KR102372201B1

KR102372201B1 - 면역 조절용 화합물, 이의 용도 및 이를 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102372201B1
Application number: KR1020167010722A
Authority: KR
Inventors: 웨이 정; 우빈 판; 신 양
Original assignee: 쑤저우 커넥트 바이오파마슈티컬즈, 엘티디.
Priority date: 2013-09-22
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2022-03-07
Also published as: CN103450171A; NZ719186A; AU2014323822B2; US10280158B2; CA2928300C; WO2015039587A1; JP2016530334A; US20160347745A1; ES2802977T3; CN103450171B; CA2928300A1; EP3048103B1; AU2014323822A1; EP3048103A1; KR20170055445A; JP6470757B2; EP3048103A4

Abstract

본 발명은 하기 식 1로 표시되는 화합물을 제공한다, 여기서 R은 할로젠 또는 C₁-C₆의 알킬기이다. 상기 화합물은 S1P1 수용체 작용제 활성및 선택성을 가지고 분명하게-단축된 반감기를 가진다. 따라서, 상기 화합물은 고-품질의 차세대 S1P1 수용체 작용제이다. 또한, 본 발명은 S1P1 수용체에 의해 매개되는 질병 또는 증상 치료용 약물 제조에 상기 화합물의 용도, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 및 S1P1 수용체에 의해 매개되는 질병 또는 증상 치료에서 상기 약학적 조성물 및 상기 화합물의 용도를 제공한다.
[식 1]

Description

면역 조절용 화합물, 이의 용도 및 이를 함유하는 약학적 조성물{IMMUNE ADJUSTMENT COMPOUND, USE THEREOF AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME}

본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, S1P1 수용체 작용제의 활성을 갖는 신규 화합물, 이를 함유하는 약학적 조성물, 상기 화합물과 약학적 조성물의 S1P1 수용체에 의해 매개되는 질환의 치료를 위한 약제 제조의 용도 및 S1P1 수용체에 의해 매개되는 관련 질환의 치료를 위한 상기 화합물 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

해당 분야에 잘 알려진 것처럼, 림프구는 스핑고신-1-포스페이트 수용체 1(S1P1)의 존재는 림프 조직으로부터 말초순환으로 림프구의 이동을 위해 필요하다. 한편, S1P1의 내재화는 림프조직으로부터 림프구의 배출을 막아, 이에 중요한 면역 세포를 림프조직에 국한시킨다. 많은 연구를 통해, 림프구에서 발현되는 동종 수용체에 결합하고 S1P1의 내재화를 야기하고, 이에 림프구의 이동을 방지할 수 있는 여러 S1P1 작용제가 존재함을 규명였다. S1P1 수용체 작용제는 림프구의 이동을 제한함으로써 인간의 면역 반응 개시능을 줄일 수 있고, 따라서 다양한 자가 면역 질환의 치료에 면역 억제제로서 기능할 수 있다.

많은 S1P1 작용제가 제시되었고, 그 중 가장 대표적인 화합물로 FTY720이 있다("Fingolimod"라고 불린다). 현재 FTY720은 시판되어 노바티스에 의해 상표명 "Gilenya", 다발성 경화증 치료용으로 판매되고 있다. 상기 FTY729은 치료 효과를 가지나, 선택성이 없는 S1P 수용체 작용제며 S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, 및 S1P5와 같은 여러 S1P 수용체를 활성화 할 수 있다. S1P3와 상기 FTY729의 결합으로부터 심각한 부작용들이 유발될 수 있는데, 예를 들어 서맥 및 조직 섬유증이 있다. 이에, 상기 FTY720의 부작용을 극복하기 위하여, 많은 제약 회사 및 생명 공학 그룹들이 보다 선택적이고 안전한 차세대 S1P1 작용제를 찾고 있다.

또한, 타깃 선택성을 향상하는 것 외에, 약물(즉, S1P1 수용체 작용제)의 생체 내 반감기를 줄이는 것은 차세대 S1P1 작용제를 선별의 또 다른 중요한 목적이다(Pan et al., 2013, ACS Medicinal Chemistry Letters, 4, p333). 전통적으로, 긴 반감기는 약의 빈번한 복용 횟수를 피할 수 있어, 긴 반감기의 작은 분자 약물은 필수적인 것으로 고려되어 왔으나, 긴 반감기는 면역 억제 약물에 있어 심각한 단점이 될 수 있는데, 약물 사용자에게 면역 억제제 약물이 지속적으로 림프구의 이동이 억제되고, 이에 말초 혈액내 림프구의 수가 감소 되어, 이로부터 면역 기능이 감소되고 바이러스 감염의 위험성이 증가되기 때문이다. 상기와 같은 단점은 현재 임상적으로 사용되는 FTY720과 같은 S1P1 수용체 작용제에서 발견된다. 감염의 경우, 가능한 빠르게 정상 수준으로 말초 혈액 내 림프구를 돌려놓고 인체의 면역 기능을 회복시키기 위해, 종종 약의 복용을 중단할 필요가 있다. 체내의 FTY720의 반감기가 6 내지 9일이기 때문에, 환자가 상기 약물을 중단하더라도 정상 수준으로 림프구를 되돌리려면 긴 시간이 요구된다(Budde et al., 2002, Journal of the American Society of Nephrology, 13:1073-83).

따라서, 본 기술 분야에서 기존 치료법의 단점을 극복하기 위해, S1P1 수용체에 대한 높은 선택성 및 짧은 반감기를 갖는 새로운 S1P1 수용체 작용제 약물 개발이 여전히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 현존하는 S1P1 수용체 작용체의 선택성 및 반감기에 결함을 해결하기 위한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 약제를 제조하기 위한 화합물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 주요 활성 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 상기 약학적 조성물을 사용하는 질병 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 합성 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 의약품 화학 합성을 수행하였고, 면역 세포 조절 등에 대한 연구와 조합하여 래트에서 약동학 연구를 통해 많은 수의 합성된 화합물에 대하여 선별작업을 수행하였다.

상기 연구를 통해, 1-{4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실 산으로 알려진(Li et al., 2005, Journal of Medicinal Chemistry, 48 (20) 6169-6173; also known as “Compound 1” herein), 하기 식 1A로 나타나는 화합물의 2번 위치에 알킬 또는 할로젠의 첨가함으로써 신규한 화합물을 얻을 수 있다는 것을 알아내었다.

상기 화합물은 정맥, 경구 투여 후, 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 면역 조절의 효능을 가지고 있었고, 또한 할로젠으로 치환함으로써 합성된 화합물은 상기 다른 두가지 방법의 투여 후, 분명하게 감소된 반감기를 가지는 것으로 확인되었다.

[식 1A]

(화합물 1)

상기 목적을 달성하기 위해, 하기와 같이 본 발명은 기술적인 해결책을 제공한다:

하나의 양태로, 본 발명은 하기 식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[식 1]

(식 1)

식 1에 있어서,

R은 할로젠 또는 C₁-C₆의 알킬이다.

바람직하게, 상기 R은 F, Cl 또는 Br이거나, 상기 R은 C₁-C₃의 알킬이고, 보다 바람직하게 메틸이다.

상기 R이 F인 경우, 상기 화합물은 하기 식 1B로 표시되는, 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(본 명세서상 "화합물 2"):

[식 1B]

식 1B(화합물 2)

상기 R이 Cl인 경우, 상기 화합물은 식 1C로 표시되는, 1-{2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(본 명세서상 "화합물 3"):

[식 1C]

식 1C(화합물 3)

상기 R이 Br인 경우, 상기 화합물은 식 1D로 표시되는, 1-{2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(본 명세서상 "화합물 4"):

[식 1D]

식 1D(화합물 4)

상기 R이 메틸인 경우, 상기 화합물은 식 1E로 표시되는, 1-{2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(본 명세서상 "화합물 5"):

[식 1E]

식 1E(화합물 5)

많은 실험을 통해, 본 발명에서 제공하는 상기 화합물은, 상기 화합물에 의해 유도되는 S1P1의 내재화 및 말초 혈액 내 감소된 림프구 수의 검출로부터 확인되는, S1P1 작용제 활성을 가지는 것으로 나타났다. 한편, 본 발명에서 제공하는 화합물은 또한 S1P1에 대한 특정 선택성을 갖는다; 특히 상기 화합물은 S1P3가 발현되는 세포에 내재화를 유도하지 않았다. 또한, 본 발명에서 제공하는 상기 화합물의 약동학 실험에서, 특정 화합물의 반감기가, 식 1A로 표시되는 화합물의 반감기와 비교하여 상당히 짧아졌고, FTY720의 반감기 보다 많이 짧은 것으로 나타났다.

따라서, 또 다른 양태로, 본 발명은 S1P1에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 치료용 약물의 제조를 위한 상기 화합물의 용도를 제공한다.

특히, 상기 질환 또는 상태는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장염, 자가 면역 질환, 만성 염증성 질환, 천식, 염증성 신경 병증, 관절염, 이식, 크론 병, 궤양성 대장염, 홍반 루푸스, 건선, 허혈-재관류 손상, 고형 종양, 혈관 신생과 관련된 질환, 혈관 질환, 통증, 급성 바이러스성 질환, 염증성 장 질환, 인슐린 및 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병, 및 기타의 것과 관련된 면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 질병 또는 상태는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 염증성 장염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

S1P1에 의해 매개되는 질병 또는 상태에 대한 치유 외에도, 본 명세서에서 사용되는, 표현 "치료" 또는 "처치"는 상기 질병 또는 상태를 예방하거나 또는 증상을 감소시키는 것 등을 포함한다.

나아가 다른 양태로, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 상기 화합물 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 그 자체로 의약 제제일 수 있거나, 또한 다른 부형제나 약물과 조합 의약 제제 또는 의약 제제로 제조될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 의해 제공되는 상기 약학적 조성물은 정제, 좌제, 분산성 정제, 장용 코팅 정제, 씹을 수 있는 정제, 경구 정제, 캡슐, 당-코팅제, 과립제, 건조 분말, 경구액, 주사용 작은 바늘, 동결 건조된 분말 또는 주사를 위한 대용량 비경구 용액의 형태일 수 있다; 여기서, 상기 약학적으로 허용 가능한 부형제는 희석제, 가용화제, 붕해제, 현탁제, 윤활제, 결합제, 충전제, 향미제, 감미제, 산화 방지제, 계면 활성제, 방부제, 소포, 안료, 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 대상에 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 화합물 또는 상기 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 S1P1에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 대상은 포유류이다.

여기서, 상기 질환 또는 상태는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장염, 자가 면역 질환, 만성 염증성 질환, 천식, 염증성 신경 병증, 관절염, 이식, 크론 병, 궤양성 대장염, 홍반 루푸스, 건선, 허혈-재관류 손상, 고형 종양, 혈관 신생과 관련된 질환, 혈관 질환, 통증, 급성 바이러스성 질환, 염증성 장 질환, 인슐린 및 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병, 및 기타의 것과 관련된 면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 질병 또는 상태는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 염증성 장염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에서 제공되는 상기 화합물 또는 상기 약학적 조성물은 다른 요법 또는 치료제와 같이 투여될 수 있다. 또한, 치료, 예방 또는 지연의 역할을 수행하기 위해 필요한 상기 화합물 또는 상기 약학적 조성물의 투여량은 투여되는 특정 화합물, 환자, 특정 질병 또는 장애 및 이의 심각도, 투여의 경로 및 횟수 등에 의존적이고, 특정 상태에 따라 담당 의사에 의해 결정되어야 한다.

요약하면, 본 발명은 S1P1 작용제의 활성을 가지는 신규한 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1A로 표시되는 화합물의 2번 위치에 할로젠 특히 불소, 염소 또는 브롬으로 또는 저급 알킬로 치환함으로써 얻어진다. 본 발명의 상기 화합물은, 실험적으로 검출된 S1P1의 내재화 및 말초 혈액 내 감소된 림프구의 수를 통해, S1P1 작용제의 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 또한, S1P3가 발현되는 세포를 사용한 내재화 유도 실험을 통해 상기 화합물이 S1P1에 대한 특정 선택성을 갖는 것으로 입증되었다.

특히, 알려진 S1P1 작용제 및 식 1A로 표시되는 화합물과 비교하여, 할로젠으로 치환함으로써 얻어진 본 발명의 상기 화합물은 상당히 짧아진 반감기를 갖는다. 약물 동역학 실험은 상기 화합물의 반감기가 약 11시간 내지 5.5시간 또는 그 이하의 시간으로 상당히 짧아지는 것을 입증하였다. 정맥 투여 또는 경구 투여 둘 모두의 경우에서 상당히 짧은 반감기를 나타냈고, 이는 평균 체류 시간의 감소된 파라미터(parameter)와 일치하였다. 또한, 특정 위치에 특정 치환체로 치환하는 것은 창조적이다. 게다가, 저급 알킬, 특히 메틸(화합물 5)로 상기 같은 위치에 치환함으로써 얻어진 화합물의 반감기가 짧아지지 않았더라도, 생체 내 림프구에 대한 효과는 할로젠으로 치환된 화합물의 효과와 유사하였다. 상기와 같은 결과는 본 발명에 의해 제공되는 화합물이 충분한 잠재력을 갖춘 차제대 S1P1 작용제임을 나타낸다.

또 다른 양태로, 식 1B로 표시되는 화합물(화합물 2)의 경우와 같이, 본 발명은 간단한 반응 조건을 포함하고, 후처리에 편리하며, 높은 수율 및 안정한 공정으로 산업화된 제조공정에 적합한 합성 방법을 제공한다.

간략하게, 본 발명의 합성 방법은 하기와 같다:

구체적으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식 1B로 표시되는 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실 산("화합물 2")의 합성 방법을 제공한다.

(1) 하기 반응식 (1)과 같이, 축합제 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 및 1-하이드록시벤조트리졸의 존재하에, 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘과 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산을 반응시켜 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 제조하는 단계:

[반응식 (1)]

(2) 하기 반응식과 (2)와 같이, 상기 단계 (1)에서 제조한 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올과 이산화망간을 반응시켜 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 제조하는 단계:

[반응식 (2)]

(3) 하기 반응식 (3)과 같이, 아세트 산을 촉매로 및 소듐 시아노보로하이드라이드를 환원제로 사용하여, 상기 단계 (2)에서 제조한 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드와 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실 산을 반응시켜 식 1B로 표시되는 화합물을 제조하는 단계:

[반응식 (3)]

본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 상기 단계 (1)은 또한, 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 제조 후, 얻어진 미정제 생성물을 정제하는 단계를 포함한다; 바람직하게, 상기 정제는 컬럼 크로마토그래피 또는 결정화를 통해 수행된다.

상기 결정화를 통해 정제가 수행될 경우, 사용되는 결정화 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상이고, 바람직하게, 상기 결정화 용매는 메탄올 및 물의 혼합 용액이고, 보다 바람직하게, 상기 결정화 용매는 메탄올 및 물을 부피비 3:1의 비율로 혼합한 혼합용액이다.

바람직하게, 상기 미정제 생성물(g, 중량)의 결정화 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:3-20, 보다 바람직하게, 1:5이다.

바람직하게, 상기 결정화는 20℃에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 상기 단계 (1)은 아세토니트릴, N-메틸피롤리돈 및 N,N-디메틸포름아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 반응 용매에서 수행되고; 상기 반응은 80-140℃의 온도에서 수행되고; 및 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘의 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산에 대한 몰 비율은 1:1-2.0이다.

바람직하게, 단계 (1)에서, 상기 반응 용매는 N,N-디메틸포름아미드이고;

바람직하게, 상기 반응 온도는 130-140℃이고; 및

바람직하게, 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘의 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산에 대한 몰 비율은 1:1-1.5, 보다 바람직하게 1:1-1.2이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 상기 단계 (2)의 반응은 톨루엔, 테트라하이드로퓨란 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 반응 용매에서 수행되고; 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(g, 중량)의 상기 반응 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:10-30이고; 상기 반응은 40-70℃의 온도에서 수행되고; 및 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:4-10이다.

바람직하게, 단계 (2)에서, 상기 반응 용매는 에틸 아세테이트이고;

바람직하게, 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(g, 중량)의 상기 반응 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:10이고;

바람직하게, 상기 반응 온도는 60-70℃이고; 및

바람직하게, 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:5-6, 보다 바람직하게 1:6이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 상기 단계 (3)의 반응은 테트라하이드로퓨란 및 메탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 반응 용매에서 수행되고; 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1-1.2이고; 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율은 1:0.5-6이고; 상기 반응은 0-30℃의 온도에서 1-16 시간의 반응 시간 동안 수행된다.

바람직하게, 단계 (3)에서, 상기 반응 용매는 메탄올이고;

바람직하게, 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1-1.1이고; 보다 바람직하게 1:1이고;

바람직하게, 상기 소듐 시아노보로하이드라이드는 메탄올에 녹이고 반응계에 0-20℃의 온도에서, 보다 바람직하게 15-20℃의 온도에서 적하하고;

바람직하게, 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율은 1:1이고;

바람직하게, 상기 반응은 10-20℃의 온도, 보다 바람직하게 15-20℃의 온도에서 수행되고; 및

바람직하게, 상기 반응 기간은 4-16 시간이다.

본 발명에 의해 제공되는 식 1B(화합물 2)로 표시되는 상기 화합물의 합성 방법의 단계 (1)에서, 중간 미정제 생성물의 정제는, 컬럼 크로마토그래피 보다, 바람직하게 결정화로 수행된다. 정제 작업은 많은 양의 용매가 요구되고, 환경에 덜 친화적이며, 많은 비용이 필요한 컬럼 크로마토그래피를 포기함으로써 단순화되고 많은 양의 용매 사용을 피할 수 있다. 한편, 본 발명에서 제공되는 상기 합성 방법의 각 단계에서 사용되는 반응물, 용매 및 이의 양은 조정된다. 예를 들어, 단계 (2)에서, 이산화망간의 감소량은 비용 감소를 위해 사용될 수 있고; 및 발생할 수 있는 안전 위험을 피하기 위한 반응 용매로서, 테트라하이드로퓨란 보다, 에틸 아세테이트를 사용할 수 있다. 단계 (3)에서, 메탄올은, 반응 중 부산물 생성을 줄일 수 있고, 반응 수율은 증가되며, 반응에 사용되는 용매의 양을 감소시키는, 반응 용매로 사용된다. 일반적으로 말해서, 상기와 같은 개선을 통해 비용이 감소하고, 저비용으로 대량제조하고, 높은 효율과 안전 수준이 실현된다.

본 명세서에 이에 제한되지 않으나 본 명세서에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하여 모든 발행물이, 각 개별 공보가 구체적으로 및 개별적으로 완전히 기재된 것으로 본 명세서에 참고로 포함되도록 나타내는 것처럼, 참고로 인용된다.

본 발명은 S1P1 작용제의 활성을 가지는 신규한 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1A로 표시되는 화합물의 2번 위치에 할로젠 특히 불소, 염소 또는 브롬으로 또는 저급 알킬로 치환함으로써 얻어진다. 본 발명의 상기 화합물은, 실험적으로 검출된 S1P1의 내재화 및 말초 혈액 내 감소된 림프구의 수를 통해, S1P1 작용제의 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 또한, S1P3가 발현되는 세포를 사용한 내재화 유도 실험을 통해 상기 화합물이 S1P1에 대한 특정 선택성을 갖는 것으로 입증되었다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 실시 예 6에서의 본 발명에서 제공하는 화합물의 약물 동력학 실험 결과를 나타내고, 도 1A는 랫트에 화합물 2, 3 및 4를 경구 투여 후, 시간 경과에 따라 변하는 생체 내 약물 농도에 대한 실험데이터를 보여주고, 도 1B는 랫트에 화합물 1 및 5를 경구 투여 후, 시간 경과에 따라 변하는 생체 내 약물 농도에 대한 실험 데이터를 보여준다.
도 2는 실시예 8의 실험 결과를 나타내고, 본 발명의 화합물 2에 의해 말초 혈액 내 감소된 림프구의 수룰 나타낸다.
도 3은 실시예 8의 실험 결과를 나타내고, 본 발명의 화합물 3 및 4를 랫트에 0.1 mg/kg(체중)으로 투여함으로써, 말초 혈액 내 감소된 림프구의 수룰 나타낸다.
도 4는 실시예 8의 실험 결과를 나타내고, 본 발명의 화합물 5를 랫트에 0.1 mg/kg(체중)으로 투여함으로써, 말초 혈액 내 감소된 림프구의 수룰 나타낸다.
도 5는 실시예 9의 실험 결과를 나타내고, 본 발명에 의해 제공되는 화합물 2에 의해 억제되는 관절염의 부종의 발달 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 9의 실험 결과를 나타내고, 본 발명에 의해 제공되는 화합물 2에 의해 억제되는 관절염의 관절 구조의 손상을 나타낸다.
도 7은 실시예 10의 실험 결과를 나타내고, 본 발명에 의해 제공되는 화합물 2에 의해 억제되는 EAE의 발달 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 8c는 실시예 11의 실험 결과를 나타내고, 본 발명에 의해 제공되는 화합물 2의 심전도 지수에 대한 효과를 나타낸다. 이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 것일 뿐, 어떤 방식으로도 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님을 해당 분야의 당업자라면 이해할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명은 실시예를 들어 상세히 설명한다.

다음의 구체적인 실시 예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 당업자는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐임을 이해할 것이다.

이하 실시예에 기술된 실험 방법에 있어, 달리 명시하지 않는 한, 종래의 방법 또는 통상적인 방법이다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 원료, 시약 및 후술하는 실시예 및 실험예에 사용된 모든 재료는 시중에서 구입 가능한 것이다.

실시예 1: 1 -{4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3- 아제 티딘 카르복실산(화합물 1)의 제조

1.1 (Z)-N'-히드록시-4- 히드록시메틸 벤즈아미딘 (1-3)

히드록시라민 히드로클로라이드(1-2, 20.903 g, 300.76 mmol) 및 소듐 바이카보네이트(50.5 g, 601.5 mmol)를 4-히드록시메틸 벤조니트릴(1-1, 20 g, 150.38 mmol)이 녹아 있는 메탄올(250 mL)에 연속적으로 첨가하여 현탁액을 제조한 후, 5시간 동안 가열 환류하였다. 이것을 실온으로 식힌 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(100 mL)로 씻어주고, 얻어진 여과액을 농축하여 (Z)-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘을 흰색 미정제 생성물(1-3, 24.8 g 미정제 생성물, 99.3% 수율)로 수득하였고, 다음 단계에 직접 사용하였다.

액체 크로마토그래피 질량 분석으로 나타낸 분자 이온피크는 다음과 같다:

MS (ESI): m/z 167.3 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H).

1.2 4 -[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 알코올(1-5)

실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 26.6 g, 149.4 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 28.685 g, 149.4 mmol) 및 1-히드록시벤조트리졸(20.169 g, 149.4 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(200 mL)에서 30분 동안 교반한 뒤, (Z)-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 24.8 g, 149.4 mmol)을 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 140℃ 유조(oil bath)에서 2시간 동안 가열하였다. LC-MS로 반응 종결을 확인하였다. 이후, 실온으로 냉각한 뒤, 감압하에 증류하여 대부분의 N,N-디메틸포름아미드를 제거하였다. 물 및 에틸 아세테이트로 추출하고, 상기로부터 얻어진 유기상을 0.5 N HCl 용액, 포화 NaHCO₃ 용액 및 물로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 여과액을 농축하여 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체 생성물(1-5, 34.5 g, 75% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 309.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.16 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.79 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.95 (m, 1H), 1.85 (t, 1H), 0.97 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

1.3 4 -[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤즈알데하이드 (1-6)

60℃에서, 4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 17.7 g, 57.5 mmol) 및 이산화망간(50 g, 575 mmol)의 테트라하이드로퓨란(330 mL) 현탄액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 현탄액을 실온으로 냉각시켜주고, 여과하고, 농축하여 건조하였다. 이후, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 20/1)로 정제하여 4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 흰색 고체 생성물(1-6, 16.44 g, 93.5% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 307.2 [M+H]⁺.

2. 1-{4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3- 아제티딘 카르복실산

실온에서, 4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 10 g, 32.7 mmol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 3.63 g, 36 mmol) 및 아세트산(15 mL)의 메탄올/테트라하이드로퓨란(200 mL/200 mL) 용액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 용액에 소듐 시아노보로하이드라이드(1.03 g, 16.35 mmol)의 메탄올(60 mL) 용액을 첨가하고, 결과 혼합물을 실온에서 추가적으로 16시간 동안 교반한 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(90 mL)로 씻어주고 건조하여 1-{4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산을 흰색 고체 생성물로(5.5g; 화합물 1-6으로부터 환원 생성물 1-5를 회수하고, 산화한 뒤, 환원성 아민화 하여 5g의 최종생성물을 수득하였다; 82% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 392.2 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.12 (m, 4H), 3.42 (m, 1H), 2.63 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.97 (m, 1H), 0.97 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

실시예 2: 1 -{2- 플루오로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤 질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2)의 제조

1.1 4 - 브로모 -2- 플루오로벤질 알코올 (1-1)

0℃에서, 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.14 g, 30 mmol)를 메틸 4-브로모-2-플루오로벤조에이트((4.66 g, 20 mmol)의 테트라하이드로퓨란(100 mL)에 천천히 적하 하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거한 뒤, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응을 종결시켰다(LCMS 및 TLC로 확인). 혼합물을 다시 0℃로 냉각한 뒤, 물(1.14 mL) 및 10%의 NaOH 용액(11.4 mL)으로 각각 퀀칭하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 뒤, 혼합물을 여과하고, 이어서 여과 잔여물을 테트라하이드로퓨란(50 mL X 2) 및 에틸 아세티이트 EA(50 mL X 2)로 씻어주었다. 여과액은 무수 황산나트륨으로 건조시킨 뒤, 여과하고, 농축하여 무색의 오일 생성물(3.4 g, 83% 수율)을 수득하였다.

1.2 3 - 플루오로 -4- 하이드록시메틸 벤조니트릴(1-2)

시안화 아연(1.85 g, 15.85 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(Pd(PPh₃)₄, 0.916 g, 0.79 mmol)을 4-브로모-2-플루오로벤질 알코올의 DMF(35 mL) 용액에 첨가하였다. 아르곤 버블링(bubbling)을 통해 산소를 제거한 후, 반응 혼합물을 100℃로 가열하고 16시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시킨 뒤, 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하고, 물(100 mL X 3) 및 포화 염수(100 mL X 3)으로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조 시킨 뒤, 여과하였다. 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 15/1-4/1)로 정제하여 흰색 고체의 생성물(0.72 g, 30% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 152.1 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.63 (t, J = 7.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 1.2 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 1.2 Hz, 9.2 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 10 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 10 Hz, 1H).

1.3 (Z)-3- 플루오로 -N'-히드록시-4- 히드록시메틸 벤즈아미딘 (1-3)

히드록시라민 히드로클로라이드(0.645 g, 9.28 mmol) 및 소듐 바이카보네이트(1.56g, 18.56 mmol)을 연속적으로 3-플루오로-4-히드록시메틸 벤조니트릴(1-2, 0.70 g, 4.64 mmol)의 메탄올(150 mL) 용액에 첨가하여 현탁액을 제조한 뒤, 5시간 동안 가열 환류하였다. 이어서, 실온으로 식힌 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어주고, 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘을 흰색 미정제 생성물로(1-3, 0.846 g, 99% 수율) 수득하였고, 이것을 다음 단계에 직접 사용하였다.

MS (ESI): m/z 185.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.51~7.45 (m, 2H), 7.37~7.34 (m, 1H), 4.67 (s, 2H).

1.4 2 - 플루오로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 알코올(1-5)

실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.819 g, 4.60 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 0.882 g, 4.60 mmol) 및 1-히드록시벤조트리졸(0.621 g, 4.60 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(10 mL)를 30분 동안 교반하고, (Z)-3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.846 g, 4.60 mmol)을 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 140℃ 유조(oil bath)에서 2시간 동안 가열하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 이후, 실온으로 냉각한 뒤, 감압하에 증류하여 대부분의 N,N-디메틸포름아미드를 제거하였다. 이것을 물 및 에틸 아세테이트로 추출하고, 상기로부터 얻어진 유기상을 0.5 N HCl 용액, 포화 NaHCO₃ 용액 및 물로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 여과액을 농축하여 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체 생성물(1-5, 0.92 g, 61% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 327.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.98 (m, 1H), 7.86 (m, 1H), 7.59 (t, J = 8.0 Hz, 7.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.85 (s, 2H), 2.57 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.93 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 6H).

1.5 2 - 플루오로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤즈알데하 이드(1-6)

60℃ 에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.91 g, 2.79 mmol) 및 이산화망간(2.43 g, 27.9 mmol)의 테트라하이드로퓨란(30 mL) 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 현탁액을 실온으로 냉각한 뒤, 여과하고 농축하여 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 흰색 고체의 생성물로(1-6, 0.90 g, 99.6% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 325.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 10.42 (s, 1H), 8.12~7.99 (m, 5H), 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.93 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.4 Hz, 6H).

1.6 1 -{2- 플루오로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2)

실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 0.90 g, 2.78 mmol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 0.28 g , 2.78 mmol) 및 아세트산(1 mL)의 메탄올/테트라하이드로퓨란(20 mL/20 mL) 용액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 혼합물에 소듐 시아노보로하이드라이드(1.03 g, 16.35 mmol)의 메탄올(60 mL)을 첨가하고 결과 혼합물을 실온에서 추가적으로 16시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어준 뒤, 건조하여 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2)를 흰색 고체의 생성물로(0.20g, 18% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 410.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.05 (m, 1H), 7.97 (m, 1H), 7.68 (t, J = 8.0 Hz, 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.40 (s, 2H), 4.15 (m, 4H), 3.41 (m, 1H), 2.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.95 (m, 1H), 0.94 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

실시예 3: 1 -{2- 클로로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤 질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 3)의 제조

1.1 메틸 4- 브로모 -2- 클로로벤조에이트 (185312-82-7)

0℃에서, 싸이오닐 클로라이드(3.57 g, 30 mmol)을 4-브로모-2-클로로벤조산(4.71 g, 20 mmol)의 메탄올(100 mL) 용액에 천천히 적하하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거한 뒤, 반응 혼합물을 3시간 동안 가열 환류하였다. TLC 및 LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 용매와 과량의 싸이오닐 클로라이드를 회전 증발로 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 디클로로메탄(100 mL)에 녹이고, 포화 소듐 바이카보네이트 용액(100 mL X 2) 및 포화 염수(100 mL)로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 뒤, 여과하였다. 회전 증발하여 황색 고체의 생성물(4.79 g, 96% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 248.9.8/250.8/252.8 [M+H]⁺.

1.2 4 - 브로모 -2- 클로로벤질 알코올(1-1)

0℃에서, 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.09 g, 30 mmol)를 메틸 4-브로모-2-클로로벤조에이트(4.78 g, 19.16 mmol)의 테트라하이드로퓨란(100 mL) 용액에 천천히 적하하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 반응이 종결되었다(LCMS 및 TLC로 확인). 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고 물(1.09 mL) 및 10% NaOH 용액(10.9 mL) 각각으로 반응을 퀀칭하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 이어서, 여과 잔여물을 테트라하이드로퓨란(50 mL X 2)과 에틸 아세테이트 EA(50 mL X 2)로 씻어주었다. 여과액을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 농축하여 무색의 오일 생성물(3.4 g, 80% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 202.9/204.9 [M-OH]⁺.

1.3 3 - 클로로 -4- 히드록시메틸 벤조니트릴(1-2)

시안화 아연(0.67 g, 5.73 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(Pd(PPh₃)₄, 0.33 g, 0.287 mmol)을 4-브로모-2-클로로벤질 알코올(1-1, 1.27 g, 5.73 mmol)의 DMF(15 mL) 용액에 첨가하였다. 아르곤 버블링(bubbling)을 통해 산소를 제거한 후, 반응 혼합물을 100℃로 가열하고 16시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시킨 뒤, 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고, 물(50 mL X 3) 및 포화 염수(50 mL X 3)으로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조 시킨 뒤, 여과하였다. 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 15/1-4/1)로 정제하여 흰색 고체의 생성물(0.387 g, 40% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 168.0/170.1 [M+H]+.

1.4 (Z)-3- 클로로 -N'-히드록시-4- 히드록시메틸 벤즈아미딘 (1-3)

히드록시라민 히드로클로라이드(0.321 g, 4.62 mmol) 및 소듐 바이카보네이트(0.776g, 9.24 mmol)를 연속적으로 3-클로로-4-히드록시메틸 벤조니트릴(1-2, 0.387 g, 2.31 mmol)의 메탄올(80 mL) 용액에 첨가하여 현탁액을 제조한 뒤, 5시간 동안 가열 환류하였다. 이어서, 실온으로 식힌 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어주고, 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 3-클로로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘을 흰색 미정제 생성물로(1-3, 0.324 g, 70% 수율) 수득하였고, 이것을 다음 단계에 직접 사용하였다.

MS (ESI): m/z 201 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.74 (br, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.88 (br, 2H), 5.49 (br, 1H), 4.27 (s, 2H).

1.5 2 - 클로로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 알코올(1-5)

실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.288 g, 1.62 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 0.31 g, 1.62 mmol) 및 1-히드록시벤조트리졸(0.219 g, 1.62 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(8 mL)를 30분 동안 교반하고, (Z)-3-클로로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.324 g, 1.21 mmol)을 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 140℃ 유조(oil bath)에서 2시간 동안 가열하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 이후, 실온으로 냉각한 뒤, 감압하에 증류하여 대부분의 N,N-디메틸포름아미드를 제거하였다. 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트로 추출하고, 상기로부터 얻어진 유기상을 0.5 N HCl 용액, 포화 NaHCO₃ 용액 및 물로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 여과액을 농축하여 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체의 생성물(1-5, 0.36 g, 65% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 343.0/345.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.16 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.07 (dd, J = 1.2 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.85 (s, 2H), 2.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 0.94 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

1.6 2 - 클로로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤즈알데하이드 (1-6)

40℃ 에서, 2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.36 g, 1.05 mmol) 및 이산화망간(0.914 g, 10.5 mmol)의 테트라하이드로퓨란(30 mL) 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 현탁액을 실온으로 냉각한 뒤, 여과하고 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 20/1-10/1)로 정제하여 2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를(1-6, 0.34 g, 95% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 341.1 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 10.52 (s, 1H), 8.28 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.16 (dd, J = 1.2 Hz, 8.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 0.94 (d, J = 7.6 Hz, 6H).

1.7 1 -{2- 클로로 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3- 아제티딘 카르복실산 (화합물 3)

실온에서, 2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 0.34 g, 1.0 mmol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 0.101 g , 1.0 mmol) 및 아세트산(0.35 mL)의 메탄올/테트라하이드로퓨란(10 mL/10 mL) 용액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 혼합물에 소듐 시아노보로하이드라이드(0.378 g, 6.0 mmol)의 메탄올(20 mL)을 첨가하고 결과 혼합물을 실온에서 추가적으로 16시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어준 뒤, 건조하여 1-{2-클로로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 3)을 흰색 고체의 생성물로(0.109g, 26% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 426.1/428.3 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.33 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.22 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.72 (s, 2H), 4.46 (m, 4H), 3.74 (m, 1H), 2.63 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.97 (m, 1H), 0.96 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

실시예 4: 1 -{2- 브로모 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤 질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 4)의 제조

1.1 메틸 2,4- 디브로모벤조에이트 (54335-33-0)

0℃에서, 싸이오닐 클로라이드(3.57 g, 30 mmol)을 2,4-디브로모벤조산(5.60 g, 20 mmol)의 메탄올(100 mL) 용액에 천천히 적하하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거한 뒤, 반응 혼합물을 3시간 동안 가열 환류하였다. TLC 및 LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 용매와 과량의 싸이오닐 클로라이드를 회전 증발로 제거하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 디클로로메탄(100 mL)에 녹이고, 포화 소듐 바이카보네이트 용액(100 mL X 2) 및 포화 염수(100 mL)로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 뒤, 여과하였다. 회전 증발하여 황색 고체의 생성물(5.92 g, 100% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 292.8/294.7/269.9 [M+H]⁺.

1.2 2 ,4- 디브로모벤질 알코올(1-1)

0℃에서, 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.14 g, 30 mmol)를 2,4-디브로모벤조에이트(5.90 g, 20 mmol)의 테트라하이드로퓨란(120 mL) 용액에 천천히 적하하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 반응이 종결되었다(LCMS 및 TLC로 확인). 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고 물(1.14 mL) 및 10% NaOH 용액(11.4 mL) 각각으로 반응을 퀀칭하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 이어서, 여과 잔여물을 테트라하이드로퓨란(60 mL X 2)과 에틸 아세테이트 EA(60 mL X 2)로 씻어주었다. 여과액을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 농축하고, 이어서, 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 무색의 오일 생성물(2.3 g, 43% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 246.9/248.9/250.9 [M-OH]⁺.

1.3 3 - 브로모 -4- 히드록시메틸 벤조니트릴(1-2)

시안화 아연(1.01 g, 8.65 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(Pd(PPh₃)₄, 0.50 g, 0.43 mmol)을 2,4-디브로모벤질 알코올(1-1, 2.3 g, 8.65 mmol)의 DMF(20 mL) 용액에 첨가하였다. 아르곤 버블링(bubbling)을 통해 산소를 제거한 후, 반응 혼합물을 80℃로 가열하고 5시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시킨 뒤, 에틸 아세테이트(80 mL)로 희석하고, 물(80 mL X 3) 및 포화 염수(80 mL X 3)으로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조 시킨 뒤, 여과하였다. 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 15/1-4/1)로 정제하여 흰색 고체의 생성물(0.81 g, 44% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 211.9/213.9 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.82 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.80 (s, 2H).

1.4 (Z)-3- 브로모 -N'-히드록시-4- 히드록시메틸 벤즈아미딘 (1-3)

히드록시라민 히드로클로라이드(0.524 g, 7.54 mmol) 및 소듐 바이카보네이트(1.27g, 15.08 mmol)을 연속적으로 3-브로모-4-히드록시메틸 벤조니트릴(1-2, 0.80 g, 3.77 mmol)의 메탄올(120 mL) 용액에 첨가하여 현탁액을 제조한 뒤, 5시간 동안 가열 환류하였다. 이어서, 실온으로 식힌 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어주고, 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 3-브로모-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘을 흰색 미정제 생성물로(1-3, 0.90 g, 97% 수율) 수득하였고, 이것을 다음 단계에 직접 사용하였다.

MS (ESI): m/z 245/247 [M+H]⁺.

1.5 2 - 브로모 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 알코올(1-5)

실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.653 g, 3.67 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 0.704 g, 3.67 mmol) 및 1-히드록시벤조트리졸(0.495 g, 3.77 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(10 mL)를 30분 동안 교반하고, (Z)-3-브로모-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.90 g, 3.67 mmol)을 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 140℃ 유조(oil bath)에서 2시간 동안 가열하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 이후, 실온으로 냉각한 뒤, 감압하에 증류하여 대부분의 N,N-디메틸포름아미드를 제거하였다. 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트로 추출하고, 상기로부터 얻어진 유기상을 0.5 N HCl 용액, 포화 NaHCO₃ 용액 및 물로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 여과액을 농축하여 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체 생성물(1-5, 0.36 g, 36% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 387.1/389.1 [M+H]⁺.

1.6 2 - 브로모 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤즈알데하이드 (1-6)

50℃ 에서, 2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.51 g, 1.32 mmol) 및 이산화망간(1.15 g, 13.2 mmol)의 테트라하이드로퓨란(30 mL) 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 현탁액을 실온으로 냉각한 뒤, 여과하고 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 20/1-10/1)로 정제하여 2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를(1-6, 0.34 g, 67% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 385.0/387.0 [M+H]⁺.

1.7 1 -{2- 브로모 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3- 아제티딘 카르복실산 (화합물 4)

실온에서, 2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 0.34 g, 0.88 mmol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 0.089 g , 0.88 mmol) 및 아세트산(0.3 mL)의 메탄올/테트라하이드로퓨란(10 mL/10 mL) 용액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 혼합물에 소듐 시아노보로하이드라이드(0.333 g, 5.28 mmol)의 메탄올(20 mL)을 첨가하고 결과 혼합물을 실온에서 추가적으로 16시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL)로 씻어준 뒤, 건조하여 1-{2-브로모-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 4)를 흰색 고체의 생성물로(0.112g, 27% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 469.9/471.8 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.39 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 1.2 Hz, 8.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.23 (s, 2H), 4.08 (m, 2H), 3.99 (m, 2H), 3.44 (m, 1H), 2.56 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.91 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 6H).

실시예 5: 1 -{2- 메틸 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3-아제티딘 카르복실산(화합물 5)의 제조

1.1 4 - 브로모 -2- 메틸벤질 알코올(1-1)

0℃에서, 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.425 g, 37.5 mmol)를 4-브로모-2-메틸벤조에이트(5.725 g, 25 mmol)의 테트라하이드로퓨란(120 mL) 용액에 천천히 적하하였다. 적하 후, 사용된 얼음-염 조를 제거하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 반응이 종결되었다(LCMS 및 TLC로 확인). 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고 물(1.43 mL) 및 10% NaOH 용액(14.33 mL) 각각으로 반응을 퀀칭하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 이어서, 여과 잔여물을 테트라하이드로퓨란(80 mL X 2)과 에틸 아세테이트 EA(80 mL X 2)로 씻어주었다. 여과액을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 농축하여 무색의 오일 생성물(4.535 g, 90% 수율)을 수득하였다.

1.2 3 - 메틸 -4- 히드록시메틸 벤조니트릴(1-2)

시안화 아연(2.63 g, 22.5 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(Pd(PPh₃)₄, 1.31 g, 1.13 mmol)을 4-브로모-2-메틸벤질 알코올(1-1, 4.53 g, 22.5 mmol)의 DMF(50 mL) 용액에 첨가하였다. 아르곤 버블링(bubbling)을 통해 산소를 제거한 후, 반응 혼합물을 100℃로 가열하고 16시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시킨 뒤, 에틸 아세테이트(120 mL)로 희석하고, 물(120 mL X 3) 및 포화 염수(120 mL X 3)으로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조 시킨 뒤, 여과하였다. 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 15/1-4/1)로 정제하여 흰색 고체의 생성물(2.8 g, 84% 수율)을 수득하였다.

MS (ESI): m/z 148.1 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.52 (d, 7.6 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 4.76 (d, J = 5.6 Hz, 2H) , 2.34 (s, 3H).

1.3 (Z)-3- 메틸 -N'-히드록시-4- 히드록시메틸 벤즈아미딘 (1-3)

히드록시라민 히드로클로라이드(2.64 g, 38 mmol) 및 소듐 바이카보네이트(6.38g, 76 mmol)을 연속적으로 3-메틸-4-히드록시메틸 벤조니트릴(1-2, 2.8 g, 19 mmol)의 메탄올(500 mL) 용액에 첨가하여 현탁액을 제조한 뒤, 5시간 동안 가열 환류하였다. 이어서, 실온으로 식힌 뒤, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(100 mL X 2)로 씻어주고, 상기로부터 얻어진 여과액을 농축하여 3-메틸-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘을 흰색 미정제 생성물로(1-3, 3.425 g 미정제 생성물, 100% 수율) 수득하였고, 이것을 다음 단계에 직접 사용하였다.

MS (ESI): m/z 181.0 [M+H]⁺.

1.4 2 - 메틸 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 알코올(1-5)

실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 3.382 g, 19 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 3.642 g, 19 mmol) 및 1-히드록시벤조트리졸(2.565 g, 19 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(60 mL)를 30분 동안 교반하고, (Z)-3-메틸-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 3.42 g, 19 mmol)을 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 140℃ 유조(oil bath)에서 2시간 동안 가열하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 반응하였음을 확인하였다. 이후, 실온으로 냉각한 뒤, 감압하에 증류하여 대부분의 N,N-디메틸포름아미드를 제거하였다. 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트로 추출하고, 상기로부터 얻어진 유기상을 0.5 N HCl 용액, 포화 NaHCO₃ 용액 및 물로 연속적으로 씻어주고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 뒤, 여과액을 농축하여 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(용출 시스템: 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 10/1-4/1)로 정제하여 2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체 생성물(1-5, 2.51 g, 41% 수율)로 수득하였다.

MS (ESI): m/z 323.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.98 (m, 2H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.77 (s, 2H), 2.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.93 (m, 1H), 0.92 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

1.5 2 - 메틸 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤즈알데하이드 (1-6)

60℃ 에서, 2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 2.5 g, 7.76 mmol) 및 이산화망간(6.75 g, 77.6 mmol)의 테트라하이드로퓨란(100 mL) 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 현탁액을 실온으로 냉각한 뒤, 여과하고 농축하여 2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 흰색 고체의 생성물로(1-6, 2.4 g, 97% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 321.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 10.38 (s, 1H), 8.20~8.13 (m, 4H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.61 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 1.96 (m, 1H), 0.96 (d, J = 7.6 Hz, 6H).

1.6 1 -{2- 메틸 -4-[5-(4- 이소부틸페닐 )-1,2,4- 옥사디아졸 -3-일]- 벤질 }-3- 아제 티딘 카르복실산(화합물 5)

실온에서, 2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 0.88 g, 2.75 mmol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 0.278 g , 2.75 mmol) 및 아세트산(1 mL)의 메탄올/테트라하이드로퓨란(20 mL/20 mL) 용액을 2시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 혼합물에 소듐 시아노보로하이드라이드(1.04 g, 16.5 mmol)의 메탄올(60 mL)을 첨가하고, 결과 혼합물을 실온에서 추가적으로 16시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올(10 mL X 2)로 씻어준 뒤, 건조하여 1-{2-메틸-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산을 흰색 고체의 생성물로(0.23g, 21% 수율) 수득하였다.

MS (ESI): m/z 406.0 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.08 (s, 1H), 8.04 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.47 (s, 2H), 4.23 (m, 4H), 3.44 (m, 1H), 2.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.95 (m, 1H), 0.94 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

실시예 6: 본 발명에 의해 제공되는 화합물의 생체 내 약동역학 실험

본 실시예에서, 스프라그 돌리 랫트(Spraque Dawley rat)를 대상으로 경구 및 정맥 투여를 통해 본 발명의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 5의 약동역학 특성을 평가하였다.

본 실시예 및 이하에서 사용된 실험 동물은 7-9 주생의 수컷 SD 랫트로, 체중 범위 186-231 g이고, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd에서 구입하였다. 구입 후, 5일 동안 수의사에 의해 상기 실험 동물을 검역 보관하고, 이후, 검역을 통과한 실험 동물은 선별하여 SPE 조건하에 실험하였고, 이때, 실험 동물은 하기와 같이 한 그룹당 3 마리의 랫트를 할당하였다.

경구 투여 그룹: 본 발명의 화합물 1-5를 각각 2.74 mg씩 독립적으로 9.113 mL 0.5% CMC-Na을 희석제로 사용함으로써 0.3 mg/mL의 용액으로 준비하였다. 완전히 혼합한 후, 각 용액을 1-2분 동안 와동(vortexed)하였고, 이어서, 균일한 현탁액을 수득할 때까지, 20-30분 동안 초음파 처리를 수행하였다. 상기 균일한 현탁액을 경구 투여 그룹에 투여되는 약물로 사용하였고, 상기 투여는 각 랫트의 체중의 10 mL/kg 투여량으로 수행되었다.

정맥 내 투여 그룹: 본 발명의 화합물 1-5를 각각 1. 61 mg씩 독립적으로 1.610 mL 10% HP-β-CD를 희석제로 사용함으로써 1 mg/mL의 용액으로 준비하였다. 완전히 혼합한 후, 각 용액을 1-2분 동안 와동(vortexed)하였고, 이어서, 균일한 현탁액을 수득할 때까지, 28-30분 동안 초음파 처리를 수행하였다. 상기로부터 수득된 용액을 정맥 내 투여 그룹에 투여되는 약물로 사용하였고, 상기 투여는 각 랫트의 체중의 1 mL/kg 투여량으로 수행되었다.

경구 투여 그룹 및 정맥 투여 그룹 두 그룹 모두에서, 혈액 샘플은 투여 후, 0833 시간 (5 분), 0.25 시간 (15 분), 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간 및 24 시간에서 채혈하였다. 각 시점에서 이소플루란 마취 후, 0.3 mL 전혈을 상기 실험 동물의 안와정맥얼기(orbital venous plexus)에서 채집하였다. 모든 샘플이 수집된 후, 모든 실험 동물을 안락사 되었다.

수집된 혈액 샘플은 헤파린 나트륨(약 10 μl, 1000 IU/mL)을 포함하는 EP 튜브에 주입하고, 이어서, 이것을 즉시 얼음물에 두고, 4,500 rpm, 저온(4℃)에서 5분 동안 원심분리 하였다. 빠르게 혈장을 분리하고 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다.

하기와 같이, 혈액 내각 화합물의 농도는 오살마이드(osalmide)를 내부 표준 물질로서 LC-MS/MS-001 (Q-trap-3200)으로 측정하였다. 24 μL 블랭크 혈장을 6 μL 혈장 샘플(5배 희석)에 첨가하고, 이어서, 150 μL의 내부 표준 물질(오살마이드 100 μg/mL)을 함유하는 아세토니트릴 용액을 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 진탕하고, 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상기로부터 수득된 샘플 2 μL를 분석하기 위해 LC-MS/MS에 주입하였다. 희석되지 않은 플라즈마 샘플을 위해 150 μL의 내부 표준 물질(오살마이드 100 μg/mL)을 함유하는 아세토니트릴 용액을 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 진탕하고, 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상기로부터 수득된 샘플 2 μL를 분석하기 위해 LC-MS/MS에 주입하였다.

실험 데이터 분석에 있어서, t1/2, AUC(0-t), AUCinf, V, Cl, MRT, 등을 포함하는 주요 대사 약동역학 파라미터를 계산하기 위해, WinNolin (V6.2) non-compartment model (NCA)을 사용하였고, 평균값, 표준 편차 및 변동 계수를 계산하기 위해 Microsoft Office EXCEL을 사용하였다.

표 1에 나타낸 데이터로부터 분명하게 알 수 있는 것은, 경구 투여 후 약 11시간인 화합물 1의 말단 반감기와 비교하여, 화합물 2, 3 및 4의 말단 반감기는 5.5 시간 미만이다. 따라서, 할로젠으로 치환된 상기 세 화합물(화합물 2, 3 및 4)은 화합물 1의 반감기 보다 거의 50% 짧다는 것이다.

경구 투여의 약동역학 연구에서도 비슷한 반감기 변화가 나타났다. 표 2에 나타낸 데이터로부터 분명하게 알 수 있는 것은, 화합물 1의 평균 체류 시간(MRT) 및 말단 반감기와 비교하여, 할로젠으로 치환된 화합물 2, 3 및 4의 평균 체류 시간 및 말단 반감기는 상당하게 줄어들었다. 상기와 같은 결과 데이터는 화합물 1의 2번 위치에 할로젠 치환이 혈액으로부터 상기 화합물의 제거를 가속화할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 소실(clearance (CI)) 연구의 결과에서 나타난 바와 같이, 상기 말단 반감기 및 평균 체류 시간의 단축은 상기 화합물의 증가된 소실로부터 기인한 것이 아니다.

화합물 1의 동일 위치에 여타의 치환기로 치환하여 이와 유사한 결과를 얻을 수 없기 때문에, 화합물 2, 3 및 4의 생체 내 반감기에서 상당한 단축은 통상의 이론으로 설명될 수 없다. 예를 들어, 메틸로 치환한 경우(화합물 5에 해당), 반감기가 짧아진 것이 아니라 길어졌다(표 1 및 2 참조). 또한, 경구 투여 후, 시간 대비 혈액 내 화합물의 농도 곡선으로부터 알 수 있듯이, 화합물 1 및 화합물 5와 비교하여, 화합물 2, 3 및 4의 소실 속도는 최고 농도에 이르러서 분명하게 가속화 되었다(도 1).

경구 투여(3 mg/kg) 약동역학

화합물	T_max (hr)	C_max (ng/mL)	AUC_inf (hr*ng/mL)	T1/2 (hr)	F (%)
화합물 1	2.00	365±51.5	6197±147	10.6±1.07	82.5
화합물 2	2.00	341±36.2	3829±184	5.47±0.63	63.4
화합물 3	3.33	681±61.1	8107±469	5.30±0.51	96.1
화합물 4	1.15	346±29.6	4419±449	5.37±0.15	52.9
화합물 5	3.33	249±8.74	5460±401	12.3±2.09	74.0

정맥 투여(1 mg/kg) 약동역학

화합물	CL (L/hr/kg)	Vss (L/kg)	AUC_inf (hr*ng/mL)	T1/2 (hr)	MRT_inf (hr)
화합물 1	0.427±0.063	4.65±0.389	2376±329	8.69±0.80	11.0±1.20
화합물 2	0.499±0.039	3.12±0.101	2012±146	5.47±0.42	6.28±0.44
화합물 3	0.366±0.050	2.65±0.229	2767±410	5.04±0.37	5.11±0.39
화합물 4	0.362±0.026	2.75±0.112	2768±200	5.29±0.60	5.23±0.36
화합물 5	0.454±0.018	5.87±0.802	2203±89.5	10.1±1.02	12.9±1.24

실시예 7: 본 발명에서 제공되는 화합물의 S1P1 및 S1P3의 내재화에 대한 효과

1) S1P1에 대한 내재화 효과 실험

S1P1 소분자 작용제가 세포 표면의 S1P1의 내재화를 유도함으로써 림프구의 말초 순환 유입을 막는다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명에 의해 제공되는 화합물이 S1P1 내재화 유도 활성을 갖는지 판단하기 위해, 림프구를 대체하는, 인간 S1P1이 발현된 CHO-S 세포를 S1P1 내재화 검출 시스템으로 사용하였다. 세포 표면의 S1P1 모니터링의 편의를 위해, Myc 태그를 S1P1의 N-말단에 융합하였고, S1P1의 발현은, Myc 태그에 대한 형광-표지 항체로 세포를 배양한 후, 유동 세포 계측법으로 분석하였다.

디메틸 설폭사이드(DMSO)에 본 발명에서 제공되는 화합물 2를 녹여, 10 mM의 스톡 용액을 준비하였고, 이어서, DMEM으로 원하는 바로 상기 스톡 용액을 각각 다른 농도로 희석하였다. Myc 태그와 인간 S1P1을 포함하는 CHO-S 세포를 채취하고, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 mL당 일백만 세포의 밀도로 조절해 주었다. 동일 부피에 희석된 화합물 2의 각기 다른 농도로 혼합하고, 이어 세포 현탁액을 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 혼합물을 800 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하였다. 상기 세포를 FACS 버퍼(1% BSA를 함유하는 PBS)에 재현탁하고, 플루오레세인이소티오시안산염(FITC)이 표지된 Myc 항체(Californian Miltenyi Biotec GmbH, USA)를 첨가한 뒤, 얼음에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 씻어주고, 사전 냉각된 FACS 버퍼에 재현탁하고, FACS Calibur 세포 계측법으로 분석하였다.

실험 데이터는, 화합물 2가 투여량-의존 방식으로 S1P1 내재화 유도의 활성을 나타나는 것을 보여준다(표 3). S1P1 내재화를 유도하는 화합물 3 및 4의 활성 역시 동일한 방식으로 확인되었다. 얻어진 결과는 화합물 1의 결과와 많은 차이가 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 F, Cl 및 Br로 치환함으로써 얻어진 화합물 모두(화합물 2, 3 및 4), 분명하게 단축된 반감기를 나타내면서 동시에, S1P1 활성 효과를 갖고 있음을 나타낸다.

2) S1P3에 대한 내재화 효과 실험

인간 S1P3가 발현된 CHO-S 세포를 사용하여 내재화 검출 실험을 수행하였다. 한편, 세포, 실험 방법은 상기 S1P1의 내재화 검출 실험의 방법과 동일하게 하였다.

실험 결과는, 화합물 1의 효과와 유사하게, 화합물 2, 3 및 4의 S1P에 대한 효과는 특이한데, 즉 화합물은 오직 S1P1에 대하여 내재화 활성 효과를 가지며 S1P3에 대하여 내재화 활성 효과를 가지지 않았다(표 3). 이와 같은 결과는, F, Cl, 또는 Br 치환된 화합물이, 화합물 1과 비교하여, 분명하게 단축된 생체 내 반감기를 가지지만, 표적 S1P1에 대한 화합물의 선택성은 변하지 않았다는 것이다. 이 점에서, 본 발명의 화합물은, 비-선택적 S1P 작용제이며, 치료에 사용되는 FTY720과 다르다. FTY720은, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 및 S1P5와 같은, 여러 종류의 S1P 수용체를 활성화하고, 이로부터, 예를 들어 서맥과 같은 심각한 부작용들의 원인이 된다.

수용체에 대한 화합물 2, 3 및 4의 활성 및 선택성

화합물	수용체 내재화(EC 50)
화합물	S1P1	S1P3
화합물 1	5.69 nM	>1000 nM
화합물 2	9.83 nM	>1000 nM
화합물 3	3.21 nM	>1000 nM
화합물 4	4.20 nM	>1000 nM

실시예 8: 본 발명에서 제공하는 화합물의 말초 혈액 내 림프구 수에 대한 효과

림프구의 표면에 발현되는 S1P1은, 림프구가 이차 림프 조직을 벗어나고 이어서, 말초 순환 내로 유입되기 위해, 필수적이다. S1P1의 소분자 작용제는 수용체를 활성화할 수 있고 상기 수용체의 내재화 효과를 유발한다. 이와 같은 메카니즘은, 림프구가 이차 림프 조직을 벗어나는 것을 막고, 이로부터 말초 순환 내 림프구의 수의 감소를 유발한다는 것으로, 현재까지 알려진 메카니즘이다. 본 발명에서 제공하는 화합물이 말초 혈액 내 림프구의 수를 감소시킬 수 있는지 판단하기 위해, 림프구에 대한 생체 내 효과 실험을 수행하였다.

화합물 2의 적량을 소듐 카복시메틸셀룰로오스(CMC-Na)와 현탁액으로 준비하고, 세 마리의 스프라그-돌리(SD) 랫트에 경구로 투여하였다. 혈액 샘플(0.5 ml)을 투여 30분 전 및 투여 후, 각 다른 시점에 채집하고(채집된 혈액 샘플은 EDTA-2K 용액 적량을 함유하는 EP 튜브에 주입하였다), ADVIA2120 혈구 분석기에서 바로 분석하였다.

실험 결과는, 화합물 2가 효과적으로 말초 혈액 내 림프구의 수를 감소시킨 것으로 나타났다. 말초 혈액 내 림프구의 수는 투여 후, 30분에서 분명하게 감소하였고, 모든 샘플 시점(30, 120, 240, 360 및 480분)에서 더욱 감소하였다. 평가된 세 가지 투여량 모두에서, 화합물 2는 활성을 나타냈고, 여기서 말초 혈액 내 림프구의 수를 50% 이상의 감소는 0.01 mg/kg의 투여량에서 나타났고, 최대 감소는 1 mg/kg의 투여에서 관찰되었다(도 2). 또한, 화합물 2의 효과는 림프구에 특정하였으며, 화합물 2는 말초 단핵 세포 및 기타 백혈구의 수는 변화시키지 않았다.

본 발명의 화합물 3, 4 및 5를 동일한 방법으로 실험함으로써 림프구에 대한 화합물 3, 4 및 5의 효과는 화합물 2의 효과와 유사함을 알 수 있었다(도 3 및 도 4).

실시예 9: 루이스 랫트의 콜라겐 타입 II-유도된 관절염(Collagen Type II-induced Arthritis)의 발달에서 화합물 2의 효과

인간의 류마티스 관절염은, 환자의 면역 시스템이 관절 조직을 공격하는, 자가 면역 질환이다. T 및 B 세포를 포함한 림프구는 상기 질환의 발병 기전에 중요한 역할을 한다. T 세포 기능을 T 세포의 활성을 차단함으로써 저해하는 것이 류마티스 관절염의 효과적인 치료임은 알려져 있다. 화합물 2가 림프구의 배출을 차단하기 때문에, 랫트 CIA 모드에서 관절염의 발달을 억제하는 효과가 있는지 판단하는 것은 가치가 있다. 실험을 수행하기 위해, 루이스 랫트가 하기와 같이 질환이 유도되었다. 랫트는 이소플루란으로 마취하고 총 0.5 mL CII/CFA 에멀젼으로 피하주사하였다. 상기 에멀젼은 3 부분에, 하나의 부분은 꼬리의 기지에(0.1 mL), 나머지 두 부분은 꼬리의 기지 부근의 랫트의 등에(각 위치당 0.2 mL) 주사되었다.

화합물 2는 0.5% CMC-Na에 현탁액으로 준비되었고, 랫트에 CII/CFA 주사 시점에 경구 투여하였다. 양성 대조군은 TOFACITINIB를 경구로 감작 후 12일에 투여하였다. 네 발의 관절염의 심각도는 감작 후 7일을 시작으로 한 주당 2회 평가하였다. 판단 기준은 하기와 같다: 스코어 0: 홍반과 부종의 증거가 없다; 스코어 1: 홍반과 부종이 발의 중간(부골) 또는 발목 관절에 국한된다; 스코어 2: 발목에서 발의 중간까지 연장된 홍반 및 가벼운 부종; 스코어 3: 발목에서 중족골 관절까지 연장된 홍반 및 중간 정도의 부종; 스코어 4: 발목, 발 및 발가락을 포함한 홍반 및 심각한 부종. 관절 부종은, 체적변화유량계(Plethysmometer)를 사용하여 뒷 발의 부피를 측정함으로써, 0일에 측정하고, 7일부터 28일까지 한주당 2회 측정하였다. 관절 구조의 손상은 28일째에 X-선 실험으로 판단하였다.

실험 결과는, 1 mg/kg에서 화합물 2가 관절 부종(도 5) 및 관절 구조 손상(도 6)을 기초한 관절염의 발달을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 도 5를 살펴보면, 화합물 2가 TOFACITINIB와 유사한 기능을 갖는 것으로 보이나, 투여량은 상당하게 감소하였다.

실시예 10: 화합물 2의 실험적 자가 면역성 뇌염( EAE )의 발달에 대한 효과

S1P1 작용제는 인간의 다발성 경화증 및 동물 모델의 MS에 효과적인 것으로 알려져 있다. 화합물 2를 실험적 자가 면역성 뇌염(EAE), 인간 다발성 경화증의 마우스 모델에 대하여 효과를 평가하였다. 본 연구에서 80마리의 암컷 C56BL/6 마우스를 임의로 체중을 기초하여 8개의 그룹으로 할당하고, 면역화하였다. 각 그룹은 10 마리의 마우스로 이루어졌다. 질병을 유도하기 위해, MOG 35-55(MOG, 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질)을 식염수에 2 mg/mL의 농도로 녹여주고, 변경된 CFA(complete Freund’s Adjuvant)에 유화시켰다. 마우스는 이소플루란으로 마취시키고, 마우스의 면되된 등 부위에 100 μL의 에멀젼을 세부위, 양 어깨의 등 중간에 따라 한 부위, 및 허리의 중심선의 양쪽 두 부위에 피하주사하였다. 백일해 독소(Pertuxus toxin, 200 ng in 200 μL of PBS)를 면역화 날 및 48시간 후에 모든 그룹에 대하여 복강내 투여하였다. EAE 발달은 면역화 후 0일부터 30일까지 매일 한번씩 마우스의 임상 점수로 평가되었다.

화합물 2는 Na CMC 현탁액으로 준비되었고, MOG 면역화의 시점을 시작으로 본 연구의 전체 기간 동안 경구로 투여되었다. 실험 결과 데이터는, 세 가지 투여량 모두에서(0.03, 0.1 및 1 mg/kg), 화합물 2가 효과적으로 EAE의 발달을 억제하는 것으로 나타났다(도 7).

실시예 11: 화합물 2의 비글견에서 심혈관 기능에 대한 효과

FTY720은 비-선택성 S1P1 작용제로 사람에서 서맥을 포함한 다양한 심혈관 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 화합물 2가 심박수 및 QT 시간에 효과를 가지는지 판단하기 위해, 상기 화합물을 의식이 있는 비글견에서 텔레메트리 분석(telemetry assay)으로 평가하였다.

CMC-Na 적량을 주사용 멸균수로 0.5% CMC-Na(w/v) 용액으로 준비하였다. 상기 용액은 투여 하루전에 제조하였다.

2, 6 및 20 mg/mL의 농도로 화합물 2의 용액(샘플)을 하기와 같이 투여 하루전 준비하였다. 화합물 2의 적량을 0.5% CMC-Na 용액의 적량에 첨가하였다. 상기로부터 얻어진 혼합물을 유화 등방성 장치(emulsification isotropic machine)에서 유화시키고 균질화 하였다. 상기 준비된 샘플 용액에 화합물 2의 이론적인 농도는 2, 6 및 20 mg/mL이다.

본 실험에서, 8마리의 동물 및 이중 라틴방격법(Double Latin squared experimental design)이 사용되었다. 투여 주기는 3-5일로 분리하였다. 각 투여 주기전 첫째날, 동물들은 무게를 측정하고 밤새 금식시켰다. 투여 당일, 텔레메트리 시스템(Implantable physiological signal telemetry system 1, Data Science International Inc., USA)을 가동하였고, 실험 파라미터를 설정하고, 임플란트를 활성화하고 동물들의 생리학 지표를 기록하였다. 시스템 가동 후, 약 2시간 경과 후에, 동물들에 설계된 주기에 따라 투여하였다. 동물들의 혈압, 심전도, 체온 등의 지표 데이터는 투여 후 24시간 내에 수집되었다. 데이터 오버플로우(data overflow)를 피하기 위해, 상기 수집 중에, 시스템은 적절히 해제하였고 이후, 다시 재가동하였다. 이와 같은 전환 과정은 데이터 포인트 설정 값에 영향을 주지 않았고 시스템 전환 시간은 기록되었다. 다음날, 기록이 완료된 시점에, 상기 텔레메트리 시스템은 해제되었다. 검출의 시간점은 하기와 같다: 투여 1시간 전(-1h)과 투여 후, 0.5 시간 (±5 분), 1 시간 (±10 분), 1.5 시간 (±10 분), 2 시간 (±15 분), 3 시간 (±15 분), 4 시간 (±15 분), 8 시간 (±45 분), 24 시간 (±1 시간). 모든 데이터는 PONEMAH 버젼 4.8 소프트웨어로 자동적으로 수집되었다. 파라미터는 수집이 완료된 후, 인공적인 설정을 사용하여 분석하였다.

먼저, 상기 데이터는 PONEMAH 버젼 4.8 소프트웨어로 자동적으로 분석되고, 선별된 값에 대하여 인공적으로 한점 한점 검토하였다. 심박수, 혈압, 호흡 및 체온의 지표로서, 1분 이내에 연속 파형의 평균값으로 선별하였으며, 다른 심전계 지표에 대해서 10초 내에 연속 파형의 평균값으로 선별하였다. 값 선택시, 검출 시점에서 즉각적인 데이터가 바람직하나, 큰 노이즈 장애, 심박수 이상과 같은 문제 또는 불분명한 파형이 검출 시점에 확인되는 경우, 지정된 범위의 명확한 신호 파현을 선택하였다. 또한, 주어진 범위에서 파형이 불명확하여 분석하기에 불가능한 경우, 상기 값 지점의 분석이 가능한 데이터를 찾아야 했고, 값을 나타낸 표에 특정하게 설명하였다. 시간은 값이 선별된 지점에 시간을 기록하였다.

본 실험에서 통계 소프트웨어 SPSS13.0을 사용하여 데이터를 처리하였다. 두-꼬리 분석(Two-tailed analyses)이 수행되었고 이에 중요 수준은 p < 0.05에 설정되었다. 혈압, 심전도, 호흡 및 체온의 지표는 "평균 ± 표준오차"로 나타냈고, 하기 과정에 따라 분석되었다: 먼저, 리벤 테스트(Levene Test)의 사용으로 데이터 상의 균일성 실험을 수행하였고, 만일 데이터가 균일한 경우(P>0.05), 단일 요인 분산 분석을 수행하였고; 분산 분석의 결과가 상당한 경우（P≤ 0.05）, 샘플 그룹과 비히클 그룹 간의 차이에 있어서 던네트 다중 검정(Dunnett’s multiple comparison)이 수행되었다. 만약 상기 리벤 테스트의 결과가 상당한 경우（P≤ 0.05）, 크루스칼-윌리스 비-모수 실험(Kruskal-wallis non-parametric test)을 수행하였고; 및 크루스칼-윌리스 비-모수 실험의 결과가 상당한 경우 (P≤0.05), 맨-휘트니 U 실험(Mann-Whitney U test)의 사용으로 페어와이즈 비교(pairwise comparison)가 수행되었다.

변화 범위는, 큰 차이 또는 현저한 변화 경향의 시점에서 수집된 데이터를 표준화 한 후, 산출되었다. 상기 표준화의 공식은 △%=[(b1-b0)-(a1-a0)]/a1×100이고, 여기서 b1은 샘플의 투여 후 시점의 값을 나타내고, b0은 샘플의 투여 전 시점의 값을 나타내고, a1은 비히클 투여 후 시점에 따른 값을 나타내고, a0은 비히클 투여 전 시점의 값을 나타내고, 및 △%은 변화 범위를 나타낸다.

샘플의 투여량에 따라 투여된 동물의 심박수, QT 시간 및 QTcF 간격과 비히클로 투여된 동물의 심전도 지표와 비교하여, 큰 변화(P>0.05) 또는 변화 경향이 관찰되지 않았다(도 8A 내지 도 8C).

1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2)의 합성 방법에 있어서, 하기에 최적화된 방법 및 이의 조건을 제공하였다.

화합물 2의 합성은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 수행될 것이다:

(1)

(2)

(3)

실시예 12: 본 발명의 합성 방법에 대한 선별 -단계 (1)

실시예 2에 따라 식 1-5로 표시되는 화합물의 미정제 생성물을 제조하고 분석하였다. LCMS에 의해 검출된 순도는 77.25%이었다.

상기 제조한 미정제 생성물의 결정화 정제 조건에 대한 선별을 수행하였다. 결정화 작업은 다음과 같이 수행하였다: 미정제 생성물을 결정화 용매에 녹여주고, 20℃에서 결정화 하고, 진공으로 건조하여 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 흰색 고체의 생성물로 수득하였다. 순도는 LCMS로 측정되었다.

우선, 바람직한 결정화 용매를 선별하기 위해, 상기 결정화 작업은 표 4에 열거된 요소에 따라 수행하였다.

결정화 정제를 위한 용매 및 이의 양의 선별

용매	용매의 양 (미정제 생성물: 용매)	미정제 생성물의 순도	순수 생성물의 순도	정제의 수율
에틸 아세테이트	1g : 1ml	77.25%	96.72%	약간의 침전물
아세톤	1g : 1ml	77.25%	95.22%	약간의 침전물
메탄올	1g : 3ml	77.25%	99.08%	55.4%
에탄올	1g : 3ml	77.25%	99.36%	37.4%
테트라하이드로퓨란	1g : 1ml	77.25%		맑은 용액
디클로로메탄	1g : 1ml	77.25%	98.58%	약간의 침전물
물	1g : 1ml	77.25%	95.34%	84%

표 4에 나타난 바와 같이, 단일 용매가 결정화에 사용된 경우, 메탄올 또는 에탄올을 용매로 사용함으로써 생성물의 순도는 분명하게 증가하였다. 수율은 에탄올 사용시 보다 메탄올 사용시 더 높았으나, 55.4%으로 나타났다. 생성물의 순도는 물을 용매로 사용함으로써 거의 증가하지 않았으나, 수율 소실은 제일 적었다. 따라서, 이어지는 연구에서 결정화 용매로, 물과 메탄올을 혼합 용매로 사용하는 시도를 수행하였다.

두번째로, 상기 결정화 작업은 혼합 용매에서 물과 메탄올의 바람직한 비율을 선별하기 위해, 표 5에 열거된 요소들에 따라 수행되었다. 미정제 생성물(g, 중량)의 결정화용 혼합 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:5이다.

혼합 용매에서 메탄올 및 물의 비율 선별

용매	용매 비율 (부피비)	미정제 생성물의 순도	순수 생성물의 순도	정제의 수율
메탄올 및 물	1:1	77.25%	98.32%	75.2%
메탄올 및 물	2:1	77.25%	99.13%	73.1%
메탄올 및 물	3:1	77.25%	99.27%	72.7%
메탄올 및 물	1:2	77.25%	97.20%	79.8%
메탄올 및 물	1:3	77.25%	95.68%	83.2%

표 5를 살펴보면, 혼합용매에서 메탄올의 양이 증가됨으로써 생성물의 순도는 증가하지만, 수율은 감소하고; 및 물의 양이 증가함으로써 정제의 수율은 증가하나, 생성물의 순도는 감소하는 것을 확인할 수 있다. 총체적으로 고려하여, 3:1의 부피비가 혼합 용매에서 메탄올 및 물의 비율로 선별되었다.

세번째로, 상기 결정화 작업은 혼합 용매의 바람직한 양을 선별하기 위해 표 6에 열거되어 있는 요소에 따라서 수행되었다. 상기 혼합 용매에 메탄올 및 물의 부피비는 3:1이다.

용매 양의 선별

용매	용매의 양 (미정제 생성물: 용매)	미정제 생성물의 순도	순수 생성물의 순도	정제의 수율
메탄올 및 물	1g:3ml	77.25%	98.99%	69.9%
메탄올 및 물	1g:5ml	77.25%	99.16%	72.2%
메탄올 및 물	1g:10ml	77.25%	99.05%	68.9%
메탄올 및 물	1g:20ml	77.25%	99.30%	67.2%

표 6을 살펴보면, 미정제 생성물 중량의 용매 부피에 대한 비율이 1g:5mL일때 높은 수율 및 순도가 얻어졌다는 것을 알 수 있다. 반면, 미정제 생성물 중량의 용매 부피에 대한 비율이 1g:20mL일때 비율이 1g:5mL일때 보다 더 높은 순도가 얻어질 지라도, 수율은 더 작았다. 따라서, 1g:5mL의 비율이 미정제 생성물 중량의 결정화를 위한 용매 시스템으로 사용된 용매 부피에 대한 비율로 선별되었다.

실시예 13: 본 발명의 합성 방법에서의 선별-단계 (2)

본 발명의 단계 (2)는 하기 과정에 따라 수행되었다: 실시예 1로부터 정제된 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 반응 용매에 녹이고, 이어서, 활성 이산화망간을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류하고 계속하여 반응시켰다. 상기 반응을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 밝은 황색의 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 수득하였다. 전환율은 LCMS로 확인하였다.

먼저, 바람직한 반응 용매를 선별하기 위해 표 7에 열거되 있는 요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:6이었다. 표 7-9에서 "원료 물질"이란 표현은 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 말한다.

반응 용매의 선별

용매	용매의 양 (원료 물질:용매)	반응 시간	전환율 (LCMS)	수율
테트라하이드로퓨란	1g:10ml	1 시간	96.2%	92.2%
에틸 아세테이트	1g:10ml	1 시간	93.3%	93.3%
톨루엔	1g:10ml	1 시간	91.7%	91.7%

표 7를 살펴보면, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이토 또는 톨루엔을 반응 용매로 사용하였을때 전환율 및 수율에 있어서 약간의 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 테트라하이드로퓨란을 반응 용매로 사용시 안전 위험이 존재하고 톨루엔을 반응 용매로 사용시 높은 독성이 있어, 이에, 에틸 아세테이트를 반응 용매로 선별하였다.

두 번째로, 상기 용매의 바람직한 양을 선별하기 위해 표 8에 열거되어 있는요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 에틸 아세테이트를 반응 용매로 사용하였고, 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:6이다.

반응 용매의 양 선별

용매의 양 (원료 물질:용매)	반응 시간	전환율 (LCMS)	수율
1g:10ml	1 시간	97.76%	93.3%
1g:20ml	1 시간	98.93%	92.6%
1g:30ml	1 시간	98.83%	93.1%

표 8을 살펴보면, 원료 물질 중량의 용매 부피에 대한 비율이 1 g: 10 ml, 1 g: 20 ml 및 1 g: 30 ml이었을때 전환율 및 수율에 있어서 약간의 효과가 있는 것으로 나타났다. 비용을 고려하여, 1 g: 10 ml의 비율을 반응 용매의 양으로 선별하였다.

세번째로, 이산화망간의 바람직한 양을 선별하기 위해 표 9에 열거되어 있는 요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올대 에틸 아세테이트 1g:10ml의 양이 사용되었다.

산화제의 양 선별

산화제의 양 (원료 물질의 이산화망간에 대한 몰 비율)	반응 시간	전환율 (LCMS)	수율
1:4	3 시간	96.91%	86.6%
1:5	3 시간	97.06%	91.0%
1:6	3 시간	97.03%	93.3%
1:10	3 시간	97.12%	93.6%

표 9를 살펴보면, 원료 물질의 이산화망간에 대한 몰 비율이 1:6 일때 높은 전환율 및 수율이 얻어진 것을 확인할 수 있다. 그러나, 원료 물질의 이산화망간에 대한 몰 비율이 1:10으로 증가하였을 때 전환율 및 수율에 대하여 약간의 효과가 있다. 따라서, 비용과 수율 모두를 고려하여, 1:6의 몰 비율이 원료 물질 및 이산화망간의 양으로 선별되었다.

실시예 14: 본 발명의 합성 방법에서의 선별-단계 (3)

본 발명의 단계 (3)은 하기 과정에 따라 수행되었다:

실온에서, 식 1-6의 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드, 식 1-7의 아제티딘-3-카르복실산 및 빙초산을 반응 용매에 첨가하였고 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. NaBH₃CN을 메탄올에 녹이고, 이어서, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 교반하여 반응시키고 여과하였다. 여과 잔여물을 메탄올로 씻어주고 건조시켜 흰색 고체의 생성물인 식 1B로 표시되는 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2)을 수득하였다. 전환율은 LCMS로 확인하였다.

우선, 바람직한 반응 용매를 선별하기 위해 표 10에 열거되어 있는 요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 식 1-6 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1.05이고; 식 1-6 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율은 1:1이고; NaBH₃CN 메탄올 용액의 적하 온도는 15-20℃이고; 표 10-12에서 "원료 물질"이란 표현은 식 1-6로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 말한다.

반응 용매의 선별

용매	용매의 양 (원료 물질:용매)	반응 시간	전환율 (LCMS)	수율
테트라하이드로퓨란	1g:40ml	6 시간	1.64%
메탄올	1g:40ml	6 시간	79.26%	69.10%
에탄올	1g:40ml	6 시간	66.20%	53.23%

표 10을 살펴보면, 테트라하이드로퓨란을 반응 용매로 사용하였을 때 전환율은 매우 낮은 것을 확인할 수 있다. 반면 메탄올 또는 에탄올을 반응 용매로 사용하였을 때 전환율 및 수율 모두 더 높게 나타났다.

두번째로, 환원제의 바람직한 양을 선별하기 위해 표 11에 열거되어 있는 요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 식 1-6 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1.05이고; 반응 용매는 메탄올이고 및 NaBH₃CN 메탄올 용액의 적하 온도는 15-20℃이다.

환원제 양의 선별

환원제의 양 (원료 물질의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율)	반응 시간	전환율 (LCMS)	수율	순도
1:0.5	15 시간	66.42%	67.20%	94.58%
1:1	15 시간	79.26%	69.10%	95.50%
1:2	15 시간	73.77%	65.61%	94.24%
1:6	15 시간	64.51%	53.27%	94.36%

표 11을 살펴보면, 원료 물질의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율이 1:1일때 생성물의 전환율, 수율 및 순도 모두 더 높은 것을 확인할 수 있다.

세번째로, 환원제의 바람직한 적하 온도를 선별하기 위해 표 12에 열거되어 있는 요소에 따라 상기 합성 단계를 수행하였다. 식 1-6 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1.05이고; 및 반응 용매는 메탄올 이었다.

환원제의 적하 온도 선별

온도	환원제의 양 (원료 물질(1-6):환원제)	용매의 양 (원료 물질:용매)	적하 시간	전환율	순도
0-5℃	1 Eq	40 V	20 분	67.65%	95.61%
5-15℃	1 Eq	40 V	20 분	71.04%	96.91%
15-20℃	1 Eq	40 V	20 분	74.50%	97.91%

표 12를 살펴보면, 소듐 시아노보로하이드라이드의 적하 온도가 15-20℃일때 생성물의 전환율 및 순도 둘 모두 더 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 15: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.148 Kg, 0.83 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1.7 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(0.11 Kg, 0.83 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(0.16 Kg, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.153 Kg, 0.83 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2.0 L)에 녹여주고, 물(1.5 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(1.5 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 256 g의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 3:1)의 혼합용매 1.28 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 182 g, 71% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 93.1% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(1.4 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.21 Kg, 2.42 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 139g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 97.6%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(11.5 g, 0.185 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 67 g, 89.0% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 98.8%이었다.

MS (ESI): m/z 410.2 [M+H]⁺. NMR: ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.05 (m, 1H), 7.97 (m, 1H), 7.68 (t, J = 8.0 Hz, 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.40 (s, 2H), 4.15 (m, 4H), 3.41 (m, 1H), 2.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.95 (m, 1H), 0.94 (d, J = 7.2 Hz, 6H).

실시예 16: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 1.477 Kg, 8.30 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(17 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(1.12 Kg, 8.30 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(1.58 Kg, 8.30 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 1.527 Kg, 8.30 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(20 L)에 녹여주고, 물(15 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(15 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 2.6 Kg의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 3:1)의 혼합용매 12.5 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 1.9 Kg, 73% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 93.89% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(14 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 1.4 Kg, 4.30 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(2.1 Kg, 24.15 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 1.38g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 93.94%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 0.6 kg, 1.85 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 0.195 kg, 1.93 mol) 및 빙초산(0.360 L, 6.3 mol)을 메탄올(16 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(0.115 kg, 1.85 mol)을 메탄올(2 L)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 3 L 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 0.7 kg, 92.6% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 97.6%이었다.

실시예 17: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.148 Kg, 0.83 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1.7 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(0.11 Kg, 0.83 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(0.16 Kg, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.153 Kg, 0.83 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2.0 L)에 녹여주고, 물(1.5 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(1.5 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 251 g의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 1:1)의 혼합용매 1.28 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 158 g, 63% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 92.1% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(1.4 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.19 Kg, 2.15 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 138 g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 98.5%이었다.

MS (ESI): m/z 325.0 [M+H]+. NMR: 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 10.42 (s, 1H), 8.12~7.99 (m, 5H), 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.93 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.4 Hz, 6H).

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(5.8 g, 0.09 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 62 g, 81.9% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 94.6%이었다.

실시예 18: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.148 Kg, 0.83 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1.7 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(0.11 Kg, 0.83 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(0.16 Kg, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.153 Kg, 0.83 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2.0 L)에 녹여주고, 물(1.5 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(1.5 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 260 g의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 1:1)의 혼합용매 1.30 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 196 g, 76% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 88.7% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(1.4 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.21 Kg, 2.42 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 139 g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 97.7%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(23.0 g, 0.37 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 60 g, 79% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 94.2%이었다.

실시예 19: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.148 Kg, 0.83 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1.7 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(0.11 Kg, 0.83 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(0.16 Kg, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.153 Kg, 0.83 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2.0 L)에 녹여주고, 물(1.5 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(1.5 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 250 g의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 2:1)의 혼합용매 1.25 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 169 g, 68% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 93.9% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(1.4 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.37 Kg, 4.3 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 139 g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 99.2%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(69.0 g, 1.11 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 54g, 71.2% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 94.4%이었다.

실시예 20: 본 발명의 합성 방법

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 1:2)의 혼합용매 1.28 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 190 g, 74% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 92.6% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(1.4 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.15 Kg, 1.72 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 139 g, 99.0% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 96.9%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(11.5 g, 0.185 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 64g, 84.4% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 95.5%이었다.

실시예 21: 본 발명의 합성 방법

(1) 실온에서, 4-이소부틸 벤조산(1-4, 0.148 Kg, 0.83 mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1.7 L)에 녹이고, 이어서, 1-히드록시벤조트리졸(0.11 Kg, 0.83 mol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(0.16 Kg, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 액체를 30℃로 가열하고 30분 동안 교반하고, 이어서, 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘(1-3, 0.153 Kg, 0.83 mol)을 상기 반응 액체에 첨가하였다. 상기 반응 액체를 140℃로 가열하고 2시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각한 뒤, N,N-디메틸포름아미드를 감압하에 농축하여 제거하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2.0 L)에 녹여주고, 물(1.5 L X 2) 및 포화 NaHCO₃ 용액(1.5 L)로 연속적으로 씻어주었다. 유기상을 수집하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 농축하여 258 g의 미정제 생성물을 수득하였다.

상기로부터 수득된 미정제 생성물을 메탄올 및 물(부피비 3:1)의 혼합용매 1.29 L로 재결정화 하였고, 20℃에서 결정화 하였으며, 여과하고 진공에서 건조시켜 거의 흰색 고체의 생성물로 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 186 g, 72% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 93.8% 이었다.

(2) 실온에서, 에틸 아세테이트(2.8 L)에 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(1-5, 0.14 Kg, 0.43 mol)을 녹여주고, 이어서, 활성 이산화망간(0.21 Kg, 2.42 mol)을 첨가하였다. 반응 액체를 가열 환류시키고 3시간 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 냉각하고 여과하였다. 밝은 황색 여과액을 모으고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색 고체의 생성물인 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 138 g, 99% 수율)를 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 98.8%이었다.

(3) 실온에서, 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드(1-6, 60 g, 0.185 mol), 아제티딘-3-카르복실산(1-7, 19.5 g, 0.193 mol) 및 빙초산(360 mL, 0.63 mol)을 메탄올(1.6 L)에 첨가하고 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. NaBH₃CN(11.5 g, 0.185 mol)을 메탄올(200 mL)에 녹여주고, NaBH₃CN 메탄올 용액을 반응계에 1시간 내로 적하하였다. 적하 온도는 15-20℃로 조절되었다. 적하 후, 반응 액체를 20℃에서 16시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과 잔여물을 300 mL 메탄올로 씻어주고, 이어서, 건조시켜 흰색 고체의 생성물로 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실산(화합물 2, 64g, 84.5% 수율)을 수득하였다. LCMS로 검출된 순도는 96.9%이었다.

본 발명의 실시예에 해당하는 상기 설명은 본 발명을 제한하는 것이 아니고, 해당 분야의 당업자라면 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 본 발명의 보호 범위에서, 본 발명에 따라 다양한 변경 및 변형을 할 수 있다.

Claims

하기 식 1로 표시되는 화합물:
[식 1]

상기 식 1에서,
R은 할로젠이다.
제1항에 있어서,
R이 F, Cl 또는 Br인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
R이 F인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, S1P1에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 치료를 위한 의약품이되,
상기 질병 및 상태는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장염, 자가 면역 질환, 만성 염증 질환, 천식, 염증성 신경병증, 관절염, 이식, 크론 병, 궤양성 대장염, 홍반성 루푸스, 건선, 허혈-재관류 손상, 고형 종양, 통증, 급성 바이러스성 질환, 염증성 장 질환, 및 인슐린 및 비-인슐린 의존성 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의약품.
제4항에 있어서,
상기 질병 및 상태는 궤양성 대장염 또는 크론 병인 것을 특징으로 하는 의약품.
제4항에 있어서,
상기 질병 및 상태는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 염증성 장염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의약품.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, S1P1에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 치료를 위한 약학적 조성물이되,
상기 질병 및 상태는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장염, 자가 면역 질환, 만성 염증 질환, 천식, 염증성 신경병증, 관절염, 이식, 크론 병, 궤양성 대장염, 홍반성 루푸스, 건선, 허혈-재관류 손상, 고형 종양, 통증, 급성 바이러스성 질환, 염증성 장 질환, 및 인슐린 및 비-인슐린 의존성 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 질병 및 상태는 궤양성 대장염 또는 크론 병인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정제, 좌약, 분산성 정제, 장용 코팅 정제, 씹을 수 있는 정제, 경구 정제, 캡슐, 당-코팅제, 과립제, 건조 분말, 경구액, 주사용 작은 바늘, 동결 건조된 분말 또는 주사를 위한 대용량 비경구 용액의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정제, 좌약, 분산성 정제, 장용 코팅 정제, 씹을 수 있는 정제, 경구 정제, 캡슐, 당-코팅제, 과립제, 건조 분말, 경구액, 주사용 작은 바늘, 동결 건조된 분말 또는 주사를 위한 대용량 비경구 용액의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 캡슐의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 캡슐의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 희석제, 가용화제, 붕해제, 현탁제, 윤활제, 결합제, 충전제, 향미제, 감미제, 산화 방지제, 계면 활성제, 방부제, 소포 및 안료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 희석제, 가용화제, 붕해제, 현탁제, 윤활제, 결합제, 충전제, 향미제, 감미제, 산화 방지제, 계면 활성제, 방부제, 소포 및 안료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기 단계를 포함하는, 1-{2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질}-3-아제티딘 카르복실 산의 합성 방법:
(단계 1) 하기 반응식 (1)과 같이, 축합제 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 및 1-하이드록시벤조트리졸의 존재하에, 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘과 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산을 반응시켜 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올을 제조하는 단계:
[반응식 (1)]

;

(단계 2) 하기 반응식 (2)와 같이, 상기 단계 (1)에서 제조한 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올과 이산화망간을 반응시켜 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드를 제조하는 단계:
[반응식 (2)]

; 및

(단계 3) 하기 반응식 (3)과 같이, 아세트 산을 촉매로 및 소듐 시아노보로하이드라이드를 환원제로 사용하여, 상기 단계 (2)에서 제조한 식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드와 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실 산을 반응시켜 식 1B로 표시되는 화합물을 제조하는 단계:
[반응식 (3)]

.
제15항에 있어서,
(단계 1)은 식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올이 생성된 후, 얻어진 미정제 생성물을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제16항에 있어서,
상기 정제는 컬럼 크로마토그래피 또는 결정화를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제17항에 있어서,
결정화를 통해 정제를 수행하는 경우, 사용되는 결정화 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제18항에 있어서,
상기 결정화 용매는 메탄올과 물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제18항에 있어서,
상기 결정화 용매는 메탄올과 물의 3:1 부피비의 혼합물인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제18항에 있어서,
미정제 생성물(g, 중량)의 상기 결정화 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:3-20인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제18항에 있어서,
미정제 생성물(g, 중량)의 상기 결정화 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:5인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제17항에 있어서,
상기 결정화는 20℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
(단계 1)의 반응은 아세토니트릴, N-메틸피롤리돈 및 N,N-디메틸포름아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그이상의 반응 용매에서 수행되고;
상기 반응은 80-140℃의 온도에서 수행되고; 및
식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘과 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산의 몰 비율이 1:1-2.0인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제24항에 있어서,
(단계 1)에서, 반응 용매는 N,N-디메틸포름아미드인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제24항에 있어서,
상기 반응은 130-140℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제24항에 있어서,
상기 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘과 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산의 몰 비율이 1:1-1.5인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제24항에 있어서,
상기 식 1-3으로 표시되는 3-플루오로-N'-히드록시-4-히드록시메틸 벤즈아미딘과 식 1-4로 표시되는 4-이소부틸벤조산의 몰 비율이 1:1-1.2인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제15항에 있어서,
(단계 2)의 반응은 톨루엔, 테트라하이드로퓨란 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 반응 용매에서 수행되고;
식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(g, 중량)의 반응 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:10-30이고;
반응은 40-70℃의 온도에서 수행되고; 및
식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:4-10이인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제29항에 있어서,
(단계 2)에서, 반응 용매는 에틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제29항에 있어서,
식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올(g, 중량)의 반응 용매(ml, 부피)에 대한 비율은 1:10인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제29항에 있어서,
상기 반응은 60-70℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제29항에 있어서,
식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:5-6인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
식 1-5로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤질 알코올의 이산화망간에 대한 몰 비율은 1:6인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제15항에 있어서,
(단계 3)의 반응은 테트라하이드로퓨란 및 메탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 반응 용매에서 수행되고;
식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1-1.2이고;
식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율은 1:0.5-6이고; 및
반응은 0-30℃의 온도에서 1-16 시간의 반응 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
단계 (3)에서, 반응 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1-1.1인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 식 1-7로 표시되는 아제티딘-3-카르복실산에 대한 몰 비율은 1:1인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
소듐 시아노보로하이드라이드는 메탄올에 녹이고 반응계에 0-20℃의 온도에서 적하하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
소듐 시아노보로하이드라이드는 메탄올에 녹이고 반응계에15-20℃의 온도에서 적하하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
식 1-6으로 표시되는 2-플루오로-4-[5-(4-이소부틸페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]-벤즈알데하이드의 소듐 시아노보로하이드라이드에 대한 몰 비율은 1:1인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
상기 반응은 10-20℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항에 있어서,
상기 반응은 15-20℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 4-16 시간의 반응 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.