KR102329524B1

KR102329524B1 - 변형된 rt-let7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102329524B1
Application number: KR1020210103567A
Authority: KR
Inventors: 남석우; 양희두
Original assignee: 주식회사 네오나
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-11-23

Abstract

본 발명은 변형된 RT-LET7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 변형된 RT-LET7은 기존의 RT-LET7 대비 Let-7i-5p의 발현 억제를 증가시키고, 간암 세포 성장 억제를 증가시키며, TSP1 발현을 증가시키고, 및 대식세포 식작용 활성을 증가시킴을 확인하였다. 따라서 이를 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용할 수 있다.

Description

변형된 RT-LET7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LIVER CANCER COMPRISING MODIFIED RT-LET7 AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, Let-7i-5p의 발현 억제제인 변형된 RT-LET7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

간암은 전 세계적으로 다섯 번째로 빈발하는 암이지만 그로 인한 사망률은 3위에 해당하는 공격적인 암이다(Ahn J, Flamm SL Hepatocellular carcinoma Dis Mon 2004;50:556-573) 치료목적의 수술은 단지 15%에서 25% 정도의 환자에게만 가능하고 대부분의 간암 환자들은 국부적으로 진행하거나 전이되는 질병들에 의해 비교적 단기간 내에 사망한다(Roberts LR, Gores GJ Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic targets Semin Liver Dis 2005;25:212-225) 간암의 주요 원인으로 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 및 아플라톡신 B1(aflatoxin B1) 등이 잘 알려져 있다. 하지만, 지난 20년간 간암 환자의 전체적인 생존율은 크게 증가하지 않았고, 간암의 발달(development) 및 진전(progression) 기작은 여전히 잘 알려져 있지 않은 상태이다(Bruix J, et al Focus on hepatocellular carcinoma Cancer Cell 2004;5:215-219) 지금까지, 분자표적치료(molecular targeted therapy)가 성숙한 간암의 치료에 효과적인 것으로 나타났지만(Shen YC, Hsu C, Cheng AL Molecular targeted therapy for advanced hepatocellular carcinoma: current status and future perspectives J Gastroenterol;45:794-807), 어떻게 이러한 유전적 변화가 간암 환자들 개개인에게 관찰되는 임상적 특징들을 야기하는지는 불명확하다.

HDACs (Histone deacetylases)는 종종 보조억제자(corepressors)나 다중-단백질 전사복합체(multi-protein transcriptional complexes)들에 의해 유전자 프로모터에 붙을 수 있으며, 그곳에서 DNA에 직접 결합하지 않고 크로마틴(chromatin) 변형을 통해 전사를 조절한다(Thiagalingam S, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Thiagalingam A, Ponte JF Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code Ann N Y Acad Sci 2003;983:84-100) 암호화된 사람 HDACs는 18개가 있으며, 이들은 클래스 I (HDAC 1, 2, 3 및 8), 클래스 II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10), 클래스 III (SIRT 1-7), 및 클래스 IV (HDAC11) 효소들로 분류된다(Yang XJ, Seto E The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:206-218) 히스톤 아세틸화 효소(acetyltransferases) 및 HDACs 모두 세포 증식, 분화 및 세포주기 조절에 관여한다는 사실이 알려져 있다(Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I HDAC family: What are the cancer relevant targets Cancer Lett 2009;277:8-21) 또한, HDACs의 병리학적 활성 및 조절감소(deregulation)가 암, 면역질환, 및 근이영양증(muscular dystrophy)과 같은 여러 질병들을 야기할 수 있다는 사실이 보고되었다(Yang XJ, Seto E HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention Oncogene 2007;26:5310-5318). HDAC6는 HDACs의 클래스 IIb 패밀리 멤버이고, 미세소관(MTs)[0004] 과 관련 있는 세포질내 탈아세틸화효소(cytoplasmic deacetylase)로 작용하며, 알파-튜뷸린(α-tubulin)을 탈아세틸화시킨다(Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, et al HDAC6 is a microtubule-associated Mis18α. Nature 2002;417:455-458).

한편, miRNA는 세포 내에 존재하는 20-25 핵산(nucleotide) 길이의 작은 RNA (endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적인 서열에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다.

한편, 대식세포들은 식균작용에 의해 질병세포(암세포)들을 탐식하는데, 그것은 항체들의 Fc 절편이 대식세포들 막표면의 Fc 수용체와의 결합을 매개함으로써 일어난다. 그러나 종양들은 정상 면역 조절 기구 전복을 통해 대식세포들을 포함한 면역세포들의 공격에서 벗어날 수 있다. 그러한 기전의 하나가 정상 세포들에서 발현되는 하나의 단백질인 CD47이다. CD47은 SIRPα(signal-regulatory protein α)라 부르는 대식세포의 수용체와 상호작용하여 이것이 대식세포들에게 “나를 잡아먹지 말라(탐식 차단)”는 신호 전달을 이끌음으로써 정상 세포들을 떠나게 한다. 동일하게 암세포들에 의한 CD47 발현도 그들로 하여금 암세포들이 항체와 결합했을 경우에서 조차 대식세포들에 대한 저항성을 갖게 하는 것이다. 따라서 종양들에 많은 수의 대식세포들이 접근하지만 “탐식 차단” 신호가 꺼지지 않으면 암세포들에게 작용할 수없는 것이다. 이에대한 하나의 치료 전략이 CD47에 대한 단일클론 항체를 이용한 “탐식 차단” 신호를 차단하는 것이다.

따라서, 본 발명은 Let-7i-5p의 발현 억제제인 RT-LET7을 변형시켜 기존의 RT-LET7 보다 효과가 상승됨을 통해 이를 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 로 사용될 수 있음을 확인하였고, 또한 변형된 RT-LET7에 의한 대식세포 식작용을 조절할 수 있음을 통해 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 약학 조성물로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR

10-2012-0014893

A

본 발명의 목적은 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 변형된 RT-LET7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 변형된 RT-LET7을 유효성분으로 포함하는 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 변형된 RT-LET7은 기존 간암세포의 Let-7i-5p를 억제하는 안티센스 microRNA(AS-miRNA)인 RT-LET7 대비 간암에서의 종양 세포 성장을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 변형된 RT-LET7은 간암세포에서 Let-7i-5p를 억제해 TSP1을 증가시키고, 증가한 TSP1은 CD47과 결합해 대식세포의 SIRPα와 상호작용을 막게되며, 따라서 간암세포의 CD47과 대식세포의 SIRPα 결합을 막아 암세포에 대한 대식세포의 면역활성을 높여 항암효과를 보이는 기전을 통해 대식세포 식작용 활성을 현저히 증가시킴을 확인하여, 이를 간암의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 CD47-양성 간암의 예방 또는 치료용 면역항암제 약학 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.

도 1은 Let-7i-5p의 발현 억제제인 RT-LET7의 다양한 변형 구조(도 1a) 및 억제 효율(도 1b)을 나타낸 도이다(기본형: RT-LET7, 변형: RT-LET7-2, RT-LET7-4, RT-LET7-6 및 RT-LET7-8).
도 2는 본 발명의 변형된 RT-LET7인 RT-LET7-8이 HCC 세포주에서 유의미하게 지속적으로 Let-7i-5p를 억제하는 효과를 확인한 도이다(도 2a; SNU-387, 도 2b; SNU-368, 도 2c; SNU-423).
도 3은 본 발명의 변형된 RT-LET7인 RT-LET7-8에 의해 HCC 세포주의 생장억제 및 대식세포의 활성 증가를 확인한 도이다(도 3a; MTT 및 세포 생존 분석을 통한 Let-7i-5p의 종양 형성에 대한 특성, 도 3b; 기본형 RT-LET7 및 변형 RT-LET7-8을 처리 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 TSP1 발현변화, 도 3c; 기본형 RT-LET7 및 변형 RT-LET7-8가 처리된 HCC 세포의 대식세포 식작용 활성).

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 핵산분자로서, Let-7i-5p를 표적화하는 핵산분자에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열이 2`-O-methyl(2`-OMe)화 또는 2`-O-methoxyethyl(2`-O-MOE)화 되어 변형된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 3`을 Phosphorothioate로 변형된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 5`말단으로부터 4번째까지 서열의 뉴클레오티드 중 어느하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 3`말단으로부터 4번째까지 서열의 뉴클레오티드 중 어느하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 5`말단으로부터 4번째까지 서열의 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것이며, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 3`말단으로부터 4번째까지 서열의 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 5`말단으로부터 4번째까지 서열의 뉴클레오티드 모든 뉴클레오티드의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것이며, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 3`말단으로부터 4번째까지 서열의 모든 뉴클레오티드 서열의 3`이 Phosphorothioate로 변형된 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 "조성물"은 Let-7i-5p의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "조성물"은 간암 세포 성장을 억제하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "조성물"은 TSP1(thrombospondin-1) 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "조성물"은 대식세포 식작용 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 약학 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 "TSP1"은 CD47 수용체를 점유하여 CD47-SIRPα의 상호작용을 방해할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "핵산분자"는 let-7i-p-TSP1 신호전달 축을 조절할 수 있으며, 대식세포와 HCC 사이의 CD47-SIRPα 상호작용을 CD47-TSP1 상호작용으로 전환함으로써 대식세포의 HCC 세포에 대한 식작용을 재-활성화하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 "간암"은 Let-7i-5p 고발현 간암일 수 있으며, 간세포암종(hepatocellular carcinoma)일 수 있고, stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, ⅣA 또는 ⅣB 병기(phase)의 간세포암종일 수 있으며, 초기 병기보다 치료가 어려운 stageⅢ 내지 Ⅳ 병기의 간세포암종인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 "간암"은 TSP1 저발현 간암일 수 있으며, 간세포암종일 수 있고, stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, ⅣA 또는 ⅣB 병기(phase)의 간세포암종일 수 있으며, 초기 병기보다 치료가 어려운 stageⅢ 내지 Ⅳ 병기의 간세포암종인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서, 사용된 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간암의 발생, 발달 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 간암 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 감염증의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여 하는 것이 가장 바람직하다. 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 기존 RT-LET7의 변형된 RT-LET7 제작

Let-7i-5p의 억제제인 RT-LET7(서열번호1: AACAGCACAAACUACUACCUCA에 4단계 과정으로 한 cycle씩 진행하여, RNA oligo 1mer 씩 3‘말단에서 5’말단까지 Deblocking -> Coupling -> Oxidation -> Capping의 과정으로 순차적으로 진행한다. 이때, 변형된 염기를 사용하는데, Nat Rev Drug Discov. 2020 Oct;19(10):673-694.에 따르면, 2’-Ribose의 변형(2’-O-methyl, 2‘-MOE)은 변형시키지 않은 RNA보다 핵산분해효소로부터 저항성을 증가시키고, 세포질내에서 안정성을 증가시키는데 기여한다. 또한, 생체 조직내에서 반감기를 증가시키는 역할도 하여, 결과적으로 약물의 효과를 증대시키는 역할을 한다. 더욱이, 상보적인 RNA에 강하게 부착하여, RNase에 의해 표적 유전자가 더 효과적으로 분해되는데 도움을 준다. 추가로, RNA 염기사이에 phosphorothioate로 치환하였을 때, RNase의 활성에는 영향을 주지 않으며, 표적 RNA에 효율적으로 결합한다. 그리고, 세포와 체내에서 알부민과 같은 단백질과 결합하여, 핵산분해효소로부터 보호되고, 이에 따라, 약물이 소변으로 배출되는 것을 막아주는 역할을 하여, 체내에서 약물의 지속시간을 늘려, 약물의 효과를 증대시키는 역할을 하는 이유 때문에 Ribose와 phosphorothioate 변형을 진행하였다. 변형된 RNA 염기 2‘-OMe rA Phosphoramidite(Glen Research, Sterling, VA, cat. 10-3100), 2‘-OMe rC Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3115), 2‘-OMe rG Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3120), 2‘-OMe rU Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3130), 2'-MOE rA Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3200), 2'-MOE rC Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3211), 2'-MOE rG Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3220), 2'-MOE rU Phosphoramidite(Glen Research, cat. 10-3231)를 합성한다. 합성과정에서 phosphorothioate로 치환이 필요한 부분은 Sulfurizing Reagent II(Glen Research, cat. 40-4037-10)를 활용하여 합성한다(바이오니아 합성). 이때, 아무변형을 하지 않은 RNA oligo를 RT-LET7, 모든 염기를 2’-O-methyl로 변형하고, phosphorothioate로 변형한 RNA oligo를 RT-LET7-2, 5’말단과 3’말단 4곳을 변형시킨 염기를 RT-LET7-6으로 명명하였다. 그리고, 모든 염기를 2’-MOE로 변형하고, phosphorothioate로 변형한 RNA oligo를 RT-LET7-4, 5’말단과 3’말단 4곳을 변형시킨 염기를 RT-LET7-8로 명명하였다(도 1a).

<실시예 2> 변형된 RT-LET7의 처리에 의한 Let-7i-5p의 발현 억제 확인

도 1a와 같이 만들어진 변형된 RT-LET7를 트랜스펙션한 HCC 세포주(SNU-387, SNU-368, 및 SNU-423)에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 분리한 후, 상기 두 miRNA에 특이적인 cDNA를 micscipt II RT 키트(Qiagen, Manchester, UK)를 이용하여 합성하였다. qRT-PCR은 SensiFASTTM SYBR　NoROX Kit(Bioline, London, UK)로 수행되었다. HCC 세포주(SNU-387, SNU-368, 및 SNU-423)에서 Let-7i-5p의 qRT-PCR 분석을 수행한 결과, 2’-MOE로 모든 염기를 치환 하였을 때(RT-LET7-4 및 RT-LET7-8), 2‘-O-methyl로 치환하였을 때(RT-LET7-2 및 RT-LET7-6) 보다 Let-7i-5p의 발현을 억제하는데 효과가 좋은 것을 확인하였다(도 1b).

또한, 2’-MOE로 RT-LET7을 변형시켰을 때, HCC 세포주(SNU-387, SNU-368, 및 SNU-423)에 트랜스펙션 후 최대 7일까지 배양 후 RNA 추출 후 Let-7i-5p의 발현 억제정도를 비교하였을 때, 2’-MOE로 변형시킨 후 phosphorothioate로 치환하였을 때, 아무 변형도 안한 RT-LET7에 비해서 Let-7i-5p의 발현 억제가 유의미하게 효율이 증대되는 것을 확인하였다(도 2).

<실시예 3> MTT 및 세포 생존 분석을 통한 Let-7i-5p의 종양 형성에 대한 특성 확인

간암에서의 RT-LET7 처리시 인비트로 종양형성(in vitro tumorigenesis) 억제능을 확인하기 위해, RT-LET7를 이용하여 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, MTT 분석을 위해, SNU-387 세포를 12-웰 플레이트에 분주하고 RT-LET7, RT-LET7-4, RT-LET7-8을 트랜스펙션한 뒤, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액(Sigma) 0.5 mg/ml과 1시간 동안 인큐베이션한 뒤, SYNERGY H1 Multilabel 플레이트 리더기(Bio-Tek, Winooski, VT)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과, RT-LET7의 변형된 RT-LET7-8을 처리한 실험군에서 종양 세포 성장을 가장 우수하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 3a).

<실시예 4> 변형된 RT-LET7에 의한 대식세포 식작용 조절 확인

Let-7i-5p가 대식세포 식작용(macrophage phagocytosis)의 조절에 관여하는 TSP1의 발현을 조절하는지 확인하기 위해, RT-LET7과 변형된 RT-LET7-8을 처리 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 발현변화를 확인하였다. 그 결과, RT-LET7과 RT-LET7-8을 각각 처리하였을 때, TSP1의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 3b).

이러한 결과를 토대로, Let-7i-5p-TSP1 네트워크의 CD47과 SIRPα(signal regulatory protein α)의 상호작용에서 TSP1이 CD47 수용체를 점유하여 CD47-SIRPα의 상호작용을 방해하여 대식세포가 HCC를 식작용할 수 있게 하는지를 확인하기 위하여, 인비트로 식작용 분석을 수행하였다. 구체적으로, HCC 세포주인 SNU-387 각각 단일 세포 현탁액으로 만든 후, CFSE(abcam, Cambridge, UK)로 표지하였다. 그 후, C57BL/6 마우스로부터 복막 대식세포를 수득하고 SNU-387과 2시간 동안 공배양한 뒤, RT-LET7 및 변형된 RT-LET7-8로 각각 처리하였고, 양성 대조군으로 TSP1 재조합 단백질을 직접 처리한 HCC 세포와 비교하였다. 식작용 지수는 종양 세포를 포획하는 대식세포의 수를 대식세포의 총 수로 나눠 계산하였다. 그 결과, RT-LET7 및 변형된 RT-LET7-8가 처리된 HCC 세포 모두 대식세포 식작용 활성이 현저히 증가함을 확인하였고, RT-LET7 대비 변형된 RT-LET7-8에서 대식세포 식작용 활성이 더 증가함을 확인하였다(도 3c).

이를 통해, RT-LET7을 변형시킨 RT-LET7-8가 let-7i-p-TSP1 신호전달 축을 조절할 수 있으며, 대식세포와 HCC 사이의 CD47-SIRPα 상호작용을 CD47-TSP1 상호작용으로 전환함으로써 대식세포의 HCC 세포에 대한 식작용을 재-활성화하는 것을 알 수 있다.

<110> NEORNAT <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LIVER CANCER COMPRISING MODIFIED RT-LET7 AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> PN2106-323 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-LET7 <400> 1 aacagcacaa acuacuaccu ca 22

Claims

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 표시되는 Let-7i-5p를 표적화하는 핵산분자로서,
상기 핵산분자는,
서열번호 1의 뉴클레오티드의 모든 서열을 2’-O-methoxyethyl(2’-O-MOE)화 시켜 변형된 것이고,
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 5’말단으로부터 4번째까지 뉴클레오티드의 3’이 Phosphorothioate로 변형된 것이며,
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 3’말단으로부터 4번째까지 뉴클레오티드의 3’이 Phosphorothioate로 변형된 것인, Let-7i-5p를 표적화하는 핵산분자.
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제1항의 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 Let-7i-5p의 발현을 억제하는 것인, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 간암 세포 성장을 억제하는 것인, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 TSP1(thrombospondin-1) 발현을 증가시키는 것인, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 대식세포 식작용 활성을 증가시키는 것인, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 약학 조성물.