KR102318061B1

KR102318061B1 - 반려동물용 발효귀리 사료

Info

Publication number: KR102318061B1
Application number: KR1020180062827A
Authority: KR
Inventors: 이찬호; 강정선
Original assignee: (주)진바이오텍
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2021-10-28
Also published as: KR20190137202A

Abstract

본 발명은 발효동물용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 구체적으로 반려견 등의 반려동물의 피모 혹은 면역기능 개선에 탁월한 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명은 귀리를 P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 의 조합으로 발효한 것이 특징이다.

Description

반려동물용 발효귀리 사료 {OAT FERMENTATION FOR COMPANION ANIMAL}

본 발명은 발효동물용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 구체적으로 반려견의 피모 혹은 면역기능을 개선할 수 있는 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.

국민소득의 증가, 핵가족화의 심화 및 고령화 사회로의 진입이 빠르게 진행됨에 따라 국내 애완견 시장이 성장하고 있다. 최근 5년간 반려동물 산업은 고령화, 독신가구의 증가, 여가확대 등에 힘입어 지속적으로 성장했으며, 2012년 9천억원에서 2016년 2조 3천억원으로 5년 만에 2.5배 수준의 매출액 성장을 기록했으며, 2020년 반려동물 산업의 시장 규모는 5조 8천억원으로 다시 배 이상 성장할 것으로 예상된다.

2019년까지 세계 애완동물 시장도 매년 3% 이상 증가할 것으로 예상된다. 그 중 특히 동남아시아와 중국이 급성장을 하고 있고, 이러한 급성장 국가들에서 애완견 사료의 28% 이상을 소비하게 될 것으로 예상하고 있다(Pet food Industry, 2017). 전세계 애완동물 사료의 매출규모는 2010년 59.3billion USD에서 2014년 73.3billion USD 규모로 성장했고, 이러한 성장은 2020년까지는 지속될 것으로 전문가들은 예상하고 있다(Euromonitor, Bloomberg).

애완동물 사료는 애완동물 시장의 주된 매출분야이다. 그 동안 애완동물 사료에서 탄수화물이나 단백질의 주공급원으로는 옥수수와 소맥 등이 있었다. 예컨대 대한민국 공개특허공보 제 10-2017-0033433호는 옥수수, 소맥 등의 글루텐의 필러와 균을 혼합한 사료를 개시한다.

그런데 위 소맥 등의 경우는 gluten 함량이 높은데, Gluten은 소맥, 대맥, 옥수수 등 모든 곡물에 함유되어 있는 불용성 단순 단백질로서, 불용성이기 때문에 개 사료로 사용할 시 소화율 저하 문제를 야기 시킬 수 있다.

대한민국 공개특허공보 제 10-2017-0033433호

영국의 경우 전체 14,532 명의 수의사를 대상으로 조사한 결과 수의사들이 가장 진료를 많이 보는 종(Species)은 개였으며, 이 종에서 가장 자주 문제를 나타내는 장기 또는 부위를 물었을 때, 17개의 카테고리 중 피부(32%)가 가장 높은 비율을 나타내었으며(Veterinary Record, 2014), 병원을 내원한 환자 중 피부질환자가 가장 많은 비율을 차지했다(Diss. University of Nottingham, 2014).

국내 반려견의 경우도 전체의 50% 수준에서 정도의 차이는 있어도 세균성 피부질환을 보유하고 있고, 일반 다른 질병에 의해서 내원하는 반려견의 경우도 70% 이상에서 피부질환을 보유하고 있는 것으로 보고되고 있다(경북대 수의과대학 내과학실, 2017). 게다가 이러한 경향은 매년 증가하는 추세를 보이고 있어 이에 대한 대책이 필요한 실정이다.

그런데 소화율 개선을 위한 기능성 탄수화물 공급원으로서 면역 활성 증대를 통한 피모품질 및 알러지 개선 효과 등 치료효과를 가진 기능성 사료 원료는 아직까지 보편화되어 있지 않다.

이에 본 발명자는 본 연구를 통해 반려견의 피모 및 면역기능 개선을 목적으로 하는 기능성 소재를 개발하고자 하였다.

구체적으로 본 발명자는 소맥, 대맥, 옥수수 등을 다른 곡물로 대체하여 글루텐에 의한 소화율 저하 문제를 개선하고, 동시에 반려동물, 예컨대 반려견의 피모 및 면역기능을 개선할 수 있는 사료 또는 사료첨가제를 발명하고자 하였다.

본 발명자는 귀리가 가지고 있는 기능적인 특성에 주목했다. 또한 귀리 단독 사료보다는 귀리와 함께 특정 미생물 균주를 배합한 발효귀리의 효능에 관심을 가졌다. 그 결과 반려견 등의 반려동물의 피모 및 면역기능을 개선하는데 귀리와의 효과와 탁월한 미생물 균주를 선발했고, 이를 통한 귀리의 최적의 발효공정을 확립하여, 전술한 과제를 해결했다.

본 발명의 과제의 해결 수단은 구체적으로 다음과 같다.

1. 반려동물의 피모개선능을 가진 P. pentosaceus 균주(KCCM11600P).

2. 반려동물의 피모개선능을 가진 S. cerevisiae 균주(KCCM11130P).

3. P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 의 복합균주로 발효한 귀리를 포함하는 반려동물 사료.

4. 상기 3 에 있어서, 원료배지인 귀리에 P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 를 접종하여 30-36 °C 에서 배양하여 고체발효하여 제조된 것을 특징으로 하는 반려동물 사료.

본 발명에 따른 발효귀리는 반려동물의 피부질환 개선에 효과가 있다. 아울러 본 발명에 따른 발효귀리는 글루텐 함량이 적어 소화율 저하의 문제를 야기하지 않고, 반려동물의 영양적 기능의 개선을 유도하며, 면역활성증진 효과도 있다.

또한 본 발명에 따른 발효귀리는 옥수수나 귀리와 달리 대등한 양의 귀리를 발효했을 뿐인데도, 예상과 달리 베타글루칸의 양이 증진되었다.

또한 본 발명에 따른 발효귀리의 제조에 적합한 균주는 충분한 내열성을 갖추어 제품으로 가공하는 공정에서 손실되지 않으며, 대장균에 대한 활성도 있다.

도 1 은 고체발효물의 대장균 균주에 대한 항균활성 평가결과를 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명에 따른 개발제품의 내열성 평가결과를 나타낸 것이다. 각 온도별 5분간 열처리했으며, PP 는 P. pentosaceus 를, SC 는 S. cerevisiae 를 말한다.
도 3 은 본 발명에 따른 개발제품의 베타글루칸 함량을 분석한 결과이다. 발효귀리 (B) 가 본 발명에 따른 개발제품이다.
도 4 는 피부수분손실량 (TEWL) 평가결과를 나타낸 것이다. Oat 는 일반 귀리를, F-Oat 는 본 발명에 따른 발효귀리를 말한다.
도 5 는 Body condition score 측정결과를 나타낸 것이다. 1-3 은 Too thin, 4-5 는 Ideal, 6 은 Overweight, 7-9 는 Too heavy 라고 해석하면 된다.
도 6 은 일반견에서의 개발제품 급이 후 피부상태 평가결과를 나타낸 것이다. A 는 일반귀리를, B 는 본 발명에 따른 발효귀리를, C 는 대조구를 말한다. 1 은 Dull, coarse, dry, 2 는 Poorly reflective, nonsoft, 3 은 Medium reflective, medium soft, 4 는 Highly reflective, very soft, 5 는 Greasy 라고 해석하면 된다.
도 7 은 일반견에서의 개발제품 급이 후 피모상태 평가결과를 나타낸 것이다. A 는 일반귀리를, B 는 본 발명에 따른 발효귀리를, C 는 대조구를 말한다. 1 은 Dry, 2 는 Slightly dry, 3 은 Normaml, 4 는 Slightly greasy, 5 는 Geasy 라고 해석하면 된다.
도 8 은 피부수분손실량 (TEWL) 평가결과를 나타낸 것이다.
도 9 는 처리구별 소양감지수를 나타낸 것이다. 발효귀리가 본 발명에 따른 개발제품을 말한다.

본 발명자는 기능성 원료로서 B-glucan 함량이 높은 귀리 원료가 활용가능성이 높을 것으로 기대했다.

B-glucan은 B-D-glucose의 다당체로서, 자연계에서는 곡물, 박테리아, 그리고 진균류의 세포벽을 구성하고 있는 물질이다. 귀리와 효모의 베타글루칸은 구조가 다른데, 귀리의 경우는 화학식 1 과 같이 1,3 그리고 1,4 탄소결합에 의한 linear한 구조를 이루고, 효모의 경우는 화학식 2 와 같이 1,3 탄소 결합 그리고 1,6 탄소가지를 가지고 있는 형태를 가지고 있다.

[화학식 1] 귀리의 β-glucan 구조

[화학식 2] 효모의 β-glucan 구조

대부분의 피부질환에 대한 처방사료에는 피부에 효능이 있다고 알려진 오메가 지방산, 비타민 A 나 E, 아연 등을 첨가한 사료를 주로 활용하고 있으나, 본 발명자는 귀리에서의 B-glucan 도 면역 활성 증진을 통한 아토피 등 피부질환 예방 및 치료(B-glucan 기준 0.1~1.0% 첨가)에 도움이 될 수 있을 것으로 기대했다.

그리고 본 발명자는 귀리를 그 자체로 원료로 생산하기 보다는 균과 함께 발효하여 효능을 극대화하는 것에 노력했다.

생균제(유산균 류, 바실러스 류, 효모 류 등) 중 하나이자 현재 항생제 대체제로 활용되고 있는 유산균은 최근 연구 결과에 의하면 장관면역을 강화하고, 비특이 면역을 향상시켜, 병원성 미생물에 대한 잠재적 조절 기능을 갖고 있는 것으로 보고되었으며(Isolauri 등, 1993; Kaila 등 1992; Hamid 등 2006), 이러한 연구를 기초로 유산균 등의 장내 미생물에 의한 면역 시스템 조절 기전 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 생균 자체로뿐만 아니라 그람양성균의 세포벽 성분 중 하나인 리포테이코산(LTA)은 일반적으로 글루코스 또는 D-알라닌 치환체를 갖는 폴리인산글리세롤 및 당 단위와 지방산 사슬을 포함하는 당지질의 두 개의 구조체로 구분되는데, 이 중 폴리인산글리세롤의 D-알라닌 함량에 따라서 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 조절된다고 알려져 있다(Morath, S 등, 2001).

이러한 유산균의 기능적 특성으로 인해 apotic dermatitis에 대한 효능이 다양하게 보고되고 있어(Irfan A 등, 2016; Hyejin Kim 등, 2015; K.Wickens 2012), 반려견의 피모개선 및 면역기능을 개선하는 효과를 기대할 수 있을 것으로 기대했다.

또한 Avenanthramides은 귀리에서 주로 발견되는 폴리페놀로서, NF-κB 활성을 억제함으로써 anti-imflammatory 활성과 anti-itch 활성을 가진다고 보고되어(Sur. R 외, 2008), 귀리와 유산균의 시너지 효과가 분명히 존재할 것으로 기대했다.

또한 귀리에 포함된 B-glucan은 prebiotic으로서 유산균 (Lactobacillus류, Bifidobacillus류 등)의 생장 촉진에 기여할 수 있으며(J Korean Soc Food Sci Nutr 38(12), 1811~1814(2009)), 이러한 유용균주를 이용한 귀리의 발효를 통해 유용균주의 성장 증가와 그에 따른 면역활성 증진효과를 기대했다.

또한 귀리의 glucan에 의해 쥐의 macrophage phagocytic 활성이 증가된다는 연구결과가 있으며(Estrada 외,1997), 쥐의 intestinal leukocytes 와 enterocytes 의 transcription factor의 증가(Volman 외 ,2010), monocytes와 neutrophils의 증가(Liang 외,1998 ; Kaiser 외, 2002)등의 연구 결과 등이 보고되었고, 효모의 glucan 또한 수술환자에서의 패혈증 예방(Babineau 외, 1994; Dellinger EP 외, 1999)의 연구 결과로 보아 반려견에게 투여했을 시 면역 증강 효과가 있을 것으로 기대했다.

또한 B-(1,3)(1,6)-glucan의 애견 아토피 모델에서의 아토피 징후 감소가 보고되어(Beynen 외 2011) 애견 아토피 질환에서의 효과 또한 있을 것으로 기대했다.

이처럼 본 발명자는 귀리 발효를 통해 귀리 원료의 영양적 기능의 개선뿐만 아니라, 귀리가 가지고 있는 B-glucan 과 발효에 이용된 유용균주의 면역 활성 증진효과 등 면역학적인 개선효과를 목적하고 본 발명을 연구했다.

1. 면역활성 개선 균주 선발 준비

1) 액상발효 균주 준비

균주별 면역활성 개선효과를 평가하기 위해 선발균주를 7종을 대상으로 1L의 MRS 및 PDA 액체배지를 이용하여 배양온도 30~35℃, 200rpm으로 24시간동안 유산균 및 효모 균주를 각각 배양하였다. 배양 후 균수 측정 후 각각의 균주를 대상으로 면역 활성 평가를 실시하였다. 액상발효 샘플에서의 복합균주에 대한 처리는 단독 발효균주를 각각 혼합(50% 씩 혼합)하여 처리한 후 면역활성 개선효과를 확인하였다.

2) 고체발효 샘플 준비

면역 활성 개선균주 선발을 위해 고체발효 공정으로 발효샘플을 준비하였다. 원료배지로는 귀리를 사용하였으며, 초기 종균 접종 수준을 2.0×10⁶ cfu/g 으로 접종하고 30~35℃ 조건으로 36시간 배양하였다. 고체발효결과를 표 1에 나타내었다. 발효샘플은 단독 발효 샘플 및 시너지효과를 확인하기 위한 복합발효 샘플을 각각 제조하였다. 복합발효는 종균 접종량을 1.0×10⁶ cfu/g 씩을 각각 접종하였다.

균주 별 귀리 고체발효결과 (균수)

Treatment	발효종료 후 균수
Lactobacillus rhamnosus GG	3.5×10⁸
Lactobacillus plantarum 1	3.3×10⁸
Pediococcus pentosaceus	7.5×10⁸
L. plantarum 2	2.7×10⁸
L. reuteri	3.1×10⁸
Saccharomyces cerevisiae	5.0×10⁷
Aureobasidium pullulans	4.3×10⁷
L. plantarum 1 + S. cerevisiae	2.5×10⁸/ 3.9×10⁷
P. *pentosaceus* *+ S.* *cerevisiae*	5.4×10⁸/ 5.0×10⁷
L. plantarum 2 + S. cerevisiae	2.8×10⁸/ 4.1×10⁷
L. reuteri + S. cerevisiae	4.4×10⁸/ 3.1×10⁷
L. plantarum 1 + A. pullulans	3.5×10⁸/ 5.0×10⁷
P. pentosaceus + A. pullulans	5.3×10⁸/ 2.8×10⁷
L. plantarum 2 + A. pullulans	4.1×10⁸/ 4.6×10⁷
L. reuteri + A. pullulans	4.4×10⁸/ 4.3×10⁷

2. In vitro 면역활성 개선효능 보유 균주 선발선발 유산균주의 면역활성을 측정하기 위해 한국세포주은행으로부터 RAW 264.7 macrophage cell을 분양받아 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco Laboratories)과 100unit/mL의 스트렙토마이신, 페니실린(Gibco Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO²조건에서 배양했다.

선발균주에 의한 마크로파지(macrophage)의 사이토카인(cytokine) 및 nitrite oxide (NO) 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 12 well plate의 각 well당 5.0 X 10⁵ cell/ml가 되도록 분주하여 2시간 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체한 후 1.0 X 10⁸ cfu/mL 농도 로 맞춘 유산균 배양액 100 μl 첨가해 최종 1.0 X 10⁷ cfu/mL 농도로 48시간 배양했다.

염증 반응 모델은 각 well 당 1㎍/mL lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)를 처리하고, 음성 대조군(Negative control)은 phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2)을 처리한다.

면역활성의 비교균주로는 Lactobacillus rhamnosus GG 균주를 사용한다.

Nitric oxide (NO) 분석은 RAW 264.7 세포를 5.0 X 10⁵ cell/ml로 접종하여 유산균과 양성대조군으로 처리한 LPS, 음성대조군으로 처리한 PBS 배양액을 각각 회수하여 Griess reagent system (Promega, USA)을 사용하여 NO를 측정한다. 96-well 플레이트에 배양액 50㎕를 넣고 Griess reagentⅠ(NED solution)과 Griess reagentⅡ (Sulfaniliamide solution)을 동량으로 섞어 넣고, 10분간 반응 후 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 흡광도를 540nm에서 측정하고, 산화질소(NO)의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선 (0-100μM)을 이용하여 계산한다.

NF-κB 분석은 마크로파지 세포를 96 well plate의 각 well 당 5.0 X 10⁴ cell/ml가 되도록 분주하여 2시간 안정 화 시킨 후 1.0 X 10⁷ cfu/mL 농도로 맞춘 후 선발균주 배양액 시료를 100 μl 첨가하여 최종 1.0 X 10⁶ cfu/mL 농도로 24시간 배양하고, 양성대조군(Positive control)은 웰 당 100ng/mL의 lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)를 처리한 뒤 NF-κB 생성량을 측정한다.

TNF-α 분석은 RAW 264.7 세포를 5.0 X 10⁵ cell/ml로 접종한 후 세포가 안정되면 선발균주 또는 고체발효 추출물과 LPS 처리 후 48시간 후에 배양액을 회수하였다.

TNF-α 생산량은 TNF-α ELISA kit를 이용하여 측정한다.

선발균주별 면역활성 측정결과는 표 2와 표 3에 나타내었다.

균주별 배양액에서의 면역활성 평가결과 (액상발효)

Treatment	NOS (Relative, %)	TNF -α (Relative, % )	비고
Control/ Lactobacillus rhamnosus GG	100.0	100.0	단독발효
Lactobacillus plantarum 1	90.1	94.0
Pediococcus pentosaceus	85.7	95.3
L. plantarum 2	86.8	94.5
L. reuteri	104.4	96.6
Saccharomyces cerevisiae	102.2	93.3
Aureobasidium pullulans	105.5	97.4
P. *pentosaceus* *+ S.* *cerevisiae*	81.3	85.5	단독발효 배양액 50% 씩 혼합
L. plantarum 2 + S. cerevisiae	99.5	91.3
L. reuteri + S. cerevisiae	124.2	92.1
L. plantarum 1 + A. pullulans	108.8	96.7
P. pentosaceus + A. pullulans	90.1	91.9
L. plantarum 2 + A. pullulans	113.2	88.2
L. reuteri + A. pullulans	120.9	86.7

균주별 발효귀리 샘플에서의 면역활성 평가결과 (고체발효)

Treatment	NOS (Relative, % )	TNF -α (Relative, %)	비고
Control/ Lactobacillus rhamnosus GG	100.0	100.0	단독발효
Lactobacillus plantarum 1	91.3	93.0
Pediococcus pentosaceus	85.0	90.5
L. plantarum 2	101.3	99.3
L. reuteri	111.3	102.2
Saccharomyces cerevisiae	91.3	98.8
Aureobasidium pullulans	98.8	102.9
L. plantarum 1 + S. cerevisiae	92.5	102.7	복합발효
P. *pentosaceus* *+ S.* *cerevisiae*	88.8	89.3
L. plantarum 2 + S. cerevisiae	102.5	96.8
L. reuteri + S. cerevisiae	108.8	92.4
L. plantarum 1 + A. pullulans	106.3	90.5
P. pentosaceus + A. pullulans	82.5	94.0
L. plantarum 2 + A. pullulans	106.3	99.0
L. reuteri + A. pullulans	116.3	104.7

귀리에서 P. pentosaceus(KCCM11600P) 와 S. cerevisiae(KCCM11130P) 를 복합발효한 것이 면역활성에 있어서 효과가 가장 탁월했다. 본 발명자는 P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 의 조합이 귀리와의 시너지 효과가 가장 우수함을 확인하여, 이를 최종 선발균주로 하였다. 이하 최종 선발균주라 함은 P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 의 조합을 말한다.

2. 고체발효공정을 활용한 기능성 생균제 제조

최종 선발균주를 대상으로 in vivo 효능평가를 위해 고체발효 공정으로 발효샘플을 준비하였다.

원료배지로는 귀리를 사용하였으며, 초기 종균 접종 수준을 2.0×10⁶ cfu/g 으로 접종하고 30~36℃ 조건으로 36시간 배양하였다.

고체발효 제품의 균수 및 일반성분 함량 분석결과를 표 4, 표 5에 각각 나타내었다.

최종 건조 및 분쇄 종료 후 균수는 P. pentosaceus 균주가 3.9×10⁸ CFU/g 및 S. cerevisiae 균주가 1.3×10⁷CFU/g으로 확인되었다. 일반성분 함량 분석결과에서는 일반귀리 대비 큰 차이는 아니지만, 본 발명에 따른 발효귀리에서 조지방, 조섬유, 조회분함량의 감소 및 조단백질 함량 증가가 확인되었다.

발효귀리 균수 분석결과

균주명	최종 제품 ( CFU /g)
P. pentosaceus	3.9×10⁸
S. cerevisiae	1.3×10⁷

발효귀리 일반성분 및 아미노산 함량 분석결과

구분	항목	일반귀리	발효귀리 (P. pentosaceus + S. cerevisiae)
일반성분 함량, %	수분	12.92	8.79
	조단백질	13.14	13.99
	조지방	4.71	4.70
	조섬유	2.65	1.50
	조회분	1.78	1.82
아미노산 함량, %	트립토판	0.14	0.13
	트레오닌	0.47	0.5
	세린	0.67	0.72
	프롤린	0.49	0.51
	발린	0.7	0.72
	이소루신	0.46	0.49
	루신	0.96	1.01
	티로신	0.43	0.44
	메치오닌	0.27	0.29
	시스틴	0.61	0.58
	라이신	0.56	0.62
	글라이신	0.67	0.69
	알라닌	0.6	0.6
	알기닌	0.91	0.91
	글루타민산	2.78	2.98
	아스파틱산	1.07	1.12
	히스티딘	0.29	0.32
	페닐알라닌	0.67	0.75

3. 개발제품의 대장균 항균활성 평가 결과이하 P. pentosaceus 와 S. cerevisiae 의 조합인 최종 선발균주로 발효한 발효귀리를 개발제품이라고도 한다.

처리구별 기능성 평가를 위해 대장균에 대한 항균활성을 agar diffusion법으로 평가하였다.

LB agar 배지에 대장균 (E. coli, 장독소형)을 혼합하여 배지를 제조하였다. 배지에 10mm 크기로 punching 하여 0.25㎛의 syringe filter로 여과한 고체발효 추출액 250㎕ 첨가하고 24시간 배양 후 투명환 생성유무를 확인하였다.

평가 결과 P. pentosaceus 균주가 L. reuteri 및 L. plantarum 2 대비 투명환의 크기가 2cm로 가장 컷으며, P. pentosaceus 균주와 S. cerevisiae 혼합 처리구에서도 유사한 경향을 나타내었다. 결과는 도 1 에 나타냈다.

4. 개발제품의 in vitro 내열성 평가결과

개발제품의 내열성을 평가하기 위해 water bath를 이용하여 80, 85, 90, 95℃의 온도조건에서 5분간 열처리 후 균수변화를 조사하였다.

열처리 방법은 고체발효물 10g을 90mL의 DW로 30분간 추출 한 후 추출액을 50mL tube에 담아 각 온도조건의 water bath에 넣어 열처리 한 후 ice bucket에 담아 방냉 후 균수를 분석하였다.

분석결과 P. pentosaceus 균주와 S. cerevisiae 균주 모두 내열성이 양호했으며, P. pentosaceus 균주가 초기 균수 대비 95℃, 5분간 열처리조건에서도 Log값 기준 약 92%이상의 안정적인 균수를 유지하는 것으로 확인되어 내열성이 상당히 우수한 것으로 확인되었으며, 애완용 펠렛사료 가공 시 고온 열처리조건에서 안정적인 균수를 유지할 수 있을 것으로 예상되었다.

5. In vivo 효능평가

발효귀리 소재 개발식이군 (처리구 B), 일반귀리 함유식이군 (처리구 A) 및 귀리 대신 옥수수 혼합 일반식이군 (대조구)으로 분류하여, 각3두의 비글견을 암/수 구별 없이 무작위 배치한 후 6주(42일)간 각각의 식이를 급여하면서 피부, 피모 변화 등을 조사하였다.

처리군은 일반 시험 및 임상시험에 동일하게 적용하여 개발제품의 효능을 평가하였다.

일반시험은 비글견을 대상으로 진행하였으며, 임상시험은 경북대학교 동물병원에 내원하는 피부질환 보유 환견을 대상으로 시험을 진행하였다.

일반시험 및 임상시험용 처리군 구성

Group	No of Dogs	Feeding
A. 일반 귀리	3	200 g/ dog/ day
B. 발효 귀리	3	200 g/ dog/ day
C. 대조구 (일반 사료)	3	200 g/ dog/ day

효능평가를 위한 시험방법은 아래와 같다.

① 시험동물

- 시험에 공시한 비글 실험견에 대한 기본적인 임상정보를 기록한다. 품종, 년령, 성별 및 체중을 측정한다.

- 임상시험동물은 최소 6개월 이상 또는 2회 피부염이 재발된 환견을 대상으로 한다.

② 시험사료 제조

- 애견사료는 전문 생산업체를 통해 시제품을 제조하여 in vivo 평가에 활용한다.

③ 기호성 테스트

Two-Bowl Test로 평가한다.

④ 체중 및 BCS (body condition score) 측정

- 각각의 시험군에 할당된 식이 급여 전, 급여 후 14일, 28일, 42일에 체중을 측정하고 BCS를 작성한다. 각각의 측정시기에 시험견의 측면 및 배부 사진을 촬영한다.

⑤ 피부증상평가 (임상시험동물)

- 피부병력, 현증경과 및 치료력을 기록한다.

- 피부병변 및 소양증에 대한 Scoring System을 적용한다.

⑧ 피부 및 피모 평가

식이 급여 전, 급여 후 28일, 42일에 시험견의 피부 및 피모 상태를 평가한다. 평가는 블라인드 테스트로 진행하며 4명의 숙련된 수의사가 밝은 광원아래에서 시험견을 피모의 뻣뻣함과 건조함, 각질의 정도에 따라 1-5점의 점수로 평가한다.

⑨ 피부기능 평가

식이 급여 전, 급여 후 28일 및 42일에 시험견의 피부기능을 평가한다. 피부 pH, 수화도, 지질도 및 피부장벽능력을 평가하기 위해 피부수분 손실도를 평가한다. 수의사는 각각의 평가일 전 날, 지정된 측정 부위의 털을 깨끗하게 제거하고 평가 일에 지정된 부위에서 연속 3번 TEWL 값을 측정, 평균값을 구한다.

⑩ 부작용 평가

구토, 설사, 복통 등 소화기 관련 증상과 기타 증상에 대한 발생유무를 조사했다.

⑪ 통계분석

각각의 시점에 대한 각 군간 유의성 검정은 반복측정 분산분석 (Repeated Measure ANOVA), Wilcoxon Signed Rank test를 이용하여 분석하고 값이 0.05 미만인 경우 유의한 결과로 판정한다.

1) In vivo 시험용 펠렛사료 제조 결과

In vivo 시험용 펠렛사료 제조 결과 (전체 조성대비 발효귀리 10% 첨가) 100~110℃의 높은 온도조건에서 펠렛 가공 후 균수변화를 조사한 결과 펠렛 전 초기 균수 대비 P. pentosaceus 균주가 약 92% (log 값 기준), S. cerevisiae 균주가 약 79% (log 값 기준)수준의 균수를 유지하는 것으로 확인되어 in vitro 시험결과에서 검증된 바와 같이 펠렛 가공을 통해서도 균수 감소가 크지 않은 것으로 확인되었다.

펠렛 가공 전/ 후 균수 변화

균주명	균수 (Log CFU /g)			비고 ( 펠렛 전/후 균수 변화, % )
균주명	발효귀리	펠렛 전	펠렛 후	비고 ( 펠렛 전/후 균수 변화, % )
P. pentosaceus	8.59	7.59	6.96	91.7
S. cerevisiae	7.11	6.11	4.81	78.7

사양시험용 처리구별 일반성분 분석결과는 표 8에 나타내었으며, 처리구별 단백질 수준의 편차를 최소화하였다.

처리구 사료 일반성분 분석결과

분석항목	귀리 (A)	발효귀리 (B)	대조구 (시판제품, C)
수분, %	6.55	6.40	6.51
조단백질, %	30.41	31.33	31.45
조지방, %	15.61	17.47	18.07
조섬유, %	2.22	2.94	2.13
조회분, %	6.64	6.76	7.11

사양시험용 사료는 시판제품의 조성에서 옥수수를 단순히 귀리 또는 발효귀리로 대체하여 사료를 제조하여 기본적인 사료의 베타글루칸 함량은 동일할 것으로 예상된다. 시판제품 41.39 mg/g 대비 일반귀리 54.49 mg/g으로 약 13 mg/g 이 증가하였으나, 발효귀리 처리구의 경우 일반귀리 사료 대비 약 33 mg/g 이 증가한 것으로 확인되어 발효공정을 통한 베타글루칸 함량의 증가가 확인되었다. 처리구 별 베타글루칸 분석결과는 표 9에 나타내었으며 발효귀리 처리구에서의 베타글루칸 증가가 확인되었다.

처리구 사료 베타글루칸 분석결과

분석항목	귀리 (A)	발효귀리 (B)	대조구 (시판제품, C)
베타글루칸, mg/g	54.49	88.01	41.39

2) 효능평가결과(1) 엉덩이 피부수분손실량(TEWL) 평가결과

엉덩이 부분에서 피부 표면에서 증발되는 피부 수분 손실량을 평가한 결과 본 발명에 따른 개발제품 처리구인 발효귀리 (F-oat) 처리구에서 가장 수분손실량이 낮은 것으로 평가되었다. 결과는 도 4 에 나타냈다.

피부 수분 손실량을 검사하는 것은 피부장벽기능을 알아보는 것으로서 피부 수분 손실이 과도한 경우에는 피부가 건조해지며, 정상인의 경우 피부의 가장 겉부분인 각질층에 수분이 많이 함유된 경우에는 수분 손실량 또한 많아지지만, 아토피 피부를 가진 경우 각질층의 수분이 정상이거나 적음에도 수분 손실량이 많은 특징을 일반적으로 나타낸다. 따라서 본 발명에 따른 개발제품의 급여를 통해 피부장벽의 기능 강화를 통한 수분손실량이 정상 또는 최소화되는 것으로 판단된다.

(2) BCS 측정결과 (Body condition score)

Body condition score 측정결과는 Royal canin 사의 측정기준을 적용하여 측정하였다. 본 발명에 따른 발효귀리 (F-Oat) 처리구에서는 대조구 및 일반귀리 처리구 대비 상대적으로 안정적인 결과를 확인하였다. 결과는 도 5 에 나타냈다.

3) 피부 (skin) 평가결과

피부질환이 없는 일반견 (비글견)에서의 피부상태 평가결과에서는 전체 처리구에서도 동일하게 4주차 및 8주차 결과에서 3.0~3.5 수준을 유지하였으며, 처리구별 차이는 없는 것으로 확인되었다. 결과는 도 6 에 나타냈다.

4) 피모 (hair) 평가결과

피부질환이 없는 일반견 (비글견)에서의 피모상태 평가결과에서는 전체 처리구에서도 동일하게 4주차 및 8주차 결과에서 3.0~3.5 수준을 유지하였으며, 처리구별 차이는 없는 것으로 확인되었다. 결과는 도 7 에 나타냈다.

5) 환견 대상 임상시험 결과: 피부수분손실량 (TEWL) 평가 (복부)

복부 부분에서 피부 수분 손실량을 평가한 결과 본 발명에 따른 개발제품 처리구인 발효귀리 처리구에서 가장 수분 손실량이 가장 낮은 것으로 평가되었다. 결과는 도 8 에 나타냈다.

6) 환견 대상 임상시험 결과: 급여기간에 따른 소양감지수 변화

동일한 처리구를 대상으로 경북대학교 동물병원을 내원하는 피부질환 보유 환견을 대상으로한 임상시험결과에서 6주까지 급여하면서 소양감지수를 평가하였다.

소양감지수에서는 본 발명에 따른 개발제품인 발효귀리 첨가군에서 6주차 평균 0.7로 확인되어 일반귀리 및 대조구 대비 증상에 대한 개선이 있는 것으로 평가되었다.

처리구별 소양감지수

처리구	0주차	4주차	6주차
일반귀리	7.0	4.5	3.0
발효귀리	6.7	2.0	0.7
대조구	4.0	3.0	3.3

소양감 기준	소양감 기준
0	소양감을 나타내지 않음
2	피부문제가 생기며 소양감을 보이기 시작
4	소양감이 있으나 수면, 식사, 운동 시에는 나타내지 않음
6	수면시 소양감을 나타내나 식사, 운동시에는 나타나지 않음
8	수면, 식사, 운동시간에도 소양감을 나타냄
10	쉴 새 없이 소양감을 나타냄

표 10 의 결과를 도 9 에 나타냈다.6) 환견 대상 임상시험 결과: 병변지수 분석결과 (피부병변 총점)

환견을 대상으로 6주간 개발제품 급여를 통해 피부병변지수를 반점 (macule), 탈모 (alopecia), 구진 (papule), 인설(Scale), 플라그(Plaque), 가피(Crust), 농포(Pustule), 모낭원주(Follicular cast), 팽진(Wheal), 과색소침착 (hyperpigmentation), 소수포 (vesicle), 면포(comedo), 수포(Bulla), 짓무름(Erosion), 낭 (Cyst), 결절 (Nodule), 궤양 (Ulcer), 종양 (Tumor), 태선 (Lichenification), Epidermal collaborate에 대해 각각 평가하고 총합계 점수를 표 12에 나타내었다.

피부 병변지수 평가결과 발효귀리 및 일반귀리 처리군의 0주차 피부 병변이 대조구대비 심하였으나, 6주차 급이 후 발효귀리 처리군에서는 대조구 수준까지 개선되는 경향을 확인하여 상시, 장기 급여를 통해 피부질환에 대한 개선효과를 가질 수 있을 것으로 기대된다.

피부병변지수 (피부병변 총점)

처리구	0주차	4주차	6주차
일반귀리	32.8	29.8	30.0
발효귀리	31.7	22.0	24.0
대조구	22.7	23.0	23.0

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11600P

20141103

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11130P

20101110

Claims

삭제
삭제
Pediococcus pentosaceus 균주(KCCM11600P) 와 Saccharomyces cerevisiae 균주(KCCM11130P) 의 복합균주로 발효한 귀리를 포함하는 반려동물 사료.
제 3 항에 있어서, 원료배지인 귀리에 Pediococcus pentosaceus 균주(KCCM11600P) 와 Saccharomyces cerevisiae 균주(KCCM11130P) 를 접종하여 30-36 °C 에서 배양하여 고체발효하여 제조된 것을 특징으로 하는 반려동물 사료.