WO2019150414A1 - 核酸の検出方法 - Google Patents

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WO2019150414A1
WO2019150414A1 PCT/JP2018/002824 JP2018002824W WO2019150414A1 WO 2019150414 A1 WO2019150414 A1 WO 2019150414A1 JP 2018002824 W JP2018002824 W JP 2018002824W WO 2019150414 A1 WO2019150414 A1 WO 2019150414A1
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nucleic acid
primer
target
complementary
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PCT/JP2018/002824
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Inventor
加藤　真吾
Original Assignee
学校法人 慶應義塾
株式会社ニコン
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid.
  • Nucleic acid chromatography in which a probe nucleic acid and a target nucleic acid are hybridized on a piece of test paper is useful as a method for easily detecting the target nucleic acid.
  • a special tag is attached to a primer for amplifying a target, and this tag portion is bound to a single-stranded probe to detect (non-patent document). 1, Patent Documents 1 and 2). In this case, there is a problem of false positives that are detected even when amplification occurs non-specifically.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a nucleic acid that is unlikely to cause false positives due to nonspecific amplification.
  • the present inventor has primers (jumped) having sequences complementary to the upstream region and the downstream region of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence).
  • PCR amplification is performed using a primer (Jumped primer), and the target sequence in the PCR amplification product is detected by hybridizing with a single-stranded probe to detect amplification specific to the target nucleic acid.
  • the present invention has been completed.
  • a PCR reaction is carried out using three types of primers (forward primer, reverse primer, jumped primer).
  • a DNA having a single-stranded DNA (a target sequence portion or a sequence portion complementary to the target sequence) is formed and detected by binding to a single-stranded probe having a sequence complementary to the sequence of this single-stranded portion.
  • Formation of DNA in which a part of the double-stranded DNA becomes a single strand can be enhanced by converting the double-stranded DNA, which is a PCR product, into a single strand (denaturation) and then returning it to a double strand.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the following primers (A) a forward primer for synthesizing the target nucleic acid; (B) a reverse primer for synthesizing the target nucleic acid, and (c) a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and the 3 ′ end of the target sequence PCR amplification is performed using a primer (jumped primer) that has a complementary sequence in the downstream region adjacent to the target sequence but does not include a sequence complementary to the target sequence, and is complementary to the target sequence in the PCR amplification product
  • a method for detecting a nucleic acid comprising detecting a simple sequence by hybridizing with a single-stranded probe.
  • the method further comprises subjecting the PCR amplification product to additional denaturation before detecting the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto by hybridization with a single-stranded probe.
  • Method. (3) The method according to (2), wherein the denaturation treatment additionally performed on the PCR amplification product is heating, and further includes rapid cooling after the heating.
  • the denaturation treatment additionally performed on the PCR amplification product is an alkali treatment, and further comprises a neutralization treatment after the alkali treatment.
  • primers (A) a forward primer for synthesizing the target nucleic acid; (B) a reverse primer for synthesizing the target nucleic acid, and (c) a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and the 3 ′ end of the target sequence
  • a primer (jumped primer) having a complementary sequence in the downstream region adjacent to but not including a sequence complementary to the target sequence
  • Primer set consisting of (6)
  • a nucleic acid detection kit comprising the primer set of (5).
  • the kit according to (6) further comprising a single-stranded probe that hybridizes with the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto.
  • the kit according to (7) wherein a single-stranded probe that hybridizes with a target sequence in a PCR amplification product or a sequence complementary thereto is held on a carrier.
  • the carrier is a strip composed of rectangular cellulose fibers, and is complementary to the target sequence in the PCR amplification product in the specimen development direction by dropping the specimen on the carrier or immersing the carrier in the specimen.
  • the kit according to (8), wherein a single-stranded probe that hybridizes with the sequence is immobilized.
  • a single-stranded probe that hybridizes to the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto is fixed to the strip so as to constitute one or a plurality of test lines perpendicular to the sample development direction.
  • the kit according to (9). (11) The kit according to any one of (6) to (10), further comprising a labeling reagent.
  • the original sequence of the target nucleic acid can be detected, and the possibility of false positives due to nonspecific amplification is reduced.
  • false positives due to non-specific amplification can be reduced in the detection of the target nucleic acid.
  • double-stranded DNA (c and d) having a loop-like single-stranded portion is generated in addition to long double-stranded DNA and short double-stranded DNA (a and b).
  • a, b, and d are synthesized by DNA extension, and a, b, c, and d are generated by once denaturing a double strand synthesized by DNA extension into a single strand and then performing hybridization again.
  • the determination result by the chromatography with the strip 1 of the PCR amplification product which carried out the denaturation by a strong alkali and the neutralization by a weak acid is shown.
  • the strip 1 was coated with the sequences A, B, C, and D selected from the HIV-1 gag and p17 regions in order from the top of the strip.
  • the results of chromatographic determination on strip 1 of PCR amplification products that had been heat-denatured (94 ° C. for 2 minutes) and then ice-cooled are shown.
  • the determination result by the chromatography with the strip 2 of the PCR amplification product which carried out the denaturation by a strong alkali and the neutralization by a weak acid is shown.
  • Strip 2 includes E, which is the sequence of ⁇ phage, sequence F selected from LTR, R3 region of HIV-2, gag of HIV-1, GTR, sequence of HIV-1, LTR, U5 of sequence selected from p17 region H and H ′, which are arrays selected from the region, were applied by changing the position in the order of E, F, G, and H from the top.
  • E is the sequence of ⁇ phage
  • sequence F selected from LTR
  • R3 region of HIV-2 gag of HIV-1, GTR
  • sequence of HIV-1, LTR sequence of HIV-1, LTR
  • U5 of sequence selected from p17 region H and H ′ which are arrays selected from the region
  • the nucleic acid detection method of this embodiment includes the following primers: (A) a forward primer for synthesizing the target nucleic acid; (B) a reverse primer for synthesizing the target nucleic acid, and (c) a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and the 3 ′ end of the target sequence PCR amplification is performed using a primer (jumped primer) that has a complementary sequence in the downstream region adjacent to the target sequence but does not include a sequence complementary to the target sequence, and is complementary to the target sequence in the PCR amplification product Detection of a hybrid sequence with a single-stranded probe.
  • PCR is performed by repeatedly performing a reaction to synthesize a complementary strand of a target nucleic acid with a DNA polymerase from a primer (forward primer and reverse primer) designed in pairs so as to sandwich the region (target nucleic acid) to be amplified. It is a reaction to replicate nucleic acid.
  • PCR consists of heat denaturation (dissociating double-stranded DNA to be templated into single-stranded DNA by heat) and annealing (primer is bound to single-stranded DNA.
  • the forward primer is the template antisense strand
  • the reverse primer is the template.
  • the target nucleic acid is amplified by repeating the three steps of binding to the sense strand and extension reaction (by synthesizing the complementary strand of the original DNA from the primer by DNA polymerase).
  • target nucleic acid may be either a double-stranded DNA or a single-stranded DNA, and the single-stranded DNA may be either a sense strand or an antisense strand.
  • Target nucleic acids include those before PCR amplification and replicates after PCR amplification.
  • the DNA of the target nucleic acid may be genomic DNA, synthetic DNA, mitochondrial DNA, chloroplast DNA, etc., and may be cDNA reverse transcribed from RNA.
  • the length of the target nucleic acid may be any length that can be amplified by PCR, and the length that can be amplified by PCR is said to be several bases to several tens of kilobases, but is preferably 1000 bases or less, 200 to 260 bases are preferred.
  • a template nucleic acid containing the target nucleic acid sequence is used.
  • Samples containing template nucleic acids include whole blood, serum, plasma, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissues, cells, sputum, nasal discharge, biological samples, plant extracts / pulverized products, foods, Examples include, but are not limited to, drinking water, biological preparations, soil, water such as lakes and rivers, drainage, sewage, and the like.
  • the forward primer and the reverse primer are synthetic oligonucleotides (single-stranded DNA) having a base sequence complementary to the template DNA, and are preferably designed in pairs so as to sandwich the region (target nucleic acid) to be amplified.
  • the primer preferably binds to the template DNA in the region (target nucleic acid) to be amplified, but does not bind to the template DNA in other regions.
  • the length of the primer is preferably 15 to 35 mer, and preferably 18 to 27 mer.
  • the T at the 3 'end should be avoided. Moreover, it is good to design so that a secondary structure may not be taken in a primer.
  • the GC content of the primer should be about 40-60%.
  • the bases (G, A, T, C) constituting the primer should be randomly distributed so as not to partially become GC rich or AT rich.
  • the Tm value of the primer should be about 55 to 60 ° C., and the paired primers should be close to each other.
  • PCR amplification is performed using a jumped primer in addition to a forward primer and a reverse primer.
  • the jumped primer has a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and a sequence complementary to the downstream region adjacent to the 3 ′ end of the target sequence. Primer does not contain a sequence complementary to the target sequence. It is desirable that the 5 'end of the jumped primer and the 5' end of the forward primer coincide.
  • FIG. 1 describes the case where the jumped primer has a sequence overlapping with the forward primer, the jumped primer may have a sequence overlapping with the reverse primer.
  • the length of the target sequence is preferably about one third of the length of the target nucleic acid, and preferably 45 to 90 bases.
  • the length of the jumped primer is preferably 30 mer to 70 mer, and preferably 33 mer to 51 mer.
  • the length of the sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 'end of the target sequence in the jumped primer may be 15 mer to 35 mer, and preferably 18 to 27 mer.
  • the length of the sequence complementary to the downstream region adjacent to the 3 'end of the target sequence in the jumped primer may be 15 mer to 35 mer, and preferably 15 to 24 mer.
  • the concentration ratio between the jumped primer and the forward primer (or reverse primer) may be 1/4 to 1/32, and preferably 1/4 to 1/16.
  • DNA polymerase in PCR amplification, DNA polymerase, buffer, Mg ion, dNTP, reverse transcriptase, PCR enhancer, etc. may be used.
  • PCR In PCR, heat denaturation (dissociation of double-stranded DNA used as a template into single-stranded DNA by heat), annealing (binding a primer to single-stranded DNA), extension reaction (by DNA polymerase from the primer to the original DNA) 3) is repeated, and the target nucleic acid is amplified.
  • the temperature and time of each step and the number of cycles may be adjusted as appropriate.
  • a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) in the PCR amplification product (target sequence) or a sequence complementary thereto is hybridized with a single-stranded probe and detected.
  • the single-stranded probe may have a sequence complementary to part or all of the target sequence or a sequence complementary thereto.
  • the length of the probe is preferably 14-30 mer.
  • a target nucleic acid (double strand) consisting of a sense strand and an antisense strand is amplified by PCR, and a part of the double-stranded DNA (target sequence or a sequence complementary thereto) is single-stranded. It is considered that this single-stranded portion is hybridized with a single-stranded probe and detected (see “double-stranded c. And loop-shaped single-stranded portion c. d.).
  • the double-stranded DNA of the PCR amplification product is once denatured into a single strand, and then a double strand is rapidly formed. By this step, it is considered that more “double strands having a loop-like single-stranded portion” in FIG. 1 are formed.
  • a PCR amplification product is treated with a strong alkali (for example, NaOH), and then a weak acid (for example, CH 3 And a method of neutralizing with COOH).
  • the PCR amplification product may be heat denatured (for example, heated at 94 ° C.
  • the container containing the PCR amplification product may be rapidly cooled in ice water (for example, 94 ° C. to 10 ° C./sec. It is rapidly cooled to the range of 0 ° C to 4 ° C).
  • ice water for example, 94 ° C. to 10 ° C./sec. It is rapidly cooled to the range of 0 ° C to 4 ° C.
  • the inventor denatures the double-stranded DNA of the PCR amplification product into a single strand by strong alkali or heat, and rapidly changes the single strand again by pH change from alkaline to neutral or rapid cooling. It was found that the detection sensitivity increases when it is returned to double strands.
  • the target nucleic acid can be detected by nucleic acid chromatography, microarray, nucleic acid hybridization, or the like.
  • a labeling substance can be used to detect the PCR amplification product.
  • the primer to be used is preferably bound with a distinguishable labeling substance.
  • PCR amplification is performed using a forward primer or reverse primer to which biotin is bound, and avidin-colored latex beads are bound to biotin bound to the PCR amplification product and colored. If the single-stranded probe is fixed to the carrier, the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto hybridizes with the single-stranded probe, and coloring is confirmed at that position.
  • the labeling substance that binds to the primer to be used may be a labeling substance that emits a detectable signal, or a labeling substance that emits a signal in combination with other components.
  • the labeling substance that emits a detectable signal per se include fluorescent labeling substances (for example, FITC, rhodamine, etc.).
  • labeling substances that emit signals in combination with other components include haptens such as biotin and digoxigenin, enzymes such as alkaline phosphatase, and peroxidase.
  • a technique for assuming that the primer is provided with a labeling substance can be appropriately selected by those skilled in the art from known means.
  • the primer set of this embodiment includes the following primers: (A) a forward primer for synthesizing the target nucleic acid, (B) a reverse primer for synthesizing the target nucleic acid, and (c) a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and the 3 ′ end of the target sequence A primer (jumped primer) having a complementary sequence in the downstream region adjacent to but not including a sequence complementary to the target sequence Consists of.
  • the forward primer, reverse primer and jumped primer are described above.
  • the primer set of this embodiment is used for the above-mentioned nucleic acid detection method as an example.
  • the primer set may be included in a nucleic acid detection kit.
  • ⁇ Nucleic acid detection kit> The nucleic acid detection kit of this embodiment includes the above primer set.
  • the kit of this embodiment may further include a single-stranded probe that hybridizes with the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto.
  • the single-stranded probe has been described above.
  • the single-stranded probe that hybridizes with the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto may be held on a carrier.
  • the chromatographic process may be either a dip (immersion) method or a dropping method
  • the material of the carrier is cellulose, nitrocellulose, nylon, polyethersulfone, silica gel, agarose , Dextrin, gelatin and the like, and the shape of the carrier is preferably flat.
  • the carrier is a strip.
  • the strip is usually an elongated belt-like solid phase carrier composed of cellulose fibers, glass fibers, nylons, ceramic fibers and the like.
  • a single-stranded probe that hybridizes with the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto may be immobilized in the direction of development of the specimen by dropping the specimen on the carrier or immersing the carrier in the specimen.
  • a single-stranded probe that hybridizes to a target sequence in a PCR amplification product or a sequence complementary thereto, which is perpendicular to the carrier development direction, may be fixed to constitute one or a plurality of test lines.
  • the kit of this embodiment may further contain a labeling reagent.
  • a labeling reagent for example, biotin is bound to the forward primer or the reverse primer, and the labeling reagent may be avidin colored latex beads.
  • the single-stranded probe that hybridizes with the target sequence or a sequence complementary thereto may be fixed to a substrate (carrier) such as glass, metal, or resin to constitute a microarray.
  • a substrate such as glass, metal, or resin
  • mRNA is extracted from a sample, PCR is performed using cDNA synthesized by reverse transcription as a template, using forward primer, reverse primer, and jumped primer, and the target sequence in the PCR amplification product or a sequence complementary thereto Can be detected by hybridizing with a single-stranded probe of a microarray.
  • the PCR amplification product may be labeled by binding the labeling substance to the primer, and the label on the microarray may be detected.
  • the single-stranded probe may be fixed to beads such as glass, metal, and resin.
  • a single-stranded probe may be immobilized on a nitrocellulose membrane (carrier).
  • mRNA is extracted from a sample, and PCR amplification is performed using a cDNA synthesized by reverse transcription as a template, using a forward primer, a reverse primer, and a jumped primer.
  • Complementary sequences can be detected by hybridizing with single stranded probes on the membrane.
  • the PCR amplification product may be labeled by binding the labeling substance to the primer, and the label on the microarray may be detected.
  • the kit may include DNA polymerase, dNTP, PCR buffer, Mg ion, nucleic acid chromatography development buffer (for nucleic acid chromatography), microarray buffer (for microarray analysis), nucleic acid hybridization buffer, instruction manual, etc. Good.
  • Example 1 Material Platinum Taq (Invitrogen, 10966-034) NaOH (Nacalai Tesque, 31511-05) Acetic acid (Wako Pure Chemical Industries, 015-00257) Custom C-PAS (strip with probe bound), chromatography developer (100 mM NaCl buffer), dye-labeled latex solution (above, TBA)
  • Strips were applied with a region containing the sequence contained in the amplified PCR product as a probe. In HIV-1, LTR and gag sequences are conserved, and the U5 region of LTR, the p17 region in gag is preferred.
  • Strip 1 The strip 1 was coated with the sequences A, B, C, and D selected from the HIV-1 gag and p17 regions in order from the top of the strip (FIGS. 2 and 3). Probes A, B, C, and D all contain the sequence of probe D (SEQ ID NO: 4), and probes A to C are sequences with several bases added at both ends as shown below to function as probes. The required length was confirmed.
  • Lines 10, 12, and 14 are marks used for positioning when A, B, C, and D are applied to the strip 1.
  • A 5′-ATCAATGARGARGCTGCAGAATGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
  • B 5′-CAATGARGARGCTGCAGAATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
  • C 5′-ATGARGARGCTGCAGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
  • D 5'-GARGARGCTGCAGA-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Strip 2 the sequence selected from the ⁇ phage is E, the sequence selected from the HIV-2 LTR, R3 region is F, the sequence selected from the HIV-1 gag, p17 region is G, the sequence selected from the HIV-1 LTR, U5 An array, which is an array selected from the region, was applied to the position H (FIGS.
  • HIV-1 is a collection of strains having various base sequences
  • two types of probes H and H ′ different in length by one base were applied at the same position.
  • the sequence of probe G (SEQ ID NO: 7) is a sequence complementary to the sequence of probe A (SEQ ID NO: 1).
  • C Of “double strand having looped single-stranded portion” shown in FIG. And d.
  • the probe G having the complementary strand of the probe A was used.
  • Lines 20 and 22 are marks used for positioning when E, F, G, and H are applied to the strip 2.
  • E 5′-CTGGCCCTTTCCTTTACCAGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
  • F 5'-CACCCAGGCTCTACCTCTC-3-3 (SEQ ID NO: 6)
  • G 5′-CCCATTCTGCAGCCYTCYTCATTG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • H 5′-GAGGCTTAAGCAGTGGGTTCC-3 ′
  • SEQ ID NO: 8 H ′, 5′-GAGGCTTTAAGCAGTGGGTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
  • FIG. 6 shows an image of the binding position of the primer to the target nucleic acid sequence and the binding position of the probe.
  • gagM-1FA forward primer
  • gagM-1FA-3FB jumped primer
  • gagM-3RA-Bio biotin-labeled reverse primer
  • 5 ′-[Bio] TTTATAGATTTCTCCYACTGGRAYAGGTGG-3 ′ SEQ ID NO: 12
  • PCR product 10.0 ⁇ l 1N NaOH 1.0 ⁇ l After stirring well, the following solutions were added. 1N CH 3 COOH 1.1 ⁇ l Latex beads (Dye-labeled latex solution) 4.0 ⁇ l Chromatographic developing solution 10.0 ⁇ l Strip 1 or 2 was immersed in a pretreated PCR product solution. Chromatography was performed at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes, 10.0 ⁇ l of a new chromatographic developer was added to wash the strip. Depending on the position of the strip band, it was confirmed that the desired product was produced.
  • PCR product 10.0 ⁇ l Latex beads (Dye-labeled latex solution) 4.0 ⁇ l Chromatographic developing solution 10.0 ⁇ l
  • the PCR product is directly reacted with the strip 2 without denaturing the determination.
  • Strip 2 was immersed in the PCR product solution and chromatographed for 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, 10.0 ⁇ l of chromatography developing solution was added to wash the strip. The judgment result is shown in 3.2.2.
  • the additional signal is that the band signal becomes stronger when neutralized with acid after alkali denaturation or ice-cooled after heat denaturation.
  • the single strand generated by the jumped primer during rapid annealing of the denatured DNA The structure of the double-stranded DNA including the single-stranded portion formed between the DNA and the full-length single-stranded DNA complementary thereto is kinetically fixed, so that the number of DNA molecules that can hybridize with the probe increases. It is thought that.
  • the present invention can be used for genetic testing in fields such as medicine and food.
  • ⁇ SEQ ID NO: 1> The sequence of probe A applied to strip 1 (sequence selected from the gag and p17 regions of HIV-1) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 2> The sequence of probe B applied to strip 1 (sequence selected from the gag and p17 regions of HIV-1) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 3> The sequence of probe C applied to strip 1 (sequence selected from the gag and p17 regions of HIV-1) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 4> The sequence of probe D applied to strip 1 (sequence selected from the gag and p17 regions of HIV-1) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 5> The sequence of the probe E applied to the strip 2 ( ⁇ phage sequence) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 6> The sequence of probe F applied to strip 2 (sequence selected from LTR and R3 regions of HIV-2) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 7> The sequence of the probe G applied to the strip 2 (sequence selected from the gag and p17 regions of HIV-1) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 8> The sequence of the probe H applied to the strip 2 (sequence selected from HIV-1 LTR, U5 region) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 9> The sequence of the probe H ′ applied to the strip 2 (sequence selected from the LTR, U5 region of HIV-1) is shown.
  • SEQ ID NO: 10 shows the base sequence of the forward primer (gagM-1FA) used for PCR.

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Abstract

非特異的な増幅による偽陽性が起こりにくい核酸の検出方法を提供する。下記のプライマー： （ａ）標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、 （ｂ）標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び （ｃ）標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５'末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３'末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することを含む、核酸の検出方法。 プライマーセット、核酸の検出キットも提供される。

Description

核酸の検出方法
　本発明は、核酸の検出方法に関する。
　検査紙片上でプローブ核酸とターゲット核酸をハイブリダイズさせる核酸クロマトグラフィーは、ターゲット核酸を簡便に検出する方法として有用である。既存の核酸クロマトグラフィーによる核酸検出法では、ターゲットを増幅するためのプライマーに特殊なタグを付与し、このタグ部分を一本鎖プローブに結合させて検出する方法が用いられていた（非特許文献１、特許文献１、２）。この場合は非特異的に増幅が起こった場合でも検出してしまう偽陽性という問題があった。
ＢｉｏＭｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｖｏｌｕｍｅ　２０１４　（２０１４），　Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ　１８０３２３，　１０　ｐａｇｅｓ）
特開２０１６－２０２０３７ 特開２０１５－１９５９１
　本発明は、非特異的な増幅による偽陽性が起こりにくい核酸の検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、標的核酸の配列を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの他、標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の上流領域と下流領域に相補的な配列を有するプライマー（ジャンプトプライマー（Ｊｕｍｐｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ））を使用してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することにより、標的核酸に特異的な増幅を確認できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　特定の理論に拘泥するわけではないが、標的核酸を増幅するにあたり、３種のプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー、ジャンプトプライマー）を使用してＰＣＲ反応を行うと、二本鎖ＤＮＡの一部（ターゲット配列部分又はターゲット配列に相補的な配列部分）が一本鎖になったＤＮＡが形成され、この一本鎖部分の配列と相補的な配列を有する一本鎖プローブと結合させ検出することができると考えられる（図１）。二本鎖ＤＮＡの一部が一本鎖になったＤＮＡの形成は、ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡを一本鎖にした（変性）後、二本鎖に戻すことにより、増強できる。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記のプライマー：
（ａ）　標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
（ｂ）　標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
（ｃ）　標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することを含む、核酸の検出方法。
（２）ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出する前に、ＰＣＲ増幅産物に追加で変性処理を行うことをさらに含む（１）記載の方法。
（３）ＰＣＲ増幅産物に追加で行う変性処理が加熱であり、加熱後、急冷することをさらに含む（２）記載の方法。
（４）ＰＣＲ増幅産物に追加で行う変性処理がアルカリ処理であり、アルカリ処理後、中和処理することをさらに含む（２）記載の方法。
（５）下記のプライマー：
（ａ）　標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
（ｂ）　標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
（ｃ）　標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）
からなるプライマーセット。
（６）（５）のプライマーセットを含む、核酸の検出キット。
（７）さらに、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブを含む、（６）記載のキット。
（８）ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが担体に保持されている（７）記載のキット。
（９）担体が長方形のセルロース繊維で構成されたストリップであり、検体を担体に滴下するか若しくは検体に担体を浸漬することによる検体の展開方向にＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが固定されている（８）記載のキット。
（１０）前記ストリップに、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが、検体の展開方向に垂直な１本若しくは複数本のテストラインを構成するよう固定されている（９）記載のキット。
（１１）さらに、標識試薬を含む、（６）～（１０）のいずれかに記載のキット。
（１２）フォワードプライマー又はリバースプライマーにビオチンが結合しており、標識試薬がアビジン着色ラテックスビーズである（１１）記載のキット。
　本発明によれば、標的核酸本来の配列を検出することができ、非特異的な増幅による偽陽性が起こる可能性が低くなる。
　本発明により、標的核酸の検出において、非特異的な増幅による偽陽性を減らすことができる。
本発明の概念図を示す。ＰＣＲ反応が終わると、長い二本鎖ＤＮＡと短い二本鎖ＤＮＡ（ａとｂ）のほかに、ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖ＤＮＡ（ｃとｄ）が生成する。ａ、ｂ、ｄはＤＮＡ伸長により合成され、ａ、ｂ、ｃ、ｄはＤＮＡ伸長により合成された二本鎖を一旦一本鎖に変性させ、再度ハイブリダイゼーションさせることにより生成する。 強アルカリによる変性と弱酸による中和を行ったＰＣＲ増幅産物のストリップ１でのクロマトグラフィーによる判定結果を示す。ストリップ１には、ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列であるＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄをプローブとしてストリップの上から順に位置を変えて塗布した。 熱変性（９４℃で２分間）させた後に氷冷したＰＣＲ増幅産物のストリップ１でのクロマトグラフィーによる判定結果を示す。 強アルカリによる変性と弱酸による中和を行ったＰＣＲ増幅産物のストリップ２でのクロマトグラフィーによる判定結果を示す。ストリップ２には、λファージの配列であるＥ、ＨＩＶ－２のＬＴＲ，Ｒ３領域から選んだ配列Ｆ、ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列であるＧ、ＨＩＶ－１のＬＴＲ，Ｕ５領域から選んだ配列であるＨとＨ’を、上からＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈの順で位置を変えて塗布した。 変性させていないＰＣＲ増幅産物のストリップ２でのクロマトグラフィーの判定結果を示す。 標的核酸の配列に対する各プライマーの結合位置と、各プローブの結合位置を示す。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。本発明は、この形態に限定されることはなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、変更、改変などが可能である。
＜核酸の検出方法＞
　本実施形態の核酸検出方法は、下記のプライマー：
（ａ）　標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
（ｂ）　標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
（ｃ）　標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することを含む。
　本実施形態は、ＰＣＲを利用する。ＰＣＲは、増幅を行いたい領域（標的核酸）を挟むようにペアで設計したプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）から、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的核酸の相補鎖を合成する反応を繰り返し行うことにより、標的核酸を複製する反応である。ＰＣＲは、熱変性（鋳型となる二本鎖ＤＮＡを熱で一本鎖ＤＮＡに解離させる）、アニーリング（一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させる。フォワードプライマーは鋳型アンチセンス鎖に、リバースプライマーは鋳型センス鎖に結合する）、伸長反応（ＤＮＡポリメラーゼによって、プライマーから元のＤＮＡの相補鎖を合成する）の３ステップが繰り返され、標的核酸が増幅される。
　「標的核酸」は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖又はアンチセンス鎖のどちらであってもよい。標的核酸には、ＰＣＲ増幅される前のものも、ＰＣＲ増幅された後の複製物も含まれる。標的核酸のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ，葉緑体ＤＮＡなどであるとよく、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであってもよい。
　標的核酸の長さは、ＰＣＲで増幅可能な長さであればよく、ＰＣＲで増幅可能な長さは、数塩基から数十キロ塩基と言われているが、１０００塩基以下であるとよく、２００～２６０塩基が好ましい。
　ＰＣＲ増幅には、標的核酸配列を含む鋳型核酸が用いられる。鋳型核酸を含む試料としては、全血、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、***、唾液、組織、細胞、喀痰、鼻汁のような生体由来試料、植物抽出物・粉砕物、食品、飲料水、生物学的製剤、土壌、湖沼や河川などの水、排水、下水などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
　フォワードプライマーとリバースプライマーは、鋳型ＤＮＡに相補的な塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡ）であり、増幅を行いたい領域（標的核酸）を挟むようにペアで設計するとよい。プライマーは、増幅を行いたい領域（標的核酸）では鋳型ＤＮＡに結合するが、それ以外の領域では鋳型ＤＮＡに結合しないものであるとよい。プライマーの長さは、１５～３５ｍｅｒであるとよく、１８～２７ｍｅｒが好ましい。ＰＣＲ反応において、プライマーダイマーの形成により、目的とする核酸増幅の効率に影響が出ないようにするためには、プライマー同士やプライマー内部で３’側に相補性を持たないようにするとよい。ミスマッチが起こらないようするには、３’末端のＴは避けるとよい。また、プライマー内で二次構造をとらないように設計するとよい。プライマーのＧＣ含量は４０～６０％くらいがよい。プライマーを構成する塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）はランダムに分布し、部分的にＧＣリッチ、ＡＴリッチにならないようにするとよい。プライマーのＴｍ値は、５５～６０℃くらいになるようにし、ペアとなるプライマーは互いにＴｍ値の近いものを選ぶとよい。
　本実施態様においては、フォワードプライマーとリバースプライマーの他に、ジャンプトプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行う。ジャンプトプライマーは、標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するプライマーであって、ターゲット配列に相補的な配列を含まない。ジャンプトプライマーの５’末端とフォワードプライマーの５’末端は一致していることが望ましい。図１では、ジャンプトプライマーがフォワードプライマーと重複する配列を有する場合を記載したが、ジャンプトプライマーはリバースプライマーと重複する配列を有してもよい。
　ターゲット配列の長さは、標的核酸の長さの３分の１程度であるとよく、４５～９０塩基が好ましい。
　ジャンプトプライマーの長さは、３０ｍｅｒ～７０ｍｅｒであるとよく、３３ｍｅｒ～５１ｍｅｒが好ましい。
　ジャンプトプライマーにおけるターゲット配列の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列の長さは、１５ｍｅｒ～３５ｍｅｒであるとよく、１８～２７ｍｅｒが好ましい。
　ジャンプトプライマーにおけるターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列の長さは、１５ｍｅｒ～３５ｍｅｒであるとよく、１５～２４ｍｅｒが好ましい。
　ＰＣＲ反応において、ジャンプトプライマーとフォワードプライマー（あるいはリバースプライマー）の濃度比は、１／４～１／３２であるとよく、１／４～１／１６が好ましい。
　その他、ＰＣＲ増幅においては、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、Ｍｇイオン、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＰＣＲエンハンサーなどを用いるとよい。
　ＰＣＲでは、熱変性（鋳型となる二本鎖ＤＮＡを熱で一本鎖ＤＮＡに解離させる）、アニーリング（一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させる）、伸長反応（ＤＮＡポリメラーゼによって、プライマーから元のＤＮＡの相補鎖を合成する）の３ステップが繰り返され、標的核酸が増幅される。各ステップの温度と時間並びにサイクル数は、適宜調整するとよい。
　本実施態様において、ＰＣＲ増幅産物中の標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出する。一本鎖プローブは、ターゲット配列又はそれに相補的な配列の一部又は全部に相補的な配列を有するとよい。
　プローブの長さは、１４～３０ｍｅｒであるとよい。
　本実施態様において、ＰＣＲにより、センス鎖とアンチセンス鎖からなる標的核酸（二本鎖）が増幅される他、二本鎖ＤＮＡの一部（ターゲット配列又はそれに相補的な配列）が一本鎖になったＤＮＡが形成され、この一本鎖部分が一本鎖プローブとハイブリダイズして、検出されると考えられる（図１の「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖ｃ．及びｄ．）。
　検出感度を高めるには、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡを一旦一本鎖に変性させ、その後急速に二本鎖を形成させるとよい。この工程により、図１の「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖」がより多く形成されると考えられる。二本鎖ＤＮＡを一旦一本鎖に変性させ、その後急速に二本鎖を形成させる方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅産物を強アルカリ（例えば、ＮａＯＨ）で処理した後、弱酸（例えば、ＣＨ３ＣＯＯＨ）で中和する方法が挙げられる。あるいはまた、ＰＣＲ増幅産物を熱変性させてから（例えば、９４℃で２分間加熱）、ＰＣＲ増幅産物を収容する容器を氷水に入れて急冷してもよい（例えば、９４℃から１０℃／ｓｅｃくらいの速度で０℃～４℃の範囲に急冷する）。本発明者は、実施例に示すとおり、強アルカリや熱によりＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させ、アルカリ性から中性へのｐＨ変化や急冷により、一本鎖を再び急速に二本鎖に戻すと、検出感度が上昇することを見出した。
　標的核酸の検出は、核酸クロマトグラフィー、マイクロアレイ、核酸ハイブリダイゼーションなどで行うことができる。
　本実施態様において、ＰＣＲ増幅産物を検出するために、標識物質を使用することができる。使用するプライマーは、識別可能な標識物質が結合していることが好ましい。
　例えば、ビオチンを結合させたフォワードプライマー又はリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物に結合しているビオチンにアビジン着色ラテックスビーズを結合させ、着色する。一本鎖プローブを担体に固定させておけば、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列が一本鎖プローブとハイブリダイズして、その位置で着色が確認される。
　また一方、標識物質は、公知のものを用いることができる。使用するプライマーに結合する標識物質は、それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資であっても、他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質であってもよい。それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資としては、蛍光標識物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）が挙げられる。他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテン、アルカリホスファターゼ、ペルオキシターゼなどの酵素等が挙げられる。プライマーが標識物質を備えたものとする手法は、当業者が適宜公知の手段から選択することができる。
＜プライマーセット＞
　本実施態様のプライマーセットは、下記のプライマー：
（ａ）標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
（ｂ）標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
（ｃ）標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）
からなる。
　フォワードプライマー、リバースプライマー及びジャンプトプライマーについては、上述した。
　本実施態様のプライマーセットは、一例として、上述の核酸の検出方法に用いられる。プライマーセットは、核酸の検出キットに含まれていてもよい。

＜核酸の検出キット＞
　本実施態様の核酸検出キットは、上記のプライマーセットを含む。本実施態様のキットは、さらに、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブを含んでもよい。
　一本鎖プローブについては、上述した。
　ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブは担体に保持されていてもよい。核酸クロマトグラフィーで検出する場合には、クロマト工程は、ディップ（浸漬）方式と滴下方式のいずれであってもよく、担体の材質としては、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエーテルスルフォン、シリカゲル、アガロース、デキストリン、ゼラチンなどを例示することができ、担体の形状は、平板状であるとよい。例えば、担体は、ストリップである。ストリップとは、通常、セルロース繊維、ガラス繊維、ナイロン類、セラミックス繊維等で構成された細長い帯状の固相担体である。検体を担体に滴下するか若しくは検体に担体を浸漬することによる検体の展開方向にＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが固定されていてもよい。担体の展開方向に垂直となる、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが１本若しくは複数本のテストラインを構成するよう固定されていてもよい。
　本実施態様のキットは、さらに、標識試薬を含んでもよい。例えば、フォワードプライマー又はリバースプライマーにビオチンが結合しており、標識試薬がアビジン着色ラテックスビーズであるとよい。
　また、ターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブは、例えば、ガラス、金属、樹脂等の基板（担体）に固定され、マイクロアレイを構成していてもよい。例えば、試料からｍＲＮＡを抽出し、逆転写により合成したｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びジャンプトプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を、マイクロアレイの一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することができる。上述のように標識物質をプライマーに結合させておくことによってＰＣＲ増幅産物を標識し、マイクロアレイ上の標識を検出してもよい。一本鎖プローブは、ガラス、金属、樹脂等のビーズに固定されていてもよい。
　また、核酸ハイブリダイゼーションで検出する場合には、例えば、ニトロセルロースメンブレン（担体）に一本鎖プローブを固定するとよい。この場合も、例えば、試料からｍＲＮＡを抽出し、逆転写により合成したｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びジャンプトプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を、メンブレン上の一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することができる。上述のように標識物質をプライマーに結合させておくことによってＰＣＲ増幅産物を標識し、マイクロアレイ上の標識を検出してもよい。
　キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲバッファー、Ｍｇイオン、核酸クロマトグラフィー展開バッファー（核酸クロマトグラフィーの場合）、マイクロアレイ用バッファー（マイクロアレイ分析の場合）、核酸ハイブリダイゼーション用バッファー、取扱説明書などを含んでもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．材料
Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｔａｑ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０９６６－０３４）
ＮａＯＨ　（ナカライテスク、３１５１１－０５）
酢酸（和光純薬工業、０１５－００２５７）
カスタムＣ－ＰＡＳ（プローブが結合したストリップ）、クロマトグラフィー展開液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ）、色素標識ラテックス液（以上、ＴＢＡ）
２．方法
２．１　ストリップに塗布するプローブの配列
　ストリップには増幅したＰＣＲ産物に含まれる、配列が保存された領域をプローブとして塗布した。ＨＩＶ－１ではＬＴＲ及びｇａｇの配列が保存されており、ＬＴＲのＵ５領域、ｇａｇにあるｐ１７領域が好ましい。
（１）ストリップ１
　ストリップ１として、ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列であるＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄをプローブとしてストリップの上から順に位置を変えて塗布した（図２、３）。プローブＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、いずれもプローブＤの配列（配列番号４）を含み、プローブＡ～Ｃは、以下のとおりその両端に数塩基ずつ付加した配列とし、プローブとして機能するために必要な長さを確認した。
　ライン１０、１２、１４は、ストリップ１にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄを塗布する際の位置決めに使用した目印である。
Ａ，　５’－ＡＴＣＡＡＴＧＡＲＧＡＲＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧ－３’（配列番号１）
Ｂ，　５’－ＣＡＡＴＧＡＲＧＡＲＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧ－３’（配列番号２）
Ｃ，　５’－ＡＴＧＡＲＧＡＲＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴ－３’（配列番号３）
Ｄ，　５’－ＧＡＲＧＡＲＧＣＴＧＣＡＧＡ－３’（配列番号４）
（２）ストリップ２
　ストリップ２として、λファージから選んだ配列をＥ、ＨＩＶ－２のＬＴＲ，Ｒ３領域から選んだ配列をＦ、ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列をＧ、ＨＩＶ－１のＬＴＲ，Ｕ５領域から選んだ配列である配列をＨの位置に塗布した（図４、５）。ＨＩＶ－１は多様な塩基配列を持った株の集合であるため、プローブＨに対応する部位には長さが１塩基異なる２種類のウイルス株が存在する。どちらの株にも対応するように、長さが１塩基異なる２種類のプローブ（ＨとＨ’）を同じ位置に塗布した。
　プローブＧの配列（配列番号７）は、プローブＡの配列（配列番号１）の相補的な配列である。図１に示す「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖」のｃ．及びｄ．の双方が形成されていることを確認するため、この実験ではプローブＡの相補鎖を有するプローブＧを用いた。
　ライン２０、２２は、ストリップ２にＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈを塗布する際の位置決めに使用した目印である。
Ｅ，　５’－ＣＴＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣ－３’（配列番号５）
Ｆ，　５’－ＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＡ－３’（配列番号６）
Ｇ，　５’－ＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＹＴＣＹＴＣＡＴＴＧ－３’（配列番号７）
Ｈ，　５’－ＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣ－３’（配列番号８）
Ｈ’，　５’－ＧＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣ－３’（配列番号９）
２．２　ジャンプトプライマーを加えたＰＣＲ
　ＨＩＶ－１のプロウイルスをクローニングしたプラスミドであるｐＮＬ４３２を鋳型にし、ＰＣＲ増幅を行った。
　ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりである。標的核酸の配列に対するプライマーの結合位置と、プローブの結合位置のイメージを図６に示す。
ｇａｇＭ－１ＦＡ（フォワードプライマー）
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＣＨＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＲＧＡ－３’（配列番号１０）
ｇａｇＭ－１ＦＡ－３ＦＢ（ジャンプトプライマー）
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡ　ＧＡＡＣＣＡＡＧＲＧＧＡＡＧＴＧＡＹＡＴＡＧＣ－３’（配列番号１１）
ｇａｇＭ－３ＲＡ－Ｂｉｏ（ビオチン標識リバースプライマー）
５’－［Ｂｉｏ］ＴＴＴＡＴＡＧＡＴＴＴＣＴＣＣＹＡＣＴＧＧＲＡＹＡＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１２）
　ＰＣＲ反応液は以下のように作成した。
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　ＰＣＲ　ｐｒｏｆｉｌｅは以下のとおりに行った。
　熱変性９４℃、２分行った後、サイクル反応を熱変性９７℃、５秒；アニーリング５６℃、１０秒；伸長反応７２℃、１５秒のサイクルで５回行った後、熱変性９４℃、５秒；アニーリング５６℃、１０秒；伸長反応７２℃、１５秒のサイクルで３０回行った。サイクル反応終了後４℃で保温した。
２．３　核酸クロマトグラフィーを用いたＰＣＲ産物の確認
２．３．１　強アルカリによる変性と酸による中和を行ったＰＣＲ産物のクロマトグラフィーによる判定（図２、４）
　ＰＣＲ産物に対して以下の試薬を加えて前処理した。
ＰＣＲ産物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
１Ｎ　ＮａＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０μｌ
　よく攪拌した後、以下の液を加えた。
１Ｎ　ＣＨ３ＣＯＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　 １．１μｌ
Ｌａｔｅｘ　ｂｅａｄｓ（色素標識ラテックス液）　　　４．０μｌ
クロマトグラフィー展開液　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
　前処理したＰＣＲ産物の溶液にストリップ１又は２を浸漬させた。室温で１０分間クロマトグラフィーを行った。１０分経過後、クロマトグラフィー展開液を新たに１０．０μｌ加え、ストリップを洗浄した。
　ストリップのバンドの位置によって、目的の産物が出来ているか確認した。
２．３．２　熱による変性と氷冷を行ったＰＣＲ産物のクロマトグラフィーによる判定（図３）
　ＰＣＲ産物に対して熱変性を行い、前処理を行った。
　熱変性の方法はサーマルサイクラーによって、９４℃で２分間熱変性させた後、氷水に浸して急冷を行った。
　ＰＣＲクロマトグラフィーによる判定を行うため、試薬を加えて前処理をした。
ＰＣＲ産物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
Ｌａｔｅｘ　ｂｅａｄｓ（色素標識ラテックス液）　　　　４．０μｌ
クロマトグラフィー展開液　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
　前処理したＰＣＲ産物の溶液にストリップ１を浸漬させ、室温で１０分間クロマトグラフィーを行った後、クロマトグラフィー展開液を１０．０μｌ加え、ストリップ１を洗浄した。
ストリップ１のバンドの位置によって、目的の産物が出来ているのか確認した。
２．３．３　ＰＣＲ産物のクロマトグラフィーによる判定（図５）
　ＰＣＲ産物に対して以下の試薬を加えて前処理をした。
ＰＣＲ産物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
Ｌａｔｅｘ　ｂｅａｄｓ（色素標識ラテックス液）　　　　４．０μｌ
クロマトグラフィー展開液　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
　この判定方法は、ＰＣＲ産物を変性させることなく直接ストリップ２に反応させて判定を行なうものである。
　ＰＣＲ産物の溶液にストリップ２を浸漬させ、室温で１０分間クロマトグラフィーを行った。１０分経過後、クロマトグラフィー展開液を１０．０μｌ加え、ストリップを洗浄した。
判定結果は３．２．２に示す。
３．結果
３．１．１　強アルカリを用いたＤＮＡ変性によるストリップ１でのクロマトグラフィーの判定結果
　強アルカリを用いて変性を行ったＤＮＡは、長さを変えた４本のｇａｇのプローブ全てと反応し、シグナルが検出された（図２）。
３．１．２　熱変性を用いたＤＮＡ変性によるストリップ１でのクロマトグラフィーの判定結果
　９４℃で変性した後に氷冷によって冷却したＤＮＡは、長さを変えた４本のｇａｇのプローブ全てと反応し、シグナルが検出された（図３）。
３．２．１　強アルカリを用いたＤＮＡ変性によるストリップ２でのクロマトグラフィーの判定結果
　強アルカリを用いて変性を行ったＤＮＡは、ＨＩＶ－１のｇａｇのプローブと反応し、Ｇのバンドの箇所に青色のシグナルが検出された（図４）。
３．２．２　変性させていないＰＣＲ産物のストリップ２でのクロマトグラフィーの判定結果
　変性をしなかったＤＮＡは、ｇａｇのプローブと反応し、Ｇのバンドで検出されたが、強アルカリによる変性を行った場合に比較して青色は薄くシグナルは弱かった（図５）。
　以上の結果から、通常のフォワードプライマーとリバースプライマーのセットに加えてジャンプトプライマーを加えると、ＰＣＲ増幅産物に一本鎖部分が形成され、当該一本鎖部分に対する相補的な配列を有するプローブを用いて標的核酸を検出できることが確認された。
　ＰＣＲ産物の追加処理とクロマトグラフィーにおけるバンドのシグナル強度の関係をまとめると、ＰＣＲ産物であるＤＮＡをアルカリ変性後に酸で中和したときが最もシグナルが強く、次に熱変性後に氷冷したときであったが、追加処理を行わないで直接クロマトグラフィーを行った場合にもシグナルは検出された。追加処理としてアルカリ変性後に酸で中和、あるいは熱変性後に氷冷させた場合にバンドのシグナルが強くなる原因は、変性後のＤＮＡが急速にアニーリングする際、ジャンプトプライマーによって生成した一本鎖ＤＮＡとそれと相補的な全長一本鎖ＤＮＡの間で形成された、一本鎖部分を含む二本鎖ＤＮＡの構造が速度論的に固定されるため、プローブとハイブリダイズできるＤＮＡ分子が増大することであると考えられる。
　ＰＣＲ産物の追加処理方法として、アルカリ変性後の中和と熱変性後の急冷を比較した場合、熱変性の方が簡便であるが、急冷するためには氷などを用意しなければならず、また冷却速度をコントロールすることが困難であるため、資源の乏しい地域で再現性の高い結果を得るためにはアルカリ変性に中和する方が優れていると考えられる。
　また、プローブにはＰＣＲ産物の２本の相補鎖のうちのどちらを使っても結果が変わらないことが確認された。図２のプローブＡ（配列番号１）と図４のプローブＧ（配列番号７）の配列は互いに相補的であり、いずれのプローブでもシグナルを検出できたことから、図１の「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖」のｃ．及びｄ．の双方が形成されていることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、医療や食品などの分野における遺伝子検査に利用することができる。
＜配列番号１＞
ストリップ１に塗布したプローブＡの配列（ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号２＞
ストリップ１に塗布したプローブＢの配列（ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号３＞
ストリップ１に塗布したプローブＣの配列（ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号４＞
ストリップ１に塗布したプローブＤの配列（ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号５＞
ストリップ２に塗布したプローブＥの配列（λファージの配列）を示す。
＜配列番号６＞
ストリップ２に塗布したプローブＦの配列（ＨＩＶ－２のＬＴＲ，Ｒ３領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号７＞
ストリップ２に塗布したプローブＧの配列（ＨＩＶ－１のｇａｇ，ｐ１７領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号８＞
ストリップ２に塗布したプローブＨの配列（ＨＩＶ－１のＬＴＲ，Ｕ５領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号９＞
ストリップ２に塗布したプローブＨ’の配列（ＨＩＶ－１のＬＴＲ，Ｕ５領域から選んだ配列）を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ＰＣＲに使用したフォワードプライマー（ｇａｇＭ－１ＦＡ）の塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ＰＣＲに使用したジャンプトプライマー（ｇａｇＭ－１ＦＡ－３ＦＢ）の塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ＰＣＲに使用したリバースプライマー（ｇａｇＭ－３ＲＡ－Ｂｉｏ）の塩基配列を示す。

Claims (12)

  1. 下記のプライマー：
    （ａ）標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
    （ｂ）標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
    （ｃ）標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出することを含む、核酸の検出方法。
  2. ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出する前に、ＰＣＲ増幅産物に追加で変性処理を行うことをさらに含む請求項１記載の方法。
  3. ＰＣＲ増幅産物に追加で行う変性処理が加熱であり、加熱後、急冷することをさらに含む請求項２記載の方法。
  4. ＰＣＲ増幅産物に追加で行う変性処理がアルカリ処理であり、アルカリ処理後、中和処理することをさらに含む請求項２記載の方法。
  5. 下記のプライマー：
    （ａ）標的核酸を合成するためのフォワードプライマー、
    （ｂ）標的核酸を合成するためのリバースプライマー、及び
    （ｃ）標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマー（ジャンプトプライマー）
    からなるプライマーセット。
  6. 請求項５のプライマーセットを含む、核酸の検出キット。
  7. さらに、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブを含む、請求項６記載のキット。
  8. ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが担体に保持されている請求項７記載のキット。
  9. 担体が長方形のセルロース繊維で構成されたストリップであり、検体を担体に滴下するか若しくは検体に担体を浸漬することによる検体の展開方向にＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが固定されている請求項８記載のキット。
  10. 前記ストリップに、ＰＣＲ増幅産物中のターゲット配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズする一本鎖プローブが、検体の展開方向に垂直な１本若しくは複数本のテストラインを構成するよう固定されている請求項９記載のキット。
  11. さらに、標識試薬を含む、請求項６～１０のいずれかに記載のキット。
  12. フォワードプライマー又はリバースプライマーにビオチンが結合しており、標識試薬がアビジン着色ラテックスビーズである請求項１１記載のキット。
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