째 C57BL/6J (n=8 눈), Cx3cr1GFP / GFP (n=8), Cx3cr1GFP/GFPApoE-/- (n=10) 및 ApoE-/- (n=10) 마우스의 RPE/맥락막 편평 표본 상의 CD102+ CNV 면적의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (n=8-10/군; 일원 ANOVA/본페로니 Cx3cr1GFP / GFP 대 Cx3cr1GFP / GFPApoE-/- *p<0.0001. Cx3cr1GFP / GFP 대 Cx3cr1GFP/GFPApoE-/-의 독립 만 & 휘트니 t 검정: p<0.0001). 스케일 막대 = 50 ㎛. CD102 염색의 정량화를 통해 Cx3cr1GFP / GFP-마우스에서의 과대 CNV를 확인하였고, CNV는 Cx3cr1GFP / GFPApoE-/--마우스에서 유의적으로 더 작은 것으로 나타났다.
도 42는 대조군 IgG, IL-6 또는 CD14-차단 항체로 처리된 Cx3cr1GFP / GFP-마우스의 RPE/맥락막 편평 표본 상의 CD102+ CNV 면적의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 5 ㎍/mL; n=8-10 눈/군. IgG 대 임의의 다른 군의 일원 ANOVA/던넷 사후 검정 *p=0.0197. 만 & 휘트니 t 검정 *IgG 대 항-IL-6 p<0.0001; IgG 대 항-CD14 p=0.015). 스케일 막대 = 50 ㎛. CD102 염색의 정량화를 통해 CD14-, 및 IL-6-차단 항체로 처리된 Cx3cr1GFP / GFP-마우스에서의 CNV는 대조군 IgG 처리된 Cx3cr1GFP / GFP-마우스에서의 CNV와 비교하였을 때 유의적으로 더 작은 것으로 나타났다.
도 43은 세포 배양 1일 후 추적가능한 뉴클레오티드 EdU+ 핵의 정량화 결과를 보여주는 히스토그램이다. WT- 및 Cx3cr1GFP / GFP-대식세포의 증식률은 낮고, 서로 유의적으로 상이하지는 않다. APOE3 또는 IL-6은 증식률을 증가시키지 않는다. APOE3도 IL-6도 증식률을 증가시키지 않는다.
도 44는 레이저-손상 후 d7째 APOE3, APOE2 및 APOE4 마우스의 병변 주변의 RPE 상에 국재화된 망막하 IBA-1+ MP/충격의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n= 8-9/군, 일원 ANOVA/본페로니 사후 검정 * APOE3 대 APOE2 p=0.0004. 만 & 휘트니 t 검정 * APOE2 대 APOE3 p=0.0004).
도 45는 레이저-손상 후 d7째의, 대조군 IgG, 또는 IL-6 및 CD14 차단 항체를 주사된 APOE2 마우스의 병변 주변의 RPE 상에 국재화된 망막하 IBA-1+ MP/충격의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 5 ㎍/ml; n=13-14/군. IgG 대 임의의 다른 군의 일원 ANOVA/던넷 사후 검정 *p<0.001. 만 & 휘트니 t 검정 * IgG 대 항-IL-6 p=0.0028; IgG 대 항-CD14 p=0.0021).
도 46은 레이저-손상 후 d7째의 APOE3, APOE2 및 APOE4 마우스의 CD102+CNV의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n=8-9/군, 일원 ANOVA/본페로니 사후 검정 * APOE2 대 APOE3 p=0.0001. 만 & 휘트니 t 검정: * APOE2 대 APOE3 (12m) p=0.0004).
도 47은 레이저-손상 후 d7째의 대조군 IgG 또는 IL-6 및 CD14 차단 항체를 주사된 APOE2 마우스의 CD102+CNV의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (계산된 안구내 농도 5 ㎍/ml; n=13-14/군. IgG 대 임의의 다른 군의 일원 ANOVA/던넷 사후 검정 *p<0.01. 만 & 휘트니 t 검정 * IgG 대 항-IL-6 p=0.0029; IgG 대 항-CD14 p=0.0012).
도 48은 2m된 명시된 계통의 마우스의 4일 광-챌린지 후 망막하 IBA-1+ MP의 정량화를 보여주는 히스토그램이다 (n= 6/군 ANOVA/본페로니 * APOE3 대 APOE2 p=0.0007; APOE3 대 APOE2의 만 & 휘트니 t 검정 p=0.0022).
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
물질 및 방법
동물
Cx3cr1 GFP / GFP , ApoE -/- , Fas lpr , FasL gld , APOε2, APOε3 및 APOε4-TR 마우스를 구입하고 (찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories), 잭슨 라보라토리즈(Jackson laboratories), 타코닉(Taconic)), Cx3cr1GFP / GFPApoE-/- 마우스를 생성하였다 (문헌 [Combadiere et al., 2003]). Crb1rd8 돌연변이로 오염된 마우스를 C57BL/6J 마우스와 역교배시켜 돌연변이를 제거하였다. 따라서, 모든 마우스는 Crb1rd8, Pde6brd1 및 Gnat2cpfl3 돌연변이에 대하여 음성이었다. 마우스를 특정 병원체 부재 조건하에서 식수 및 정상 식이 사료를 임의대로 이용가능한, 12/12h 명주기/암주기 (100-500 lux)의 동물 시설에서 하우징하였다. 모든 동물 실험은 지방의 동물 관리 윤리 위원회(Animal Care ethics Committee)인 "(코미테 데티크 앙 엑스페리멘티시옹 애니말 찰스 다윈(Comite d'ethique en experimentation animale Charles Darwin)"의 승인을 받았다 (No. p3/2008/54).
기증자 샘플에서의 APOE , IBA -1, CD18 면역조직화학법
AMD의 병력이 있는 것으로 알려져 있는 기증자의 눈, 및 대조군을 미네소타 라이온즈 아이 뱅크(Minnesota Lions Eye bank)로부터 수집하였다. 사후의 기저부 사진을 촬영하고, 후안부를 4% PFA 중에서 4 h 동안 고정시키고, PBS 중에서 수송하고, 절개하고, 파라핀 중에 포매시키고, 절편화하였다 (5개의 대조군 황반; 5개의 GA 기증자 황반). 기증자는 상기 아이 뱅크의 윤리 위원회에 따라 사전 동의하였다. 재발성 급성 편도염에 대해 제거된, 5개의 편도선 절제술 수술 샘플을 파운데이션 로쉴드(Fondation Rothschild)에서 편도선 절제술로부터 회복시킨 후, 같은 방식으로 고정시키고, 절편화하였다. 편평 표본 면역조직화학법을 위해, 가시적 위축성 부위 (5개의 눈), RPE 편평 표본 상의 가시적 큰 드루젠 (5개의 눈), 및 대조군 (3개의 눈)을 가진 기증자의 눈을 대략 5 x 5 mm 조직 부분으로 절개하고, 침지된 샘플에 대하여 면역조직화학법을 수행하였다. APOE (M068-3 마우스-항-인간, 파라핀 절편을 위한 시트레이트 완충제 열 항원 복구, MBL), IBA-1 (토끼-항-인간, 포름산 항원 복구, 와코 케미칼즈(Wako Chemicals)), 및 CD18 (MCA503, 래트-항-인간, 시트레이트 완충제 열 항원 복구, Abd 세로테크(Abd Serotec)) 면역조직화학적 분석을 수행하고, 적절한 형광성 또는 알칼리성-포스파타제 커플링된 2차 항체 (몰레큘러 프로브(Molecular Probe))를 이용하여 패스트 레드(Fast Red) 기질 키트(시그마(Sigma)를 사용함으로써 나타내었다.
면역조직화학법 , 단핵성 포식세포 정량화, 및 조직학적 방법
인간 및 뮤린 망막 색소 상피 (RPE) 및 망막 편평 표본, 및 인간 및 뮤린 절편을 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]), 폴리클로날 염소 항-인간 APOE (밀리포어), 폴리클로날 토끼 항-IBA-1 (Wako), 폴리클로날 토끼 항-래트 FASL (밀리포어), 모노클로날 래트 항-마우스 IL-6 (R&D 시스템즈), 알렉사플루오르(AlexaFluor) 555 팔로이딘 (몰 프로브즈(Mol probes)), 및 래트 항-마우스 CD102 (클론 3C4, BD 바이오사이언시즈 파미겐(BD Biosciences Pharmingen)) 적절한 2차 항체를 사용하여 염색하고, 정량화하고, 지시될 경우, 훽스트(Hoechst)로 대조 염색하였다. 형광 현미경 (DM5500, 라이카(Leica)) 또는 FV1000 (올림푸스(Olympus)) 공초점 현미경을 이용하여 표본을 관찰하였다.
이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Sennlaub et al., 2013], 마우스 눈에 대한 조직학적 방법 및 광수용체 정량화를 수행하였다.
세포 제조 및 세포 배양
BMM, TPM (티오글리콜레이트-유발 복막 대식세포), RPM (상주 복막 대식세포), 및 MP- 및 BMM-망막 외식편 공동 배양물 (모두 무혈청 X-비보(X-Vivo) 15 배지 중)과 같이, 상주 및 티오글리콜레이트-유발 복막 세포, 복막 대식세포, BMM (골수 유래 단핵구), 뇌 미세아교세포, 및 POS (광수용체 분절) 단리를 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Sennlaub et al., 2013] 수행하였다. 구체적인 실험에서, 재조합 인간 CX3CL1, APOA-I, APOE2, APOE3 또는 APOE4 (레인코 테크놀러지즈(Leinco Technologies)), APOE (5 ㎍/ml, 레인코 테크놀러지즈), 폴리믹신(Polymyxin) B (25 ㎍/ml, 칼바이오켐(Calbiochem))와 함께 APOE (5 ㎍/ml), 열 변성된 APOE (5 ㎍/ml, 95℃, 90min.), 래트 항-IgG 이소형 대조군 (100 ㎍/ml, R&D), 래트 항-마우스 CD14 (100 ㎍/ml, R&D), 래트 항-마우스 TLR2 (100 ㎍/ml, R&D) 및 이전에 기술된 바와 같이 제조된 POS (문헌 [Molday et al., 1987])에 의해 세포를 자극시켰다. 시험관내 아포프토시스 실험을 위해, 상이한 유전자형의 100 000 Mo 또는 Mφ를 메가FasL (아디포겐)과 함께, 또는 그를 포함하지 않고 24h 동안 배양하였다. 제조사의 설명서에 따라 TUNEL 염색 (인 시츄 셀 데쓰 디텍션 키트(In Situ Cell Death Detection Kit), 로슈 다이아그나스틱스(Roche Diagnostics))을 수행하였다; 어레이 스캔(Array Scan) (써모피셔(Thermofischer))을 이용하여 TUNEL+ 및 훽스트+ 핵을 계수하였다.
망막하 단핵성 포식세포 세포 제거
RPC (상주 복막 세포), TPC (티오글리콜레이트-유발 복막 세포, 70% Mφ 함유), BMM (골수 유래 단핵구, 순도 ~95%) 및 미세아교세포 (순도 ~95%)를 10 μM CFSE (라이프 테크놀러지즈(Life technologies))로 표지하였다. 세포를 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. 미세주사기 및 유리 미세 모세관 (에펜도르프(Eppendorf))을 이용하여 12,000개의 세포 (4 ㎕)를 마취된 2개월된 마우스의 망막하 공간에 주사하였다. 안구내 압력 증가를 막고, 4 ㎕ 용액으로 망막 박리가 이루어질 수 있도록 하기 위해 망막하 주사 전에 유리 모세관으로 구멍을 내었다. 안저 검사에 의해 망막하 주사를 확인하였다. 구체적인 실험에서, Mφ, RPC 및 TPC를 rhApoE3 (레인코 테크놀러지즈), rmIL-6, 래트 항-마우스 IL-6, 래트 항-마우스 CD14, 이소형 대조군 래트 IgG1 (R&D 시스템즈), 또는 메가FasL (아디포겐)과 함께 공동 주사하였다. 주사된 4 ㎕는 대략 1/10th의 안구내 부피에 상응하는 바, 안구내 농도는 주사액의 10x 희석으로서 계산하였다. 24시간 경과 후, 눈에서 핵을 제거하고, 4% PFA 중에서 고정시키고, 편평 표본을 탑재하였다. 편평 표본을 CSFE+F4/80 Mφ 확인을 위해 항-F4/80 항체로 이중으로 표지하고, 각 눈의 망막 편평 표본 및 RPE/맥락막 편평 표본의 망막하 측면에서 계수하였다. 망막하 출혈이 있는 눈은 폐기하였다. 망막하 공간 중의 이중 표지된 단핵성 포식세포를 망막 색소 상피 편평 표본 상에서 및 망막 편평 표본의 망막하 측에서 정량하였다.
유세포 분석법
이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Camelo et al., 2012]), 항-CD11b PE, 항-F4/80 파시픽 블루(Pacific Blue) 또는 APC, PI, 아넥신(Annexin) V-비오틴, 스트렙트아비딘 APC (모두 Abd 세로테크(Abd Serotec)로부터)를 사용하여 세포분석법을 수행하였다. LSRII 세포분석기 ((BD 바이오사이언시즈) 상에서 획득하고, 플로우조 7.9(FlowJo 7.9)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
웨스턴 블롯 , 역전사 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 및 ELISA
이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Houssier et al., 2008]), 폴리클로날 염소 항-ApoE (밀리포어)를 이용하여 WB 분석을 수행하였다. 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]), Sybr 그린(Sybr Green) (라이프 테크놀러지즈)을 이용하여 RT-PCR를, 및 인간 APOE ELISA 키트 (맙테크(Mabtech)) 및 마우스 IL-6 듀오세트(DuoSet) (R&D 시스템즈)를 이용하여 ELISA를 수행하였다.
통계학적 분석
데이터를 분석하고, 그래프로 표현하는 데 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism) 5 및 6 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 사용하였다. 모든 값은 평균±SEM으로 기록하였다. 실험 디자인에 따라, 일원 Anova 분산 분석, 이어서, 평균 사이의 비교를 위하여 본페로니 또는 던넷 사후 검정 (다중 비교) 또는 만-휘트니 U 검정 (2개 군 실험)에 의해 통계학적 분석을 수행하였다. n 및 p-값은 도면 범례에 명시되어 있다. 망막하 MP 주사를 포함하는 경험의 경우, 선행 연구 결과, 망막하 주사에 따른 심각한 출혈은 MP 제거를 간섭하며, 이는 배제 기준으로서 사용된 것으로 나타났다.
편평 표본 상의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지 (TUNEL)
4% PFA 고정된 망막 편평 표본을 30min 동안 냉동 메탄올/아세트산 (2:1) 중에서 후고정시키고, PBS 중에서 세척하였다. 편평 표본을 말단 트랜스퍼라제 및 공급받은 완충제 (인 시츄 셀 데쓰 디텍션 키트, 로슈 다이아그나스틱스)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 편평 표본을 37℃에서 90min 동안 인큐베이션시키고, PBS로 세척하여 반응을 중단하였다. 훽스트 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로 핵을 대조 염색하였다. 편평 표본 영상을 DM5500 현미경 (라이카)으로 포착하였다.
광- 챌린지 및 레이저-손상 모델
2 내지 4개월된 마우스를 6시간 동안 어둠에 적응시켰고, 동공이 확장되었으며, 이를 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]), 4일 동안 녹색 LED 광에 노출시켰다 (2AM에 시작, 4,500 Lux, JP 베존(JP Vezon) 장치). 조작 현미경 상에 탑재된 532 nm 안과학적 레이저 (비트라 레이저(Vitra Laser), 532 nm, 450 mW, 50 ms 및 250 ㎛)를 이용하여 레이저 응고를 수행하였다. 유리 모세관 (에펜도르프) 및 미세주사기를 사용하여 2 ㎕의 PBS, 이소형 대조군 래트 IgG1, 래트 항-마우스 IL-6 (R&D 시스템즈), 및 래트 항-마우스 CD14 (BD 바이오사이언시즈)의 유리체내 주사를 수행하였다. 그가 안구내 부피로 대략 1/10th만큼 희석된다고 가정할 때 5 ㎍/ml인 안구내 농도에 상응하는 50 ㎍/ml로 2 ㎕의 항체 용액을 주사하였다.
실시예 1: 망막하 단핵성 포식세포 ( MP )는 조기 AMD에서 연성 드루젠에서 및 그 주변에서 클러스터링되고 , ApoE를 발현한다.
생리학적으로, 망막하 공간은 가능하게는 부분적으로 면역억제성 RPE 신호에 기인하여 상당수의 MP를 함유하지 않는다 (문헌 [Streilein et al., 2002]).
그럼에도 불구하고, 단핵성 포식세포는 망막하 공간에, 및 위축성 AMD의 병변에 인접한 망막 색소 상피 세포의 정단측 상에 존재하는 것으로 알려져 있다.
중간 정도의 AMD를 앓는 기증자로부터의 연성 드루젠의 망막 색소 상피/맥락막 편평 표본 상에서 수행된 실험을 통해 다수의 CD18+ 및 IBA-1+ 세포가 (부분적으로 망막 색소 상피에 의해 커버된) 연성 드루젠 내에 함유되어 있을 뿐만 아니라, 주변 자가 형광성 망막 색소 상피 상의 연성 드루젠에 인접한 부분에도 함유되어 있다는 것을 입증한다 (데이터는 나타내지 않음). 더 높은 고배율로 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포를 통과하는 측면 Z 스택 투사를 이용하여 단핵성 포식세포가 자가 형광성 망막 색소 상피와 물리적으로 가깝게 접촉하고 있다는 것을 추가로 입증한다 (데이터는 나타내지 않음). 망막 색소 상피와 접촉해 있는 망막하 단핵성 포식세포는 조사된 모든 연성 드루젠 부근에서 관찰된다 (5개의 눈). 망막하 단핵성 포식세포는 연성 드루젠으로부터 멀리 떨어져 있는 위치에서, 및 건강한 황반에서는 매우 드물다 (3개의 눈). (망막 색소 상피 자가 형광에 의해 차폐되는 것을 막기 위해) 오버레잉 망막의 망막하 측 상의 APOE 및 IBA-1 이중 표지를 통해 APOE가 IBA-1+ 고도로 분기된 미세아교세포에서 관찰되는 내부 망막의 유기체 측면과 비교하였을 때, 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포가 APOE를 강력하게 발현한다는 것이 밝혀졌다.
종합해 볼 때, 상기 결과들은 망막하 단핵성 포식세포가 조기 AMD에 존재하며, 이는 연성 드루젠에서 및 그 주변에서 클러스터링된다는 것을 입증한다. 상기 세포는 망막 색소 상피는 가깝게 접촉하고 있으며, 예컨대, 죽상경화증 병변과 같은 다른 조직의 염증에서의 대식세포와 유사한 방식으로 APOE를 강력하게 발현한다.
실시예 2: 망막하 단핵성 포식세포 ( MP )는 위축성 병변 및 큰 드루젠 부분의 RPE 상에 축적된다
후기 AMD에서, 절편에 대한 면역조직화학적 연구를 통해 위축성 AMD의 병변에 인접한 RPE 세포 상에 망막하 MP가 존재하고 (문헌 [Gupta et al., 2003]; [Sennlaub et al., 2013]), MP은 망막하 신생혈관막에서 발견된 (문헌 [Oh et al., 1999]) 것으로 밝혀졌다. 작고, 분산되어 있는 MP는 절편 상에서 검출하기 어려운 바, 이에, 건강한 것 및 이환된 황반 RPE/맥락막 편평 표본에 대해 MP-마커-IBA-1 면역조직화학법을 수행하였다 (IBA-1 녹색 형광, 적색 및 녹색 채널에서 그의 자가 형광에 기인하여 오렌지색으로 보이는 RPE 자가 형광). 공초점 현미경 검사를 통해 망막하 IBA-1+ MP는 동일 연령의 건강한 기증자의 중심 RPE에서 아주 가끔 관찰되는 것으로 확인되었다 (데이터는 나타내지 않음). RPE가 소실된 GA 환자의 위축성 병변 내에는 MP가 다수 존재하였을 뿐만 아니라, 병변에 인접한 RPE의 정단측에서도 또한 변함없이 관찰되었다. 추가로, 해부 현미경 하에서는 망막 제거 후 담색 병변으로 보이고, 공초점 현미경 하에서는 돔 형상의 돌출부로 보이는 큰 드루젠 (>125 ㎛)은 드루젠 내에 그뿐만 아니라, 인접한 RPE 상에도 다수의 IBA-1+ 세포를 함유하는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). (RPE 자가 형광에 의해 차폐되는 것을 막기 위해) 오버레잉 망막의 망막하 측 상의 이중 표지를 통해 망막하 IBA-1+ MP 또한 범-MP(pan-MP) 마커 CD18을 발현하는 것으로 밝혀졌다. RPE와 가깝게 접촉해 있는 IBA-1+ MP는 조사된 모든 큰 드루젠 및 위축성 구역 부근에서 관찰되었다.
함께 고려해 볼 때 상기 관찰 결과들을 통하여 AMD에서 망막하 MP가 존재한다는 것이 확인되고 (문헌 [Gupta et al., 2003]; [Penfold et al., 1985]; [Sennlaub et al., 2013]), 그는 RPE와 접촉하여 큰 드루젠 및 GA 병변 주변에 축적되어 있다는 것이 설명된다. 이는 건강한 기증자에서는 매우 드물다. 이는 중간 정도의 AMD (큰 드루젠) 및 후기 AMD (GA)에서는 RPE 매개된 면역억제가 손상되어 있다는 것을 추가로 제안한다.
실시예 3: 위축성 병변 및 큰 드루젠 부근의 RPE 상에 축적된 망막하 MP가 APOE를 발현한다
MP는 APOE를 고수준으로 발현하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Basu et al., 1982]; [Nakai et al., 1996]; [Peri & Nusslein-Volhard, 2008]; [Rosenfeld et al., 1993]). 양성 대조군으로서 사용된, 인간 편도선의 파라핀 절편 상에서의 APOE 및 IBA-1의 면역조직화학법을 통해 IBA-1+ MP가 APOE를 강력하게 발현할 수 있다는 것을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 유사하게, 큰 드루젠을 가진 기증자의 눈의 망막 편평 표본 상에서 망막하 IBA-1+ MP에서 및 그 주변에서 APOE 염색이 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). RPE 자가 형광에 의해 차폐되는 것을 막기 위해 망막의 망막하 측 상에서 이중 표지를 수행하였다. 대조군, 및 지도형 위축 병변을 가진 기증자 눈의 파라핀 절편 상에서 APOE 염색을 수행하였다. RPE 자가 형광과의 혼동을 피하기 위해, 명시야에서 가시적인, 기질을 밝히는 방법 (알칼리성 포스파타제/패스트 레드(Fast Red))을 사용하였다. 대조군 눈으로부터의 절편에서, APOE 신호는 RPE의 기저부에 집중되어 있었다 (데이터는 나타내지 않음). 위축성 부위에 인접한 GA를 가진 기증자 눈에서는 RPE에서 강력한 APOE 신호가 관찰되었지만, 이는 기저부 측으로 한정되는 것은 대조군에서보다는 덜하였다. 추가로, RPE에 인접한 세포에서 APOE 면역염색이 관찰되었다. IBA-1을 이용하여 이중 표지한 결과, 상기 세포는 망막하 IBA-1+ MP인 것으로 확인되었다. APOE-항체는 생략하고, 동일한 실험 프로토콜을 따라 수행하였을 때, 어떤 유의적인 염색도 일어나지 않았다.
종합해 볼 때, 상기 결과는 RPE 이외에도, AMD 환자의 망막하 MP는 다른 염증성 환경 (예컨대, 죽상경화증 병변 (문헌 [Rosenfeld et al., 1993]))과 유사한 방식으로 APOE를 강력하게 발현한다는 것을 나타낸다
실시예 4: APOE는 Cx3Cr1 GFP / GFP 마우스에서 망막하 MP 축적 및 광수용체 변성을 촉진시킨다
눈에서 CX3CL1은 내부 망막 뉴런 (문헌 [Silverman et al., 2003]; [Zieger et al., 2014]) 및 망막 색소 상피에서 막횡단 단백질로서 구성적으로 발현되며, 이는 긴장 억제성 신호를 CX3CR1 보유 망막 미세아교세포 (MC)에 제공함으로써 상기 세포를 생리학적 조건하에서 휴지 감시 모드로 유지시키는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Combadiere et al., 2007]; [Ransohoff, 2009]). 마우스에서 Cx3cr1이 결실 또는 결핍되면, 노화됨에 따라, 광-챌린지 또는 레이저-손상 후에 (문헌 [Combadiere et al., 2007]; [Ma et al., 2009]; [Raoul et al., 2008]), 당뇨병에서 (문헌 [Kezic et al., 2013]), 및 파라콰트 유도성 망막증 모델에서 (문헌 [Chen et al., 2013]) 망막하 단핵성 포식세포 축적이 강하게 증가된다. Cx3cr1 GFP /GFP 마우스에서는 드루젠 및 망막 색소 상피 위축이 발생하지 않지만, AMD와 유사한 RPE 상의 망막하 단핵성 포식세포 축적 뿐만 아니라, AMD에서 관찰되는 관련된 광수용체 변성 및 과도한 CNV가 나타난다 (문헌 [Combadiere et al., 2007], [Sennlaub et al., 2013]). Cx3cr1 GFP / GFP 마우스는 AMD의 기본 메커니즘을 해독하는 데 도움을 줄 수 있다. 망막하 MP 축적을 나타내는 12개월된 Cx3cr1 GFP / GFP-마우스에서 APOE 국재화를 평가하였다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]).
12개월된 야생형 및 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스, 둘 모두의 망막 편평 표본의 망막 절편 및 망막하 측에 대한 면역조직화학적 국재화 결과, 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Anderson et al., 2001]), APOE 국재화는 주로 RPE 및 내부 망막에서 이루어지는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). 추가로, AMD 환자와 유사하게, IBA-1 발현 MP로서 확인된, 노화된 Cx3cr1 GFP / GFP-마우스의 망막 편평 표본의 망막 절편 상의 RPE 및 망막하 측에 병렬된 세포에서 강력한 신호가 검출되었다. 추가로, 12개월된 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 눈에서 ApoE mRNA가 유의적으로 증가되었고 (도 1), 이때 망막하 단핵성 포식세포 축적이 발생하였다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]).
망막하 단핵성 포식세포 (MP) 축적에서 APOE의 역할을 평가하기 위해, Cx3cr1 GFP/GFP ApoE -/- 마우스를 분석하였다. 12개월된 Cx3cr1 GFP / GFP 및 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- 마우스의 망막 및 망막 색소 상피/맥락막 편평 표본 상에서의 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포를 정량화한 결과, (C57BL/6J 및 ApoE -/- 마우스와 비교하여) Cx3cr1 GFP/GFP 마우스에서 관찰된 유의적인 연령 의존성 망막하 단핵성 포식세포 축적은 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- 마우스에서 거의 완전하게 억제된 것으로 나타났다 (도 20). 이러한 결과는 APOE가 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서 연령 의존성 망막하 단핵성 포식세포 축적에 필수적이라는 것으로 보여주는 것이다.
이어서, 12개월된 C57BL/6J, ApoE -/- , Cx3cr1 GFP / GFP , 및 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- 마우스의 조직학적 절편 상에 광수용체 핵을 함유하는 외핵층 (ONL)을 조사하여 APOE 결핍이 광수용체 변성에 미치는 영향을 평가하였다. 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Ong et al., 2001]), 시신경으로부터 같은 거리에 있을 때, ApoE -/- 마우스는 더욱 얇지만, 규칙적인 외핵층을 제시하는데, 이는 전신 APOE 및 교란된 전신 지질 수송 및 망막 콜레스테롤 수송 결여되었기 때문이다. 흥미롭게도, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- 마우스의 외핵층은 ApoE -/- 마우스와 유사하였고, Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서보다 더 두껍고, 더욱 규칙적이었고, 여기서, Cx3cr1 -/- 마우스에서 관찰된 것과 유사한 염증 관련 광수용체 변성이 발생하였다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]). 시신경 (0 ㎛)으로부터의 거리 증가에 따른 광수용체 핵 열 계수 (도 3) 및 곡선하 면적 계산 (도 4)은 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스와 비교하였을 때, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- 마우스가 연령 의존성 광수용체 세포 손실로부터 유의적으로 보호되며, ApoE -/- 마우스와 유의적으로 상이한 것은 아니라는 것을 보여준다.
요약컨대, 상기 실험은 ApoE 결실이 연령 의존성 광수용체 변성을 유의적으로 억제시켰고 (도 3 및 4), Cx3cr1 GFP / GFP-마우스에서 관찰된 과대 CNV를 유의적으로 억제시켰다 (도 41)는 것을 입증한다. 따라서, Cx3cr1-결핍 마우스에서 APOE 발현은 증가되고, 연령 의존성 축적 및 염증 관련 광수용체 변성은 필수적이다.
유사하게, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스는 광-챌린지 4일 후 Cx3cr1 GFP / GFP-마우스에서 관찰된 망막하 MP 축적으로부터 유의적으로 보호된 것으로 나타났다 (도 32). 본원에서 사용된 광-챌린지 모델의 강도는 Cx3cr1 -/- 마우스에서 망막하 염증을 유도하는 데에는 충분하였지만, WT 마우스에서는 유의적인 망막하 염증도 변성도 유발하지 못하였다는 점에 주의하여야 한다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]). 또한, 레이저-손상 후 7일 경과시, Cx3cr1 GFP / GFP- 및 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스에서 CD102+CNV까지의 0-500 ㎛ 거리의 RPE 상에서 계수된 망막하 IBA-1+ MP는 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스에서 유의적으로 억제되었다 (데이터는 나타내지 않음).
C57BL/6J (WT) 마우스는 근친교배계이고, 비교적 일반적인 Pde6b rd1 (망막 변성 1), Crb1 rd8 (망막 변성 8), Gnat2 cpfl3 (원뿔 광수용체 기능 손실 3) 돌연변이를 보유한다 (문헌 [Chang et al., 2013]). 상기 돌연변이는 원발성 망막 변성 다음으로 망막하 염증을 일으킬 수 있다 (문헌 [Luhmann et al., 2012]). 수행된 실험에서, 사용된 마우스 계통 모두 상기 3가지 돌연변이에 대하여 음성 반응을 보였다. 추가로, Cx3cr1 +/ GFP 브리더의 12m된 Cx3cr1 +/ GFP , 및 Cx3cr1 GFP / GFP 한배 새끼에서의 망막하 MP 축적은 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스 계통에 특이적인 비공지된 공여자 유전자로부터의 영향에 대한 증거를 보여주지는 못했다 (데이터는 나타내지 않음). 독립적으로 구입한 Cx3cr1 GFP / GFP 및 ApoE -/- -마우스를 이용하여 2회에 걸쳐 (한번은 라보라토이레 이뮤니테 엣 인펙션(Laboratoire Immunite et Infection)에서 및 한번은 인스티튜트 데 라 비젼(Institut de la Vision)에서) Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스를 생성하였고, 두 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스 계통 세대 모두 두 지역의 두 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스 계통에서 관찰되는 망막하 MP 축적으로부터 보호되었다. 종합해 볼 때, 상기 결과, Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서의 MP 축적 및 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -마우스에서의 보호는 Cx3cr1 및 ApoE 이외의 다른 유전자에 기인한다고 볼 수 있는 가능성은 아주 없다.
요약컨대, 상기 실험은 APOE는 망막하 MP에서 강하게 발현되고, Cx3cr1 GFP / GFP MP에서 더욱 강력하게 발현되며, ApoE 결실이 Cx3cr1-결핍 마우스에서 관찰되는, 연령, 광, 및 레이저 유도성 망막하 MP 축적을 매우 유의적으로 억제시켰다는 것을 입증한다.
실시예 5: CX3CR1에 의해 제어되는 ApoE가 망막하 단핵성 포식세포 제거를 조절한다.
Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서, 망막하 단핵성 포식세포는 부분적으로 단핵구 (Mo) 및 미세아교세포 (Mc)로부터 유래된 것이고 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]), 이들 모두는 Cx3cr1 프로모터-제어식 GFP를 발현한다. CX3CL1/CX3CR1 신호전달이 단핵성 포식세포에서 ApoE 발현을 직접 제어하는지 여부를 시험하기 위해, 및 Cx3cr1GFP/GFP MP가 그의 ApoE 발현에 있어 상이한지 여부를 평가하기 위해, 망막하 공간에서 단핵성 포식세포 분화 조건을 자극시킴으로써 (CX3CL1을 발현하는) 오버레잉 망막 외식편의 광수용체 분절 (POS)과 접촉된 상태로 24h 동안 배양된 C57BL/6J (WT) 및 Cx3cr1 GFP / GFP -Mo (골수로부터 제조)를 연구하였다. RT-PCR 결과, ApoE mRNA는 오버레잉 망막 외식편의 POS의 존재하에 Cx3cr1 GFP / GFP - Mo-에서 유의적으로 더 빠른 속도로 유도되는 것으로 나타났다 (도 5). 따라서, APOE 및 CX3CR1을 발현하는 WT 티오글리콜레이트-유발 복막 대식세포 (TPM)의 ApoE mRNA 전사는 CX3CL1에 의해 억제되고, Cx3cr1 GFP / GFP TPM과 비교하였을 때, 유의적으로 더 낮다 (도 6).
CX3CL1에 노출된 TPM으로부터의 등가량의 상청액 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, 배양된 대식세포로부터 구성적으로 방출되고 (문헌 [Sather et al., 2007]), 로딩 대조군으로서의 역할을 하는 가용성 Mer 수용체 티로신 키나제와 비교하였을 때, Cx3cr1 GFP / GFP 샘플에서 또한 APOE 분비가 증가된 것으로 나타났다 (도 7) (ApoE -/- 혈청에 대하여 시험된 마우스 APOE ELISA 키트는 신뢰할 수 없는 것으로 입증되었는 바, 이에 웨스턴 블롯을 사용) (데이터는 나타내지 않음). 대조군과 비교하였을 때, 성체 Cx3cr1 GFP / GFP 뇌로부터 새로 추출된 FACS로 분류된 미세아교세포에서 ApoE mRNA의 양이 유의적으로 증가된 것 또한 관찰되었다 (도 8).
Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서 망막하 MP가 축적되는 이유에 대해서는 완전히 이해되고 있지 않다. 이론상, 망막하 MP 개수는 i) 동원, ii) 계내 증식, iii) 이동 (배출), 및/또는 iv) 아포프토시스 제거에 의해 결정된다. Cx3cr1-결핍 마우스에서의 MP 축적은 Cx3cr1 GFP / GFP MP에 의한 CCL2의 과다발현으로부터 초래되며, 이는 결국 혈액으로부터의 CCR2+Mos 동원을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]). 광-챌린지된 Cx3cr1 GFP / GFP -마우스에서 추적가능한 뉴클레오티드 EdU의 국부 주사는 망막하 MP에 혼입되지 못하였고, 이는 계내 증식이 축적에는 유의적으로 기여하지 못한다는 것을 제안한다 (문헌 [Sennlaub et al., 2013]의 보충 자료). 망막하 MP가 망막하 공간으로부터 배출되는지 또는 아포프토시스되는지 여부를 평가하기 위해, 12,000개의 CFSE 염색된 WT- 및 Cx3cr1 GFP / GFP -티오글리콜레이트-유발 복막 세포 (70% Mφ 함유)를 WT 마우스의 망막하 공간으로 이입 방식으로 전달하고, 일단 망막 박리가 진정되고 나면 (8-12 h) RPE- 및 망막-편평 표본 상에서 CFSE에 대해 공동 염색된, F4/80을 발현하는 Mφ의 개수를 계수하였다.
정량화 결과, 주사된 대식세포는 망막하 공간으로부터 빠르게 제거되었고 (도 9), 상기 두 유전자형 모두의 대식세포의 제거는 4일 동안에 걸쳐 달성되었다. 눈 세포 현탁액 중 CFSE+F4/80+CD11b+ 대식세포에 대한 세포분석 정량화 결과, Cx3cr1 GFP/GFP 대식세포는 주사 후 24h 경과하였을 때 유의적으로 더 많은 개수로 눈에 존재하는 것으로 나타났다 (도 10). 망막 색소 상피 /맥락막 및 망막 편평 표본 상에서의 CFSE+F4/80+ 대식세포 세포 계수를 통하여 망막하 공간에서의 상기와 같은 차이를 확인할 수 있었다 (도 11). 세포분석법 분석에서 F4/80+CD11b+-Mφ의 CFSE 형광 강도는 강하고, 균일하였으며 (도 10), 이는 (가변적 CFSE 강도를 유도하는) 숙주 세포에 의한 CFSE 흡수, 또는 (세포 집단이 CFSE 형광 강도의 절반을 나타내도록 하는) 증식은 유의적인 정도로는 발생하지 않는다는 것을 제안한다. 그럼에도 불구하고, Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ 제거 속도는 유의적으로 더 느렸고, Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ는 1일째 및 2일째 유의적으로 높은 개수로 잔존하였다 (도 33). 조직학적 방법 또는 세포분석법에 의해 어떤 CFSE+ 세포도 내부 망막 및 맥락막, 혈액, 국부 림프절, 폐, 간, 또는 비장에서 관찰되지 않았는 바, WT- 또는 Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ에서는 망막하 공간으로부터의 배출에 대한 어떤 징후도 검출되지 못했다 (데이터는 나타내지 않음). 그러나, 다수의 망막하 CFSE+ 세포의 핵이 TUNEL+인 것으로 관찰되었고, 아포프토시스의 징후, 예컨대, 핵농축형 및 분획형 핵을 나타내었고, 아넥신-V는 양성을 띠었지만, 프로피디움 아이오다이드 (PI)는 음성을 띠었다. 관찰된 차이가 복막 Mφ에 특이적인지, 또는 다른 기원의 MP에 공통되는지 여부를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. WT 및 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스로부터의, CFSE 표지된, 자기-비드-분류된 골수 유래 Mo (순도 ~95%, 도 34), 및 CD11bFACS로 분류된 뇌 MC (순도 ~95%, 도 35)를 WT-마우스의 망막하 공간으로 이입 방식으로 전달하였다. 복막 Mφ와 같이, 상기 두 기원 모두의 Cx3cr1 -결핍 MP는 주사 후 1d째 망막 및 RPE/맥락막 편평 표본 상에서 계수하였을 때, 그 개수가 유의적으로 더 많았다. 추가로, WT- 및 Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ는 시험관내 증식에 있어서는 어떤 차이도 나타내지 않았으며 (도 43), 이는 Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ의 빠른 증식이 상기 이입식 전달 실험에서 관찰된 차이에 대한 원인이 되는 것은 아니라는 것을 제안한다.
MP APOE 발현이 망막하 MP 제거 속도에 영향을 주는지 여부를 평가하기 위해, Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -Mφ를 WT-수용자 내로 이입 방식으로 전달하였다. 놀랍게도, Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ의 망막하 제거에 대하여 증가된 저항은 Cx3cr1 GFP / GFP ApoE -/- -Mφ로 완전히 제거되었다 (도 11). 추가로, 주된 인간 APOE 이소형인 외인성 지질 무함유 APOE3은 WT-CFSE+-Mφ에 첨가되었을 때, 망막한 제거에 대한 저항을 증가시키는 데 충분하였다 (도 36).
종합해 볼 때, 면역 특권 부위에서 예상되는 바와 같이, 및 말초 조직에서 (문헌 [Gautier et al., 2013])에서 및 특히 망막하 면역억제성 환경과 관련하여 백혈구 제거가 일어나는 (문헌 [Streilein et al., 2002]) 염증 관해의 관찰 결과에 따르면, 상기 결과는 망막하 대식세포 제거는 주로 아포프토시스에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 추가로, 상기 결과는 연구된 모든 기원 (복막, 골수, 및 뇌) 의 Cx3cr1-결핍 MP는 망막하 제거에 대하여 더욱 큰 저항을 띤다는 것을 보여준다. 제거에 대한 이러한 저항 증가는 APOE 의존적이며, 상기의 국부, 재조합 APOE는 망막하 공간으로부터의 WT-Mφ 제거를 억제하는 데 충분하다.
실시예 6: ApoE는 FasL을 통해 망막하 대식세포 생존을 제어한다
CX3CL1/CX3CR1 신호전달은 주화성에서 그의 역할에 대하여 널리 알려져 있다. 그러므로, Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서 비효율적인 배출이 망막하 단핵성 포식세포 축적의 기점이 되는 것으로 의심해 볼 수 있다. 그러나, 본 결과는 단핵성 포식세포 배출은 망막하 공간으로부터는 측정가능하게 발생하지 않는다는 것을 나타내며, 이는 면역 특권 부위의 경우에는 놀라운 것도 아니다.
망막 색소 상피 면역억제성 환경 변경이 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP 단핵성 포식세포 축적과 관련이 있는지 여부를 시험하기 위해, 먼저 생체내에서 FasL 발현을 분석하였다. RPE는, 그의 면역억제성을 부분적으로 매개하는 FasL (CD95L)을 구성적으로 발현한다 (문헌 [Wenkel & Streilein, 2000]). 2개월 및 12개월된 C57BL/6J 및 Cx3cr1 GFP/GFP 마우스의 망막 색소 상피/맥락막 추출물 상에서 수행된 RT-PCR 결과, FasL mRNA 발현은 어린 마우스에서는 유사하였고, Cx3cr1 +/+ 마우스에서는 노화됨에 따라 증가하였지만, 망막하 APOE 발현 단핵성 포식세포가 축적되어 있는 동일 연령의 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서는 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났다 (도 12). 유사하게, 망막하 MP 축적이 이루어진 2개월된 광-챌린지된 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스는 WT와 비교하였을 때 유의적으로 더 적은 FasL mRNA를 발현하였다 (데이터는 나타내지 않음).
WT 마우스 및 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 망막 절편 및 망막 색소 상피 편평 표본에 대한 면역조직화학법을 통해 12개월된 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포를 가지는 Cx3cr1 GFP/GFP 마우스의 망막 색소 상피에서의 감소된 FasL 발현을 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 따라서, 이는 Cx3cr1-결핍 MP가 RPE-FasL 전사를 억제시킨다는 것을 제안한다. 이는 Cx3cr1 GFP / GFP -Mφ를 WT-마우스의 망막하 공간 내로 주사함으로써 RPE/맥락막 추출물 상에서의 FasL 전사는 WT-Mφ 주사된 눈과 비교하였을 때, 3 h 경과 후 유의적으로 억제되었다는 결과를 보인 것을 통해 확인되었다 (도 17).
FasL은 시험관내에서 활성화된 단핵구 및 활성화된 대식세포의 아포프토시스를 유도하는 것으로 알려져 있지만, 망막하 단핵성 포식세포 제거에 있어 그의 역할을 여전히 알려져 있지 않다. FAS-FASL 신호전달이 MP 제거에 참여하는지 여부를 평가하기 위하여, 망막하 MP 개수를 광-챌린지된 WT-, FASL-결핍- (FasLgdl / gdl-마우스) 및 FAS-결핍- (Faslpr / lpr-마우스)에서 비교하였다 (FasLgdl / gdl- 및 Faslpr / lpr-마우스에서는 노화됨에 따라 림프절증 및 전신 자가면역 질환이 발생하며, 이로 인해 12개월째 연령 의존성 MP 축적을 평가하기는 어렵다). 망막 및 RPE/맥락막-편평 표본에서의 망막하 IBA1+-MP의 정량화 결과, Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 것과 유사하게, 2개월된 FasLgdl / gdl- 및 Faslpr / lpr-마우스에서 4일 동안의 광-챌린지에 의해 망막하 MP의 유의적인 증가가 유도된 것으로 나타났다 (도 37).
WT CFSE+ TPC를 C57BL/6J (WT) 또는 FasL-결핍 마우스 (FasL gld / gld 마우스) 내로, 및 (티오글리콜레이트-유발 복막염 Fas lpr - lpr 마우스로부터 제조된) Fas-결핍 CFSE+ TPC를 C57BL/6J 마우스 내로 망막하로 주사한 이입식 전달 실험 결과, 망막하 CFSE+F4/80+ 대식세포 개수는 Fas 또는 FasL 기능이 손상되었을 때, 상기 주사 후 24h 경과시 유의적으로 더 많았고, 24h째 WT 수용자에서의 Cx3cr1 GFP / GFP CFSE+ 대식세포 개수와 유사한 것으로 나타났다 (도 13).
FASL-유도성 MP 사멸에 대한 감수성에서의 차이가 망막하 MP 축적에서의 ApoE-결실의 보호 효과에 기여하는지 여부를 시험하기 위해, 상이한 마우스 계통으로부터의 단핵구 (Mo) 및 티오글리콜레이트-유발 Mφ를 메가FasL에 노출시키고, 24h째 시험관내에서 TUNEL+ 세포를 정량하였다 (도 38). 본 결과를 통해 FASL은, 시험관내 FASL 유도성 아포프토시스에 대하여 좀더 저항성을 띠는 Mφ와 비교하였을 때, 시험관내에서 Mo 아포프토시스를 유도하는 데 충분한 것으로 나타났다 (문헌 [Kiener et al., 1997]; [Park et al., 2003]; [Um et al., 1996]). Mos 또는 Mφ의 야생형 및 Cx3cr1 GFP / GFP -세포 사이에는 어떤 차이도 관찰되지 않았지만, Cx3cr1 GFP/GFP ApoE -/- - 및 ApoE -/- -세포 둘 모두의 Mo에서 감수성이 증가하는 경향은 생체내에서 관찰된 제거 차이의 원인이 될 수 있다. 이러한 결과는 또한 이입 방식으로 전달된 복막 Mφ의 망막하 제거에 대하여 메가FasL이 미치는 효과 (도 21)가 시험관내에서 메가FasL-유도성 아포프토시스 (도 38)보다 훨씬 더 강력하게 나타났는 바, FASL은 망막하 공간에서 Mφ 아포프토시스를 유도하기 위해 생체내에서 다른 인자와 함께 작용한다는 것을 강조한다.
본 결과는 망막 색소 상피 Fas-FasL 신호전달이 생체내에서 망막하 대식세포 제거에 참여하고, 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP-MP는 RPE FASL 발현의 하향조절과 관련이 있으며, 메가FasL에 의한 치환은 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP-MP의 제거를 복구시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 7: APOE는 IL-6을 통해 망막하 대식세포 생존을 촉진시킨다
IL-6은 림프구에서 FasL 전사를 하향조절하는 것으로 알려져 있다. 추가로, APOE 및 APOA-I는 TLR 신호전달을 활성화시키거나, 또는 LPS/TLR4 유도성 IL-6 유도를 억제시키는 그의 능력에 대하여 알려져 있다. APOE 및 APOA-I 둘 모두 TLR 리간드 부재하에서 TLR-2 및 -4를 함유하는 CD14 의존성 선천 면역 수용체 클러스터를 활성화시킬 수 있다 (문헌 [Smoak et al., 2010]). 이러한 활성화는 APOA-I의 경우에 다른 사이토카인 중에서도 IL-6을 유도하는 것으로 나타났다. 본 결과는 APOA-I 및 APOE3이, 자극 후 8h째에 상청액의 ELISA에 의해 측정된, 시험관내에서 대식세포의 LPS-유도성 IL-6 분비를 유의적으로 억제시킨다는 것을 확인시켜 준다 (도 14). 유사하게, 24h 동안 WT-복막-Mφ를 재조합 지질 무함유 APOE3과 함께 인큐베이션시켰을 때, IL-6이 매우 유의적으로 유도되었다 (도 39). LPS 억제제 폴리믹신 B는 상기 유도를 억제시키지 못한 반면, 90min 열 변성이 상기 유도를 폐기하였으며, 다중 접근법을 사용하여 APOA-I에 대해 나타난 바와 같이 (문헌 [Smoak et al., 2010]), 이를 통해 APOE3의 LPS 오염이 상기 효과의 원인이 되지는 못한다는 것을 확인할 수 있었다. APOA-I의 경우와 같이, 중화 항체가 상기 항체를 억제시켰는 바, 대조군 IgG와 비교하였을 때, 상기 유도는 크게 CD14- 및 TLR2-의존적이었다 (도 39).
그러나, TLR 효능제, 예컨대, LPS 없이 투여되었을 때에도 지질 무함유 APOE3 및 APOA-I는 또한 앞서 APOA-I에 대해 보고된 바와 같이, 8h째 대식세포에서 IL-6을 유의적으로 유도하였다 (도 14). 24h째 IL-6 분비는 APOE3 자극받은 대식세포에서 추가로 증가된 반면, 90min 열 변성 (95℃)은 유도를 폐기하였으며, 이를 통해 다중 접근법을 사용하여 APOA-I에 대해 나타난 바와 같이, APOE3의 LPS 오염이 상기 효과의 원인이 되지는 못한다는 것을 확인할 수 있었다.
상응하여, CX3CL1과 함께 24h 배양되었을 때, Cx3cr1 GFP / GFP TPM은 WT TPM과 비교하여 유의적으로 더 많은 양의 IL-6을 발현하고 분비한다 (도 15 및 16). 이러한 효과는 RT-PCR (도 15) 및 ELISA (도 16)에 의해 관찰되는 바와 같이, Cx3cr1 GFP/GFP ApoE -/- TPM에서 유의적으로 억제되었다. 비록 IL-6이 생체내에서 전체 눈 mRNA 추출물에서 RT-PCR에 의해 검출가능하지는 않지만, IL-6 염색은 12개월된 Cx3cr1 GFP/GFP 마우스 및 광-챌린지된 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서 IBA-1+ 망막하 단핵성 포식세포에서 재현가능하게 검출된다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 외인성 APOE 및 APOE 과다발현 Cx3cr1 GFP / GFP 대식세포가 IL-6의 양을 증가시켰다는 것을 나타난다.
ApoE-IL-6 분비 대식세포가 망막 색소 상피 FasL 발현에 직접적으로 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, WT 및 Cx3cr1 GFP / GFP TPC를 WT 수용자 내로 망막하로 주사하고, 3시간 후 망막 색소 상피/맥락막 추출물 상에서 RT-PCR에 의해 망막 색소 상피 FasL mRNA 발현을 평가하였다. 실제로, WT TPC 주사된 눈과 비교하였을 때 Cx3cr1 GFP / GFP TPC는 FasL 전사를 유의적으로 억제시켰다 (도 17).
사실상, PBS와 비교하였을 때, 생체내에서 망막 색소 상피 FasL 전사를 유의적으로 억제시키는 데 재조합 IL-6의 망막하 주사면 충분하다. 이에 반해, 증가된 망막하 대식세포 생존을 유도하는 충분한 용량으로 주사된 지질 무함유 APOE3 (도 18)은 대식세포 없이 주사된 경우에는 직접 FasL 발현을 변경시키지 못하였다. 이러한 결과는 APOE가 아닌 대식세포 IL-6이 망막 색소 상피 FasL 발현을 조절한다는 것을 제안한다.
추가로, 주사 후 24h째 그의 대조군과 비교하였을 때, CFSE+ TPC에 첨가된 재조합 IL-6은 망막하 WT CFSE+F4/80+ 대식세포의 개수를 2배 초과로 배가시켰고 (도 19), IL-6 차단 항체는 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP CFSE+F4/80+ 대식세포를 유의적으로 감소시켰다 (도 20). 추가로, CD14- 및 IL-6 차단 항체는 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 병변 주변의 RPE 상에 국재화된 망막하 IBA-1+ MP/충격을 감소시킨다 (도 40). 추가로, Cx3cr1 GFP/GFP CFSE+ TPC에의 육량체 Fas 효능제 메가FasL (문헌 [Greaney et al., 2006])의 공동 투여는 관찰된 FasL 하향조절을 효율적으로 상쇄시키며 (도 21), IL-6 차단 항체와 유사하게 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP CFSE+F4/80+ 대식세포의 개수를 유의적으로 감소시켰다. 시험관내에서 WT 및 Cx3cr1 GFP / GFP 대식세포에 대하여 수행된 Fas RT-PCR 및 Fas 유도성 아포프토시스 결과, 유전자형 사이에는 어떤 차이도 나타나지 않았는 바 (도 22a 및 22b), 따라서, 이는 망막하 대식세포 생존의 차이는 FasL/Fas 유도성 아포프토시스에 대한 Cx3cr1 GFP / GFP 대식세포의 감수성 변경이 원인이 아니라는 것을 시사한다.
CD14 의존성 IL-6 유도가 생체내에서 망막하 MP 축적에 실제로 참여하는지 여부를 시험하기 위해, (망막하 공간으로의 항체 투과도 촉진시키는) 레이저-손상으로 망막하 염증을 유도한 후, Cx3cr1 GFP / GFP 마우스의 유리체 내로 대조군 IgG 및 IL-6- 또는 CD14-중화 항체를 주사하였다. 레이저-충격 후 7일째 CD102+CNV에 인접한 RPE에서 관찰된 망막하 IBA1+ MP의 축적은 관련된 CNV와 같이, CD14 또는 IL-6 중화시 유의적으로 억제되었다 (도 42).
요약컨대, 본 데이터는 대식세포 APOE가 대식세포 IL-6 발현을 조절하고, IL-6에 의해 조절되는 망막 색소 상피 FasL이 망막하 대식세포 제거의 중요한 매개인자라는 것을 나타낸다. 이러한 메커니즘이 Cx3cr1 GFP / GFP 대식세포의 내인성 APOE 및 WT 대식세포에 외부에서 첨가된 APOE가 어떻게 망막하 공간에서의 단핵성 포식세포 생존을 증가시키는지에 대해 설명한다. 따라서, Cx3cr1 GFP / GFP MP는 APOE를 증가된 양으로 발현한다. APOE는 MP에서 IL-6의 발현을 유도하여, 결국 RPE에서 FasL 전사를 하향조절시킨다. 감소된 FASL 발현은 망막하 Cx3cr1 GFP / GFP MP의 생존 시간을 연장시키는 데 참여한다.
이에, 본 결과는 APOE 및 IL-6이 AMD 발병기전에 참여한다는 것을 최초로 입증한다. IL-6이 RPE FasL 발현을 억제시키고, 망막하 MP 생존을 연장시키며, 만성 망막하 염증을 촉진시킨다고 밝혀진 것을 고려해 볼 때, 따라서, CD14 또는 IL-6 억제가 RPE 면역억제 기능을 재확립하고, 후기 AMD에서 병원성 염증을 억제시키는 데 도움을 줄 수 있다.
실시예 8: APOε 2 대립유전자 관련 ApoE 분비가 망막하 대식세포 생존 및 망막 변성을 촉진시킨다
상기 제시된 바와 같이, CX3CR1은 단핵성 포식세포에서 APOE 전사를 조절하지만, APOE의 전사 조절은 복잡하며, 근위 프로모터 및 원위 인핸서와 전사 인자와의 상호작용을 필요로 하는 것으로 알려져 있다. ε2/ε3/ε4 대립유전자를 정의하는 두 다형성, rs7412 및 rs429358은 세포 유형, 이소형, 및 DNA 메틸화에 의존하는 방식으로 후성적으로 APOE 전사를 조절하는, 잘 정의된 CpG 섬에 포매되어 있는 것으로 최근 밝혀졌다 (문헌 [Yu et al., 2013]). 증가된 AMD 위험을 부여하는 APOε2 대립유전자는 다른 이소형과 비교하였을 때 rs7412에 CpG 부위를 포함하지 않으며, 이는 특정 세포 유형, 예컨대, 뇌 성상세포에서의 APOE 전사를 증가시킨다. APOE 대립유전자가 단핵성 포식세포에서 그의 전사에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 인간 APOE 이소형과 동일한 CpG 섬 구조를 가지는 인간화된 APOE 마우스 모델을 사용하였다. 본 결과, 24h의 세포 배양 후 APOε2 BMM 및 RPM은 다른 두 이소형과 비교하였을 때 유의적으로 더 많은 APOE mRNA를 발현하는 것으로 나타났다 (도 23, APOε3 BMM에 대해 상대적으로 계산). TPM에서의 발현은 더욱 가변적이며, 새로 추출된 뇌 MC에서는 어떤 유의적인 차이도 검출되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 유사하게, 망막하 단핵성 포식세포 분화를 자극시키기 위하여 POS의 존재하에서 3일 동안 배양된 APOε2 BMM의 RT-PCR 결과, APOε3 및 APOε4 마우스로부터의 BMM과 비교하였을 때, 유의적으로 더 많은 APOE mRNA를 발현하였다 (도 24).
흥미롭게도, 24h 동안 배양된 BMM과 달리, 각 APOE 이소형에 대하여 동형접합성인 인간 기증자로부터의 14일 동안의 시험관내 단핵구 유래 대식세포에 관한 공지된 종래 보고와 유사하게, 3일째 POS 없이 배양된 BMM에서는 어떤 유의적인 차이도 검출되지 않았다. APOε2 RPM은 또한 항-인간 APOE ELISA를 사용하여 측정된 바와 같이, 다른 이소형과 비교하였을 때, 유의적으로 더 많은 APOE를 분비한다 (도 25). 흥미롭게도, Cx3cr1 결핍 및 APOε2 대립유전자는 같은 단핵성 포식세포에서 APOE 전사에 어떤 영향도 미치지 않았으며, 이는 기본 전사 조절 메커니즘이 상이하다는 것을 제안한다. 그러나, Cx3cr1 결핍 및 APOε2 대립유전자는, 가능하게는 침윤성 단핵구의 망막하 단핵성 포식세포 분화를 가장 잘 자극시키는 POS 인큐베이션된 BMM에서의 APOE 전사에 영향을 준다.
APOE 의존성 대식세포 IL-6 분비가 증가된 망막하 대식세포 생존의 중요한 매개인자인 바, APOE 이소형이 IL-6을 유도하는지 여부, 및 ε2/ε3/ε4 대립유전자를 보유하는 대식세포가 시험관내에서 IL-6 방출에 있어 차이를 보이는지 여부를 시험하였다. APOE 인큐베이션된 C57BL/6J RPM으로부터의 배양 배지의 ELISA 분석 결과, 대조군과 비교하였을 때, 3가지 이소형 모두 IL-6 분비를 유의적으로 유도하였으며, APOE2 및 APOE4에 의한 유도가 APOE3보다 유의적으로 열등한 것으로 나타났다 (도 26). 그러나, 증가된 양으로 APOE를 분비한 APOε2 RPM은 APOε3 및 APOε4 대식세포와 비교하였을 때, 유의적으로 더 많은 IL-6을 방출하였다 (도 27).
이러한 결과는 IL-6을 유도하는 데 있어 감소된 APOE2 효율이 APOε2 RPM에서의 APOE 분비 증가에 의해 더욱 잘 상쇄된다는 것을 나타낸다.
APOε2 RPM에서 관찰되는 증가된 APOE 및 IL-6 분비가 망막하 대식세포 제거를 감소시키는지 여부를 시험하기 위해, CFSE 표지된 상주 복강 세포 (RPC)를 망막하로 주사하고, 24h째에 망막 및 망막 색소 상피 편평 표본 상에서 CFSE+F4/80+ 대식세포를 정량하였다.
APOε2 RPM은 APOε3 및 APOε4 대식세포보다 유의적으로 더 많았고 (도 28), IL-6 차단 항체 또는 메가FasL의 첨가가 주사 후 24h째에 APOε2 대식세포 존재를 유의적으로 감소시켰다 (도 29).
APOε2 대립유전자가 생체내에서 망막하 단핵성 포식세포 제거에 대한 이러한 저항을 부여하는지 여부를 연구하기 위해, 본 발명자들은 12개월된 APOε3 -, APOε2-, 및 APOε4-마우스의 IBA-1 염색된 망막 및 망막 색소 상피/맥락막 편평 표본 상의 단핵성 포식세포 축적을 평가하였다. 흥미롭게도, 망막하 IBA-1+ 단핵성 포식세포의 정량화 결과, 다른 이소형을 보유하는 마우스와 비교하였을 때 APOε2 마우스에서는 유의적인 연령 의존성 망막하 단핵성 포식세포 축적이 나타났다 (도 30). 추가로, 망막하 MP의 이러한 유의적인 증가는 APOε2-마우스에서 4500 lux 광-챌린지 후 4일째 (도 48) 및 레이저 화상에 의한 망막하 염증 유도 후 7일째 (도 44)에 관찰되었다.
또한, 12개월된 APOε3 -, APOε2 - 및 APOε4- 마우스의 조직학적 분석 및 그의 ONL 두께의 정량화 (도 31a 및 31b) 결과, APOε3 - 및 APOε4 -마우스와 비교하였을 때, 12개월된 APOε2 마우스에서 광수용체의 유의적인 연령 의존성 손실이 나타났고, 레이저-손상 후 7d째 APOε2-마우스에서 증가된 염증은, RPE/편평 표본 상에서의 CD102 양성 면적으로 정량된, 맥락막 신생혈관 증가를 동반하였다 (도 46).
또한, 12개월된 APOε3 -, APOε2 - 및 APOε4- 마우스의 조직학적 분석 및 그의 ONL 두께의 정량화 (도 31a 및 31b) 결과, APOε3 - 및 APOε4 -마우스와 비교하였을 때, 12개월된 APOε2 마우스에서 광수용체의 유의적인 연령 의존성 손실이 나타났다.
CD14 의존성 IL-6 유도가 생체내에서 망막하 MP 축적에 실제로 참여하는지 여부를 시험하기 위해, (망막하 공간으로의 항체 투과도 촉진시키는) 레이저-손상으로 망막하 염증을 유도한 후, APOε2-마우스의 유리체 내로 대조군 IgG 및 IL-6- 또는 CD14-중화 항체를 주사하였다. 레이저-충격 후 7일째 CD102+CNV에 인접한 RPE에서 관찰된 망막하 IBA1+ MP의 축적은 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스와 유사하게 관련된 CNV와 같이 (도 47), CD14 또는 IL-6 중화시 유의적으로 억제되었다 (도 45).
요약컨대, 상기 결과는 AMD 위험을 부여하는 APOε2 대립유전자가 특정 환경하에 단핵성 포식세포에서 증가된 APOE 전사 및 IL-6 분비와 관련이 있다는 것을 보여준다. 상기 실험은 APOE를 과다발현하는 APOε2 단핵성 포식세포가 IL-6 및 FasL에 의존하는 방식으로 망막하 제거에 대하여 더욱 큰 저항을 띤다는 것을 입증한다. 따라서, 노화된 APOε2 트랜스제닉 마우스 생체내에서 관찰된 망막하 단핵성 포식세포의 연령 의존성 축적 및 관련된 광수용체 변성으로부터 유사 메커니즘은 생체내에서 망막하에서 발생한다고 유추할 수 있다.
종합적으로 고려해 볼 때, 상기 관찰 결과는 아직 설명되지 못한 IL-6 수준 상승과 AMD의 관련성에 중요한 병태생리를 제공하며 (문헌 [Klein et al., 2008]), 연성 드루젠에 및 그 주변에의 망막하 단핵성 포식세포 축적이 조기 중간 정도의 AMD에서 관찰되는 유의적인 초점 염증에 관여한다는 것을 입증한다. 이러한 관찰 결과는 또한 APOE가 조기 AMD의 망막하 단핵성 포식세포에서 발현되고, CX3CR1의 긴장 억제성 신호가 결여된 마우스 및 APOε2 트랜스제닉 마우스에서 증가된다는 것을 입증한다. 상기 결과는 APOE가 IL-6을 유도하고, 이는 망막 색소 상피 FasL 발현을 하향조절함으로써 Cx3Cr1 결핍 마우스 및 APOε2 마우스에서 관찰되는 연장된 망막하 단핵성 포식세포 생존, 단핵성 포식세포 축적, 및 관련된 광수용체 변성을 허용한다는 것을 입증한다.
상기 결과는 AMD 위험을 부여하는 APOε2 대립유전자가 단핵성 포식세포에서 APOE 전사 증가와 관련이 있으며, 이러한 메커니즘은 CX3CR1 신호전달과는 독립적이라는 것을 추가로 입증한다. 이러한 결과는 APOε2 TR 및 Cx3cr1 GFP / GFP 마우스에서 관찰되는, APOE를 과다발현하는 망막하 단핵성 포식세포가 제거에 대하여 더욱 큰 저항을 띤다는 것을 나타낸다. 상기 결과를 비추어 볼 때, 따라서, APOε2 보유 환자에서 연성 드루젠 주변의 망막 색소 상피에 인접한, 지도형 병변에 인접한, 및 CNV에서의 망막하 단핵성 포식세포 축적 증가는 명백하게 AMD 진행 및 후기 AMD에 관여하는 것으로 보인다. 그러므로, 선행 내용으로부터 놀랍게도, 과도한 APOE 및 IL-6의 억제, 또는 망막 색소 상피 FasL 발현의 복구가 조기 AMD에서 망막하 염증을 제어할 수 있고, 후기 AMD의 발생을 예방할 수 있다는 결과를 얻을 수 있다.
참고 문헌
Figure 112016075979312-pct00001
Figure 112016075979312-pct00002
Figure 112016075979312-pct00003
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Figure 112016075979312-pct00005

Claims (6)

  1. 망막 염증 치료에 사용하기 위한 IL-6 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서,
    상기 IL-6 억제제가 IL-6을 인식하는 항체이고,
    상기 망막 염증이 위축성 연령-관련 황반 변성 또는 색소성 망막염인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-6을 인식하는 항체가 MH166 항체, SK2 항체 또는 그의 인간화된 유도체, 실투맙, 아비머 TM C326, 시루쿠맙, 실툭시맙, 올로키주맙, ALD518, VX30, ARGX-109, FM101 및 MAB 406으로 이루어진 군에서 선택되는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 IL-6 억제제가 안구내로 투여되는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 IL-6 억제제가 유리체내 주사에 의해 투여되거나 또는 국소 안구 투여에 의해 적용되는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-6 억제제가 5 mg/mL 내지 500 mg/mL의 농도인 약제학적 조성물.
  6. 삭제
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