KR102355774B1 - 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 메틸 아크릴레이트 수식된 글리콜 키토산 유도체로서, 카르복실기가 치환된 글리콜 키토산 유도체 및 이를 포함하는 애주번트 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 애주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물은, 시판중인 애주번트를 포함하는 백신 조성물과 비교하여 증가된 면역원성을 나타냈다.
Description
본 발명은 신규한 애주번트 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 글리콜 키토산 기반의 백신 애주번트 조성물에 관한 것이다.
다양한 질병을 치료하기 위해서 치료용 백신을 환자에게 투여하였을 때 그 자체 만으로의 효율도 중요하지만, 백신의 효력의 저하 시키는 다양한 체내 환경을 극복하여야 한다. 이를 위해, 백신을 에멀젼 (emulsion), 리포좀 (liposome), 나노파티클 (nanoparticle) 등을 이용하여 함께 전달하는 기술이 개발되었으며, 최근에는 면역자극에 대한 애주번트 (adjuvant), 및 수용체 (receptor)를 이용한 작용제 등이 개발되고 있다 (Seth A, Ritchie FK, Wibowo N, Lua LHL, Middelberg APJ. Non-Carrier Nanoparticles Adjuvant Modular Protein Vaccine in a Particle-Dependent Manner. PloS one. 2015;10). 특히, 면역보조제 또는 면역증강제로서 애주번트는 다양한 방법으로 제조 가능하여 백신 제조시 많이 사용되고 있다. 이상적인 애주번트는 재현성이 가능한 제조방법을 지녀야 하며, 독성이 없어야 한다. 이와같이, *?**?*애주번트*?**?*는 특이적 항원을 구성하지는 않지만, 동시 투여된 항원에 대한 면역 반응의 강도 및 수명을 증진시키는 제제를 의미하며, 면역치료에 대한 안전하고 새로운 애주번트 또는 백신보조제의 개발을 위한 연구가 꾸준히 수행되고 있다 (Batista-Duharte A, Lindblad EB, Oviedo-Orta E. Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms. Toxicology letters. 2011;203:97-105).
키토산 (chitosan)은 N-아세틸클루코사민 (N-acetylglucosamine)으로 명명되는 긴 체인 (long chain)의 고분자로서, 독성이 없고 생체 적합하며 자연에서 유래된 물질로 잘 알려져 있다 (Zaharoff DA, Rogers CJ, Hance KW, Schlom J, Greiner JW. Chitosan solution enhances the immunoadjuvant properties of GM-CSF. Vaccine. 2007;25:8673-86). 키토산 유도체들은 현재 유전자와 약물 전달체로서 광범위하게 사용되고 있으며, 제약분야에서도 적용되고 있다 (Haryono A, Salsabila K, Restu WK, Harmami SB, Safari D. Effect of Chitosan and Liposome Nanoparticles as Adjuvant Codelivery on the Immunoglobulin G Subclass Distribution in a Mouse Model. J Immunol Res. 2017; Saenz L, Neira-Carrillo A, Paredes R, Cortes M, Bucarey S, Arias JL. Chitosan formulations improve the immunogenicity of a GnRH-I peptide-based vaccine. International journal of pharmaceutics. 2009;369:64-71). 그러나 키토산은 물에 잘 녹지 않고 산성의 용액을 사용해야만 녹는다는 특성을 가지고 있다. 반면에 키토산의 유도체인 글리콜 키토산 (Glycol chitosan)은 기존의 키토산과 동일하게 독성이 없으며, 생체 적합성과 생분해성을 지니고, 수용성인 특징을 가지고 있다 (Pawar D, Mangal S, Goswami R, Jaganathan KS. Development and characterization of surface modified PLGA nanoparticles for nasal vaccine delivery: effect of mucoadhesive coating on antigen uptake and immune adjuvant activity. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 2013;85:550-9). 글리콜 키토산이 레이저 면역치료 (laser immunotherapy)에서 큰 효과를 보인다는 것이 보고된 바 있으며 (Chen WR, Liu H, Ritchey JW, Bartels KE, Lucroy MD, Nordquist RE. Effect of different components of laser immunotherapy in treatment of metastatic tumors in rats. Cancer Res. 2002;62:4295-9), 이는 글리콜 키토산이 잠재적으로 유용한 면역보조제로서 이용될 수 있음을 보여주는 결과이다. 또한, 폴리포스파젠-폴리락산의 면역자극 활성이 카르복실산 (carboxylic acid)의 함량에 의존한다는 것이 확인된 바 있으며, 그 결과, 카르복실산의 함량이 낮아지면 면역자극 활성도가 떨어지고, 함량이 증가하면 면역 자극 활성도가 증가하는 것이 밝혀진 바 있다 (Andrianov AK, Svirkin YY, LeGolvan MP. Synthesis and biologically relevant properties of polyphosphazene polyacids. Biomacromolecules. 2004;5:1999-2006). 한편, 한국특허출원 제 10-1998-0703215호는 키토산을 보조제로 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 기술하고 있다. 이러한 기존의 연구를 바탕으로 보았을 때, 본 발명에서 사용하고자 하는 키토산 유도체인 글리콜 키토산은 수용성이며 생체 적합성과 생 분해성이 뛰어난 물질임을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 키토산 유도체를 이용한 백신보조제를 개발하고자 노력하였다. 애주번트로서 글리콜 키토산을 이용하고 이를 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate)로 수식 (modification) 하였다. 또한, 에스테르 가수분해 (ester hydrolysis) 방법을 이용하여 GC-MA의 끝 부분을 카르복실산으로 치환하였다. 그 결과, 본 발명이 글리콜 키토산 유도체가 애주번트 또는 백신 보조제로서가 우수한 효과를 갖는 것을 본 발명을 완성하였다.
Seth A, Ritchie FK, Wibowo N, Lua LHL, Middelberg APJ. Non-Carrier Nanoparticles Adjuvant Modular Protein Vaccine in a Particle-Dependent Manner. PloS one. 2015;10.
Batista-Duharte A, Lindblad EB, Oviedo-Orta E. Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms. Toxicology letters. 2011;203:97-105.
Haryono A, Salsabila K, Restu WK, Harmami SB, Safari D. Effect of Chitosan and Liposome Nanoparticles as Adjuvant Codelivery on the Immunoglobulin G Subclass Distribution in a Mouse Model. J Immunol Res. 2017.
Saenz L, Neira-Carrillo A, Paredes R, Cortes M, Bucarey S, Arias JL. Chitosan formulations improve the immunogenicity of a GnRH-I peptide-based vaccine. International journal of pharmaceutics. 2009;369:64-71.
Pawar D, Mangal S, Goswami R, Jaganathan KS. Development and characterization of surface modified PLGA nanoparticles for nasal vaccine delivery: effect of mucoadhesive coating on antigen uptake and immune adjuvant activity. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 2013;85:550-9.
Chen WR, Liu H, Ritchey JW, Bartels KE, Lucroy MD, Nordquist RE. Effect of different components of laser immunotherapy in treatment of metastatic tumors in rats. Cancer Res. 2002;62:4295-9.
Andrianov AK, Svirkin YY, LeGolvan MP. Synthesis and biologically relevant properties of polyphosphazene polyacids. Biomacromolecules. 2004;5:1999-2006.
이와 같이, 본 발명은 애주번트 조성물의 제조에 사용될 수 있는 글리콜 키토산 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 메틸 아크릴레이트를 가수분해하여 카르복실기를 갖는 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 애주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 백신의 투여를 필요로 하는 사람 또는 동물에 투여하는 것을 포함하여 사람 또는 동물을 면역화 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 메틸 아크릴레이트 수식된 글리콜 키토산 유도체:
화학식 1
(상기 식에서, n은 1 내지 5,000 이하의 정수이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, 니트로, C1∼C5 알킬기, C5∼C10 아릴기, C4∼C10 헤테로아릴기, C3∼C10 시클로알킬기 또는 C3∼C10 헤테로시클로알킬기이다).
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 구조식을 갖는 메틸 아크릴레이트 수식된 클리콜 키토산을 포함하는 애주번트 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 그리고 비제한적인 예로서, 상기 글리콜 키토산 유도체의 분자량은 1,000 Da 내지 1,000,000 Da이며, 상기 글리콜 키토산 유도체는 10% 내지 100%의 메틸 아크릴레이트 치환율을 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 애주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명에서 항원은, 예를 들어, 세균 항원, 바이러스 항원, 재조합 항원, 또는 이들의 조합이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 세균 항원은, 예를 들어, Mycoplasma hyopneumoniae , Mycoplasma galanacieum , Mycoplasma bovis , Haemophilus parasuis , Haemophilus somnus , Mycobaterium bovis , Bordetella bronchiseptica, Leptospira , Actinobacillus pleuropneumoniae , Pasteuella multocida , Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli , Streptococcus suis , Streptococcus uberis , Staphylococcus aureus , 및 Salmonella entericaserovars 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원일 수 있다. 본 발명에서, 바이러스 항원은, 예를 들어, Bovine herpesviruses-1,3,6, Bovine viral diarrhea virus(BVDV) type 1,2, Bovine parainfluenza virus, Bovine respiratory syncytial virus, Bovine leukosis virus, Porcine epidemic diarrhea virus, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), Foot and mouth disease virus, Swine fever virus, Porcine parvovirus, Porcine circovirus, Swine influenza virus, Swine vesicular disease virus, Techen fever virus, Rabies virus, Canine coronavirus, Canine influenzavirus, Canine parvovirus, Feline panleukopenia virus, Feline calicivirus, Feline parvovirus, 및 Feline herpesvirus 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원일 수 있다. 추가적인 항원에는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 및 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 재조합 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 메틸 아크릴레이트 수식된 글리콜 키토산 유도체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 글리콜 키토산 (GC)과 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate) (MA)를 반응시켜 메틸 아크릴레이트 수식된 글리콜 키토산 유도체를 제조한 다음, 에스테르 가수분해하여 메틸 아크릴레이트 수식된 카르복실기를 갖는 글리콜 키토산 유도체를 제조하였다. 글리콜 키토산과 메틸 아크릴레이트는, 예를 들어, 1:50 ~ 1:200의 몰비로 반응시키며, 에스테르 가수분해는 예를 들어 NaOH를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 메틸 아크릴레이트를 가수분해하여 카르복실기를 갖는 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물은 세균, 바이러스, 및/또는 재조합 항원의 면역기능을 강화한다. 본 발명의 일 실시예에서, 두 가지의 세포주에 본 발명의 애주번트 조성물인 글리콜 키토산 유도체과 시중에서 사용되어지는 알룸 겔 등을 대조군으로하여 세포 생존률을 비교한 결과, 본 발명의 조성물을 사용한 시료가 90% 이상의 높은 생존율을 나타냈다. 이로부터 본 발명에서 제조된 글리콜 키토산 유도체가 세포 내로 전달되었을 때 면역반응을 일으키지 않고 세포 독성을 나타내지 않음을 나타내며, 생체 내로 투입하였을 경우 안전성 또한 뛰어난 애주번트 조성물임을 확인할 수 있었다. 또 다른 일 실시예에서, 세균 항원과 함께 본 발명의 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 백신 조성물을 투여한 마우스의 생존률이 증가하였다. 또한, 다른 일 실시예에서, 바이러스 항원과 함께 본 발명의 글리콜 키토산을 포함하는 백신 조성물을 투여한 기니피그에서 항체가의 현저한 증가가 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 글리콜 키토산은 애주번트로서 백신 조성물의 제조에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.
도 1의 (A) 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트의 합성과정을 개략적으로 나타낸 것이고, (B)는 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 COOH 또는 COO-Na+의 염기-촉매 에스테르 가수분해 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2은 글리콜 키토산 (GC, 검은색 선)의 1H NMR 스펙트럼 (위쪽), (B) 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (아래쪽)을 각각 나타낸다.
도 3은 글리콜 키토산의 ATR-FTIR 스펙트럼 (GC, 검은색 선), 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA, 녹색 선) 및 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 COOH/COO-Na+ (GC-MA-COOH/COO-Na+, 빨간색 선)을 각각 나타낸다.
도 4는 재조합 단백질 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세균 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 바이러스 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HEK 293 세포주를 사용한 독성 평가 결과를 나타낸 것으로 알룸 (Alum, 파란색 선), 글리콜 키토산 (GC, 빨간색 선), 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA, 녹색 선) 및 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 COOH/COO-Na+ (GC-MA-COOH/COO-Na+, 보라색 선)을 각각 나타낸다.
도 8은 HeLa 세포주를 사용한 독성 평가 결과를 나타낸 것으로 각각의 선들은 도 7과 동일하게 나타낸 것이다.
도 2은 글리콜 키토산 (GC, 검은색 선)의 1H NMR 스펙트럼 (위쪽), (B) 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (아래쪽)을 각각 나타낸다.
도 3은 글리콜 키토산의 ATR-FTIR 스펙트럼 (GC, 검은색 선), 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA, 녹색 선) 및 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 COOH/COO-Na+ (GC-MA-COOH/COO-Na+, 빨간색 선)을 각각 나타낸다.
도 4는 재조합 단백질 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세균 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 바이러스 항원을 사용한 애주번트 효력 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HEK 293 세포주를 사용한 독성 평가 결과를 나타낸 것으로 알룸 (Alum, 파란색 선), 글리콜 키토산 (GC, 빨간색 선), 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA, 녹색 선) 및 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 COOH/COO-Na+ (GC-MA-COOH/COO-Na+, 보라색 선)을 각각 나타낸다.
도 8은 HeLa 세포주를 사용한 독성 평가 결과를 나타낸 것으로 각각의 선들은 도 7과 동일하게 나타낸 것이다.
이하 실시예 및 도면에 의거하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이며, 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
재료 및 방법
글리콜 키토산 (GC, degree of deacetylation = 91.6%)은 와코 (Wako pure chemical industrials, Osaka, Japan)에서 구매하였다. 메틸 아크릴레이트 (99%), 소듐 하이드록사이드 (sodium hydroxide), 메탄올 (methanol) (anhydrous, 99.8%)은 시그마-알드리치 (Sigma-aldrich)에서 구매하였다. 투석 멤브레인 튜브 (dialysis membrane tubing)는 스펙트럼 랩스 (Spectrum Labs, USA)에서 구매하였다.
(1) 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA) 합성
30 ㎎의 글리콜 키토산 (GC, 1 m㏖)과 1.305 ㎖의 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate) (MA, 100 m㏖)를 계량하였다. 계량한 글리콜 키토산을 3차 증류수에 녹이고 튜브에 옮겨 담았다. 준비한 250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크와 마그네틱 바 (magnetic bar)를 메탄올로 세척하였다. 둥근 바닥 플라스크에 메틸 아크릴레이트를 넣고, 메탄올로 채운 후 10분 정도 교반하면서, 증류수에 미리 녹인 글리콜 키토산을 떨어 뜨렸다. 플라스크 내의 용매는 메탄올과 증류수의 비율을 9:1로 조정하였다. 둥근 플라스크 내부를 질소 기체로 채운 후 쉐이킹 인큐베이터 (shaking incubator)에서 4일간 37℃, 180 rpm에서 반응시켰다. 4일 후, 메탄올을 증발시켜 제거하고, 잔류한 생성물을 투석 멤브레인 (dialysis membrane) (MWCO 3.5 kDa)에 넣은 다음, 1일 동안 증류수에서 투석시켰다. 1일 후, 생성물을 다시 1일 동안 동결건조 (freeze dry) 하여 물을 제거하였다. 이 때 GC-MA의 결합 확인을 위해 1H Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (AVANCE, 600 FT-NMR, Bruker, Germany)을 측정하였다. GC: 1H-NMR (600 MHz, D2O, ppm) δ 2.0 - 2.1 (NHCOCH 3, acetyl group), 2.6 - 2.8 (H2 of deacetylated monomer), 3.4 - 3.9 (H2 to H8, multiplet, D-glucosamine unit and hydroxyl ethyl substituents), 4.3-4.5 (H1); GC-MA: 1H-NMR (600 MHz, D2O, ppm) δ 2.0 - 2.1 (NHCOCH 3, acetyl group), 2.5-2.7 (H2 of deacetylated monomer, OCCH, H10), 3.0 - 3.2 (HCCHN, H9), 3.5 - 3.8 (H2 to H8, multiplet, D-glucosamine unit and hydroxyl ethyl substituents), 4.4-4.5 (H1)
(2) GC-MA-COOH 제조
합성된 GC-MA를 5M의 소듐 하이드록사이드 (Sodium hydroxide) (NaOH)에 녹인 후 250 ㎖의 둥근 플라스크에 옮겼다. 물의 온도를 70 ~ 80℃으로 맞춘 후 중탕으로 둥근 플라스크를 교반하면서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후에 둥근 플라스크 내부의 녹여진 GC-MA를 투석 멤브레인 (dialysis membrane) (MWCO 3.5 kDa)에 넣어 1일 동안 증류수에서 투석시켰다. 1일 후 생성물을 동결건조하여 물을 제거하였다. 합성된 GC-MA-COOH가 갖는 작용기를 확인하였다 (Nicolet iS5 Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) spectroscopy (Thermo scientific, Madison, Wisconsin, USA).
(3) GC-MA-COOH 합성 확인
글리콜 키토산을 백본으로 하여 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate)를 마이클 첨가 (michael addition) 방법으로 연결하였다. 합성 과정을 도 1(A)에 나타내었고, GC-MA 합성 후 NaOH를 이용하여 제조한 GC-MA-COOH의 과정은 도 1(B)에 나타내었다. 다음, GC와 MA가 결합된 것을 확인하기 위하여 합성된 물질을 D2O에 녹인 후, 600MHz 1H NMR 핵자기공명 스펙트럼으로 측정하였다. 그 결과 도 2에서 볼 수 있듯이 GC에 MA를 연결하였을 때 2.5 - 2.7 ppm 사이에 OCCH- 의 수소 (H10)가 존재하는 것을 확인할 수 있었고, 3.0 - 3.2 ppm 에서는 HCCHN- 의 수소 (H9)가 존재하는 것을 통해 GC-MA의 합성이 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 합성된 GC-MA를 5M NaOH로 에스테르 가수분해시킨 GC-MA-COOH는 ATR-FTIR 스펙트럼을 통해 합성 후 생성된 작용기를 확인하였다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 GC의 그래프 중 3500 cm-1은 하이드록실기 (hydroxyl group)이며, GC에 MA를 결합하였을 경우 1550 cm-1에 카르복실기가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 이는 GC와 MA가 마이클 첨가 방법을 통해 NCH2CH2 COOCH3-가 형성되었음을 확인할 수 있었다. 특히 GC-MA를 5M NaOH로 가수분해시켰을 때는 1420, 1610 cm-1에 새로운 피크가 나타났는데, 이 피크는 5M NaOH가 GC-MA 말단의 OOCH2와 만나면서 물을 제거해 주었을 때 COOH의 염형태로써 말단에 Na+가 결합되어 나타났음을 알 수 있었다.
(4) GC-MA-COOH의 독성 평가
합성된 GC-MA-COOH의 세포 내 독성 확인을 위하여 HeLa와 HEK 293 세포주를 사용하여 독성 평가를 진행하였다. 이때, WST 시약을 세포에 처리한 후 각각의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 도 7 및 도 8에 나타내었다. GC-MA-COOH와 비교를 위하여 알룸 겔 (Alum gel), 글리콜 키토산 (GC) 및 가수분해되지 않은 글리콜 키토산 메틸 아크릴레이트 (GC-MA)를 대조군으로 사용하였다. 사용된 샘플의 농도는 12.5, 25, 50, 100 및 200 ug/ml의 농도를 사용하여 세포에 처리하였다. 그 결과, 도 7은 HEK 293 세포주로서 모든 샘플에서 생존율이 90% 이상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 8은 HeLa 세포주로서 도 7과 마찬가지로 세포 생존율이 90% 이상을 나타내었다. 이는 글리콜 키토산을 기반으로 합성된 글리콜 키토산 메틸아크릴레이트 COOH가 애주번트로서 독성이 없고 무해하며 안전성이 높아 생체 적합함을 입증해주는 결과이다.
실시예
재조합 단백질 항원을 이용한 애주번트 효능평가
재조합단백질 항원을 이용한 효능평가를 수행하였다. 먼저 5종의 시험백신을 아래 표 1과 같은 조성으로 제조하였다. 상기 제조예에서 제조한 글리콜 키토산 중합체 (GC-MA-COOH)를 사용하였다.
시험백신 | Vac1 | Vac2 | Vac3 | Vac4 | Vac5 |
항원 (Antigen) | PPV VP2 HA 211 |
PPV VP2 HA 211 |
PPV VP2 HA 211 |
PPV VP2 HA 211 |
- |
폴리머 (Polymer) | GC 0.1 ㎎/dose |
GC-MA 0.1 ㎎/dose |
GC-MA-COOH 0.1 ㎎/dose |
- | - |
비고 | Non adjuvant | 무접종군 |
항원 (antigen)으로서 돼지 파보바이러스 VP2 단백질 (Recombinant Baculovirus VP2-BV주) (Seed 입수처: 국립수의과학검역원)을 사용하고 백신조성물에 HA 211/㎖이 포함되도록 하였다. 모든 시험백신은 pH7이 되도록 하였다. 실험동물로서 기니피그 (수컷, 300 ~ 350 g)를 사용하였다. 시험백신 그룹 당 5마리 기니피그 (대조군의 경우 3마리)에 상기 제조한 백신의 1/2 (1 ㎖/두)씩 피하접종하고, 4주 후에 대조군과 함께 채혈하여 혈구응집억제 항체가를 측정하였다. 아래 표 2 및 도 4는 그 결과를 나타낸 것이다.
백신그룹 | Vac1 | Vac2 | Vac3 | Vac4 | Vac5 |
샘플 | GC | GC-MA | GC-MA-COOH | Non adjuvant | 무접종군 |
접종군 | 320 | 160 | 640 | 80 | 1 |
160 | 160 | 640 | 80 | 1 | |
320 | 160 | 320 | 160 | 1 | |
160 | 80 | 320 | 40 | - | |
160 | 80 | 80 | 80 | - | |
기하평균 | 211.1 | 121.3 | 320 | 80 | 1 |
표준편차 | 87.6 | 43.8 | 240 | 43.8 | 0 |
상기 표 2 및 도 4에서 확인되는 것과 같이, 이와 같은 혈구응집억제 항체가 결과에 따르면, 본 발명의 Vac3 (GC-MA-COOH)이 가장 높은 혈구응집억제 항체가를 나타냈으며, 글리콜 키토산 중합체 (GC-MA-COOH)의 전구물질들 (Vac1, Vac2)도 애주번트 비처리군 (Non adjuvant) 및 무접종군과 대비하여 보다 더 높은 혈구응집억제 항체가을 나타냈으며, 이는 애주번트 효과에 의한 것이다.
세균 항원을 이용한 애주번트 효능평가
세균 항원을 이용한 효능평가를 수행하였다. 먼저 4종의 시험백신을 아래 표 3과 같은 조성으로 제조하였다. 상기 제조예에서 제조한 글리콜 키토산 중합체 (GC-MA-COOH)를 사용하였다.
시험백신 | Vac1 | Vac2 | Vac3 | Vac4 |
항원 (Antigen) | SE bacterin 0.2 X 1010CFU/㎖ |
SE bacterin 0.2 X 1010CFU/㎖ |
SE bacterin 0.2 X 1010CFU/㎖ |
- |
폴리머 (Polymer) | GC-MA-COOH 0.4 ㎎/dose |
- | - | - |
알룸 (Alum) | - | Alum 20% | - | - |
비고 | 양성대조군 | Non adjuvant | 무접종군 |
항원 (antigen)으로서 SE bacterin (Erysipelothrix . rhusiopathiae) (Seed 입수처: 국립수의과학검역원, 항원 입수처: 중앙백신연구소)을 사용하고 백신조성물에 0.2 X 1010CFU/㎖이 포함되도록 하였다. 양성대조군으로서 일반적으로 많이 사용되는 백신보조제인 알룸 (Alum, Aluminum hydroxide gel)을 사용하고, 백신조성물에 20 % (v/v) 포함되도록 하였다. 모든 시험백신은 pH7이 되도록 하였다. 시험백신 그룹 당 마우스 (ICR 마우스, 수컷, 4 ~ 6 주령, 15 ~ 20 g) 8 마리에 상기 제조한 백신의 1/10 (0.2 ㎖) 두분을 1회 피하 접종하고, 5마리의 마우스는 대조군 (무접종군)으로 두었다. 1차 접종 2주 후에 대조군과 함께 돼지 단독균 (E. rhusiopathiae) 100 LD50/0.2㎖을 피하에 공격접종한 후 10일간 생존여부를 관찰하였다. 아래 표 4 및 도 5는 그 결과를 나타낸 것이다.
백신그룹 | 샘플 | 마리수 | 시험결과 | 생존율(%) |
Vac1 | GC-MA-COOH | 10 | 8/10 | 80 |
Vac2 | Alum | 10 | 7/10 | 70 |
Vac3 | Non adjuvant | 10 | 6/10 | 60 |
Vac4 | 무접종군 | 5 | 0/5 | 0 |
상기 표 4 및 도 5에서 확인되는 것과 같이, 이와 같은 생존율 결과에 따르면, 양성대조군인 Vac2 (Alum)과 본 발명의 Vac1 (GC-MA-COOH)이 Vac4 (무접종군)와 대비하여 보다 더 높은 생존율을 나타냈으며, 이는 애주번트 효과에 의한 것이다. 특히, 본 발명의 Vac1 (GC-MA-COOH)이 Vac2 (Alum) 보다 더 우수한 효과를 나타냈다.
바이러스 항원을 이용한 애주번트 효능평가
바이러스 항원을 이용한 효능평가를 수행하였다. 먼저 4종의 시험백신을 아래 표 5과 같은 조성으로 제조하였다.
그룹 | Vac1 | Vac2 | Vac3 | Vac4 |
항원(Antigen) | CCV 105.5TCID50/dose |
CCV 105.5TCID50/dose |
CCV 105.5TCID50/dose |
- |
폴리머 (Polymer) | GC-MA-COOH 0.4mg/dose |
- | - | - |
알룸 (Alum) | - | Alum 3% | - | - |
비고 | - | 양성대조군 | Non adjuvant | 무접종군 |
항원 (antigen)으로써 개코로나바이러스 (CCV, Canine Corona virus) (Seed 입수처: Cornell university, 또는 항원 입수처: 중앙백신연구소)를 사용하고 백신조성물에 105.5 TCID50/㎖이 포함되도록 하였다. 양성대조군으로서 일반적으로 많이 사용되는 백신보조제인 알룸 (Aluminum hydroxide gel)을 사용하고, 백신조성물에 3% (v/v) 포함되도록 하였다. 모든 시험백신은 pH7이 되도록 하였다. 실험동물로서 기니피그 (수컷, 300 ~ 350g)를 사용하였다. 시험백신 그룹 당 5마리 기니피그 (대조군의 경우 3마리)에 상기 제조한 백신의 1/2 (1 ㎖/두)씩 2주 간격으로 2회 근육 접종하고, 2주 후에 대조군과 함께 채혈하여 개코로나바이러스에 대한 중화항체가 (NPLA)를 측정하였다. 아래 표 6 및 도 6는 그 결과를 나타낸 것이다.
백신그룹 | Vac1 | Vac2 | Vac3 | Vac4 |
샘플 | GC-MA-COOH | Alum | Non adjuvant | 무접종군 |
접종군 | 32 | 32 | 1 | 1 |
16 | 2 | 1 | 1 | |
32 | 16 | 2 | 1 | |
32 | 16 | 1 | - | |
16 | 8 | 2 | - | |
기하평균 | 24.25 | 10.56 | 1.32 | 1 |
표준편차 | 8.76 | 11.27 | 0.54 | 0 |
개코로나바이러스의 동물용 의약품 국가검정 기준은 접종 동물의 80% 이상이 8배 이상을 만족해야 한다. 중화항체가 시험결과 Vac2 (2차)와 비교하여 본 발명 Vac1 (GC-MA-COOH) 그룹의 항체가가 높게 형성됨을 확인하였다. 중화항체가 시험결과 Vac1 (GC-MA-COOH) 그룹의 항체가가 가장 높게 형성됨을 확인하였다. 기존 CCV 백신의 항원함량 대비 함량을 1/2로 낮추어 시험백신을 제작하였음에도 불구하고 Vac1 (GC-MA-COOH)그룹의 모든 접종 동물에서 동물용 의약품 국가검정 기준인 8배 이상의 항체가를 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 애주번트 (GC-MA-COOH)가 현재 사용 중인 알룸 백신보조제와 비교하여 매우 우수한 효과가 있음을 제시한다.
본 발명에 따른 애주번트 조성물과 항원을 포함하는 백신 조성물을 동물에 투여한 결과 증가된 생존력 및 항체가를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 사람 또는 동물의 백신 조성물 제조에 있어서 면역원성 강화를 위해 널리 이용될 수 있을 것이다.
Claims (16)
- 삭제
- 제 1항의 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물로서, 상기 글리콜 키토산 유도체의 분자량은 1,000 Da 내지 1,000,000 Da인 것인, 애주번트 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 10% 내지 100%의 메틸 아크릴레이트 치환율을 갖는 것을 특징으로 하는, 애주번트 조성물.
- 제 1항의 글리콜 키토산 유도체 또는 제 3항의 애주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물.
- 제 4항의 애주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물.
- 제 5항에 있어서, 항원이 세균 항원, 바이러스 항원, 또는 재조합 항원인 것인, 백신 조성물.
- 제 6항에 있어서, 항원이 세균 항원, 바이러스 항원, 또는 재조합 항원인 것인, 백신 조성물.
- 제 5항에 있어서, 세균 항원은 Mycoplasma hyopneumoniae , Mycoplasma galanacieum , Mycoplasma bovis, Haemophilus parasuis , Haemophilus somnus , Mycobaterium bovis , Bordetella bronchiseptica , Leptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae , Pasteuella multocida , Erysipelothrix rhusiopathiae , Escherichia coli , Streptococcus suis , Streptococcus uberis , Staphylococcus aureus , 및 Salmonella entericaserovars 로 구성된 군으로부터 선택된 것인, 백신 조성물.
- 제 5항에 있어서, 바이러스 항원은 Bovine herpesviruses-1,3,6, Bovine viral diarrhea virus(BVDV) type 1,2, Bovine parainfluenza virus, Bovine respiratory syncytial virus, Bovine leukosis virus, Porcine epidemic diarrhea virus, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), Foot and mouth disease virus, Swine fever virus, Porcine parvovirus, Porcine circovirus, Swine influenza virus, Swine vesicular disease virus, Techen fever virus, Rabies virus, Canine coronavirus, Canine influenzavirus, Canine parvovirus, Feline panleukopenia virus, Feline calicivirus, Feline parvovirus, 및 Feline herpesvirus 로 구성된 군으로부터 선택된 것인, 백신 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 세균 항원은 돼지단독균 (Erysipelothrix . rhusiopathiae)인 것인, 백신 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 바이러스 항원은 개코로나바이러스 (Canine Corona virus)인 것인 백신 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 i)에서 글리콜 키토산과 메틸 아크릴레이트는 1:50 내지 1:200의 몰 비로 반응시키고, 상기 ii)의 에스테르 가수분해가 NaOH에 수행되는 것인, 글리콜 키토산 유도체를 제조하는 방법.
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- 삭제
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KR1020180137788A KR102355774B1 (ko) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물 |
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KR1020180137788A KR102355774B1 (ko) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물 |
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KR20200054485A KR20200054485A (ko) | 2020-05-20 |
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KR1020180137788A KR102355774B1 (ko) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 글리콜 키토산 유도체를 포함하는 애주번트 조성물 |
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KR (1) | KR102355774B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL9500590A (nl) | 1995-03-28 | 1996-11-01 | Hollandse Signaalapparaten Bv | Inrichting voor het detecteren van doelen. |
-
2018
- 2018-11-12 KR KR1020180137788A patent/KR102355774B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Carbohydrate Polymers, Vol. 137, pages 669-677 (2016)* |
Drug Deliv, Vol. 23(1), pages 185-194(2016)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200054485A (ko) | 2020-05-20 |
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