KR102350655B1 - 테스토스테론-특이적 어피바디 및 이의 용도 - Google Patents

테스토스테론-특이적 어피바디 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테스토스테론에 결합하는 어피바디 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 어피바디, 또는 어피바디와 오스테오폰틴 단편의 복합체는 발모 또는 탈모 방지효과가 매우 우수한 바, 발모제 또는 탈모 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

테스토스테론-특이적 어피바디 및 이의 용도{Testosterone-specific Affibody and Uses thereof}
본 발명은 테스토스테론에 특이적인 어피바디 및 이의 용도에 관한 것이다.
탈모란 유전적 요인, 노화, 스트레스, 영양 불균형, 남성호르몬 등 다양한 원인에 의하여 머리카락 또는 체모가 손실되는 질환을 말한다. 탈모의 종류로는 만성 탈모인 남성형 탈모(androgenic alopecia), 외상성 탈모, 화학적 탈모 등이 있다. 현재까지 미국 식품의약청(FDA)에서 허가된 탈모 치료제로는 미녹시딜(Minoxidil)과 피나스테라이드(Finasteride) 두 종류가 있다. 미녹시딜의 모발성장 기전은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나 혈관내피 성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)의 발현을 증가시켜 모유두 세포(dermal papilla cell)에 영양분 공급을 촉진하는 효과와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 피나스테라이드는 남성형 탈모와 전립선 비대증의 원인이 되는 DHT (dihydrotestosterone)의 생성을 억제하는 물질로서, 5-alpha-reductase의 기능을 차단하는 역할을 한다. 그러나, 도포용 제제인 미녹시딜과 경구용 치료제인 피나스테라이드는 모두 가임기 여성과 임산부에는 사용할 수 없으며, 특히 피나스테라이드는 경구용 제제로서 피나스테라이드 복용시 테스토스테론의 DHT로의 전환을 전신적으로 억제하여 성기능 저하 등 부작용이 크다는 문제가 있다. 또한, 실질적으로 탈모의 치료를 위해서, 탈모 환자에게는 모유두 세포 주변의 혈관내피 성장인자를 증가시키는 미녹시딜과 5-alpha-reductase를 차단하는 피나스테라이드를 모두 처방하고 있어, 탈모 환자가 두 가지 약물을 별도로 투여하여야 하므로 사용상의 불편함을 겪고 있다. 이에 전신적 부작용이 적으면서도 약물 투여상의 불편함을 개선할 수 있는 새로운 탈모 치료제 개발에 대한 요구가 점차 증가하고 있는 실정이다.
M Li et al., J Invest Dermatol. 2001 Dec;117(6):1594-600. Hamada et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 10;310(1):153-7.
본 발명자들은 상기와 같은 기존 탈모 치료제의 부작용과 사용상의 불편함을 개선하고 탈모 치료 효과가 우수한 신규한 탈모 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 유리 테스토스테론과 결합하는 신규한 결합 폴리펩타이드 (어피바디, affibody) 및 이를 혈관생성 촉진 폴리펩타이드(pro-angiogenic polypeptide)와 결합한 복합체를 개발하고, 이들의 발모 또는 탈모 치료 효과가 우수함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 혈관생성촉진 폴리펩타이드(pro-angiogenic polypeptide)를 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 또는 복합체를 유효성분으로 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 또는 복합체를 유효성분으로 포함하는 모발 성장 자극용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 '어피바디(Affibody)' 분자는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(Protein A) 중 IgG에 친화성이 있는 부위인 Z-도메인 (Z-domain)으로, 58개의 아미노산 잔기로 이루어진 작은 단백질이다. 이러한 어피바디 분자의 단백질 서열에서 IgG와 결합면을 형성하는 14개의 아미노산은 아미노산 서열에 따라 다양한 타겟 항원에 대한 결합이 가능하며, 무작위적인 배열이 가능하여 라이브러리(library)를 구축할 수 있다. 어피바디 분자는 항체와 유사하게 라이브러리로부터 파아지 디스플레이(phage display), 효모단백질 잡종법(yeast two hybrid, Y2H) 등의 스크리닝 방법을 통해서 다양한 타겟 항원에 대하여 결합할 수 있는 어피바디 분자들을 선별할 수 있다. 타겟 항원과 결합이 가능한 어피바디 분자의 특성을 이용하여 최근 HER2 및 아밀로이드 베타(amyloid-beta)에 특이적으로 결합하는 어피바디가 개발된 바 있다(Orlova et al. 2006, Cancer Res., Gronwall et al., 2007, J. Biotechnol.). 또한, 어피바디는 분자량이 6 kDa으로 매우 작아, 일반적으로 150 kDa의 분자량을 가진 IgG 형태의 항체와 비교하여 인체 투여 시 전신적으로 확산되고, 신장여과로 빠르게 제거되는 특징이 있다. 따라서, 어피바디는 주로 진단시료 연구개발에 응용되고 있다(Goldstein R et al., 2013, Expert Rev Anticancer Ther.). 어피바디는 일반 IgG와 결합된 이중항체의 형태로도 개발되어 지고 있다(Yu F et al., 2014, MAbs).
제1 세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO95/19374에 개시된 바 있고, 제2 세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO2009/080811에 개시된 바 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 94%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다:
VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (서열번호 1).
상기 폴리펩타이드는 상기한 어피바디(Affibody®) 분자로 이루어진다.
본 명세서에서 용어 "친화성(affinity)"은 특정 대상에 대하여 특이적으로 결합하려고 하는 성질 또는 능력을 의미한다. 본 발명과 같은 생물학 분야에서는 특정 물질 간, 예컨대 효소와 기질이 결합하는 능력, 항체가 항원과 결합하는 능력 등 결합력의 강도를 나타내는 용어로 사용된다.
본 명세서에서 용어 "아미노산(amino acid)"은 단백질 분자의 가장 기본적인 구성 단위를 의미한다. 아미노산의 구조를 보면 탄소 원자 1개에 아미노기(- NH2)와 카르복실기(-COOH)가 붙어 있으며 여기에 수소와 R기가 연결되어 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "단백질(protein)"은 모든 생물의 몸을 구성하는 고분자 유기물로서 수많은 아미노산의 연결체이다. 천연 아미노산에는 20여 종류가 있는데, 이 아미노산들이 펩타이드 결합이라고 하는 화학결합으로 서로 연결되어 길게 측쇄형으로 된 것을 폴리펩타이드(polypeptide)라고 한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 당 업계에 공지된 합성 방법, 예를 들어 단백질을 발현하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환하여 재조합 단백질을 합성하거나, 고체상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 테스토스테론을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 폴리펩타이드의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 94%의 서열 상동성(예컨대 94%, 95%, 96%, 97, 98%, 또는 99%)을 가지는 서열을 포함한다. 상기 94% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이의 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 11번째 아미노산 잔기 Q, 17번째 아미노산 잔기 S, 및 25번째 아미노산 잔기 T 중 1 이상의 아미노산 잔기가 서로 독립적으로 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것이다:
VDNKFNKEMV Q AMREI S YLPNLNH T QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 98%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 11번째 아미노산 잔기 Q, 17번째 아미노산 잔기 S, 또는 25번째 아미노산 잔기 T가 아미노산 잔기 A로 치환된 아미노산 서열을 포함한다:
VDNKFNKEMV Q AMREI S YLPNLNH T QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 5 내지 7, 9 내지 14, 16, 및 20 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 밑줄로 표시한 아미노산 잔기를 모두 포함한다:
VDNKFNKE MVQ A MR EI SY LPNLN HT Q IR AFI WV L F DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK.
상기 밑줄로 표시한 아미노산 잔기의 위치는 어피바디(affibody)로 알려진 58개의 아미노산 서열로 이루어진 타겟 결합 폴리펩타이드에 있어서, 타겟에 특이적으로 결합하는 위치의 아미노산 잔기이다. 상기 위치의 아미노산 잔기는 마치 항체의 상보성 결정부위(CDR, complementarity-determining region)와 같은 역할을 수행한다. 어피바디는 58개의 아미노산 서열 중 상기 위치의 아미노산 잔기를 변경함으로써 다양한 타겟에 결합하는 폴리펩타이드로 제조될 수 있다. 상기 밑줄 친 위치의 아미노산 잔기 외의 아미노산 서열은 어피바디의 세 개의 나선형 폴리펩타이드 구조(triple helix polypetide structure)를 유지하는 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 상기 밑줄로 표시한 아미노산 잔기와 동일한 위치 및 종류의 아미노산 서열을 포함하는 다른 스캐폴드 서열로 이루어진, 어피바디 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 혈관신생촉진 폴리펩타이드(angiogenic polypeptide)를 포함하는 복합체를 제공한다.
이 경우 상기 폴리펩타이드 복합체는 각각의 폴리펩타이드 단량체가 연결된 다량체 형태이다. 상기 본 발명의 폴리펩타이드 복합체에 있어서, 각 폴리펩타이드는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혈관신생촉진 폴리펩타이드는 오스테오폰틴 또는 이의 단편을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴의 단편은 서열번호 66의 아미노산 서열(SVVYGLR)을 포함한다. 상기 서열번호 66의 아미노산 서열(SVVYGLR)은 오스테오폰틴의 트롬빈(thrombin)에 의해 절단된 에피토프(cleaved epitope)이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴의 단편은 상기 트롬빈에 의해 절단된 에피토프인 SVVYGLR (OPN-R)을 포함할 수 있으며, 예컨대 GRGDSVVYGLRS, GRGDSVVYGLR, RGDSVVYGLR, SVVYGLRS, 또는 RGDSVVYGLR이다. 본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴의 단편은 carboxypeptidase B (CPB)에 의해 C-말단의 아르기닌이 추가로 절단되어 형성된 OPN-L (SVVYGL)일 수 있다.
상기 오스테오폰틴의 단편 및 이들의 아미노산 서열은 상술한 혈관신생 촉진 폴리펩타이드의 실례 중 하나로 사용한 것이며, 따라서 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서 본 발명의 복합체에 포함되는 혈관신생 촉진 폴리펩타이드는 적합한 혈관신생 촉진 기능을 가지는 어떤 다른 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 혈관신생촉진 폴리펩타이드(angiogenic polypeptide)를 포함하는 복합체를 구성하는 혈관신생촉진 폴리펩타이드(예컨대 오스테오폰틴의 단편)는, 상기 테스토스테론-결합 폴리펩타이드(testosterone-binding polypeptide) (i.e. 어피바디 분자)의 N-말단 및/또는 C-말단에, 보다 구체적으로는 N-말단 또는 C-말단에, 가장 구체적으로는 C-말단에 융합되어 연결될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 테스토스테론-결합 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되어 연결되는 것이 혈관신생 촉진효과 면에서 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 복합체에서 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 및 혈관신생 촉진 폴리펩타이드는 직접적으로 연결되거나, 또는 링커(예컨대 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.
통상의 기술자라면, 융합 단백질의 제작 시 보통 융합하고자하는 기능적 일부분(moiety) 사이에 링커를 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 서로 다른 특성을 가진 다른 종류의 링커, 예를 들어 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커가 있다는 것을 알고 있을 것이다. 링커는 융합단백질의 발현량 증가, 생물학적 활성 향상, 타겟팅을 가능하게 하거나, 약동학을 변경시키기 위한 목적으로, 또는 융합단백질의 안정성을 증가시키고 폴딩을 향상시키기 위해 사용되어 왔다.
따라서 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 복합체는 적어도 하나의 링커, 예컨대 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커로부터 선택되는 적어도 하나의 링커를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 가장 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 링커는 상기 어피바디 분자와 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 사이에 배열된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복합체는 C-말단 및/또는 N-말단에 적어도 하나의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 상기의 추가적인 아미노산 잔기는 예를 들어, 생산성, 정제, 생체 내 또는 생체 외에서의 안정화, 복합체의 커플링 또는 검출을 향상시키기 위한 목적으로 개별적 또는 집합적으로 추가될 수 있다. 예컨대 상기 복합체는 상기 복합체의 C-말단 및/또는 N-말단에 시스테인 잔기가 추가될 수 있다. 추가적인 아미노산 잔기는 정제 또는 폴리펩타이드의 검출을 위한 "태그(tag)"를 제공할 수도 있으며, 예를 들어 그 태그에 특이적인 항체와의 상호작용을 위한 것이거나, 또는 His6 태그의 경우 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 위하여 His6 태그, (HisGlu)3 태그 ("HEHEHE" tag) 또는 "myc"(c-myc) 태그 또는 "FLAG" 태그와 같은 태그를 제공할 수 있다.
상술한 바와 같은 추가적인 아미노산은 본 명세서에서 정의된 i) 테스토스테론-결합 폴리펩타이드, 또는 ii) 테스토스테론-결합 폴리펩타이드와 혈관신생 촉진 폴리펩타이드의 복합체에 화학적 컨쥬게이션에 의해 연결되거나, 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 복합체의 i) 테스토스테론-결합 폴리펩타이드와 ii) 혈관신생 촉진 폴리펩타이드는 적어도 하나의 링커로 연결된다.
이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGG이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 링커는 VDGS 또는 ASGS 등이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 i) 테스토스테론-결합 폴리펩타이드, 또는 ii) 테스토스테론-결합 폴리펩타이드와 혈관신생 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 상기 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 폴리펩타이드 또는 상기 복합체를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 충분하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 복합체를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 적어도 60% 이상의 상동성(예컨대, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 바람직하게는 적어도 70% 이상의 상동성(예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 바람직하게는 적어도 80% 이상(예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%)의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상(예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 70% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이의 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 상술한 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 결합(operatively linked) 된다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt·λ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E.coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 동물 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 E. coli이다. 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 ER2537 E. coli와 BL21(DE3) 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E.coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
상기 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기한 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기한 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 추가적 폴리펩타이드를 포함하는 복합체; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 상기한 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 모발 성장 자극용 화장료(미용용) 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 추가적 폴리펩타이드를 포함하는 복합체를 포함하는 모발 성장 자극용 화장료(미용용) 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 모발 성장 자극용 또는 탈모 치료용 약제학적/화장료(미용 용도) 조성물의 유효성분이 되는 i) 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드; 또는 ii) 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 추가적 폴리펩타이드를 포함하는 복합체는 액체상 및 고체상 합성(예를 들어, t-Boc 고체상 펩타이드 합성 및 BOP-SPPS)과 같은, 알려진 수단에 의해 합성될 수 있다.
또한 상기 i) 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드; 또는 ii) 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 추가적 폴리펩타이드를 포함하는 복합체의 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염을 포함한다는 것이 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 본 발명에서 유용한 전술된 염기 화합물의 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 산 부가 염을 제조하는데 사용되는 산은 무독성 산 부가 염, 즉, 다른 것들 중에서, 특히 염산염, 히드로브로마이드, 히드로아이오디드, 나이트레이트, 설페이트, 바이설페이트(bisulphate), 포스페이트, 인산(acid phosphate), 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 시트르산(acid citrate), 타르타레이트, 비타르타레이트(bitartrate), 숙시네이트, 말레에이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 사카레이트(saccharate), 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 [즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3 나프토에이트)] 염과 같은, 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 음이온을 함유하는 염을 형성하는 것이다. 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 염기 부가 염은 또한 상기 폴리펩타이드 또는 복합체의 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 염 형태를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 복합체는 보관을 위해 동결건조(lyophilise)될 수 있고 사용 전 적절한 담체로 재구성될(reconstituted) 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 복합체는 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 또는 미용적 적용에 관련하여 선택되는, 약제학적으로 허용가능한 및/또는 미용적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 제공된다(예를 들어, 본 명세서 참조로 포함되는, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA 참조).
"약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 제제가 멸균이고 발열원(pyrogen)이 없는 것이다. 적절한 약제학적 담체는 약제학 분야에서 잘 알려져 있다. 상기 담체(들)은 본 발명의 유효성분의 효능에 악영향을 미치지 않고 그의 수용자(recipient)에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능(acceptable)"해야 한다. 전형적으로, 상기 담체는 멸균되고 발열원이 없는 물 또는 식염수일 것이다; 그러나, 다른 허용가능한 담체가 사용될 수 있다. 따라서, "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)" 및 "약제학적으로 허용가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)"는 단순히 담체로서 작용하도록 의도된, 즉, 그 자체의 생물학적 활성을 갖는 것으로 의도되지 않는, 제제의 일부를 형성하는데 사용된 화합물(들)을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 일반적으로 안전하고, 무독성이다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제는 1 이상의 담체 및/또는 부형제를 모두 포함한다.
마찬가지로, 용어 "미용적으로 허용가능한(cosmetically acceptable)"은 화장품으로서 사용하기에 적절한 제제를 나타내는데 사용된다. 적절한 미용적 담체는 샴푸, 로션, 크림, 스프레이 및 다른 이러한 제품에 일반적으로 사용되는 것과 같이, 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
부형제는 하나 이상의 탄수화물, 폴리머, 지질 및 미네랄일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토스, 수크로스, 만니톨, 및 시클로덱스트린을 포함하고, 이것은 예를 들여, 동결건조를 가능하게 하기 위해 조성물에 첨가된다. 폴리머의 예는 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌 옥시드 코폴리머, 상이한 가수분해도(degree of hydrolysis)의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 모든 상이한 분자량의 폴리비닐피롤리돈이고, 이들은 예를 들어, 점도 조절을 위해, 접착을 이루기 위해, 또는 화학적 및 단백질 분해성 분해로부터 지질을 보호하기 위해 상기 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 인산, 모노-, 다이-, 및 트리글리세리드, 세라마이드, 모든 상이한 아실 사슬 길이 및 포화의 스핑고지질 및 당지질, 달걀 레시틴, 콩 레시틴, 수소화된 달걀 및 콩 레시틴이고, 이들은 폴리머에 대한 이유와 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이고, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 색소 특성과 같은 이점을 수득하기 위해 상기 조성물에 첨가된다.
용어 "희석제(diluent)"는 약제학적 제조에서 펩타이드를 희석할 목적을 갖는 수성 또는 비-수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 하나 이상의 식염수(saline), 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 (홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름과 같은) 오일일 수 있다.
희석제는 또한 완충액으로서 기능할 수 있다. 용어 "완충액(buffer)"은 pH를 안정화하는 목적을 갖는 산-염기 혼합물을 함유하는 수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충액의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르타레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
선택적으로, 상기 조성물을 아쥬반트를 포함할 수 있다. 용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 상기 펩타이드의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제제에 첨가된 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 아쥬반트는 상이한 음이온을 갖는 하나 이상의 아연, 구리 또는 은 염일 수 있고, 예를 들어 불화물, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 티오시아네이트, 아황산염, 수산화물, 포스페이트, 카르보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르타레이트, 및 다른 아실 조성의 아세테이트이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 생분해성 마이크로스피어(microsphere)의 형태일 수 있다. 폴리(락트산)(poly(lactic acid); PLA), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid); PGA), PLA와 PGA의 코폴리머(PLGA) 또는 폴리(카르프로락톤)(poly(carprolactone); PCL), 및 폴리안하이드리드와 같은, 지방족 폴리에스테르가 마이크로스피어의 생성에서 생분해성 폴리머로서 널리 사용되어 왔다. 이러한 마이크로스피어의 제조는 US 5,851,451 및 EP0213303에서 확인될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 폴리머 겔, 또는 폴리머로 이루어진 마이크로니들의 형태일 수 있고, 상기 폴리머는 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트 등이다.
상기 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체는 사용되는 유효성분의 효능 또는 독성에 따라, 다양한 농도로 제제화 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 1 nM 내지 1 M, 예를 들어 0.1 μM (micromole) 내지 1 mM, 1 μM 내지 100 μM, 5 μM 내지 50 μM, 10 μM 내지 50 μM, 20 μM 내지 40 μM 및 선택적으로 약 30 μM의 농도로 상기 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체를 포함한다. 생체 외(ex vivo) 및 시험관 내 적용을 위해, 조성물은 더 낮은 농도, 예를 들어, 0.0025 μM 내지 1 μM 의 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 경로 예를 들어, 국부, 피하, 비경구 또는 경구 투여로 투여될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 국부 투여 또는 피내(intracutaneous) [0122] 투여에 적절하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부(예를 들어, 두피)에 국부적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 갖는 혼합물에 현탁 또는 용해된 활성 폴리펩타이드를 함유하는 연고의 형태로 제공될 수 있다: 미네랄 오일, 액체 페트롤라툼, 백색 페트롤라툼, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화(emulsifying) 왁스 및 물. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 예를 들어 하기 중 하나 이상의 혼합물에 현탁 또는 용해된, 적절한 로션 또는 크림으로 제제화될 수 있다: 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물.
선택적으로, 국부 투여용 조성물은 투과 증진제(penetration enhancer)를 포함할 수 있다(예를 들어, 그 개시가 본 명세서에 참조로서 포함된, Osborne & Henke, 1997, Pharmaceutical Technology, November: 58-82 and Pathan & Setty, 2009, Tropical Journal of Pharmaceutical Research 8(2): 173-179에 기재된 바와 같음).
대안적으로, 본 발명의 조성물은 비경구적으로, 예를 들어 피내로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 다른 물질, 예를 들어 혈액과 등장성인 용액을 만드는데 충분한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수성 용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 상기 수성 용액은 필요하면, 적절하게 (바람직하게는 pH 3 내지 9로) 완충되어야 한다. 멸균 상태 하의 적절한 비경구 제제의 제조는 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기법에 의해 손쉽게 달성된다.
비경구 투여에 적절한 조성물은 항산화제, 완충액, 세균 발육 억제제(bacteriostat) 및 의도된 수득자의 혈액과 등장성인 제제를 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 상기 제제는 단위-용량 또는 다회(multi)-용량 용기(container), 예를 들어 밀폐된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용하기 직전에, 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 요구하는 냉동 건조된(동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 파우더, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
상술한 테스토스테론-결합 폴리펩타이드 또는 복합체를 전달하기 위해, 마이크로스피어 제제와 같은, 서방성 시스템을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
안적으로, 조성물은 활성 폴리펩타이드를 요구되는 부위(즉, 표피)에 직접 방출시키는 수술에 의해 이식된 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 경피 방법으로 전달될 수 있다.
예를 들어, 전기천공 요법(electroporation therapy; EPT) 및/또는 이온영동(iontophoresis) 시스템이 단백질 또는 폴리펩타이드의 투여를 위해 채용될 수 있다. 이러한 방법에서, 장치가 펄스된 전기장을 세포에 전달하는데 사용되어, 약물에 대한 세포막의 증가된 투과능 및 세포내 약물 전달의 현저한 증가를 야기한다.
대안적인 경피 방법, 전기 결합(electroincorporation)은 피부의 표면에서 직경 30 미크론까지의 작은 입자가 전기 천공에 사용된 것과 동일하거나 유사한 전기 펄스를 경험한다는 것을 이용한다. 상기 입자는 각질층 (stratum corneum)을 통해 피부의 더 깊은 층으로 들어간다. 상기 입자는 약물 또는 유전자로 충진 또는 코팅되거나, 약물이 들어갈 수 있는 피부의 구멍을 만드는 "총알(bullets)"로서 단순히 작용할 수 있다.
추가적인 경피 방법은 또한 PowderJect Pharmaceuticals (현재 Novartis AG에 의해 소유됨)에 의해 개발되었다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 조성물의 투여를 위한 적절한 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Therapeutic Protein and Peptide Formulation and Delivery, Zahra Shahrokh et al.(Eds), 1997, American Chemical Society, ISBN13: 9780841235281을 참조한다.
본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 유효량으로 대상체(subject)투여된다. 본 명세서에 사용된, '치료적 유효량(therapeutically effective amount)', 또는 '유효량(effective amount)', 또는 '치료적으로 유효한(therapeutically effective)'은 모발 성장에 자극 효과를 제공하는 양을 말한다. 이것은 원하는 치료 효과를 생성하도록 산출된 활성 물질의 미리 결정된 양이다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식되는 바와 같이, 유효성분의 양은 그의 특이적 활성에 따라 달라질 수 있다. 적절한 용량은 요구되는 희석제와 함께 원하는 치료적 효과를 생성하도록 산출된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조를 위한 방법 및 용도에서, 활성 성분의 치료적 유효량이 제공된다. 치료적 유효량은 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 기타 질병 등과 같은, 환자 특성에 기초하여 통상의 의료계 또는 수의계 종사자에 의해 결정될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 탈모는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 안드로겐 탈모 (안드로겐성 탈모, 알로페시아 안드로게네티카(alopecia androgenetica), 남성형 대머리 또는 여성형 대머리로도 알려짐); (b) 견인성 탈모; (c) 성장기 탈모증; (d) 휴지기 탈모증; (e) 원형 탈모; (f) 전두 탈모; (g) 전신 탈모; (h) 모낭염성 탈모; (i) 점액 탈모; (j) 신생물 탈모; (k) 반흔성 탈모; 및 (l) 흉터형성 탈모.
예를 들어, 상기 탈모는 안드로겐 탈모일 수 있다.
대안적으로, 상기 탈모는 예를 들어 방사선요법 및/또는 화학요법에 의해 유도된, 성장기 탈모증일 수 있다(상기 참조).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대상체는 인간, 침팬지, 오랑우탄, 개, 고양이, 말, 햄스터, 마우스, 랫트, 저빌, 돼지, 소 등의 포유동물이고, 가장 구체적으로는 인간이다.
본 발명의 화장료(미용적) 조성물은 의학적 용도에 한정되지 않고 (그들이 어떠한 신체적 건강 개선을 제공하는 것이 아니라, 단순히, 포유동물에 심미적 이점을 제공한다는 의미에서) 미용적 작용제로서도 사용될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식된다.
따라서, 상기 화장료(미용적) 조성물은 기존 모공을 자극하고 및/또는 새로운 모공(또는 이를 생성할 수 있는 줄기 세포)의 성장을 유도하기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미용 조성물은 대머리의 치료 또는 예방을 위해 사용되고, 이것은 후퇴하는 머리선 (receding hairline) 및/또는 숱이 적어지는 머리(thinning hair)와 연관될 수 있다.
이러한 조성물은 두피에 사용하는 것에 한정되지 않고, (수염, 속눈썹 또는 눈썹의 성장을 촉진하기 위해 얼굴을 포함하여) 신체의 어디라도 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 자체로 또는 다른 치료용 또는 미용 작용제와 조합하여 사용될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 기존 모발 빠짐을 예방하고 및/또는 새로운 모발 성장을 자극하는 기존 치료법, 예를 들어, 미녹시딜(Regaine RTM., Pharmacia Corp.) 및 디아족시드(diazoxide)와 같은 포타슘 채널 개방제(opener); 피나스테리드(finasteride)(Propecia RTM., Merck & Co.)와 같은 5-알파-리덕타제 저해제; 및 면역억제제 시클로스포린 A와의 병용 요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 사용될 수 있다는 것이 또한 통상의 기술자에게 인식된다.
따라서, 포유동물에 직접 적용 또는 투여되는 것에 추가하여, 상기 조성물은 생체 외, 예를 들어 포유동물의 피부에 이식하기 전 피부 체외배양조직(explant)에서, 모발 성장을 자극하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 상기 조성물은 시험관 내, 예를 들어 세포 배양에서 모공을 성장시키기 위해 사용될 수 있고, 이것은 그 후 환자에게 이식될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 양태를 시험관 내 또는 생체 외 모발 성장을 자극하기 위한 따른 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
일 구체에에서, 상기 폴리펩타이드는 모공 (또는 이를 생성할 수 있는 줄기 세포, dermal papilla cell)의 성장을 자극하기 위해 사용된다.
본 발명은 테스토스테론에 결합하는 어피바디 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 i) 테스토스테론에 결합하는 어피바디 또는 ii) 상기 어피바디와 오스테오폰틴 단편의 복합체; 및 iii) 이들을 유효성분으로 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 어피바디, 또는 어피바디와 오스테오폰틴 단편의 복합체는 발모 또는 탈모 방지효과가 매우 우수한 바, 발모제 또는 탈모 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 어피바디 클론 T26의 알라닌 스캐닝 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 어피바디 T26의 25번째 아미노산 잔기 트레오닌(T)를 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 T26 변이체의 테스토스테론(T17-G-BSA)과의 결합력을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 어피바디 T26의 25번째 아미노산 잔기 트레오닌(T)를 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 T26 변이체를 정제하여 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 선별된 T26 변이체들의 4종의 BSA (BSA, T3-CMO-BSA, G-BSA, T17-G-BSA)에 대한 결합 여부로부터 T26 변이체들의 테스토스테론에 대한 선택성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 T26 및 T26 변이체들의 테스토스테론(T17-G-BSA)과의 친화성 (EC50)을 확인하기 위하여, 어피바디들의 다양한 농도에서의 ELISA 측정 값을 4-parameter logistic curve로 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 T26 및 T26-INS001을 SDS-PAGE 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 T26 및 T26-INS001의 테스토스테론 결합에 대한 선택성을 확인하기 위하여 BSA와 글리신이 접합된 BSA (G-BSA) 및 테스토스테론이 접합된 BSA (T3-CMO-BSA, T17-G-BSA)들과의 결합 여부를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 T26-INS001의 안정성을 확인하기 위하여, T26 및 시료보관 기간이 다른 T26-INS001의 테스토스테론에 대한 친화성을 확인한 도이다. 상기 도 8에서 1차 생산은 먼저 생산된 T26-INS001 시료를 의미하고, 2차 생산은 30일 후에 생산된 T26-INS001 시료를 의미한다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 T26 및 T26-INS001의 발모 또는 탈모 치료 효과에 대한 in vivo 시험 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 테스토스테론이 고정된 소혈청 알부민 (BSA, bovine serum albumin) 준비
T17-G-BSA 준비
테스토스테론 (TCI, cat. #. T0027)의 17-beta 하이드록시기는 Boc-글리신 (GENERAY BIOTECH, cat. #. 0167)과 에스테르화 반응을 통해 아민기를 도입하였고 Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) (Thermo Fisher, cat. #. 22322) 링커를 이용하여 BSA (Sigam-Aldrich, cat. #. A7030)에 고정하여 BSA-linker-glycine-17beta-hydroxy Testosterone 과 같은 구조의 T17-G-BSA를 제조하였다.
대조군으로서, 글리신이 Sulfo-SMCC 링커로 BSA에 고정된 항원을 준비하였다 (G-BSA). T17-G-BSA 및 G-BSA와의 각각의 반응 혼합물들은 투석여과(diafiltration) 방법 (Sartorius, cat. #. VS2002)을 이용하여 완충용액을 교환하였고, 반응에 참가하지 않고 남은 저분자 물질들을 제거하였다.
T3-CMO-BSA 준비
T3-CMO (Testosterone-3-(O-carboxymethyl)oxime) (Sigma-Aldrich, cat. #. T8390)의 BSA에의 고정은 T3-CMO의 카르복실기와 BSA의 1차 아민의 아미드 결합을 유도함으로써 하였다 (T3-CMO-BSA). T3-CMO-BSA 반응 혼합물은 투석여과(diafiltration) 방법 (sartorius, cat. #. VS2002)을 이용하여 완충용액을 교환하였고, 반응에 참가하지 않고 남은 저분자 물질들을 제거하였다.
실시예 2: Testosterone에 특이적인 어피바디 선별
테스토스테론에 특이적으로 결합하는 어피바디는 T17-G-BSA가 고정된 자성 비드(magnetic beads) (Thermo Fisher, cat. #. 14301)를 이용한 바이오패닝(bio-panning) 방법으로 선별하였다.
Bio-panning에 사용한 T17-G-BSA를 고정한 자성 비드(magnetic beads)의 준비는 다음과 같았다: 자성 비드(Magnetic beads) 30 mg (2 X 109)는 2 ml의 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4)로 3회 세척하여 준비하였다. 실시예 1의 T17-G-BSA 600 μg를 세척한 30 mg의 자성 비드(Magnetic beads)와 섞어주고 용액의 부피를 600 μl가 되도록 0.1 M sodium phosphate buffer를 첨가하였다. 자성 비드의 에폭시기 (Epoxy group)와 T17-G-BSA의 아민기를 반응시키기 위하여 300 μl의 3 M ammonium sulfate를 첨가 후 37 ℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
테스토스테론에 특이적으로 결합하는 어피바디 선별을 위한 바이오패닝(bio-panning) 스크리닝은 다음과 같이 진행하였다: 어피바디 라이브러리는 VCSM13 helper phage를 이용하여 phage 형태로 rescue를 하여 panning에 사용하였다. 최초 항원에 결합시키는 library phage의 수는 1013개 이상으로 사용하였고, 5 round의 panning을 진행하였다. 친화도(Affinity)가 높은 phage를 선택적으로 선별하기 위한 전략으로 panning round 차수가 증가함에 따라 항원 (magnetic beads) 양을 줄여 주었다 (순서대로 50 μg, 30 μg, 20 μg, 20 μg, 10 μg). 세척 횟수는 최초 round에서 PBST (phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20)로 3회 진행하였고, 이 후 차수(2~4 rounds)에서는 5회 진행하였다.
표적 항원에 결합한 phage의 수는 ER2537 E. coli를 이용하여 다음과 같이 측정(titration) 하였다: Bio-panning 각 round에서 얻은 binder phage는 20 mM 유리(free) 테스토스테론이 포함된 0.1 M HCl 용액으로 용출(elution)하였다. SB media (MOPS 10 g/L, Bacto YEAST extract 20 g/L, Trypton 30 g/L)에서 하룻밤(overnight) 배양된 ER2537 E. coli를 새로운 SB media에 1/200배로 희석(dilution)하여 계대한 후 3시간 동안 37℃에서 추가 배양하여 log phage에 도달하게 하였다. 신선한 ER2537 E. coli 100 μL 및 상기 희석된 phage 10 μL를 1.5 ml 단위 튜브에서 섞은 다음, 30분 동안 배양(incubation)한 후 ampicillin을 포함하는 LB plate에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. Phage 수는 생성된 ER2537 E. coli의 집락(colony) 수와 희석배수(dilution factor)를 적용하여 측정하였다.
Bio-panning 각 round에서 얻은 binder phage는 ER2537 E. coli에 감염(infection) 시켜 집락(colony) 형태로 유지한 상태에서 다음과 같이 ELISA 방법으로 각 항원에 대한 결합여부를 확인하였다: Binder phage를 감염(infection) 시켜 얻은 ER2537 E. coli 집락(colony)을 SB media에 접종하고 OD600에서 0.5가 될 때까지 배양하였다. 어피바디 발현유도는 0.5 mM IPTG (엘피스 솔루션)를 첨가하고 30 ℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. ER2537 E. coli의 막간공간의 분획은 BBS buffer (200 mM Boric acid, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)를 이용하여 추출하였다. 어피바디 추출 분획들은 T17-G-BSA가 0.2 mg/well 농도로 코팅된 ELISA plate에 상온에서 1시간 동안 처리 후 TBST (Tris buffered saline + 0.05% Tween 20)로 3회 세척하였다. 어피바디의 항원에 대한 결합여부는 발현된 어피바디 C-말단의 HA(hemagglutinin) tag에 결합하는 anti-HA mouse HRP (Roche, cat. #. 12013819001)를 이차 항체(secondary antibody)로 상온에서 1시간 처리 후 TBST로 3회 세척하고 TMB (3',5,5'-Tetramethylbenzidine) solution으로 발색 후 ELISA reader (Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하여 확인하였다.
본 발명의 목적인 유리(free) 테스토스테론과 특이적 결합이 가능한 어피바디를 선별하기 위해 competitive ELISA를 수행하였다. 어피바디 추출 분획들은 0.1 mM의 유리 테스토스테론과 상온에서 1시간 전처리 과정 후 위의 ELISA 과정을 반복 수행하였다. T17-G-BSA 및 유리 테스토스테론에 모두 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 어피바디 (T26)를 동정하였고 이의 phagemid plasmid를 확보하여 핵산서열 분석을 하여 표 1에 나타내었다.
Bio-Panning으로 선별된 어피바디 및 affinity maturation에 의해 도출된 어피바디들의 서열
Classification Nucleotide sequences Amino acid sequences
T26
(Parental)		 GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATACGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 23) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 1)
T26-Q11A GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTGCTGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATACGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 24) VDNKFNKEMV A AMREISYLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 2)
T26-S17A GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTGCTTACCTGCCCAACCTGAACCATACGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 25) VDNKFNKEMVQAMREI A YLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 3)
T26-T25A GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATGCTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 26) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH A QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 4)
T26-T25R GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATAGGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 27) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH R QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 5)
T26-T25H GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATCATCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 28) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH H QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 6)
T26-T25K GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATAAGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 29) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH K QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 7)
T26-T25D GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATGATCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 30) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH D QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 8)
T26-T25E GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATGAGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 31) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH E QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 9)
T26-T25S GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATAGTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 32) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH S QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 10)
T26-T25N GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATAATCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 33) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH N QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 11)
T26-T25Q GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATCAGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 34) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH Q QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 12)
T26-T25C GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATTGTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 35) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH C QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 13)
T26-T25G GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATGGTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 36) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH G QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 14)
T26-T25P GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATCCTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 37) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH P QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 15)
T26-T25V GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATGTGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 38) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH V QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 16)
T26-T25I GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATATTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 39) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH I QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 17)
T26-T25L GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATCTTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 40) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH L QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 18)
T26-T25F GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATTTTCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 41) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH F QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 19)
T26-T25Y GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATTATCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 42) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH Y QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 20)
T26-T25M GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATATGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 43) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH M QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 21)
T26-T25W GTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATTGGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAG (SEQ ID NO: 44) VDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNH W QIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 22)
실시예 3: T26 친화도 성숙 (Affinity maturation)
선별된 T26 어피바디와 테스토스테론의 결합에 관여하는 부위를 확인하기 위해 가변부위의 알라닌 스크리닝을 수행하였다. 선별된 T-26의 서열을 바탕으로 각 가변부위의 서열이 알라닌으로 치환될 수 있는 프라이머를 디자인하였다. 알라닌 코돈은 GCT를 사용하였다. 알라닌 서열 치환방법은 over-lapping PCR 방법으로 다음과 같이 진행하였다. 돌연변이를 유발하고자 하는 가변부위 아미노산을 기준으로, N-말단 쪽 DNA 절편을 생성하기 위해서 템플레이트 DNA 50 ng, 10 pmol/μL 농도의 #22 forward 프라이머와 가변부위 reverse 프라이머를 각각 4 μL, 10X pfu polymerase mixture (ELPIS biotech, EBT-1011) 10 μL를 PCR 튜브에 넣어준 다음, 총 반응 부피(total reaction volume)가 50 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후, PCR 반응을 진행하였다. 또한, 돌연변이를 유발하고자 하는 가변부위 아미노산을 기준으로, C-말단 쪽 DNA 절편은 위와 같은 조건으로 가변부위 forward와 #24 reverse 프라이머를 사용하여 생성하였다. PCR 반응으로 생성된 상기 두 DNA 절편은 아가로즈 겔에 로딩한 후, DNA gel elution kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, cat. #. 17288)을 사용하여 아가로즈 겔로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 두 DNA 절편 각각 50 ng을 템플레이트 DNA로 사용하여 10 pmol/μL 농도의 #22 forward와 #24 reverse 프라이머 4 μL, 10X pfu polymerase mixture (ELPIS, cat. #. EBT-1011) 10 μL를 PCR 튜브에 넣어준 다음, 총 반응부피(total reaction volume)가 50 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후 두 DNA 절편을 연결하는 오버래핑 PCR을 진행하여 각 가변부위의 아미노산을 알라닌으로 치환한 변이체 서열을 제작하였다. (표 2의 프라이머 서열 참조)
T26 어피바디의 알라닌 스크리닝에 사용된 프라이머 서열
Primers Nucleotide sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
#22 forward gtgtggaattgtgagcggataac 45
#24 reverse atagcccccttattagcgtttgccatc 46
M9A-forward CAAGTTCAACAAGGAGGCTGTTCAGGCCATGCGTG 47
V10A-forward GTTCAACAAGGAGATGGCTCAGGCCATGCGTGAGA 48
Q11A-forward CAACAAGGAGATGGTTGCTGCCATGCGTGAGATTTC 49
M13A-forward GGAGATGGTTCAGGCCGCTCGTGAGATTTCTTACC 50
R14A-forward GATGGTTCAGGCCATGGCTGAGATTTCTTACCTGC 51
S17A-forward CAGGCCATGCGTGAGATTGCTTACCTGCCCAACCTGAAC 52
Y18A-forward CATGCGTGAGATTTCTGCTCTGCCCAACCTGAACC 53
H24A-forward CTTACCTGCCCAACCTGAACGCTACTCAGATCCGTGCCTTC 54
T25A-forward CTGCCCAACCTGAACCATGCTCAGATCCGTGCCTTCAT 55
I27A-forward CAACCTGAACCATACTCAGGCTCGTGCCTTCATTTGGGTTC 56
R28A-forward CTGAACCATACTCAGATCGCTGCCTTCATTTGGGTTCTG 57
W32A-forward CAGATCCGTGCCTTCATTGCTGTTCTGTTCGACGACCCTT 58
V33A-forward GATCCGTGCCTTCATTTGGGCTCTGTTCGACGACCCTTCC 59
F35A-forward CCTTCATTTGGGTTCTGGCTGACGACCCTTCCCAGTC 60
각 클론의 막간공간 분획들은 BSA, T17-G-BSA 그리고 G-BSA 항원들에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 결과 T26 서열에서 11번째 글루타민 (T26-Q11A), 17번째 세린 (T26-S17A) 25번째 트레오닌 (T26-T25A)을 알라닌으로 치환한 3종 클론들에서 T17-G-BSA와 결합과 특이성이 유지되는 것을 확인하였다 (도 1). T17-G-BSA 결합능이 확인된 클론들의 염기, 아미노산 서열은 표 1에 기술하였다. 특히 T25A에서 T17-G-BSA와의 결합능이 모클론에 비해 증가함을 확인하여 25번째 아미노산의 치환이 T26의 테스토스테론에 대한 친화도를 증가시킬 수 있을 가능성이 있는 것으로 판단하였다.
T26의 25번째 자리 트레오닌을 다른 아미노산으로 치환한 어피바디들은 다음과 같이 준비하였다. 선별된 T26의 서열을 바탕으로 26번째 아미노산 트레오닌을 다른 아미노산으로 치환하는 방법은 NNK 프라이머를 사용하여 over-lapping PCR 방법으로 진행하였다. (표 3의 프라이머 서열 참조)
T26-T25X 돌연변에 사용된 프라이머 서열
Primers Nucleotide sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
#22 forward gtgtggaattgtgagcggataac 45
#24 reverse atagcccccttattagcgtttgccatc 46
T25NNK-forward CTGCCCAACCTGAACCATNNKCAGATCCGTGCCTTCAT 61
T25-reverse ATGGTTCAGGTTGGGCAG 62
트레오닌을 다른 아미노산으로 치환한 어피바디들의 염기, 아미노산 서열을 표 1에 기술하였다. 각 클론들의 막간공간 분획들은 BSA와 T17-G-BSA를 항원으로 한 ELISA를 수행하였고 (도 2) 친화도를 기준으로 트레오닌 대신 아르지닌 (T26-T25R), 히스티딘 (T26-T25H), 리신 (T26-T25K), 아스파라진 (T26-T25N), 알라닌 (T26-T25A), 발린 (T26-T25V), 메치오닌 (T26-T25M), 타이로신 (T26-T25Y), 트립토판 (T26-T25W), 글루타민 (T26-T25Q)으로 치환된 10 종의 어피바디를 추가 선별하였다. 선별된 어피바디 유전자들은 PCR 증폭하여 (표 4의 프라이머 서열 참조) NdeI (NEB cat. # R0111L)과 XhoI (NEB cat. # R0146L) 제한효소 처리 후 pET21a (Novagen, cat. #. 69740) 발현 벡터에 클로닝하였다.
T26-T25X 돌연변이 pET21a cloning에 사용된 primer
Primers Nucleotide sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
forward AATTCATATGGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAG 63
reverse CCGCTCGAGCTTGGGAGCCTGGGCGTCGTTC 64
형질전환 BL21 (DE3) colony는 ampicillin 100 μg/ml이 포함된 5 ml 2X YT media (NaCl 5 g/L, Bacto YEAST extract 10 g/L, Trypton 16 g/L)에 접종하고 37 ℃에서 16시간 전배양하였다. 전배양액 200 μl를 250 ml 2X YT media에 접종하고 37 ℃ OD600에서 0.5가 될 때까지 배양하였다. 어피바디 발현유도는 1 mM IPTG를 첨가하고 30 ℃에서 16시간 진탕배양으로 하였다. 원심분리로 모은 균은 lysis buffer (6 M guanidine, 47 mM Na2HPO4, 2.65 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH8.0)로 현탁 후 초음파 파쇄를 하였다. 어피바디들은 Ni-NTA beads (Qiagen, cat. #. 30410)를 이용하여 파쇄액으로부터 정제하고 diafiltration 방법을 이용하여 정제 완충용액에서 PBS로 교체하였다. 정제된 어피바디들은 흡광도 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정제된 재조합 단백질은 4-20% gradient gel을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 3).
정제된 각 어피바디 10 μg/ml (50 μl)은 BSA, T3-CMO-BSA, G-BSA, T17-G-BSA가 각각 well 당 100 ng의 농도로 코팅된 ELISA plate를 이용하여 결합 특이성을 확인하였다. 어피바디들은 상온에서 1시간 처리 후 TBST로 3회 세척하였다. 어피바디의 항원 결합여부는 anti-6x His mouse HRP (R&D systems, cat. #. MAB050H)를 secondary antibody로 상온에서 1시간 처리 후 TBST로 3회 세척하고 TMB solution으로 발색 한 다음 ELISA reader (Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하여 확인하였다. 결과 T26을 포함한 11종의 어피바디들은 테스토스테론이 접합되어 있는 항원인 T3-CMO-BSA와 T17-G-BSA에서만 결합이 확인되었고 BSA와 G-BSA에는 전혀 결합하지 않음을 확인하였다 (도 4).
각 어피바디의 T17-G-BSA에 대한 결합력은 ELISA로 확인하였다. T17-G-BSA가 well 당 100 ng의 농도로 코팅된 ELISA plate에 어피바디를 40 μg/ml의 농도에서 5배씩 10회 연속 희석하여 최소 농도 20.48 pg/ml의 농도로 상온에서 1시간 처리하고 ELISA를 수행하였다. TMB solution의 발색 정도인 OD450의 값은 GraphPad Prism 프로그램에 입력하고 4-parameter logistic curve로부터 EC50 값을 산출하였다 (도 5 및 표 5). 그 결과, T26의 T17-G-BSA에 대한 EC50 값은 약 0.8 μg/ml (1 x 10-7M)로 산출되었고 보다 향상된 친화력을 갖는 어피바디로 T26-T25R (9.3배), T26-T25A (5.6배), T26-T25Q (2.0배)가 확인되었다.
2nd ELISA T26 parental T26-T25R T26-T25H T26-T25K T26-T25N T26-T25A T26-T25V T26-T25M T26-T25Y T26-T25W T26-T25Q
EC50(μg/ml) 0.806 0.087 0.990 1.304 1.013 0.145 0.894 1.100 1.509 0.576 0.400
Affinity 1.0배 9.3배 0.8배 0.6배 0.8배 5.6배 0.9배 0.7배 0.5배 1.4배 2.0배
실시예 4. 어피바디-혈관신생 펩타이드 융합 단백질 생산 및 특성분석
본 발명자들은 상기 T26 어피바디와 오스테오폰틴 단백질의 단편(SVVYGLR)을 펩타이드 링커 (GGGG)로 연결한 복합체를 제조하고, 이를 T26-INS001라고 명명하였다. 상기 T26-INS001은 정제 용이성을 위해 T26의 N-말단 앞으로 6X histidine tag와 그 사이 트롬빈 절단 서열이 부과되는 pET28a 발현 벡터에 다음과 같이 클로닝 하였다: T26이 삽입되어 있는 pET21a vector은 PCR 증폭 템플릿으로 사용하였다 (표 6의 프라이머 서열 참조).
동물 실험 샘플 (T26, T26-INS001) 단백질 발현 벡터 pET28a cloning에 사용된 primer
Primers Nucleotide sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
Forward AATTCATATGGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAG 63
reverse (T26) CCGCTCGAGCTTGGGAGCCTGGGCGTCGTTC 64
reverse (T26-INS001) CCGCTCGAGTTAGCGCAGGCCATACACCACGCTGCCGCCGCCGCCCTTGGGAGCCTGGGCGTCG 65
PCR 증폭 결과물은 NdeI (NEB cat. # R0111L)과 XhoI (NEB cat. # R0146L) 제한효소 처리 후 pET28a (Novagen, cat. # 69864)의 MCS (multiple cloning site)에 삽입하였다. 각 단백질의 핵산, 아미노산 서열은 표 7에 나타내었다.
동물실험에 사용한 시료의 서열
Classification Nucleotide sequence Amino acid sequence
T26 ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATACGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAGTAA (SEQ ID NO: 68) MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 67)
T26-INS001 ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGATGGTTCAGGCCATGCGTGAGATTTCTTACCTGCCCAACCTGAACCATACGCAGATCCGTGCCTTCATTTGGGTTCTGTTCGACGACCCTTCCCAGTCCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGCCCAGGCTCCCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGTATGGCCTGCGCTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAA (SEQ ID NO: 70) MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVDNKFNKEMVQAMREISYLPNLNHTQIRAFIWVLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVVYGLR (SEQ ID NO: 69)
형질전환 BL21 (DE3) colony는 Kanamycin 50 μg/ml이 포함된 5 ml 2X YT media (NaCl 5 g/L, Bacto YEAST extract 10 g/L, Trypton 16 g/L)에 접종하고 37 ℃에서 16시간 전배양 하였다. 전배양액 500 μl를 500 ml 2X YT media에 접종하고 37 ℃ OD600에서 0.5가 될 때까지 배양하였다. T-26 (pET28 벡터에 클로닝), T26-INS001의 발현유도는 1 mM IPTG를 첨가하고 25 ℃에서 24시간 진탕배양으로 하였다. 원심분리로 모은 균은 lysis buffer (6 M guanidine, 47 mM Na2HPO4, 2.65 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH8.0)로 현탁 후 초음파 파쇄를 하였다. T26과 T26-INS001은 Ni-NTA beads를 이용하여 파쇄액으로부터 정제하고 diafiltration 방법을 이용하여 정제 완충용액에서 saline (0.9% NaCl)로 교체하였다. 정제된 T26과 T-26-INS001은 흡광도 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정제된 재조합단백질은 15% SDS-PAGE로 분석하였다 (도 6).
정제된 T26, T26-INS001 0.1 μg/ml (50 μl)은 BSA, T3-CMO-BSA, G-BSA, T17-G-BSA가 각각 well 당 100 ng의 농도로 코팅된 ELISA plate를 이용하여 결합 특이성을 확인하였다. T26, T26-INS001은 상온에서 1시간 처리 후 TBST로 3회 세척하였다. T26과 T-26-INS001의 항원 결합여부는 anti-6x His mouse HRP를 이차 항체(secondary antibody)로 상온에서 1시간 처리 후 TBST로 3회 세척하고 TMB solution으로 발색반응을 한 다음 ELISA reader (Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하여 확인하였다. 결과 T26와 T26-INS001은 테스토스테론이 접합 되어있는 항원인 T3-CMO-BSA와 T17-G-BSA에서만 결합이 확인되었고 BSA와 G-BSA에는 결합하지 않음을 확인하였다 (도 7). T26의 N-말단 펩타이드 (6X 히스티딘 테그, 트롬빈 절단서열)와 C-말단 펩타이드는 T26의 결합 특이성에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
T26, T26-INS001의 T17-G-BSA에 대한 결합력은 ELISA로 확인하였다. T17-G-BSA가 well 당 100 ng의 농도로 코팅된 ELISA plate에 T26과 T-26-INS001를 20 μg/ml (50 μl)의 농도에서 3배씩 8회 연속 희석하여 최소 농도 9 ng/ml의 농도로 상온에서 1시간 처리하고 ELISA를 수행하였다. T26-INS001의 안정성을 확인하기 위해 30일간의 차이가 있는 기존 준비한 시료(1차 생산)와 새롭게 준비한 시료(2차 생산)에 대하여 ELISA를 각각 수행하였다. 1차 생산된 T26-INS001 시료는 2차 생산된 T26-INS001 시료의 생산 전까지 0.9% NaCl 생리 식염수에 용해된 상태로 4℃에서 보관되었다. TMB solution의 발색 정도인 OD450의 값은 GraphPad Prism 프로그램에 입력하고 4-parameter logistic curve로부터 EC50 값을 산출하였다 (도 8). 그 결과, T26의 T17-G-BSA에 대한 EC50 값은 0.5 mg/l (6 x 10-9M)로 산출되었고 T26-INS001은 이보다 2배가량 낮은 EC50 값으로 확인되었다. 이로써 C-말단에 융합된 펩타이드는 T26의 T17-G-BSA에 대한 친화력에 미치는 영향은 크지 않은 것으로 확인되었다. 또한 시료 준비 시기가 다른 T26-INS001 간의 친화력의 차이가 미미한 것으로 T26-INS001의 안정성이 최소 30일간 유지될 수 있음을 확인하였다.
구분 T26 T26-INS (1차 생산) T26-INS (2차 생산)
EC50 0.5081 1.223 0.9548
Affinity 1.0배 0.4배 0.5배
실시예 5. 마우스를 이용한 in vivo 발모효과 검증
본 발명의 T26 및 T26-INS001의 발모 효과를 검증하기 위하여, 수컷 C57BL/6 마우스 (7주령)를 구입(대한 바이오 링크)한 후 1주간 사육실 환경에 적응하도록 하였다. 8주령 차에 마우스의 등 부위를 제모기를 사용하여 긴 털을 깎고 제모제 (80% thioglycolic acid 포함)를 이용하여 털을 완벽하게 제거하였다. 제모 부위에 피부 손상이 없고 피부색이 분홍색인 마우스를 선별하여 무작위로 실험군을 나누었고 하루 동안 안정화를 시켰다.
시험군은 각각 4마리 마우스로 음성대조군 (Saline), T26 투여군 (0.6 μM), T26-INS001 투여군 (0.6 μM)으로 나누었다. 시료의 투여 용량은 총 100 μl를 25 μl씩 나누어 4군데에 피내 주사하였고 투여 빈도는 1일 1회 동일 시간에 진행되었다. 실험기간은 총 29일 진행되었다. 시험기간 중 사진촬영은 3일 간격으로 하였고 발모가 진행되기 시작한 15일차부터는 매일 수행하였다. 도 9a에는 모발 성장 정도를 수치화하기 위하여 전체 제모부위 (피부 주름으로 인한 수치의 비정확성의 이유로 목부위는 제외하였다.)에서 발모가 시작되는 부위를 이미지분석 프로그램 (Image J)으로 구분하여 %로 수치화 하고 4마리 마우스의 평균을 그래프화 하였다 (도 9b).
그 결과, 음성대조군 (Saline)에 비해 T26과 T26-INS001 투여군에서 털이 빨리 자라는 뚜렷한 효과를 관찰할 수 있었다. 수치적 데이터에서도 음성대조군은 실험이 종료되는 시점에 제모면적의 60% 정도에서 발모가 관찰되었으나 T26 투여군은 5일 빠른 24일차에 60% 면적에서 발모가 관찰된다. 특히 T26-INS001 투여군에서는 8일 빠른 21일차에 60% 면적에서 발모가 관찰되며 실험 종료일에 4마리 마우스 모두가 제모 전과 유사한 수준의 털을 보유하게 되었다.
<110> INSSEN Inc. <120> Testosterone-specific Affibody and Uses thereof <130> PN200295 <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T26 (Parental) <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Val Gln Ala Met Arg Glu Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Leu Pro Asn Leu Asn His Thr Gln Ile Arg Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Val Leu Phe Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T26-Q11A <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Val Ala Ala Met Arg Glu Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Leu Pro Asn Leu Asn His Thr Gln Ile Arg Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Val Leu Phe Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T26-S17A <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Val Gln Ala Met Arg Glu Ile 1 5 10 15 Ala Tyr Leu Pro Asn Leu 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Claims (16)

  1. 서열번호 1 내지 7, 9 내지 14, 16 및 20 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 테스토스테론에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 혈관신생촉진 폴리펩타이드(angiogenic polypeptide)를 포함하는 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혈관신생촉진 폴리펩타이드는 오스테오폰틴 또는 이의 단편인, 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 오스테오폰틴의 단편은 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 복합체.
  7. 제1항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자.
  8. 제4항의 테스토스테론-결합 폴리펩타이드와 혈관신생 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자.
  9. 제7항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제8항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제9항의 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포.
  12. 제10항의 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포.
  13. (a) 제1항의 폴리펩타이드; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모치료용 약제학적 조성물.
  14. (a) 제4항의 복합체; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 모발 성장 자극용 또는 탈모치료용 약제학적 조성물.
  15. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 모발 성장 자극용 화장료 조성물.
  16. 제4항의 복합체를 포함하는 모발 성장 자극용 화장료 조성물.
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