KR102344395B1 - 자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성 입자를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 자성 입자를 이용한 핵산 분리방법은 종래 방법보다 핵산 분리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 핵산 또는 단백질 분리 이후 과정에서도 실리카 자성 입자를 이용하여 빠른 시간 내에 정제를 완료함으로써 원심분리법이나 중력분리법 등에 비해 월등하게 빠른 시간 내에 전체 과정을 완료할 수 있으며, 수득율 또한 향상 시킬수 있는 장점이 있다.
본 발명의 자성 입자를 이용한 핵산 분리방법은 종래 방법보다 핵산 분리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 핵산 또는 단백질 분리 이후 과정에서도 실리카 자성 입자를 이용하여 빠른 시간 내에 정제를 완료함으로써 원심분리법이나 중력분리법 등에 비해 월등하게 빠른 시간 내에 전체 과정을 완료할 수 있으며, 수득율 또한 향상 시킬수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 물질에서 신속하고 빠르게 고순도의 핵산 또는 단백질을 분리, 정제하는 방법은 생화학 연구 및 진단 프로세스에 있어서 무엇보다 중요하다. 이를 위해 세포 용해 용액 내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 효과적이고 재현성 있는 분리 방법에 대한 다양한 연구가 이루어져 왔다.
최근에는 자성 입자를 이용하여 세포 혼합물에서 핵산 또는 단백질을 분리하는 연구가 활발히 진행 중이다. 자성 입자를 이용한 방법은 세포 혼합물에 자성 입자를 첨가해줌으로써, 핵산 또는 단백질과 자성 입자 사이에 결합을 유도하여 결합체를 형성시킨 후 외부 자기장을 이용하여 자성 입자와 결합된 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 분리시키는 방법이다. 일반적으로 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 분리 정제하는데 사용되는 자성 입자의 입자크기는 500 내지 2000nm 정도가 적당하다고 알려져 있다.
미국 특허 5665554호에서는 게놈 DNA 물질에서 플라스미드 DNA를 분리시키는 방법으로 자성 비드와 자석을 이용하는 방법을 제시하고 있다. 상세하게는 플라스미드 DNA와 결합하는 자성 비드를 첨가하여 자성 비드와 플라스미드 DNA를 결합시켜 침전시키고 자석을 이용해 자성 비드와 플라스미드 DNA결합을 제외한 상층액을 제거하여 플라스미드 DNA만을 분리하는 방법이다.
미국 특허 6027945호에서는 실리카 자성 입자를 이용하여 생물학적 타겟 물질과 실리카 자성 입자의 결합체를 형성시킨 후 자기장을 제공해 줌으로써 타겟 물질을 분리하는 방법에 대해 제시하고 있으며, 실리카 자성 입자 1mg에 적어도 2ug의 타겟 물질이 결합되며 60%이상의 수득율을 제시하고 있다.
미국 특허 7078224호에서는 1 ~ 15μm 사이즈의 자성 입자를 이용하는데, 상기 자성 입자는 pH 의존성 이온 교환 입자, 실리카 산화물로 코팅된 실리카 자성 입자를 이용하여 분리하는 방법을 제시하고 있다. 그러나, 이러한 실리카 코팅 자성 입자는 제조 과정이 복합하고, 입자 크기 분포를 균일하게 제어하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명자들은 보다 쉽게 실리카 자성 입자를 제조하고, 입자크기를 균일하게 제어할 수 있는 새로운 제조방법을 개발하였으며(한국 등록특허 10-1053023호), 상기 방법에 의해 제조되는 실리카 자성 입자는 표면에 기능기를 갖으며 구형의 형태로 입자 크기 분포가 균일한 장점이 있으며. 그 입자 크기 또한 1 내지 20 μm로 제조된다.
생물학적 시료에서 자성 입자와 결합된 핵산 또는 단백질만을 신속하게 분리하기 위해 외부에서 자기장을 보다 손쉽게 제공해주기 위한 다양한 제품도 다양하게 출시되고 있다. 일 예로 Maglisto(바이오니아사)는 생물학적 시료를 주입할 수 있는 튜브와 튜브가 고정되는 튜브고정부가 있으며, 튜브와 상응하는 외부 위치에서 자기장을 제공할 수 있는 자석고정부를 제공하고 있다. 이 때 제공되는 자석고정부도 튜브고정부와 용이하게 자석으로 탈부착이 가능하게 설계되어 있어, 사용자가 손쉽게 생물학적 물질에서 핵산 또는 단백질을 분리할 수 있는 장점이 있다.
그러나, 상기 방법들에서 사용되는 자성 입자는 비용해성 응집물 또는 타겟핵산과의 결합력이 충분하지 않아, 결합물질에 대한 결합력을 향상시킨 자성 입자의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용하여 핵산을 분리하는 경우, 단백질 변성 응집물을 포함한 비용해성 응집물 또는 핵산분자를 보다 신속하고 효율적으로 분리할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생체 시료로부터 비용해성 응집물 또는 타겟핵산을 보다 신속하고 효율적으로 분리할 수 있는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자성 입자를 이용한 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 자성 입자를 이용한 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 이용한 전자동 핵산 분리 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 평균 입경 크기가 50 nm ~ 1μm인 자성 입자를 포함하는 생체시료로 부터 핵산 분리 정제용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 및 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;를 포함하고, 상기 멀티웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,
1) 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 자성 입자를 결합시키는 단계;
2) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자를 제외한 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;
3) 상기 수득된 혼합물에 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계;
4) 타겟핵산이 결합된 친수성 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및
5) 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자에서 타겟핵산을 분리시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 포함하는 생체시료로부터 핵산 분리정제용 키트 및 장치를 제공한다.
본 발명의 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 이용한 핵산 분리방법은 종래 방법보다 핵산 분리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 핵산 또는 단백질 분리 이후 과정에서도 실리카 나노 자성 입자를 이용하여 빠른 시간 내에 정제를 완료함으로써 원심분리법이나 중력분리법 등에 비해 월등하게 빠른 시간 내에 전체 과정을 완료할 수 있으며, 수득율 또한 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 자성 입자를 사용하여 대장균 세포로부터 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 처리 후 아가로스 젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법을 이용하여 혈액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 박테리아 배양액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 세포에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 동물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 방법을 이용하여 식물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 다양한 세포에서 핵산 RNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자동정제장치의 개략도이다.
도 9는 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 10은 베이스 플레이트에 튜브랙이 장착된 상태도이다.
도 11은 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 12는 본 발명의 실시예 6의 방법이 적용된 자성 입자를 분리하기 위한 자석부재장치이다.
도 13은 베이스 플레이트에 자석부재가 배치된 사용 상태도이다.
도 14는 자석부재가 배치된 베이스 플레이트에 멀티 웰 플레이트가 삽입배치된 단면도이다.
도 15는 자기장 인가부가 구비된 자석장착부에 대한 사시도이다.
도 16은 자성 입자를 이용한 타겟핵산 분리 방법에 대한 흐름도이다.
도 17은 같은 시료를 여러 개를 실시예 2와 같은 방법이 적용된 전자동 핵산추출장비로 추출을 진행하여 추출된 플라스미드를 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 18은 플라스미드 핵산을 추출하고 삽입된 목적 유전자 주위의 특정 염기서열을 분리할 수 있는 제한효소로 처리하였을 때 목적 유전자의 크기만큼 적절히 절단되어 전기영동 상에서 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법을 이용하여 혈액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 박테리아 배양액에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 세포에서 핵산 DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 동물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 방법을 이용하여 식물조직세포에서 핵산DNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 다양한 세포에서 핵산 RNA을 추출하여 아가로스젤에 전기 영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자동정제장치의 개략도이다.
도 9는 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 10은 베이스 플레이트에 튜브랙이 장착된 상태도이다.
도 11은 베이스 플레이트 사용 상태도이다.
도 12는 본 발명의 실시예 6의 방법이 적용된 자성 입자를 분리하기 위한 자석부재장치이다.
도 13은 베이스 플레이트에 자석부재가 배치된 사용 상태도이다.
도 14는 자석부재가 배치된 베이스 플레이트에 멀티 웰 플레이트가 삽입배치된 단면도이다.
도 15는 자기장 인가부가 구비된 자석장착부에 대한 사시도이다.
도 16은 자성 입자를 이용한 타겟핵산 분리 방법에 대한 흐름도이다.
도 17은 같은 시료를 여러 개를 실시예 2와 같은 방법이 적용된 전자동 핵산추출장비로 추출을 진행하여 추출된 플라스미드를 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 18은 플라스미드 핵산을 추출하고 삽입된 목적 유전자 주위의 특정 염기서열을 분리할 수 있는 제한효소로 처리하였을 때 목적 유전자의 크기만큼 적절히 절단되어 전기영동 상에서 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자를 첨가하여, 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 자성 입자를 결합시키는 단계; 및 (b) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 핵산을 수득하는 단계;를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산 분리하는 방법에 관한 것이다.
또한, 상기 단계 이후에
(c) (b) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 친수성 자성 입자를 결합시키는 단계; 및
(d) 타겟핵산과 결합한 친수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여 타겟핵산을 수득하는 단계를 추가적으로 포함하여 생체시료로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다.
상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)가 바람직하며, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, 유전자 재조합 DNA, mRNA, rRNA, tRNA, 유전자 재조합 RNA, micro RNA 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 수득되는 최종 타겟핵산은 바람직하게는 플라스미드 DNA, 박테리아의 게놈 DNA, 혈액 및 동식물 조직 DNA, 동물 세포주의 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 핵산 분리 방법은 원심 분리법, 진공 분리법(vacuum manifold type), 필터 분리법, 중력 분리법 또는 크로마토그래피법, 자기장을 이용한 분리법이 다양하게 적용될 수 있다. 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 상세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 입자는 소수성 자성 나노입자 또는 실리카 자성 나노입자 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 자성 입자는 철, 코발트, 니켈 및 그 산화물 또는 합금 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질로 제조될 수 있으며, 평균 크기는 50 nm ~ 1μm, 바람직하게는 50 ~ 700 nm, 가장 바람직하게는 200 ~ 500 nm로 제조되어 사용될 수 있다.
자성 입자의 직경이 1μm 이상이 되면 자성 입자의 침강속도가 빨라져 사용상 불편함을 초래하기 때문에 바람직하지 못하다. 또한, 직경이 50nm이하일 경우, 자성이 약해서 목적하는 물질과의 분리에 문제가 생길 수 있다. 입자의 형태는 원형, 사각형, 침형 등 다양한 형태의 입자 모두 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 사용되는 친수성 자성 입자는 상기 자성 입자를 실리카 코팅하여 사용할 수 있다. 또한, 바이오니아에서 제조되는 AccuNanoBeadTM을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 평균 크기는 50 nm ~ 1μm, 바람직하게는 50 ~ 700 nm, 가장 바람직하게는 200 ~ 500 nm로 사용될 수 있으며, 통상의 기술자들이 핵산을 분리, 정제하기 위해 사용하는 자성 입자를 광범위하게 사용할 수 있다.
상기 자성 입자는 그 자체로 사용하거나, 수용액에 분산되어 사용할 수 있으나, 수용액에 분산되어 사용하는 것이 자성 입자의 응집을 줄일 수 있을 뿐 아니라 실험 편의성 측면에서 보다 바람직하다. 이 때 수분산액은 자성 입자 자체의 응집 및 침강을 방지하기 위하여, 분산제를 더 함유하여 보관 및 사용될 수 있으며, 상기 분산제로는 글리세롤, 알콕실레이트, 알칸올아미드, 에스테르, 아민 옥사이드, 알킬 폴리길리코사이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌아민, 폴리비닐아민, 베타인, 글리시네이트 및 이미다졸린 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 분산제를 사용할 수 있다.
상기 자성 입자를 제공하는 단계는
ⅰ) 생체 시료에 직접 제공하는 단계
ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 단계
ⅲ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액을 처리한 후 제공하는 단계
ⅳ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계
ⅴ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액을 처리한 후 제공하는 단계
ⅵ) 용해된 생체 시료에 단백질 변성 응집물을 형성시키기 위한 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계
ⅶ) 단백질 변성 응집물이 형성된 용액에 제공하는 단계
에서 선택되는 어느 하나 이상의 단계에서 선택적으로 첨가되어 사용될 수 있으며, ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 것이 자성 입자가 비용해성 응집물에 고르게 분포하여 핵산과의 분리 효과적인 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 자성 입자를 첨가하는 단계를 응용함에 있어서, 본 발명에 따를 자성 입자를 포함하여 이루어지는 핵산 또는 단백질 추출용 키트에 적용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 자성 입자와 결합된 비용해성 단백질 변성 응집물 및 세포 잔해 입자들과 핵산을 분리 분리시키는 방법에 있어서 자기장을 갖는 물질을 이용하는 방법을 제공하는 것이다. 이는 자성 입자가 갖는 자성의 성질을 이용하는 방법으로 비용해성 단백질 변성 응집물 및 세포 잔해 입자들과 결합된 자성 입자의 외부에 자기장을 제공해 줌으로써, 용이하게 응집물을 분리시킬 수 있는 장점을 갖는다.
다른 관점에서, 본 발명은 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 및 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;를 포함하고, 상기 멀티웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치에 관한 것이다.
본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산 또는 단백질을 분리, 정제하는데 있어 전자동 시스템인 자동정제장치를 이용하여 자동적으로 분리, 정제 할 수 있다. 상기 자동정제장치는 한국등록특허 제10-25135호, 한국공개특허 제2011-0121588호, 한국등록특허 제14-00675호에 기재된 장치 또는 바이오니아사에서 제조되는 Exiprep / Exiprogen을 사용할 수 있지만(도 8 내지 도 15 참조), 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 핵산 또는 단백질 등을 분리 정제할 수 있는 자동화 또는 반자동화 시스템에 제한없이 적용가능하다.
상기 자동정제장치는 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 유동성 물질이 흡입 및 토출되는 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록; 베이스플레이트에 탑재되어 상기 피펫블록의 하방에 위치하는 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기장 인가부를 구비한 생물학적 시료 자동정제장치에 관한 것이다.
본 발명은 상기 멀티웰플레이트의 상기 특정 단위 웰을 가열하기 위한 히팅부를 추가로 포함할 수 있고, 상기 자기장 인가부는, 자석이 장착되며 상기 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰 하방에 위치하는 자석장착부; 상기 멀티웰플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위하여 상기 자석장착부를 상승 및 하강시키는 승강부; 를 포함하고, 상기 히팅부는 상기 자석장착부에 설치될 수 있고, 상기 히팅부는 상기 자석장착부에 접촉 설치된 발열 필름일 수 있다.
본 발명은 상기 피펫블록을 지지하는 고정몸체; 상기 고정몸체에 설치된 용액 받이대 이동수단에 의하여 수평방향으로 이동 가능하도록 설치되어 상기 피펫블록의 수평방향 이동시 상기 피펫블록에 장착된 상기 다수의 피펫 하방에 위치하는 용액 받이대; 를 포함할 수 있고, 상기 다수의 피펫 중 상기 타겟핵산을 포함한 용액에 적셔진 부분들이 외부와 차단되도록, 상기 다수의 피펫 하방에 위치한 상기 용액 받이대와 밀착되어 상기 다수의 피펫 중 상기 타겟핵산을 포함한 용액에 적셔진 부분들을 감싸도록 형성된 에어로졸방지대를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스플레이트에는 상기 피펫블록에 장착되기 위한 다수의 피펫이 삽착 수용되는 피펫랙, 분리된 상기 타겟핵산을 수용하기 위한 다수의 타겟핵산 보관용 튜브가 삽착 수용되는 제1 튜브랙 및 상기 피펫블록에 장착된 다수의 피펫으로부터 버려지는 폐액을 수용하기 위한 폐액통이 탑재될 수 있고, 상기 베이스플레이트에는 상기 제1 튜브랙을 냉각하기 위한 냉각블록이 탑재될 수 있다.
상기 자기장인가부는 자석봉이 장착된 자석부재가 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 자석부재는 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰 하부에 장착할 수 있음으로써, 멀티웰 플레이트의 특정 단위 웰에서 형성된 자성 입자와 결합된 혼합물을 응집시켜 분리할 수 있게 한다.
상기 자동정제장치는 목적에 맞게 제조된 멀티 웰 플레이트를 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 멀티 웰 플레이트는 핵산 분리 정제를 위한 용액, 즉, DEPC 증류수, 세포 용해용액, 발현용액, 자성 입자 현탁액, 세척용액, 단백질 분해효소 등에서 선택되는 하나 이상의 용액을 포함하여 제조된다. 상기 핵산 분리 정제를 위한 용액들은 이에 한정된 것은 아니고 통상의 기술자들이 핵산 분리 정제를 위해 사용하는 광범위하게 모두 포함될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,
1) 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 소수성 자성 입자를 결합시키는 단계;
2) 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자를 제외한 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;
3) 상기 수득된 혼합물에 친수성 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계;
4) 타겟핵산이 결합된 친수성 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및
5) 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자에서 타겟핵산을 분리시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법에 관한 것이다.
상기 2)단계 또는 4)단계에서 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합된 자성 입자 또는 타겟핵산과 결합된 친수성 자성 입자는 자동정제장치에 포함된 자기장 인가부에 의해 멀티 웰 플레이트 하부에 응집되어 분리될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자, 바람직하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 입자를 포함하는 생체시료로부터 핵산 분리정제용 키트에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 소수성 자성 입자 및 친수성 자성 입자의 제조
본발명에서 사용한 소수성 자성 입자는 평균 400nm 정도의 제품(코스모신소재, SMT-01S)을 구입하여 사용하였다. 상기 자성 입자의 특성은 표면적 7.87 m2/g, 기공체적 0.01608 cm3/g, 기공크기 8.17nm을 갖는다.
본발명에서 사용한 친수성 자성 입자는 평균 400nm 정도의 실리카 코팅 자성 입자 제품(바이오니아, AccuNanoBeadTM TA-1010)을 구입하여 사용하였다. 상기 친수성 자성 입자의 특성은 표면적 15.50 m2/g, 기공체적 0.02277 cm3/g, 기공크기 5.87nm을 갖는다.
실시예 2: 소수성 자성 입자를 이용한 핵산 추출
생체 시료로부터 핵산을 분리하기 위해 실시예 1의 소수성 자성 입자와 함께 단백질 변성 응집물과 세포 잔해 입자 및 크로모조멀 DNA(chromosomal DNA) 를 응집시킨 후 자석을 이용하여 핵산을 분리하고 이후 실리카 자성 입자와 자석을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제한 후 흡광도 측정을 통해 수율과 순도를 확인하였다.
생체 시료로는 암피실린 저항성 유전자가 삽입된 3.0kb의 pGEM-B1 vector (Bioneer, 한국)가 도입된 DH5α 대장균주를 사용하였다. 100㎍/ml의 암피실린이 포함된 LB 액체배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 정도 진탕 배양하여 O.D600 값이 2.0이 되도록 배양하였다. 배양된 대장균 배양액 2ml을 원심분리하여 배양액과 대장균 세포를 분리하고 상등액을 제거하여 대장균 세포만 획득하였다.
획득된 각각의 대장균 세포에 소수성 자성 입자와 RNase A가 포함된 보전 처리용 완충용액을 넣고 세포를 잘 풀어준 후 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어 주었다. 마지막으로 중화용 완충용액을 넣고 잘 섞어 준 후 자석을 이용하여 용액과 비용해성 응집물을 분리하였다.
분리된 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 입자를 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 에탄올을 이용해 다시 한번 씻어 주었다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 TE 버퍼에 녹여 핵산을 회수하였다.
회수된 핵산은 분광광도계를 이용하여 DNA 수율과 순도를 확인하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 핵산 농도 (ng/ul) | OD260/OD280 | OD260/OD230 | |
| 시료 1 | 207.4 | 1.96 | 2.18 |
| 시료 2 | 195.5 | 2.03 | 2.33 |
일반적으로 정제가 잘 된 깨끗한 상태의 핵산은 OD260nm/280nm가 1.8 이상이고 OD260nm/230nm가 2.0 이상일 때를 말한다.
도 1과 표 1에 나타난 바와 같이, 소수성 자성 입자와 실리카 자성 입자를 이용하는 방법으로 실험하였을 때 모든 시료에서 OD260nm/280nm값은 1.8 이상이고 OD260nm/230nm 값은 2.0 이상을 유지하여 핵산이 깨끗하게 정제되었음을 확인하였다.
실시예 3: 소수성 자성 입자를 이용한 핵산분리와 필터를 이용한 핵산분리방법의 비교
소수성 자성 입자를 처리하여 핵산을 분리하는 방법과 소수성 자성 입자를 사용하지 않은 핵산분리방법의 전체 실험 소요 시간을 비교하였다.
실시예 2에 따라 2ml의 대장균 세포를 준비하고, 동일하게 실험한 후 전체 소요시간을 계산하여 일반적으로 많이 사용하는 필터방식과 비교하였다.
| 본 발명 | 필터 분리법 | |
| 생체 시료 용해 및 응집, 핵산과 분리 과정 소요시간 |
2분 | 11분 |
| 정제 과정 소요시간 | 2분 | 4분 |
| 핵산 회수 소요시간 | 2분 | 2분 |
| 전체 소요시간 | 6분 | 17분 |
또한 생물시료를 용해 및 응집시켜 핵산과 분리하는 과정은 원심분리로 이루어지며 10분가량 원심분리를 해야 분리되기 때문에 이 과정에서 많은 시간이 소요된다.
반면 소수성 자성 입자를 사용하는 방법에서는 생물시료를 용해 및 응집시켜 핵산과 분리하는 과정이 자석을 이용해 짧은 시간 (1분 이내)에 완료 되고 정제 과정에서도 기계 사용 없이 자석을 이용하여 빠르게 과정을 완료할 수 있다.
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 핵산 분리과정은 필터 분리법에 비해 소요시간이 약 1/3로 줄어드는 효과를 나타내었다.
실시예
4: 소수성 자성 입자가 처리된 실험 방법을 이용하여 생물시료로부터 분리된 핵산의 효소활성 저해여부 확인
실시예 2에서 분리된 플라스미드 1㎍을 바이오니아로부터 구입한 EcoRI 으로 37℃에서 1시간 동안 절단하고 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 제한효소에 의해 절단된 플라스미드 DNA의 크기가 3.0kb가 맞는지 확인하고, 실시예 1에서 제조된 소수성 자성 입자가 포함된 핵산 분리 방법에 의한 결과물이 효소 활성 저해요인을 포함하고 있는지 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 레인 1~ 3은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 (EcoRI) 처리한 실험구이다.
도 1의 전기영동 사진에서 볼 수 있듯이 본 발명에 의한 방법으로 분리된 플라스미드 DNA는 효소 활성에 아무런 저해 요소를 갖고 있지 않음을 알 수 있었다.
실시예 5: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 혈액 샘플의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 동물의 혈액 샘플에서 다음과 같이 간편한 방법으로 응용하였다.
획득된 혈액 샘플에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 넣고 잘 섞어준다. 다음에 프로티나아제 K를 넣고 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 2의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 6: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양된 박테리아 샘플의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 배양시킨 박테리아 샘플에서 다음과 같이 응용하였다.
배양시킨 박테리아가 있는 배양액 샘플을 고속으로 원심분리하여 박테리아 침전물을 얻는다. 이는 실시예2 방법 중 생체시료에서 대장균 세포를 얻는 과정과 유사하다. 얻어진 침전물은 박테리아 종류 중 그람양성의 경우 라이소자임 효소와 그람양성 전용 완충액과 을 섞어 37℃에서 30분간 반응시키고 프로티나아제 K 와 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 60℃에서 30분간 반응시킨다. 박테리아중 그람음성은 침전물에서 세포분해용 완충액 을 넣고 잘 섞는다. 다음에 프로티나아제 K를 넣고 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 넣어 섞는다. 이후 박테리아 그람 양성, 음성 모두 같은 방법으로, 에탄올을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 3의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 2은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 7: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양 세포의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 배양된 세포 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.
배양된 세포와 배양액이 섞인 샘플을 10분간 중력가속도의 3000배 정도의 속도로 원심분리하여 상층액을 모두 제거하고 인산완충액(PBS)를 넣어 재부유시킨다. 프로티나아제 K 와 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 4의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 8: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 동물조직의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 채취된 동물조직 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.
채취된 동물조직 샘플을 액체질소로 급속냉동시켜 조직파쇄기, 믹서를 사용하여 최대한 가루가 되도록 파쇄시킨다. 가루가 된 조직 샘플 20mg을 프로티나아제 K 와 조직용해액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하여 최대한 골고루 섞고 에탄올을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 5의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 9: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 식물조직의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 채취된 식물조직 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.
채취된 식물조직 샘플을 액체질소로 급속냉동시켜 조직파쇄기, 믹서를 사용하여 최대한 가루가 되도록 파쇄시킨다. 가루가 된 조직 샘플 100mg을 프로티나아제 K 와 계면활성제가 첨가된 조직용해액을 첨가하여 60℃에서 10분간 단백질 분해 반응을 거친다. 다음에 용액에 초산과 완충용액 혼합액을 첨가하여 최대한 골고루 섞고 10분간 얼음에 둔 후, 고속으로 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮긴다. 상층액에 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액을 첨가하여 섞은 다음 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 6의 M은 바이오니아로부터 구입한 1kb ladder 제품으로 사이즈 마커(size marker)이고, 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 핵산 DNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 10: 실리카 자성 나노 입자를 이용한 배양 세포의 핵산 RNA 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 배양된 세포 샘플에서 다음과 같은 방법으로 응용하였다.
배양된 세포와 배양액이 섞인 샘플을 모두 수집하여 5분간 중력가속도의 300배 정도의 속도로 원심분리하여 상층액을 모두 제거하고 구아니딘 염산과 계면활성제, 완충용액 혼합액을 첨가하고 1분 이상 골고루 섞어 세포파쇄과정을 거친다. 다음에 용액에 에탄올을 첨가하여 섞고 실리카 자성 나노 입자까지 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 준다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
도 7의 레인 1~ 4은 본 발명에 의한 방법으로 분리한 배양된 다양한 세포의 핵산 RNA를 전기영동하여 핵산의 농도 및 순도가 일정함을 확인하였다.
실시예 11: 실리카 자성 나노 입자 처리를 이용한 다양한 샘플의 핵산 추출 방법
상기 실시예 2 방법을 다양한 샘플의 핵산 추출 방법에 보다 간편한 방법으로 응용하였다.
획득한 혈액 샘플, 액체 배지에서 배양된 동물 세포주, 동물조직 및 식물조직 등 에 전처리용 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어준다. 이 때, 동식물의 조직세포들은 완충용액 외에도 프로티나아제 등의 단백질 분해 단계를 진행할 수 있다. 그 다음, 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 나노 입자, 에탄올을 첨가하여 섞어준 후 자석을 이용하여 상등액만 제거 한 후 구아니딘 염산과 에탄올 혼합액, 염화나트륨과 에탄올 혼합액, 에탄올을 순차적으로 사용하여 실리카 자성입자를 씻어 주었다. 열풍기, 건열 건조기나 자연건조를 통해 남아있는 에탄올을 모두 제거한 후 물이나 Tris 완충용액에 녹여 핵산을 회수하였다.
핵산 분리 방법에 의한 결과물이 불순물 없이 잘 추출되었는지에 대해 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인한 결과, 도 2 내지 7에 개시된 바와 같이 불순물 없이 잘 추출된 것을 확인할 수 있었다. 도 2 내지 7의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 레인 번호는 본 발명에 의한 방법으로 추출한 샘플 DNA이다.
실시예
12: 소수성 자성 입자 및 실리카 자성 입자 처리를 이용한 추출 방법을 핵산추출 장비에 적용한 전자동화
실시예 2의 핵산추출 방법을 핵산추출장비를 사용하여 전자동화시켰다.
단백질 합성 정제 및 핵산추출용 장비 ExiProgen (바이오니아사, 한국공개특허 제2011-0041126호 및 제2011-0085824호 등에 사용되는 전용 키트의 샘플 주입칸에 넣고 가동시키면 상기 실시예 2의 핵산추출 방법의 모든 절차가 전자동으로 장비 내에서 실행된다.
핵산추출용 장비 ExiProgen은 도 8~15에 그 개략도 및 상태도를 나타내었다.
첫 번째 세포 용해용 완충용액을 제외한 모든 용액이 따로 전용키트에 각각 들어있으며 1개 샘플에서부터 최대 16개 샘플까지 동시에 용액을 이동 및 혼합을 하여 실험을 진행할 수 있다.
상기 실시예1 방법으로 획득된 각각의 대장균 세포를 RNase A가 포함된 보전 처리용 완충용액을 넣고 세포를 잘 풀어준 후 세포 용해용 완충용액을 넣고 잘 섞어 전용키트에 샘플을 주입하고 장비를 가동한다. 장비내부에서 중화용 완충용액과 소수성 자성 입자까지 섞인 용액을 장비내 설치된 자석장치를 이용하여 비용해성 응집물을 키트 일부 웰에 붙이고 용액을 분리하였다. 설치된 자석장치는 도 12와 같은 구조로 ExiProgen 장비 내에 장착되어 있다.
분리된 용액에 구아니딘 염산과 실리카 자성 입자를 첨가하여 섞어준 후 장비내 구동하는 자기장 인가부를 이용하여 상등액만 제거한 후 에탄올을 이용해 다시 한번 씻어 주었다. 에탄올을 자기장 인가부의 히팅 장치로 모두 제거한 후 물이나 TE 버퍼에 녹여 핵산을 회수하였다.
회수된 핵산은 분광광도계를 이용하여 DNA 수율과 순도를 확인하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
| 핵산 농도 (ng/ul) | OD260/OD280 | OD260/OD230 | |
| 시료 1 | 95.5 | 1.92 | 2.23 |
| 시료 2 | 94.6 | 1.88 | 2.2 |
| 시료 3 | 108.9 | 2 | 2.46 |
| 시료 4 | 81.2 | 1.99 | 2.43 |
| 시료 5 | 73.2 | 1.97 | 2.45 |
| 시료 6 | 73.3 | 2.02 | 2.46 |
| 시료 7 | 106.9 | 2 | 2.43 |
| 시료 8 | 78.6 | 1.82 | 2.4 |
일반적으로 정제가 잘 된 깨끗한 상태의 핵산은 OD260nm/280nm가 1.8 이상이고 OD 260nm/230nm가 2.0 이상 일 때를 말한다.
자성 입자, 상세하게는 소수성 자성 입자 또는 실리카 자성 나노입자와 실리카 자성 입자를 이용하는 방법을 단백질 합성 정제 및 핵산추출용 장비 ExiProgen (바이오니아사, 한국공개특허 제2011-0041126호 및 제2011-0085824호)를 이용하여 자동화시켜 장비 내에서 모든 작업이 이루어지면 최대 16개까지 같이 동시에 작동할 수 있고 표 3과 도 17에 나타난 바와 같이 거의 일정한 농도와 모든 시료에서 OD 260nm/280nm값은 1.8 이상이고 OD 260nm/230nm값은 2.0 이상을 유지하여 핵산이 깨끗하게 정제 되었음을 확인하였다.
표 3의 분리된 핵산을 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동 한 결과 전자동화장치 내에서 정제된 핵산 중 플라스미드 DNA가 깨끗하게 정제되었음을 확인할 수 있었다. 도 17의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, 1 내지 8 레인은 표 3에서 회수한 핵산 시료이다.
실시예 13: 전자동화 장치를 이용하여 생물시료로부터 분리된 핵산의 효소활성 저해여부 확인
실시예 12에서 분리된 플라스미드 1㎍을 바이오니아로부터 구입한 EcoRI 으로 37℃에서 1시간 동안 절단하고 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 제한효소에 의해 절단된 플라스미드 DNA의 크기가 3.0kb가 맞는지 확인하고, 전자동화 장치에 의해 분리된 결과물을 도 18에 나타내었다.
도 18의 M레인은 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사, 1kb ladder)이고, U레인은 제한효소에 의해 절단하지 않은 플라스미드 DNA이고, C 레인은 플라스미드 DNA를 제한효소 (EcoRI) 처리한 실험구이다. 전기영동 결과에서 볼 수 있듯이, 플라스미드 핵산에 삽입된 목적 유전자 주위의 특정 염기서열을 분리할 수 있는 제한효소로 처리하였을 때 목적 유전자의 크기만큼 적절히 절단되어 전기영동상에서 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
120 : 피스톤 130 : 피스톤 안내부
140 : 피펫부 141 : 제1열 피펫 142 : 제2열 피펫
150 : 피스톤 안내부 지지판
200 : 고정몸체
231 : 상하 이동모터 232 : 상하 이동벨트
233 : 상하 이동스크류 241 : 전후 이동 슬라이더
300 : 케이싱
310 : 전후 이동 지지봉 311 : 전후 안내가이더
320 : 전후 이동모터 330: 전후 이동벨트
340 : 멸균을 위한 자외선 램프
400 : 베이스플레이트 401 : 손잡이
420 : 멀티웰플레이트 420' : 멀티웰플레이트
430 : 피펫랙 440 : 시료보관용 튜브랙
440-1 : 타겟핵산 보관용 튜브삽착공 440-3 : 타겟핵산 진단용 튜브삽착공
442-1 : 타겟핵산 보관용 튜브 442-3 : 타겟핵산 진단용 튜브
450 : 폐액통 460 : 고온반응블럭
472 : 생물학적 시료용 튜브
700 : 자기장 인가부
710 : 자석장착부 711 : 자석
713 : 단위 웰 인입홈
720 : 자석장착부 지지대 730 : 가이드봉
740 : 가이드 블럭 750 : 인장 스프링
760 : 승강부 761 : 승강모터
762 : 제1 승강축 763 : 승강캠
764 : 제2 승강축
770 : 센싱부 장착판
780 : 높이 감지 센서
781 : 센싱부 782 : 센싱 타겟부
810 : 히팅부 812 : 히팅부 고정판
140 : 피펫부 141 : 제1열 피펫 142 : 제2열 피펫
150 : 피스톤 안내부 지지판
200 : 고정몸체
231 : 상하 이동모터 232 : 상하 이동벨트
233 : 상하 이동스크류 241 : 전후 이동 슬라이더
300 : 케이싱
310 : 전후 이동 지지봉 311 : 전후 안내가이더
320 : 전후 이동모터 330: 전후 이동벨트
340 : 멸균을 위한 자외선 램프
400 : 베이스플레이트 401 : 손잡이
420 : 멀티웰플레이트 420' : 멀티웰플레이트
430 : 피펫랙 440 : 시료보관용 튜브랙
440-1 : 타겟핵산 보관용 튜브삽착공 440-3 : 타겟핵산 진단용 튜브삽착공
442-1 : 타겟핵산 보관용 튜브 442-3 : 타겟핵산 진단용 튜브
450 : 폐액통 460 : 고온반응블럭
472 : 생물학적 시료용 튜브
700 : 자기장 인가부
710 : 자석장착부 711 : 자석
713 : 단위 웰 인입홈
720 : 자석장착부 지지대 730 : 가이드봉
740 : 가이드 블럭 750 : 인장 스프링
760 : 승강부 761 : 승강모터
762 : 제1 승강축 763 : 승강캠
764 : 제2 승강축
770 : 센싱부 장착판
780 : 높이 감지 센서
781 : 센싱부 782 : 센싱 타겟부
810 : 히팅부 812 : 히팅부 고정판
Claims (18)
- 다음 단계를 포함하는 자성 입자를 이용하여 생체 시료로부터 핵산을 분리하는 방법으로
(a) 핵산을 포함하는 생체 시료에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 소수성 자성 입자를 첨가하여, 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 상기 입자를 결합시키는 단계;
(b) 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 소수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;
(c) (b) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 실리카 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 실리카 자성 입자를 결합시키는 단계; 및
(d) 타겟핵산과 결합한 실리카 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여 타겟핵산을 수득하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 소수성 자성 입자의 평균 입경이 50nm ~ 700nm인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 실리카 자성 입자의 평균 입경이 50nm ~ 700nm인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 철, 코발트, 니켈 및 그 산화물 또는 합금에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 자성 입자를 첨가하는 단계는
ⅰ) 생체 시료에 직접 제공하는 단계;
ⅱ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액에 함께 섞어 제공하는 단계;
ⅲ) 생체 시료를 보전 처리하는 보전용액을 처리한 후 제공하는 단계;
ⅳ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계;
ⅴ) 생체 시료 용해를 위해 완충용액을 처리한 후 제공하는 단계;
ⅵ) 용해된 생체 시료에 단백질 변성 응집물을 형성시키기 위한 완충용액에 함께 섞어 제공하는 단계; 및
ⅶ) 단백질 변성 응집물이 형성된 용액에 제공하는 단계;
에서 선택되는 단계에 첨가되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 제1항에 있어서 분리되는 타겟 핵산은 플라스미드 DNA, 박테리아의 게놈 DNA, 혈액 및 동식물 조직 DNA, 동물 세포주의 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 수평방향 및 수직방향으로 이동 가능하게 설치되며, 다수의 피펫을 분리 가능하도록 장착하기 위한 피펫블록;
멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 자기장을 인가 및 해제하기 위한 자기장 인가부;
상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰 하방에 위치하는 자석장착부;
상기 자석장착부를 상승 및 하강시키기 위한 승강부;
자성 입자를 분리하기 위한 자석부재; 및
상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰을 가열하기 위한 히팅부;
를 포함하고,
상기 멀티 웰 플레이트에 생체시료와 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 자성 입자가 첨가되는 것을 특징으로 하는 생체 시료로부터 핵산을 전자동으로 분리하는 전자동 핵산 분리 장치를 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟핵산을 분리하는 방법으로서,
1) 소수성 자성 입자를 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰에 첨가하여 타겟핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 자성 입자를 결합시키는 단계;
2) 타겟 핵산을 제외한 비용해성 응집물 또는 핵산분자와 결합한 상기 소수성 자성 입자를 자기장을 이용하여 분리하여, 타겟핵산을 함유한 혼합물을 수득하는 단계;;
3) 2) 단계에서 수득된 혼합물에 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 실리카 자성 입자를 첨가하여 타겟핵산과 결합시키는 단계;
4) 타겟핵산과 결합된 실리카 자성 입자를 제외한 혼합물을 제거하는 단계; 및
5) 타겟핵산과 결합된 실리카 자성 입자에서 타겟핵산을 분리하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제10항에 있어서,
2) 단계 또는 4) 단계의 자성 입자와 결합된 물질을 분리함에 있어서, 자기장 인가부를 이용하여 상기 멀티 웰 플레이트의 특정 단위 웰 하부의 내벽에 부착시켜 분리하는 것을 특징으로 하는 전자동 핵산 분리 방법
- 제10항에 있어서,
분리되는 타겟 핵산은 플라스미드 DNA, 박테리아의 게놈 DNA, 혈액 및 동식물 조직 DNA, 동물 세포주의 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
- 평균 입경 크기가 50nm ~ 1μm인 소수성 자성 입자 및 실리카 자성 입자를 포함하는 생체시료로 부터 핵산 분리정제용 키트.
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