KR102351434B1 - 고도로 선택적인 핵산 증폭 프라이머 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 프라이머-의존적 핵산 증폭 방법을 위한 다중-부분 프라이머를 개시한다. 또한, 프라이머-의존적 핵산 증폭 반응, 특히, DNA 증폭 반응, 반응 혼합물 및 상기 반응을 위한 시약 키트도 개시한다. 본 발명은, 프라이머-의존적 핵산 증폭 반응, 특히, PCR과 같은 DNA 증폭 반응, 및 프라이머, 반응 혼합물 및 상기 반응을 위한 시약 키트 및 이를 사용하는 검정에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 2013년 2월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/762,117호의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은, 프라이머-의존적 핵산 증폭 반응, 특히, PCR과 같은 DNA 증폭 반응, 이러한 반응을 위한 프라이머, 반응 혼합물 및 시약 키트 및 이를 사용하는 검정에 관한 것이다.
증폭 산물("앰플리콘(amplicon)")의 검출을 포함할 수 있는 프라이머-의존적 핵산 증폭 반응은, "특이성"을 필요로 하는데, 즉, 핵산 가닥의 의도된 위치에의 프라이머의 어닐링, 및 의도된 표적 서열에만 결합된 프라이머의 신장을 필요로 한다. 통상적으로, 특이성은, 프라이머를 충분히 길게 제조하여 증폭 반응 조건 하에 주로 프라이머-어닐링 단계 동안에 프라이머가 핵산 가닥 내의 한 위치로만 가도록 하여 얻는다.
소정 증폭 반응은, 대립유전자 변이체들, 예를 들면, 단일-뉴클레오티드 다형(SNP: single-nucleotide polymorphism)들을 구별하도록 의도된다. 이를 수행하는 한가지 방법은, 모든 변이체를 증폭시키고 대립유전자-특이적 하이브리드화 프로브, 예를 들면, 분자 비콘 프로브(molecular beacon probe)에 의해 이들을 구별하는 것이다. 이러한 접근법의 경우, 증폭 프라이머를 모든 변이체에 동등하게 상보성으로 제조하여 대립유전자간에 변하는 서열을 포함하는 영역을 증폭시키고, 프로브가, 증폭된 산물 또는 산물들 내에 존재하는 대립유전자를 확인한다. 예를 들면, 문헌[Tyagi et al. (1998) Nature Biotechnology 16:49-53]을 참조한다. 조사되는 서열이, 다른 대립유전자, 예를 들면, 야생형(WT) 변이체와의 혼합물 중에 존재하는 대립유전자, 예를 들면, SNP인 경우에는, 보편적인 대립유전자의 증폭이 희귀한 대립유전자의 증폭을 압도하는 경향으로 인해, 프로브 사용에 의한 구별은 약 3%(1,000,000개의 대안의 대립유전자 분자의 존재 하에 약 30,000개 이상의 표적 대립유전자 분자)의 실제적인 검출 한계를 갖는다.
대립유전자를 구별하는 다른 방법은, 조사되는 서열에 대해 선택적인 프라이머를 사용하는 것이다. 이러한 접근법의 경우, 프라이머를 대립유전자간에 변하는 서열에 대해 상보성으로 제조하고, 증폭된 산물은, 표지된 프라이머, DNA 결합 염료, 또는 표지된 프로브(이 경우 프로브는, 모든 대립유전자의 앰플리콘에 공통인 서열을 검출한다)에 의해 검출할 수 있다. 고도로 특이적인 프라이머는 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이러한 통상의 프라이머는 다른 대립유전자에 비해 한 대립 유전자에 대해 매우 제한된 선택성을 갖는다. 프라이머의 단축(shortening)은 이의 선택성을 증진시킬 것이지만, 이러한 증진은 특이성을 훼손시키기 때문에, 그리고, 짧은 프라이머는 전형적인 어닐링 온도에서 이들의 표적 서열과의 안정한 하이브리드를 형성하지 않을 가능성이 있기 때문에, 프라이머의 단축은, 대립유전자의 혼합물을 분석하기 위한 유용성이 제한되는 것으로 공지되어 있다.
프라이머의 특이성을 유지하면서 이들의 선택성을 증진시키기 위한 프라이머의 다른 변형이 개발되었다. 하나의 이러한 접근법은 ARMS("증폭 불응 돌연변이 시스템(amplification refractory mutation system)")이다. ARMS 프라이머는, 조사되는 서열 변이체에 대해 상보성이지만 다른 대립유전자 또는 대립유전자들에 대해 미스매치(mismatched)되는 3'-말단 뉴클레오티드를 갖는다. 문헌[Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503-2516; 및 Ferrie et al. (1992) Am. J. Hum. Genet. 51:251-262]를 참조한다. ARMS는, 소정 DNA 폴리머라제의 불응 성질에, 즉, 이러한 미스매치를 갖는 프라이머-표적 하이브리드를 신장시키지 않는 경향에 의존한다. ARMS는 접합구조(zygosity)(동형접합성 WT, 이형접합성, 또는 동형접합성 돌연변이체(MUT))를 결정하는데 유용한 것으로 입증되어 왔지만, 그 외에 사용시 약 1%(1,000,000개의 대안의 대립유전자 분자의 존재 하에 약 10,000개 이상의 표적 대립유전자 분자)의 실제적인 검출 한계를 갖는다.
다른 접근법은, 프라이머를 헤어핀으로 되도록 제조하여 이의 선택성을 증가시키는 것이다. 조사되는 서열에 대해 상보성이지만 다른 대립유전자 또는 대립유전자들에 대해 미스매치되는 헤어핀 루프의 제조를 개시한 문헌[Tyagi et al. 유럽 특허 EP 제1 185 546호(2008)]; 및 ARMS에서와 같이, 조사되는 서열 변이체에 대해 상보성이지만 다른 대립유전자 또는 대립유전자들에 대해 미스매치되는 헤어핀 프라이머의 3' 암(arm) 말단 뉴클레오티드의 제조를 개시한 문헌[Hazbon and Alland (2004) J. Clin. Microbiol. 42:1236-1242]를 참조한다. 이들 변형 또한 약 1%(1,000,000개의 대안의 대립유전자 분자의 존재 하에 약 10,000개 이상의 표적 대립유전자 분자)의 실제적인 검출 한계를 갖는다.
대한민국 서울 소재 씨젠 생명 과학 연구소(Seegene Institute of Life Science)의 전종윤(Jong-Yoon Chun) 및 그의 동료들은 이들이 "이중-프라이밍 올리고뉴클레오티드(DPO)"로서 칭하는 한 유형의 프라이머를 고안해냈다. 문헌[Chun et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35 (6) e40; Kim et al. (2008) J. Virol. Meth. 149:76-84; Horii et al. (2009) Lett. Appl. Microbiol. 49:46-52]; WO 제2006/095981 A1호; 및 WO 제2007/097582 A1호를 참조한다. DPO 프라이머는 3개의 절편으로 이루어진다: 길이가 예를 들면, 20 내지 25개의 뉴클레오티드인 긴 5' 고온 절편, 5개의 데옥시리보이노신의 중앙 분리 절편, 및 의도된 표적 서열에 대해 상보성이지만 다른 표적 서열들에 대해 미스매치되는, 일반적으로 8 내지 12개의 뉴클레오티드 길이의 3' 프라이밍 절편. 표적 서열은 모든 3개의 절편에 대해 상보성이지만, 3' 절편의 Tm은, 이의 보다 짧은 길이로 인해 5' 절편의 Tm보다 더 낮고, 분리 절편은 5개의 데옥시리보이노신으로 인해 가장 낮은 Tm을 갖는다. DPO 프라이머는, 5' 절편과 3' 절편 둘 다가 표적 가닥에 하이브리드화되는 경우에만 증폭이 초래되도록 설계된다. Chun et al.(2007)에 따르면, 분리 절편은 3 내지 4개 및 6 내지 8개의 데옥시리보이노신이 그다지 우수한 결과를 제공하지 않았기 때문에 5개의 데옥시리보이노신이 되도록 선택하였고; 3' 절편은 40 내지 80%의 GC 함량을 제공하도록 위치시켰으며, 5' 절편은, 이의 Tm을 3'-RACE 증폭에서 사용되는 어닐링 온도 초과로 상승시키기에 충분한 길이로 제공하였다(Nucleic Acids Res. 35(6) e40 at page 2). 문헌[Chun et al.]은 2쌍의 DPO 프라이머를 사용하여 CYP2C19 유전자에서 SNP(G→A 돌연변이)의 성공적인 유전형 분석(genotyping)(동형접합성 야생형, 이형접합성, 또는 동형접합성 돌연변이)을 보고한다. 4개의 DPO 프라이머 중, 하나의 프라이머는 둘 다의 대립유전자에 대해 완전히 상보성인 12-뉴클레오티드 길이의 3' 절편을 가졌고; 하나의 프라이머는, 둘 다의 대립유전자에 대해 완전히 상보성인 9-뉴클레오티드 길이의 3' 절편을 가졌으며; 2개의 프라이머는, 중앙에, 즉, 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드 위치에 놓인 가변성 뉴클레오티드를 갖는 8-뉴클레오티드 길이의 3' 절편을 갖는다. 유전형 분석은 겔 전기영동에 의해 성취되었다.
매우 풍부한 제2 대립유전자의 존재 하에 매우 희귀한 제1 대립유전자를 검출하는 것이 요망되는 상황이 존재한다. 이를 "민감도(sensitivity)"라 명명하였다. 다시 말하면, 프라이머는 "특이적"이어야 하고(게놈 내의 정확한 위치로 가야 하고) "선택적"이어야 할(표적 서열과 유사한 다른 풍부한 서열 또는 야생형 서열을 거부해야 할)뿐만 아니라 프라이머는, 풍부한 야생형 또는 다른 풍부한 제2 서열의 존재 하에 매우 적은 돌연변이체 또는 다른 희귀한 제1 서열을 검출하기에 충분하게 높은 선택성, 즉, "민감성"이어야 한다. 마카로프(Makarov) 및 추프레타(Chupreta)의 국제 특허 출원 WO 제2012/112 582 A2호의 단락 [0004]를 참조한다.
특이성과 선택성을 유지하면서 민감도를 증진시키기 위해, 스위프트 바이오사이언시스(Swift Biosciences)(미국 미시건주 앤 아버 소재)의 블라디미르 마카로프(Vladimir Makarov) 및 그의 동료들은, myT™ 프라이머로서 상용화된 "불연속 폴리뉴클레오티드 ["프라이머"] 디자인"(WO 제2012/112 582 A2호 단락 [0051])을 개시한다. 이러한 프라이머는, 2개의 올리고뉴클레오티드로 구성되어, 8-뉴클레오티드 3' 프라이밍 서열; 및 상기 서열의 5' 말단에 그리고 다른 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 추가의 상보성 테일(tail)을 생성하여 고온 스템(stem)을 형성하는 긴 통상의 프라이머로서 간주될 수 있다. 스템을 통해, 2개의 올리고뉴클레오티드가 비공유적으로 연결되고, 표적 서열에 결합시 안정한 3원 접합물(three-way junction)을 형성한다. 8-뉴클레오티드 3' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드를 "프라이머"로서 나타내고, 다른 올리고뉴클레오티드를 "픽서(fixer)"로서 나타낸다. 픽서의 기능은 특이성을 제공하는 것, 즉, 프라이머를 게놈 내의 의도된 위치에 결합시키는 것이다. 따라서, 이는 전형적으로 약 30-뉴클레오티드 길이이다. 테일의 기능은 2개의 올리고뉴클레오티드를 증폭 조건 하에 하이브리드화시키는 것이며, 따라서, 테일도 상당히 길고, 20 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 스템을 형성한다. 8-뉴클레오티드 3' 영역의 기능은, 선택성을 이용하여 프라이밍하는 것이다. 불연속 하이브리드화는 "프라이머 올리고뉴클레오티드의 [프라이밍] 영역 사이에서, 상기 영역이 8 염기와 같이 작은 경우라도, 안정된 결합을 가져오며, 이에 의해 PCR의 효율을 증가시킨다"(WO 제2012/112582 A2호). 추가의 개선은, WO 제2012/112582 A2호의 실시예 9 내지 11에 개시된다. ARMS에서와 같이, 야생형 표적에 대해 미스매치되는 뉴클레오티드를 3'-말단 뉴클레오티드로서 제조하고; 5'-말단 뉴클레오티드가 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 중첩되고 야생형 표적에 대해 상보성인 제3 올리고뉴클레오티드인 블로킹 올리고뉴클레오티드("블로커(blocker)")를 증폭 반응에 포함시키고; 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드를 잠금 핵산(locked nucleic acid)("LNA")으로서 제조한다. K-ras 및 B-raf 유전자에서의 단일-뉴클레오티드 다형의 검출에 대해, 14,000개의 야생형 중 하나의 돌연변이체(대략 0.01%)의 검출 민감도가 개시되었다.
희귀한 제1 표적 서열, 예를 들면, 돌연변이체 표적 서열을, 상기 제1 표적 서열과는 단일 뉴클레오티드와 같이 작은 차이를 갖는 매우 많은 수의 제2 표적 서열, 예를 들면, 야생형 서열의 존재 하에 검출하고 바람직하게는 그의 수를 정량화하는 능력을 갖는 단일-올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은, 희귀한 의도된 표적(예를 들면, 돌연변이체 DNA 표적)과 때대로 단일-뉴클레오티드 다형, 약칭하여 SNP라고 하는 단일-뉴클레오티드 치환에 의해 차이가 나는 이와 밀접하게 관련된 서열(예를 들면, 야생형 DNA 표적)을 구별할 수 있는, 특히, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함하는 프라이머-의존적 핵산 증폭 방법을 위한 다중-부분 프라이머(multi-part primer)를 포함한다.
본 발명은, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하고, 이와 밀접하게 관련된 풍부 서열의 집단 중에서 하나 이상의 희귀 표적 서열을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머-의존적 핵산 증폭 방법, 예를 들면, PCR 방법을 포함한다. 이러한 의도된 표적 서열은 희귀 돌연변이체 서열, 예를 들면, 악성 세포 내에서 발견되는 서열, 또는 정상 세포 내에서 발견되는 다른 풍부한 야생형 집단의 서열일 수 있다. DNA-의존적 DNA 폴리머라제를 사용하는 방법, 예를 들면, PCR 방법의 경우, 의도된 표적 및 관련 서열은 시료 중에서 발생하는 DNA 서열이거나, 이들은 시료 중에서 발생하는 mRNA 서열을 포함하는 RNA 서열로부터의 역 전사에 의해 제조되는 cDNA 서열이다. 역 전사는 후속적 증폭과 동일한 반응 혼합물 중에서 수행될 수 있거나, 이는 증폭 전에 별도로 수행될 수 있다. 다중-부분 프라이머는 역 전사 반응에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은, 증폭된 산물 또는 "앰플리콘"의 검출을 포함하는 증폭 및 검출 방법을 포함한다. 실시예를 포함하여 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 DNA 표적을 사용하여 출발되는 PCR 증폭 반응과 관련하여 다중-부분 프라이머를 기술한다. 당해 분야의 숙련가들은 이들 교시 내용을 다른 프라이머-의존적 핵산 증폭 방법과 관련하여 다중-부분 프라이머에 적용시키는 방법을 이해할 것이다.
본 발명은, 이러한 증폭 및 검출 방법을 포함하는, 이러한 증폭 방법을 수행하기 위한 시약들을 함유하는 시약 키트를 추가로 포함한다.
본 발명은, 특히, 매우 풍부한 정상 세포를 함유하는 임상 시료 중에서 (구별 체세포 돌연변이에 의해) 극히 희귀한 암 세포를 검출하기 위한 민감하고 특이적인 수단을 찾아내기 위한, 그리고, 이들의 존재비(abundance)를 정량적으로 측정할 수 있기 위한 분자 진단의 주요 목표를 다룬다. 하기를 포함하여, 이를 수행할 수 있는 여러 이점이 존재한다:
1. 치료 후(예를 들면, 백혈병 환자에서 골수 이식 후) 암 세포의 존재 및 존재비를 검출하는 능력. 본 발명을 사용하는 것은, 의사가 (상당히 독성인) 약물의 투여를 중단할 수 있을지를 결정하도록 할 수 있을 것이다. 본 발명은, 약물 치료 없이 신체에 의해 처리될 수 있는 최소한의 잔여 질환의 수준을 측정하기 위한 임상 연구를 수행할 수 있게 할 것이다. 또한, 환자는 치료 후 경시적으로 모니터링하여 더 높은 수준의 출현을 검출할 수 있으며, 이는 이후 적절한 수단에 의해 치료될 수 있다.
2. 수술 동안 시행되는 생검(biopsy)에서 (너무 낮은 수준이라 병리학자가 현미경으로 볼 수 없는 경우) 희귀 암 세포를 신속하게 검출하고 정량화하는 능력. 본 발명을 사용하는 것은, 외과의가 수술 정도를 합리적으로 결정하도록 할 수 있을 것이며, 이는 병에 걸리지 않은 조직의 제거를 피하게 한다.
3. 혈액 내의 희귀한 순환성 종양 세포의 자연적인 파괴 과정에 의해 혈장 내로 방출되는 DNA 분자 내의 핵심 돌연변이를 검출하는 능력. 본 발명을 사용하는 것은, 세포가 전이 능력을 획득한 종양의 조기 검출을 가능하게 할 것이며, 이는 의사에게 조기 개재의 기회를 제공한다.
4. (많은 유방암에서와 같이) 환자의 유전 형질(genetic inheritance)이, 생명을 위협하는 종양이 생존 기간 동안 발생할 수 있음을 시사하는 환자를 모니터링하는 능력. 본 발명을 사용하는 것은, 핵심 체세포 돌연변이가 발생하였는지를 측정하기 위한 주기적인 모니터링을 가능하게 할 것이며, 따라서, 질환의 매우 초기 단계에서 치료학적 개재가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 적용은 당해 분야의 숙련가에게 발견될 것이다.
"희귀한" 및 "풍부한"은, 의도된 표적 서열과 이에 밀접하게 관련된 서열의 비가 적어도 1/103 내지 1/107의 범위(즉, 천분의 일, 만분의 일, 십만분의 일, 백만분의 일, 또는 천만분의 일)인 것을 의미한다. "밀접하게 관련된"이란, 의도된 표적 서열과 1개, 2개 또는 최대 수개의 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 서열을 의미한다. 야생형 서열과 특정 위치에서 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 돌연변이체 표적 서열을 흔히 단일-뉴클레오티드 다형(SNP)이라고 하거나 SNP를 갖는다고 한다.
본 발명에 따른 방법은, 밀접하게 관련된 의도되지 않은 표적 서열(예를 들면, 야생형 DNA 표적 서열)을 풍부하게 함유하는 시료 또는 반응 혼합물 내에서 희귀하게 발생될 수 있는 하나 이상의 의도된 표적 서열(예를 들면, 돌연변이체 DNA 표적 서열)을 위한 프라이머-의존적 핵산 증폭을 포함한다. 이들 방법은, 각각의 희귀 표적에 대해 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 함유하는 반응 혼합물을 사용한다. 프라이머의 3개의 부분이 서로 협력하여 극도로 선택적인 증폭이 얻어진다. 도 1은, 본 발명에 따른 프라이머의 개략도이다. 도 1은, 2개의 도식을 포함하며: 상단의 도식은, PCR 주기의 어닐링 단계 동안 발생하는 것과 같은 하이브리드화 조건 하에 다중-부분 프라이머(103)를 이의 의도된 표적(101)(상기 표적은 희귀할 수 있음)과 관련하여 나타내고; 하단의 도식은, 동일 프라이머를 밀접하게 관련된 서열(본원에서는 의도되지 않거나 미스매치된 표적(102)으로서 나타냄)과 관련하여 나타낸 것이다. 의도된 표적(101) 및 의도되지 않은 표적(102)은, 의도된 표적(101)이, 미스매치된 표적(102)에서 상응하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들(이를 본원에서는 "y"로 표시함)과는 상이한 하나 이상의 뉴클레오티드 "x", 바람직하게는 단일 뉴클레오티드를 갖는 것을 제외하고는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 예를 들면, 의도되지 않은 표적 서열(102)은 야생형 사람 DNA 서열일 수 있고, 의도된 표적 서열(101)은, SNP를 함유하는 돌연변이체 암 세포 서열일 수 있다. 상단의 도식은, 의도된 표적 가닥(101)에 하이브리드화된 프라이머(103)를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로, 프라이머는 앵커 서열(anchor sequence)(104), 브릿지 서열(bridge sequence)(105) 및 풋 서열(foot sequence)(106)을 포함한다. 프라이머(103)는 추가 기능을 부여하기 위해 임의로 5' 테일(107)을 포함할 수 있다. 이는, 또한, 임의로 블로킹 그룹(108)을 포함한다. 증폭 시작시 프라이머 어닐링 동안, 앵커 서열(104)은, 통상적으로 앵커 서열과 (상보성 뉴클레오티드의 쌍을 이루는 것(pairing)을 나타내는) 이의 결합 부위 사이에 짧은 수직선으로 표시된 바와 같이 의도된 표적(101)에 하이브리드화된다. 브릿지 서열(105)은, 본 발명자들이 "개재 서열(intervening sequence)"로서 칭하는 서열(109)에서 표적(101)에 대해 미스매치되고(상보성이 아니고) 이중 구조에서 "버블(bubble)"을 야기한다. 풋 서열(106)은, 의도된 표적(101)에 하이브리드화되고 DNA 폴리머라제에 의한 카피를 프라이밍한다. 하단의 도식은, 의도되지 않은 미스매치된 표적(102)에 하이브리드화된 동일 프라이머(103)를 도시한다. 언급된 바와 같이, 미스매치된 표적(102)은, 의도된 표적(101)과는 프라이머 풋(106)의 반대편 서열 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변화(x에서 y)에 의해 차이가 난다. 증폭 시작시 프라이머 어닐링 동안, 앵커 서열(104)은, 도시된 바와 같이 앵커 서열 결합 부위에서 의도되지 않은 표적(102)에 하이브리드화된다. 또한, 브릿지 서열(105)은 개재 서열(109)에 대해 미스매치된다. 그러나, 풋 서열(106)은 표적(102)에 하이브리드화되지 않아, 표적(102)은 카피에 대해 프라이밍되지 않는다.
도 1에 따른 이상적인 증폭 반응에서, 의도된 표적(101)은 희귀하더라도 항상 카피될 것이고, 의도되지 않은 표적(102)은 풍부하더라도 카피되지 않을 것이다. 그러나, 프라이밍은 통계적인 사안이다. 예를 들면, 프라이머는 완전한 표적과 미스매치된 표적을 어느 정도의 빈도로 다가가거나 물러난다. 결과적으로, 완전한 표적이 항상 카피되는 것은 아니며, 미스매치된 표적이 때때로 카피된다. 따라서, 희귀 표적을 선택적으로 증폭시키고 검출하는 것은, 완전한 표적이 카피되는 빈도와 미스매치된 표적이 카피되는 빈도 둘 다에 의존한다. 본 발명에 유용한 다중-부분 프라이머는, 증폭-및-검출 검정을 포함하는 실제적인 증폭 반응에서 서로 협력하여 매우 높은 선택성을 달성하는 3개의 연속한 서열(앵커 서열, 브릿지 서열 및 풋 서열)을 갖는다. 앵커 서열은, 통상의 프라이머의 하이브리드화와 다르지 않은 효율적인 방식으로, 의도된 표적 및 의도되지 않은 미스매치된 표적에서 동일한(또는 거의 동일한) 표적 서열에 프라이머를 하이브리드화시키는 작용을 한다. 하기에서 더욱 완전하게 기술되는 브릿지 서열 및 풋 서열은, 프라이머 특이성, 즉, 미스매치된 표적보다 의도된 표적에 대한 선택성을 부여하도록 협력한다. 본 발명자들은, 브릿지 서열과 풋 서열이 협력하여 의도된 표적의 카피 가능성을 높이기 보다는 낮추는 경우 높은 정도의 선택성이 달성된다는 것을 발견하였다. 추가로, 본 발명자들은, 브릿지 서열을 극단적으로 그리고 효율적으로 카피가능하도록 제조한다. 브릿지 서열은 바람직하게는 DNA 서열이다. 의도된 표적 서열의 증폭은 시작시에는 지연되지만 일단 시작되면 정상적으로 진행되고; 반면에 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열의 증폭은 유의하게 더 많이 지연되지만 일단 시작되면 정상적으로 진행되는 결과가 달성된다. 매치된 표적과 비교하여 미스매치된 표적의 증가된 지연은, 프라이머에 의해 성취되는 선택성을 개선시킨다. DNA 폴리머라제에 의한 카피되는 의도되지 않은 표적 서열의 확률이, 의도된 표적 서열의 카피 확률보다 1,000배 이상, 바람직하게는 10,000배 이상 더 낮고, 더욱 바람직하게는 100,000배 이상 더 낮기 때문에 이러한 개선된 선택성이 성취된다.
도 1을 참조하면, 프라이머는, 증폭 반응의, 프라이머-어닐링 단계는 프라이머-어닐링 온도를 포함하는 프라이머-어닐링 단계 동안 프라이머를 의도된 표적 및 이와 밀접하게 관련된 표적 서열 내의 결합 부위에 하이브리드화시키는 앵커 서열(104)을 포함한다. 이와 관련하여, 앵커 서열은 통상의 프라이머와 유사하고, 통상의 프라이머와 유사하게 기능한다. 이는 표적에 그리고 이와 밀접하게 관련된 서열에 대해 완전히 상보성일 수 있거나, 이는 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 앵커 서열이 사용되는 증폭 반응에서, 이는 하이브리드화를 향상시키기 위해 일반적으로 어닐링 온도와 적어도 동일하거나 이를 초과하는 용융 온도 Tm을 갖는다. 대부분의 실시예에서, 앵커 서열의 Tm은 프라이머-어닐링 온도보다 3℃ 내지 10℃ 더 높다. 블로킹 그룹에 의해 방해되지 않는 정도로, 본 발명에서 사용되는 다중-부분 프라이머의 앵커 서열의 전부 또는 일부가 DNA 폴리머라제에 의해 카피된다. 높은 정상적인 PCR 효율로 지수적인 증폭이 빠르게 진행되기 때문에, 카피되는 부분 내에 비천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모사물 및 비-천연 뉴클레오티드간 연결기를 포함시키는 것은, DNA 폴리머라제에 의한 빠르고 효율적인 카피를 허용하는 유형 및 갯수로 제한된다. 본 발명자들은, 앵커 서열이 DNA 서열인 것을 선호한다.
앵커 서열(104)은 전형적으로 15 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 그리고 더욱 바람직하게는 20 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 프로브-표적 하이브리드를 형성한다. 더 짧은 앵커 서열은, 상기에 언급된 바와 같이 프라이머 어닐링 동안 이들의 표적 서열에 계속해서 하이브리드화되어야 하고, 이는, 종종 이들의 Tm이 50℃ 이상(예를 들면, 66 내지 72℃)이어야 한다는 것을 의미한다. 이는 표적에 대해 완전히 상보성일 수 있거나, 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있고; 예를 들면, 앵커에 대비되는 서열이 가변성인 표적을 조사할 경우, 임의의 버젼의 표적에 대해 완전히 상보성인 것은 아니지만 프라이머 어닐링 동안 모든 변이체에 하이브리드화되는 컨센서스(consensus) 서열인 앵커 서열(104)을 선택할 수 있다. 본 발명자들은, 일반적으로 15 내지 30 염기 쌍에서 앵커-서열/표적 하이브리드를 형성하는 DNA 앵커 서열을 선호하고, 이는 통상적인 PCR 프라이머에서 전형적인 바와 같다. 본 발명자들은, 하기 실시예에서 DNA이고 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 24-뉴클레오티드 길이의 앵커 서열을 설명한다. 다중-부분 프라이머는 이의 표적 서열, 즉, 의도된 표적 서열 및 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열 외에는 반응 혼합물 내의 서열을 프라이밍하지 않는다. 통상의 프라이머는, 그러한 기능을 달성하도록 설계되어야 하는 반면 앵커 서열에 대한 요건은 덜 엄격하고, 그 이유는, 풋 서열이, 시료 중에 존재하거나 또는 존재할 수 있는 다른 서열들을 구별하는 것을 도와주기 때문이다.
도 1을 참조하면, 프라이머는, 뉴클레오티드(SNP 뉴클레오티드), 또는 일부 경우 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 영역 내에, 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열과 상이한 의도된 표적 서열에 대해 상보성인 풋 서열(106)을 포함한다. 풋 서열은, 의도된 표적 서열에 대해 완전히 상보성일 수 있거나, 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 둘 다에 대해 미스매치되는 하나, 또는 일부 경우 심지어 2개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 풋 서열(106)은 항상 미스매치된 표적 서열보다는 의도된 표적 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 더 상보성이다. 풋 서열은 증폭 동안 카피된다. 높은 정상적인 PCR 효율로 지수적인 증폭이 빠르게 진행되기 때문에, 비-천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모사물, 및 비-천연 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 것은, DNA 폴리머라제에 의한 빠르고 효율적인 카피를 허용하는 유형 및 수에 제한된다. 본 발명자들은, 풋 서열이 DNA 서열인 것을 선호한다. 높은 정상적인 PCR 효율로 앰플리콘의 후속의 지수적인 증폭이 진행되는 것이 바람직하기 때문에, 풋 서열 내에 비-천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모사물, 및 비-천연 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 것은, DNA 폴리머라제에 의한 효율적인 카피를 허용하는 유형 및 수에 제한된다. 바람직한 실시형태에서, 풋 서열은, 의도된 표적 서열에 대해 완전히 상보성이고 의도되지 않은 표적 서열 내 뉴클레오티드에 대해 미스매치되는 단일 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 서열이다.
풋 서열(106)은, 5개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들면, 5 내지 8 염기 쌍 범위, 바람직하게는 6 내지 8 염기 쌍 범위, 그리고 더욱 바람직하게는 7개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들면, 6 내지 7 염기 쌍 범위의 길이인 의도된 표적 서열과의 하이브리드를 형성한다. 앵커 서열이, 의도된 표적 서열에 하이브리드화될 때, 풋 서열에 대한 단 하나의 결합 부위가 존재한다. 풋 서열이 단축됨에 따라, 이것이 다른 가능한 결합 부위를 가질 수 있는 기회가 증가되고, 특히, 풋 서열이 단지 5개의 뉴클레오티드로 단축되는 경우, 프라이머 설계에서 고려되어야 할 사안이다. 본 발명자들이 실시예에서 설명한 바와 같이, 의도되지 않은 표적에 대한 미스매치된 뉴클레오티드는 풋(106)의 임의의 뉴클레오티드 위치에 존재할 수 있지만, 본 발명자들은, 미스매치된 뉴클레오티드가 ARMS 프라이머(Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503-2516; 및 Ferrie et al. (1992) Am. J. Hum. Genet. 51:251-262)에서와 같이 3' 말단 뉴클레오티드이거나, 또는 풋의 3' 말단으로부터 하나의 뉴클레오티드 만큼 떨어진 위치(이를 본 발명자들은 때때로 "3'에서 두 번째의 뉴클레오티드"라고 칭함)"에 존재하는 것을 선호한다.
또한, 도 1을 참조하면, 프라이머는, 다중-부분 프라이머의 표적 분자에의 어닐링 동안 개재 서열(109)과 하이브리드화될 수 없도록 선택되는 브릿지 서열(105)을 포함한다. 브릿지 서열, 또는 브릿지 서열이 블로킹 그룹을 함유하는 경우에는 이의 3' 부분은 DNA 폴리머라제에 의해 카피된다. 높은 정상적인 PCR 효율로 앰플리콘의 지수적인 증폭이 빠르게 진행되는 것이 요망되기 때문에, 브릿지 서열의 카피되는 부분 내에 비천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모사물, 및 비천연 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 것은, DNA 폴리머라제에 의한 빠르고 효율적인 카피를 허용하는 유형 및 수에 제한된다. DNA인 브릿지 서열이 바람직하다.
브릿지 서열(105) 및 이의 반대편의 표적 내의 개재 서열(109)은 프라이머/의도된 표적 하이브리드 내에 버블을 형성한다. 버블의 원주는 브릿지 서열(105)의 길이 + 개재 서열(109)의 길이 + 4(앵커-서열 하이브리드로부터의 한 쌍의 뉴클레오티드 및 풋-서열 하이브리드로부터의 한 쌍의 뉴클레오티드)이다. 브릿지 서열과 개재 서열은 동일 길이일 필요는 없으며, 어느 하나의 서열이 다른 서열보다 더 짧을 수 있다. 소정 실시형태에서, 개재 서열의 길이는 0일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이는 6개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 브릿지 서열과 개재 서열의 길이의 합이 24개 이상의 뉴클레오티드인 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 발명자들은, 개재 서열이 8개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것을 선호한다. 브릿지 서열은 6개 이상의 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 바람직한 소정 실시형태는, 동인 길이의 브릿지 서열과 개재 서열을 갖는다. 버블의 원주는 16개의 뉴클레오티드와 같이 짧고 52개의 뉴클레오티드와 같이 길 수 있으며, 예를 들면, 16 내지 52개의 뉴클레오티드, 20 내지 52개의 뉴클레오티드, 또는 28 내지 44개의 뉴클레오티드일 수 있다.
다중-부분 프라이머의 설계를 위한 일반적인 고려사항으로서, 버블의 원주의 증가 및 풋의 단축은, 의도된 표적의 증폭에서 지연을 증가시킨다. 특정 수의 의도된 표적 서열을 사용해 개시되는 반응에서 소정의 검출가능한 수의 앰플리콘을 합성하는 데 필요한 PCR 주기의 수(해당 반응에 대한 역치 주기, CT)는, 예를 들면, 삽입(intercalating) 염료 SYBR® Green의 형광 강도가, 각각의 PCR 주기 동안 존재하는 앰플리콘의 수를 반영하는 상기 삽입 염료 SYBR® Green의 형광 강도를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 이는, DNA 폴리머라제가 다중-부분 프라이머/의도되지 않은-표적 하이브리드를 신장시키는 확률과 DNA 폴리머라제가 다중-부분 프라이머/의도된 표적 하이브리드를 신장시키는 확률의 차이를 측정하는 방법을 제공한다. 증폭이 지수적인 2배가에 의해 진행된다면, 10 주기의 CT 차이는, 다중-부분 프라이머/의도되지 않은 표적 하이브리드의 신장의 확률이, 다중-부분 프라이머/의도된 표적 하이브리드의 신장 확률보다 1,000배 더 낮다는 것을 나타내고; 13.3 주기의 CT 차이는, 확률이 10,000배 더 낮다는 것을 나타내며; 약 16.6 주기의 CT 차이는, 확률이 100,000배 더 낮다는 것을 나타내고; 20 주기의 CT 차이는, 확률이 백만배 더 낮다는 것을 나타낸다.
다중-부분 프라이머를 사용하는 본 발명에 따른 검정에 있어서, SYBR® Green 염료를 반응 혼합물에 첨가함으로써 달성되는 각각의 PCR 주기에서의 형광 강도의 측정으로부터의 ΔCT로 반영되는 바와 같이, 미스매치된 표적 서열에 대해 관찰되는 더 높은 역치 주기와, 동일한 수, 예를 들면, 106개의 카피의 의도된 표적 서열에 대해 관찰되는 더 낮은 역치 주기 사이의 차이는, 10 주기 이상, 바람직하게는 12 주기 이상, 더욱 바람직하게는 14 주기 이상, 더욱 더 바람직하게는 17 주기 이상, 특히 더 바람직하게는 18 주기 이상, 그리고 가장 바람직하게는 20 주기 또는 그 이상이어야 한다. 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머가, 잘-설계된 통상적인 PCR 프라이머를 대체한 증폭 반응에서는, 의도된 표적 서열을 사용하여 달성되는 역치 주기에서 지연(ΔCT)이 존재한다. 지연의 양은, 비교되는 통상의 프라이머가 얼마나 잘 설계되었는지에 좌우되지만, 전형적으로는 오로지 다중-부분 프라이머의 앵커 서열로 이루어진 통상의 프라이머와 비교해 지연은 적어도 2 증폭 주기, 종종 적어도 3 주기, 그리고 때때로 적어도 8 주기, 또는 심지어 10 주기이다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시형태는, 희귀 표적 서열의 증폭으로부터 초래되는 산물을 검출하는 것을 포함한다. 증폭된 산물의 검출은, 증폭 후, 예를 들면, 겔 전기영동에 의해 별도로 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 증폭 반응 혼합물에 검출 시약이 포함되며, 이 경우 검출은 "실시간(real time)", 즉, 증폭 과정 동안 여러 차례 수행될 수 있거나, 또는 "종말점(end point)", 즉, 증폭 반응 종료 후 수행될 수 있으며, 이는 바람직하게는 반응 컨테이너를 열지 않고 균일 검출에 의해 수행될 수 있다. 검출 시약에는 DNA 결합 염료, 예를 들면, SYBR® Green, 증폭된 산물의 생성을 신호전달하는 이중-표지된 형광 프로브, 예를 들면, 분자 비콘 프로브, 및 결합 염료와 상기 염료로부터의 방출에 의해 자극되는 형광 프로브의 조합물이 포함된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 프라이머 자체는, 프라이머가 앰플리콘 내에 혼입될 때 또는 대안으로 프라이머가 상보성 앰플리콘에 결합할 때 유일하게 형광을 내는 형광 표지를 포함할 수 있다.
본 발명은, 하나 이상의 표적 서열의 증폭을 위한 반응 혼합물을 포함한다. 반응 혼합물은, 각각의 의도된 표적 서열에 대해 한 쌍의 프라이머를 포함하며, 각각의 쌍 중 하나의 프라이머는, 본원에 기술된 바와 같은 다중-부분 프라이머이다. 또한, 반응 혼합물은 표적의 증폭을 위한 시약을 포함하며, 상기 시약으로는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 증폭 완충액, 및 DNA 폴리머라제가 포함된다. 본 발명에 따른 검정 방법을 위한 바람직한 반응 혼합물은, 또한, 검출 시약, 즉, DNA 결합 염료, 하이브리드화 프로브(또는 상기 염료와 상기 프로브 둘 다), 또는 각각의 다중-부분 프라이머의 5' 기능성 테일을 포함한다. 출발 시료가 RNA를 함유하는 경우, 증폭 반응 혼합물은, 또한, 역 전사 효소 및 역 전사를 위한 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 의도된 표적 서열에 대해 상기에 기술된 증폭 반응 및 증폭-및-검출 반응을 수행하기 위한 키트 제품을 포함한다. 키트는, 본 발명에 따른 반응 혼합물을 생성하는데 필요한 올리고뉴클레오티드 및 시약을 포함한다. RNA인 출발 시료를 위한 키트는 역 전사를 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세 설명이 아래의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점은, 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은, 다중-부분 프라이머의 의도된 표적 서열에 하이브리드화되고 상기 의도된 표적 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드 치환에 의해 차이가 나는 미스매치된 서열에 하이브리드화되는, 본 발명에서 유용한 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
도 2는, 우선 본 발명의 다중-부분 프라이머가 카피되고, 그 결과로 생긴 앰플리콘의 후속적인 카피가 다음 2개의 주기에서 수행되는, 증폭 주기의 개략도이다.
도 3은, DNA 폴리머라제에 의한 카피를 종결시키는 블로킹 그룹의 배치를 위한 위치를 나타내는, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
도 4는, 몇몇의 예시적인 임의의 5' 기능성 모이어티의 개략도이다.
도 5는, 통상적인 선형 프라이머 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 1,000,000개의 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내고, 상기 서열들은, 프라이머가 결합하는 서열의 중앙에 위치하는 단일 뉴클레오티드에서 서로 상이하다.
도 6은, ARMS 프라이머, 및 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 1,000,000개의 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내고, 여기서, 프라이머 내의 "심문성 뉴클레오티드(interrogating nucleotide)"(이는, 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이지만 의도되지 않은 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해서는 상보성이 아니다)는 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드이고; 또한, 당해 도면은, 심문성 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 뉴클레오티드에 존재하는 유사한 프라이머를 사용하여 얻어진 결과도 나타낸다.
도 7은, 프라이머의 1,000,000개의 의도된 표적 서열 분자 또는 프라이머의 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 분자를 함유하는 반응물에서 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다(여기서, 다중-부분 프라이머는 풋 서열의 끝에서 두 번째의 위치에 심문성 뉴클레오티드를 가졌다).
도 8은, 각각 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 및 0; 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 또는 1,000,000개의 의도된 표적 서열을 함유하는 일련의 반응물에서 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다.
도 9는, 도 8에 나타낸 각각의 반응물에 대해 관찰된 역치 주기와 각각의 반응물 중에 존재하는 의도된 표적 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이고, 당해 도면에서 점선은, 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 함유하고 의도된 표적 서열은 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 10은, 다중-부분 프라이머의 풋이 6, 7 또는 8개의 뉴클레오티드 길이이고 그 외에는 동일한 3개의 다중-부분 프라이머를 사용하여, 도 8 및 도 9에 나타낸 실험에 사용된 것과 동일한 일련의 희석물로부터 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다(여기서, 심문성 뉴클레오티드는 각각의 풋 서열의 끝에서 두 번째 위치에 위치하였다).
도 11은, 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열들이, 표적 분자 내의 동일-길이의 개재 서열과 상이한 원주의 버블을 형성하는 3개의 다중-부분 프라이머를 사용하여, 도 8, 도 9 및 도 10에 나타낸 실험에 사용된 것과 동일한 일련의 희석물로부터 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 프라이머의 풋 내의 심문성 뉴클레오타이드(이는, 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이지만, 의도되지 않은 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해서는 상보성이 아니다)가 프라이머의 3' 말단에 대해 상이한 위치들에 위치하는 그 외에는 동일한 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 (상기 의도된 표적 서열과는 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 차이가 나는) 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 13은, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머, 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내는 일련의 그래프이고, 여기서, 브릿지 서열의 길이 + 표적 분자 내의 개재 서열의 길이는 일정하게 유지되지만(즉, 버블의 원주는 동일하지만), 브릿지 서열과 표적 분자 내의 개재 서열에 의해 형성되는 버블의 대칭성(이들 서열의 상대적 길이)은 가변적이다.
도 14는, 각각 1,000,000개의 야생형 사람 B-raf 표적 서열, 및 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 또는 1,000,000개의 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열을 함유한 일련의 반응물에서 관찰된 역치 주기와 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이다. 점선은, 1,000,000개의 야생형 사람 B-raf 표적 서열로부터의 DNA를 함유하고 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열로부터의 DNA는 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 15는, 각각 배양된 정상 사람 세포로부터 단리된 게놈 DNA 중에 존재하는 10,000개의 야생형 표적 서열, 및 EGFR 유전자 내의 T790M 돌연변이를 갖는 배양된 사람 암 세포로부터 단리된 게놈 DNA 중에 존재하는 10; 30; 100; 300; 1,000; 3,000; 또는 10,000개의 돌연변이체 표적 서열을 함유한 일련의 반응물에서 관찰된 역치 주기와 상기 반응물 중에 존재하는 돌연변이체 표적 서열 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이다. 점선은, 10,000개의 야생형 표적 서열을 함유하고 암 세포로부터의 DNA는 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 16은, 바이오-래드(Bio-Rad) IQ5 분광형광계 열 주기 장치 대신에 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치를 사용하여 실험을 수행한 것을 제외하고는 실험의 결과가 도 9에 나타내어진 실험과 유사한 실험의 결과를 나타낸다.
도 17은, 프라이머의 1,000,000개의 의도된 표적 서열 분자 또는 프라이머의 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 분자를 함유하는 반응물에서, 패널 A의 경우 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머(상기 다중-부분 프라이머는 풋 서열의 끝에서 두 번째 위치에 심문성 뉴클레오티드를 갖는다)를 사용하여, 그리고, 패널 B의 경우 3'으로부터 두 번째 뉴클레오티드와 3'-말단 뉴클레오티드가 소실된 절단된 버젼의 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다.
도 18은, 2개의 밀접하게 관련된 의도된 표적 서열을 위한 복합 반응에서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 2개의 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
도 19는, 2개의 밀접하게 관련된 의도된 표적 서열을 위한 복합 반응에서 사용될 수 있는 2개의 다중-부분 프라이머 및 2개의 분자 비콘 프로브의 개략도이다.
도 2는, 우선 본 발명의 다중-부분 프라이머가 카피되고, 그 결과로 생긴 앰플리콘의 후속적인 카피가 다음 2개의 주기에서 수행되는, 증폭 주기의 개략도이다.
도 3은, DNA 폴리머라제에 의한 카피를 종결시키는 블로킹 그룹의 배치를 위한 위치를 나타내는, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
도 4는, 몇몇의 예시적인 임의의 5' 기능성 모이어티의 개략도이다.
도 5는, 통상적인 선형 프라이머 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 1,000,000개의 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내고, 상기 서열들은, 프라이머가 결합하는 서열의 중앙에 위치하는 단일 뉴클레오티드에서 서로 상이하다.
도 6은, ARMS 프라이머, 및 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 1,000,000개의 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내고, 여기서, 프라이머 내의 "심문성 뉴클레오티드(interrogating nucleotide)"(이는, 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이지만 의도되지 않은 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해서는 상보성이 아니다)는 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드이고; 또한, 당해 도면은, 심문성 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 뉴클레오티드에 존재하는 유사한 프라이머를 사용하여 얻어진 결과도 나타낸다.
도 7은, 프라이머의 1,000,000개의 의도된 표적 서열 분자 또는 프라이머의 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 분자를 함유하는 반응물에서 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다(여기서, 다중-부분 프라이머는 풋 서열의 끝에서 두 번째의 위치에 심문성 뉴클레오티드를 가졌다).
도 8은, 각각 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 및 0; 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 또는 1,000,000개의 의도된 표적 서열을 함유하는 일련의 반응물에서 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다.
도 9는, 도 8에 나타낸 각각의 반응물에 대해 관찰된 역치 주기와 각각의 반응물 중에 존재하는 의도된 표적 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이고, 당해 도면에서 점선은, 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 함유하고 의도된 표적 서열은 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 10은, 다중-부분 프라이머의 풋이 6, 7 또는 8개의 뉴클레오티드 길이이고 그 외에는 동일한 3개의 다중-부분 프라이머를 사용하여, 도 8 및 도 9에 나타낸 실험에 사용된 것과 동일한 일련의 희석물로부터 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다(여기서, 심문성 뉴클레오티드는 각각의 풋 서열의 끝에서 두 번째 위치에 위치하였다).
도 11은, 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열들이, 표적 분자 내의 동일-길이의 개재 서열과 상이한 원주의 버블을 형성하는 3개의 다중-부분 프라이머를 사용하여, 도 8, 도 9 및 도 10에 나타낸 실험에 사용된 것과 동일한 일련의 희석물로부터 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 프라이머의 풋 내의 심문성 뉴클레오타이드(이는, 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이지만, 의도되지 않은 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해서는 상보성이 아니다)가 프라이머의 3' 말단에 대해 상이한 위치들에 위치하는 그 외에는 동일한 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 (상기 의도된 표적 서열과는 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 차이가 나는) 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 13은, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머, 및 1,000,000개의 의도된 표적 서열 또는 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열을 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타내는 일련의 그래프이고, 여기서, 브릿지 서열의 길이 + 표적 분자 내의 개재 서열의 길이는 일정하게 유지되지만(즉, 버블의 원주는 동일하지만), 브릿지 서열과 표적 분자 내의 개재 서열에 의해 형성되는 버블의 대칭성(이들 서열의 상대적 길이)은 가변적이다.
도 14는, 각각 1,000,000개의 야생형 사람 B-raf 표적 서열, 및 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 또는 1,000,000개의 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열을 함유한 일련의 반응물에서 관찰된 역치 주기와 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이다. 점선은, 1,000,000개의 야생형 사람 B-raf 표적 서열로부터의 DNA를 함유하고 V600E 돌연변이체 사람 B-raf 표적 서열로부터의 DNA는 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 15는, 각각 배양된 정상 사람 세포로부터 단리된 게놈 DNA 중에 존재하는 10,000개의 야생형 표적 서열, 및 EGFR 유전자 내의 T790M 돌연변이를 갖는 배양된 사람 암 세포로부터 단리된 게놈 DNA 중에 존재하는 10; 30; 100; 300; 1,000; 3,000; 또는 10,000개의 돌연변이체 표적 서열을 함유한 일련의 반응물에서 관찰된 역치 주기와 상기 반응물 중에 존재하는 돌연변이체 표적 서열 수의 대수 사이의 역 선형 관계를 나타내는 그래프이다. 점선은, 10,000개의 야생형 표적 서열을 함유하고 암 세포로부터의 DNA는 함유하지 않은 반응물에 대해 얻어진 역치 주기를 나타낸다.
도 16은, 바이오-래드(Bio-Rad) IQ5 분광형광계 열 주기 장치 대신에 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치를 사용하여 실험을 수행한 것을 제외하고는 실험의 결과가 도 9에 나타내어진 실험과 유사한 실험의 결과를 나타낸다.
도 17은, 프라이머의 1,000,000개의 의도된 표적 서열 분자 또는 프라이머의 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열 분자를 함유하는 반응물에서, 패널 A의 경우 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머(상기 다중-부분 프라이머는 풋 서열의 끝에서 두 번째 위치에 심문성 뉴클레오티드를 갖는다)를 사용하여, 그리고, 패널 B의 경우 3'으로부터 두 번째 뉴클레오티드와 3'-말단 뉴클레오티드가 소실된 절단된 버젼의 프라이머를 사용하여 얻어진 실시간 형광성 결과를 나타낸다.
도 18은, 2개의 밀접하게 관련된 의도된 표적 서열을 위한 복합 반응에서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 2개의 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
도 19는, 2개의 밀접하게 관련된 의도된 표적 서열을 위한 복합 반응에서 사용될 수 있는 2개의 다중-부분 프라이머 및 2개의 분자 비콘 프로브의 개략도이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 프라이머-의존적 증폭 반응을 위한 다중-부분 프라이머의 독특한 설계에 기초한다. 따라서, 본 발명은, 본래 시료 내에 존재하는 주형에 하이브리드화될 때 놀라운 선택성을 나타내는 다중-부분 프라이머의 설계 및 특성을 개시한다. 이러한 놀라운 선택성으로 인해, 본 발명자들은, 본 발명의 다중-부분 프라이머를 "초선택적(SuperSelective)" 프라이머라고 칭한다.
유의하게, 일단 돌연변이체 주형 상에서 합성이 개시되면, 그 결과로 얻어지는 앰플리콘은 높은 효율로 지수적으로 증폭되며, 실시간 데이터는, 원시료 중에 존재하는 돌연변이체 주형의 존재비를 평가하는 통상의 수단을 제공한다. 아래에 기재된 실험은, 초선택적 프라이머가, 1,000,000개의 야생형 서열 분자를 함유하는 시료 내에서 10개와 같이 적은 돌연변이체 서열 분자를 신뢰성 있게 검출할 수 있는 정도로 충분히 구별력이 있어 심지어 돌연변이체와 야생형 사이의 유일한 차이가 단일-뉴클레오티드 다형일 때에도 야생형 서열의 합성을 억제시킨다는 것을 입증한다.
1. 프라이머-의존적 증폭 반응
본 발명의 방법에 유용한 프라이머-의존적 증폭 반응은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 대칭 또는 비대칭 리가제 연쇄 반응(LCR), 절단(nicking) 효소 증폭 반응(NEAR), 가닥-대체 증폭(SDA), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 전사-매개된 증폭(TMA) 및 회전 환 증폭(RCA)을 포함하는 임의의 적합한 지수적 증폭 방법일 수 있다. 바람직한 방법은 PCR을 이용한다. 비대칭 PCR 증폭 방법, 예를 들면, 비대칭 PCR에서는, 하나의 프라이머인 제한 프라이머가, 증폭 완료 전에 고갈되도록 제한적인 양으로 존재하고, 그 후 남아있는 프라이머인 과잉 프라이머를 사용하여 선형 증폭을 일으킨다. 본 발명에 유용한 비대칭 PCR 방법은 LATE-PCR(예를 들면, 유럽 특허 EP 제1,468,114호; 및 문헌[Pierce et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8609-8614] 참조)이다. 비대칭 증폭 방법을 사용하는 경우, 다중-부분 프라이머는 바람직하게는 과잉 프라이머이다. 바람직한 방법으로는 디지털 PCR(예를 들면, 문헌[Vogelstein and Kinzler (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9236-9241] 참조)도 포함되며, 상기 방법에서는 풍부한 야생형 분자를 함유하는 반응물 중에 존재하는 단일 돌연변이체 주형 분자로부터 다수의 앰플리콘을 검출하는 것이 바람직하다.
증폭 반응이 RNA-의존적 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우(예시는 NASBA임), 증폭 반응은 등온성이다. 본 발명자들은, 증폭 산물 합성의 반복되는 라운드를 "주기(cycle)"라 칭하지만, 이들은 열 주기는 아니다. 이러한 증폭의 경우, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머에 의해 프라이밍되는 "의도된 표적 서열" 및 "의도되지 않은 표적 서열"은, 원시료 중에 그리고 증폭 반응 혼합물 중에 존재하는 RNA 서열이고, 여기서, 이들은 DNA 폴리머라제 및 다중-부분 프라이머와 함께 존재한다.
증폭 반응이 DNA-의존적 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우(예시는 PCR임), 원시료는 DNA 또는 RNA 표적을 함유할 수 있다. 이러한 증폭의 경우, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머에 의해 프라이밍되는 "의도된 표적 서열" 및 "의도되지 않은 표적 서열"은, 원시료 중에 존재하거나 또는 원시료 중에 존재하는 RNA 서열의 역 전사에 의해 제조되는 DNA 서열이다. 다중-부분 프라이머가 역 전사에 사용되는 경우, "의도된 표적 서열" 및 "의도되지 않은 표적 서열"은 RNA뿐만 아니라 cDNA이다. 별도의 외부적인 프라이머가 역 전사에 사용되는 경우, "의도된 표적 서열" 및 "의도되지 않은 표적 서열"은 cDNA이다. 어느 경우에도, "의도된 표적 서열" 및 "의도되지 않은 표적 서열"은, DNA 폴리머라제 및 다중-부분 프라이머와 함께 증폭 반응 혼합물 중에 존재하는 핵산 서열이다. 프라이머-의존적 증폭 반응은 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 가닥 변성(가닥 융해)의 반복적인 열 주기를 포함한다. 프라이머 어닐링을 프라이머-신장 온도 미만의 온도에서 수행할 수 있거나(예를 들면, 3-온도 PCR) 또는 프라이머 어닐링과 프라이머 신장을 동일 온도에서 수행할 수 있다(예를 들면, 2-온도 PCR). 반응의 전체적인 열 프로파일은 특정 주기의 반복을 포함할 수 있거나 또는 온도/시간이 하나 이상의 주기 동안 변할 수 있다. 예를 들면, 일단 증폭이 시작되고 다중-부분 프라이머의 프라이밍 서열이 길어지면, 보다 긴 프라이머에 적합한 더 높은 어닐링 온도를 사용하여 증폭 반응을 완료할 수도 있다.
본 발명에 따른 검정 방법은, 증폭된 표적 서열의 검출을 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 특정 검출 계획에 제한되지 않는다. 검출은 겔 전기영동에 의해서와 같이 수행될 수 있다. 대안으로, 단일 튜브, 웰 또는 다른 반응 용기 내에서 증폭 동안 존재하는 시약을 사용하여 증폭 반응 동안에 (실시간) 또는 증폭 반응 종료시에(종말점) 균일 검출을 수행할 수 있다. 대안으로, 미세유체 장치를 사용하여, 증폭된 산물을 챔버로 이동시킬 수 있고, 여기서, 이들은 하나 이상의 검출 시약 또는 단리 시약, 예를 들면, 고정된 포획 프로브와 접촉된다. 검출 시약으로는 이중-가닥 DNA 결합 염료, 예를 들면, SYBR Green, 및 하이브리드화시 신호를 발생시키는 형광 또는 발광 표지된 하이브리드화 프로브, 예를 들면, 분자 비콘 프로브 또는 ResonSense® 프로브, 또는 증폭 동안 개열되는 프로브, 예를 들면, 5'-뉴클레아제(TaqMan®) 프로브가 포함된다.
2. 다중-부분 프라이머
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 각각의 희귀 표적 서열에 대한 다중-부분 프라이머의 사용을 포함한다. 다중-부분 프라이머를 사용한 증폭은 도 2에서 프라이머(103) 및 의도된 표적 서열(101)(도 1)에 대해 예시된다. 우선, 전방향 프라이머로서 나타낸 프라이머(103)가 표적 서열(101)에 어닐링되고, 가닥(101)을 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장되어 신장 산물(201)을 생성한다. 가운데 도면을 참조하면, 다음 증폭 주기에서는 프라이머(103) 및 신장 산물(201)을 포함하는 가닥(202)이 역방향 프라이머인 통상의 프라이머(203)에 대한 주형이 된다. 역방향 프라이머(203)가 어닐링되고 가닥(202)을 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장되어 신장 산물(204)을 생성한다. 신장 산물(204)은, 프라이머(103)에 대해 완전히 상보성인 서열을 포함하는 것이 관찰될 것이다. 신장 산물(204)은, 이러한 완전히 상보성인 서열을 가닥(101)의 서열과는 상관 없이 포함한다. 즉, 선행 주기에서 프라이머(103)가 신장된 경우(상단 그림), 그 결과로 생긴 가닥(202)(가운데 그림)은 항상 프라이머(103)의 완전한 상보물을 포함한다. 다음 증폭 주기(하단 그림)에서, 역방향 프라이머(203) 및 신장 산물(204)을 포함하는 가닥(205)은 프라이머(103)의 완전한 상보물을 함유하고; 프라이머(103)가 가닥(205)에 결합하고 DNA 폴리머라제에 의해 신장되어 신장 산물(206)을 생성한다. 따라서, 도 2는, 의도된 표적 서열(101)뿐만 아니라 미스매치된 표적 서열(102)에도 적용되며, 어느 때든 다중-부분 프라이머가 어닐링되고 신장되어 앰플리콘(202)을 생성한다.
앞의 단락에서 나타낸 바와 같이, 도 2는, 역방향 프라이머(203)의 신장 동안 프라이머(103) 전체가 카피되는 것을 보여준다. 이는 다음 주기를 위한 긴 프라이밍 영역, 즉, 앵커 서열(104), 브릿지 서열(105) 및 풋 서열(106)에 대해 상보성인 서열을 생성한다. 소정 실시형태에서, 나머지 증폭을 이러한 길이의 프라이밍 영역을 사용해 진행하는 것이 바람직하지 않을 수 있다. 도 3은, 후속 주기에서 프라이밍 영역을 단축시키도록 블로킹 그룹을 갖는 다중-부분 프라이머의 사용을 예시한다. 블로킹 그룹은, DNA 폴리머라제에 의한 신장을 중단시키기 위한 것으로 익히 공지되어 있다. 블로킹 그룹은, 예를 들면, 헥사에틸렌 글리콜(HEG)일 수 있다. 특히 브릿지 서열(105)이 긴 경우에는 도 3의 상단 도면에 도시된 바와 같이 블로킹 그룹(108)을 브릿지 서열(105) 내에 위치시키는 것이 바람직할 수 있다. 후속 증폭 주기에서 프라이밍 영역은, 블로킹 그룹(108)의 3'에 위치하는 브릿지(105)의 뉴클레오티드 + 풋(106)의 뉴클레오티드로 이루어질 것이다. 대안으로, 도 3의 하단 도면에 도시된 바와 같이 블로킹 그룹(108A)을 앵커 서열(104) 내에 위치시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 후속 증폭 주기에서 프라이밍 영역은, 블로킹 그룹(108A)의 3'에 위치하는 앵커(104)의 뉴클레오티드 + 브릿지(105)의 뉴클레오티드 + 풋(106)의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 다중-부분 프라이머는, 앵커 서열(104)에 부착된 기능성 모이어티, 5' 테일을 포함할 수 있다. 본 발명은, 이러한 그룹이 수행하는 기능에 관하여 또는 이의 구조에 관하여 제한되지 않는다. 여러 기능성 모이어티의 예가 도 4에 예시된다. 각각의 도면은 앵커 서열(104) 및 상기 앵커 서열의 5' 말단에 위치하는 상이한 기능성 그룹을 갖는 다중-부분 프라이머(103)를 나타낸다. 기능성 그룹(401)은 단순히 올리고뉴클레오티드 테일이며, 이는 포획 프로브에의 하이브리드화 또는 표지된 프로브에의 하이브리드화에 사용될 수 있다. 테일(401)은, 도시된 바와 같이, 프라이머(103) 내의 다른 서열에 대해 상보성이 아니다. 상보성 앰플리콘이 단일 가닥이든 이중 가닥이든 상관 없이, 테일(401)을 함유하는 프라이머 내의 블로킹 그룹(108B)의 존재로 인해 DNA 폴리머라제가 테일(401)을 카피하지 않아 테일(401)은 항상 단일 가닥이며 포획 프로브에 또는 표지된 프로브에 결합되도록 이용가능하다. 올리고뉴클레오티드(401)는, 포획 프로브들의 어레이(array) 상의 특정 위치에 또는 분산된 어레이의 상이한 요소들에 연결된 포획 프로브에 수득된 앰플리콘을 고정시키기 위한 "집 코드(zip code)"로서 작용할 수 있다. 다른 기능성 모이어티는 링커(403)를 통해 앵커 서열(104)에 부착된 비오틴 그룹(402)을 포함한다. 프라이머 내 블로킹 그룹(108B)의 존재로 인해, DNA 폴리머라제가 링커(403)를 카피하지 않아 링커(403)는 항상 단일 가닥이다. 비오틴 그룹(402)은, 프라이머로부터 합성된 앰플리콘이 추가의 기능을 획득할 수 있도록 한다. 예를 들면, 비오틴 그룹은, 앰플리콘이 연결 그룹을 통해 고체 표면, 예를 들면, 상자성 비드(paramagnetic bead)에 고정된 스트렙트아비딘 단백질에 의해 강하게 포획되도록 한다. 다른 기능성 모이어티는, 헤어핀 올리고뉴클레오티드(404)로서, 이는 켄처(407)(바람직하게는 비형광성 켄처, 예를 들면, 답실(Dabcyl) 또는 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher) 2)로 표지된 이중-가닥 스템(406) 및 단일-가닥 루프(405)를 포함하는 스템-및-루프 구조물 및 상호작용 형광성 모이어티(408)(바람직하게는 형광단)를 갖는다. 역방향 프라이머(203)의 신장(도 2)은, 표지된 헤어핀(404)을 통해 계속되고, 켄처(407)를 형광 모이어티(408)로부터 분리시키고, 이에 의해 형광 신호를 발생시킨다. 문헌[Nazarenko et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:2516-2521]을 참조한다. 프라이머(103) 내에 표지된 헤어핀(404)을 포함시키면 증폭의 지표인 형광 신호가 초래된다. 또 다른 기능성 모이어티는, 올리고뉴클레오티드 서열(414) 및 블로킹 그룹(108B)을 통해 앵커 서열(104)에 부착된 분자 비콘 프로브(409)이다. 이 기능성 모이어티는 Scorpion® 프라이머의 추가 기능을 갖고, 즉, 테더링된(tethered) 분자 프로브가 카피(201) 생성시 프라이머(103)로부터 다운스트림의 표적 가닥(의도된 표적 서열 및 미스매치된 표적 서열 둘 다)에 하이브리드화되는 것을 가능하게 한다. 분자 비콘 프로브(409)는 루프(410) 및 스템(411)을 포함하고, 여기에 상호작용 켄처(412) 및 형광성 모이어티(413)가 공유결합적으로 부착되어 있어, 신장 산물(201)에의 프로브(409)의 하이브리드화가 스템(411)을 붕괴시키고, 증폭의 지표인 형광 신호를 발생시킨다. 헤어핀(404)과는 달리, 헤어핀(409)은 카피되지 않고, 그 이유는 이 경우 프라이머(103)가 블로킹 그룹(108B)을 함유하기 때문이다. 도 4의 맨 아래 도면은 헤어핀(404)의 변형으로서, 분자 비콘의 스템(417)의 5'-말단 서열이 브릿지 서열(105)의 일부분에 대해 상보성이고 루프가 앵커 서열(104)을 포함하는 것을 나타낸다. 결과적으로, 상보성 앰플리콘 가닥에 하이브리드화될 때, 그 결과로 생긴 하이브리드의 강성이 상호작용 켄처(415)를 형광성 모이어티(416)로부터 분리시키고, 이에 의해 증폭의 지표인 형광 신호를 발생시킨다.
다중-부분 프라이머는 이의 표적 서열, 즉, 의도된 표적 서열 및 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열 외에는 반응 혼합물 내의 서열을 프라이밍하지 않는다. 브릿지 서열의 3' 부분과 풋 서열은, 함께 이러한 무관한 서열을 위한 프라이머로서 작용하는 서열을 형성하지 않는다.
본 발명의 방법에 유용한 다중-부분 프라이머는, 도 1과 관련하여, 다음과 같이 기능한다. 고온 변성 단계 다음에 올 수 있는 제1 라운드의 합성, 예를 들면, 제1 PCR 주기에서, 앵커 서열(104)이, 표적 서열인 의도된 표적(101) 및 의도되지 않은 미스매치된 표적(102) 둘 다에 하이브리드화된다. 브릿지 서열(105)은 표적 서열에 하이브리드화되지 않는다. 풋 서열(106)은, 의도된 표적 서열(101)에 우선적으로 하이브리드화되지만, 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열(102)에도 어느 정도까지는 하이브리드화된다. 하이브리드가 어느 정도의 빈도로 형성 및 분리된다. 또한, 어느 정도의 빈도로, 형성된 하이브리드에 DNA 폴리머라제가 결합하여 프라이머의 신장을 개시한다. 의도된 표적 서열(101)과 관련하여, 하이브리드 형성 빈도와 폴리머라제 결합/신장 빈도의 조합이, 의도된 표적 서열(101)의 비효율적인 카피를 초래하며, 이는, 본 발명자들이, 다중-부분 프라이머 및 106개의 카피의 의도된 표적 서열(101)을 (의도되지 않은 표적 서열(102)의 카피와 함께 또는 의도되지 않은 표적 서열의 카피 없이) 사용하는 SYBR Green 검출을 이용한 PCR 증폭 및 검출 검정과 (다중-부분 프라이머의 앵커 서열과 유사한) 상응하는 통상의 프라이머를 사용하는 동일 검정을 비교할 때, PCR 역치 주기 CT에서의 적어도 2 주기의 지연으로서 평가한다. 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열(102)과 관련하여, 하이브리드 형성 빈도와 폴리머라제 결합/신장 빈도의 조합이 극도로 비효율적인 카피를 초래하며, 이는, 본 발명자들이 이러한 검정에서, 다중-부분 프라이머 및 106개의 카피의 미스매치된 표적 서열(102)를 사용한 경우의 CT와, 다중-부분 프라이머 및 106개의 카피의 의도된 표적 서열(101)을 (의도되지 않은 표적 서열(102)의 카피와 함께 또는 의도되지 않은 표적 서열의 카피 없이) 사용한 경우의 CT 사이의 차이(ΔCT)로서 평가한다. 의도된 표적 서열에 대해 다중-부분 프라이머에 의해 야기되는 지연은 적어도 2 PCR 주기이고, 이보다 더 길 수도 있으며, 예를 들면, 4 주기 또는 심지어 5 내지 10 주기일 수 있다. 의도되지 않은 미스매치된 표적과 의도된 표적 사이의 차이(ΔCT)는 적어도 10 PCR 주기이고, 바람직하게는 이를 초과한다. 의도된 표적 서열은 증폭이 추가의 주기를 통해 진행됨에 따라 카피될 것이며, 따라서, 궁극적으로는 미스매치된 표적이 될 것이다. 둘 다의 표적으로부터 합성된 카피들은 다중-부분 프라이머를 함유할 것이며, 따라서 동일해질 것이다.
다중-부분 프라이머가, 증폭 전 피험 시료 중에 존재하는 표적 핵산 분자 상에서 앰플리콘 합성을 개시한 후에는, 이러한 개시가 제1 주기에서 일어나든 더 나중 주기에서 일어나든, 그 결과로 생긴 앰플리콘이 후속 주기에서 정상적인 높은 효율로 빠르게 지수적으로 증폭되며, 이때 다중-부분 프라이머는 앰플리콘과 관련해 통상의 프라이머로서 작용한다. 예를 들면, 앰플리콘의 카피를 위해, 다중-부분 프라이머는, 20 내지 50개의 뉴클레오티드 길이인 통상의 PCR 프라이머와 동일한 방식으로 기능한다. 이는, 일단 증폭이 시작되면 풋 이상의 것들이 프라이머로서 작용한다는 것을 의미한다. 하나의 가능성은, 전체(또는 적어도 블로킹 그룹의 5'에 위치하는 기능성 모이어티, 예를 들면, 401, 403 및 409를 제외하고서 전체)가 카피되고, 이것이 앰플리콘 카피를 위한 프라이머로서 작용한다는 것이다.
다중-부분 프라이머 내에 블로킹 그룹을 갖는 이들 실시형태에서, 블로킹 그룹의 목적은, 프라이머의 5' 말단의 일부 부분이 카피되는 것을 방지하는 것이다. 블로킹 그룹은 당해 분야의 숙련가들에게 친숙하다. 블로킹 그룹은, 예를 들면, 헥사에틸렌 글리콜일 수 있거나 질소성 염기가 결여된 비염기성 뉴클레오티드일 수 있다. 블로킹 그룹은, 기능성 모이어티(401, 403, 또는 409)에 대한 블로킹 그룹(108B)의 배치에서처럼 기능성 모이어티의 카피를 방지하도록 앵커 서열(104)의 5' 말단에 위치할 수 있거나; 또는 이는 블로킹 그룹(108A)의 배치에서처럼 앵커 서열(104) 내의 임의의 위치에 놓일 수 있거나; 또는 이는 블로킹 그룹(108)의 배치에서처럼 브릿지 서열(105) 내에 놓일 수 있으며; 이는, 카피된 단축 서열이, 주형 분자가 앰플리콘일 때 효율적인 프라이머로서 작용하도록 충분히 긴 경우에만 해당한다. 설명을 위해, 다중-부분 프라이머가 6개의 뉴클레오티드 길이의 풋 서열을 갖고, 35 뉴클레오티드를 카피하는 것을 원한다고 가정한다. 브릿지 서열(105)이 24개의 뉴클레오티드 길이인 경우, 원하는 프라이머 길이를 달성하기 위해서는 5 뉴클레오티드의 앵커 서열(104)이 블로킹 그룹의 다운스트림(즉, 3')에 존재해야 한다.
3. 명명법
아래에 기재된 실시예에서는 2가지 명명법을 사용하여 본 발명의 다수의 다중-부분 프라이머를 지칭한다.
하나의 명명법에서는 다중-부분 프라이머를, 예를 들면, "24-14-5:1:1" 프라이머와 같은 형태로 나타내는데, 이는 24개의 뉴클레오티드 길이인 앵커 서열, 14개의 뉴클레오티드 길이인 브릿지 서열, 그리고, 7개의 뉴클레오티드 길이인 풋 서열을 의미하고, 상기 풋 서열은, 풋의 5' 말단으로부터, 돌연변이체(MUT) 표적과 야생형(WT) 표적 둘 다에 대해 상보성인 5개의 뉴클레오티드, WT 표적 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이 아니지만 MUT 표적 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성인 하나의 심문성 뉴클레오티드, 그리고, 마지막으로 둘 다의 표적에 대해 상보성인 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 심문성 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단의 안쪽에 있는 하나의 뉴클레오티드에 위치하기 때문에, 본 발명자들은 이 뉴클레오티드를 "3'에서 두 번째 위치"에 놓여 있다고 말한다.
브릿지 서열을 앵커의 결합 서열과 풋의 결합 서열 사이에 놓인 표적 서열의 영역(상기 영역을 본 발명자들은 "개재 서열"이라 부름)과 비교하면, 하기 실시예 중 일부에서 개재 서열은 14개의 뉴클레오티드 길이로서 브릿지 서열과 동일 길이인 반면, 다른 실시예(예를 들면, 실시예 8)에서는 개재 서열과 브릿지 서열이 상이한 길이를 갖는 것을 볼 수 있다. 개재 서열의 길이를 명시하기 위해, 때때로 두 번째 명명법이 사용된다. 이 경우, "24-18/10-5:1:1" 다중-부분 프라이머는, 이의 5'-앵커 서열이 24-뉴클레오티드 길이이고, 이의 브릿지 서열이 18-뉴클레오티드 길이이며, 반대편에 10-뉴클레오티드 길이인 주형 내 개재 서열이 존재하고, 이의 3'-풋 서열이 7-뉴클레오티드 길이이고, 이는 돌연변이체 주형과 야생형 주형 둘 다에 대해 완전히 상보성인 5' 절편, 그에 이어 돌연변이체 주형 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해서만 상보성인 심문성 뉴클레오티드, 그에 이어 돌연변이체 주형과 야생형 주형 둘 다에서 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성인 3' 뉴클레오티드로 이루어진다는 것을 의미한다.
브릿지 서열의 서열을 개재 서열에 대해 상보성이 아니도록 선택하여 프라이머 어닐링 동안 브릿지 서열이 개재 서열에 하이브리드화되는 것을 방지한다. 앵커 서열과 풋 서열이 둘 다 주형에 하이브리드화될 때, 브릿지 서열과 개재 서열은 서로 어닐링되지 않고 단일-가닥 "버블"을 형성한다. 본 발명자들은, 브릿지 서열과 개재 서열을 합친 것을 때때로 버블이라 부른다. 예를 들면, 24-14/14-5:1:1 표시는 "14/14 버블"을 갖는 것으로 언급될 수 있다.
"버블의 원주"는 브릿지 서열 내의 뉴클레오티드 수 + 개재 서열 내의 뉴클레오티드 수 + 앵커 서열의 3' 뉴클레오티드 및 이의 상보물 + 풋 서열의 5'-말단 뉴클레오티드 및 이의 상보물의 합으로서 정의된다. 결과적으로, 주형 분자에의 24-14/14-5:1:1 다중-부분 프라이머(14/14 버블)의 결합에 의해 형성되는 버블의 원주는 14 + 14 + 2 + 2이며, 이는 32개의 뉴클레오티드 길이와 같다. 아래의 목록은, 하기 실시예에서 사용된 프라이머 일부를 이러한 두 번째 방식을 이용하여 열거한다.
PCR 검정에서 사용되는 예시적인 프라이머
각각의 초선택적 프라이머 내의 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 이의 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 밑줄 쳐진 굵은 글자로서 표시된다. 프라이머들은, 비교 실험에서의 이들의 사용을 반영하는 그룹별로 배열된다.
4. 용도
본 발명은, 특정한 의도된 표적, 특정한 증폭 방법 또는 특정한 기기에 제한되지 않는다. 비교 목적을 위해, 본 발명자들은 실시예 1 내지 8에서 몇몇의 일련의 실험들을 제시하며, 이들 실험은, 동일한 의도된 표적, EGFR 돌연변이 L858R, 균일한 PCR 검정을 사용하고, 플라스미드 DNA로 출발하여, SYBR® Green 검출을 이용하고, 동일한 열 주기 장치인 바이오-래드 IQ5 분광형광계 열 주기 장치를 사용한다. 본 발명자들은 다른 검정들을 수행하였으며, 이들은, 실시예에서 보고된 것들에 부합하는 결과를 제공하였다. 이러한 검정은, 사람 EGFR 돌연변이체 T790M 및 사람 B-raf 돌연변이체 V600E를 포함하는 다른 의도된 표적들을 사용하였고; 게놈 DNA를 사용하였으며; 분자 비콘 프로브를 사용한 검출을 포함하였고; 상이한 PCR 파라미터를 사용하였으며; 상이한 기기인 ABI PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치를 사용하였다.
실시예 1은 대조군 검정으로서, 통상적인 21-뉴클레오티드 길이의 PCR 전방향 프라이머를 사용하여, 완전히 매치된 의도된 표적 서열을 증폭시키고, 또한, 프라이머가 결합하는 서열의 중심부 부근에 위치한 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 차이가 나는 의도되지 않은 미스매치된 표적 서열도 증폭시켰다(여기서, 또한, 다른 실시예에서와 같이 통상적인 PCR 역방향 프라이머가 사용되었다). 이중-가닥 증폭 산물(또는 이중-가닥 "앰플리콘")의 균일 검출은, 이들의 형광성을 유의하게 증가시키는 방식으로 이중-가닥 앰플리콘에 결합하는 SYBR Green®을 초기 증폭 반응 혼합물에 포함시킴으로써 가능해졌다. 결과적으로, 각각의 PCR 증폭 주기의 쇄 연장 스테이지 종료시 측정된 SYBR Green® 형광 강도는, 존재하는 앰플리콘 수의 정확한 지표를 제공한다. 도 5에 나타낸 실시간 동역학적 형광 곡선(형광 강도 대 증폭 주기 수)은, 증폭은 대략 20 PCR 주기가 수행된 시점에서 배경값을 초과하는 검출가능한 신호(역치 주기, 약칭하여 "CT")를 제공하기에 충분한 이중-가닥 산물인 대략 1012개의 앰플리콘을 생성한다는 것을 보여주며, 이는, 106개 주형을 사용해 출발되는 PCR 검정에서 전형적이다. 도 5는, 또한, 전방향 프라이머는, 의도되지 않은 미스매치된 표적에 비해 의도된 표적에 대해 선택성을 거의 갖지 않았으며, 즉, 미스매치된 표적으로 출발하는 경우 역치 주기(CT)에서 유의한 지연이 존재하지 않았음을 보여준다. 열역학적으로, 미스매치된 하이브리드의 안정성에 비해 완전히 상보성인 하이브리드의 안정성의 차이가 거의 존재하지 않는다(이는 형성 가능성이 약간 더 적은 미스매치된 프라이머-표적 하이브리드로부터 제조된 앰플리콘 출현시 관찰가능한 지연을 사실상 초래하지 않음).
실시예 2는 2가지의 추가의 대조군 실험을 설명하고, 여기서, 미스매치된 표적 내의 치환된 뉴클레오티드가 우선 통상적인 전방향 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드에 위치하고(익히 공지된 ARMS 기술), 이어서, 통상적인 전방향 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드로부터 안쪽에 있는 하나의 뉴클레오티드에 위치한다. 본 발명자들은, 단일-뉴클레오티드 다형이 존재하거나 또는 부재할 수 있는 표적 내 뉴클레오티드의 반대편에 존재하게 될 프라이머 서열 내 뉴클레오티드의 위치를 때때로 "심문성 뉴클레오티드"라 일컫는다. 이들 대조군 실험에 대한 실시간 동역학적 곡선이 도 6에 제시되며, 여기서, 의도된 표적 사용시에는 CT가 20 주기 부근으로 유지되었음을 볼 수 있으며, 이는, 의도된 표적에 대해 증폭 반응이 실시예 1에서 보고된 증폭만큼 효율적이었음을 시사한다. 그러나, 미스매치된 표적 사용시에는 CT가 몇몇의 주기 만큼 지연되었다. 풋 서열의 3'-말단에 심문성 뉴클레오티드를 갖는 프라이머의 경우(도 6, 패널 A), 지연(11 주기)은 대략 10 주기였으며, 이는, 완전히 매치된 의도된 표적에 대한 선택성이 1000배(210은 1,024임)라는 것을 나타낸다. 심문성 뉴클레오티드가 풋 서열의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 있는 경우, CT는 약 8 주기로서 다소 더 적었다. 실시예 1 및 2를 비교하면, 의도된 표적의 증폭 효율은, 심문성 뉴클레오티드를 프라이머의 3' 말단에 또는 프라이머의 3' 말단 부근에 위치시키는 것에 의해 감소되지 않지만, 단일 뉴클레오티드에 의해 차이가 나는 의도되지 않은 표적에 비해 의도된 표적에 대한 선택성은 개선되는 것으로 나타난다. 본 발명자들은, 선택성이 제한되는 것은 케토-에놀 호변이성으로 인해 표적 서열 내 비-상보성 뉴클레오티드와의 미스매치된 심문성 뉴클레오티드의 일부 염기쌍 형성이 때때로 일어나고, 따라서, 일부 바람직하지 못한 신장이 일어나기 때문이며, 따라서 앰플리콘이 생성될 확률은, 하이브리드가 형성될 확률과 그 결과로 생긴 하이브리드가 신장가능한 구조를 형성할 확률을 곱한 값이라는 것을 이해한다.
실시예 3은, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용한 동일 실험을 보여준다. 본 발명자들은, 여기서 사용된 프라이머를 24-14-5:1:1로서 기술한다. 첫 번째 숫자 24는 앵커 서열의 뉴클레오티드 길이이다. 두 번째 숫자 14는 브릿지 서열의 뉴클레오티드 길이이다(또한, 이 실험에서는 본원에 기재된 다른 실험에서와 마찬가지로, 본 발명자들이 별도로 명확하게 명시한 경우를 제외하고는 표적 내 개재 서열이 브릿지 서열과 동일한 길이이다). 마지막 세 번째 숫자 5:1:1은 풋 서열을 나타내며, 이는 심문성 뉴클레오티드(들)의 5'인 뉴클레오티드의 수, 이어서, 심문성 뉴클레오티드 수(이는 본원에 기재된 모든 실험에 대해 1이다), 그리고, 마지막으로 심문성 뉴클레오티드(들)의 3'인 뉴클레오티드의 수를 제공한다. 따라서, 이 경우, 풋은 7개의 뉴클레오티드 길이이며, 끝에서 두 번째 위치에 심문성 뉴클레오티드를 갖는다. (각각의 주기의 쇄 연장 스테이지 종료시 측정되는) SYBR Green® 형광 강도를 사용하여 각각의 열 주기 완료 후 존재하는 앰플리콘 수를 평가하는 이들 실시간 검정의 결과는 도 7에 제시된다. 도 5와 도 7을 비교하면, 의도된 완전히 매치된 표적 사용시 CT가 지연되는 것을 알게 되고, 이 경우 약 3 주기 만큼이다. 또한, (풋 내의 심문성 뉴클레오티드에 대해 상보성이 아닌 단일-뉴클레오티드 다형을 함유하는) 의도되지 않은 표적 사용시에는 CT가 훨씬 더 많이 지연되는 것을 알게 되며, 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 사이의 ΔCT가 약 19 주기로서, 이는 선택성에 있어서 대략 500,000배 차이이다(219는 524,288이다).
어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 다음 사항들이 사실이라는 것을 믿는다:
A. 풋 서열이 앵커 하이브리드에 의해 주형에 테더링되더라도, 풋이 매우 작고, 풋이 (프라이머의 브릿지 서열 및 주형 내 개재 서열을 포함하는) 커다란 버블에 의해 앵커 하이브리드로부터 분리되어 있으며, 어닐링 온도가 짧은 풋 서열에 비해 매우 높아서, (PCR 검정의 어닐링 스테이지의 평형 조건 하에) 임의의 주어진 순간에, 피험 시료 내에 존재하는 주형 분자의 극히 일부만이 임의의 주어진 순간에 풋에 하이브리드화된다.
B. 또한, 풋과 표적 사이에 형성되는 하이브리드는 상대적으로 약해서, 이들의 평균 존속 시간이 매우 짧다(아마도 100 마이크로초).
C. 임의의 주어진 순간에 하이브리드가 존재할 확률이 감소된 것, 및 수득되는 약한 하이브리드의 평균 존속 시간이 감소된 것 둘 다의 결과로서, 하이브리드(심지어 완전히 상보성인 하이브리드)와 DNA 폴리머라제 분자 사이에 안정한(신장가능한) 복합체가 형성될 확률이 극히 낮다.
D. 이는 바람직한 다중-부분 프라이머 디자인을 사용해 수행된 PCR 검정에서는 완전히 상보성인 ("돌연변이체") 표적으로부터 제조되는 앰플리콘 출현시 대략 10-주기의 지연이 나타나고, (즉, 통상적인 선형 프라이머를 106개의 완전히 상보성인 표적과 함께 사용할 때 발생하는 바와 같은 약 20의 CT 대신에) Ct는 약 30이다. CT 값에서 10의 열 주기 증가는, DNA 폴리머라제 분자와 완전히 상보성인 풋 하이브리드 사이에 안정한 복합체가 형성될 확률이 동일 반응 조건 하에 통상적인 선형 프라이머를 사용할 때보다 1/1,000로 더 낮다는 것을 시사한다.
E. 이들 동일한 PCR 조건 하에 동일한 바람직한 다중-부분 프라이머 디자인을 사용하여, 미스매치된 ("야생형") 표적을 사용해 얻은 CT 값은 완전히 상보성인 표적 사용시 발생하는 CT 값보다 거의 20 주기 더 늦게 발생한다. 따라서, 동일 조건 하에 다중-부분 프라이머 대신 통상의 선형 프라이머를 사용했을 때 발생하는 CT 값과 비교하여, 이들 미스매치된 표적으로부터의 앰플리콘 출현시 대략 30-주기의 지연이 존재한다. 따라서, 미스매치된 풋 표적 서열에 결합된 풋 서열을 함유하는 하이브리드와 DNA 폴리머라제 분자 사이에 안정한 복합체가 형성될 확률은 훨씬 더 낮다. 이러한 CT 값에서의 30-주기의 증가는, DNA 폴리머라제 분자와 미스매치된 풋 하이브리드 사이에 안정한 복합체가 형성될 확률이, 동일 반응 조건 하에 통상의 선형 프라이머를 사용할 때보다 1/1,000,000,000로 더 낮다는 것을 시사한다.
F. 의도되지 않은 표적 서열과 DNA 폴리머라제 분자 사이에 신장가능한 복합체가 형성될 확률이 이처럼 극적으로 더 낮은 것은, 다음과 같은 차별화된 요소의 결과물이다: (i) (완전히 상보성인 하이브리드의 안정성과 비교하여) 미스매치된 하이브리드의 안정성이 낮을수록 임의의 주어진 순간에 존재하는 미스매치된 하이브리드의 분율이 (임의의 주어진 순간에 존재할 수 있는 완전히 상보성인 하이브리드의 분율에 비교하여) 현저하게 감소되고; (ii) 미스매치된 하이브리드의 안정성이 낮을수록 하이브리드의 평균 존속 기간이 더 짧아지게 되며, 이에 의해 (일정한 브라운 운동(Brownian motion)을 수행하는) DNA 폴리머라제 분자가 안정화된 복합체를 형성하게 될 하이브리드를 발견하는 능력이 현저하게 감소된다.
실시예 4는, 실시예 3의 검정을 사용하여, 106개의 카피의 의도되지 않은 표적 서열만을 함유하는 시료 및 106개의 카피의 의도되지 않은 표적 서열의 존재 하에 10개 이상의 카피의 의도된 표적 서열을 함유하는 시료로부터 얻은 상이한 결과들을 쉽게 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 일련의 희석물(106개의 카피의 의도되지 않은 표적 서열을 함유하는 반응 혼합물 중 106, 105, 104, 103, 102, 101개의 카피의 의도된 표적 서열)로부터 얻은 실시간 PCR 결과가 도 8에 제시되고, 이들 결과에 대해 측정된 CT가 도 9에 제시되며, 여기서, 이들은, 의도된 표적 서열의 출발 카피 수의 대수에 대해 플로팅된다. 이들 도면과 관련하여, SYBR Green® 형광의 CT는, 의도된 표적 농도가 1000배 감소할 때마다 대략 10 주기 만큼 지연된다는 것과, 10개의 카피의 의도된 표적 서열 + 106개의 카피의 의도되지 않은 표적 서열을 갖는 시료는, 의도된 표적 서열은 갖지 않고 106개의 카피의 의도되지 않은 표적 서열을 갖는 시료로부터 구별된다는 것을 알게 되며; 즉, 100,000개의 카피의 상응하는 야생형 서열 집단에서 하나의 돌연변이체 서열의 검출이 가능해진다. 또한, 검정은 정량적이며, 이때 역치 주기는 출발 반응 혼합물 내 돌연변이체 카피 수의 대수에 상응한다.
이들 결과는, 본 발명에 따른 선택적 프라이머의 사용에 대한 다음의 양상을 확인시켜 준다:
A. 일단 다중-부분 프라이머가 PCR 검정의 어닐링 스테이지 동안 DNA 폴리머라제에 결합하여 하이브리드를 형성하면, 상기 안정화된 하이브리드는 PCR 검정의 연장 스테이지 동안 신장되고, 이어서, 그 결과로 생긴 앰플리콘이 높은 효율로 증폭된다(이는 전형적인 선형 프라이머를 사용하여 반응을 수행할 때와 마찬가지이다). 이는, 시료 내에 원래 존재하는 돌연변이체 주형 수가 1,000 인자 만큼 감소하면, 유의한 수의 앰플리콘 출현시 대략 10의 열 주기 만큼의 지연이 초래된다는 사실에 의해 알 수 있다(예를 들면, 결과가 도 8 및 도 9에 나타난 실험에서, 100,000개의 돌연변이체 주형을 갖는 시료의 CT 값은 대략 27이었고, 100개의 돌연변이체 주형을 갖는 시료의 CT 값은 대략 37이었다). 존재하는 앰플리콘 수가 매회의 열 주기마다 효율적으로 2배가 되면, 10 주기 후 1,024배 만큼 많은 앰플리콘(즉, 210)이 존재해야 한다. 이들 결과는, 피험 시료 내에 존재하는 돌연변이체 주형으로부터 생성되는 앰플리콘이 효율적으로 증폭된다는 것을 확인시켜 준다.
B. 일단 다중-부분 프라이머가 앰플리콘 산물("플러스" 앰플리콘 가닥)의 5' 말단 내에 혼입되면 다음 합성 주기에서 생성되는 상보성 앰플리콘("마이너스" 앰플리콘 가닥)은, 다중-부분 프라이머의 전체 서열에 대해 완전히 상보성인 서열을 이의 3' 말단에 갖게 되기 때문에, 앰플리콘의 효율적인 증폭이 일어난다. 결과적으로, 앰플리콘과 관련해서는, (원래의 주형 분자와는 대조적으로) 다중-부분 프라이머가 앰플리콘의 추가 증폭을 위해 전형적인 선형 프라이머와 마찬가지로 거동한다.
C. (피험 시료 내에 존재하는 미스매치된 야생형 주형으로부터의 앰플리콘 생성에 비해) 피험 시료 내에 존재하는 완전히 상보성인 돌연변이체 주형으로부터의 앰플리콘 생성이 월등히 선택적이라는 것은, 일단 앰플리콘이 합성되면 프라이머에 의한 앰플리콘이 효율적으로 증폭된다는 것과 조합되어, 수득되는 실시간 데이터를 사용하여 피험 시료 내에 존재하는 돌연변이체 주형 분자 수를 정량적으로 평가하는 것을 가능하게 한다.
(PCR 검정과 같은 지수적인 증폭 반응에서는) 피험 시료 내에 존재하는 표적 분자 수의 대수와 소정 수의 앰플리콘 합성에 소요되는 열 주기 수 사이에 역 선형 관계가 존재하고, 이는, 상이한 수의 돌연변이체 주형 분자를 함유하는 시료들로부터 얻은 CT 값에서 반영된 바와 같다. 문헌[Kramer & Lizardi (1989) Nature 339:401-402]을 참조한다. 예를 들면, 결과가 도 9에 나타난 실험에서와 같이, 각각의 피험 시료 내에 존재하는 의도된 (돌연변이체) 주형 분자 수의 대수와 CT의 플롯의 선형성은, (1,000,000개의 야생형 주형 분자가 각각의 시료 내에 존재하였더라도) 야생형 주형으로부터의 유의한 앰플리콘 생성이 존재하지 않는다는 것을 시사한다. 야생형 주형으로부터 생성되는 유의한 수의 앰플리콘이 존재한다면, 단지 소수의 돌연변이체 주형을 함유하는 시료에 대한 CT 값이 더 낮아질 것이다(즉, 결과가 직선을 형성하지 않을 것이고, 그 이유는 풍부한 의도되지 않은 표적 분자로부터 합성되는 원치 않는 앰플리콘의 출현이 매우 희귀한 의도된 표적 분자로부터의 앰플리콘의 출현을 차폐하게 될 것이기 때문이다).
실시예 5에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은, 증폭 반응에 대한 다중-부분 프라이머의 풋 길이의 영향을 일련의 3개의 프로브: 24-14-4:1:1, 24-14-5:1:1 및 24-14-6:1:1을 사용하여 실시예 4의 검정을 이용하여 조사하였다. 앵커 서열의 길이는 24 뉴클레오티드로 유지시켰다. 브릿지 서열의 길이는 14 뉴클레오티드로 유지시켰고, 표적 서열 사이에 동일한 단일-뉴클레오티드 차이를 유지시켰으며, 심문성 뉴클레오티드의 위치는 풋의 3' 말단으로부터 두 번째 위치로 유지시켰다. 풋 서열의 길이는 심문성 뉴클레오티드 위치의 5' 뉴클레오티드의 수를 4에서 5, 6으로 변화시킴으로써 6 뉴클레오티드에서 7 뉴클레오티드, 8 뉴클레오티드로 변경시켰다. 수득된 CT 값이 표 1에 요약되어 있고, 도 10에서 의도된 표적 서열의 출발 카피 수의 대수에 대해 플로팅되어 있다. 직선(1001)(풋 길이 6), 직선(1002)(풋 길이 7) 및 직선(1003)(풋 길이 8)은 데이터에 피트된다. 모든 3개의 프라이머가 정량적 결과를 제공하였음을 볼 수 있고, 이는 도 9에 대해 상기에 보고된 바와 같다. 또한, 피트된 선(1001), 선(1002) 및 선(1003)이 평행에 가까운 것을 볼 수 있으며, 이는, 모든 3개의 풋 길이에 대한 출발 카피 수의 대수와 CT 사이에서의 동일한 정량적 관계를 시사한다. 도 10은, 또한, 풋 길이를 단축시키면 CT가 지연된다는 것을 보여주지만, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 풋 길이를 단축시키면 106개에서 101개까지의 의도된 표적 서열 카피 데이터의 더 우수한 직선 피트가 또한 제공된다(즉, 풋 길이가 짧을수록, 피험 시료 내의 풍부한 의도되지 않은 표적 분자로부터 합성된 앰플리콘이, 동일 시료 내에 존재하는 희귀한 의도된 표적 분자로부터 합성된 앰플리콘을 차폐할 가능성이 더 적어진다).
실시예 6에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은, 또한, 증폭에 대한 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열과 의도된 및 의도되지 않은 표적 서열의 개재 서열에 의해 형성되는 버블의 원주의 영향을 일련의 3가지 프라이머: 24-10-5:1:1, 24-14-5:1:1, 및 24-18-5:1:1을 사용하여 실시예 4의 검정을 이용하여 조사하였다. 본 발명자들은 앵커 서열의 길이를 24 뉴클레오티드로 유지시켰고; 풋 서열을 5:1:1로 유지시켰으며; 브릿지 서열의 길이를 10에서 14, 18 뉴클레오티드로 변화시켰고, 각각의 다중-부분 프라이머에 대한 앵커 서열은, 표적 내의 개재 서열이 해당 프라이머 내의 브릿지와 동일한 길이가 되도록 선택하였다. 결과적으로, 프라이머의 풋 서열이 표적에 하이브리드화될 때 3개의 프라이머 각각에 의해 형성된 버블의 원주(뉴클레오티드로 표시됨)는 (앵커 하이브리드 및 풋 하이브리드에 의해 기여되는 4 뉴클레오티드를 포함하여) 각각 24, 32 및 40이었다. 수득된 CT 값이 표 2에 요약되어 있고, 도 11에서 의도된 표적 서열의 출발 카피 수의 대수에 대해 플로팅되어 있다. 직선(1101)(버블 원주 24), 직선(1102)(버블 원주 32) 및 직선(1103)(버블 원주 40)은 데이터에 피트된다. 도 9 및 도 10에 대해 상기에 보고된 바와 같이 모든 3개의 프라이머가 정량적 결과를 제공하였음을 볼 수 있다. 또한, 피트된 선(1101), 선(1102) 및 선(1103)이 평행에 가까운 것을 볼 수 있으며, 이는, 모든 3개의 버블 원주에 대한 출발 카피 수의 대수와 CT 사이에서의 동일한 정량적 관계를 시사한다. 도 11은, 또한, 버블 원주를 증가시키면 CT가 지연된다는 것을 보여주지만, 도 11에서 나타난 바와 같이, 버블 원주를 증가시키면 106개에서 101개까지의 의도된 표적 서열 카피 데이터의 더 우수한 직선 피트가 제공된다(즉, 버블이 클수록, 피험 시료 내의 풍부한 의도되지 않은 표적 분자로부터 합성된 앰플리콘이, 동일 시료 내에 존재하는 희귀한 의도된 표적 분자로부터 합성된 앰플리콘을 차폐할 가능성이 더 적어진다).
이들 실험 관찰 결과는, 풋 길이가 짧을수록 그리고/또는 버블이 클수록 하이브리드 형성 가능성이 상당히 덜 낮아지고, 풋 길이가 짧을수록 그리고/또는 버블이 클수록 미스매치된 야생형 주형에 대해 증가된 선택성이 초래된다는 것을 입증하고, 이는, CT 대 의도된 표적 분자 수의 대수의 플롯의 선형성 향상에 의해 증명된다. 이것이 왜 그러한지를 이해하기 위해, 본 발명자들은, PCR 검정의 어닐링 스테이지 동안 존재하는 평형 조건 하에 풋 하이브리드 형성의 열역학을 검토하였다. 본 발명자들이 이해한 사항은 이러하다:
A. 본 발명자들의 PCR 검정에서는 매우 높은 농도의 다중-부분 프라이머가 존재한다(이는 각각의 반응에서 합성될 수 있는 대략 1013개의 앰플리콘 내에 혼입되도록 이용가능한 충분한 다중-부분 프라이머가 존재할 필요가 있기 때문이다). 결과적으로, 이들 PCR 검정의 어닐링 스테이지에서 존재하는 평형 조건 하에 사실상 모든 주형 분자가 다중-부분 프라이머의 앵커 서열에 빠르게 결합된다. 또한, 앵커 서열이 길기 때문에(예를 들면, 24 뉴클레오티드), 앵커 서열과 주형 분자 사이의 결합이 매우 강하고 평균적으로 장시간 동안(아마도 수분으로 측정됨) 지속된다. 평형시, 이들 앵커링된 복합체의 극히 일부에서는 짧은 풋 서열도 주형 분자에 하이브리드화된다. 임의의 주어진 순간에, 풋 서열이 하이브리드화되지 않은 앵커링된 복합체의 농도는 "[A]"이고, 풋 서열이 하이브리드화된 앵커링된 복합체의 농도는 "[B]"이다. 이들 두 상태의 연관성을 설명하는 전형적인 평형 상수("k")는 다음과 같다:
k = [B] / [A] 수학식 1
열역학적으로, 평형시 하이브리드가 형성될 확률은, 하이브리드 강도(엔탈피)에, 그리고, 2개의 서열이 상호작용하여 하이브리드를 형성할 수 있게 될 확률을 결정하는 물리적 관계(엔트로피) 둘 다에 의존한다. 평형 상수는, 풋 서열이 하이브리드화되지 않은 앵커링된 복합체가 풋 서열이 하이브리드화된 복합체로 전환될 때 발생하는 엔탈피 변화(ΔH)로부터 그리고 풋 서열이 하이브리드화되지 않은 앵커링된 복합체가 풋 서열이 하이브리드화된 복합체로 전환될 때 발생하는 엔트로피 변화(ΔS)로부터 다음의 전형적인 식에 따라 결정될 수 있다:
(ΔH - TΔS) = -RT ln(k) 수학식 2
여기서, R은 열역학적 기체 상수이고, T는 켈빈 도로 표시되는 온도이며, ln(k)는 평형 상수의 자연 대수이다. 이 수학식을 재배열하여 k에 대해 나타낸다:
여기서, e = 2.71828이다. 매우 동일한 반응에 대해, 하이브리드화된 풋 서열을 갖는 복합체의 분율(Θ)은 다음의 수학식에 의해 기술된다: Θ = [B] / ([A] + [B]). 그러나, (다중-부분 프라이머를 사용하는 반응의 경우에서와 같이) [B]가 매우 작아질수록, Θ가 0에 접근하여, Θ에 대한 수학식은 다음과 같이 표현될 수 있다:
수학식 4에서 Θ에 대한 표현은 수학식 1에서 k에 대한 표현과 사실상 동일하기 때문에, 본 발명자들은 수학식 3에서 k를 Θ로 치환하여, 하이브리드화된 풋을 갖는 프라이머-주형 복합체의 매우 낮은 존재비(Θ)를 전형적인 열역학적 파라미터 ΔH 및 ΔS에 결부시킨 수학식을 얻을 수 있으며, 이는 다음과 같다:
PCR 조건 하에 일어나는 핵산 하이브리드화 반응에 대해, 수치량(ΔH - TΔS)은 양의 값이고, 따라서 e는 음수로 올라가고, 이는 Θ에 대한 분율 값을 제공한다. (ΔH - TΔS)의 값이 작을수록, 분율 Θ가 작아진다. 또한, PCR 반응의 어닐링 스테이지 동안 T는 일정하다. 따라서, 다중-부분 프라이머 디자인의 변화의 결과로서 Θ가 어떻게 달라지는지를 이해하기 위해, 본 발명자들은 단지 각각의 프라이머 디자인에 대한 ΔH 및 ΔS 값의 크기를 고려하여, 해당 디자인의 효과를 다중-부분 프라이머가 의도된 표적에 하이브리드화될 때와 의도되지 않은 표적에 하이브리드화될 때를 비교해 이해할 필요가 있다.
B. 엔트로피는 분자 복합체가 형성될 수 있는 입체구조적으로 구별되는 상태의 수의 척도이다. 따라서, 앵커링된 복합체의 풋이 이의 표적에 하이브리드화될 때, 복합체가 형성될 수 있는 위상적으로 구별되는 상태의 수는 높은 수에서 낮은 수로 간다. 따라서, 풋 하이브리드 형성 시 엔트로피 변화(ΔS)는 음의 값을 갖는다.
C. 엔탈피는 분자 복합체의 안정성의 척도로서, 복합체를 함유하는 용액 내에 존재하는 에너지의 양으로 표현된다. 핵산 하이브리드를 해리시키기 위해서는 높은 온도가 필요하기 때문에, 복합체가 분해될 때는 열 에너지가 첨가되고 복합체 형성 시에는 열 에너지가 방출된다. 따라서, 풋 하이브리드 형성 시 엔탈피 변화(ΔH) 또한 음의 값을 갖는다.
D. 다중-부분 프라이머가 PCR 검정에 사용될 때, 하이브리드화된 풋 서열을 갖는 복합체의 분율(Θ)은 수학식 5에 의해 잘 설명된다. 풋의 길이를 변화시키거나 또는 버블의 원주를 변화시키는 상기에 기재된 실험에서, 유일한 변수는 ΔH 및 ΔS이다. 풋 하이브리드 형성의 경우, ΔH 및 ΔS는 음의 값이고, 깁스 자유 에너지(ΔG)로서 공지된 수치량(ΔH - TΔS)는 양의 값이다. 결과적으로, 수치량 TΔS는 ΔH보다 더 큰 음의 값이다. 하이브리드화된 풋 서열을 갖는 복합체의 분율(Θ)의 산출에 관하여, ΔH의 음의 크기가 작을수록, Θ가 작아질 것이다. 유사하게, ΔS의 음의 크기가 클수록, Θ가 작아질 것이다.
E. 하이브리드화된 풋 서열을 갖는 복합체의 분율(Θ)에 대한 상이한 풋 길이의 효과를 알아내기 위해서는, 다른 모든 것이 동등하면, 풋 하이브리드의 길이가 짧을수록 ΔH가 더 작은 음의 값이라는 것을 알 필요가 있다. 결과적으로, 풋 하이브리드의 길이가 짧을수록, 임의의 주어진 순간에 풋 하이브리드를 갖는 프라이머-표적 복합체의 비율이 더 낮아진다.
F. 유사하게, 하이브리드화된 풋 서열을 갖는 복합체의 분율(Θ)에 대한 상이한 버블 원주의 효과를 알아내기 위해서는, 다른 모든 것이 동등하다면, 버블 원주가 클수록 ΔS가 더 큰 음의 값이라는 것을 알 필요가 있다. 결과적으로, 버블 원주가 클수록, 임의의 주어진 순간에 풋 하이브리드를 갖는 프라이머-표적 복합체의 비율이 더 낮아진다.
G. 이를 이해했다면, 이제 다중-부분 프라이머 내의 풋 서열의 디자인이 완전히 상보성인 표적 서열(의도된 표적 서열)과 미스매치된 표적 서열(의도되지 않은 표적 서열) 사이의 구별에 어떻게 기여하는지를 검토해 보자. 예를 들면, 도 8 및 도 9에 결과가 나타난 실험에 사용된 다중-부분 프라이머는 상이한 길이의 풋("6:1:1" 또는 "5:1:1" 또는 "4:1:1")을 가졌다. 이들 표시는 각각의 풋의 전체 길이가 각각 8 뉴클레오티드, 7 뉴클레오티드 또는 6 뉴클레오티드이고, 이때 심문성 뉴클레오티드(이는 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이거나, 또는 의도되지 않은 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이 아니다)가 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 놓여 있다는 것을 의미한다.
H. 본 발명자들이 핵심 뉴클레오티드를 끝에서 두 번째 위치에 놓은 이유는, (미스매치로 인해) 끝에서 두 번째 염기쌍이 형성될 수 없을 때 (풋의 3' 뉴클레오티드가 표적 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이라 하더라도) 말단 염기쌍 또한 형성될 수 없다는 것을 믿기 때문이며, 이는 단리된 염기쌍은 PCR 검정의 어닐링 온도(대략 60℃)에서 안정해질 가능성이 극히 낮기 때문이다. 따라서, 주어진 풋 서열에 대해, 미스매치된 하이브리드는 완전히 상보성인 하이브리드보다 2개의 염기쌍 만큼 더 짧을 것이다.
I. 이는 (개념적으로) 다음을 의미한다: 요점을 설명하기 위해, 온도(T) = 1이라 가정하고, 기체 상수(R) = 1이라 가정하는데, 그 이유는 이들이 상수이기 때문이다. 6:1:1 풋을 갖는 완전히 상보성인 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값이 -16이고, 6:1:1 풋을 갖는 더 짧은 미스매치된 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값이 -12라고 하자. 또한, 버블의 원주에 의해 결정되는 이들 하이브리드 둘 다에 대한 ΔS 값을 -20이라고 하자. 결과적으로, 완전히 상보성인 하이브리드에 대한 ΔG 값은 4(20 - 16로 계산됨)이고, 미스매치된 하이브리드에 대한 ΔG 값은 8(20 - 12로 계산됨)이다. 이들 값을 수학식 5에 대입하면, 의도된 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θm)은 e-4이고, 이는 0.0183 값을 갖는다. 그에 비해, 의도되지 않은 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θw)은 e-8이고, 이는 0.000335 값을 갖는다. 따라서, 이 개념적 예시에서, 완전히 상보성인 하이브리드의 존재비는 미스매치된 하이브리드의 존재비보다 54.6배 더 크다. 이러한 계산은 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하면 (임의의 주어진 순간에) 의도되지 않은 표적과 형성되는 풋 하이브리드의 존재 확률이 (임의의 주어진 순간에) 의도된 표적과 형성되는 풋 하이브리드의 존재 확률에 비해 훨씬 더 낮아지게 된다는 것을 보여주지만, 그리고 이러한 차이가 의도된 표적으로부터 합성된 앰플리콘에 대한 CT와 비교해 의도되지 않은 표적으로부터 합성된 앰플리콘에 대한 CT에서 더 큰 지연을 명백히 초래하지만, 실제 Θm 및 Θw의 값은 이러한 개념적인 예시와는 다를 것이다.
J. 이제, 5:1:1 풋을 갖는 다중-부분 프라이머에 대해 동일한 개념적 계산을 해보자. 이 경우, 5:1:1 풋을 갖는 완전히 상보성인 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값은 -14이고, 4:1:1 풋을 갖는 미스매치된 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값은 -10이며; 그 결과로 생긴 ΔG 값(동일 크기의 버블에 대한 값이며, ΔS = -20)은 다음과 같다: 완전히 상보성인 하이브리드에 대한 ΔG 값은 6(20 - 14 = 6으로 계산됨)이고, 미스매치된 하이브리드에 대한 ΔG 값은 10(20 - 10으로 계산됨)이다. 이들 값을 수학식 5에 대입하면, 의도된 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θm)은 e-6이고, 이는 0.00248 값을 갖는다. 그에 비해, 의도되지 않은 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θw)은 e-10이고, 이는 0.0000454 값을 갖는다. 놀랍게도, 이 개념적 예시에서, 완전히 상보성인 하이브리드의 존재비도 또한 미스매치된 하이브리드의 존재비보다 54.6배 더 크다.
K. 이제, 4:1:1 풋을 갖는 다중-부분 프라이머에 대해 동일한 개념적 계산을 해보자. 이 경우, 4:1:1 풋을 갖는 완전히 상보성인 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값은 -12이고, 4:1:1 풋을 갖는 미스매치된 하이브리드의 형성에 대한 ΔH 값은 -8이며; 그 결과로 생긴 ΔG 값(동일 크기의 버블에 대한 값이며, ΔS = -20)은 다음과 같다: 완전히 상보성인 하이브리드에 대한 ΔG 값은 8(20 - 12 = 8로 계산됨)이고, 미스매치된 하이브리드에 대한 ΔG 값은 12(20 - 8로 계산됨)이다. 이들 값을 수학식 5에 대입하면, 의도된 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θm)은 e-8이고, 이는 0.000335 값을 갖는다. 그에 비해, 의도되지 않은 표적과 형성된 하이브리드에 대한 개념적인 Θ 값(Θw)은 e-12이고, 이는 0.00000614 값을 갖는다. 또한 더욱 놀랍게도, 이 개념적 예시에서, 완전히 상보성인 하이브리드의 존재비도 또한 미스매치된 하이브리드의 존재비보다 54.6배 더 크다. 따라서, 본 발명자들은, 더 짧은 풋이 더 낮은 Θ 값을 초래하더라도, 그리고 더 짧은 풋이 CT 값의 증가를 초래하더라도, 엄격한 열역학적 관점에서, 더 짧은 풋 서열이 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 사이의 구별을 향상시킨다는 것을 믿을 이유가 없다고 결론내렸다.
L. 추가로, 버블 원주의 증가 또한 Θ 값을 저하시키기는 하지만, 버블 원주의 증가는 하이브리드의 형성 가능성을 더 낮추기는 해도, 의도된 표적으로부터 형성되는 풋 하이브리드과 의도되지 않은 하이브리드로부터 형성되는 풋 하이브리드의 평형 비를 변화시키지 않는 것이 명백하다.
M. 전형적인 열역학적 분석과 관련하여, 풋 하이브리드를 형성하는 분자 복합체의 분율이 극히 낮은 임의의 주어진 다중-부분 프라이머에 대해, 의도된 표적과 형성된 풋 하이브리드의 분율(Θm)과 의도되지 않은 표적과 형성된 풋 하이브리드의 분율(Θw)의 비는 (ΔS를 변화시키는) 버블 원주의 증가에 의해서도 영향을 받지 않고 또한 (ΔH를 변화시키는) 풋 길이의 감소에 의해서도 영향을 받지 않으며, 오히려 이들 변화는 Θw 값과 Θm 값 둘 다를 감소시키면서도 (Θm/Θw) 비는 변화시키지 않고, 상기 비는 엔탈피 차이(ΔHm - ΔHw)의 함수이다. 결과적으로, 전형적인 열역학적 관점에서, 의도된 하이브리드과 의도되지 않은 하이브리드의 상대적 존재비에 영향을 미치는 유일한 요인은 이들의 엔탈피 값의 차이이며, 이 차이는 형성된 염기쌍의 갯수의 차이로 인한 것으로, 이는 풋의 길이에 상관 없이 동일하다. (Θm/Θw) 비를 기술하는 열역학적 수학식은 다음과 같다:
결과가 도 10 및 도 11에 나타난 실험은 버블 원주의 증가 및 풋 길이의 감소가 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 선택성을 유의하게 증가시키며, 즉 다중-부분 프라이머의 디자인에서의 이들 변화는 풋 하이브리드의 존재비를 감소시키기는 해도 차별적 비(Θm/Θw)를 유의하게 증가시킨다는 것을 입증하며, 이는 이러한 차별적 비의 증가가 106개의 의도된 표적 분자를 사용해 얻은 CT와 106개의 의도되지 않은 표적 분자를 사용해 얻은 CT 사이의 CT 값의 차이(ΔCT)의 증가에 의해 증명되는 바와 같다. 이들 관찰 결과는 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 놀라운 선택성에 대한 추가의 (아마도 비-열역학적인) 이유가 존재한다는 것을 시사한다.
본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 PCR 증폭 검정의 어닐링 스테이지의 평형 조건 하에 임의의 순간에 존재하는 풋 표적 비율을 감소시키도록 설계할 때 발생하는 선택성 향상에 대한 설명은 ARMS의 구별 결과에서는 발견될 수 없는데, 그 이유는 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드를 포함하는 염기쌍을 갖지 않는 하이브리드를 DNA 폴리머라제 분자가 거부하는 정도가 이들 프라이머의 존재비와는 상관 없이 동일하기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 추가의 구별 메커니즘이 풋 하이브리드를 거의 형성하지 않도록 프라이머를 설계할 때 발생하는 놀라운 선택성을 가능하게 하고 있다는 것이 실험 결과로부터 명백하다.
어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들이 풋 길이의 감소 및 버블 원주의 증가가 선택성을 향상시킨다고 믿는 이유는 이러하다. 이에 대한 설명은 PCR 검정의 어닐링 스테이지 동안 존재하는 상대적으로 높은 온도에서 매우 짧은 풋 하이브리드가 이들이 해리되기 전 매우 짧은 시간(아마도 수천 또는 수백 마이크로초로 측정됨) 동안만 존재한다는 본 발명자들의 예상치 못한 발견에서 찾을 수 있다. 게다가, 하이브리드가 짧을수록, 그리고 버블 원주가 클수록, 하이브리드가 존재하는 동안의 평균 시간이 더 짧아진다. 특정 유형의 하이브리드의 평균 존속 시간이 짧을수록 DNA 폴리머라제 분자가 이들 하이브리드 중 하나와 만나서 그 하이브리드과 안정된 복합체(이는 쇄 연장을 겪게 될 수 있음)를 형성할 가능성이 더 낮아진다고 본 발명자들은 추측한다. 여기서 핵심은, 하이브리드가 DNA 폴리머라제 분자와 안정된 복합체를 형성하게 될지의 여부와는 상관 없이, 해당 하이브리드의 평균 존속 시간의 기능이다. 본 발명자들은, 특정 다중-부분 프라이머와 함께 형성된 완전히 상보성인 하이브리드의 평균 존속 시간과 동일 유형의 다중-부분 프라이머와 함께 형성된 미스매치된 (더 짧은) 하이브리드의 평균 존속 시간의 비는 프라이머의 풋 길이가 감소하고 프라이머의 버블 원주가 증가할 때 더 크다는 것을 신뢰한다. 따라서, 더 엄격한 다중-부분 프라이머 디자인(더 짧은 풋, 더 긴 버블)은 더 짧은 수명의 하이브리드를 생성하고, 상기 하이브리드는 DNA 폴리머라제 분자와의 안정된 하이브리드를 형성할 가능성이 상당히 더 낮다. 결과적으로, 더 짧은 풋 하이브리드는 덜 풍부할 뿐만 아니라, 이들은 DNA 폴리머라제 분자와의 안정된 복합체를 형성할 기회가 더 적고, 이러한 추가의 차별화된 특성이 다중-부분 프라이머의 놀라운 선택성을 설명한다.
실시예 7에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 풋 서열 내 심문성 뉴클레오티드 위치 변화의 효과에 대해서도 조사하였다. 본 발명자들은 일련의 6개의 프라이머: 24-14-6:1:0, 24-14-5:1:1, 24-14-4:1:2, 24-14-3:1:3, 24-14-2:1:4, 및 24-14-1:1:5를 사용하였다. 본 발명자들은 앵커 서열의 길이, 브릿지 서열의 길이 및 풋 서열의 길이(7 뉴클레오티드)를 유지시켰으며, 풋 서열 내 심문성 뉴클레오티드의 위치만을 변화시켰다. 이들 프라이머 각각에 대해 106개의 카피의 의도된 표적(돌연변이) 및 106개의 카피의 의도되지 않은 표적(야생형)을 사용해 얻은 실시간 형광 결과가 도 12에 도시되고, CT 산출값이 표 3에 요약되어 있다. 결과는 심문성 뉴클레오티드의 위치가 풋의 3' 말단에 가까울수록, 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 사이의 구별 범위(ΔCT)가 점점 증가한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 심문성 뉴클레오티드의 바람직한 위치가 풋의 3' 말단에(이는 ARMS 구별을 가능하게 한다) 그리고 풋의 3'로부터 두 번째 뉴클레오티드에(이는 단지 하나의 염기쌍이 형성되는 것을 방지하기보다는 오히려 2개의 염기쌍이 형성되는 것을 방지하도록 한다) 있다는 것을 시사한다.
실시예 8에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열과 의도된 및 의도되지 않은 표적 서열 내 개재 서열 사이에서 형성되는 버블의 형상에 대해서도 조사하였다. 본 발명자들은 이들 2개 서열의 상대적 길이를 선택함으로써 "버블의 형상"을 변화시켰다. 검정을 수행함에 있어서, 본 발명자들은 24개의 뉴클레오티드 길이의 앵커 서열을 갖고 5:1:1 풋 서열을 갖는 일련의 프라이머를 사용하였다. 본 발명자들은 버블 원주를 32 뉴클레오티드로 유지시켰지만, (앵커의 서열을 변화시켜서 이것이 주형 분자에 하이브리드화될 때 개재 서열이 원하는 길이가 되도록 함으로써) 브릿지 서열의 길이와 개재 서열의 길이를 변화시켰다. 대칭의 버블을 형성하는 다중-부분 프라이머, 즉 14 뉴클레오티드의 브릿지 서열을 그리고 개재 서열이 14개의 뉴클레오티드 길이를 갖도록 하는 앵커 서열을 갖는 프라이머(14/14 버블)를 시험함에 더하여, 본 발명자들은 상대적으로 더 긴 브릿지 서열을 갖는 비대칭 버블(18/10 버블 및 16/12 버블) 및 상대적으로 더 짧은 브릿지 서열을 갖는 비대칭 버블(12/16 버블 및 10/18 버블)을 생성하는 다중-부분 프라이머를 시험하였다. 이들 프라이머 각각에 대해 106개의 카피의 의도된 표적(돌연변이) 및 106개의 카피의 의도되지 않은 표적(야생형)을 사용해 얻은 실시간 형광 결과가 도 13에 도시되고, CT 산출값이 표 4에 요약되어 있다. 이들 결과는 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 사이의 구별 범위(ΔCT)가 대칭의 14/14 버블에서 가장 크다는 것을 보여주지만, 단지 보통 정도로만 그러하다. 결과적으로, 본 발명의 가장 바람직한 버블은 대칭이다.
실시예 9는 (EGFR 돌연변이 L858R 대신에) 상이한 표적인 B-raf 돌연변이 V600E 및 해당 돌연변이를 위한 24-14-5:1:1 다중-부분 프라이머에 대해 실시예 4의 검정 방법을 사용하는 실험을 보고한다. 도 14는 CT 대 의도된 표적 주형의 출발 갯수의 로그의 그래프이다. 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 당해 검정은 106개의 WT 주형을 함유하는 시료와, 106개의 WT 주형 존재 하에 106개의 MUT 주형을 함유하는 시료 사이에서 23.1 주기의 ΔCT를 제공하였으며, 이는 실시예 4에서 달성된 상응하는 ΔCT 보다 훨씬 더 크다.
실시예 10은 또다른 변경을 보고하며, 이번에는 최대 10,000 카피의 야생형 표적 주형을 갖는 게놈 DNA 및 24-14-4:1:1 다중-부분 프라이머를 사용하는 PCR 증폭 및 EGFR 돌연변이 T790M을 사용한다. 도 15는 CT 대 의도된 돌연변이 표적 주형의 출발 갯수의 로그의 그래프이다. 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 검정은 104 WT 주형을 함유하는 시료와, 104 MUT 주형을 104 WT 주형 존재 하에 함유하는 시료 사이에서 12.6 주기의 ΔCT를 제공하였다.
실시예 11는 실시예 4에서의 EGFR 돌연변이 L858R에 대한 검정과 유사한 검정을 보고하며, 이는 상이한 분광형광계 열 주기 장치인 ABI PRISM 7700, 동일한 24-14-5:1:1 다중-부분 프라이머 및 플라스미드 DNA를 사용하되, 이번에는 주형을 소화시키지 않았다. 도 16은 CT 대 의도된 표적 주형의 출발 갯수의 로그의 그래프이다. 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 검정은 106개의 WT 주형을 함유하는 시료와, 106개의 MUT 주형을 106개의 WT 주형 존재 하에 함유하는 시료 사이에서 16.4 주기의 ΔCT를 제공하였다.
도 17은 실시예 12에 기재된 실험의 결과를 나타낸다. 실험은 본원에 기재된 다중-부분 프라이머의 선택성을 결정함에 있어서 효소적(ARMS-유형) 고려 사항과 비교해 열역학적 고려 사항의 상대적 기여를 입증하도록 설계되었다. 본 발명자들이 행한 것은 24-14-5:1:1 프라이머 뿐만 아니라, 3'에서 두 번째 뉴클레오티드와 말단 뉴클레오티드가 생략된 절단형 24-14-5:0:0 프라이머를 사용하여 실시예 3의 검정을 반복하는 것이었다. 따라서, 후자의 프라이머의 풋 서열은 의도된 표적 서열과 의도되지 않은 표적 서열 둘 다에 대해 완전히 상보성이었다. 도 17, 패널 A는, ARMS 뿐만 아니라 열역학적 특성을 사용해 수행되는 바와 같이, 풋/표적 하이브리드가 3' 말단에서 불안정된 24-14-5:1:1 다중-부분 프라이머를 사용해 1,000,000개의 의도된 표적 서열의 증폭과 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열의 증폭을 비교하여 2가지 유형의 주형을 구별한다. 프라이머 24-14-5:1:1의 CT 값은 의도된 표적 서열(곡선 1701)의 경우 23.1이었고, 의도되지 않은 표적 서열(곡선 1702)의 경우 40.7이었으며, 이는 17.6 주기의 ΔCT를 제공한다.
도 17, 패널 B는 풋/표적 하이브리드가 3' 말단에서 불안정되지 않은 24-14-5:0:0 프라이머를 사용해 1,000,000개의 의도된 표적 서열의 증폭과 1,000,000개의 의도되지 않은 표적 서열의 증폭을 비교한다. 프라이머 24-14-5:0:0의 CT 값은 의도된 표적 서열의 경우 39.7이었고, 의도되지 않은 표적 서열의 경우 39.4였으며, 이는 -0.3 주기의 ΔCT를 제공한다.
절단형 프라이머 24-14-5:0:0과 마찬가지로, 다중-부분 프라이머 24-14-5:1:1은 야생형 주형(곡선(1702))에서 동일한 5 뉴클레오티드를 갖는 풋 하이브리드를 형성하는데, 그 이유는 이 프라이머의 심문성 뉴클레오티드가 단일-뉴클레오티드 다형에 대해 상보성이 아니고, 그 결과로 생긴, 풋 서열의 끝에서 두 번째 위치의 미스매치된 염기쌍이 이 프라이머의 풋 서열의 연속한 3'-말단 뉴클레오티드가 단리된 염기쌍을 형성하지 못하도록 하기 때문이다. 그러나, 프라이머 24-14-5:0:0과 야생형 주형에 의해 형성된 하이브리드과, 프라이머 24-14-5:1:1과 야생형 주형에 의해 형성된 하이브리드 사이에는 차이가 존재하며, 이러한 차이는, 프라이머 24-14-5:1:1과 야생형 주형에 의해 형성된 하이브리드 내의 풋 서열은 3'로부터 두 번째 위치의 미스매치에 의해 야기되는 2개의 돌출형 뉴클레오티드를 갖고, 따라서 DNA 폴리머라제에 의한 ARMS-유형의 구별에 적용되는 반면, 프라이머 24-14-5:0:0과 야생형 주형에 의해 형성된 하이브리드 내의 절단형 풋 서열은 임의의 돌출형 3'-말단 염기쌍을 갖지 않고, 따라서 DNA 폴리머라제에 의한 ARMS-유형의 구별에 적용되지 않는다는 것이다. 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머가 사용될 때 ARMS-유형의 구별이 선택성에 있어서 중요한 역할을 한다면, 본 발명자들은 프라이머 24-14-5:0:0과 야생형 주형을 수반하는 반응의 CT 값(곡선(1704))이 프라이머 24-14-5:1:1과 야생형 주형을 수반하는 반응의 CT 값(곡선(1702))보다 더 낮을(즉, 덜 지연될) 것으로 예상했을 것인데, 그 이유는 ARMS-유형의 구별은 프라이머 24-14-5:0:0과 야생형 주형을 수반하는 반응에서는 역할을 하지 못하지만, 프라이머 24-14-5:1:1과 야생형 주형을 수반하는 반응에서는 구별의 역할을 할 수 있기 때문이다. 이들 결과는, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머가 사용될 때는 (아마도 선택성이 높은 이들 핵산 증폭 프라이머에 의해 형성되는 풋 하이브리드의 평균 존속 시간이 극히 짧아진 결과로서) ARMS-유형의 구별의 역할이 존재하지 않거나 또는 유의하게 감소한다는 것을 시사한다.
본 발명에 따른 검정은 복수의 가능한 희귀 표적 중 하나가 존재할 수 있을 때 임의의 희귀 표적의 존재를 찾아내는 스크리닝 검정을 포함할 수 있다. 이러한 검정을 위해 다중-부분 프라이머가 각각의 가능한 희귀 표적에 대해 사용되지만, 검출은 어떤 표적이 존재하는지를 확인할 필요가 없다. 따라서, SYBR Green 염료가 검출 시약으로서 사용될 수 있고, 무차별적으로 신호를 발생시키는 이중-표지된 하이브리드화 프로브가 사용될 수 있으며, 무차별적으로 신호를 발생시키는 프라이머 상의 5' 기능성 서열이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머를 사용하는 검정은 단일 반응 튜브, 반응 웰 또는 다른 반응 용기 내에서 둘 이상의 희귀 표적 서열을 동시에 증폭시키고 검출함(정량화를 포함할 수 있음)을 포함하며, 여기서는 어떤 표적 또는 표적들이 존재하는지를 확인할 필요가 있다. 서열 상동성을 갖지 않고 게놈 내의 상이한 위치에 놓인 둘 이상의 희귀 표적 서열을 단일 반응 튜브 내에서 증폭시키고 검출하는 것(예를 들면, 상이한 유전자에 위치하는 희귀한 단일-뉴클레오티드 다형의 동시 검출)은 각각의 상이한 의도된 표적 서열에 대해, 특별한, 독특하게 착색된 하이브리드화 프로브, 예를 들면, 다중-부분 프라이머로부터 다운스트림의 증폭 산물 가닥 내의 독특한 서열에 하이브리드화되는 5'-뉴클레아제(TaqMan®) 프로브 또는 분자 비콘 프로브, ResonSense® 프로브를 포함할 수 있다. 이는 자유-부동성(free-floating) 검출 프로브에 뿐만 아니라, 도 4의 분자 비콘 프로브(409)와 같은 테더링된 프로브에도 적용된다. 대안으로, 각각의 상이한 표적 서열에 대한 다중-부분 프라이머는 표지된 헤어핀, 예를 들면, 도 4의 헤어핀(404)를 포함할 수 있다. 도 4를 참조하면, 각각이 상이한 희귀한 의도된 표적 서열에 특이적이고, 각각이 독특하게 착색된 형광 표지(408, 413, 416)으로 표지된 2개 이상의 상이한 다중-부분 프라이머(103)을 사용하여 개별 시료 내에 존재하는 각각의 의도된 표적 서열을 동시에 확인 및 정량화할 수 있다.
5. 복합 검정
본 발명의 초선택적 프라이머의 특히 매력적인 특징은 동일한 임상 시료 내에서 상이한 희귀 돌연변이 서열의 존재비를 동시에 측정하는 복합 검정에서 잠재적으로 사용된다는 것이다. 이들 검정의 결과는 환자-특성적 정보를 제공하여 각각의 개체를 위한 치료요법을 조정할 수 있다.
흥미로운 복합 라벨링 전략은, 브릿지 서열과 의도된 표적 서열 사이에는 어떠한 연관성도 없기 때문에 검정 설계자가 복합 검정에서 동시에 존재하는 상이한 초선택적 프라이머 각각에 대해 뚜렷하게 다른 브릿지 서열을 자유롭게 선택한다는 사실의 발견에 기초한다. 각각의 프라이머의 전체 서열은 프라이머가 이의 돌연변이 표적에 결합할 때 생성되는 앰플리콘의 불가결한 부분이 되기 때문에, 브릿지 절편의 특징적인 핵산 서열은 그가 생성된 돌연변이 표적을 확인시키는 해당 앰플리콘 내의 "일련 번호(serial number)"로서 작용할 수 있다.
이들 확인성 브릿지 서열은 비교적 길 수 있고(예를 들면, 이들의 독특성을 보장하기 위해 20개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고), 프라이머는 그에 맞게 짧은 개재 서열을 주형 내에 형성하도록 설계될 수 있다. 임상 시료 내에 존재하는 상이한 돌연변이체 표적 서열을 동시에 검출하고 정량화하기 위해, 한 세트의 특이적 분자 비콘 프로브(문헌[Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14, 303-308, Tyagi et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16, 49-53, 및 Bonnet et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6171-6176])를 실시간 유전자 증폭 반응에 포함시킬 수 있으며, 상기 프로브는 초선택적 프라이머 중 하나의 프라이머의 특징적인 브릿지 서열의 상보물에 각각 특이적이고, 상이하게 착색된 형광단으로 각각 표지된다.
이들 반응에 있어서, 본 발명자들은 초선택적 전방향 프라이머의 농도가 제한되어야 하고, 선형 역방향 프라이머는 과량으로 존재해야 하는 것을 선호하며, 이에 의해 반응이 대칭이 되지 않을 것과, 덜 풍부한 상보성 앰플리콘과의 유의한 경쟁(문헌[Pierce et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 8609-8614]) 없이, 과량으로 합성되는 사실상 모든 표적 앰플리콘에 분자 비콘이 결합할 수 있을 것을 보장한다. 이들 복합 검정은 동일 코돈 내에서 발생하는 상이한 돌연변이들을 균등하게 구별할 수 있는데, 그 이유는, 특정 돌연변이를 검출하도록 설계된 초선택적 프라이머는 그가 야생형 표적 서열을 구별하는 것과 동일한 방식으로 이웃하는 또는 대안의 돌연변이를 구별할 것이기 때문이다.
또다른 복합 전략이 도 18에 도시되며, 이는 2개의 밀접하게 관련된 의도된 표적 서열에 대해 복합 반응에서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 2개의 다중-부분 프라이머의 개략도이다.
복합 검정에서 의도된 표적 서열 사이에 서열 상동성이 존재하는 경우, 각각의 상이한 의도된 표적 서열에 대해 독특한 브릿지 서열을 사용함으로써 특유의 서열을 도입할 수 있다. 도 2와 관련해 상기에 설명된 바와 같이, 역방향 프라이머는 전체의 전방향 (다중-부분) 프라이머를 역방향 산물 가닥으로 되도록 카피하고, 따라서 후속 증폭 주기에서 전체의 다중-부분 프라이머(앵커 서열, 브릿지 서열 및 풋 서열)는 역방향 프라이머의 신장에 의해 만들어지는 산물에 대해 상보성이다. 복합 검정에서는, 이렇게 카피된 단 하나의 다중-부분 프라이머인 "올바른(correct)" 프라이머가 그 역방향 산물 가닥에 하이브리드화되고 상기 가닥을 프라이밍하는 것이 중요하다. 따라서, "올바른" 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열을 충분히 특징적으로 만들어서 또다른 다중-부분 프라이머가 그 역방향 산물 가닥을 프라이밍(소위 "교차 하이브리드화(cross hybridization)")하지 못하도록 해야 한다는 것을 이해할 것이다. 이것이 수행되었으면, 브릿지 서열의 상보물을 기피하여 표적화되는, 특별한, 독특하게 착색된 하이브리드화 프로브, 자유-부동성 프로브 또는 프라이머는 단지 하나의 의도된 표적의 증폭을 신호할 것이고, 잘못해서 다중-부분 프라이머 자체에의 하이브리드화에 의해 신호를 발생시키지 않게 될 것이다. 유사하게, 독특하게 착색된 헤어핀 테일(도 4에서 헤어핀(405))을 갖는 "올바른" 다중-부분 프라이머만이 역방향 산물 가닥에 하이브리드화되고 신호를 발생할 것이다.
거의 동일하고(단 1개 또는 2개의 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 서로 차이가 나고) 게놈 내에서 서로 매우 가깝게 존재하는 상이한 희귀 표적 서열들(예를 들면, 사람 K-ras 유전자의 의학적으로 유의한 변이체들로서, 여기서 코돈 12 내에 상이한 단일-뉴클레오티드 다형들이 존재할 수 있고, 이들 각각은 해당 유전자의 인코딩된 단백질 내의 상이한 아미노산의 정체성(identity)을 특정한다)을 구별하고 정량화하기 위해, 도 18 또는 도 19에 도시된 구조를 갖는 2개 이상의 다중-부분 프라이머를 사용할 수 있다. 먼저 도 18로 돌아와서, 상단의 구조물(103A)는 특정한 의도된 희귀 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 다중-부분 프라이머를 나타내고, 상기 표적 서열은 상보성 뉴클레오티드 "g"(심문성 뉴클레오티드)에 상응하는 뉴클레오티드를 해당 표적 서열 내에 포함한다. 하단의 구조물(103B)는 상이한 특정의 희귀한 의도된 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 풋 서열(106B)를 갖는 다중-부분 프라이머를 나타내며, 상기 표적 서열은 풋(106A)에 대한 표적의 변이체이고, 게놈 내에서 풋(106A)에 대한 의도된 표적 서열의 위치에(또는 상기 위치에 매우 가깝게) 놓여 있다. 풋 서열(106B)에서, 뉴클레오티드 "h"는 풋(106B)의 의도된 표적 서열 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보성인 심문성 뉴클레오티드이다. 이들 희귀 표적 서열 각각의 존재비를 동일 반응에서 동시에 구별하거나 또는 구별 및 정량화할 수 있도록 하기 위해, 프라이머(103A)를 독특한 구조물(404A)에 연결시킬 수 있으며, 상기 구조물은 서열(405A, 406A) 및 형광단 표지(408A)가 프라이머(103B)의 구조물(404B) 내의 서열(405B, 406B) 및 형광단 표지(408B)와는 상이하다. 동일한(또는 매우 유사한) 위치에서 유사한 의도된 희귀 표적 서열을 구별하고 정량하기 위해 2개 이상의 다중 부분 프라이머, 예를 들면, 프라이머(103A) 및 프라이머(103B)가 동시에 사용될 때, (구별될 변이 서열이 존재하는 곳에 가까운 원하는 위치에 프라이머가 결합되도록 하기 위해) 이들의 각각의 앵커 서열은 동일하거나 또는 매우 유사한 경우가 흔히 있다. 그러나, 본 발명의 다중-부분 프라이머의 브릿지 서열과 이의 의도된 표적 서열 사이에는 어떠한 연관성도 없기 때문에, 프라이머(103A) 내의 브릿지 서열(105A)를 이의 뉴클레오티드 서열이 프라이머(103B)의 브릿지 서열(105B)와 상이하도록 선택할 수 있다. 서로 대립유전자이고 게놈 내에서 동일한(또는 매우 유사한) 위치에 놓인 희귀한 의도된 표적 서열을 구별하고 정량화하기 위해 본 발명의 2개 이상의 다중-부분 프라이머를 동시에 사용하는 방법은 이러하다:
역방향 프라이머(203)(도 2)의 신장은 표지된 구조물(404A) 및 (404B)를 통해 계속되고, 이는 각각 형광단 표지(408A) 및 (408B)로부터 켄처(407)을 분리시킨다. 그 결과로서, 프라이머(103A) 및 (103B) 각각은 이들이 앰플리콘 내에 혼입될 때 이들의 독특한 식별 색으로 형광을 발광할 것이며, 이는 이들의 형광 강도가 각각의 쇄 연장 사이클 종료 시에 실시간으로 측정되는 경우에 그러하다(PCR 증폭에서와 같이 앰플리콘이 이중-가닥이 되는 증폭 반응에서). 대안으로, 프라이머(103A) 및 (103B) 각각은 이들의 형광 강도가 증폭 반응의 어닐링 스테이지 종료 시에 측정될 때 이들의 독특한 식별 색으로 형광을 발광할 것인데, 그 이유는 각각의 프라이머(103A 또는 103B)가 동일 프라이머의 혼입에 의해 합성이 개시된 이들의 앰플리콘 가닥(204)(도 2)의 3' 말단에서 이의 완전히 상보성인 서열에 결합된 결과로서 이들의 켄처 그룹(407)이 이들의 형광단 표지(408A) 또는 (408B)로부터 분리되어지기 때문이다.
도 19는 표지된 헤어핀 테일이 아닌 자유-부동성 분자 비콘 프로브를 사용하는 유사한 검정을 위한 프라이머 및 프로브를 나타낸다. 도 19에서 다중-부분 프라이머(1903A)는 심문성 뉴클레오티드 "r"을 포함하는, 특정한 제1의 의도된 희귀한 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 풋 서열(1906A)를 갖는다. 다중-부분 프라이머(1903B)는 상이한 특정한 제2의 희귀 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 풋 서열(1906B)를 갖고, 상기 제2의 희귀 표적 서열은 풋 서열(1906A)에 대한 표적의 변이체이고, 게놈 내에서 풋(1906A)의 의도된 표적 서열의 위치에(또는 상기 위치에 매우 가깝게) 놓여 있다. 풋 서열(1906B)에서, 뉴클레오티드 "s"는 심문성 뉴클레오티드이다. 이 실시형태에서 심문성 뉴클레오티드 "r"은 제2의 희귀 표적 서열에 또는 야생형 서열에 대해 상보성이 아니다. 또한 심문성 뉴클레오티드 "s"는 제1의 희귀 표적 서열에 또는 야생형 서열에 대해 상보성이 아니다. 동일 반응 내에서 2개의 희귀 표적 서열의 증폭 산물을 구별하고, 뿐만 아니라 교차 하이브리드화를 방지할 수 있도록 하기 위해, 브릿지(1905A)의 서열을 브릿지(1905B)의 서열과 매우 다르게 만든다. 루프(1908A), 스템(1909A), 형광단(1910A) 및 켄처(1911A)로 구성된 분자 비콘 프로브(1907A)는 브릿지 서열(1905A)의 상보물에 특이적인 루프를 갖는다. 루프(1908B), 스템(1909B), 형광단(1910B) 및 켄처(1911B)로 구성된 분자 비콘 프로브(1907B)는 브릿지 서열(1905B)의 상보물에 특이적인 루프를 갖는다. 형광단(1911A) 및 형광단(1911B)는 상이한 색이다. 프로브(1907A, 1907B)에 의한 검출은 실시간 또는 종말점일 수 있다.
상이한 희귀한 의도된 대립유전자 표적 서열로부터 생성되는 상이한 앰플리콘의 동시 실시간 측정을 가능하게 하는 핵심적 특징은 본 발명의 다중-부분 프라이머를 이들의 표지된 헤어핀 테일(예를 들면, 404A 및 404B)에 그리고 이들의 브릿지 서열(예를 들면, 105A 및 105B)에 매우 다른 서열을 갖도록 설계할 수 있다는 것이다. 결과적으로, 어닐링 조건을 조정하여 각각의 유형의 프라이머가 동일 유형의 프라이머에 의해 합성이 개시된 앰플리콘에만 유일하게 결합하는 것을 보장할 수 있다. 게다가, 만약 특정 유형의 프라이머가 비-동족 앰플리콘에 결합된다면, 해당 프라이머 말단의 신호 헤어핀이 해당 앰플리콘의 3' 말단 서열에 대해 상보성이 아닐 것이며, 따라서 형광이 발광되지 않을 것이다. 반응물 내에 동시에 존재하게 될 각각의 다중-부분 프라이머를 위한 상이한 브릿지 서열의 사용을 단순화하기 위한 대안으로서, 앵커 서열을 단축시키거나 또는 이를 표적을 따라서 활주시킴으로써 상이한 앵커 서열을 사용할 수 있다. 대안으로, 상이한 길이의 브릿지 서열(예를 들면, 105A 및 105B)은 각각의 프라이머의 선택성을 유의하게 변경시키지 않으면서 상이한 앵커 서열(예를 들면, 104A 및 104B)의 사용을 가능하게 할 것이다. 이는 프라이머(103B)에 대한 프라이밍 서열을 함유하는 비-동족 앰플리콘과 프라이머(103A) 사이에서 미스매치된 하이브리드가 형성될 확률을 감소시킬 것이며, 뿐만 아니라 프라이머(103B)에 대한 프라이밍 서열을 함유하는 비-동족 앰플리콘과 프라이머(103B) 사이에서 미스매치된 하이브리드가 형성될 확률도 감소시킬 것이다.
6. 다중-부분 프라이머의 설계를 위한 추가의 고려 사항
본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 설계는 간단하다. 본 발명자들은 특정한 증폭 프로토콜에 대해서는 특정한 기기 상에서의 설계를 권고하는데, 그 이유는 기기마다 특히 형광 검출 및 표시에서 차이가 나기 때문이다. 적합한 절차는 디자인을 선택하는 것으로, 이는 앵커 길이, 브릿지 길이 및 풋 길이이며, 상기 풋의 3'-말단 뉴클레오티드에 또는 상기 풋의 3' 말단으로부터 두 번째 뉴클레오티드에 심문성 뉴클레오티드가 위치한다. 이어서, 브릿지 서열 길이 및 풋 서열 길이를 몇번의 시도로 간단히 변화시킴으로써, 의도된 표적을 함유하는 시료와 의도되지 않은 표적을 함유하는 시료 사이에서 원하는 큰 ΔCT를 달성하도록 프라이머 디자인을 최적화할 수 있다. 이는 프라이머가 의도된 표적 서열의 증폭에 대해 비효율적이 되도록 하는 것을 수반한다. 설계를 위한 고려 사항은 실시예와 관련해 상기에 논의된 것들이다. 특히, 풋 서열을 짧게 하는 것과 브릿지 서열 및 표적의 개재 서열에 의해 형성되는 버블의 크기를 증가시키는 것은 의도된 표적에서의 CT 지연을 증가시키고, 의도된 표적을 함유하는 시료와 의도되지 않은 표적을 함유하는 시료 사이의 ΔCT를 증가시킨다.
본 발명의 다중-부분 프라이머를 설계함에 있어서 추가의 고려 사항이 존재한다. 프라이머는 시료 내에 존재하거나 또는 존재할 수 있는 다른 서열을 프라이밍하지 않아야 한다. 이를 방지하기 위한 통상적인 컴퓨터 방법이 익히 공지되어 있으며 쉽게 이용가능하다.
a. 앵커 서열
앵커 서열은 보통(그러나 필수적인 것은 아님) 주형 서열에 대해 완전히 상보성이고, 보통 풋 서열의 5' 말단으로부터 대략 14개의 뉴클레오티드에 위치할 수 있으며, 보통 15 내지 40개, 15 내지 30개 또는 20 내지 30개(예를 들면, 20 내지 24개)의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 이의 길이는 앵커 서열이 주형과 함께 형성하는 하이브리드의 용융 온도가 적합한 범위, 예를 들면, 일부 실시예에서 66℃ 내지 72℃가 되도록 선택된다.
특정한 다형을 구별하도록 설계된 다중-부분 프라이머 내의 앵커 서열이, 이의 표적 서열이 게놈 내의 다른 곳에 존재하는 이유로 충분히 특이적이지 않을 경우, 이러한 문제점은 동일한 다형을 구별하지만 상보성 표적 가닥에 결합하는 다중-부분 프라이머를 설계함으로써 해결될 수 있다.
b. 브릿지 서열
브릿지 서열과 관련하여, 본 발명자들은 브릿지 서열이 표적과의 저-Tm 하이브리드를 형성할 수 있는 경우 발생할 수 있는 일시적인 하이브리드화 사건을 검사하고, 필요하다면, 이를 제거함으로써 이의 유효 길이를 감소시킬 것을 권고한다. 또한, 상이한 뉴클레오티드 서열은 다소 상이한 강성을 갖기 때문에, 브릿지 서열의 강성을 조정함으로써 브릿지의 효과를 변경할 수 있다. 문헌[Goddard et al. (2000) Phys. Rev. Lett. 85:2400-2403]을 참조한다.
일례로, 브릿지 서열은 대략 6개 이상(예를 들면, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20개)의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 이의 뉴클레오티드 서열은, 어닐링 조건 하에: (i) 상기 서열이 (풋 표적 서열과 앵커 표적 서열 사이에 위치하는) 주형 가닥 내의 상응하는 "개재 서열"과 하이브리드화되지 않고; (ii) 상기 서열이 사람 게놈 내의 임의의 서열에 하이브리드화되지 않으며; (iii) 상기 서열이 검정 조건 하에 이의 길이를 유효하게 단축시키게 될 임의의 제2 구조물을 형성하지 않고; (iv) 상기 서열이 상보성 주형 가닥의 합성의 프라이밍에 사용되는 통상적인 역방향 프라이머에 하이브리드화되지 않는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 추가로, 주형 가닥 내의 개재 서열이 검정 조건 하에 이의 길이를 유효하게 단축시키는 제2의 구조물을 형성할 수도 있을 경우에는, 브릿지 서열의 길이를 증가시킬 수 있고, 상응하는 뉴클레오티드 수 만큼 개재 서열의 길이를 감소시킬 수 있다(이는 동일한 뉴클레오티드 수 만큼 풋 표적 서열에 더 가까운 앵커 표적 서열을 선택함으로써 성취된다).
브릿지 서열을 상대적으로 짧게 되도록 또는 상대적으로 길게 되도록 선택할 수 있다는 것의 발견, 그리고 프로브 설계자가 브릿지 절편을 위해 어느 임의적인 서열이든 선택할 수 있다는 것의 발견은 본 발명의 초선택적 프라이머의 설계를 위한 많은 기능적 가능성을 열어 놓았다.
예를 들면, 주형 내에 자연적으로 존재하는 추정상의 개재 서열이 검정 조건 하에 제2의 구조물을 형성할 수도 있는 서열인 경우에는, 프라이머-주형 하이브리드 내에 상대적으로 작은 개재 서열을 생성하도록 프라이머를 설계함으로써 제2의 구조물의 형성을 방해할 수 있고, 프라이머의 브릿지 서열을 상대적으로 더 긴 길이가 되도록 선택함으로써 검정의 선택성을 유지시킬 수 있다(표 4에 나타낸 결과 참조). 그 외에, 개재 서열과 브릿지 서열의 가요성의 차이를 고려한 브릿지 서열을 선택함으로써 프라이머 기능을 미세-조정할 수 있다.
또한, 초선택적 프라이머를 위한 적절한 브릿지 서열의 선택은 잘못된 앰플리콘, 예를 들면, 프라이머-이량체의 생성을 명백하게 억제한다. 통상적인 선형 프라이머(상기 프라이머의 서열은 그가 결합하는 주형에 의해 결정된다)의 설계와는 달리, 임의적인 서열이 브릿지 절편을 위해 사용된다. 본 발명자들은: (i) 제2의 구조물을 형성하지 않고; (ii) 주형의 서열, 게놈 DNA의 서열 및 통상적인 역방향 프라이머의 서열과는 무관하며; (iii) 전체-길이의 프라이머 내에 혼입될 때 프라이머가 자가-하이브리드화할 수 없도록 하는 브릿지 서열을 선택하기 위해 주의한다.
c. 브릿지 서열 및 개재 서열에 의해 형성되는 버블의 역할
상기에 기재된 허용가능한 범위 내에서, 초선택적 프라이머의 원래의 주형 분자에의 하이브리드화에 의해 형성되는 버블의 원주가 클수록, 돌연변이 앰플리콘 합성의 억제와 비교해 야생형 앰플리콘 합성의 억제가 더 커진다(예를 들면, 도 11 참조). 열역학적 관점에서, 더 큰 버블은 야생형 하이브리드과 돌연변이 하이브리드 둘 다의 평형 존재비를 감소시킬 것이지만 이들의 상대적 존재비를 변경시키지는 않을 것이다. 그러나, 동역학적 관점에서, 버블이 반응 혼합물 내에서 물 분자의 무작위적인 브라운 운동을 수행하기 때문에, 풋 하이브리드를 표적 하이브리드에 접속시키는 버블에 충돌하는 힘을 고려하는 것이 적절하다. 이는 풋 하이브리드를 떼어내는 잠재력을 갖는 힘을 생성한다. 버블의 원주가 클수록 이러한 잠재적으로 분열시키는 힘이 더 커진다. 게다가, 완전히 상보성인 돌연변이 하이브리드보다 더 약한 미스매치된 야생형 하이브리드는 탈리될 가능성이 더 크다.
따라서, 미스매치된 야생형 하이브리드는 이들의 안정성이 더 낮음으로 인해 더 짧은 기간 동안 존재할 뿐만 아니라, 이들은 또한 버블에 충돌하는 무작위적 힘에 의해 더 쉽게 탈리된다. 따라서, 본 발명자들은, 초선택적 프라이머의 놀라운 선택성은 하이브리드 안정성을 좌우하는 열역학적 요인과 그 결과로 생긴 하이브리드의 평균 존속 기간을 좌우하는 동역학적 요인 둘 다에 기인한다는 것을 신뢰한다.
d. 풋 서열
풋 서열은 프라이머의 3' 말단에 위치하고; 이는 의도된 표적 서열과 이의 밀접하게 관련된 의도되지 않은 표적 서열 사이의 하나 이상의 뉴클레오티드 차이, 예를 들면, 단일-뉴클레오티드 다형이 위치하는 주형 가닥 영역에 대해 상보성이며; 이는 보통 7개의 뉴클레오티드 길이이다. 풋 서열 내의 "심문성 뉴클레오티드"는 풋 서열의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 또는 풋 서열의 3' 말단에 위치할 수 있다. 풋 서열의 길이를 변경시켜 선택성을 개선할 수 있다. 풋 서열은 특히 그가 높은 G-C 함량을 갖는 경우 더 짧을 수 있다(6 또는 심지어 5개의 뉴클레오티드 길이). 심문성 뉴클레오티드가 야생형 주형 가닥과의 G:T 염기쌍을 형성한다면, 상기 뉴클레오티드를 오히려 상보성 주형 가닥에 결합하도록 프라이머를 설계하는 것이 바람직하다.
풋 서열이 표적 서열에 하이브리드화된다면, 그리고 하이브리드가 탈리되기 전 DNA 폴리머라제가 그 하이브리드과의 기능적 복합체를 형성할 수 있다면, 풋 서열의 신장이 DNA 폴리머라제에 의해 촉매되어 앰플리콘이 생성될 수 있다. 짧은 풋 서열, 예를 들면, 6 또는 7개의 뉴클레오티드 길이의 풋 서열은 일반적으로 매우 짧아서, 이들이 피험 시료 내에, 예를 들면, 사람 세포로부터의 게놈 DNA 내에 존재할 수 있는 핵산 내에 많은 상이한 위치들에 존재하는 서열들에 대해 상보성이라는 것을 이해할 것이다. 그러나, 풋 서열이 너무 짧고 그 결과 증폭에 사용되는 조건, 예컨대 PCR 검정에서 사용되는 조건 하에 극도로 낮은 용융 온도 Tm을 갖는 경우에는, 프라이머의 앵커 서열이 원하는 표적 서열로부터 단지 몇 뉴클레오티드 떨어져 있는 피험 핵산 내 위치에 먼저 하이브리드화되지 않는다면, 풋 서열은 피험 핵산 시료 내의 어떠한 완전히 상보성인 서열과도 하이브리드를 형성하지 않을 것이다.
일단 본원에 개시된 방식으로 설계되면, 임의의 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, 올리고애널라이저(OligoAnalyzer) 컴퓨터 프로그램(미국 아이오와주 코랄빌 소재의 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies))의 도움으로 프라이머 서열을 조사하여, 검정 조건 하에 이들이 내부의 헤어핀 구조물 또는 자가-이량체를 형성할 가능성이 없음을 보장하고, 이들이 통상적인 역방향 프라이머와의 이형이량체를 형성하지 않음을 보장할 수 있다.
7. 키트
본 발명은, 증폭 및 검출 방법을 포함하여 상기에 기재된 증폭 방법을 수행하기 위한 시약을 함유하는 시약 키트를 추가로 포함한다. 상기 목적을 위해, 본원에 개시된 방법을 위한 반응 구성성분들 중 하나 이상을 표적 핵산 검출에서의 사용을 위한 키트 형태로 공급할 수 있다. 이러한 키트에서, 하나 이상의 반응 구성성분의 적정량이 하나 이상의 용기에 제공되거나 또는 (예를 들면, 정전기 상호작용 또는 공유 결합에 의해) 기재(substrate) 상에 고정된다.
본원에 기재된 키트는 상기에 기재된 프라이머들 중 하나 이상을 포함한다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 프라이머를 함유하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 단일 용기 내의 단일 프라이머, 동일 프라이머를 함유하는 복수의 용기, 2개 이상의 상이한 본 발명의 프라이머를 함유하는 단일 용기, 또는 상이한 프라이머를 함유하거나 2개 이상의 프라이머의 혼합물을 함유하는 복수의 용기를 함유할 수 있다. 프라이머 및 용기의 모든 조합 및 순열이 본 발명의 키트에 의해 포함된다.
키트는 또한 상기에 기재된 방법의 실시를 위한 추가의 재료를 함유한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 발명에 따른 프라이머를 사용하는 방법의 수행을 위한 시약, 재료 일부 또는 전부를 함유한다. 따라서, 키트는 본 발명의 프라이머를 사용하는 PCR 반응의 수행을 위한 시약 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 키트의 구성성분 일부 또는 전부를 본 발명의 프라이머를 함유하는 용기(들)과 별개 용기에 제공할 수 있다. 키트의 추가의 구성성분의 예에는 하나 이상의 상이한 폴리머라제, 대조 핵산에 또는 표적 핵산에 특이적인 하나 이상의 프라이머, 대조 핵산에 또는 표적 핵산에 특이적인 하나 이상의 프로브, 중합 반응을 위한 (1X 또는 농축된 형태의) 완충액, 및 중합 산물의 검출을 위한 하나 이상의 염료 또는 형광 분자가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 키트는 또한 다음 구성성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 지지체, 종결 시약, 변경 시약 또는 소화 시약, 삼투물질, 및 검출 프로브 검출용 장치.
증폭 및/또는 검출 공정에서 사용되는 반응 구성성분은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 구성성분(예를 들면, 효소, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 프로브 및/또는 프라이머)은 수용액 중에 현탁될 수 있거나 또는 냉동-건조된 또는 동결건조된 분말, 펠릿 또는 비드일 수 있다. 후자의 경우, 구성성분은 재구성 시, 검정에서의 사용을 위한 완전한 성분 혼합물을 형성한다.
키트 또는 시스템은 본원에 기재된 구성성분들의 임의의 조합을 하나 이상의 검정에 충분한 양으로 함유할 수 있으며, 구성성분들의 사용에 대한 유형의 형태로 기록된 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 적용분야에서, 하나 이상의 반응 구성성분은 전형적으로는 1회용인 개별 튜브 또는 이와 동등한 용기 내에 사전-측량된 단일 사용량으로 제공될 수 있다. 이러한 배열을 사용하면, 표적 핵산의 존재에 대해 시험될 시료가 개별 튜브에 첨가될 수 있어서 증폭이 곧바로 수행될 수 있다. 키트에 공급되는 구성성분의 양은 임의의 적정한 양일 수 있으며, 이는 제품이 추구하는 목표 시장에 의존할 수 있다. 적정량을 결정하기 위한 일반적인 가이드라인은, 예를 들면, 문헌[Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 및 Frederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법의 실시에 유용한 다수의 추가 시약 또는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질에는 세포의 용해를 위한 시약(완충액을 포함함), 2가 양이온 킬레이트제 또는 원치않는 뉴클레아제를 저해하는 다른 약제, 프라이머, 폴리머라제 및 반응의 다른 구성성분이 적절하게 기능하고 있음을 보장하는 데 사용하기 위한 대조 DNA, DNA 단편화 시약(완충액을 포함함), 증폭 반응 시약(완충액을 포함함) 및 세척 용액이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 키트는 임의의 온도에서 제공될 수 있다. 예를 들면, 액체 중의 단백질 성분 또는 이의 착화합물을 함유하는 키트의 저장을 위해서는, 이들을 0℃ 미만, 바람직하게는 -20℃ 또는 그 미만, 또는 그렇지 않으면 냉동 상태로 제공하고 유지시키는 것이 바람직하다.
구성성분이 공급되는 용기(들)는 공급된 형태를 유지시킬 수 있는 임의의 통상적인 용기, 예를 들면, 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube), 앰풀, 병, 또는 일체형 시험 장치, 예컨대 유체 장치, 카트리지, 측면 유동 장치 또는 다른 유사한 장치일 수 있다. 키트는 표적 핵산의 증폭 또는 검출에서의 사용을 위한 표지되거나 표지되지 않은 핵산 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 방법, 예를 들면, 핵산 추출 및/또는 정제 없이 조악한 매트릭스를 사용하는 방법 중 어느 것에 구성성분들을 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 또한 용기 또는 용기들의 조합물을 수용하기 위한 패키징 재료를 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 시스템을 위한 전형적인 패키징 재료는 다양한 구성형태 중 어느 것(예를 들면, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 웰, 마이크로어레이 등)에 반응 구성성분 또는 검출 프로브를 수용하는 고체 매트릭스(예를 들면, 유리, 플라스틱, 종이, 호일, 미세입자 등)를 포함할 수 있다.
8. 추가의 정의
본원에서 사용된 용어 "표적 핵산" 또는 "표적 서열"은 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산을 나타낸다. 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 종종 DNA, RNA, DNA 또는 RNA의 유도체 또는 이들의 조합이다. "표적 핵산 서열", "표적 서열" 또는 "표적 영역"은 단일-가닥 핵산의 서열 일부 또는 전부를 포함하는 특정 서열을 의미한다. 표적 서열은 핵산 주형 내에 있을 수 있으며, 상기 주형은 임의의 형태의 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산일 수 있다. 주형은 정제되거나 단리된 핵산일 수 있거나, 또는 정제되지 않거나 단리되지 않은 핵산일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "증폭" 및 이의 변형은 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분의 복수의 카피 또는 상보물을 생성하기 위한 임의의 공정을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드를 전형적으로 "주형"이라 한다. 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 주어진 주형의 증폭은 폴리뉴클레오티드 증폭 산물의 군집의 생성을 초래할 수 있으며, 상기 증폭 산물을 통칭하여 "앰플리콘"이라 한다. 앰플리콘의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 전형적으로, 주형은 표적 서열을 포함할 것이며, 수득되는 앰플리콘은 표적 서열과 실질적으로 동일하거나 표적 서열에 실질적으로 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 특정 앰플리콘의 폴리뉴클레오티드들은 서로 실질적으로 동일하거나 또는 서로에 대해 실질적으로 상보성이고; 대안으로, 일부 실시형태에서, 주어진 앰플리콘 내의 폴리뉴클레오티드들은 서로 다른 뉴클레오티드 서열들을 가질 수 있다. 증폭은 선형 또는 지수적 방식으로 진행될 수 있으며, 주어진 주형의 반복적이고 연속적인 복제를 수반하여 둘 이상의 증폭 산물을 형성할 수 있다. 일부 전형적인 증폭 반응은 순차적이고 반복적인 주형-기반 핵산 합성 주기를 수반하며, 이는, 주형의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 함유하고 주형과의 적어도 어느 정도의 뉴클레오티드 서열 동일성(또는 상보성)을 공유하는 다수의 딸 폴리뉴클레오티드의 형성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 증폭의 "주기(cycle)"라 불릴 수 있는 각각의 핵산 합성 사례는 (예를 들면, dsDNA의 하나의 가닥을 니킹(nicking)함으로써) 자유 3' 말단을 생성하여 프라이머 및 프라이머 신장 단계를 조성하는 것을 포함하고; 임의로, 추가의 변성 단계가 또한 포함될 수 있으며, 여기서 주형이 부분적으로 또는 완전히 변성된다. 일부 실시형태에서, 하나의 라운드의 증폭은 주어진 반복 횟수의 단일 증폭 주기를 포함한다. 예를 들면, 하나의 라운드의 증폭은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 또는 그 이상의 특정 주기의 반복을 포함할 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 증폭은 특정한 폴리뉴클레오티드 주형이 2회의 연속적인 핵산 합성 주기를 수행하는 모든 반응을 포함한다. 합성은 주형-의존성 핵산 합성을 포함할 수 있다.
용어 "프라이머" 또는 "프라이머 올리고뉴클레오티드"는, 주형 핵산에 하이브리드화될 수 있고 핵산 합성을 위해 주형 핵산의 조성에 따라 신장 뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 개시 지점으로서 작용할 수 있는 핵산 가닥 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. "신장 뉴클레오티드"는 증폭 동안 신장 산물 내에 혼입될 수 있는 임의의 뉴클레오티드, 즉 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA의 유도체를 나타내며, 이는 표지를 포함할 수 있다.
"하이브리드화" 또는 "하이브리드화하다" 또는 "어닐링하다"란 완전히 또는 부분적으로 상보성인 핵산 가닥들이 특정한 하이브리드화 조건(예를 들면, 엄격한 하이브리드화 조건)하에서 평행 또는 바람직하게는 역평행 방향으로 합쳐져서, 2개의 구성 가닥이 수소 결합에 의해 연결된 안정한 이중-가닥 구조물 또는 영역(때때로 "하이브리드"이라 부름)을 형성하는 능력을 나타낸다. 수소 결합이 전형적으로 아데닌 및 티민 또는 우라실(A 및 T 또는 U) 또는 시토신 및 구아닌(C 및 G) 사이에서 형성되긴 하지만, 다른 염기쌍이 형성될 수 있다(예를 들면, 문헌[Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 11th ed., 1992]).
용어 "엄격한 하이브리드화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 프로브 또는 올리고머가 이의 의도된 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화되고 또다른 서열에는 하이브리드화되지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 익히 공지된 요인, 예를 들면, GC 함량 및 서열 길이에 따라 가변적일 수 있으며, 분자 생물학에서의 통상의 숙련가에게 익히 공지된 표준 방법을 사용하여 실험적으로 예측 또는 결정될 수 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Ch. 11, pp. 11.47-11.57, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)] 참조).
본원에 기재된 바와 같이, 다수의 값의 범위가 제공된다. 문맥에서 별도의 명확한 지시가 없는 한, 해당 범위의 상한치와 하한치 사이의 각각의 개재 값이 또한, 하한치 단위의 10분의 1까지 구체적으로 기재된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위 내의 개재 값과, 임의의 다른 언급된 값 또는 언급된 범위 내의 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 속한다. 이들 더 작은 범위의 상한치와 하한치는 범위 내에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있고, 상기 더 작은 범위에 한계치 중 어느 하나 또는 이들 둘 다가 포함되거나 또는 이들 둘 다 포함되지 않은 각각의 범위가 또한 본 발명 내에 속하며, 언급된 범위에서 어느 특정하게 배제된 한계치에 적용된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 이들 둘 다를 배제시킨 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
용어 "약"은 일반적으로, 지시된 숫자의 ±10%를 나타낸다. 예를 들면, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 1"은 0.9 내지 1.1을 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미, 예컨대 반올림이 문맥으로부터 명백할 수 있으며, 따라서 예를 들면, "약 1"은 0.5 내지 1.4를 의미할 수도 있다.
실시예
실시예 1: EGFR 돌연변이 L858R 및 통상의 선형 프라이머
단일-뉴클레오티드 다형에 의해 서로 차이가 나는, EGFR 돌연변이 L858R을 함유하는 플라스미드 DNA 또는 상응하는 야생형 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 주형으로서 사용하여 2가지의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 통상의 전방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 49개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 증폭 산물을 생성하였다. 전방향 프라이머(FP)는, 프라이머 서열 중간 부근에 심문성 뉴클레오티드를 함유하는 통상의 프라이머였다. 역방향 프라이머(RP)는, 표적 서열들 둘 다에 대해 완전히 상보성인 통상의 프라이머였다. 프라이머 서열, 및 돌연변이체 대립유전자를 갖는 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
FP: 5'-ATTTTGGGC G GGCCAAACTGC-3' (서열번호 1)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C CCG GTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
전방향 프라이머 서열에서, 돌연변이체 표적 주형에 대해 상보성이지만 야생형 주형에 대해 미스매치되는 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머에 대한 결합 부위가 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 돌연변이체 대립유전자에 결합된 전방향 프라이머의 Tm 산출값은 67.5℃이고, 역방향 프라이머에 대한 Tm 산출값은 64.0℃이다.
EGFR L858R 돌연변이 또는 상응하는 EGFR 야생형 서열을 함유하는 115개의 염기 쌍 EGFR 유전자 단편을, pGEM-11Zf(+) 벡터(프로메가(Promega)) 내에 삽입함으로써 플라스미드를 제조하였다. 돌연변이체 및 야생형 플라스미드 DNA를, 제한 엔도뉴클레아제 Mse I(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))을 사용하여 소화시켰다. 소화 혼합물은, 5mM KAc, 2mM Tris-Ac(pH 7.9), 1mM MgAc, 1% 소 혈청 알부민, 및 100μM 디티오트레이톨을 함유한 20㎕ 부피 중에서 10 단위의 Mse I 및 4㎍의 돌연변이체 또는 야생형 게놈 DNA를 함유하였다. 상기 반응물을 37℃에서 120분 동안 항온배양한 후 65℃에서 20분 동안 항온배양하여 효소를 불활성화시켰다.
50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 3mM MgCl2, 1.5 단위의 AmpliTaq Gold DNA 폴리머라제(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)), 250μM의 각각의 4개의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 60nM의 각각의 프라이머, 및 1x SYBR® Green(라이프 테크놀로지즈)을 함유하는 30㎕ 부피 중에서 PCR 증폭을 수행하였다. 이 시리즈에서, 반응 혼합물은 106개의 카피의 돌연변이체 주형(MUT) 또는 106개의 카피의 야생형 주형(WT)을 함유하였다. 증폭은, Bio-Rad IQ5 분광형광계 열 주기 장치 내에서 0.2㎖ 폴리프로필렌 PCR 튜브(백색)를 사용하여 수행되었다. 열-순환 프로파일은 95℃에서 10분, 이어서, 94℃에서 15초 동안 60 주기, 60℃에서 15초 동안, 그리고 72℃에서 20초 동안이었다. SYBR® Green 형광 강도를 각각의 쇄 연장 스테이지 종료시 측정하였다(72℃).
실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 5에 도시되고, 여기서, 곡선(501)은, 106개의 MUT 주형을 함유하는 반응물이고, 곡선(502)은, 106개의 WT 주형을 함유하는 반응물이다. 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 이들 값은 20.0(곡선(501)) 및 19.7(곡선(502))이었다. 그래프 왼쪽 상단의 그래프는, 중앙에 심문성 뉴클레오티드(원)를 갖는 통상의 전방향 프라이머(직선)의 개략도이다.
실시예 2: EGFR 돌연변이 L858R, 및 3'-말단 심문성 뉴클레오티드를 갖는 통상의 선형 프라이머
실시예 1에 기재된 돌연변이체(MUT) 및 야생형(WT) 주형을 사용하여 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 이 실험에서, 전방향 프라이머는 "ARMS 프라이머", 즉, 돌연변이체 주형에 대해 완전히 상보성이지만, WT 주형에 대해 미스매치되는 3'-말단을 갖는, 즉, 프라이밍 서열의 3' 말단에 심문성 뉴클레오티드를 갖는 프라이머이다. 본 발명자들은, 실시예 1에서와 동일한 역방향 프라이머를 사용하였다. 프라이머 서열, 및 돌연변이체 대립유전자를 갖는 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
FP: 5'-CAAGATCACAGATTTTGGGC G -3' (서열번호 4)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG
C CCGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5'(서열번호 2)
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
전방향 프라이머 서열에서, 돌연변이체 표적 주형에 대해 상보성이지만 야생형 주형에 대해 미스매치되는 뉴클레오티드는 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머에 대한 결합 부위는 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열은 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드는 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 돌연변이체 대립유전자에 결합된 전방향 프라이머의 Tm 산출값은 60.7℃이고, 역방향 프라이머에 대한 Tm 산출값은 64.0℃이다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 6, 패널 A에 도시되고, 여기서, 곡선(601)은, 106개의 MUT 주형을 사용하여 출발된 반응물이고, 곡선(602)은, 106개의 WT 주형을 사용하여 출발된 반응물이다. 검정 기기는, 각각의 곡선에 대한 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 이들 값은 19.4(곡선(601)) 및 30.4(곡선(602))이고, 이는 11 주기의 ΔCT를 초래한다. 그래프 왼쪽 상단에 프라이머의 3' 말단에 위치하는 심문성 뉴클레오티드(원)를 갖는 통상의 전방향 프라이머(직선)의 개략도가 있다.
상기에 기재된 실험을, 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 심문성 뉴클레오티드를 갖는 전방향 프라이머를 사용하여 반복하였다(본 발명자들은 프라이머의 3' 말단에 G를 첨가하고, 5'-말단의 C를 제거하여 프라이머 길이를 유지하였다). 수득된 전방향 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
FP: 5'-AAGATCACAGATTTTGGGC G G-3' (서열번호 5)
인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램 및 상기에 기재된 것과 동일한 반응 조건을 사용하여, 돌연변이체 대립유전자에 결합된 전방향 프라이머의 Tm 산출값은 61.9℃였다.
실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 6, 패널 B에 도시되며, 여기서, 곡선(603)은, 106개의 MUT 주형을 사용하여 출발된 반응물이고, 곡선(604)은, 106개의 WT 주형을 사용하여 출발된 반응물이다. 기계-산출된 CT 값은 19.1(곡선(603)) 및 27.8(곡선(604))이었고, 이는 8.8 주기의 ΔCT를 초래한다. 그래프 왼쪽 상단에 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 놓인 심문성 뉴클레오티드(원)를 갖는 통상의 전방향 프라이머(직선)의 개략도가 있다.
실시예 3: EGFR 돌연변이 L858R 및 24-14-5:1:1 다중-부분 프라이머(실시간 데이터)
실시예 1에 기재된 돌연변이체(MUT) 및 야생형(WT) 주형을 사용하여 2가지의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 이 실험에서, 전방향 프라이머(FP)는, 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머이다. 본 발명자들은, 실시예 1에서와 동일한 역방향 프라이머를 사용하였다.
본 발명자들의 명명법에 있어서, 당해 실시예에서 사용된 다중-부분 프라이머는 24-14-5:1:1 프라이머로서 나타내고, 이는, 24개의 뉴클레오티드 길이인 앵커 서열, 14개의 뉴클레오티드 길이인 브릿지 서열, 및 7개의 뉴클레오티드 길이인 풋 서열을 나타내며, 상기 풋 서열은 풋의 5' 말단으로부터, MUT와 WT 표적 둘 다에 대해 상보성인 5개의 뉴클레오티드, WT 표적 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성이 아니지만 MUT 표적 내의 상응하는 뉴클레오티드에 대해 상보성인 1개의 심문성 뉴클레오티드, 그리고, 마지막으로 둘 다의 표적에 대해 상보성인 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 심문성 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단의 안쪽에 있는 하나의 뉴클레오티드에 위치하기 때문에, 본 발명자들은 이 뉴클레오티드를 "3'에서 두 번째 위치"에 놓여 있다고 한다. 앵커의 결합 서열과 풋의 결합 서열 사이에 놓인 표적 서열 영역(상기 영역을 본 발명자들은 "개재 서열"이라 부른다)과 브릿지 서열을 비교하면, 당해 실시예에서 개재 서열은 브릿지 서열과 동일 길이의 14개의 뉴클레오티드 길이임이 나타난다. 브릿지 서열의 서열을, 개재 서열에 대해 상보성이 아니도록 선택하여, 프라이머 어닐링 동안 브릿지 서열의 개재 서열에의 하이브리드화를 방지한다. 앵커 서열과 풋 서열이 둘 다 주형에 하이브리드화될 때 브릿지 서열과 개재 서열은 서로에 어닐링되는 대신에 단일-가닥의 "버블"을 형성한다. "버블의 원주"는, 브릿지 서열 내의 뉴클레오티드 수 + 개재 서열 내의 뉴클레오티드 수 + 앵커 서열의 3' 뉴클레오티드 및 이의 상보물 + 풋 서열의 5'-말단 뉴클레오티드 및 이의 상보물의 합으로서 정의된다. 결과적으로, 당해 실시예에서 다중-부분 프라이머가 당해 실시예에서 사용된 주형 분자에 결합함으로써 형성된 버블의 원주는 14 + 14 + 2 + 2이고, 이는 32개의 뉴클레오티드의 길이와 같다.
프라이머 서열, 및 돌연변이체 대립유전자를 갖는 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 주형에의 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 7에 도시되고, 여기서, 곡선(701)은, 106개의 MUT 주형을 사용하여 출발된 반응물이고, 곡선(702)은, 106개의 WT 주형을 사용하여 출발된 반응물이다. 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 이들 값은 22.9(곡선(701)) 및 41.1(곡선(702))이었고, 이는 18.2 주기의 ΔCT 를 초래한다. 그래프 왼쪽 상단은, 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 놓인 심문성 뉴클레오티드(원)를 갖는 다중-부분 프라이머(브릿지 서열은 반원임)의 개략도이다.
실시예 4: EGFR 돌연변이 L858R 및 24-14-5:1:1 다중-부분 프라이머(선택적 증폭)
실시예 3에 기재된 것과 동일한 다중-부분 프라이머, 역방향 프라이머, 의도된 표적(MUT) 및 의도되지 않은 표적(WT)을 사용하여 일련의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 8에 도시되고, 여기서, 곡선(801)은, 106개의 WT 주형을 사용하여 출발된 반응물이고, 곡선(802) 내지 곡선(807)은, 각각의 반응물이 106개의 WT 주형에 더하여 각각 106, 105, 104, 103, 102, 또는 101개의 MUT 주형을 함유한 일련의 희석물이다. 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 이들 값은 41.1(곡선(801)), 23.3(곡선(802)), 26.8(곡선(803)), 30.5(곡선(804)), 33.8(곡선(805)), 37.0(곡선(806)), 및 39.2(곡선(807))이었다. 그래프 왼쪽 상단은, 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 놓인 심문성 뉴클레오티드(원)를 갖는 다중-부분 프라이머(브릿지 서열은 반원임)의 개략도이다.
도 9는, (도 8에서 곡선(802) 내지 곡선(807)으로부터 얻은) MUT 주형을 함유한 각각의 반응에 대해 관찰된 CT 값을, 해당 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서 나타낸 그래프이다. 선(901)은 데이터 점들에 대해 선형 관계 피트이다. 점선(902)은, 106개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않고서 개시된 증폭에 대한 CT 값을 나타낸다.
실시예 5: EGFR 돌연변이 L858R, 및 다중-부분 프라이머 풋 길이의 감소의 효과
7-뉴클레오티드 길이의 풋 서열을 갖는 동일한 24-14-5:1:1 프라이머(서열번호 6)를 사용하고; 또한, 추가의 다중-부분 프라이머는, 이들 추가의 프라이머들 중 하나의 프라이머의 풋 서열이 1 뉴클레오티드 더 길고(24-14-6:1:1), 다른 추가의 프라이머의 풋 서열이 1 뉴클레오티드 더 짧은(24-14-4:1:1) 것을 제외하고는 동일한 디자인의 2개의 추가의 다중-부분 프라이머를 사용하여 실시예 4에 기재된 실험을 반복하였다. 모든 3가지 경우에서, 앵커 서열은 24개의 뉴클레오티드 길이였고, 브릿지 서열은 14개의 뉴클레오티드 길이였고, 표적의 개재 서열은 14개의 뉴클레오티드 길이였으며, 이는 모든 경우에 32개의 뉴클레오티드의 버블 원주를 생성하였다. 또한, 모든 3가지 경우에서, 심문성 뉴클레오티드는 프라이머의 풋 내의 3'에서 두 번째 위치에 놓여 있었다. 프라이머 서열 및 이들의 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-14-4:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TGGTGAAAACACCGCAGCATGTCACACGAGTGAGCCCCGGGC G G-3' (서열번호 7)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-6:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-ACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTTGGAGCTGTGAGCCTTGGGC G G-3' (서열번호 8)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
역방향 프라이머
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM); 주형에의 24-14-4:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 68.1℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 80.3℃이며; 주형에의 24-14-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이며; 주형에의 24-14-6:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 68.1℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.4℃이다.
3개의 다중-부분 프라이머 디자인 각각에 대해, 106개의 WT 주형에 더하여 각각 106, 105, 104, 103, 102 또는 101개의 카피의 MUT 주형으로 출발하는 일련의 희석물을 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같이 일련의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 각각의 반응물에 대한 실시간 데이터(나타내지 않음)로부터 산출된 CT 값은, 106개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않으면서 개시된 반응에 대해 산출된 CT 값이 함께 표 1에 열거된다.
도 10은, (동일한 프라이머를 함유하는 반응 세트 각각에 대해) 관찰된 CT 값을 각각의 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서 나타내는 한 세트의 그래프이다. 선(1001)은 6-뉴클레오티드-길이의 풋 서열(4:1:1)을 갖는 프라이머에 대한 CT 값에 대한 선형 관계 피트이고; 선(1002)은, 7-뉴클레오티드-길이의 풋 서열(5:1:1)을 갖는 프라이머에 대한 CT 값에 대한 선형 관계 피트이며; 선(1003)은 7-뉴클레오티드-길이의 풋 서열(6:1:1)을 갖는 프라이머에 대한 CT 값에 대한 선형 관계 피트이다. 24-14-6:1:1 프라이머를 사용했을 때, MUT 주형의 존재비가 더 낮은 시료일수록 예상보다 다소 더 일찍 발생한 CT 값을 제공하였는데, 이는, 시료 내의 풍부한 WT 주형으로부터 생성된 약간의 차폐성 앰플리콘의 존재를 시사한다.
이들 결과는, 더 짧은 풋 서열을 갖는 다중-부분 프라이머, 예를 들면, 프라이머 24-14-5:1:1을 사용하는 것이 이러한 문제점을 감소시키고, 가장 짧은 풋 서열을 갖는 프라이머, 예를 들면, 프라이머 24-14-4:1:1을 사용하는 것이 이러한 문제점을 사실상 제거하며, 이는, 1,000,000개의 의도되지 않은 주형 분자의 존재 하에 10개와 같이 적은 의도된 주형 분자의 검출 및 정량화를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 6: EGFR 돌연변이 L858R, 및 다중-부분 프라이머 버블 원주의 증가의 효과
실시예 4에 기재된 실험을, 14-뉴클레오티드 길이의 브릿지 서열을 갖는 동일한 24-14-5:1:1 프라이머(서열번호 6)(상기 프라이머는, 이의 주형에 하이브리드화될 때 마찬가지로 14-뉴클레오티드 길이인 개재 서열을 생성한다)를 사용하고; 또한, 추가의 다중-부분 프라이머는 이들 추가의 프라이머들 중 하나의 프라이머의 브릿지 서열이 18-뉴클레오티드 길이(24-18-5:1:1)이고, 다른 추가의 프라이머의 브릿지 서열이 10-뉴클레오티드 길이(24-10-5:1:1)인 것을 제외하고는 동일한 디자인의 2개의 추가의 다중-부분 프라이머를 사용하여 반복하였다. 모든 3가지 경우에서, 앵커 서열은 24개의 뉴클레오티드 길이였고, 풋 서열은 5:1:1이었으며, 프라이머가 이의 주형에 결합될 때 프라이머의 브릿지 서열과 길이가 동일한 개재 서열이 생성되도록 앵커 서열을 선택하였다. 결과적으로, 이러한 일련의 3개의 다중-부분 프라이머에 의해 형성되는 버블 원주는 각각 24, 32 및 40개의 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 모든 3가지 경우에서, 심문성 뉴클레오티드는 프라이머의 풋 내에서 3'에서 두 번째 위치에 놓여 있었다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-10-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TGAAAACACCGCAGCATGTCAAGACACTCAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 10)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-18-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CGTACTGGTGAAAACACCGCAGCACTGACGACAAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 9)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
역방향 프라이머
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM); 주형에의 24-10-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.3℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 78.0℃이며; 주형에의 24-14-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이며; 주형에의 24-18-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 67.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.3℃이다.
3개의 다중-부분 프라이머 디자인 각각에 대해, 106개의 WT 주형에 더하여 각각 106, 105, 104, 103, 102 또는 101개의 카피의 MUT 주형으로 시작하는 일련의 희석물을 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같이 일련의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 검정 기기는 각각의 반응에 대한 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 각각의 반응물에 대한 실시간 데이터(나타내지 않음)로부터 산출된 CT 값은, 106개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않고서 개시된 반응에 대해 산출된 CT 값이 함께 표 2에 열거된다.
도 11은, (동일한 프라이머를 함유하는 반응 세트 각각에 대해) 관찰된 CT 값을 각각의 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서 나타내는 한 세트의 그래프이다. 선(1101)은, 24-뉴클레오티드 길이의 원주를 갖는 버블을 형성하는 프라이머에 대한 CT 값에 대해 선형 관계 피트이고; 선(1102)은, 32-뉴클레오티드 길이의 원주를 갖는 버블을 형성하는 프라이머에 대한 CT 값에 대해 선형 관계 피트이며; 선(1103)은, 40-뉴클레오티드 길이의 원주를 갖는 버블을 형성하는 프라이머에 대한 CT 값에 대해 선형 관계 피트이다. 더 긴 풋 서열을 갖는 프라이머로 발생된 바와 유사하게, 상대적으로 작은 버블을 형성하는 24-10-5:1:1 프라이머를 사용했을 때, MUT 주형의 존재비가 더 낮은 시료일수록 예상보다 다소 더 일찍 발생하는 CT 값을 제공하였는데, 이는, 시료 내의 풍부한 WT 주형으로부터 생성되는 약간의 차폐성 앰플리콘의 존재를 시사한다.
이들 결과는, 더 큰 버블을 형성하는 다중-부분 프라이머, 예를 들면, 프라이머 24-14-5:1:1을 사용하는 것이 이러한 문제점을 감소시키고, 가장 큰 버블을 형성하는 프라이머, 예를 들면, 프라이머 24-18-5:1:1을 사용하는 것이 이러한 문제점을 사실상 제거하며, 이는, 1,000,000개의 의도되지 않은 주형 분자의 존재 하에 10개 만큼 적은 의도된 주형 분자의 검출 및 정량화를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 7: EGFR 돌연변이 L858R, 및 다중-부분 프라이머의 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드의 위치 변화의 효과
심문성 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단으로부터 두 번째 위치에 놓인 7-뉴클레오티드 길이의 풋 서열을 포함하는 동일한 24-14-5:1:1 프라이머(서열번호 6)를 사용하고; 또한, 풋 서열을 갖는 심문성 뉴클레오티드의 위치를 변화시킨 것을 제외하고는 동일한 디자인의 5개의 추가의 다중-부분 프라이머를 사용하여 실시예 3에 기재된 실험을 반복하였다. 모든 6가지 경우에서, 앵커 서열은 24-뉴클레오티드 길이였고, 브릿지 서열은 14-뉴클레오티드 길이였으며, 풋 서열은 7-뉴클레오티드 길이였다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-14-6:1:0 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-ACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTTGCACGAGTGAGCCTTGGGC G -3' (서열번호 11)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C
CCGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-4:1:2 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TGGTGAAAACACCGCAGCATGTCACACGAGTGAGCCACGGGC G GG-3' (서열번호 12)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C CC
GGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-3:1:3 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-GGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAACGAGTGAGCCACAGGC G GGC-3' (서열번호 13)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C CCG
GTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-2:1:4 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-GTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGGAAGTGAGCCACAAGC G GGCC-3' (서열번호 14)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C CCGG
TTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-1:1:5 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TGAAAACACCGCAGCATGTCAAGACAGACTGACCCAAAC G GGCCA-3' (서열번호 15)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C CCGGT
TTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
역방향 프라이머
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM); 주형에의 24-14-6:1:0 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 67.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.0℃이며; 주형에의 24-14-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이며; 24-14-4:1:2 앵커 서열의 주형에의 결합에 대한 Tm은 68.1℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 80.0℃이며; 주형에의 24-14-3:1:3 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 67.0℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 78.9℃이며; 주형에의 24-14-2:1:4 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 65.6℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 78.2℃이며; 주형에의 24-14-1:1:5 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.6℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 78.1℃이다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 12의 6개의 패널에 도시되고, 여기서, 각각의 패널은, 사용된 다중-부분 프라이머를 표시한다. 각각의 패널에서 홀수 번호의 곡선은, 106개의 MUT 주형을 함유하는 출발 시료에 대해 얻은 결과이고, 짝수 번호의 곡선은, 106개의 WT 주형을 함유하는 시료에 대해 얻은 결과이다. 표 3은, 둘 다의 표적에 대해 각각의 프라이머를 사용해 기계-산출된 CT 값을 열거하며, 차이(ΔCT)도 기재한다.
실시예 8: EGFR 돌연변이 L858R, 및 다중-부분 프라이머 버블 대칭성 변화의 효과
14-뉴클레오티드-길이의 브릿지 서열 및 주형으로부터의 14-뉴클레오티드-길이의 개재 서열을 포함하는 대칭 버블을 형성하는 동일한 24-14-5:1:1 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 실시예 3에 기재된 실험을 반복하였고; 또한, 상기 실험은, 돌연변이체 표적과의 상이한 비대칭 버블을 형성하는 4개의 추가의 다중-부분 프라이머(서열번호 2)를 사용하였다. "비대칭 버블"은, 상이한 길이를 갖는 브릿지 서열 및 주형 내 개재 서열에 의해 형성되는 버블을 의미한다. 이 실험에서, 비교된 모든 다중-부분 프라이머는 24-뉴클레오티드 길이의 앵커 서열, 5:1:1 풋 서열 및 상이한 길이의 브릿지 서열(상기 브릿지 서열은 18, 16, 14, 12 또는 10개의 뉴클레오티드 길이임)을 가졌다. 각각의 다중-부분 프라이머에 대해, 앵커 서열의 정체성은, 브릿지 서열의 길이 + (앵커 서열과 풋 서열 둘 다가 주형에 결합함으로써 형성되는) 개재 서열의 길이의 합이 28이 되도록 선택되었다. 결과적으로, 이들 5개의 다중-부분 프라이머 각각에 의해 형성되는 버블의 원주는 항상 동일하였다. 실험의 목적은, 비대칭 버블의 형성이 프라이머의 선택성에 영향을 미치는지를 측정하기 위한 것이었다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-18/10-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TGAAAACACCGCAGCATGTCAAGACACACGACAAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 16)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-16/12-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-GGTGAAAACACCGCAGCATGTCAATCCAACAAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 17)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14/14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-12/16-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-TACTGGTGAAAACACCGCAGCATGGACGACGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 18)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-10/18-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CGTACTGGTGAAAACACCGCAGCACTGACGGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 19)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
역방향 프라이머
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. 또한, 돌연변이체 표적 서열에서, 돌연변이체에 대해 특이적인 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM); 주형에의 24-18/10-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.3℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.1℃이며; 주형에의 24-16/12-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 67.0℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 78.5℃이며; 주형에의 24-14/14-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이며; 주형에의 24-12/16-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.3℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.5℃이며; 주형에의 24-10/18-5:1:1 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 67.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.3℃이다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 도 13의 5개의 패널에 도시되고, 여기서, 각각의 패널은, 브릿지 서열의 길이 및 표적의 개재 서열의 길이에 의해 형성될 수 있는 버블을 나타낸다(예를 들면, "18/10 버블"은 10 뉴클레오티드 길이의 표적과 개재 서열을 형성할 수 있는 전방향 프라이머 24-18/10-5:1:1의 사용을 의미한다). 각각의 패널에서, 홀수 번호의 곡선은, 106개의 MUT 주형을 함유하는 출발 시료에 대해 얻은 결과이고, 짝수 번호의 곡선은, 106개의 WT 주형을 함유하는 시료에 대해 얻은 결과이다. 표 4는, 둘 다의 표적에 대해 각각의 프라이머를 사용해 기계-산출된 CT 값을 열거하며, 차이(ΔCT)도 기재한다.
실시예 9: B-raf 돌연변이 V600E
본 발명자들은, 단일-뉴클레오티드 다형인 B-raf 돌연변이 V600E를 표적으로 하는 본 발명에 따른 다중-부분 프라이머로의 실시예 4의 방법을 사용하였다. 비교 목적을 위해, 본 발명자들은 프라이머에 대해 24-14-5:1:1 디자인을 사용하였다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
B-raf 프라이머 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-AGACAACTGTTCAAACTGATGGGAAAACACAATCATCTATTTC T C-3' (서열번호 20)
MUT: 3'-GGTCTGTTGACAAGTTTGACTACCCTGGGTGAGGTAGCTCTAAAG A G
ACATCGATCTGGTTTTAGTGGATAAAAA-5' (서열번호 21)
역방향 프라이머
RP: 5'-ATAGGTGATTTTGGTCTAGC-3' (서열번호 22)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 주형에의 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 63.5℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 71.1℃이며, 역방향 프라이머의 결합에 대한 Tm 산출값은 56.1℃이다.
B-raf V600E 돌연변이 또는 B-raf 야생형 서열을 함유하는 116 bp EGFR 유전자 단편에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드를 pGEM-11Zf(+) 벡터(프로메가) 내에 삽입함으로써 플라스미드를 제조하였다. 돌연변이체 및 야생형 플라스미드 DNA를, 제한 엔도뉴클레아제 Mse I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용하여 소화시켰다. 소화 혼합물은, 5mM KAc, 2mM Tris-Ac(pH 7.9), 1mM MgAc, 1% 소 혈청 알부민 및 100μM 디티오트레이톨을 함유하는 20㎕ 부피 중에서 10 단위의 Mse I 및 4㎍의 돌연변이체 또는 야생형 게놈 DNA를 함유하였다. 상기 반응물을 37℃에서 120분 동안 항온배양한 후 65℃에서 20분 동안 항온배양하여 효소를 불활성화시켰다.
50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 3mM MgCl2, 1.5 단위의 AmpliTaq Gold DNA 폴리머라제, 250μM의 각각의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 60nM의 각각의 프라이머 및 1x SYBR® Green을 함유하는 30㎕ 부피 중에서 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭은, Bio-Rad IQ5 분광형광계 열 주기 장치 내에서 0.2㎖ 폴리프로필렌 PCR 튜브(백색)를 사용하여 수행하였다. 열-순환 프로파일은 95℃에서 10분, 이어서, 94℃에서 15초 동안 60 주기, 60℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초였다. SYBR® Green 형광 강도를 각각의 쇄 연장 스테이지 종료시 측정하였다(72℃).
106개의 WT 주형에 더하여 각각 106, 105, 104, 103, 102 또는 101개의 카피의 MUT 주형을 함유하는 일련의 희석물을 사용하여 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 106개의 WT 주형만을 함유하는 시료도 포함시켰다. 실시간 형광 데이터(나타내지 않음)로부터, 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. B-raf V600E 돌연변이체 일련의 희석물에 대해, 이들 값은 27.7(106개의 MUT 주형), 31.1(105개의 MUT 주형), 34.1(104개의 MUT 주형), 37.6(103개의 MUT 주형), 43.0(102개의 MUT 주형), 46.9(101개의 MUT 주형) 및 50.8(106개의 WT 주형을 함유하고 MUT 주형은 함유하지 않음)이었다. 도 14는, MUT 주형을 함유하는 각각의 반응에 대해 관찰된 CT 값의 해당 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서의 그래프이다. 선(1401)은 데이터 점들에 대해 선형 관계 피트이다. 점선(1402)은, 106개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않고서 개시된 증폭에 대한 CT 값을 나타낸다.
실시예 10: 사람 게놈 DNA 내의 EGFR 돌연변이 T790M
(EFGR T790M 돌연변이를 함유하는 세포주 H1975로부터 단리된) EGFR 돌연변이 T790M을 함유하는 사람 게놈 DNA 및 (코리엘 셀 레포지토리즈(Coriell Cell Repositories)로부터 수득된 사람 게놈 DNA로부터 단리된) 상응하는 야생형 서열을 함유하는 사람 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 일련의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였으며, 상기 서열들은 EGFR 유전자 내 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 서로 차이가 난다. 전방향 프라이머는, 본 발명에 따른 24-14-4:1:1 다중-부분 프라이머였다. 역방향 프라이머는 통상의 선형 프라이머였다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
T790M 프라이머 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-GCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTAATAATCTACAACAATCA T G-3' (서열번호 23)
MUT: 3'-CACGGCGGACGACCCGTAGACGGAGTGGAGGTGGCACGTCGAGTAGT A C
GTCGAGTACGGGAAGCCGACGGAGGACC-5' (서열번호 24)
역방향 프라이머
RP: 5'-GAGGCAGCCGAAGGGCATGAGC-3' (서열번호 25)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 주형에의 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 72.5℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 73.9℃이며, 역방향 프라이머의 결합에 대한 Tm 산출값은 68.2℃이다.
돌연변이체 및 야생형 사람 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Mse I을 사용해 소화시켰다. 소화 혼합물은, 5mM KAc, 2mM Tris-Ac(pH 7.9), 1mM MgAc, 1% 소 혈청 알부민 및 100μM 디티오트레이톨을 함유하는 20㎕ 부피 중에서 10 단위의 Mse I 및 4㎍의 돌연변이체 또는 야생형 게놈 DNA를 함유하였다. 상기 반응물을 37℃에서 120분 동안 항온배양한 후 65℃에서 20분 동안 항온배양하여 효소를 불활성화시켰다.
50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 3mM MgCl2, 1.0 단위의 AmpliTaq Gold DNA 폴리머라제, 250μM의 각각의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 60nM의 각각의 프라이머 및 1x SYBR® Green을 함유하는 20㎕ 부피 중에서 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭은, Bio-Rad IQ5 분광형광계 열 주기 장치 내에서 0.2㎖ 폴리프로필렌 PCR 튜브(백색)를 사용하여 수행하였다. 열-순환 프로파일은 95℃에서 10분, 이어서, 94℃에서 15초 동안 60 주기, 55℃에서 15초, 그리고, 72℃에서 20초였다. SYBR® Green 형광 강도를 각각의 쇄 연장 스테이지 종료시 측정하였다(72℃).
10,000개의 WT 주형에 더하여 각각 10,000; 3,000; 1,000; 300; 100; 30; 또는 10개의 카피의 MUT 주형을 함유하는 일련의 희석물을 사용하여 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은, 10,000개의 WT 주형만을 함유하는 시료도 포함시켰다. 실시간 형광 데이터(나타내지 않음)로부터, 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 당해 T790M 일련의 희석물에 대해, 이들 값은 29.2(10,000개의 MUT 주형), 31.1(3,000개의 MUT 주형), 32.7(1,000개의 MUT 주형), 35.5(300개의 MUT 주형), 38.2(100개의 MUT 주형), 38.8(30개의 MUT 주형), 40.7(10개의 MUT 주형) 및 42.8(10,000개의 WT 주형을 함유하고 MUT 주형은 함유하지 않음)이었다. 도 15는, MUT 주형을 함유하는 각각의 반응에 대해 관찰된 CT 값의 해당 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서의 그래프이다. 선(1501)은, 데이터 점들에 대해 선형 관계 피트이다. 점선(1502)은, 10,000개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않고서 개시된 증폭에 대한 CT 값이다.
실시예 11: 어플라이드 바이오시스템즈 PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치에서 정량화되는 EGFR 돌연변이 L858R
상이한 열 순환 기기인 어플라이드 바이오시스템즈 PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치를 사용하여 실시예 4에 보고된 검정과 유사한 실험을 수행하여 EGFR 유전자 내의 돌연변이 L858R을 증폭시키고 검출하였다. EGFR 돌연변이 L858R을 함유하는 플라스미드 DNA 및 상응하는 야생형 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 주형으로서 사용하여 일련의 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였으며, 상기 서열들은 EGFR 유전자 내 단일-뉴클레오티드 다형에 의해 서로 차이가 난다. 실시예 4에서 사용된 주형과 대조적으로, 당해 실험에서는 주형을 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키지 않았다. 실시예 3에 기재된 것과 동일한 다중-부분 전방향 프라이머 및 통상의 역방향 프라이머를 사용하여 증폭을 수행하였다. 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 주형에의 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 전체 다중-부분 프라이머의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이며, 역방향 프라이머의 결합에 대한 Tm 산출값은 68.2℃이다.
50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 3mM MgCl2, 2.0 단위의 AmpliTaq Gold DNA 폴리머라제, 250μM의 각각의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 60nM의 각각의 프라이머 및 1x SYBR® Green을 함유하는 40㎕ 부피 중에서 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭은, 어플라이드 바이오시스템즈 PRISM 7700 분광형광계 열 주기 장치 내에서 0.2㎖ 폴리프로필렌 PCR 튜브(투명)를 사용하여 수행하였다. 열-순환 프로파일은 95℃에서 10분, 이어서, 94℃에서 15초 동안 55 주기, 60℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초 동안이었다. 각각의 쇄 연장 스테이지 종료시 SYBR® Green 형광 강도를 측정하였다(72℃).
106개의 WT 주형에 더하여 각각 106, 105, 104, 103, 102 또는 101개의 카피의 MUT 주형을 함유하는 일련의 희석물을 사용하여 PCR 증폭 및 검출 검정을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 106개의 WT 주형만을 함유하는 시료도 포함시켰다. 실시간 형광 데이터(나타내지 않음)로부터, 검정 기기는 각각의 반응에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 이들 값은 21.2(106개의 MUT 주형), 24.9(105개의 MUT 주형), 28.3(104개의 MUT 주형), 32.2(103개의 MUT 주형), 36.0(102개의 MUT 주형), 37.6(101개의 MUT 주형) 및 38.7(106개의 WT 주형을 함유하고 MUT 주형은 함유하지 않음)이었다. 도 16은, MUT 주형을 함유하는 각각의 반응에 대해 관찰된 CT 값의 해당 반응물 내에 존재하는 MUT 주형 수의 대수의 함수로서의 그래프이다. 선(1601)은 데이터 점들에 대해 선형 관계 피트이다. 점선(1602)은, 106개의 WT 주형을 사용하고 MUT 주형은 사용하지 않고서 개시된 증폭에 대한 CT 값을 나타낸다.
실시예 12: 다중-부분 프라이머를 PCR 검정에 사용할 때 ARMS 구별의 역할
본 발명에 따른 다중-부분 프라이머의 기능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 실시예 3에 기재된 실험을, 본원에 기재된 24-14-5:1:1 프라이머 뿐만 아니라, 동일한 앵커 서열, 동일한 브릿지 서열 및 동일한 풋 서열의 5개의 5' 뉴클레오티드를 갖는 프라이머인 절단형 24-14-5:0:0 프라이머를 사용하여 반복하였다. 상기 절단형 프라이머는 풋 서열의 마지막 2개의 3' 뉴클레오티드가 결여되어 있었다. 따라서, 이의 풋 서열은, 의도된 돌연변이체 표적과 의도되지 않은 야생형 표적 둘 다에 대해 완전히 상보성이었다. 이들 2개의 다중-부분 프라이머 각각을 사용하는 반응들에 대한 프라이머 서열 및 의도된 표적 서열(MUT)은 다음과 같았다:
프라이머 24-14-5:1:1 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC G G-3' (서열번호 6)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG C C
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
프라이머 24-14-5:0:0 앵커 브릿지 풋
FP: 5'-CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCGCACGAGTGAGCCCTGGGC-3'
(서열번호 26)
MUT: 3'-CCTTGCATGACCACTTTTGTGGCGTCGTACAGTTCTAGTGTCTAAAACCCG CC
CGGTTTGACGACCCACGCCTTCTCTTTCTTATGGTACGTCTT-5' (서열번호 2)
역방향 프라이머
RP: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3' (서열번호 3)
다중-부분 전방향 프라이머에서, 브릿지 서열이 밑줄 쳐져 있고, 풋 서열 내의 심문성 뉴클레오티드가 굵고 밑줄 쳐지고 더 큰 글자로 표시되어 있다. 돌연변이체 표적 서열에서, 전방향 프라이머의 앵커에 대한 결합 서열 및 전방향 프라이머의 풋에 대한 결합 서열이 밑줄 쳐져 있고, 역방향 프라이머의 서열이 밑줄 쳐져 있다. DNA 하이브리드의 용융 온도 산출을 위한 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈의 SciTools 프로그램을 사용하여(지정 파라미터: [oligo] = 0.06μM; [Na+] = 60mM; [Mg2+] = 3mM; [dNTPs] = 0.25mM), 주형에의 둘 다의 프라이머에서의 앵커 서열의 결합에 대한 Tm은 66.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 프라이머 24-14-5:1:1의 결합에 대한 Tm은 79.9℃이고, 수득되는 상보성 앰플리콘에의 프라이머 24-14-5:0:0의 결합에 대한 Tm은 79.0℃이다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 PCR 증폭을 수행하였다. 실시간 형광성 결과, 즉, 완료된 증폭 주기 수의 함수로서의 SYBR Green® 형광 강도가 각각의 반응물에 대해 기록되었다. 도 17, 패널 A는, 프라이머 24-14-5:1:1을 함유하는 반응물에 대해 얻은 결과를 나타내고, 여기서, 곡선(1701)은, 106개의 MUT 주형을 함유하는 반응물이고, 곡선(1702)은, 106개의 WT 주형을 함유하는 반응물이며; 도 17, 패널 B는, 프라이머 24-14-5:0:0을 함유하는 반응물에 대해 얻은 결과를 나타내고, 여기서, 곡선(1703)은, 106개의 MUT 주형을 함유하는 반응물이고, 곡선(1704)은, 106개의 WT 주형을 함유하는 반응물이다. 검정 기기는 각각의 곡선에 대해 역치 주기(CT)를 자동으로 산출한다. 프라이머 24-14-5:1:1에 대한 CT 값은 23.1(곡선(1701)) 및 40.7(곡선(1702))이었고, 이는 17.6 주기의 ΔCT를 제공하며; 프라이머 24-14-5:0:0에 대한 CT 값은 39.7(곡선(1703)) 및 39.4(곡선(1704))였고, 이는 -0.3 주기의 ΔCT를 제공한다(이는 이들 2개의 반응물이 사실상 동일한 결과를 제공하였다는 것을 나타낸다).
상기 실시예 및 바람직한 실시형태의 설명은 예시로서 받아들여야 하며, 청구범위에 의해 정의되는 본 발명을 제한하는 것으로 받아들이지 않아야 한다. 쉽게 이해하게 될 것인 바와 같이, 상기에 제시된 특징들의 많은 변형 및 조합이, 청구범위에 제시된 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 이용될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 범위로부터 벗어나는 것으로 여겨지지 않으며, 모든 이러한 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 인용된 모든 참조문헌은 이들의 전문이 인용에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> RUTGERS, THE STATE UNIVERSITY OF NEW JERSEY
<120> HIGHLY SELECTIVE NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRIMERS
<130> 096747-00244PCT/UMDNJ 12-040
<150> US 61/762,117
<151> 2013-02-07
<160> 26
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
attttgggcg ggccaaactg c 21
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
ccttgcatga ccacttttgt ggcgtcgtac agttctagtg tctaaaaccc gcccggtttg 60
acgacccacg ccttctcttt cttatggtac gtctt 95
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
gcatggtatt ctttctcttc cgca 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
caagatcaca gattttgggc g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
aagatcacag attttgggcg g 21
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcgcacga gtgagccctg ggcgg 45
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
tggtgaaaac accgcagcat gtcacacgag tgagccccgg gcgg 44
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
actggtgaaa acaccgcagc atgttggagc tgtgagcctt gggcgg 46
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
cgtactggtg aaaacaccgc agcactgacg acaagtgagc cctgggcgg 49
<210> 10
<211> 41
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tttagtggat aaaaa 75
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cacggcggac gacccgtaga cggagtggag gtggcacgtc gagtagtacg tcgagtacgg 60
gaagccgacg gaggacc 77
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ctggtgaaaa caccgcagca tgtcgcacga gtgagccctg ggc 43
Claims (12)
- 각각의 돌연변이체 표적 서열에 대해 100,000개의 카피의 밀접하게 관련된 야생형 DNA 표적 서열을 함유하는 혼합물 중에서 10개의 카피와 같이 적은 하나 이상의 희귀한 돌연변이체 DNA 표적 서열을 검출할 수 있는 증폭 및 검출 방법으로서, 상기 방법은
(a) 프라이머-어닐링 온도를 갖는 프라이머-의존적 증폭 반응에서 반응 혼합물을 반복적으로 순환시키는 단계로서, 상기 반응 혼합물은, 상기 하나 이상의 돌연변이체 표적 서열 또는 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열 또는 상기 돌연변이체 표적 서열과 상기 야생형 표적 서열 둘 다, DNA 폴리머라제, 증폭에 필요한 다른 시약, 및 각각의 돌연변이체 표적 서열에 대한 다중-부분 프라이머(multi-part primer)를 포함하는 프라이머 쌍을 포함하고, 상기 다중-부분 프라이머는 5'에서 3' 방향으로,
프라이머 어닐링 동안 상기 돌연변이체 표적 서열 및 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열과 하이브리드화하는 앵커 서열(anchor sequence);
프라이머 어닐링 동안 상기 돌연변이체 표적 서열에 또는 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열에 하이브리드화하지 않는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이의 브릿지 서열(bridge sequence); 및
상기 돌연변이체 서열에 완전히 상보성이고 이의 야생형 서열에는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드에 의해 미스매치되는(mismatched), 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이의 풋 서열(foot sequence)
인 3개의 연속한 DNA 서열들을 포함하고, 여기서,
(i) 상기 프라이머의 상기 앵커 서열 및 상기 풋 서열이, 상기 돌연변이체 표적 서열에 또는 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열에 하이브리드화하는 경우, 프라이머-어닐링 동안 상기 프라이머의 브릿지 서열에 하이브리드화하지 않는 개재 서열(intervening sequence)이 상기 표적 서열 내에 존재하고, 상기 브릿지 서열 및 상기 개재 서열은 함께 16 내지 52개의 뉴클레오티드의 원주(circumference)를 갖는 버블(bubble)을 하이브리드 내에 생성하고, 상기 개재 서열은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이이고, 상기 브릿지 서열은 상기 개재 서열의 길이와 같거나 그보다 길고,
(ii) 상기 버블의 원주와 상기 풋 서열의 길이가 조합되어, 상기 돌연변이체 표적 서열의 카피를 불가능하게 하는 약한 풋/돌연변이체 표적 서열 하이브리드(weak foot/mutant-target-sequence hybrid)를 형성하고,
(iii) 상기 브릿지 서열 및 상기 풋 서열은 함께 상기 혼합물 내의 비-표적 서열을 프라이밍하지 않고,
(iv) 상기 순환 동안 다중-부분 프라이머/야생형 표적 서열 하이브리드가 신장될 확률은, 13.3 주기 이상의 ΔCT에 의해 입증되는 바와 같이, 상기 순환 동안 다중-부분 프라이머/돌연변이체 표적 서열 하이브리드가 신장될 확률보다 10,000배 이상 더 낮은,
단계; 및
(b) dsDNA 결합 염료를 사용하거나, 각각의 다중-부분 프라이머에 대해 상기 프라이머의 증폭 산물에의 하이브리드화시 신호를 발생시키는 형광 하이브리드화 프로브를 사용하거나, 각각의 다중-부분 프라이머에 대해 상기 프라이머의 증폭된 산물 내로의 혼입 또는 상기 프라이머의 증폭된 산물에의 하이브리드화시에만 형광을 발광하는 상기 프라이머의 5' 말단에 있는 소광된(quenched) 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 헤어핀을 사용하여 증폭된 산물 또는 산물들을 검출하는 단계
를 포함하고,
여기서, 카피가 "불가능하다"는 것은, 상기 반응이 106개의 카피의 하나 이상의 돌연변이체 DNA 표적 서열을 함유하고, 야생형 서열을 함유하지 않고, 상기 다중-부분 프라이머를 함유하는 반응 혼합물을 사용하여 시작된 경우 및 별개로 상기 반응이 106개의 카피의 하나 이상의 돌연변이체 DNA 표적 서열을 함유하고, 야생형 서열을 함유하지 않고, 상기 다중-부분 프라이머 대신 상응하는 통상의 프라이머를 함유하는 반응 혼합물을 사용하여 시작된 경우, 상기 다중-부분 프라이머를 이용한 반응의 역치 주기(CT)가 통상의 프라이머를 이용한 반응의 CT와 비교하여 3 주기 이상 지연되는 것을 의미하는, 증폭 및 검출 방법. - 제1항에 있어서, 상기 브릿지 서열은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이이고, 상기 개재 서열은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이이고, 상기 버블은 28 내지 52개의 뉴클레오티드의 원주(circumference)를 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 각각의 다중-부분 프라이머의 상기 풋 서열이 이의 야생형 표적 서열에 미스매치인 것은 상기 프라이머의 3' 뉴클레오티드 및 3' 말단으로부터 두 번째 뉴클레오티드 중 하나 또는 양쪽 모두에서인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다중-부분 프라이머들 각각에 대해, 106개의 카피의 돌연변이체 DNA 표적 서열 및 통상의 프라이머를 사용하여 시작된 반응과 비교하여 106개의 카피의 돌연변이체 DNA 표적 서열 및 상기 다중-부분 프라이머를 사용하여 시작된 반응에 대한 상기 CT 지연이 5 주기 이상인, 방법.
- 제4항에 있어서, 106개의 카피의 각각의 돌연변이체 표적 서열을 사용하여 시작된 검정의 역치 주기(CT)가, 106개의 카피의 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열을 사용하여 시작된 검정의 CT보다 18 주기 이상 더 이른, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 지연이 10 주기 이상인, 방법.
- 제6항에 있어서, 106개의 카피의 각각의 돌연변이체 표적 서열을 사용하여 시작된 검정의 역치 주기(CT)가, 106개의 카피의 이의 밀접하게 관련된 야생형 표적 서열을 사용하여 시작된 검정의 CT보다 18 주기 이상 더 이른, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 버블 원주는 28 내지 44개의 뉴클레오티드들인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 표적 서열은 의도된 표적 내에서 서로 밀접하며 서열 상동성을 공유하는 2개 이상의 돌연변이체 표적 서열을 포함하고, 여기서, 상기 2개 이상의 돌연변이체 서열 각각에 대한 다중-부분 전방향 프라이머 및 공통의 역방향 프라이머가 존재하고, 상기 프라이머-의존적 증폭 반응은 상기 공통의 역방향 프라이머가 과잉 프라이머인 비대칭이고, 각각의 다중-부분 프라이머는, 교차 하이브리드화(cross hybridization)를 방지하기에 충분히 구분되는 상이한 브릿지 서열을 갖고, 여기서 각각의 다중-부분 프라이머가 상기 의도된 표적에 하이브리드화될 때 형성되는 버블은 상기 브릿지 서열이 상기 개재 서열보다 더 긴 비대칭이며, 각각의 다중-부분 프라이머로부터의 증폭된 산물이 개별적으로 검출되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 각각의 다중-부분 프라이머가, 상기 앵커 서열의 5'에 위치하는 독특한 관능성 모이어티(moiety)를 함유하고, 상기 관능성 그룹이 상기 돌연변이체 표적 서열에 또는 상기 야생형 표적 서열에 하이브리드화하지 않는, 방법.
- 제1항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 다중-부분 프라이머, 하나 이상의 역방향 프라이머, 증폭 완충액, dNTP, DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 검출 시약을 포함하는, 제1항에 따른 증폭 및 검출을 수행하기 위한 시약 키트.
- 제11항에 있어서,
(A) 2개 이상의 다중-부분 프라이머, 및 각각의 다중-부분 프라이머의 증폭된 산물에 대해, 해당 증폭된 산물의 어느 한 가닥에의 결합시 신호를 발생시키는 독특한 이중-표지된 형광 프로브, 및
(B) 의도된 표적 내에서 서로 밀접하며 서열 상동성을 공유하는 2개 이상의 돌연변이체 표적 서열 각각에 대한 다중-부분 프라이머, 및 상기 다중-부분 프라이머에 대한 공통의 역방향 프라이머
중 하나 이상을 포함하는 키트로서,
상기 프라이머-의존적 증폭 반응은 상기 공통의 역방향 프라이머가 과잉 프라이머인 비대칭이고, 여기서, 각각의 다중-부분 프라이머는, 교차 하이브리드화를 방지하기에 충분히 구분되는 상이한 브릿지 서열을 갖고, 각각의 다중-부분 프라이머가 이의 의도된 표적 서열에 하이브리드화될 때 형성되는 버블은, 상기 브릿지 서열이 상기 개재 서열보다 더 긴 비대칭인, 키트.
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