TW201809013A - 用於藥物遞送之抗體融合蛋白 - Google Patents

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張博皓
蔡亞萍
陳君瑋
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Abstract

本發明係關於抗體融合蛋白。特定言之，本發明係關於用於胞內及核內藥物遞送之抗體融合蛋白。本發明之融合蛋白可用作肽穿透系統，其特異性地結合至各種目標以將效應肽遞送穿過生物障壁。

Description

用於藥物遞送之抗體融合蛋白
本發明係關於抗體融合蛋白。特定言之，本發明係關於用於胞內及核內藥物遞送之抗體融合蛋白。本發明之抗體融合蛋白具有雙功能目標以結合胞外表面標記物及達成胞內目標調整。
在靶向治療選項中，抗體-藥物結合物(ADC)作為最有前景的選項出現。ADC為單株抗體，其經設計成選擇性地將強效細胞毒性藥物遞送至抗原表現細胞內。用於將藥物連接至抗體之ADC的若干組分(包括抗體、連接子、細胞毒性藥物有效負載及連接位點之選擇)對ADC活性而言係至關重要的。用於製造ADC之細胞毒性藥物(或有效負載)通常經由半胱胺酸或離胺酸殘基結合至抗體。此產生每一抗體具有非均一數目之藥物的ADC。每一抗體對應的藥物之數目通常被稱作藥物與抗體的比率(DAR)，對於IgG1抗體而言，該比率可在0與8個藥物之間變化。具有0個藥物之抗體為無效的且與ADC競爭結合至抗原表現細胞。每一抗體具有8個藥物之抗體具有降低的活體內穩定性，此可能促成非目標相關毒性(non-target related toxicities)。即使具有均一化學計量之純化ADC也將攜帶結合至多個位點之藥物且因此為特有實體之複雜混合物。早期非同質ADC存在阻礙臨床發展之穩定性、藥物動力學及功效問題。儘管化學位點選擇性抗體結合之最新進展(包括使用經工程改造之半胱胺酸殘基、非天然胺基酸、及藉由醣基轉移酶及麩醯胺酸轉移酶之酶結合)導致形成更同質的ADC，但是各方法之間存在若干差別，包括對於抗體基因修飾、在結合中使用酶、及結合位點編號/位置的要求。 WO 2009/025846提供可激活結合多肽(ABP)，其含有目標結合部分(TBM)、遮蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，且表明ABP呈現可激活構形，以使得相比於在能夠裂解CM之裂解劑存在下CM裂解之後，TBM中之至少一者更難以接近未裂解之目標。US 2016/0185875揭示一種能夠選擇性地在目標細胞或組織內激活以治療其中之病症的鉸鏈抗體。鉸鏈抗體包括一個功能抗體、兩個抑制結構域及四個可裂解連接子。然而，這兩個專利公開案之有效負載無法達成滿意效果，所以需要研發具有更高有效負載之藥物遞送系統。
本發明使用包含抗體及一或多個細胞穿透效應肽(CPEP)之抗體融合蛋白，其同時靶向所關注之目標且遞送肽有效負載以用於胞內及核內治療。相比使用化學修飾策略，本發明之抗體融合蛋白不僅簡化均一生產，而且不含任何作為有效負載之化學藥物或用於結合之經修飾化學連接子。 本發明提供一種融合蛋白，其包含：(a)抗體或其抗原結合片段(Ab)，其能夠靶向胞外表面標記物；及(b)融合至(a)之Ab或融合在(a)之Ab內部的一或多個細胞穿透效應肽(CPEP)，其中一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、一個或兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此時CPEP融合至(a)之Ab的末端；或一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此時CPEP用其兩個末端融合在Ab的內部。 在一個實施例中，一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、一個或兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及結合至胞內目標之效應肽(EP)；該CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此時CPEP融合至抗體或其抗原結合片段之末端。 在另一實施例中，一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及結合至胞內目標之效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此時CPEP用其兩個末端融合在抗體或其抗原結合片段的內部。亦即，CPEP以上述配置中之任一種配置整合至抗體或其抗原結合片段(Ab)內。在一個實施例中，CPEP融合在Ab之重鏈的內部。 在另一實施例中，CPEP融合至Ab之重鏈的末端或內部。 在例示性實施例中，本文的第13頁第2段描述較佳抗體。在一個實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。在一些實施例中，抗體之抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2 片段、單鏈片段、雙功能抗體或線抗體。 在一些實施例中，一或多個CPEP融合至Ab之N端或C端，或融合在Ab內部。 PCD具有包含5至20個或其任何中間範圍之連續鹼性胺基酸之序列。在一個實施例中，聚陽離子肽係選自由以下組成之群：聚離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、聚組胺酸、及陽離子多醣或其混合物。在另一實施例中，聚陽離子肽為包含選自由以下組成之群之聚陽離子中的至少兩者的組合物：離胺酸、精胺酸、聚離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、聚組胺酸及陽離子多醣。在一較佳實施例中，聚陽離子肽組合物由離胺酸及精胺酸組成。在另一實施例中，聚陽離子肽為均聚物或共聚物，或其混合物。 EP為結合至胞內目標之蛋白有效負載。EP之實施例描述於本文之第16頁第3段中。用於本發明之例示性融合蛋白中的較佳EP及其序列列出於本文之第17頁第2段中。 本發明之CPEP的可裂解連接子(CL)為包含複數個胺基酸殘基的可裂解連接子。舉例而言，CL可包括約4至約100個之間的胺基酸，或約6至約30個之間的胺基酸。CL可包括胺基酸殘基，且可為約4至約30個之間，或約4至約10個之間的胺基酸殘基的肽鍵。CL可藉由細胞環境中所發現之條件裂解，諸如酸性條件，其可在癌細胞及癌組織或還原環境附近發現，如可於低氧或局部缺血細胞及組織附近發現；可藉由在具有待治療病症之細胞(諸如，患病、凋亡或壞死細胞及組織)的表面上發現或在細胞附近釋放的蛋白酶或其他酶類裂解；或可藉由其他條件或因子裂解。用於裂解CL之例示性酶類包括(但不限於)本文之第19頁第3段中所描述者。在一些實施例中，CL係選自本文之第20頁第2段中所描述者。 CPEP可視情況包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)。在一個實施例中，當CPEP具有聚陰離子結構域(PAD)時，CPEP為可激活性細胞穿透效應肽(ACPEP)。PAD為具有包含4至20個酸性胺基酸(較佳5至9個酸性胺基酸)之序列的聚陰離子肽。PAD可有效形成自組裝之聚陰離子-聚陽離子相互作用以防止ACPEP穿過細胞膜。在一些實施例中，PAD具有包含4至20個或其任何中間範圍之連續酸性胺基酸的序列。 在一些實施例中，當CPEP融合至(a)之Ab的末端時，本發明之融合蛋白自N端至C端具有以下配置：(EP-PCD-CL)-Ab、(PCD-EP-CL)-Ab、(EP-PCD-CL-PAD)-Ab、(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab、Ab-(CL-PCD-EP)、Ab-(CL-EP-PCD)、Ab-(PAD-CL-PCD-EP)或Ab-(CL-EP-PCD-CL-PAD)。 在一些其他實施例中，當CPEP用其兩個末端融合在Ab內部時，本發明之融合蛋白自N端至C端具有以下配置：AbN -(CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL-PAD)-AbC 或AbN -(CL-PCD-EP-CL-PAD)-AbC ，其中AbN 為Ab之N端片段且AbC 為Ab之C端片段。 本發明之融合蛋白具有雙官能目標以結合胞外表面標記物及達成胞內目標調整。本發明之融合蛋白的效應肽可藉由在特定條件存在下或在特定環境中裂解CL而進入目標細胞內。在較佳實施例中，CL在生理條件下可裂解。此CL之裂解可藉由特定病理性信號或與需要融合蛋白遞送之細胞相關的特定環境來強化或實現。CL可由特異性的酶裂解，使得細胞攝取可靶向至特定位置，其中可得到該等條件。在CL裂解之後，融合蛋白之PCD-EP或EP-PCD部分自Ab釋放。 在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含具有選自SEQ ID NO. 9、13、15、17、19、21或23之胺基酸序列的重鏈序列及具有選自SEQ ID NO. 11之胺基酸序列的輕鏈序列。 本發明亦提供用於將效應肽遞送至細胞內之組合物。在一個實施例中，組合物包含本發明之融合蛋白及藥理學上適合之載劑。 本發明亦提供用於將效應肽遞送至細胞內或細胞核內之方法，其包含向個體投與本發明之融合蛋白或包含本發明之融合蛋白的組合物。
在以下描述中，使用許多術語且提供以下定義以有助於理解所主張之主題。在本文中未明確定義之術語係根據其普通及一般含義使用。 在多個實施例中，本文所述之抗體、結合片段及聚核苷酸藉由其各別多肽或聚核苷酸序列描述。除非另外指示，否則多肽序列以N至C定向提供；聚核苷酸序列採取5'至3'定向。對於多肽序列而言，可使用基因編碼胺基酸之習知的三字母或一字母縮寫。 用於本發明中之肽的縮寫如下： Ab：抗體或其抗原結合片段； CPEP：穿透效應肽； PAD：聚陰離子結構域； CL：可裂解連接子； PCD：聚陽離子結構域； EP：效應肽； AbN ：抗體或其抗原結合片段(Ab)之N端片段；及 AbC ：抗體或其抗原結合片段(Ab)之C端片段。 除非另外規定，否則術語「一(a/an)」意指「一或多個」。 除非本文另外清楚指示，否則術語「或」在本文中用以意指術語「及/或」且可與術語「及/或」互換地使用。 在此申請案通篇中，術語「約」用於指示包括固有誤差變化之值。 如本文所使用，術語「有效負載」係指EP。EP為結合至胞內目標之肽或蛋白有效負載。 如本文所使用，術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「聚核苷酸序列」及「聚核苷酸」可互換使用。其係指任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合形式或其類似物。聚核苷酸可為單股或雙股，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。 如本文所使用，術語「胺基酸」指示通式NH2 CHRCOOH之有機化合物，其中R可為任何有機基團。具體言之，術語胺基酸可指天然及非天然(人造)胺基酸，諸如Aib=α-胺基異丁酸；tBuAla=第三丁基丙胺酸；Thr-OBzl=蘇胺酸苯甲酯；5Ava=5-胺基戊酸；Asp=D=天冬胺酸；Ala=A=丙胺酸；Arg=R=精胺酸；Asn=N=天冬醯胺；Gly=G=甘胺酸；Glu=E=麩胺酸；Gln=Q=麩醯胺酸；His=H=組胺酸；Ile=I=異白胺酸；Leu=L=白胺酸；Lys=K=離胺酸；M=甲硫胺酸；Mamb=(3-胺甲基)苯甲酸；Mamp=Met=(3-胺甲基)苯乙酸；Nle=正白胺酸；Nva=正纈胺酸；Phe=F=***酸；Pro=P=脯胺酸；Ser=S=絲胺酸；Thr=T=蘇胺酸；Trp=W=色胺酸；Tyr=Y=酪胺酸；及Val=V=纈胺酸。 如本文所使用，術語「穿透肽」係指任何促進物質移位穿過生物障壁之肽。生物障壁之實例包括(但不限於)緊密結合部及質膜。細胞穿透肽(CPP或PCD)能夠穿透細胞膜且將不同貨物(cargo)移位至細胞中。 如本文所使用，術語「多肽」及「蛋白」在本文中可互換使用，用於指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變體。 如本文所使用，術語「抗體」係指完整抗體、單株抗體或多株抗體。術語「抗體」亦涵蓋諸如雙特異性抗體之多特異性抗體。人類抗體通常由兩個輕鏈及兩個重鏈組成，該等輕鏈及重鏈各自包含可變區及恆定區。輕鏈可變區包含側接構架區之3個CDR，在本文中被標識為CDRL1或L1、CDRL2或L2及CDRL3或L3。重鏈可變區包含側接構架區之3個CDR，在本文中被標識為CDRH1或H1、CDRH2或H2及CDRH3或H3。本發明之人類化抗體的CDR可使用Kabat及Chotia定義標識。 如本文所使用，術語「可激活」或「可切換」係指可激活的細胞穿透效應肽(ACPEP)在天然或未裂解狀態(亦即，第一構形)下呈現未結合至目標的第一層級，及在裂解狀態(亦即，第二構形)下呈現結合至目標的第二層級。 如本文所使用，如本文所用之術語「投與(administer/administering/to administer)」係指給予或供應藥物，包括活體內投與以及活體外直接向組織投與。 如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」係指化合物及組合物適合向人類及/或動物投與而不會有與合理的效益/風險比相稱的過度不良副作用，諸如毒性、刺激及/或過敏反應。 如本文所使用，術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用且應理解為係指溫血動物，尤其哺乳動物。此術語之範疇及含義內之動物的非限制性實例包括天竺鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、山羊、牛、綿羊、動物園動物、非人類靈長類動物及人類。 如本文所使用，術語「有效量」係指當以本發明概念之方式使用時，足以呈現可偵測之治療效果而不會有與合理的益處/風險比相稱的過度不良副作用(諸如毒性、刺激及過敏反應)的融合蛋白或肽的量。 如本文所使用，術語「治療有效量」係指足以呈現可偵測之治療效果之融合蛋白或肽的量，當向哺乳動物或其他個體投與以治療疾病時，該量足以實現疾病的此種治療。 如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語涵蓋對哺乳動物，尤其人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防疾病在易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之個體中發生；(b)抑制疾病，即遏制其發展；及(c)減輕疾病，即引起疾病消退。 本發明提供一種用作肽穿透系統之融合蛋白，其特異性地結合至各種目標以將效應肽遞送穿過生物障壁。本發明之融合蛋白可彌補此項技術內存在之缺陷，諸如低效、活性物質之生物性質的改變、殺滅目標細胞、生物障壁之不可逆破壞及/或待用於人類個體中之高風險。本發明之融合蛋白呈現未改變之生物活性物質(諸如效應肽)的高效非侵襲性遞送。 在一個態樣中，本發明提供一種融合蛋白，其包含： (a) 抗體或其抗原結合片段(Ab)，其能夠靶向胞外表面標記物；及 (b) 融合至(a)之Ab或融合在(a)之Ab內部的一或多個細胞穿透效應肽(CPEP)， 其中一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、一個或兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此時CPEP融合至(a)之Ab的末端，或 一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此時CPEP用其兩個末端融合在Ab的內部。 將一或多個CPEP融合至抗體或其抗原結合片段，或融合在抗體或其抗原結合片段的內部。用於本發明中之抗體或其抗原結合片段特異性地結合至表現所關注目標的任何細胞或細胞群體上的所關注目標。例示性目標包括(但不限於)胺基酸序列(例如，多肽、肽及蛋白質)、多醣、寡醣、碳水化合物及脂質。目標之特定非限制性種類包括受體及抗原。目標包括結合至抗原、受體或配位體之受體，其包括激素、生長因子、分化簇(統稱為CD分子或CD標記物)、激素及生長因子類似物，及激素、激素類似物、生長因子、生長因子類似物之片段，及生長因子及類似物之片段。抗原目標包括病毒、細菌、真菌及寄生物抗原。抗原目標亦包括腫瘤相關抗原(TAA)。在一個實施例中，目標為胞外目標。例示性較佳胞外目標包括(但不限於)下表中所列舉者。 結合至目標之例示性抗體包括(但不限於)下表中所列舉者。 在其他實施例中，抗體為阿特珠單抗、艾維路單抗、培立珠單抗、杜里土單抗、帕妥珠單抗或紮魯姆單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗。在一個實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。 抗體之抗原結合片段係指包含完整抗體之組分子集且保持抗體之抗原結合性質的蛋白。抗體之抗原結合片段通常將包含至少一個可變域。可變域可為任何尺寸或胺基酸組成且一般將包含與一或多個構架序列相鄰或同框之至少一個CDR。在具有與VL域相關聯之VH域的抗原結合片段中，VH及VL域可在任何適合之配置內相對於彼此定位。舉例而言，可變區可為二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL域。在一些實施例中，抗體之抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2 片段、單鏈片段、雙功能抗體或線抗體。 在一個實施例中，一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、一個或兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此時CPEP融合至抗體或其抗原結合片段之末端。 在另一實施例中，一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此時CPEP用其兩個末端融合在抗體或其抗原結合片段的內部。亦即，CPEP整合入呈上述配置中之任一者的抗體或其抗原結合片段(Ab)內。 本發明之CPEP的可裂解連接子(CL)為包含複數個胺基酸殘基的可裂解連接子。CPEP可包含一個或兩個CL。兩個CL可為相同的或不同的。當CPEP不具有PAD時，CL需要將抗體或其抗原結合片段與PCD-EP或EP-PCD連接。當CPEP具有PAD時，CL用以將酸性部分PAD與鹼性部分PCD連接。舉例而言，CL可包括約4至約100個之間的胺基酸，或約6至約30個之間的胺基酸。CL可包括胺基酸殘基，且可為約4至約30個之間，或約4至約10個之間的胺基酸殘基的肽鍵。 PCD為具有包含5至20個鹼性胺基酸(較佳7至12個鹼性胺基酸)之序列的聚陽離子肽，其可有效地將CPEP傳輸穿過至少一個哺乳動物細胞之膜。亦發現聚陽離子肽具有核定位能力。PCD具有包含5至20個或其任何中間範圍之連續鹼性胺基酸之序列。在一個實施例中，PCD包含7至12個連續鹼性胺基酸。在一個實施例中，鹼性胺基酸在pH為6.0時帶正電荷。在一個實施例中，聚陽離子肽係選自由以下組成之群：聚離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、聚組胺酸及陽離子多醣或其混合物。在另一實施例中，聚陽離子肽為包含選自由以下組成之群之聚陽離子中的至少兩者的組合物：離胺酸、精胺酸、聚離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、聚組胺酸及陽離子多醣。在一較佳實施例中，聚陽離子肽組合物由離胺酸及精胺酸組成。在另一實施例中，聚陽離子肽為均聚物或共聚物，或其混合物。聚陽離子肽均聚物包含相同陽離子單體之單一重複單元。聚陽離子肽共聚物包含不同陽離子單體或不同陽離子聚合物。在一個實施例中，聚陽離子肽共聚物可包含陽離子單體之混合物、聚陽離子均聚物之混合物或聚陽離子共聚物之混合物。在一些實施例中，PCD包括非標準胺基酸，例如羥基離胺酸、鎖鏈素、異鎖鏈素或其他非標準胺基酸。 EP為結合至胞內目標之蛋白有效負載。在一個實施例中，EP為蛋白或功能蛋白之肽片段酶域。例示性EP包括(但不限於)下表中所列舉者。 用於本發明之例示性融合蛋白中的較佳EP及其序列列出於下表中。 CPEP可視情況包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)。在一個實施例中，當CPEP具有聚陰離子結構域(PAD)時，CPEP為可激活的細胞穿透效應肽(ACPEP)。ACPEP呈現與目標蛋白的可激活結合(可切換結合)。藉由經由蛋白酶-可裂解連接子將細胞穿透肽融合至聚陰離子肽結構域來阻斷細胞穿透肽之全身性細胞攝取，從而經由形成分子內髮夾結構中和該聚陽離子結構域。為了特異性，設計連接子以使得其被某些酶裂解。在投與之後，具有本發明之ACPEP的融合蛋白行進至腫瘤，其中ACPEP被蛋白酶裂解且積聚在目標組織內。 PAD為具有包含4至20個酸性胺基酸(較佳5至9個酸性胺基酸)之序列的聚陰離子肽。PAD能有效形成自組裝之聚陰離子-聚陽離子相互作用以防止ACPEP穿過細胞膜。在一些實施例中，PAD具有包含4至20個或其任何中間範圍之連續酸性胺基酸的序列。在一個實施例中，PCD包含5至9個連續酸性胺基酸。在一個實施例中，酸性胺基酸在pH為6.0時帶負電荷。在一個實施例中，酸性胺基酸具有pKa低於6.0之側鏈。酸性胺基酸之非限制性實例包括天冬胺酸、麩胺酸、磷絲胺酸及磷酸蘇胺酸。在一特定實施例中，PAD包含5至9個連續麩胺酸鹽、天冬氨酸鹽或其混合物。在一些實施例中，PAD包含一或多個D-胺基酸。在一特定實施例中，PAD由D-胺基酸組成。在一些實施例中，PAD為6個連續天冬胺酸鹽。在一些實施例中，PCD包括非標準胺基酸，例如羥基離胺酸、鎖鏈賴氨酸、異鎖鏈素或其他非標準胺基酸。部分A可包括經修飾之胺基酸。 在一些實施例中，當CPEP融合至(a)之Ab的末端時，本發明之融合蛋白自N端至C端具有以下配置：(EP-PCD-CL)-Ab、(PCD-EP-CL)-Ab、(EP-PCD-CL-PAD)-Ab、(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab、Ab-(CL-PCD-EP)、Ab-(CL-EP-PCD)、Ab-(PAD-CL-PCD-EP)或Ab-(CL-EP-PCD-CL-PAD)。 在一些其他實施例中，當CPEP用其兩個末端融合在Ab的內部時，本發明之融合蛋白自N端至C端具有以下配置：AbN -(CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL-PAD)-AbC 或AbN -(CL-PCD-EP-CL-PAD)-AbC ，其中AbN 為Ab之N端片段且AbC 為Ab之C端片段。在CPEP用其兩個末端融合在Ab內部的情況下，CPEP整合至Ab內的關注位置中，從而使得本發明之融合蛋白自N端至C端包含抗體N端片段、CPEP及抗體C端片段。抗體N端片段及抗體C端片段之尺寸視CPEP整合入的位置而變化。 在另一實施例中，CPEP融合至Ab之重鏈的末端或內部。 本發明之融合蛋白具有雙官能目標以結合胞外表面標記物及達成胞內目標調整。本發明之融合蛋白的效應肽可藉由在特定條件存在下或在特定環境中裂解CL而進入目標細胞內。在較佳實施例中，CL在生理條件下可裂解。此CL之裂解可得到強化或可藉由特定病理信號或與需要融合蛋白遞送之細胞相關的特定環境來實現。CL可藉由特異性酶裂解，從而使得細胞攝取可以靶向至得到該等條件之特定位置。在CL裂解之後，融合蛋白之PCD-EP或EP-PCD部分自Ab釋放。 在一些實施例中，CL可藉由細胞環境中所發現之條件裂解，諸如酸性條件，其可在癌細胞及癌組織或還原環境附近發現，如可於低氧或局部缺血細胞及組織附近發現；可藉由在具有待治療病症之細胞(諸如，患病、凋亡或壞死細胞及組織)的表面上發現或在細胞附近釋放的蛋白酶或其他酶類裂解；或可藉由其他條件或因子裂解。 用於CL裂解之例示性酶類包括(但不限於)下表中所列舉者。 用於本發明之例示性融合蛋白中的較佳CL及其序列列出於下表中。 在一些實施例中，本發明之融合蛋白展示於下表中。各融合蛋白之核苷酸及胺基酸序列亦列於下表中。因此，在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含具有選自SEQ ID NO. 9、13、15、17、19、21及23之胺基酸序列的重鏈序列及具有選自SEQ ID NO. 11之胺基酸序列的輕鏈序列。因此，本發明之融合蛋白包含： 3D4KLA：具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4S9：具有SEQ ID NO:13之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9：具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-△D6：具有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-A：具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-D：具有SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列；或 3D4Fc-rS9：具有(SEQ ID NO:23)之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。 融合蛋白之製備可藉由任何用於製備蛋白質的通用方法進行，諸如蛋白質之化學合成、使用包含(攜載)編碼融合蛋白之各組分之聚核苷酸的表現(重組)載體(在合適宿主細胞內)的蛋白表現及其類似方法。 本發明之融合蛋白可根據習知之公眾已知的基因工程技術製造。因此，舉例而言，必要時擴增編碼Ab之DNA及編碼CPEP之DNA中之每一者，彼等DNA彼此結合，將所得DNA***至細胞表現載體中，且用載體轉染宿主細胞以表現融合蛋白，由此可製造本發明之融合蛋白。DNA之擴增可藉由例如PCR方法進行。擴增DNA的結合可例如藉由重疊延伸PCR方法進行。亦可設計待表現之融合蛋白的胺基酸序列以便直接製備人工合成基因。表現載體較佳包括用於促進表現效率之啟動子，及用於自培養上清液輕易回收經表現之融合蛋白的分泌信號序列，諸如抗體重鏈信號序列或抗體κ鏈信號序列。至於表現宿主細胞，可使用哺乳動物細胞、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、細菌細胞(大腸桿菌等)等。其中，動物細胞為較佳的，且CHO細胞、HEK293細胞等為尤其較佳的。 對於熟習此項技術者而言，顯而易見的係如此定義之融合蛋白可藉由肽及蛋白質之已知化學合成方法合成。融合蛋白可藉由化學肽合成方法合成，尤其使用利用適合樹脂作為載體之固相肽合成技術。或者，融合蛋白可藉由肽之化學合成方法以連續蛋白形式合成。或者，蛋白之個別片段(結構域)可分別合成，且隨後藉由一個肽片段之胺基端自第二肽之羧基末端的縮合經由肽鍵一起組合在一個連續肽中。此等技術為習知的且熟知的。 本發明亦提供用於將效應肽遞送至細胞內之組合物。在一個實施例中，組合物包含本發明之融合蛋白及藥理學上適合之載劑。此等組合物通常製備為液態溶液或懸浮液，然而，亦涵蓋固體形式，諸如錠劑、丸劑、粉末及其類似物。本發明之融合蛋白可與醫藥學上可接受且可與該融合蛋白相容的賦形劑混合。適合之賦形劑為例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物或其組合。此外，組合物可含有少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑及其類似物。此外，組合物可含有各種輔料(可誘導或增加針對抗原或免疫原之體液及/或細胞免疫反應之化合物)。若需要投與口服形式之組合物，則可添加各種增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結合劑及其類似物。本發明之組合物可含有任何此等額外成份，從而提供呈適合於投與之形式的組合物。 本發明之組合物(製劑、調配物等)可藉由熟習此項技術者熟知之多種適合手段中的任一者投與，包括但不限於藉由非經腸(包括例如動脈內、靜脈內、肌內、皮下)、經體表(包括真皮、經皮、皮下等)、經口、經鼻、經黏膜(包括舌下)及腔內途徑(諸如***內、子宮頸內、子宮內、陰莖內及鼻內)。在一些實施例中，投與模式為藉由注射、皮內或經口。 本發明亦提供用於將效應肽遞送至細胞內及/或細胞核內之方法，其包含向個體投與本發明之融合蛋白或包含本發明之融合蛋白的組合物。因此，本發明提供一種本發明之融合蛋白在製造用於將效應肽遞送至細胞內及/或細胞核內之藥物中的用途。視待藉由融合蛋白遞送之效應肽而定，本發明之融合蛋白可經投與以用於癌症、纖維化、發炎疾病、代謝障礙、免疫系統病症、傳染病、抗老化及酶替代療法。融合蛋白可達成胞內及核內藥物遞送。前述實例用來進一步說明本發明之特定實施例，但不應解釋為以任何方式限制本發明。實例 實例 1 本發明之生物藥物遞送技術的作用機制 圖1展示用於癌症治療之此種創新生物藥物遞送技術ASC (抗體開啟細胞毒性(Antibody Switched-on Cytotoxicity))生物平台之作用機制(MOA)的示意圖，該ASC生物平台利用靶向細胞表面之抗體(步驟1)；及隨後在腫瘤微環境中激活CPEP (步驟2)，且CPP (細胞穿透肽)/PCD將作為細胞毒性肽有效負載之EP遞送至細胞內(步驟3)。實例 2 ASC 生物藥物表現及純化 各ASC生物藥物之基因係經重新DNA合成或基於PCR合成，且選殖成經修飾之哺乳動物表現載體。基於抗-DSG2抗體(3D4)產生ASC生物藥物(3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D及3D4Fc-rS9)。亦基於抗-DSG2抗體(3D4)產生具有無細胞毒性之EP的3D4scr作為陽性對照。3D4及3D4scr之核苷酸及胺基酸序列列於下表1中。各ASC生物藥物之核苷酸及胺基酸序列描述於先前序列表中(參見第20頁第3段)。遵循製造商說明書，利用Expi293™表現系統(Thermo Fisher Scientific)藉由短暫基因表現來表現ASC生物藥物。藉由蛋白A親和力純化(GE Healthcare)自Expi293™上清液純化ASC生物藥物。在用pH 8.0之0.1 M Tris及pH 8.0之10 mM Tris洗滌蛋白A樹脂之後，用pH 3.0之0.1 M甘胺酸溶離ASC生物藥物，隨後藉由每1 mL溶離液添加0.1 mL之pH 8.0之1 M Tris-HCl來快速調節樣品pH。隨後，使用PD-10 (Nap-10)去鹽管柱(Desalting Column) (GE Healthcare)將蛋白溶液與PBS緩衝交換，且最後使用Vivaspin蛋白濃縮器旋轉管柱(Vivaspin Protein Concentrator Spin Column) (GE Healthcare)濃縮。所得ASC生物藥物包括3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D及3D4Fc-rS9。 表1 實例 3 藉由流動式細胞測量術之 ASC 生物藥物分析 收集細胞(1×106 /ml)且將細胞再懸浮在具有2% FBS且含有2mM EDTA之PBS中，且與1 μg/ml IgG、3D4scr、3D4KLA或3D4S9在4℃下一起培育30分鐘。細胞用PBS洗滌兩次，且隨後在4℃下添加次級FITC結合抗體(Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG)持續30分鐘。將樣品用PBS洗滌兩次，且使用流動式細胞測量術分析。每樣品分析10000個細胞事件。圖2A展示藉由流動式細胞測量術測得之表面結合ASC生物藥物且結果展示ASC生物藥物識別目標細胞。 收集人類***腺癌MCF7細胞且將其再懸浮在具有2% FBS且含有2mM EDTA之PBS中，且在4℃或37℃下與3D4S9 (1 μg/ml)一起培育，持續各時間點(1、5、10、15、30、60、90及120分鐘)。所有細胞固定在1%多聚甲醛內10分鐘，用PBS洗滌兩次，且用初級兔抗連接子-X抗體染色。將Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG分別用於偵測連接子-X及ASC生物藥物。使用流動式細胞測量術分析樣品。每樣品分析10000個細胞事件。圖2B藉由流動式細胞測量術評估裂解的ASC生物藥物。 將人類***腺癌MCF7細胞接種在玻璃蓋玻片上48小時，且在37℃下用3D4S9處理1小時及48小時。將蓋玻片上之細胞用PBS洗滌，固定在4%多聚甲醛內，用PBS洗滌兩次，及用0.2% Triton X-100滲透化15分鐘。在用PBS洗滌之後，細胞用10% FBS阻斷1小時，隨後與兔抗連接子-X抗體一起培育。將Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG分別用於可視化連接子-X及ASC生物藥物的位置。最後，將固定細胞用PBS洗滌3次，且將其核對比染色、安放及使用螢光顯微鏡或共焦顯微鏡觀測。圖2C展示螢光ICC染色。圖2B及2C之結果展示3D4S9之聚陽離子結構域裂解且內化入人類***腺癌MCF7細胞中。實例 4 軟瓊脂群落形成分析法 細胞(2 × 103 )用3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D或3D4Fc-rS9處理10分鐘，且隨後與生長介質中的0.35%瓊脂糖混合，在12孔板中平鋪在生長介質內之0.5%瓊脂糖之固化層的頂部上。在1-2週後，將群落用Cristal Violet (0.01%溶液)染色且用PBS洗滌，且使用顯微鏡對群落計數。3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-DD6、3D4rS9-A、3D4S9-D或3D4Fc-rS9之軟瓊脂群落形成分析法的結果展示於圖3至圖9中。結果展示用3D4KLA處理之人類***腺癌MCF7細胞(A)及人類非小細胞肺癌H1299 (B)中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖3)；用3D4S9處理之人類***腺癌MDA-MB-231 (A)、人類***腺癌SKBR3 (B)、人類***腺癌MCF7 (C)、人類肺癌A549 (D)、人類非小細胞肺癌H1299 (E)及人類胰臟腺癌PANC-1細胞(F)中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖4)；用3D4rS9處理之人類肺癌A549細胞中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖5)；用3D4rS9-A處理之人類***腺癌SKBR3 (A)及人類肺癌A549細胞(B)中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖6)；用3D4rS9-D處理之人類肺癌A549細胞中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖7)；用3D4rS9-△D6處理之人類***腺癌SKBR3細胞中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖8)；用3D4Fc-rS9處理之人類肺癌A549細胞中的軟瓊脂群落形成活性降低(圖9)。 將3D4sc、3D4S9、3D4KLA、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4rS9-D及3D4Fc-rS9用於各種癌細胞株的活體外抑制分析法中，且結果展示在下表2中。 (-)：陰性結果，群落形成未減少； (+)：陽性結果，群落形成顯著減少； ND：(沒有變化)實例 5 腫瘤異種移植物 6週大雄性非肥胖嚴重糖尿病結合免疫缺乏小鼠接收皮下注射與基質膠(Matrigel) (1:1)混合之0.1 ml PBS中的人類胰臟癌PANC1細胞株的2 × 106 個細胞。當腫瘤體積達到約20 mm3 時，小鼠隨機分派至各治療組。經PBS稀釋之3D4scr及3D4S9 (30 mg/kg)每週兩次腹膜內注射，持續3週。在治療期結束時記錄體重以評估3D4scr及3D4S9療法的全身性毒性。用測徑規量測腫瘤尺寸且根據公式(長度×寬度2 )/2計算腫瘤體積。 圖10A至圖10C展示3D4S9減少使用人類胰臟癌PANC1細胞之NOD/SCID小鼠內的異種移植腫瘤生長。相比於3D4scr對照組內231 (±150) mm3的腫瘤體積，攜帶用3D4S9治療之人類PANC1腫瘤異種移植物的小鼠在三週之後具有84 (±40) mm3的腫瘤體積。3D4S9治療減小異種移植腫瘤體積達60% (A)。相比於3D4scr對照組內0.66 (±0.3) g的腫瘤重量，攜帶用3D4S9治療之人類PANC1腫瘤異種移植物的小鼠在三週之後具有0.13 (±0.02) g的腫瘤重量。3D4S9治療減小異種移植腫瘤重量達80% (B)。小鼠在處死之前稱重。攜帶用3D4scr或3D4S9治療之人類PANC1腫瘤異種移植物的小鼠具有幾乎相同的體重(C)。
圖1展示ASC生物藥物之MoA (作用機制)的示意圖。步驟1. 抗體識別細胞表面標記物。步驟2. 用微環境蛋白酶(例如MMP及ADAM等)裂解CPEP內部之可裂解連接子，且隨後開啟CPEP之細胞穿透功能。步驟3. 由CPP/PCD攜帶之細胞毒性肽(自ASC生物藥物切割下之肽)連同疾病治療功能進入細胞質及/或核中。 圖2A至圖2C展示ASC生物藥物之MoA研究。A中，流動式細胞測量術表明ASC生物藥物可識別目標細胞。B及C，使用流動式細胞測量術及免疫螢光法，結果展示聚陽離子結構域3D4S9會被裂解且內化入人類***腺癌MCF7細胞中。 圖3A及圖3B展示3D4KLA降低人類***腺癌MCF7及人類非小細胞肺癌H1299細胞內的轉化活性。用3D4KLA處理之人類***腺癌MCF7 (A)及人類非小細胞肺癌H1299細胞(B)內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖4A至圖4F展示3D4S9會降低不同細胞株內的轉化活性。用3D4S9處理之人類***腺癌MDA-MB-231 (A)、人類***腺癌SKBR3 (B)、人類***腺癌MCF7 (C)、人類肺癌A549 (D)、人類非小細胞肺癌H1299 (E)及人類胰臟癌PANC-1細胞(F)內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖5展示3D4rS9降低人類肺癌A549細胞內的轉化活性。用3D4rS9處理之人類肺癌A549細胞內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖6A及圖6B展示3D4rS9-A降低人類***腺癌SKBR3及人類肺癌A549細胞內之轉化活性。用3D4rS9-A處理之人類***腺癌SKBR3 (A)及人類肺癌A549細胞(B)內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖7展示3D4rS9-D降低人類肺癌A549細胞內的轉化活性。用3D4rS9-D處理之人類肺癌A549細胞內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖8展示3D4rS9-DD6降低人類***腺癌SKBR3細胞內的轉化活性。用3D4rS9-DD6處理之人類***腺癌SKBR3細胞內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖9展示3D4Fc-rS9降低人類肺癌A549細胞內的轉化活性。用3D4Fc-rS9處理之人類肺癌A549細胞內之軟瓊脂群落形成活性降低。 圖10A至圖10C展示3D4S9減少使用人類胰臟癌PANC-1細胞之NOD/SCID小鼠內的異種移植腫瘤生長。3D4scr或3D4S9以30 mg/kg之劑量一週兩次腹膜內給藥，持續3週。在處死小鼠之後，移除腫瘤且量測其質量。相比於3D4scr對照組內231 (±150) mm3的腫瘤體積，攜帶用3D4S9治療之人類PANC-1腫瘤異種移植物的小鼠在三週之後具有84 (±40) mm3的腫瘤體積。3D4S9治療減小異種移植腫瘤體積達60% (A)。相比於3D4scr對照組內0.66 (±0.3) g的腫瘤重量，攜帶用3D4S9治療之人類PANC-1腫瘤異種移植物的小鼠在三週之後具有0.13 (±0.02) g的腫瘤重量。3D4S9治療減小異種移植腫瘤重量達80% (B)。小鼠在處死之前稱重。攜帶用3D4scr或3D4S9治療之人類PANC-1腫瘤異種移植物的小鼠具有幾乎相同的體重(C)。

Claims (33)

  1. 一種融合蛋白，其包含： (a) 抗體或其抗原結合片段(Ab)，其能夠靶向胞外表面標記物；及 (b) 一或多個細胞穿透效應肽(cell penetrating effector peptide；CPEP)，其融合至(a)之Ab或融合在(a)之Ab內部， 其中一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(polyanionic domain；PAD)、一個或兩個可裂解連接子(cleavable linker；CL)、聚陽離子結構域(polycation domain；PCD)及效應肽(effector peptide；EP)，該CPEP自N端至C端係呈(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)、(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)或(PAD-CL-PCD-CL-PAD)配置，此時該CPEP融合至(a)之Ab的末端，或 一個CPEP包含視情況存在之聚陰離子結構域(PAD)、兩個可裂解連接子(CL)、聚陽離子結構域(PCD)及效應肽(EP)，該CPEP自N端至C端係呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此時該CPEP用其兩個末端融合在該Ab的內部。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該CPEP融合至該Ab之重鏈的末端或內部。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段靶向任何以下胞外標記物： 。
  4. 如請求項1之融合蛋白，其中該抗體係選自由以下組成之群：阿昔單抗(abciximab)、阿布里單抗(abrilumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿柏西普(aflibercept)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿瑪西單抗(amatuximab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、艾維路單抗(avelumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達利珠單抗(daclizumab)、德諾單抗(denosumab)、杜里土單抗(duligotumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、艾法珠單抗(efalizumab)、埃吉姆單抗(elgemtumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、依那西普(etanercept)、埃達珠單抗(etaracizumab)、艾托珠單抗(etrolizumab)、非吉單抗(figitumumab)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、伊派利單抗(ipilimumab)、盧姆珠單抗(lumretuzumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、納武單抗(nivolumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕特里單抗(patritumab)、培立珠單抗(pembrolizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、塞庫金單抗(secukinumab)、塞里班單抗(seribantumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲美單抗(tremelimumab)、優特克單抗(ustekinumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、沃洛昔單抗(volociximab)及紮魯姆單抗(zalutumumab)。
  5. 如請求項1之融合蛋白，其中該抗體包含：具有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之融合蛋白，其中該抗體之抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、單鏈片段、雙功能抗體或線抗體。
  7. 如請求項1之融合蛋白，其中當該CPEP融合至(a)之Ab的末端時，該融合蛋白自N端至C端具有以下配置：(EP-PCD-CL)-Ab、(PCD-EP-CL)-Ab、(EP-PCD-CL-PAD)-Ab、(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab、Ab-(CL-PCD-EP)、Ab-(CL-EP-PCD)、Ab-(PAD-CL-PCD-EP)或Ab-(CL-EP-PCD-CL-PAD)。
  8. 如請求項1之融合蛋白，其中當該CPEP用其兩個末端融合在該Ab的內部時，該融合蛋白自N端至C端具有以下配置：AbN -(CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-PCD-EP-CL)-AbC 、AbN -(PAD-CL-EP-PCD-CL)-AbC 、AbN -(CL-EP-PCD-CL-PAD)-AbC 或AbN -(CL-PCD-EP-CL-PAD)-AbC ，其中AbN 為該Ab之N端片段且AbC 為該Ab之C端片段。
  9. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該PCD包含5至20個連續鹼性胺基酸。
  10. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該PCD包含7至12個連續鹼性胺基酸。
  11. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該PCD係選自由以下組成之群：聚離胺酸、聚精胺酸及聚組胺酸或其混合物。
  12. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中PCD組合物由8至10個連續離胺酸及精胺酸組成。
  13. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該EP為肽片段、蛋白之酶結構域、或功能蛋白或其組合。
  14. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該EP為選自以下之肽片段：AKT、澱粉狀蛋白-β、APAF1、ARF、Bcl-2、BCL9、β-索烴素(catenin)、BH3螺旋體、CDKN2B、環孢素A、散亂蛋白(dishevelled)、E-鈣黏素(cadherin)、ERK、EZH2、GNAS、GRB7、HIF-1、組蛋白H3、組蛋白H4、HSP60、HSP70、HSP90、IKBKG、ITPR3、KLA、LAP、LFA-1、MAPK8IP1、MDM2、MEK、NBS1、P53、PKA、PKC、RAF、Slug、Smac/DIABLO、Stat3、存活素(survivin)或XIAP或其組合。
  15. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中EP具有SEQ ID NO:2、3或4之胺基酸序列或其組合。
  16. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CPEP之該PAD為具有包含4至20個酸性胺基酸之序列的聚陰離子肽。
  17. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該PAD包含5至9個連續酸性胺基酸。
  18. 如請求項17之融合蛋白，其中該酸性胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸、磷絲胺酸及磷酸蘇胺酸。
  19. 如請求項17之融合蛋白，其中該PAD為6至8個連續天冬胺酸及麩胺酸。
  20. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CPEP之該CL包含約6至約30個之間的胺基酸。
  21. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CPEP之該CL包含約4至約10個之間的胺基酸殘基。
  22. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL在細胞環境中可裂解。
  23. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL在胞外環境中可裂解。
  24. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL在癌細胞附近的酸性條件下可裂解。
  25. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL可藉由以下任一者或其組合裂解： 。
  26. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL序列包含： KPLGLAR (SEQ ID NO:5)、PLGLAG (SEQ ID NO:6)或KPLGLAG (SEQ ID NO:7)或其組合。
  27. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白，其中該CL包含一或多個如請求項20至26中任一項之序列。
  28. 如請求項1之融合蛋白，其包含具有選自SEQ ID NO:9、13、15、17、19、21及23之胺基酸序列的重鏈序列，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。
  29. 如請求項1之融合蛋白，其包含： 3D4KLA：具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4S9：具有SEQ ID NO:13之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9：具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-DD6：具有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-A：具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列； 3D4rS9-D：具有SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列；或 3D4Fc-rS9：具有SEQ ID NO:23之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈序列。
  30. 一種用於將效應肽遞送至細胞內的組合物，其包含如請求項1至29中任一項之融合蛋白及藥理學上適合之載劑。
  31. 一種如請求項1至29中任一項之融合蛋白或如請求項30之組合物的用途，其用於製造用以將效應肽作為蛋白有效負載遞送至細胞或細胞核內之藥物。
  32. 如請求項31之用途，其中該融合蛋白或組合物經由非經腸或腔內途徑投與。
  33. 如請求項32之用途，其中該融合蛋白經投與以用於癌症、纖維化、發炎疾病、代謝障礙、免疫系統病症、傳染病、抗老化或酶替代療法，端視欲藉由該融合蛋白遞送之該效應肽而定。
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