KR102312253B1 - 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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알렉시스 브멜망
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쏘흐본느 유니베흐시테
엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔 (인쎄름)
상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치
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Abstract

본 발명은 사람 감마-시누클레인 유전자의 조절 영역으로부터 기원하고 망막 신경절 세포내에서 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터, 및 또한 당해 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 눈 질환, 특히 망막 신경절 세포 또는 광수용기 세포 변성과 관련된 눈 질환의 치료에 있어 상기 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

프로모터 및 이의 용도
본 발명은 의약 분야, 특히 본 발명은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell) 또는 광수용기 세포(photoreceptor cell) 변성과 관련된 질환의 치료 및 예방에 관한 것이다.
망막은 2개의 부분 망막 색소 상피(RPE) 및 감각신경 망막으로 분리될 수 있다. RPE는 감각신경 망막 기능을 유지하는데 활발히 관여한다. 감각신경 망막은 광수용기 및 망막 신경절 세포(RGC)를 포함하는 신경 네트워크로서 조직화되어 있다. 광수용기는 전기 신호의 광 정보를 RGC로 전환하며, RGC는 시각 정보를 망막으로부터의 시각 피질로 전달하는데 관여한다. 이들 상이한 세포 유형 사이에, 본 발명자들은 또한 다양한 조건의 광 강도 및 대비 정보(contrast information)의 증가에 대한 망막 반응을 채택하도록 하는 네가티브 피드백(negative feedback)을 유도하는 수평 세포와 같은 조절 기능을 갖는 세포를 발견할 수 있다.
RGC는 주로 글루탐산성 신경세포(glutamatergic neuron)이며, 이는 망막의 내부 표면(신경절 세포 층)에 위치한다. 이들의 엑손(axon)은 시신경을 형성한다. 약 15 내지 20개 수개 유형의 RGC가 존재한다. RGC는 시각 과정에 있어서 중요한 역활을 하며 RGC 기능장애 및 변성은 실명을 초래할 수 있다.
시신경병증으로 불리는 광범위한 병리학은 RGC의 1차적인 결손에 의해 유발된다. 이들 중 일부는 미토콘드리아 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 레베르 시신경 병증(Leber hereditary optic neuropathy: LHON)이다. 그러나, 개발도상국에서 가장 중요한 실명의 원인이며, 전세계 7천만명의 사람들에게 영향을 미치는 녹내장과 같은, 후천성 시신경병증이 훨씬 더 우세하다.
이들 질환에 관여하는 유전자, 또는 신경보호 인자를 암호화하는 유전자의 건강한 버젼의 신경절 세포에서 표적화된 발현은 이들 시신경병증을 치료할 수 있다. 따라서, 이들 세포에서 강력하고 특이적인 유전자 발현을 수득할 수 있도록 함으로써 유전자-치료요법을 제공하는 것이 필수적이다.
더욱이, RGC는 변성 과정에 직접 연루되지 않고 치료 표적을 구성할 수 있다. 예를 들면, RGC는 광수용기가 유전성(즉, 색소성 망막염) 또는 후천성 질환으로 인하여 손실된 질환에서 광수용기 변성 후 연장된 기간 동안 지속됨으로써 광유전학 도구를 사용하여 망막을 되살리는 치료를 위한 표적을 구성한다. 이와 관련하여, RGC는 변성 세포와는 독립적인 세포 표적이며, 여기서 광감성 단백질의 강력하고 제한된 방식의 발현은 시각 회복의 성공에 필수적이다.
각각의 유형의 RGC의 크기, 형태 및 투사(projection)로서 RGC 기능을 연구하는데 있어 큰 관심이 또한 있어 왔으며, 이들은 시각 기능에 매우 상이하고 가능하게는 독립적인 역활을 담당하는 것으로 고려되고 있지만 현재 이러한 문제에 대해 비교적 거의 알려져 있지 않다. 이들 세포에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열은 RGC를 확인하거나, 추적(tracking)하여, 유전적으로 암호화된 전압 또는 칼슘 민감성 단백질(calcium sensitive protein)(즉, GCaMP)의 발현을 통해 이들의 활성을 모니터링하도록 할 것이다.
앞서의 최신 기술에서, RGC에 있어서 유전자 발현은 편재된 프로모터 또는 조직(들)에 대해 특이적인 프로모터의 사용을 통해 수득되어 왔다. 편재된 프로모터는 조직에서 강력하지만 제한되지 않은 유전자 발현 양식을 제공한다. 편재된 진핵세포 프로모터는 닭 베타 액틴(CBA) 유전자 또는 포스포글리세레이트화된 키나제(PGK) 또는 연장 인자 1 알파(elongation factor 1 alpha: EF1alpha)의 프로모터로부터 기원한다. 바이러스 기원의 다른 편재된 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 CAG와 같은 합성 프로모터 서열로부터 기원한 것들을 포함한다. 그러나, CMV 프로모터의 조절은 이식유전자의 발현을 변경시킬 수 있는 많은 세포 시그날링 경로에 의존적이다. 더욱이, 이들 프로모터는 제공된 세포 유형을 제한하지 않으며 이들이 전달되는 모든 세포, 예를 들면, 망막 색소 내피(RPE), 망막의 뮬러 신경교 세포(Mueller glial cell) 및 모양체, 홍채, 각막 등과 같은 망막 외부의 다른 눈 조직에서의 발현을 이끈다.
망막 세포에 한정된 유전자 발현은 RPE 또는 광수용기에 있어서의 발현을 이끄는 조직-특이적인 프로모터를 사용하여 수득되어 왔다. RPE65, VMD2 및 OA1을 기준으로 하는 것들과 같은 프로모터는 RPE 세포에서 유전자 발현을 유발하지만 사람(RK) 또는 소(RHO) 로돕신 키나제의 프로모터 또는 마우스 옵신(mOP)의 프로모터는 광수용기에 한정된 발현을 이끈다. 이들 프로모터는 망막에 대해 제한적이지만 RGC에서는 효율적이지 않다.
수개의 단백질이 망막의 RGC에서 발현되는 것으로 기술되어 왔다. 이들 단백질들 중에서, Thy1-1(흉선세포 항원1-1) 또는 Brn3-a 단백질은 신경절 세포의 마커로서 통상적으로 사용된다. 그러나, Thy1-1 단백질은 대식세포 및 미세아교 세포에서 또한 발현되므로 RGC에 대해 특이적이지 않다. 더욱이, Thy-1 및 Brn3-a는 신경절 세포의 서브세트(subset) 내에서만 발현된다. 따라서, 이들 마커의 프로모터 영역은 전체 신경절 세포 집단에서 이식유전자의 특정 발현을 허용하지 않을 수 있다.
최근에, 망막으로 전달 후 망막 신경절 세포에서 제한된 발현을 이끄는 수개의 프로모터 서열이 기술되어 왔다. 사람 콘넥신36(connexin36: cx36)을 기준으로 하는 2.8 kB의 하나의 서열은 마우스에서 특이적인 서브-유형(sub-type)의 RGC 및 비-사람 영장류에서 소와세포 주변(peri-foveaolar) RGC내 발현을 유도한다(Yin et al., IOVS, 2011;52(5):2775-8; Dalkara et al., Sci Trans Med, 2013;5(189):189ra76). 심슨(Simpson) 및 공동연구자들은 RGC에서의 발현을 유도하는 3.3 kB 초과의 다른 프로모터 성분(Ple25, Ple53 및 Ple67)를 기술하였다(de Leeuw et al., Mol Ther Meth and Clin Dev, 2014;1:5).
감마-시누클레인 유전자(SNCG)는 또한 망막내에서 발현되는 것으로 기술되어 왔으며, 보다 특히, 사람 및 설치류 RGC에서 감마-시뉴클레인과 Brn3-단백질의 공존(colocalization)이 기술되어 왔다(Surgucheva et al, Mol Vis, 2008, 14, 1540-8). 그러나, 상기 저자들은 또한 망막 그물모양 세포(plexiform cell) 및 저자들에 의해 확인되지 않고 Brn3-a 단백질을 발현하지 않는 세포내에서 감마-시뉴클레인에 대한 면역반응성을 주목하였다. 더욱이, 저자들은 비-RGC 세포주에서, 감마-시누클레인 프로모터 활성이 출발 ATG 코돈의 상부의 비암호화 5' 플랭킹 영역의 1,260 bp를 포함하는 γ-시누클레인 유전자의 2,195-bp 단편, 및 다시 연구된 비-RGC 세포주에서 SNCG 유전자의 발현을 조절하는데 있어서 필수적인 역활을 갖는 것으로 기술된 엑손 1 및 인트론 1에 의해 지지됨을 밝혔다(Surgucheva et al., J Mol Neurosci, 2008, 35: 267-71).
많은 재조합 바이러스 벡터가 유전자 치료요법 적용을 위해 생체내에서 효율적인 유전자 전달을 허용하는 것으로 기술되었다. 이들 중에서, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 이의 비-병원성, 비-삽입성 및 저-면역원성 특징으로 인하여 주요 전달 메카니즘인 것으로 여겨진다. 또한, AAV는 설치류 RGC에서 매우 효율적인 형질도입을 허용하는 것으로 기술되어 왔다. 실제로, 상이한 연구 팀에 의해 마우스에서, AAV 혈청형 2(AAV2) 또는 이의 타이로신 돌연변이된 형태의 유리체내 주사는 RGC에서 리포터 유전자의 매우 효율적인 발현을 이끄는 것으로 밝혀졌다(Petrs-Silva et al., Mol Ther. 2009 Mar;17(3):463-71; Petrs-Silva et al., Mol Ther. 2011 Feb;19(2):293-301). 그러나, 이의 작은 크기로 인하여, AAV의 DNA 페이로드(payload)는 심각하게 제한되며 선행 기술에 기술된 RGC 특이적인 프로모터와 같은 거대 프로모터의 사용과 양립되지 않는다.
그 결과로서, RGC에서 전이유전자의 강력하고, 안정하며 특이적인 발현을 허용하면서 AAV 벡터를 사용한 유전자 전달에 특히 적합한 콤팩트 프로모터(compact 프로모터)를 개발하는 것이 강력하게 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 본 발명에서 짧은 길이를 가짐으로써 AAV 벡터와 함께 사용하기에 적합하여 망막 신경절 세포(RGC) 내에서 고 수준의 유전자 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 새로운 전사 프로모터를 제공한다.
따라서, 제1 국면에서, 본 발명은 망막 신경절 세포내에서 프로모터 활성을 갖는 분리된 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 길이가 1.5 kb 미만이고
- 서열 번호: 1의 서열,
- 서열 번호: 1과 적어도 80% 동질성을 갖는 서열,
- 서열 번호: 1의 적어도 500개의 연속적인(consecutive) 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 및
- 서열 번호: 1의 핵산 서열과 중간의 엄격한 조건(medium stringency condition) 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열 또는 이의 상보성 쇄(strand)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.
바람직하게는, 분리된 핵산은 망막 신경절 세포의 특이적인 프로모터 활성을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 길이가 1.5 kb 미만이고 서열 번호: 1의 서열, 및 서열 번호:1에 대해 적어도 80% 동질성을 갖는 이의 기능적 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 특히, 본 발명의 핵산은 서열 번호: 1과 적어도 80% 또는 90% 동질성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 서열 번호: 1의 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 길이가 1.2kb 미만, 보다 바람직하게는 1kb 미만이다.
제2 국면에서, 본 발명은 목적한 폴리펩타이드 또는 핵산, 바람직하게는 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
특히, 목적한 폴리펩타이드는 치료학적 단백질(therapeutic protein), 광유전학적 작동인자(optogenetic actuator) 또는 리포터 단백질(reporter protein)이다. 바람직하게는, 목적한 폴리펩타이드는 치료학적 단백질 또는 광유전학적 작동인자이다.
특히, 상기 치료학적 단백질은 MT-ND4, MT-ND1, MT-ND6, MT-CYB, MT-CO3, MT-ND5, MT-ND2, MT-COI, MT-ATP6, MT-ND4L, OPA1, OPA3, OPA7 및 ACO2로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있거나, 바람직하게는 GDNF, VEGF, CNTF, FGF2, BDNF 및 EPO로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경영양 인자, 바람직하게는 BCL2 및 BCL2L1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-세포자멸사 단백질(anti-apoptotic protein), 바람직하게는 엔도스타틴, 안지오스타틴 및 sFlt로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-혈관형성 인자, 바람직하게는 IL10, IL1R1, TGFBI 및 IL4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소염 인자, 또는 막대세포-기원한 원뿔세포 생존능 인자(rod-derived cone viability factor: RdCVF)일 수 있다.
광유전학적 작동인자는 바람직하게는 로돕신, 포톱신, 멜라놉신, 피놉신, 파라피놉신, VA 옵신, 페롭신, 뉴롭신, 엔세팔롭신, 레티노크롬, RGR 옵신, ReaChR, 크림손 또는 크림손R과 같은 적색-이동 스펙트럼 특성을 갖는 미생물 옵신, 단 파장의 척추동물 옵신 또는 장 파장의 척추동물 옵신과 같은 Gi/o 시그날링을 보충할 수 있는 척추동물 옵신, 채널로돕신-1 및 채널로돕신-2(클라마이도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)로부터)과 같은 클리마이도모나스(Chlamydomonas) 속의 미세조류로부터의 채널로돕신, 및 이의 변이체, 또는 광유전학적 억제제, 바람직하게는 할로로돕신(NpHR), 향상된 할로로돕신(eNpHR2.0 및 eNpHR3.0) 및 적색-이동된 할로로돕신 Halo57과 같은 할로로로돕신, 아르카에로돕신-3(AR-3), 아르카에로돕신(Arch), 향상된 박테리오로돕신(eBR)과 같은 박테리오로돕신, 프로테오로돕신, 크산토로돕신, 렙토스파에리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans) 진균 옵신(Mac), 크룩스할로로돕신 조스(cruxhalorhodopsin Jaws), 및 이의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 광유전학적 활성인자일 수 있다.
목적한 폴리펩타이드는 또한 바람직하게는 형광성 단백질, 칼슘 지표(calcium indicator), 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 및 이의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리포터 단백질일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 목적한 폴리펩타이드는 SNCG 단백질 및/또는 이의 루시퍼라제가 아니다.
대안적으로, 본 발명의 핵산은 바람직하게는 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 및 DNAzyme으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 목적한 핵산을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결될 수 있다.
제3 국면에서, 본 발명은 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터, 및 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터 또는 비-병원성 파르보바이러스일 수 있다. 벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated viral: AAV) 벡터일 수 있으며 목적한 폴리펩타이드 또는 핵산을 암호화하는 핵산을 플랭킹(flanking)하는 2개의 ITR을 포함할 수 있다.
다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 특히 상기 벡터 및 바람직하게는 AAV-2, AAV-5, AAV-7m8(AAV2-7m8), AAV-9 및 AAV-8 혈청형 캡시드, 보다 바람직하게는 AAV-2 또는 AAV2-7m8 캡시드와 같은 AAV-2 기원한 캡시드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV-기원한 캡시드를 포함하는 AAV 입자에 관한 것이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자로 형질전환된 세포, 바람직하게는 망막 신경절 세포에 관한 것이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 세포, 및 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 눈 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 또는 세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 눈 질환은 보다 바람직하게는 레베르 유전적 시신경 병증(Leber's hereditary optic neuropathy) 또는 지배적 시신경 위축과 같은 유전성 눈 신경병증, 및 노화-관련 황반 변성, 원뿔세포-막대세포 이상증(cone-rod dystrophy), 레베르 유전성 흑내장(Leber congenital amaurosis), 스타가르트 질환(Stargardt's disease), 당뇨병성 망막병증, 망막 박리, 베스트병(Stargardt's disease), 망막 색소변성증, 맥락막 결여 또는 벽판망막 변성과 같은 광수용기 세포 변성과 관련된 질환으로부터 선택된 망막 신경절 세포 변성과 관련된 질환으로부터 선택된다.
추가의 국면에서, 본 발명은 또한 망막 신경절 세포내에서 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 목적한 핵산의 발현, 바람직하게는 망막 신경절 세포내에서 특이적인 발현을 위한 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자를 망막 신경절 세포내에서 도입함을 포함하여, 망막 신경절 세포내에서 목적한 폴리펩타이드 또는 핵산을 발현시키는, 바람직하게는 망막 신경절 세포내에서 특이적으로 목적한 폴리펩타이드 또는 핵산을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
도 1. SNCG 유전자 및 프로모터 서열의 개략도. SNCG 유전자는 10번 염색체(10q23.3)에 위치한다. 이는 +1 전사 부위로부터 5번째 엑손(exon)의 말기까지 3.5kb에 걸쳐 연장되는 5개 엑손을 함유한다. 다량체성(multimerine) 2 유전자 (MMRN2)의 첫번째 엑손은 +1 SNCG 전사 부위의 863 bp 하부에 위치한다. SNCG 프로모터의 사람 서열을 추출하기 위하여, -785 내지 +163 영역(화살표로 나타냄)을 HEK 293T 세포로부터 증폭시켰다. 이후에, PCR 생성물을 pENTR-D/TOPO 내로 아클로닝(subcloning)하고 서열분석하였다. 서열은 GeneID6623을 사용한 진뱅크(Genebank) 서열과 동일하였다. 이후에, SNCG 프로모터 서열(서열 번호: 1)의 제어하에서 eGFP 수용체 유전자를 발현하는 AAV 벡터를 생산하였다.
도 2. 상부 패널: hSNCG 프로모터는 마우스 RGC에서의 고 발현을 야기한다. AAV2-y444f-hSNCG-GFP의 유리체내 주사 후 4주째에 마우스 망막의 안저 영상(A), 망막 플랫 마운트(retinal flat mount)(B) 및 저온유지장치(cryostat) 단면(C). 하부 패널: PGK 프로모터는 망막내 다수의 세포 유형에 걸쳐 높은 발현을 생성한다. AAV2-y444f-PGK-GFP의 유리체내 주사 후 4주째에 마우스 망막의 안저 영상(D), 망막 플랫 마운트(E) 및 저온유지장치 단면(F).
도 3. AAV2-CMV-GFP(상부) 및 AAV2-hSNCG-GFP(하부)의 유리체내 주사 후 마우스 망막의 망막 플랫 마운트(retinal flat mount)의 공촛점 현미경 영상(A) 및 AAV2-hSNCG-GFP의 유리체내 주사 후 마우스 망막의 단면(B).
도 4. 안저 형광성 영상에 의한 시노몰구스 마카퀴(cynomolgus macaque) 망막의 황반 영역내 GFP 발현의 평가. SNCG 프로모터(A), CMV 프로모터(B)를 함유하는 AAV-GFP 벡터를 유리체내 주사로 투여하였다. GFP 발현된 부위는 암색 배경에 백색으로 나타난다. 카메라는 노출 시간을 자동적으로 조절하며, GFP 발현의 최대 강도를 갖는 도 4a의 영상은 가장 어두운 배경 색이지만 도 4b의 영상의 경우에는 GFP 발현의 최저 강도였고 형질도입 부위(중심와 주변 환(peri-foveal ring)과 배경 사이에 차이가 거의 없다.
도 5. SNCG 프로모터는 마우스 RGC에서 CMV 프로모터보다 더 높은 수준의 hCatCh-GFP 발현을 유도한다. A) 5x109 vg의 AAV2-SNCG-hCatCh-GFP(우측) 또는 AAV2-CMV-hCatCh-GFP(좌측)을 주사한 대표적인 rd1 마우스 망막의 안저 영상. B) SNCGG 프로모터(우측) 및 CMV 프로모터(좌측) 하에서 수득한 CatCh-GFP 형광성을 나타내는 일련의 동일한 주사로부터 수득된 망막 플랫-마운트. C) AAV2-SNCG-hCatCh-GFP 또는 AAV2-CMV-hCatCh-GFP가 주사된 rd1 마우스 망막에서 Brn3a-양성, GFP-양성 및 이중 표지된 세포의 정량화. 망막의 중심 및 주변 영역에서 선택된 영역에 걸쳐 세포 수에 대한 신경절 세포 층을 따른 공촛점 스택 투사(Confocal stack projection). 영역을 각각 사분면에서 선택하고 세포 수를 평균내어 mm2당 Brn3a-양성, GFP-양성 및 동시-표지된 세포를 수득하였다. 오차 바아(error bar)는 SEM을 나타낸다. D) SNCG-CatCh-GFP로 형질유도되고, Brn3a(적색) 및 항-GFP(녹색) 항체로 동시 표지된 rd1 마우스 망막의 RGC 층을 가로지르는 대표적인 공촛점 스택 투사. E) Bnr3a(적색) 및 항-GFP(녹색)로 동시-표지된 SNCG-CatCh-GFP 주사된 망막 및 DAPI(청색)로 표지된 핵산에서 하나의 대표적인 망막 플랫-마운트(flat-mount)로부터 수득된 횡-단면.
도 6. rd1 마우스의 망막 및 피질내 기능적 CatCh 반응. 눈(n=4) 당 5x107, 5x108 및 5x109 vg에서 CMV(검정색) 또는 SNCG(회색)의 제어 하에 CatCh를 발현하는 망막내에서 A) 1014 개의 광자/cm2/s 또는 B) 1017 개의 광자/cm2/s 하에 480nm에서 광 반응을 나타내는 자발적 활성을 지닌 세포의 퍼센트. C) 5x109개의 바이러스 입자 용량(n=4, 155 세포)에서 CMV 프로모터의 제어 하에 CatCh를 발현하는 망막내 광 강도의 함수로서의 반응 진폭(최대 발광성에서 수득된 반응으로 표준화됨). D) 눈 당 5x107개의 바이러스 입자 용량(담회색, n=4 망막, 158개 세포), 5x108(암회색, n=4 망막s, 221개 세포) 및 5x109(흑색, n=4 망막, 261개 세포)개의 바이러스 입자(vg)에서 SNCG 프로모터의 제어 하에 CatCh를 발현하는 망막내 광 강도의 함수로서의 반응 진폭(최대 발광성에서 수득된 반응에 대해 표준화됨). E) SNCG 프로모터의 제어 하에 CatCh를 발현하는 망막내에서 480nm에서 완전한 장 플래쉬 동안 스파이크 주파수(spike frequency)에 있어서 증가 또는 광 반응을 나타내는 래스터 플롯(raster plot) 및 주위-자극 시간 히스토그램(PSTH). SNCG 프로모터를 사용하여 곡선이 최대 AAV 벡터 용량에서 안정기(plateau)에 도달함에 주목한다. (F, G, H) 3개의 증가하는 광 강도(1015, 1016 및 1017 개의 양성자/cm2/s)에서 475 nm의 완전 장 플래쉬에 대한 반응시 SNCG-CatCh를 발현하는 rdl 마우스의 시각 피질 신경세포의 PSTH(상부) 및 상응하는 래스터 플롯(하부). I) 5x109 vg 용량을 사용한 SNCG-CatCh 치료된 rdl 망막에서 기록된 가시적으로 유발된 전위(VEP)의 비교. J) 475 nm(n=3마리의 마우스)에서 광 강도의 함수로서 표중화된 피질 활성(스파이크 및 VEP). 오차 바아는 SEM을 나타낸다.
도 7. AAV-CatCh 주사된 NHP에서 생체내(in vivo) 안과 시험. A) 희미한 내지 강한 후측 수정체의 등급. B) 최소 내지 심각까지 유리체 혼탁(vitreal haze) 등급.
도 8. 3개월 주사 후에 AAV2-CatCh의 고-용량 주사를 사용한 NHP로부터 눈의 조직-병리학적 시험. A) 눈의 수직 경선을 가로지르는 망막 슬라이스를 40x 해상도에서 영상화하였다. (B-F) (A)로부터 확대된 부위에서 섬유주대(trabecular meshwork)(B), 모양체(C), 시신경(D), 홍채(E) 및 망막(F)에 있어서 검출가능한 림프구, 대식구 또는 눈 구조에 대한 손상의 부재.
도 9. A) 주사 3개월 후 소와세포 주변 환내 CatCh 발현을 나타내는 절개 전 NHP1의 황반 영역. B) MEA 기록 및 RGC 면역표지 후 동일한 중심와 영역의 1/2. 망막 플랫-마운트를 Brn3a(적색) 및 GFP 항체(녹색)로 염색하였다. C) 주사 후 3개월째에 동일한 용량에서 주사된 다른 마카크(macaque)로부터의 망막의 중심와 영역. 망막 플랫-마운트를 채널로돕신에 대한 항체로 염색하였다(녹색). 핵은 DAPI로 염색하였다. D) 10E12 vg/눈의 용량에서 AAV2-SNCG-CatCh(상부 패널) 또는 AAV2-CMV-CatCh (하부 패널)를 사용한 주사 후 6개월째 마카크 망막의 중심와에 걸친 대표적인 단면. 망막 플랫-마운트를 채널로돕신에 대한 항체로 염색하였다(녹색).
도 10. CatCh-매개된 단일 세포 광 반응의 특성. A) AAV2-hCatCh(GFP 태그 없음)를 주사한, NHP 2의 소와세포 주변 영역을 나타내는 망막 슬라이스, 여기서 광-반응성 신경절 세포가 패치(patch)되어 있다. B) 기록 위의 스파이크 주파수 곡선에서 알 수 있는 바와 같이 광 자극 동안 스파이크 및 주파수에 있어서의 이들의 증가를 나타내는 세포-부착된 방식에서의 RGC 기록. C) -60mV에서 패치-클램프된 세포의 광전류 반응. D) 대략 450nm에서 광전류 진폭 피크를 나타내는 패치된 RGC의 작용 스펙트럼. E) 2 내지 22Hz의 범위에서 증가하는 주파수에서 미광 자극(Flicker stimulation). (B-E)에서의 세포를 (A) 470nm에서 1.46 1016 개의 양성자/cm2/s의 광 강도를 사용하여 L-AP4 관류 하에 나타낸 영역으로부터 기록하였다. (F-G) 막 결합된 발현을 갖는 형질감염된 세포의 고 밀도를 나타내는, AAV2-hCatCh-GFP가 주사된, NHP1의 소와세포 주변 영역의 2-광양자 영상. H) -60mV에서 패치-클램프되고 광전류를 나타내거나(좌측) 광 자극 동안 세포-부착된 방식으로 기록되고 증가하는 주파수의 스파이크를 나타내는(우측) 2개의 대표적인 세포의 반응.
도 11. 주사 6개월 후 NHP 망막에서 CatCh를 발현하는 RGC로부터의 단일 세포 기록(세포-부착되고 패치-클램프됨). 부중심와(parafovea)의 총 수는 AAV2-CMV-hCatCh(좌측) 또는 AAV2-SNCG-hCatCh(우측)을 눈 당 5x1011 vg의 농도에서 주사한 영장류 망막내 광 반응을 나타내거나 나타내지 않는 세포를 기록하였다. B) A)와 동일하나 눈 당 1x1012 vg의 농도를 사용. C) 바이러스 용량(눈 당 5x1011 또는 1x1012 vg) 및 프로모터(CMV 또는 SNCG)의 함수로서 반응하는 세포의 퍼센트. D) 주사 6개월 후 증가하는 강도에서 광에 대한 RGC 반응의 최대 점화 주파수(firing frequency). 반응성 세포의 4개의 상이한 그룹을, 저 및 고 용량에서 시험한 2개의 프로모터를 나타내는, 도에 나타낸다. E) 주사 6개월 후 증가하는 강도에서 광에 대한 RGC 반응의 피크 광전류(-60mV에서 기록된 내부 전류). 2개의 곡선은 눈 당 1x1012 vg에서 시험한 2개의 프로모터를 나타낸다.
도 12. 주사 3개월 및 6개월 후 NHP 망막에서 CatCh를 발현하는 RGC로부터의 MEA 기록. A) AAV2-SNCG-hCatCh-GFP(상부) 및 AAV2-SNCG-hCatCh(하부)를 눈당 5x1011 vg에서 주사한 영장류 망막에서 증가하는 광 강도에서 반응하는 신경세포의 점화 속도를 기준으로 한 그레이 스케일 맵(Gray scale map)(이들의 자발적 활성의 퍼센트로서 나타냄). 황반 부위는 사진에서 사선이 있는 타원으로 나타낸다. B) AAV2-SNCG-hCatCh-GFP를 주사한 영장류 망막에서 L-AP4의 적용 후, 480nm에서 완전한 장 플래쉬에 대한 신경절 세포 반응의 래스터 플롯(raster plot) 및 자극에 대한 시간 히스토그램(peri-stimulus time histogram). C) hCatCh를 발현하는 영장류 망막에서 L-AP4의 적용 후 1017 개의 광양자/cm2/s에서 평균 스펙트럼 조율. D) 상이한 자극 강도에 대한 평균 표준화된 반응. E) 주사 후 6개월 째에 증가하는 강도에서 광에 대해 반응하는 RGC의 방전 주파수. 각각의 라인은 고 용량 그룹에 대한 n=2 망막 및 저 용량 그룹에 대한 n=3 망막에 걸쳐 표준화된 방전 주파수를 나타낸다.
도 13: AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomato를 양방향에서 주사한 2 마리의 마카크의 형광성 눈-안저 영상. 영상은 주사 당일, 주사 후 1개월 및 2개월째에 획득하였으며 이들 시점에서 어떠한 검출가능한 형광성도 나타내지 않는다. LE: 좌측 눈, RE: 우측 눈.
도 14: AAV2-7m8-SNCG-ChrimsonR-tdTomato를 양방향에서 주사한 2마리의 마카크에서 형광성 눈-안저 영상. 주사 당일, 주사 후 1개월 및 2개월째에 획득한 영상은 주사후 1개월 째에 시작하는 Chrimson-tdTomato와 관련된 강력한 형광성(백색)을 나타낸다.
도 15. A-C-E-G CAG 프로모터(A & C) 및 SNCG 프로모터(E & G)에 대한 다중전극 배열에 있어서 영장류 반-중심와(semi-fovea)의 영상, 검은 점은 전극 배열(100μm 떨어짐)에 기인한다. B-D-F-H 프로모터 및 SNCG(F & H) 프로모터에 대한 모든 기록된 부위 CAG(B & D)에 대한, 10 msec 완전한 장 자극(강도: x 1017 개의 광양자.cm².sec-1)에 대한 색상 코드화된 반응. 동일한 색상 스케일을 모든 대표물에 대해 사용하였다.
도 16. 에피형광성(epifluorescence)(A-B-C) 및 2-양자 현미경(D)을 사용하여 관찰된 영장류 반-중심와의 천연 형광성 영상.　A) CAG 프로모터: 상이한 배율에서 2마리의 영장류 좌측 및 우측 반-중심와로부터의 영상(상부, NHP4 영장류; 하부, NHP3 영장류). B) SNCG 프로모터: ChrimsonR-tdTomato 발현의 형광성 스폿을 나타내는 중심와 주변의 영역 및 상이한 배율에서 NHP1 영장류 좌측 반-중심와로부터의 영상. C) B)와 동일하지만 NHP1 영장류 우측 반-중심와를 지님(화살표로 나타냄). D) 2개의 상이한 프로모터(좌측, CAG; 우측, SNCG)를 사용하여 2마리의 원숭이 부중심와로부터의 대표적인 살아있는 2개의 광양자-영상.
발명의 상세한 설명
본 발명은 사람 감마-시뉴클레인 유전자의 조절 영역으로부터 기원한 프로모터 서열을 확인하였다. 당해 프로모터는 길이가 1 kb 미만이고 망막 신경절 세포 (RGC)내에서 고 수준의 유전자 발현을 특이적으로 유도할 수 있다. 이의 짧은 길이로 인하여, 당해 프로모터는 AAV-매개된 유전자 전달에 용이하게 사용될 수 있으며 긴 유전자를 전달하는데 특히 적합하다. 본 발명자들은 당해 프로모터가 AAV 캡시드(capsid)와 함께, 마우스 및 비-사람 영장류 둘 다에서 RGC에 있어서의 강력하고 특이적인 전이유전자 발현을 이끈다는 것을 입증하였다. 실제로, 동일한 AAV 용량에서, 당해 프로모터는 편재하는 CMV 프로모터보다 RGC에서 보다 강력한 전이유전자 발현을 제공하였다. 더욱이, 본 발명자들은, 영장류에서, 당해 프로모터가 또한 CMV 프로모터보다 더 강력할 수 있었음을 나타내었다.
정의
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 어떠한 길이의 리보뉴클레오타이드의 중합체 형태, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 말한다. 따라서, 당해 용어는 일본쇄, 이본쇄, 또는 다중쇄 DNA 또는 RNA, 게놈성 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 푸린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연적인, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 골격은 당 및 포스페이트 그룹(전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있는 것으로서), 또는 개질되거나 치환된 당 또는 포스페이트 그룹을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드의 골격은 포스포르아미데이트와 같은 합성 소단위의 중합체를 포함할 수 있으므로 올리고데옥시뉴클레오사이드 포스포르아미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머와 같은 합성 소단위의 중합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 화학 합성, 재조합, 및 돌연변이유발을 포함하는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 DNA 분자이거나, 바람직하게는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 재조합 방법으로 합성된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "분리된 핵산"은 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 핵산 분자를 말한다. 특히, 당해 용어는 핵산의 천연 공급원 속에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 예를 들면, 게놈성 DNA와 관련하여, 용어 "분리된"은 이와 게놈성 DNA가 천연적으로 결합된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "분리된" 핵산 분자는 이로부터 핵산 분자가 기원하는 유기체의 게놈성 DNA내 핵산 분자를 천연적으로 플랭킹하는 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "프로모터"는 이것이 작동적으로 연결된 핵산의 전사를 지시하는 조절 성분을 말한다. 프로모터는 작동적으로 연결된 핵산의 전사 속도 및 효율 둘 다를 조절할 수 있다. 프로모터는 또한 핵산의 프로모터-의존성 전사를 향상("인핸서")시키거나 억제시키는("리프레서") 다른 조절 성분에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로모터 활성"은 작동적으로 연결된 핵산의 전사를 개시하는 프로모터의 능력을 말한다. 프로모터 활성은 당해 분야에 공지된 과정 또는 실시예에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다. 예를 들면, 프로모터 활성은 예를 들면, 노던 블롯팅(Northern blotting) 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용함으로써 전사된 mRNA의 양으로 측정될 수 있다. 또한, 프로모터 활성은 예를 들면, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), ELISA, 비색 분석법 및, 리포터 유전자 검정 및 당해 분야에 공지된 다른 과정 또는 실시예에 기술된 바와 같은 다른 과정을 포함하는 다양한 활성 검정에 의해, 해독된 단백질 생성물의 양으로서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된"은 단일 핵산 분자 상에서 핵산 서열이 연합되어 하나의 작용이 다른 것에 의해 영향받음을 말한다. 예를 들면, 프로모터는 이러한 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있는 경우 암호화 서열과 작동적으로 연결되어 있다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 말하며, 최소의 길이로 한정되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 펩타이드, 올리고펩타이드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 완전한 길이의 단백질 및 이의 단편은 상기 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩타이드"는 단백질이 바람직한 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대해 결실, 첨가, 및 치환(일반적으로 천연적으로 보존성인)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 말할 수 있다. 이들 변형은 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 고려될 수 있거나, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이, 우연히 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "망막 신경절 세포" 또는 "RGC"는 대체된 아마크린 세포를 배제한 망막의 최내부 층의 신경세포를 말한다. 이들은 광수용기로부터 망막의 이극성 세포를 통해 정보를 통합하여, 뇌로 투사하며, 여기서 이들은 시상, 시상하부 및 상부 둔덕에서 시냅스(synapse)된다. 신경세포 전사 인자 BRN3A(유전자 확인번호: 5457)는 RGC내에서 특이적으로 발견되는 것으로 밝혀졌으며 당해 단백질에 대한 항체는 RGC를 확인하고 정량화하기 위한 신뢰할만한 마커로 고려된다(Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604). 따라서, 특수한 구현예에서, 용어 "망막 신경절 세포" 또는 "RGC"는 BRN3A를 발현하는 망막의 최내부 층의 신경세포를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "서열 동질성" 또는 "동질성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열의 정렬로부터 위치에서의 일치(동질성을 갖는 핵산 잔기)의 수(%)를 말한다. 서열 동질성은 서열 갭을 최소화하면서 오버랩 및 동질성을 극대화하도록 정렬되는 경우 서열을 비교함으로써 측정된다. 특히, 서열 동질성은 2개의 서열의 길이에 의존하여, 다수의 수학적인 전체 또는 국소 정렬 알고리즘 중 어느 것도 사용하여 측정할 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는, 실질적으로 상이한 길이의 서열이 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예컨대, Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, 1981) 또는 알트슐 알고리즘(Altschul algorithm)(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 정렬되는 동안, 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전체적인 정렬 알고리즘(예컨대, 니들만 및 운슈 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm); Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬된다. 핵산 서열 동질성 퍼센트를 측정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들면, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)와 같은 인터넷 웹 사이트에서 이용가능한 공공으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 요구되는 어떠한 알고리즘도 포함하는, 정렬 측정을 위해 적절한 매개변수를 측정할 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 핵산 서열 동질성 퍼센트 값은 니들만-운슈 알고리즘을 사용하여 2개 서열의 최적의 전반적인 정렬을 생성하는 쌍식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle을 사용하여 생성한 값을 말하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 값(default value), 즉, 점수매김 매트릭스(Scoring matrix) = BLOSUM62, 갭 오픈(Gap open) = 10, 갭 연장(Gap extend) = 0.5, 말단 갭 패널티(End gap penalty) = 거짓, 말단 갭 오픈(End gap open) = 10 및 말단 갭 연장(and End gap extend) = 0.5를 위해 설정된다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 망막을 가진 동물, 바람직하게는 포유동물, 심지어 보다 바람직하게는 성인, 어린이 및 태아 단계의 사람을 포함하는 사람을 말한다.
제1 국면에서, 본 발명은 핵산, 바람직하게는 길이가 2 kb 미만이고, 서열 번호: 1의 서열 및 이의 기능적 변이체로 이루어진 그룹을 포함하거나, 이로 이루어진 망막 신경절 세포내에서 프로모터 활성을 갖는 분리된 핵산을 말한다.
서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열은 사람 감마-시뉴클레인 유전자(Symbol: SNCG; 유전자 확인번호: 6623)의 조절 영역으로부터 기원하였다. 당해 유전자는 신경변성 질환의 발병에 관여하는 것으로 여겨지는 단백질의 시뉴클레인 계열의 구성원을 암호화한다. 상기 유전자내 돌연변이는 유방 종양 발달과 관련된 것으로 추가로 밝혀졌다. 상기 유전자는 10번 염색체(10q23.2-q23.3)(86958531번 위치로부터 86963260번 위치까지 진뱅크 수탁 번호 NC_000010.11) 상에 위치한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 서열 번호: 1의 프로모터는 SNCG 유전자의 5' 조절 영역의 953개 뉴클레오타이드(-789번 위치로부터 +164번 위치, 단백질의 출발 코돈은 +168번 위치에 있다)를 포함한다.
본 발명의 핵산은 RGC에서 프로모터 활성을 나타내는데, 즉, RGC 내에 도입되는 경우, 이는 이것이 작동적으로 연결되는 핵산의 전사를 개시할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터 활성은 RGC에 특이적이다. 용어 "RGC에 특이적인"은 망막 신경절 세포내에서 주로 활성인 프로모터를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 다른 조직 또는 세포내에서 일반적으로 더 낮은 잔기 발현은 전적으로 배제될 수 없음이 이해되어야 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 이극성, 아마크린, 수평, 뮬러 또는 세포내에서 또는 광수용기내에서 활성이 아니다.
일 구현에에서, 본 발명의 프로모터는 서열 번호: 1의 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 서열 번호: 1의 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 원래의 서열과는 상이하지만, 이의 필수 특성은 유지하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 일반적으로, 변이체는 전체적으로 매우 유사하며, 많은 영역에서 원래의 폴리뉴클레오타이드와 동일하다. 변이체의 서열은 서열내 하나 이상의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 상이할 수 있으며, 이는 프로모터 활성을 손상시키지 않는다. 변이체는 원래의 서열과 동일한 길이를 가질 수 있거나, 보다 짧거나 길 수 있다.
용어 "기능적 변이체"는 서열 번호: 1의 프로모터 활성을 나타내는, 즉, RGC에서 프로모터 활성, 바람직하게는 RGC의 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 서열 번호: 1의 변이체를 말한다.
일 구현예에서, 본 발명의 프로모터는:
- 서열 번호: 1에 대해 적어도 80% 동질성을 갖는 서열,
- 서열 번호: 1의 적어도 100개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 및
- 서열 번호: 1의 핵산 서열 또는 이의 상보성 쇄와 낮은, 중간 또는 높은 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 번호: 1의 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 서열 번호: 1에 대해, 바람직하게는 서열 번호: 1의 전체 서열에 걸쳐 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동질성을 갖는 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 본 발명의 프로모터는 서열 번호; 1의 폴리뉴클레오타이드와는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 치환, 결실 및/또는 삽입으로 상이할 수 있다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 서열 번호: 1의 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 갖는 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 바람직하게는, 이는 서열 번호: 1의 적어도 500개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 갖는 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다.
추가의 특수한 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 서열 번호: 1의 핵산 서열 또는 이의 상보성 쇄와 낮은, 중간 또는 높은 엄격한 조건 하에서, 바람직하게는 중간의 엄격한 조건 하에서, 보다 바람직하게는 높은 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 서열을 갖는 기능적 변이체를 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "낮은 엄격한 조건"은 길이가 적어도 100개 뉴클레오타이드인 프로브에 대해 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/mL의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 25% 포름아미드 속에서 42℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화에 이은 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블롯 과정을 의미한다. 담체 물질은 50℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 3회 최종적으로 세척된다.
용어 "중간의 엄격한 조건"은 길이가 적어도 100개 뉴클레오타이드인 프로브에 대해 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/mL의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 35% 포름아미드 속에서 42℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화에 이은 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블롯 과정을 의미한다. 담체 물질은 55℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 3회 최종적으로 세척된다.
용어 "높은 엄격한 조건"은 길이가 적어도 100개 뉴클레오타이드인 프로브에 대해 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/mL의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 50% 포름아미드 속에서 42℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화에 이은 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블롯 과정을 의미한다. 담체 물질은 65℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 3회 최종적으로 세척된다.
본 발명의 프로모터 서열의 주요 장점 중 하나는 이의 작은 크기이다. 실제로, 본 발명의 프로모터는 길이가 2 kb 미만이므로 DNA 페이로드(payload)가 심각하게 제한되는 AAV 벡터에서 사용하기에 특히 적합하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 프로모터의 길이는 1.5 kb 미만, 바람직하게는 1.4, 1.3, 1.2, 1.1 또는 1 kb 미만, 보다 바람직하게는 990, 980, 970 또는 960개 염기 미만이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 SNCG 유전자, 및 특히 사람 SNCG 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 수용체 단백질을 암호화하는 유전자, 및 특히 루시퍼라제를 암호화하는 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 SNCG 유전자 또는 루시퍼라제를 암호화하는 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다.
제2 국면에서, 본 발명은 목적한 핵산에 작동적으로 연결된 본 발명의 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산은 목적한 폴리펩타이드 또는 목적한 핵산을 암호화할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 카세트"는 암호화 서열 및 상기 암호화 서열의 발현에 요구되는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 특히, 이들 조절 서열 중 하나는 본 발명의 프로모터이다. 일반적으로, 발현 카세트는 암호화 서열 및 선택된 유전자 생성물의 발현에 요구되는 암호화 서열 이전(5' 비-암호화 서열) 및 이후(3' 비-암호화 서열)의 조절 서열을 포함한다. 따라서, 발현 카세트는 전형적으로 프로모터 서열, 암호화 서열 및 일반적으로 폴리아데닐화 부위 및/또는 전사 터미네이터를 함유하는 3' 해독되지 않은 영역을 포함한다. 발현 카세트는 또한 예를 들면, 인핸서 서열, 벡터내에서 DNA 단편의 삽입을 촉진하고/하거나 시그날 서열을 스플라이싱(splicing)하는 폴리링커 서열과 같은 추가의 조절 성분을 함유할 수 있다. 발현 카세트는 일반적으로 벡터내에 포함되어 클로닝 및 형질전환을 촉진한다.
바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 이종 핵산에 작동적으로 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이종"은 천연적으로 발생하는 게놈 내에서 프로모터가 작동적으로 연결되는 핵산 이외의 핵산을 의미한다. 특히, 일부 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 SNCG 유전자, 및 특히 사람 SNCG 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 루시퍼라제를 암호화하는 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 SNCG 유전자 또는 루시퍼라제를 암호화하는 유전자에 작동적으로 연결되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산은 목적한 폴리펩타이드를 암호화한다.
목적한 폴리펩타이드는 RGC내 이의 발현이 요구되는 어떠한 폴리펩타이드일 수 있다. 특히, 목적한 폴리펩타이드는 치료학적 폴리펩타이드, 리포터 단백질 또는 광유전학적 작동인자일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산은 즉, 치료학적 폴리펩타이드를 암호화하는 치료학적 유전자이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료학적 유전자"는 병리학적 상태의 치료에 유용한 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다. 치료학적 유전자는, 발현되는 경우, 이것이 존재하는 세포 또는 조직에서, 또는 유전자가 발현되는 환자에서 유리한 효과를 부여한다. 유리한 효과의 예는 상태 또는 질환의 신호 또는 증상의 완화, 상태 또는 질환의 예방 또는 억제, 또는 바람직한 특성의 수여를 포함한다. 치료학적 유전자는 환자에서 유전적 결함을 부분적으로 또는 전체적으로 교정하는 유전자를 포함한다. 특히, 치료학적 유전자는 대상체의 세포 또는 조직내에서 상기 단백질의 결실되는, 결함성 또는 아-최적 수준(sub-optimal level)에 의해 유발된 결함을 완화시키는 유전자 치료요법에서 유용한 단백질을 암호화하는 핵산 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 치료학적 폴리펩타이드는 예를 들면, RGC내에서 부재하거나, 결함성이거나 아-최적 수준으로 존재하는 폴리펩타이드 및/또는 효소 활성을 공급할 수 있다. 치료학적 폴리펩타이드는 또한 예컨대, 우성-음성 폴리펩타이드로서 작용함으로써 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료학적 폴리펩타이드는 RGC에서 부재하거나, 결함성이거나 아-최적 수준으로 존재하는 폴리펩타이드 및/또는 효소 활성, 보다 바람직하게는 RGC에서 부재하거나 결함성인 폴리펩타이드 및/또는 효소 활성을 공급한다.
치료학적 유전자의 예는 MT-ND4(유전자 확인번호: 4538), MT-ND1(유전자 확인번호: 4535), MT-ND6(유전자 확인번호: 4541), MT-CYB(유전자 확인번호: 4519), MT-CO3(유전자 확인번호: 4514), MT-ND5(유전자 확인번호: 4540), MT-ND2(유전자 확인번호: 4536), MT-COI(유전자 확인번호: 4512), MT-ATP6(유전자 확인번호: 4508), MT-ND4L(유전자 확인번호: 4539), OPA1(유전자 확인번호: 4976), OPA3(유전자 확인번호: 80207), OPA7(유전자 확인번호: 84233), ACO2 및 (유전자 확인번호: 50)와 같은 망막 질환을 유발하는 것으로 알려진 결실되거나 돌연변이된 유전자의 교체용 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
치료학적 유전자는 또한 GDNF(유전자 확인번호: 2668), CNTF(유전자 확인번호: 1270), FGF2(유전자 확인번호: 2247), BDNF(유전자 확인번호: 627) 및 EPO(유전자 확인번호: 2056)와 같은 신경영양성 인자, BCL2(유전자 확인번호: 596) 및 BCL2L1(유전자 확인번호: 598)와 같은 항-혈관형성 인자, 엔도스타틴, 안지오스타틴 및 sFlt와 같은 항-혈관형성 인자, IL10(유전자 확인번호: 3586), IL1R1(유전자 확인번호: 3554), TGFBI(유전자 확인번호; 7045) 및 IL4(유전자 확인번호: 3565)와 같은 소염 인자, 또는 막대세포-기원한 원뿔세포 생존능 인자(RdCVF)(유전자 확인번호: 115861)를 암호화할 수 있다.
바람직하게는, 치료학적 유전자는 MT-ND4 (유전자 확인번호: 4538), MT-ND1 (유전자 확인번호: 4535), MT-ND6(유전자 확인번호: 4541), MT-CYB(유전자 확인번호: 4519), MT-CO3(유전자 확인번호: 4514), MT-ND5(유전자 확인번호: 4540), MT-ND2(유전자 확인번호: 4536), MT-COI(유전자 확인번호: 4512), MT-ATP6(유전자 확인번호: 4508) 및 MT-ND4L(유전자 확인번호: 4539)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 치료학적 유전자는 MT-ND4(유전자 확인번호: 4538), MT-ND1(유전자 확인번호: 4535) 및 MT-ND6(유전자 확인번호: 4541)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 시그날 펩타이드는 특히 이들을 특정 세포기관(예를 들면, 미토콘드리아) 내부로 도입하거나, 이들을 세포로부터 분비하거나, 이들을 세포막내로 삽입시키기 위해서, 치료학적 단백질에 가할 수 있다.
다른 구현에에서, 목적한 폴리펩타이드는 광유전학적 작동인자이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "광유전학적 작동인자"는 이의 발색단으로서 비타민 A 또는 이의 동형을 사용하는 광화학적으로 반응성인 폴리펩타이드를 말한다. 광유전학적 작동인자는 광을 흡수하고 광에 의해 활성화되는 광-작동된 이온 펌프(light-gated ion pump) 또는 채널이다. 광유전학적 작동인자는 원핵세포 유기체 또는 진핵세포 유기체로부터 기원할 수 있다. 특히, 이는 미생물 옵신 또는 척추동물 옵신일 수 있다. 광유전학적 작동인자는 광유전학적 활성인자 또는 광유전학적 억제제일 수 있다.
광유전학적 활성인자는 세포가 광에 대한 노출시 탈분극(depolarizing)하도록 한다. 세포가 탈분극하면, 세포의 내부 음 전하는 잠깐 동안 양성으로 된다. 세포 환경내에서 음성으로부터 양성으로의 이동은 세포내 및, 임의로 세포 사이 둘 다에서 전기 임펄스가 전파되도록 한다. 광유전학적 활성화제의 예는 로돕신, 포톱신, 멜라놉신, 피놉신, 파라피놉신, VA 옵신, 페롭신, 뉴롭신, 엔세팔롭신, 레티노크롬, RGR 옵신, ReaChR, Chrimson 또는 ChrimsonR과 같은 적색 이동된 스펙트럼 특성을 지닌 미생물 옵신, 단파장 척추동물 옵신 또는 장 파장 척추동물 옵신과 같은 Gi/o 시그날링을 보충할 수 있는 척추동물 옵신, 채널로돕신-1, 채널로돕신-2(클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)로부터)와 같은 클라미도모나스 속의 미세조류로부터의 채널로돕신 및 이의 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 채널로돕신의 다수의 변이체(예컨대, 코돈 최적화된 변이체, 돌연변이체, 키메라)가 이들 단백질의 특정 특징을 증진시키기 위애 생성된다. 이들 변이체의 예는 hChR2(L132C), ChR2(H134R), ChETA(E123T), C1V1(E122T), C1V1(E162T), C1V1(E122/162T), hChR2(C128A), hChR2(C128S), hChR2(C128T), hChR2(C128A/H134R), hCatch(T159S), hChief, hChR2(C128S/D156A), hChR2(T159C), hChR2(E123T/T159C), hChR2c(C128T), ChR2c(C128T), ChR2e(Q117C) 및 SwitChR(고찰을 위한 참고: Prakash et al. Nat Methods. 2012 Dec;9(12):1171-9)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
광유전학적 억제제는 광에 대한 노출시 세포가 과분극화하도록 한다. 세포가 과분극화하면, 세포의 내부 음성 전하는 짧은 기간 동안 더 음성으로 된다. 보다 음성으로의 이동은 막 전위를 작용 전위 역치(threshold)로 이동하는데 요구되는 자극을 증가시킴으로써 작용 전위를 억제한다. 구체적인 구현예에서, 광유전학적 억제제는 광자의 흡수시 수송 클로라이드 이온을 안으로 흡수하고/하거나 양이온을 밖으로의 수송하는 광-작동된 이온 펌프이다. 광자의 흡수시 클로라이드 이온을 안으로 또는 양이온을 밖으로 수송하는 어떠한 적합한 광-작동된 망막-의존성, 이온 펌프도 광유전학적 억제제로서 사용할 수 있다. 광유전학적 억제제의 예는 할로로돕신(NpHR), 향상된 할로로돕신(eNpHR2.0 및 eNpHR3.0) 및 적색-이동된 할로로돕신 Halo57과 같은 할로로돕신, 아카에로돕신-3(AR-3), 아카에로돕신(Arch), 향상된 박테리오로돕신(eBR)과 같은 박테리오로돕신, 프로테오로돕신, 크산토로돕신, 렙토스파에리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans) 진균 옵신(Mac), 크룩스할로로돕신 저우, 및 이의 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 특히 바람직한 구현예에서, 광유전학적 작동인자는 바람직하게는 채널로돕신 ChrimsonR 및 이의 변이체로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 hChR2 (L132C)-hCatCh 및 ChrimsonR-tdTomato로부터 선택된 광유전학적 작동인자이다.
보다 특히 바람직한 구현예에서, 광유전학적 작동인자는 바람직하게는 채널로돕신 및 이의 변이체로부터 선택된 광유전학적 활성인자이고, 보다 바람직하게는 hChR2(L132C)-hCatCh이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산은 리포터 단백질을 암호화한다. 바람직하게는, 리포터 단백질은 살아있는 RGC에서 검출가능하다. 본 발명의 프로모터의 조절 하에서 리포터 단백질의 발현은 RGC를 구체적으로 검출하거나 확인하도록 한다. 리포터 단백질은, 예를 들면, 형광성 단백질(예컨대, GFP), 칼슘 지시인자(예컨대, GCamP), 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 및 이의 변이체일 수 있다. 특수한 구현예에서, 리포터 단백질은 형광성 단백질, 칼슘 지시인자, 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 및 이의 변이체로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산은 목적한 핵산을 암호화한다.
목적한 핵산은 RGC내에서의 이의 발현이 바람직한 어떠한 핵산일 수 있다. 특히, 목적한 핵산은 치료학적 핵산일 수 있다.
핵산은, 예를 들면, siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNAzyme일 수 있다.
특수한 구현예에서, 핵산은 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산으로부터 전사되는 경우 상기 질환과 관련된 비정상적인 또는 과도한 단백질의 해독 또는 전사를 방해함으로써 눈 질환을 치료하거나 예방할 수 있다. 예를 들면, 목적한 핵산은 RNA를 암호화할 수 있으며, 이는 비정상 및/또는 과도한 단백질을 암호화하는 mRNA의 고도로 특이적인 제거 또는 감소에 의해 질환을 치료한다.
본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 하나 이상의 치료학적 유전자 및, 리포터 단백질을 암호화하는 핵산에 또는 치료학적 유전자 및 광유전학적 작동인자에 작동적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 프로모터의 모든 구현예는 또한 당해 국면에서 고려된다.
제3 국면에서, 본 발명은 본 발명의 프로모터 또는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 유전 물질을 전달하기 위한, 및 특히 핵산을 숙주 세포내로 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 전달하기 위해 비히클로서 사용된 핵산 분자를 말한다. 벡터는 플라스미드, 파스미드(phasmid), 코스미드(cosmid), 수송가능한 요소, 바이러스, 및 인공 염색체(예컨대,, YAC)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터는 유전자 또는 세포 치료요법에서 사용하기에 적합한 벡터이며, 특히 RGC를 표적화하는데 적합하다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 예를 들면, 프로모터, 예컨대, 본 발명의 프로모터, ITR, 리보소옴 결합 요소, 인핸서, 선택 마커, 인트론, 폴리A 시그날 및/또는 복제 기원과 같이, 숙주 세포내에서 목적한 폴리펩타이드의 발현을 확립하는데 요구되는 어떠한 요소를 포함하는 바이러스 게놈 벡터이다.
일부 구현예에서, 벡터는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV 또는 SNV, 렌티바이러스 벡터(예컨대, 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍성 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍성 바이러스(FIV), 소 면역결핍성 바이러스(BIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 기원), 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 파필로마 바이러스 벡터, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 벡터, 박시니아 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus) 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스(murine mammary tumor virus) 벡터, 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 벡터로부터 기원한 벡터와 같은 바이러스 벡터이다.
특수한 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터 또는 비-병원성 파르보바이러스이다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 사용을 위해 고려된 특수한 바이러스 벡터에 따라서, 기능성 바이러스 벡터를 수득하기 위해, AAV 벡터용 AAV ITR, 또는 렌티바이러스 벡터용 LTR와 같이 적합한 서열을 본 발명의 벡터내로 도입할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
사람 파르보바이러스 아데노-관련 바이러스(AAV)는 감염된 세포의 게놈내로 통합하여 잠재적 감염을 확립할 수 있는 천연적으로 복제 결핍성인 데펜도바이러스(dependovirus)이다. 마지막 특성은 통합이 19번 염색체(19ql3.3-qter) 상에 위치하는 AAVS1으로 불리는, 사람 게놈내 특정 부위에서 발생하므로, 포유동물 바이러스 중에서 독특한 것으로 여겨진다. 따라서, AAV는 사람 유전자 치료요법용의 잠재적인 벡터로서 큰 관심을 불러일으켜 왔다. 바이러스의 양호한 특성 중에는 어떠한 사람 질환과 관련된 이의 결여, 분열하는 및 분열하지 않는 세포 둘 다를 감염시키는 이의 능력, 및 감염될 수 있는 상이한 조직으로부터 유도된 광범위한 세포주이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "AAV 벡터"는 적어도 하나의 AAV 역위된 말단 반복체 서열(ITR), 바람직하게는 2개의 ITR에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 말한다. 이러한 AAV 벡터는 숙주 세포내에 존재하는 경우 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하는) AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 감염성 바이러스 벡터 입자내로 복제되어 패키지(package)될 수 있다.
"역위된 말단 반복체(inverted terminal repeat)" 또는 "ITR" 서열은 당해 분야에서 잘 이해된 용어이며 대측 배향으로 존재하는 바이러스 게놈의 말단에서 발견된 비교적 짧은 서열을 말한다. "AAV 역위된 말단 반복체(ITR)" 서열은 천연의 일본쇄 AAV 게놈의 말단 양쪽에 존재하는 대략 145개-뉴클레오타이드 서열이다. ITR의 가장바깥쪽 125개 뉴클레오타이드는 2개의 교호하는 배향중 하나로 존재하여, 상이한 AAV 게놈 사이에 및 단일의 AAV 게놈의 2개의 말단 사이에 이종성을 생성한다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오타이드는 또한 자가-상보성(A, A', B, B', C, C 및 D 영역으로 지정됨)의 수개의 보다 짧은 영역을 함유하여, ITR의 당해 부위내에서 발생하는 쇄내 염기 쌍화를 허용한다. 본 발명의 벡터내에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. AAV 벡터의 역위된 말단 반복체(ITR)의 혈청형은 어떠한 공지된 사람 또는 비사람 AAV 혈청형으로부터도 선택될 수 있다.
AAV 벡터가 보다 큰 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 염색체내 또는 클로닝 또는 형질감염에 사용된 플라스미드와 같은 다른 벡터)내로 도입되면, AAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "구조(rescue)"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로서 언급될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 플라스미드, 지질과 복합체화되고, 리포좀내에 캡슐화되고, 바이러스 입자, 예컨대, AAV 입자내에서 캡시드화된 선형의 인공 염색체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 어느 것일 수 있다.
본 발명의 프로모터 또는 발현 카세트는 숙련가에에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 벡터내로 도입될 수 있다.
벡터는 영양요구성 마커(예컨대, LEU2, URA3, TRP1 또는 HIS3)와 같은 선택가능한 마커, 형광성 또는 발광성 단백질(예컨대, GFP, eGFP, DsRed, CFP)과 같은 검출가능한 표지, 또는 화학/독성 화합물에 대해 내성을 부여하는 단백질(예컨대, 테모졸로마이드에 내성을 부여하는 MGMT 유전자)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이들 마커는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하거나 검출하는데 사용될 수 있으며 숙주 세포에 따라 숙련가가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 프로모터 및 발현 카세트의 모든 구현예는 당해 국면에서 또한 고려된다.
본 발명의 벡터는 "바이러스 입자"를 생성하는 바이러스 캡시드내로 패키지될 수 있다. 따라서, 추가의 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이고 AAV-기원한 캡시드내로 패키지되어 "아데노-관련 바이러스 입자" 또는 "AAV 입자"를 생성한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "AAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 AAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 말한다.
캡시드 혈청형은 AAV 입자의 굴성 범위를 결정한다.
12개의 사람 혈청형 및 비사람 영장류로부터의 100개 이상의 혈청형을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)의 다수의 혈청형이 현재 확인되었다(Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10). 이들 혈청형 중에서, 사람 혈청형 2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 제1 AAV이었다. 다른 현재 사용된 AAV 혈청형은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74 및 AAVdj 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 비-천연 가공된 변이체 및 키메라 AAV가 또한 유용하다. 특히, 캡시드 단백질은 형질유도 효율을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체일 수 있다.
상이한 AAV 혈청형을 사용하여 특수한 표적 조직(예컨대, RGC)내 특수한 표적 세포 또는 표적 특이적인 세포형의 형질도입을 최적화한다. AAV 입자는 동일한 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산 또는 AAV의 어떠한 천연 또는 인공 서열 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, AAV 입자는 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 AAV2 ITR을 포함할 수 있다. AAV 입자의 생산을 위한 AAV 혈청형의 어떠한 조합도 각각의 조합이 본원에 표현하여 기술한 바와 같이 본원에 제공된다.
바람직한 구현예에서, AAV 입자는 AAV2, AAV-5, AAV-7m8(AAV2-7m8, Dalkara et al. Sci Transl Med (2013), 5, 189ra76), AAV9 또는 AAV8 캡시드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV-기원한 캡시드를 포함한다.
AAV 바이러스는 통상의 분자 생물학 기술을 사용하여 가공할 수 있으며, 이들 입자를 핵산 서열의 세포 특이적인 전달을 위해, 면역원성을 최소화시키기 위해, 안정성 및 입자 수명을 조율하기 위해, 효과적인 분해를 위해, 핵으로의 정밀한 전달을 위해 최적화시키는 것이 가능하도록 한다.
AAV 천연 혈청형을 사용하는 것의 대안으로, 비-천연적으로 존재하는 캡시드 단백질을 지닌 AAV를 포함하나, 이에 한정되지 않는 인공 AAV 혈청형을 본 발명의 맥락에서 사용할 수 있다. 이러한 인공 캡시드는 비-AAV 바이러스 공급원으로부터 또는 비-바이러스 공급원으로부터 동일한 AAV 혈청형의 비-연속된 부위인, 상이한 선택된 AAV 혈청형으로부터 수득될 수 있는 이종 서열과 조합된 선택된 AAV 서열(예컨대, VP1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하는 어떠한 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 키메라 AAV 캡시드 또는 돌연변이된 AAV 캡시드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
키메라 캡시드는 적어도 2개의 상이한 AAV 혈청형으로부터 기원한 VP 캡시드 단백질로부터 기원한 VP 캡시드를 포함하거나 적어도 2개의 AAV 혈청형으로부터 기원한 VP 단백질 영역 또는 도메인을 결합시키는 적어도 하나의 키메라 VP 단백질을 포함한다.
캡시드 단백질은 또한 돌연변이시켜 특히 형질유도 효능을 향상시킬 수 있다. 돌연변이된 AAV 캡시드는 실수 유발 PCR(error prone PCR) 및/또는 펩타이드 삽입에 의해 또는 하나 또는 수개의 아미노산 치환을 포함시킴에 의해 삽입된 캡시드 변형으로부터 수득될 수 있다. 특히, 돌연변이는 천연 또는 비-천연 캡시드 단백질(예컨대, VP1, VP2, 또는 VP3)의 타이로신 잔기들 중 어느 하나 이상에서 제조될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이된 잔기는 표면 노출된 타이로신 잔기이다. 예시적인 돌연변이는 Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F 및 Y720F와 같은 타이로신 대 페닐알라닌 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구현예에서, AAV 입자는 AAV2-기원한 캡시드를 포함한다. 당해 구현예에서, 캡시드는 하나 이상의 타이로신 대 페닐알라닌 치환을 포함할 수 있고, 바람직하게는 Y444F 치환을 포함할 수 있다.
또한, AAV 입자의 게놈 벡터(즉, 본 발명의 벡터)는 일본쇄이거나 자가-상보성 이본쇄 게놈일 수 있다. 자가-상보성 이본쇄 AAV 벡터는 AAV 말단 반복체 중 하나로부터 말단 용해 부위(trs)를 결실시킴으로써 생성된다. 이의 복제하는 게놈이 야생형 AAV 게놈의 길이의 1/2인 이들 개질된 벡터는 DNA 이량체를 패키지하는 경향성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 실시에서 실행된 AAV 입자는 일본쇄 게놈을 갖는다.
형질감염, 안정한 세포주 생산, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(Conway, JE et al., (1997) Virology 71(11):8780-8789) 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 포함하는 바이러스 입자, 및 특히 AAV 입자의 생산을 위한 다수의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
AAV 바이러스 입자의 생산을 위한 AAV 생산 배양물은 모두; 1) 바큘로바이러스 생산 시스템의 경우에, 예를 들면, HeLa, A549, 또는 293 세포와 같은 사람-기원한 세포주, 또는 SF-9와 같은 곤충-기원한 세포주; 2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예를 들면, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바쿨로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공된 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 생성물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열, 예컨대, 본 발명의 벡터에 의해 플랭킹된 목적한 핵산; 및 5) 당해 분야에 잘 공지된 AAV 생산을 뒷받침하는 적합한 배지 및 배지 성분을 필요로 한다.
본 발명을 실시하는데 있어서, AAV 입자를 생산하기 위한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한 AAV rep 및 cap 유전자가 AAV 게놈이 안정하게 유지되는 숙주 세포 또는 생산자 세포내에서 안정하게 유지되는 패키징 세포일 수 있다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 기원한다. 이후에, AAV 입자는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제되거나 제형화된다.
본 발명의 프로모터, 발현 카세트 및 벡터의 모든 구현예는 또한 본 국면에서 고려된다.
다른 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스입자로 형질전환되거나 형질감염된 분리된 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 어떠한 동물 세포, 식물 세포, 세균 세포 또는 효모일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 사람 세포이다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 망막 신경절 세포, 특히 사람 RGC이다.
본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 인산칼슘-DNA 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공(electroporation), 미세주사, 유전자충격(biolistic), 지질감염, 또는 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 숙주 세포내에서 이소성 형태(ectopic form)로 유지될 수 있거나 게놈내로 통합될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 바람직하게는 본 발명의 바이러스 입자를 사용하여, 보다 바람직하게는 본 발명의 AAV 입자를 사용하여 숙주 세포내로 형질감염된다.
본 발명의 프로모터, 발현 카세트, 벡터 및 바이러스 입자의 모든 구현예는 또한 본 국면에서 고려된다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이러한 조성물은 치료학적 유효량의 치료학적 제제(본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 세포), 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및/또는 사람에서 사용하기 위한, 유럽 약전과 같은 규제 기관 또는 인식된 약전에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "부형제"는 이와 함께 치료학적 제제가 투여되는 희석제, 보조제, 담체, 또는 비히클을 말한다.
당해 분야에 잘 공지된 바와 같은, 약제학적으로 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 촉진하고 액체 용액 또는 현탁액으로서, 유제로서, 또는 사용 직전에 액체 속에 용해 또는 현탁하기에 적합한 고체 형으로 공급될 수 있는 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들면, 부형제는 형태 또는 조도(consistency)를 제공할 수 있거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투압을 변화시키기 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성없이 투여될 수 있는 눈에 직접 전달하기에 적합한 어떠한 약제학적 제제도 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 다양한 트윈 화합물(tween compound) 중 어느 것, 및 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 여기에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 완전한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition에서 이용가능하다.
바람직하게는, 조성물은 특히 안내 주사, 예를 들면, 망막하 및/또는 유리체내 투여에 의해 투여되도록 제형화된다. 따라서, 조성물은 염수, 링거 균형된 염 용액(Ringer's balanced salt solution)(pH 7.4) 등과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량 또는 다중투여량 형태로 포장될 수 있다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 벡터 또는 바이러스 입자, 보다 바람직하게는 AAV 벡터 또는 입자를 포함한다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게는 즉, 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자, 바람직하게는 AAV 입자로 형질전환되거나 형질감염된 본 발명의 사람 숙주 세포를 포함한다. 임의로 숙주 세포를 포함하는 조성물은 세포의 저장에 적절한 어떠한 온도에서도 저장을 위해 동결될 수 있다. 예를 들면, 세포는 약 -20℃ 내지 -80℃ 또는 어떠한 다른 적절한 온도에서 동결될 수 있다. 극저온 동결된 세포는 적절한 용기 속에 저장되어 저장용으로 제조됨으로써 세포 손상 위험을 감소시키고 세포가 해동을 견딜 경향성을 최대화할 수 있다. 또한, 세포를 냉장의 실온, 예컨대, 약 4℃에서 유지할 수 있다.
투여될 약제학적 조성물의 양은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 표준 과정에 의해 측정될 수 있다. 환자의 생리학적 데이타(예컨대, 연령, 체격, 및 체중) 및 치료될 질환의 유형 및 중증도는 적절한 투여량을 결정하기 위해 고려되어야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
특수한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 바이러스 입자를 포함하며 각각의 단위 투여량은 108 내지 1013의 바이러스 입자, 바람직하게는 109 내지 1012의 입자를 포함한다.
약제학적 조성물은 코르티코스테로이드, 항생제, 진통제, 면역억제제, 영양요소(trophic factor), 또는 이의 어떠한 조합과 같은 하나 또는 수개의 추가의 활성 성분을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 및 숙주 세포의 모든 구현예는 본 국면에서 또한 고려된다.
추가의 국면에서, 본 발명은 또한
- 눈 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물,
- 눈 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주 세포,
- 눈 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주 세포의 용도, 및
- 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 눈 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 눈 질환은 망막 신경절 세포 변성과 관련된 질환이다.
망막 신경절 세포 변성과 관련된 질환의 예는 유전성 시각 신경병증(레베르 유전성 시각 신경병증), 압축성 시각 신경병증(안와 거짓종양, 결후 눈병(thyroid eye disease)), 자가면역 시각 신경병증(루푸스(Lupus)), 당뇨병성 망막병증, 녹내장을 포함하는 녹내장성 시각 신경 질환(GOND), 동맥 허혈성 시각 신경병증(거세포 동맥염), 비동맥성 허혈성 시각 신경병증, 침윤성 시각 신경병증(유육종증), 감염성 시각 신경병증(매독, 라임병, 톡소플라스마증, 대상 포진), 말이집탈락병, 방사선후 시각 신경병증(posradiation optic neuropathy) 및 장성 말단 피부염으로부터의 시신경염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특수한 구현예에서, 눈 질환은 바람직하게는 레베르 유전성 시각 신경병증(LHON; OMIM #535000), 시신경 위축 1(크저 형 시신경 위축(Kjer type optic atrophy); OMIM #165500), 시신경 위축 및 백내장(시신경 위축증 3; OMIM #165300), 및 청각 신경병증이 있거나 없는 시신경 위축 7(OMIM #612989)으로부터 선택된, 유전성 시각 신경병증이다.
바람직하게는, 눈 질환은 망막 신경절 세포 변성과 관련된 유전성 눈 질환, 예컨대, LHON 또는 지배적 시신경 위축이고, 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자로부터 발현된 목적한 폴리펩타이드는 치료학적 단백질, 특히 환자에서 유전 결핍증을 교정시키는 치료학적 단백질이다.
바람직한 구현예에서, 눈 질환은 바람직하게는 시신경 위축 1, 시신경 위축 및 백내장(시신경 위축 3) 및 청각 신경병증이 있거나 없는 시신경 위축 7으로부터 선택된 LHON 및 지배적 시신경 위축으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 목적한 폴리펩타이드는 MT-ND4, MT-ND1, MT-ND6, MT-CYB, MT-CO3, MT-ND5, MT-ND2, MT-COI, MT-ATP6, MT-ND4L, OPA1, OPA3, OPA7 및 ACO2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
RGC는 광수용기가 유전성 또는 후천성 질환으로 인하여 손실된 질환에서 광수용기 변성 후 연장된 기간 동안 지속된다. 따라서, RGC는 광유전학을 사용하여 망막을 되살리는 치료용 표적을 구성한다. 이러한 맥락에서, RGC는 변성 세포와는 독립된 세포 표적이며, 여기서 광감성 단백질, 즉, 광유전학적 작동인자의 강력하고 제한된 방식으로의 발현은 시각 회복의 성공에 필수적이다.
따라서, 다른 구현예에서, 눈 질환은 광수용기 세포 변성과 관련된 질환된 질환이다. 바람직하게는, 당해 구현예에서, 목적한 폴리펩타이드는 상술한 바와 같은 광유전학적 작동인자이고 치료는 광유전학적 치료이다.
광수용기 세포 변성과 관련된 질환의 예는 노화-관련 황반 변성, 레베르 유전성 시각 신경병증, 원뿔세포-막대세포 이상증, 레베르 유전성 흑내장, 스타가르트 질환, 당뇨병성 망막병증, 망막 박리, 베스트병, 망막 색소변성증, 맥락막 결여 및 벽판망막 변성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 눈 질환은 망막 신경절 세포 또는 광수용기 세포 변성과 필수적으로 또는 구체적으로 관련되지 않지만, 망막 신경절 세포(예컨대, 녹내장)에서 목적한 폴리펩타이드 또는 핵산을 암호화하는 핵산을 구체적으로 발현시킴으로서 치료되거나 예방될 수 있는 질환으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 질병의 치료요법, 방지, 예방 및 지연과 같은, 환자의 건강 상태를 완화시키기 위해 의도된 모든 행위를 말한다. 특정의 구현예에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 완화 또는 근절을 말한다. 다른 구현예에서, 당해 용어는 하나 이상의 치료제를 이러한 질환을 지닌 대상체에게 투여함으로써 생성되는 질환의 확산 또는 악화를 최소화시키는 것을 말한다.
특히, 용어 "눈 질환의 치료"는 향상된 시력을 제공하고, 전체적인 실명으로의 질환의 진행을 방지하거나, 손상을 입지않는 눈 세포로 손상의 확산을 방지하거나, 손상된 눈 세포에 있어서 손상을 개선시키거나, 망막 손상의 발생을 방지하거나 경증 또는 진전된 질환을 가진 눈을 구조하기 위한 치료를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 당해 용어는 환자의 유전적 결함을 교정시키는 치료학적 단백질을 제공함으로써 RGC 변성을 방지하거나, 감소시키거나 중지시킴을 나타낸다. 일부 다른 구현예에서, 당해 용어는 광유전학을 사용하여 망막을 되살리거나, 시각을 회복시키는 치료를 나타낸다.
"치료학적 유효량"은 눈 질환의 위에서 정의된 바와 같은 치료를 구성하기에 충분한 대상체에게 투여된 본 발명의 약제학적 조성물의 양을 의도한다.
약제학적 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
특수한 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 바이러스 입자를 포함하고 각각의 단위 용량은 108 내지 1013개의 바이러스 입자, 바람직하게는 109 내지 1012개의 입자를 포함한다.
본 발명의 눈 질환을 치료하는 방법에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 눈내로, 보다 바람직하게는 망막하 또는 유리체내 투여로 투여된다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 하나의 추가의 치료제를 대상체에게 투여함을 포함할 수 있다. 특히 상기 치료제는 코르티코스테로이드, 항생제, 진통제, 면역억제제, 또는 영양 요소, 또는 이의 어떠한 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 질환이 증상이 있기 전 또는 후, 예컨대, 부분적이거나 완전한 RGC 또는 광수용기 세포 변성 전 또는 후 및/또는 시력의 부분적이거나 완전한 손실 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 및 약제학적 조성물의 모든 구현예가 또한 본 국면에서 고려된다.
RGC는 잠재적인 작용 형태로 망막으로부터 영상-형성 및 비-영상 형성 시각 정보를 뇌로 총괄적으로 전송한다. 따라서, RGC의 각각의 유형의 형태, 크기 및 투사가 명백하므로 및 이들이 시각 기능에 있어서 매우 상이하고 가능하게는 독립적인 역활을 담당하는 것으로 고려되므로 RGC 기능을 연구하는데 크게 관심이 집중되고 있다.
따라서, 다른 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주 세포를 포함하는 비-사람 동물 모델에 관한 것이다.
이러한 동물 모델은 RGC 기능의 생체내 연구를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 프로모터, 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자를 사용하는 경우, RGC를 확인하거나 추적하거나, 예를 들면, 리포터 단백질 또는 전압 또는 칼슘 민감성 단백질의 발현을 통해 이들의 활성을 모니터링하는 것이 가능하다.
비-사람 동물 모델은 또한 RGC에서 작용하는 약제학적 제제를 확인하거나 선택하는 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 비-사람 동물 모델은 포유동물, 보다 바람직하게는 영장류, 설치류, 토끼 또는 미니-돼지이다.
프로모터, 발현 카세트 또는 벡터는 당해 모델의 세포내에 에피솜 형태(episomic form)로 유지될 수 있거나 이의 게놈내에 통합될 수 있다.
동물 세포를 형질감염시키거나 형질전환시키거나 선택된 프로모터, 즉, 본 발명의 프로모터의 조절 하에서 목적한 핵산 서열을 발현하는 형질도입 동물을 생산하는 방법은 숙련가에게 잘 알려져 있으며 세포 및 동물에 따라 용이하게 채택될 수 있다.
본 발명의 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포가 또한 본 국면에서 고려된다.
본원에 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허출원, 가출원, 및 공보는, 이들이 본 명세서의 명백한 교시와 불일치하지 않는 정도로, 모든 도면 및 표를 포함하는 이의 전문이 참고로 포함된다.
다음의 실시예는 설명의 목적으로 제공되며 이로써 제한하지 않는다.
실시예
물질 및 방법
동물
모든 실험은 실험실 동물의 보호 및 사용을 위한 건강 가이드의 국제 협약에 따라 수행하였다. 프로토콜은 지역 동물 윤리 위원회에서 승인하였으며 유럽 의회의 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었다. 당해 연구에 사용된 모든 마우스는 Janvier Laboratories(프랑스 르 게네스 쌩 이슬 소재)로부터의 C3H/HeN(rd1 마우스) 또는 C57Bl6J 마우스(야생형) 또는 외국 기원의 시노몰구스 마카퀴(마카카 파시쿨라리스(macaca fasicularis))이었다.
AAV 생산
재조합체 AAV를 플라스미드 동시-형질감염 방법(Choi et al. Curr. Protoc. Hum. Genet. 2007;Chapter 12:Unit 12.9)으로 생산하고, 수득되는 분해물을 앞서 기술한 바와 같이 요오딕산올 구배 한외원심분리를 통해 정제하였다. 요약하면, 40% 요오딕산올 분획을 원심분리하고 완충액을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 유닛(Centrifugal Filter Unit)을 사용하여 교환하였다. 이후에, 벡터 스톡을 DNase-내성 벡터 게놈에 대해 표준물에 대한 실시간 PCR(Aurnhammer C et al. Hum Gene Ther Methods. 2012 Feb;23(1):18-28)에 의해 적정하였다.
주사
마우스를 케타민(50 mg/kg) 크살라진(10 mg/kg Rompum)으로 마취하였다. 동공을 확장시키고 울트라핀 30-게이지 1회용 바늘을 적도에서 및 가장자리 다음에서, 유리체 공간내로 공막을 통과시켰다. 107 내지 1011개 입자의 AAV를 함유하는 1 μl 스톡을 유리체 공동(cavity)의 중심에서 바늘을 직접 관찰하며 주사하였다. 영장류를 10:1 mg/kg의 케타민:크살라진으로 마취시켰다. 동공을 확장시키고 1 x 1011 또는 5 x 1011개의 바이러스 입자를 함유하는 100 μL의 바이러스 벡터를 30-게이지 바늘을 사용하여 가장자리 뒤로 대략 4mm 공막을 통해 각각의 눈의 유리체내로 주사하였다. 안과용 스테로이드 및 항생제 연고를 주사 후 각막에 적용하였다.
면역조직화학
형질유도된 마우스 망막을 절개하여 4% 파라포름알데하이드 속에 30분 동안 실온에서 고정시키고 PBS로 세척하였다. 이후에, 망막을 PBS 속에서 1% 트리톤 X-100, 0.5% 트윈 20 및 5% 소 혈청 알부민 차단 완충액으로 1시간 동안 실온(RT)에서 처리하였다. 마우스 망막을 4℃에서 1/2 희석된 차단 완충액 중 GFP(Life Technologies; 1:2000) 및 모노클로날 항-Brn3a 항체(Millipore Chemicon; 1:100)에 대해 지시된 폴리클로날 항체와 함께 밤새 항온처리하였다. 이후에, 망막을 제2 항-토끼 IgG, Alexa TM594, Alexa TM488 및 Alexa TM647 각각(Molecular Probes; 1:500)과 결합된 항-마우스 IgG와 함께 1시간 동안 실온에서 1/2 희석된 차단 완충액 속에서 항온처리하였다. 영장류 망막을 유사한 조건에서 Brn3a, GFP 및 채널로돕신에 대해 지시된 항체로 표지하였다. 세포 핵은 표본을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(Sigma-Aldrich; 10 μg/mL)과 함께 항온처리함으로써 후속적으로 나타내었다. 망막을 세정하고 초기 공촛점 획득 전 2개의 커버슬립 사이에의 봉입제(mounting medium) 속에 평편하게 올려놓았다. 앞서 표지된 플랫 마운트의 조직 단면을 크리오섹션(cryosection)(15 μm)하기 전에 OCT 속에서 내려서, 동결보존하고 매립시킴으로써 수득하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
공초점 현미경
공초점 현미경은 Olympus FV1000 레이저-스캐닝 공초점 현미경에서 수행하였다. 여기(excitation) 및 방출 혼선을 감소시키기 위하여, 상을 라인별로 순차적으로 획득하고, 단계 크기는 나퀴스트-샨논 표본화 정리(Nyquist-Shannon sampling theorem)에 따라 정의하였다. 최종 영상에서 과포화된 픽셀(pixel)을 최소화시키는 노출 셋팅을 사용하였다. 이후에, 12개의 비트 영상을 FIJI로 가공하고, Z-단면을 Z-프로젝트 기능하에 최대 강도를 사용하여 단일 평면에서 투사하고 최종적으로 8-비트 RGB 색상 모드로 전환시켰다.
변환 효율은 마우스 및 영장류 망막내 중심와 부위에서 CatCh-GFP로 형질도입시킨 Brn3a(+) 세포를 계수함으로써 평가하였다. RGC 층을 통한 공초점 스택(stack)을 20x를 사용하여 획득하였다.
분리된 망막의 MEA 기록
마우스를 마취시키고 신속한 경부 탈구로 희생시키고, 영장류에 치사 투여량의 펜토바르비탈을 제공하였다. 안구를 제거하고 95% O2 및 5% CO2로 버블링된 아메스 매질(Ames medium)(Sigma Aldrich A1420) 속에 실온에서 두었다. 분리된 망막을 셀룰로즈 막 위에 두고, 전극에 접하는 RGC와 함께, MEA(MEA256 100/30 iR-ITO, Multichannel systems, 독일)에 대해 약하게 가압하였다. 망막을 34℃에서 1-2 ml/min의 속도로 실험 동안 버블링된 아메스 매질로 연속하여 관류하였다. 대사자극성 글루타메이트 수용체 효능제 L-(+)-2-아미노-4-포스포노부티르산(LAP-4, Tocris Bioscience, 제품 번호 0103) 및 글리신 수용체 길항제 스트리키닌 하이드로클로라이드(Sigma Aldrich S8753)를 각각 50 μM 및 10 μM의 농도로 새로이 희석시키고 판독 10분 전에 관류 시스템을 통해 욕(bath)-적용하였다. 전체-장 광 자극을 STG2008 자극 생성기(MCS)에 의해 유도된 폴리크롬 V 단색화 장치(Polychrome V monochromator)(Olympus)로 적용하였다. 광 출력 강도를 1.1014개의 광양자/cm2/s 내지 1.1017개의 광양자/cm2/s의 범위로 눈금을 매겼다. 자극을 10초 간격으로 2초 동안 제공하였다. 반응의 파장 민감성을 400 nm 내지 650 nm에서, 10 nm 단계로 10회 자극하여 측정하였다. 시험한 파장의 순서를 무작위처리하여 망막의 어떠한 적응도 방지하였다.
가공되지 않은 세포외 RGC 활성을 증폭시키고 20kHz에서 샘플링하였다. 수득되는 데이타를 저장하고 200 Hz 고속 통과 필터를 사용하여 후속적인 오프라인 분석을 Spike2 소프트웨어 v.7(CED Co, 영국)을 사용하여 여과하였다. 단일 단위 래스터 플롯(raster plot)을 파형의 주 성분 분석을 기준으로 한 주형 매칭(template matching) 및 무리 그룹화의 조합을 사용하여 수득하였다. 본 발명의 집단 분석에서, 유의적인 반응을 z-점수 분석을 기준으로 측정하였다. 본 발명자들은 자극 전 활성의 평균 및 표준 편차를 추정하였으며 활성이 자극(50 ms의 빈 크기(bin size))의 개시 또는 종결 후 2초내 표준 편차의 4배 이상으로 평균을 초과한 경우 반응을 검출한 것을 고려하였다. 오차 바아는 상이한 실험에 걸쳐 계산하였다. 상이한 파장에서 광에 대한 반응을 위해, 본 발명자들은 자극 후 1초 윈도우(window)내에서 각각의 플래쉬에 대한 반응을 측정하였다. 이후에, 본 발명자들은 이의 최대 점화속도 반응에 의한 각각의 세포의 반응을 표준화하였다. 상이한 강도에서 광에 대한 반응에 대해, 본 발명자들은 기록된 세포의 세트에 걸쳐 부트스트래핑(bootstrapping)함으로써 오차 바아를 추정하였다.
2-양성자 영상화 및 패치 클램프 기록
25x 물 침지 대물렌즈(XLPLN25xWMP/NA1.05, Olympus)와 펄스된 펨토-초 레이저(femto-second laser)(InSightTM DeepSeeTM - Newport Corporation)가 장착된 통상적으로 제조된 2개의 광양자 현미경을 CatCh-GFP-양성 망막 신경절 세포의 영상화에 사용하였다. rd1 마우스로부터의 AAV-처리된 망막을 산소화된(95% O2, 5% CO2) 아메스 매질(Sigma-Aldrich) 속에서 분리하였다. 살아있는 2개의 광양자 영상화의 경우, 망막 슬라이스(300 μm)를 레이저 블레이드 조직 절단기(razor blade tissue chopper)(Stoelting)로 절단하고, 현미경의 기록 체임버에 두고, z-스택을 930 nm의 파장에서의 여기 레이저를 사용하여 획득하였다. 영상들을 ImageJ를 사용하여 오프라인으로 가공하였다. 영상화 동안에, 망막에 산소화된 아메스 매질을 따랐다.
본 발명자들은 전체-세포 기록을 위해 Axon Multiclamp 700B 증폭기를 사용하였다. 패치 전극은 보로실리케이트 유리(BF100-50-10, Sutter Instruments)로부터 제조하여 8 내지 10 MΩ으로 당겼다. 피펫을 112.5 mM CsMeSO4, 1 mM Mg SO4, 7.8 Х 10-3 mM CaCl2, 0.5 mM BAPTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP-Na2, 0.5 mM GTP-Na3, 5 mM 리도카인 N-에틸 브로마이드(QX314-Br)(pH 7.2)로 충전시켰다. 세포를 -60 mV 전위로 클램핑하여 여기 전류를 분리하였다.
시각 피질내 생체내 기록
마우스를 저 용량의 케타민-크살라진 주사(케타민: 100 mg/kg 및 크살라진: 10 mg/kg)로 진정시킨 후 우레탄(1.0 g/kg, 염수 중 10% w/v)으로 마취시켰다. 동물을 정위 홀더(stereotaxic holder) 속에 두었다. 온도를 37℃로 유지시키고 비타민 A(Allergan)로 덮은 커버슬립을 양쪽 눈에 두어 각막 탈수를 방지하였다. 치료된 눈에 대해 대측 반구내 V1 위의 개두술(1 mm2)은 람다 점으로부터 3 mm 옆으로 및 0.5mm 입쪽으로 중심을 맞췄다. 경막을 제거하고 전극을 피질 표면에 대해 30°각으로 3-축 미세조작장치(Sutter Instruments)를 사용하여 삽입하였다. 이를 800 μm 진전시키고 노출된 표면을 아가로즈(피질 완충액 중 1.2%)로 덮었다.
눈으로부터 1cm에 놓인 470 nm의 평행한 LED(모델 M470L3, Thorlabs)에 의해 시각 자극을 생성시켰다. 원뿔 세포의 분리는 조명이 자극된 눈에 한정되도록 보증하였다. 선형 다중부위 규소 마이크로프로브(Linear multisite silicon microprobe)(50 μm 간격으로 16개 전극)를 기록에 사용하였다. 각각의 획득을 위해, 200회의 시도에 걸쳐 평균낸 후, 최대 피크 진폭의 VEP를 나타내는 전극을 정량화를 위해 선택하였다. 자극은 Digidata(Axon)에 의해 개시된 1Hz에서 200회 반복된 청색 광의 200 ms 펄스로 이루어졌다. 시그날을 통상의 스크립트를 사용하여 Matlab에서 분석하였다. 국소 장 전위의 경우, 시그날은 300 Hz에서 저 통과 여과하고, 200회 시도에 걸쳐 평균내었다.
비-사람 영장류에서의 생체내 영상화 및 눈 시험
GFP의 형광성 영상(안저 자가형광성 방식: 488 nm의 여기 파장 및 500 nm의 배리어 필터) 및 눈 안저의 적외선 사진을 Spectralis HRA+OCT 시스템(Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)을 사용하여 동공 확장 후 획득하였다. 슬릿 램프 생체현미경(Portable Slit Lamp model SL-14, Kowa) 및 간접적인 안저검사법(간접적인 양안 도상검안경(Indirect Binocular Ophthalmoscope) 모델 HK 150-1 uno, Heine)을 투여 전 2주째에 및 이후 매달 기준으로 모든 마카퀴에서 수행하였다.
마카퀴 망막에서의 조직병리학적 연구
고 투여량이 주사된 NHP로부터의 눈을 주사 후 3개월 째에 핵을 제거하고 바늘을 삽입하여 0.15 내지 0.3 ml의 정착액을 안구가 팽창할 때까지 주사하였다. 눈을 정착액 속에서 밤새 침지 고정시키고 전체 구조에 걸쳐 수평 횡단면을 제조하기 위해 가공하였다. 바람직한 안구 구조 모두를 나타내는 망막 횡단편을 이후에 Nanozoomer(Hamamatsu, 일본) 위에서 영상화하였다.
실시예 1
hSNCG의 프로모터 서열
SNCG 유전자는 10번 염색체(10q23.3)에 위치시킨다(도 1). 이는 +1 전사 부위로부터 5번째 엑손의 말단까지 3.5 kb에 걸쳐 연장되는 5개의 엑손을 함유한다. 다량체성(multimerine) 2 유전자(MMRN2)의 첫번째 엑손은 +1 SNCG 전사 부위의 863bp 하부에 위치한다. SNCG 프로모터의 사람 서열을 추출하기 위하여, -785 내지 +163 영역(도 1에서 화살표로 나타냄)을 HEK 293T 세포로부터 증폭시켰다.
증폭 프라이머는 다음과 같았다:
전방 프라이머: 5'-CACAAGCCAGTTCCTGTCC-3' (서열 번호: 2), 및
역방 프라이머: 5'-GGGTGTGCAGGGTTGTG-3' (서열 번호: 3).
프로모터 서열을 94℃에서 30초 변성 단계에 이어, 54℃에서 1분의 어닐링 단계, 및 72℃에서 1분의 연장 단계로 이루어진 30회의 연속 주기로 증폭시켰다.
PCR 생성물(서열 번호: 1)을 이후에 pENTR-D/TOPO 플라스미드내로 DNA 토포이소머라제 I을 사용하는 방법에 의해 아클로닝하고 서열분석하였다. 서열은 유전자 확인번호 제6623하에 진뱅크에 발표된 서열과 동일한 것으로 확인되었다.
당해 플라스미드로부터, 본 발명자들은 AAV 벡터 및 GFP 리포터 유전자를 서열 번호: 1(도 1)의 프로모터의 제어하에서 발현하는 HIV-1으로부터 기원한 렌티바이러스 벡터를 생산하였다.
mPGK 또는 hSNCG 프로모터 및, GFP 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 AAV-2/Y444F 벡터의 작제 및 생산
작제 (Construction)
SNCG 프로모터(서열 번호: 1) 및 PGK 프로모터 서열을 게이트웨이 방법(Gateway method)을 사용하여, 5'ITR로부터 3'ITR까지 다음을 함유하는 AAV 생산용 셔틀 플라스미드(shuttle plasmid) 속에서 동종 재조합에 의해 도입하였다: Rfa 삽입물(게이트웨이 시스템과의 동종 재조합 허용), GFP, 및 소 성장 호르몬의 폴리아데닐화 시그날(bGH polyA)을 함유하는 cDNA.
당해 벡터를 치환 Y444F내 생성되는 점 돌연변이를 갖는 혈청형 2 캡시드로 위형분석(pseudotyping)하였다. 돌연변이를 지시된 돌연변이유발에 의해 AAV2의 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미드로부터 도입하였다.
생산
AAV 입자를 발현 카세트, rep2 및 cap2-Y444F 유전자를 발현하는 패키징 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드를 함유하는 재조합체 AAV2 게놈을 수반하는 플라스미드를 사용하여 HEK-293T 세포를 동시-형질감염(인산칼슘 동시-침전 사용)에 의해 생산하였다. 이후에, AAV 입자를 정제하고 불연속적인 요오딕산올 구배 한외원심분리에 의해 형질감염된 세포의 세포질성 추출물로부터 정제하고 농축시켰다. 바이러스 역가를 AAV 입자의 게놈성 DNA의 ITR 서열의 정량적인 PCR 증폭에 의해 측정하였다.
실시예 2
C57BL6/J 성체 마우스(6주령)에게 PBS 속에서 1011 vg (벡터 게놈)의 용량으로 희석된 서열 번호: 1의 프로모터 및 GFP 단백질(참고: 실시예 1 및 도 1)을 암호화하는 핵산의 유리체내 주사를 제공하였다. 주사 1개월 후, 안저 및 망막은 정상의 외관을 가졌으며, 이는 벡터 또는 외과 수술의 독성 결여를 나타낸다(도 2a).
망막 속에서 GFP 리포터 유전자의 발현은 직접적인 형광성을 사용하여 안저의 생체내 영상화에 의해 관찰하였다(도 2a). 동물을 케타민과 크살라진의 혼합물의 복강내 주사로 마취시키고, 동공을 네오시네프린 및 미드리아티쿰의 국소 적용으로 확장시켰다. 전체 동공 확장시킨 후, 동물을 설치류 안저를 관찰하도록 구체적으로 설계된 형광성 카메라(MicronIII, PhoenixLaboratories)로 시험하였다.
형광성을 사용하여, GFP를 발현하는 다수의 세포체를 검출하고, 유두(papilla) 또는 시신경 헤드를 향해 집중하는 신경 섬유를 또한 관찰하였다(나타내지 않음). 이들 신경 섬유의 존재는 GFP가 RGC 내에서 발현되었음을 입증하였다.
실시예 3
망막내에서 hSNCG 프로모터의 발현 패턴을 특성화하기 위하여, 본 발명자들은 hSNCG 프로모터(서열 번호: 1)를 망막내에서 높은 수준의 발현을 제공하는 것으로 알려진 독특한 프로모터인, mPGK 프로모터와 비교하였다.
2개 그룹의 C57BL6/J 마우스에게 PBS 속에 1011 vg의 용량에서 희석되고 mPGK 또는 hSNCG 프로모터의 제어 하에서 GFP를 암호화하는 AAV2-Y444F 벡터를 유리체내 주사하였다. 주사 1개월 후, GFP 발현을 상기 기술된 바와 같이 생체내에서 분석하였다. 이후에, 동물을 마취시키고 조직을 PBS 중 4% 포름알데하이드를 함유하는 용액의 심장내 관류에 의해 고정시켰다. 안구를 후속적으로 추출하여, 동일한 정착액 속에서 1시간 동안 후-고정시키고, PBS 중 25% 슈크로즈를 함유하는 용액 속에서 동결보호한 다음 저온유지장치를 사용하여 16μm의 두께로 절단하였다. GFP 발현을 이후에 직접적인 형광성의 가시화에 의해 및 신경절 세포의 특이적인 마커로서 Bnr3a를 사용하여 면역표지한 후 현미경 하에서 분석하였다.
편재된 프로모터 mPGK를 포함하는 AAV 벡터가 주사된 마우스에서, RGC 층 속에 다수의 형질도입된 세포가 존재하였으나, 또한 이극성 세포층(INL) 및 광수용기 층(ONL)에서도 존재하였다(도 2f). 광수용기 또는 뮬러 세포의 형태학을 갖는 세포가 또한 명확하게 검출되었다. 또한, INL 속에서 형질도입된 세포의 위치는 이극성 또는 아마크린 신경세포가 또는 형질도입됨을 시사한다.
서열 번호: 1의 프로모터를 포함하는 AAV 벡터가 주사된 마우스에서, RGC는 매우 강력하게 표시되었다. GFP는 이들 영향의 층 구조를 나타내는 내부 망상층에서 이들의 세포체 및 이들의 수상돌기 분지에서 검출되었다(도 2c). 아주 적은 수평 세포를 제외하고는, GFP 발현은 신경절 세포 층에 제한되었다.
실시예 4
본 발명자들은 Brn3a로 동시-표지함으로써 발현의 국재화(localization)를 시험하여 RGC내에서 유전자 발현의 강도 및 특이성을 평가하였다. Brn3a는 RGC 내에서 구체적으로 발현되며 당해 전사 인자에 대한 항체는 쥐 RGC를 확인하기 위한 신뢰가능한 마커인 것으로 고려된다(Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604).
C57BL6/J 마우스의 2개 그룹에게 1011 vg의 용량에서 PBS 속에 희석시키고 CMV 또는 hSNCG 프로모터의 제어 하에 GFP를 암호화하는 AAV2 벡터를 유리체내 주사하였다. 주사 1개월 후, 동물을 마취시키고 PBS 중 4% 포름알데하이드를 함유하는 용액의 심장내 주입에 의해 조직을 고정시켰다. 안구를 후속적으로 추출하고, 동일한 정착액속에 1시간 동안 후-고정시키고, PBS 중 25% 슈크로즈를 함유하는 용액 속에서 동결보존한 후, 저온유지장치를 사용하여 16μm의 두께로 절단하였다. GFP 발현을 이후에 직접적인 형광성의 가시화 및 신경절 세포의 특이적인 마커로서 Bnr3a를 사용한 면역표지화 후 현미경 하에 분석하였다.
서열 번호: 1의 프로모터를 포함하는 AAV2 벡터가 주사된 마우스에서, RGC는 매우 강력하게 표시되었다. GFP는 이들 영향의 층 구조를 나타내는 내부 망상층에서 이들의 세포체 및 이들의 수상돌기 분지에서 검출되었다. SNCG-GFP 망막으로부터 횡단면(도 3b)의 공초점 현미경 영상은 RGC내 강력한 GFP 발현을 나타내었으며 당해 발현은 Bnr3a 표지화를 사용하여 고도로 동시-국재화하였다.
실시예 5
각각의 AAV2-CMV-GFP 또는 AAV2-SNCG-GFP 벡터의 5x1011개 바이러스 입자를 정상 마카퀴(마카카 파스키쿨라리스(macaca fascicularis)의 눈에 100 μL의 용량으로 유리체내 주사하였다. 본 발명자들은 안저 형광성 영상화에 의해 시노몰구스 마카퀴 망막내에서 GFP 발현을 평가하였다. GFP의 형광성 영상(안저 자동형광성 방식: 488 nm의 여기 파장 및 500 nm의 배리어 필터)을 동공 확장 후에 Spectralis HRA+OCT 시스템(Spectralis HRA+OCT; Heidelberg Engineering, 독일 하이델베르크)을 사용하여 획득하였다. 형광성 영상은 CMV 프로모터를 지닌 것(도 4b)보다 형질도입된 부위(중심와 주변 환)와 SNCG 프로모터를 함유하는 AAV-GFP 벡터를 지닌 배경 사이에서 가장 큰 강도의 GFP 발현을 나타내었다(도 4a). 당해 실험은 보다 높은 전이유전자 발현이 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)를 사용한 비-사람 영장류에서 수득됨을 입증한다.
실시예 6
서열 번호: 1의 프로모터 서열을 사용한 마우스 망막에서 강력한, RGC-특이적인 발현
사람 감마 시누클레인(SNCG)(서열 번호: 1)의 조절 영역으로부터 실시예 1에서 수득한 프로모터 서열을 GFP의 상부에 클로닝하였다. 본 발명자들은 마우스의 망막 속에서 AAV 매개된 발현 양식을 특성화하였고 RGC에 있어서 고 수준의 GFP 발현을 관찰하였다. 이후에, 본 발명자들은 AAV 골격내 사람화된 CatCh(L132C 돌연변이를 지닌 사람 코돈-최적화된 채널로돕신)의 상부로 당해 서열을 클로닝하였다. AAV2 벡터는 GFP와의 융합시 hCatCh의 발현을 유도하는 CMV 또는 SNCG 프로모터를 사용하여 생산되었다. 5개의 rd1 마우스 눈에 hCatCh-GFP의 발현을 유도하는 CMV 또는 SNCG를 주사하였다.
형광성 안저 영상은 CMV가 주사된 눈과 관련하여 SNCG가 주사된 모든 눈에서 보다 높은 형광성을 나타내었다(도 5a). 눈을 주사 후 8주째에 적출하였으며 망막 플랫-마운트는 CMV와 비교하여 SNCG 프로모터를 사용하여 보다 높은 강도의 형광성을 제공하였다(도 5b). 본 발명자들은 Brn3a로 동시-표지함으로써 발현의 국재화를 시험하여 RGC에 있어서 유전자 발현의 강도 및 효능을 평가하였다(도 5c). Brn3a는 RGC내에서 특이적으로 발현되며 당해 전사 인자에 대한 항체는 쥐 RGC를 확인하고 정량화하기 위한 신뢰성있는 마커로 고려된다(Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604). SNCG-CatCh-GFP 망막으로부터 망막 플랫-마운트(도 5d) 및 횡단면(도 5e)의 공초점 현미경 영상은 RGC에 있어서 강력한 GFP 발현을 나타내었으며 당해 발현은 Bnr3a 표지로 고도로 동시-국재화되었다. 이러한 영상의 세포 정량화시, 본 발명자들은 Brn3a 항체가 SNCG 또는 CMV 프로모터로 형질감염된 망막에서 동일한 수의 RGC를 표지함을 나타내었다. SNCG 망막에서, 이들 Brn3a-양성 RGC의 57%는 또한 GFP를 발현하였으나 당해 비는 CMV 망막에서 21%로 감소하였다(도 5c). SNCG와 CMV 망막 사이의 차이는 통계적으로 유의적이었다. GFP-발현 Brn3a-양성 RGC의 이러한 보다 큰 비는 RGC에서 고 수준의 유전자 발현을 유도하는 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)의 보다 큰 효능을 입증하였다.
서열 번호: 1의 SNCG 프로모터 하에서 rdl 망막의 RGC내 CatCh 발현 후 망막 및 피질 반응
hCatCh-GFP의 선택적인 RGC 표적화가 실명(blind) rd1 망막(연령 > 12주)에서 시각 기능을 회복할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 다중 전극 배열(MEA)을 사용하여 망막 신경절 세포로부터 스파이킹 활성을 기록하였다. 마우스에게 출생 후 4 내지 8주째에 CMV 또는 SNCG(서열 번호: 1) 프로모터 하에서 hCatCh-GFP를 암호화하는 AAV2를 3회 용량으로 주사하고 MEA 기록을 주사한지 8 내지 12주 후 수행하였다(도 6 a-e). 광유전학적 반응의 감광성을 1014 내지 1017개의 광양자/cm2/s 범위의 광 조건에서 252-전극 배열 상에서 판독물로서 측정하였다. rdl 망막을 2초의 전체 파장의 플래쉬로 자극하는 경우 광 유발된 스파이크 활성이 관찰되었으나(도 6a-e), 대조군 rd1 망막은 광에 대한 반응시 스파이크 활성에 있어서의 어떠한 증가도 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 광에 반응하는 세포의 퍼센트는 바이러스 용량에 의존적이었다(도 6 a-b). 보다 큰 수의 세포가 1014개의 광양자/cm2/s에서 최대 AAV 용량에서 SNCG 프로모터를 주사한 rdl 동물에서 반응하였다(도 6a). 이러한 개선된 민감성은 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)가 RGC에서 보다 높은 수준의 CatCh 발현을 유도함으로써 보다 높은 퍼센트의 세포가 동일한 바이러스 로드에 대해 광 반응성이 됨을 제공한다. 점화율 주파수는 강도 의존적이었으며 눈 당 5x109 vg의 바이러스 용량에서 SNCG 프로모터 하에 발현된 CatCh에 대해 1014개의 광양자/cm2/s에서 풍부한 광-반응을 유발하였다(도 6a). 표준화된 점화율은 광 강도의 증가와 함께 증가하였다(도 6c-d). CMV 프로모터를 사용한 최대 바이러스 용량만이 1014개의 광양자/cm2/s에서 광에 대한 반응을 생성하였음에 주목한다(도 6a). 또한, 매우 적은 수의 세포가 이들 조건에서 광에 반응하였다. 최대 광 강도에서조차, 중간 바이러스 용량(눈 당 5x108 vg)에서 반응하는 세포는 거의 없었다(도 6b). 당해 실험은 RGC에서 기능성 단백질의 발현을 유도하는 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)의 보다 큰 효능을 입증하였다.
이러한 RGC 활성화가 뇌로 전송되는지를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 생체내에서 망막 자극시 피질 수준에서 광 반응을 기록하였다. 당해 실험을 위해, 다른 일련의 rd1 마우스에게 AAV2-SNCG-hCatCh-GFP를 주사하고 본 발명자들은 이들을 사용하여 증가하는 광 강도에 대한 반응에 있어서 시각 피질내 스파이킹 활성 및 국소 장 전위(VEP)를 기록하였다. RGC 반응은 시각 피질내에서 고도의 광-민감성 활성으로 해독되었다(도 6f-j). 치료된 눈(기록하는 반구에 대해 대측)을 1Hz에서 200회 반복된 청색 광(1.7 1017개 이하의 광양자/cm2/s의 광 강도 사용)의 200 ms 펄스로 자극하였다. VEP는 치료되지 않은 rdl 마우스로부터의 기록에 있어 가시적이지 않았다(플랫 트레이스(flat trace)). 야생형 마우스에서 측정한 VEP와 비교하는 경우, CatCh-유도된 VEP는 보다 느린 잠재능을 가졌다(도 6i). 광변환 캐스케이드 및 후속적인 망막 계산이 우회되므로 보다 짧은 잠재능이 예측되었다. 도 6f-h 및 j는 보다 높은 광 강도에서 보다 짧은 잠재능의 우세한 피크의 진행적인 환영과 함께 스파이킹 반응의 강도 의존성을 나타낸다. CatCh-치료된 rd1 마우스에서 스파이크의 잠재능은 또한 야생형 마우스(52.98 +/-3.83 ms, n=3)에서의 평균 온(ON) 잠재능보다 더 짧았다(10.1 +/-2ms, n=3). 이들 반응은 광 자극의 기간과 엄격하게 관련되었으며 CatCh-유도된 RGC 활성화의 결과였다. 이들 기능적 결과는 SNCG 프로모터 하에서 CatCh의 AAV-유도된 발현이 실명 마우스 망막내 RGC를 활성화시켜 감광성을 회복시키며 이들 세포가 광 시그날을 뇌로 시각 피질까지 전송함을 명확하게 입증한다.
NHP 눈에서 생체내 염증 반응
마우스 연구에서, 본 발명자들은 5x107 내지 5x109 vg/눈 범위의 용량을 사용하였다. 본 발명자들은 사람에서 광독성을 최소화시키는데 요구되는 낮은 광 강도(1014-1015개의 광양자/cm2/s 범위)를 사용하는 경우, MEA에 대한 광 반응을 수득하는데 필요한 입자 수가 5x108 내지 5x109 vg/눈 범위에 있었음을 관찰하였다. 마카퀴 유리체의 용적은 마우스의 유리체 용적보다 약 100배 더 크므로, 본 발명자들은 본 발명의 비-사람 영장류 실험에서 당해 용량 범위의 약리학적 등가물을 사용하기로 결정하였다. 5마리의 비-사람 영장류를 이들의 혈액 혈청 속에서 AAV2에 대한 중화 항체 역가의 부재를 기준으로 선택하였다(Kotterman et al. Gene Ther. 2015 Feb;22(2):116-26). 이들 성체 마카퀴 중 4마리에게 SNCG 프로모터 하에 hCatCh를 암호화하는, 1x1011 (n=4개의 눈) 또는 5x1011 개의 입자(n=4개의 눈)의 AAV2를 유리체내 주사하였다(표 1).
표 1. 비-사람 영장류에서의 주사: 동물 수, AAV 벡터 및 유리체내 주사된 바이러스 용량
Figure 112018065942784-pct00001
GFP가 면역원성일 수 있으므로, GFP에 대한 및 hCatCh에 대한 잠재적인 염증 반응 사이를 구별하기 위하여, 본 발명자들은 형광성 태그가 없는 hCatCh를 사용하였다. 그러나, 한마리의 영장류에게는 동일한 2개의 용량(하나의 눈에는 저 용량 및 다른 눈에는 고 용량)을 주사하였지만 이때 GFP와의 융합물 속에 hCatCh를 암호화하여 생체내에서 유전자 발현(NHP1)을 모니터링하였다.
유리체는 충분히 투명하여 유리체 혼탁(vitreous haze)에 대한 등급화 계획에서 정의된 바와 같이 염증의 정도에 있어 진전이 거의 없었다(도 7의 하부 패널). 안저 시각화의 약간의 손상 만이 저 투여량 그룹에서 하나의 눈에 주사 후 1 및 3개월째에; 및 고 투여 그룹에서 모든 눈에서 주사 후 2 내지 3개월 째에 검출되었다(도 7의 하부 패널).
후측 포도막염 등급화(Posterior uveitis grading)에 의한 평가(도 7 - 상부 패널)는 주사 후 1개월부터 시작하여 모든 연구 그룹에서 유리체내의 세포의 지속적인 존재를 나타내었다(도 7 - 상부 패널). 주사한지 5 내지 6개월 후 유리체내에서 세포의 대부분은 늙은 것으로 보인다.
유리체내 세포의 정량화 및 분석을 중간 및 고 투여 그룹에서 수행하였고 염증 반응성의 2개-파장 곡선을 나타내었다(도 7). 그룹 둘 다의 모든 눈은 주사 시점 후 1개월째에 제1-파장 유리체 염증을 나타내며, 유리체 세포 염증 반응의 수준은 바이러스 작제물(SNCG-Catch 및 CMV-Catch) 및 CMV-Catch 작제물 그룹 둘다의 고 투여 그룹에서 중간 투여 그룹보다 더 높았다. 보다 낮은 수준인 것을 제외한 동일한 프로파일이 주사 시점 후 3 내지 4개월째에 제2 파장 염증성 유리체 세포내에서 나타났다.
슬릿 램프 및 간접적인 검안경을 사용한 눈 안저의 실험은 망막, 망막 혈관, 시신경 원판 및 맥락막의 염증 신호를 나타내었다.
상기 기술된 염증의 신호는 유전자 치료요법에 대한 눈의 천연의 면역학적 반응을 잘 반영한다. 이러한 완전하고 상세한 분석의 목적은 유전자 치료요법에 대한 염증 반응의 역학을 이해하기 위한 것이다. 5 내지 6개월의 관찰 기간을 통한 염증 반응의 관찰된 현상 중 어느 것도 시각에 있어서 유의적인 영향을 가지지 않았다.
고 용량 그룹으로부터의 하나의 눈의 조직병리학적 실험은 염증 세포를 나타내지 않는다.
본 발명자들이 주사 후 3개월 째에 고-용량 그룹으로부터 분석한 눈에서만 조직학적 병변이 관찰되지 않았다. 전체 눈을 고정시키고, 단면화하고 단면내 어느 곳에서도 40x 해상도를 허용하는 나노줌머 기술(nanozoomer technology)을 사용하여 관찰하였다(도 8). 염증의 구조적 변화 지표(잔기둥 그물(trabecular meshwork) 및 홍채-각막 각에서 림프구 또는 혈장 세포, 유리체내에서 염증 세포, 또는 망막내에서 혈관주의 림프구의 존재)는 나타나지 않았다(도 8b-f). 중요하게도, 5 x 1011 vg 용량 그룹으로부터의 당해 동물(NHP 3)은 주사 후 1 내지 2개월째에 간접적인 검안경 평가시 다양한 수준의 유리체 혼탁 및 세포를 나타내었다(도 7). 3개월째에 염증 세포 및 망막 손상의 부재는 어떠한 앞서의 전방 챔버 플레어(anterior chamber flare) 또는 유리체 혼탁이 망막 구조내 영구적인 변화를 생성하지 않았으며 눈의 전체적인 망막 및 전방 분절이 손상 또는 염증의 어떠한 신호도 없음을 나타낸다. 따라서, SNCG 프로모터(서열 번호: 1)의 제어하에서 광유전자 발현은 염증 반응을 유도하지 않는 것으로 나타난다.
NHP의 주변-중심와 부위내에서의 CatCh-발현 RGC의 비율
망막 플랫-마운트를 이후에 채널로돕신에 대한 항체(Busskamp et al. Science 2010;3(June):413-7), Brn3a 및 GFP(존재하는 경우)로 MEA 기록 후에 염색하였다. NHP1로부터의 조직을 항-GFP 항체를 사용하여 녹색으로 및 항-Brn3a 항체를 사용하여 적색으로 표지하였다(도 9b). 이는 본 발명자들이 Brn3a 및 항-채널로돕신 항체 둘 다로서 CatCh의 국재화가 동일한 종에서 생산됨을 나타내는 항체와 함께, RGC 특이적인 마커, Brn3a을 사용할 수 있는 유일한 망막이다. 중심와의 중앙으로부터 ~1 mm 사각형에 걸친 당해 조직에서, 본 발명자들은 중심와 주변 600 μm 반경을 지닌 원의 1/2에서 Brn3a (+) 및 CatCh-GFP (+) 세포를 계수하였다(도 9b). 당해 부위에서 Brn3a(+) 세포의 약 37%는 GFP에 대해 양성(1413개의 Brn3a-양성 세포의 경우 523개의 GFP-양성 세포)이었다. NHP 2로부터의 조직에서, 본 발명자들은 중심와의 중앙으로부터 600 μm에 걸친 영역내에서 눈의 한쪽 1/2의 경우 CatCh-양성 세포를 1351개를 및 대측 눈에서 455개를 계수하였다(도 9c). 고-용량 그룹으로부터의 망막 중 하나는 MEA 기록 과정 후 손상되었으며 면역형광성 표지에 사용할 수 없었다. 이들 결과는 주변-소와 RGC의 적어도 1/4이 5 x 1011 vg의 주사 후 CatCh로 표지됨을 나타낸다.
단일-세포 패치 클램프 기록은 중심와 주변의 개개 RGC에 있어서 CatCh-유도된 광전류를 나타낸다.
AAV2-SNCG-hCatCh-GFP가 주사된 NHP1을 주사한지 3개월 후 희생시켰다. 망막을 절개하고 GFP에 기여한 녹색 형광성은 당해 영역에서 최대였으므로, 중심와 영역을 MEA 및 패치-클램프 기록을 위해 2개의 반구를 조심스럽게 절단하였다(도 9a). 당해 발현 양식은 앞서의 NHP 연구와 일치하였다(Dalkara et al. Sci Transl Med. 2013 Jun 12;5(189):189ra76; Yin et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Apr 25;52(5):2775-83). 본 발명자들의 실험 모두에서, NHP 망막내 내인성 광 반응이 욕(bath) 용액 중 50μM에서 대사자극성 글루타메이트 수용체 효능제 L-(+)-2-아미노-4-포스포부티르산(L-AP4)을 사용하여 차단되었다. 본 발명자들은 마우스(Nagel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003;100(24):13940-5) 및 사람 망막(Tomita et al. Mol Ther. 2014 Aug;22(8):1434-40) 둘 다에서 야생형 망막에 있어 모든 온 반응의 L-AP4 차단을 이미 입증하였다.
단일 세포 수준에서, 패치-클램프 기록은 AAV2-SNCG-hCatCh 및 AAV2-SNCG-hCatCh-GFP 조건 둘 다(각각 n=2 및 n=3 세포)로부터 RGC에 있어서 470nm에서 1.46 1016개의 광양자/cm2/s 하에 광 반응을 입증하였다(도 10). AAV2-SNCG-hCatCh RGC는 형광성 표지에 의한 보조없이 패치되어야 했다. 모든 반응성 세포가 중심와 중앙 주변의 원반(500-600μm)에서 발견되었다(도 10a). 일부 경우에, 세포-부착된 구조로 기록된 세포는 신속하고 풍부한 스파이킹 패턴을 나타내었다(도 10b). 본 발명자들은 리도카인의 존재하에서 -60mV의 유지 전위에서 전체 세포 구조 하에 신속한 일시적인 전류에 이은 정체상으로 이루어진 대표적인 채널로돕신-유발된 광전류를 관찰하였다(도 10c). 450nm에서의 자극시 피크가 된 광전류는 500nm까지 현저하게 남았으며(도 10d) 이들은 22Hz 광-펄스를 수반하기에 충분히 신속하였다(도 10e). 2-광양자 레이저로 스캐닝하는 경우, CatCh-GFP 신경절 세포는 중심와 주변 영역에서 조밀한, 막-결합된 GFP-표지를 나타내었다(도 10 f-g).
AAV2-CMV-hCatCh 또는 AAV2-SNCG-hCatCh가 5x1011 또는 1x1012 vg/용량에서 주사된 원숭이를 주사한지 6개월 후에 희생시켰다. 단일 세포 기록 기술(세포-부착된 및 패치-클램프 기록)을 사용하여 본 발명자들은 저 용량에서 SNCG 그룹으로 수득된 실시예를 사용하여 도 10h에 나타낸 바와 같이, 모든 그룹으로부터 광 반응(광 전류 및 스파이킹 활성)을 기록할 수 있었다.
주사한지 6개월 후 NHP 망막에서 CatCh를 발현하는 RGC로부터의 단일 세포 기록(세포 부착된 및 패치-클램프)
이후에, 본 발명자들은 반응성 세포의 비율(도 11a-c), 및 최대 점화 주파수(도 11d) 또는 광전류(도 11e, 고 용량 만을 사용)의 측면에서 4개 그룹을 광 강도의 함수로서 비교하였다. 본 발명자들은 AAV2-SNCG-hCatCh를 주사한 동물로부터 기록한 부중심화 세포가 바이러스 용량 둘 다에 대해, AAV2-CMV-hCatCh를 주사한 동물로부터 기록한 세포보다 광-반응성이 훨씬 더 높을 가능성을 가졌음을 발견하였다. 본 발명자들의 결과는 또한, SNCG 반응성-세포 그룹(용량 둘 다에서)이 CMV 프로모터를 지닌 그룹보다 더 광 민감성(보다 신속한 점화 활성)이었음을 나타내었다.
NHP 망막의 다중-전극 배열(MEA) 기록에 의해 측정된 CatCh-발현 RGC로부터의 기능적 반응
이들 광전류가 집단 수준에서 RGC 활성을 제어하는 방법을 정의하기 위해, 망막 플랫마운트를 다전극 배열(MEA) 기술을 사용하여 기록하였다. 도 12b는 NHP1 좌측 눈(고 용량)의 단일 단위 기록으로부터의 래스터 플롯(raster polt)을 나열한다. 주변 중심와 GFP 발현 패턴과 관련된 광 반응이 망막 플랫마운트에서 관찰되었다(도 12a-d). 5배 더 적은 용량을 사용하여 주사한 대측 눈으로부터는 반응이 수득되지 않았다. 본 발명자들은 다음에 GFP 태그가 없는 고 용량의 AAV2-hCatCh를 주사한 다른 동물을 희생시켰다. 고 용량 그룹으로부터의 4개의 망막 모두는 광에 반응하는 기록된 90% 이하의 RGC를 사용한 L-AP4 차단 하에서 유사한 광 반응을 나타내었다(도 12a). 유사하게, 광-반응성 세포의 분포는 AAV2-SNCG-hCatCh 벡터를 사용하는 경우에도 항상 중심와 영역의 중앙에 있었다. 이들 결과는 GFP 태그가 RGC에서 기능적 CatCh 발현을 수득하는데 필요하지 않음을 나타낸다. 점화 주파수의 스펙트럼 조율을 계산하고 480 nm 광에 대한 최대 주파수 반응을 나타내었으며, 상기 광은 ChR2의 여기 피크에 상응한다. 반응성 세포의 점화율 주파수는 1017개의 광양자/cm2/s에 적용된 최대 광 강도에 도달한 최대 값과 의존적인 강도이었다(도 12d).
저-용량 그룹에서, 5개의 기록된 망막중 2개 만이 광유전학적 광 반응을 나타내었고, 기록된 RGC의 10% 미만은 이들 망막에서 광에 반응하였다. 다른 망막은 자발적인 RGC 활성을 나타내었지만 L-AP4 하에서 광 반응은 없었다. 이들 결과는 1011개의 입자가 본 발명자들이 CatCh의 발현을 통해 RGC의 신뢰할 수 있는 광유전학적 활성화를 예측할수 있는 역치 상태에 있음을 나타낸다.
주사한지 6개월 후, RGC에서 CatCh의 발현을 3개월째의 반응과 비교할 수 있었다. CatCh-매개된 광 반응은 모든 시험한 망막에서 관찰되었다. 광 반응 동안의 배출 주파수는 1.1014 내지 1.1017개의 광양자.cm-2.s-1의 범위에서의 강도에서 AAV2-CMV-hCatCh로 감염된 망막과 비교하여 AAV2-SNCG-hCatCh 벡터로 감염된 조직에서 더 높았다(도 12e). 광 반응을 개시하기 위한 역치는 SNCG 망막에서 더 낮았다(각각 6.1014 및 8.1015개의 광양자.cm-2.s-1). SNCG 조직에서, 모든 강도에 있어서 방전 주파수는 또한 바이러스 입자의 용량과 관련되었으며, 보다 높은 바이러스 용량을 사용한 조직은 가장 강력한 반응을 나타내었다. 이들 결과는 SNCG 프로모터가 CMV 프로모터와 비교하여 마카퀴 망막 신경절 세포에서 CatCh 발현을 유도하는데 있어서 더 효율적이어서, 조광(dimmer light) 수준에서 보다 강력한 광 반응을 허용함을 종합적으로 나타낸다.
주사한지 6개월 후, RGC에서의 CatCh의 발현은 3개월째 반응과 비교할 만 하였다. CatCh-매개된 광 반응을 모든 시험한 망막에서 관찰하였다. 광 반응 동안의 방전 주파수는 1.10E14 내지 1.10E17의 광양자.cm-2.s-1 범위의 강도에서 AAV2-CMV-hCatCh로 감염된 망막과 비교하여 AAV2-SNCG-hCatCh 벡터로 감염된 조직에서 더 높았다. 광 반응을 개시하기 위한 역치는 SNCG 망막에서 더 낮았다(각각 6.10E14 및 8.10E15 개의 광양자.cm-2.s-1). SNCG 조직에서, 모든 강도에 있어서의 방전 주파수는 또한 바이러스 입자의 용량과 관련되었으며, 보다 높은 바이러스 용량을 사용한 조직은 가장 강력한 반응을 나타내었다. 이들 결과는 SNCG 프로모터가 마카퀴 망막 신경절 세포에서 CatCh 발현을 유도하는데 있어서 보다 더 효율적임을 나타낸다.
실시예 7
서열 번호: 1의 프로모터 서열을 사용한 영장류 망막에서 강력한, RGC-특이적인 발현
당해 벡터는 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)의 제어 하에서 ChrimsonR-tdTomato(Klapoetke et al., Nat Methods, 2014 Mar;11(3):338-46)의 암호화 서열을 캡시드화하는 망막 형질도입을 위해 최적화된 AAV 캡시드 변이체 AAV2-7m8 (Dalkara et al., Sci Trans Med, 2013 Jun 12;5(189):189ra76)로 이루어진다.
4 마리의 비-사람 영장류를 이들의 혈액 혈청 속에서 AAV2에 대한 중화 항체 역가의 부재를 기준으로 선택하였다(Kotterman et al. Gene Ther. 2015 Feb;22(2):116-26). 이들 성체 마카퀴 중 4마리에게 SNCG 프로모터 하에 ChrimsonR-tdTomato를 암호화하는 AAV2-7m8의 5x1011개 입자를 유리체내 주사하였다 (표 2).
표 2: 비-사람 영장류에 있어서의 주사: 동물 수, AAV 벡터 및 유리체내 주사된 바이러스 용량
Figure 112018065942784-pct00002
NHP를 안저 형광성을 사용하여 2개월 동안 수반하였다. 형광성 안저 영상은 CAG 프로모터를 주사한 눈과 관련하여 SNCG 프로모터를 주사한 모든 눈에서 더 높은 형광성을 나타내었다(도 13 및 14). 주변내로 멀리 연장하는 ChrimsonR-tdTomato 발현은 NHP2의 우측 눈, 및 다른 눈에서 명확하게 가시성이다.
NHP 망막의 다눙-전극 배열(MEA) 기록에 의해 측정된 ChrimsonR-발현 RGC로부터의 기능적 반응
ChrimsonR-tdTomato의 선택적인 RGC 표적화가 영장류에서 시각 기능을 회복시킬 수 있음을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 다중-전극 배열(MEA)를 사용하여 망막 신경절 세포로부터 스파이킹 활성을 기록하였다. MEA 기록은 주사한지 6개월 후 수행하였다(도 15).
색상-코드된 반응 영상을 MCRack 소프트웨어를 사용하여 생성하였으며 상이한 기록 전극에서 활성을 나타낸다. 주파수를 10 msec 전체 장 플래쉬(600+/-200 nm에서 2 x 1017개의 광양자.cm².sec-1)를 포함하는 300ms 시간 윈도우에서 나타난 스파이크의 수를 기준으로 계산한다. 스파이크는 200Hz 고 통과 제2 차수 버터워쓰 필터링(2nd order butterworth filtering) 후, 및 20μV에서 수득되는 여과된 시그날에서의 역치화 후 검출되었다. 동일한 매개변수를 모든 상이한 망막 종에서 모든 전극에 대해 사용한다. MEA 기록 격자상의 ChrimsonR-tdTomato 형광성의 영상은 ChrimsonR의 발현이 비특이적인 CAG 프로모터보다 SNCG 프로모터(서열 번호: 1) 하에서의 보다 큰 부위에서 수득되었음을 입증하였다. 또한, RGC에서 스파이킹 활성은 CMV 프로모터의 경우보다 SNCG 프로모터(서열 번호: 1)의 경우에 더 넓은 영역에서 기록되었다. 당해 실험은 CAG 프로모터의 사용보다 SNCGT 프로모터의 사용시 보다 큰 장의 광유전학적의 활성화에 대한 증거를 제공한다.
모든 마카퀴 망막을 단일-세포 전기생리학적 실험 전에 영상화하였다. 중심와 조각의 1/2을 실험 동안 36℃에서 산소화된(95% O2/5% CO2) 아메스 매질(Sigma-Aldrich) 속에서 신경절 세포를 마주하면서, 현미경의 기록 체임버 속에 두었다. 에피형광성(epifluorescence) 또는 생 2-광양자 영상화를 위해(도 16), td-tomato 형광성을 td-tomato 필터 및 CCD 카메라(Hamamatsu Corp., 뉴저지주 브릿지워터 소재)를 사용하거나 1030 nm의 파장에서 2-광양자 레이저 여기를 각각 사용하여 수행하였다. 5x 및 40x 확대 대물렌즈를 사용하였다. 이들 형광성 관찰은 또한 CAG 프로모터하에서보다 SNCG 프로모터 하에서 ChrimsonR-tdTomato의 보다 광범위한 발현을 입증하며, 이들은 심지어, 주변 중심와 환 밖의 발현이 형광성 스폿에 의해 나타나는 바와 같이 SNCG 프로모터를 사용하여 수득될 수 있음을 나타낸다(도 15b). 최종적으로, 2개의 광양자 현미경 하에서, ChrimsonR-tdTomato의 위치는 SNCG 프로모터를 사용한 혈장 막으로 제한되는 것으로 나타난다(도 15d-우측).
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS6) INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> Promoters and uses thereof <130> IP20183422FR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 953 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacccacaag ccagttcctg tccctgagga cttggctcag ggactctggg aatgtggtag 60 acatggggtg gccccaccaa atgcatcctt atgggaacct gctccctggg agccatgaaa 120 agagcgtgga cttcgaggtg gggccacagg aagtggtcag gtccatctca ggggacctgc 180 tgcccatcca cactgctggc caggaaatgg ggggcaattc atgcctcctc agcaccttca 240 gcactgggcg gctcaaagaa ggcaagggac tattctgggg tcacacagca tgcagccaga 300 ggccaaggca tgaggaagtc cttcatttcc ccacccccac ccacctcaga tcctccaacc 360 ggtttcatgg cagcccaggg tccagcggca tccaggatgc tggtgggtag ctgcacagcc 420 caggccgcgg gaggttggct gctctcacct aacaggccta tgtggccctg acccctacct 480 aggaagctgg ggacaatggc caaggcgcct cccctctctg tgcctgtctg tccaggtgca 540 gcatagacac agcacccctg gggccaagag cacccagcca gggctgcccc catgggtggg 600 cagggcagta aatgaatgag ggacaggttg ggaggtggcc agccccctcc agcccatgga 660 gggcacgggg caggagagct gggctgagcc agcaggagcc cagggagcct ggtctctgcc 720 ttcctatcct ggaggaaggt gaggctgaac ctccttccct ccctccctcc ctccccgccc 780 ccactgcacg cagggctggc tgggctccag ctggcctccg catcaatatt tcatcggcgt 840 caataggagg catcggggac agccgctgcg gcagcactcg agccagctca agcccgcagc 900 tcgcagggag atccagctcc gtcctgcctg cagcagcaca accctgcaca ccc 953 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SNCG promoter amplification <400> 2 cacaagccag ttcctgtcc 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SNCG promoter amplification <400> 3 gggtgtgcag ggttgtg 17

Claims (38)

  1. 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로, 상기 발현 카세트가 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 목적한 핵산에 작동적으로 연결된 망막 신경절 세포내에서 프로모터 활성을 갖는 길이가 1.5 kb 미만인 핵산을 포함하고, 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산이 서열 번호: 1의 서열, 또는 서열 번호: 1과 적어도 99% 상동성(identity)을 갖는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    프로모터 활성을 갖는 상기 핵산이 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell)의 특이적인 프로모터 활성을 갖는, 바이러스 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서,
    프로모터 활성을 갖는 상기 핵산이 1.2kb 미만의 길이를 갖는, 바이러스 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서,
    프로모터 활성을 갖는 상기 핵산이 1kb 미만의 길이를 갖는, 바이러스 벡터.
  5. 청구항 1에 있어서,
    프로모터 활성을 갖는 상기 핵산이 서열 번호: 1의 서열로 이루어지는, 바이러스 벡터.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 목적한 폴리펩타이드가, 눈질환 치료 단백질, 광유전학적 작동인자(optogenetic actuator) 또는 리포터 단백질(reporter protein)인, 바이러스 벡터.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 MT-ND4, MT-ND1, MT-ND6, MT-CYB, MT-CO3, MT-ND5, MT-ND2, MT-COI, MT-ATP6, MT-ND4L, OPA1, OPA3, OPA7 및 ACO2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 신경 영양인자, 항-세포자멸사 단백질(anti-apoptotic protein), 항-혈관형성 인자, 소염 인자(anti-inflammatory factor), 또는 막대세포-기원한 원뿔세포 생존능 인자(rod-derived cone viability factor: RdCVF)인, 바이러스 벡터.
  9. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 GDNF, CNTF, FGF2, BDNF 및 EPO로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경 영양인자인, 바이러스 벡터.
  10. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 BCL2 및 BCL2L1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-세포자멸사 단백질인, 바이러스 벡터.
  11. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 엔도스타틴, 안지오스타틴 및 sFlt로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-혈관형성 인자인, 바이러스 벡터.
  12. 청구항 6에 있어서,
    상기 눈질환 치료 단백질이 IL10, IL1R1, TGFBI 및 IL4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소염 인자(anti-inflammatory factor)인, 바이러스 벡터.
  13. 청구항 6에 있어서,
    상기 광유전학적 작동인자가 광유전학적 광활성화제(optogenetic activator)이거나 광유전학적 억제제인, 바이러스 벡터.
  14. 청구항 6에 있어서,
    상기 광유전학적 작동인자가 로돕신, 포톱신, 멜라놉신, 피놉신, 파라피놉신, VA 옵신, 페롭신, 뉴롭신, 엔세팔롭신, 레티노크롬, RGR 옵신, 적색-이동 스펙트럼 특성을 갖는 미생물 옵신(microbial opsin), Gi/o 시그날링을 보충할 수 있는 척추동물 옵신, 및 클리마이도모나스(Chlamydomonas) 속의 미세조류로부터의 채널로돕신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 광유전학적 광활성화제(optogenetic activator)인, 바이러스 벡터.
  15. 청구항 6에 있어서,
    상기 광유전학적 작동인자가 할로로돕신, 아르카에로돕신-3(AR-3), 아르카에로돕신(Arch), 박테리오로돕신, 프로테오로돕신, 크산토로돕신, 렙토스파에리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans) 진균 옵신(Mac), 및 크룩스할로로돕신 죠스(cruxhalorhodopsin Jaws), 로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 광유전학적 억제제인, 바이러스 벡터.
  16. 청구항 6에 있어서,
    상기 리포터 단백질이 형광성 단백질, 칼슘 인디케이터(calcium indicator), 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 및 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  17. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    프로모터 활성을 갖는 핵산과 연결된 목적하는 핵산이 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 및 DNAzyme으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  18. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적한 폴리펩타이드가 SNCG 단백질이 아닌, 바이러스 벡터.
  19. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적한 폴리펩타이드가 루시퍼라제가 아닌, 바이러스 벡터.
  20. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV 또는 SNV, 레트로바이러스 벡터, 비-병원성 파르보바이러스, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 파필로마 바이러스 벡터, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 벡터, 박시니아 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus) 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스(murine mammary tumor virus) 벡터 및 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  21. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍성 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍성 바이러스(FIV), 소 면역결핍성 바이러스(BIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 기원한 렌티바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
  22. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 바이러스 입자가, AAV-기원한 캡시드(capsid)를 더 포함하는, 바이러스 입자.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 바이러스 입자가, AAV-2, AAV-5, AAV2-7m8, AAV-9 및 AAV-8 혈청형 캡시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV-기원한 캡시드(capsid)를 더 포함하는, 바이러스 입자.
  25. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터를 포함하거나, 또는 상기 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 포함하는 세포.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 세포는 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell)인, 세포.
  27. 하기를 포함하는, 눈 질환(ocular disease)의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물:
    - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터; 또는 상기 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자; 또는 상기 바이러스 벡터 또는 상기 바이러스 입자를 포함하는 세포, 및
    - 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient).
  28. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    눈 질환(ocular disease)의 치료에 사용하기 위한, 바이러스 벡터.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 눈 질환이 망막 신경절 세포 변성 또는 광수용기 세포 변성과 관련된 눈 질환이거나 또는 유전성 시각 신경병증인, 바이러스 벡터.
  30. 청구항 22에 있어서,
    눈 질환의 치료에 사용하기 위한, 바이러스 입자.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 눈 질환이 망막 신경절 세포 변성 또는 광수용기 세포 변성과 관련된 눈 질환이거나 또는 유전성 시각 신경병증인, 바이러스 입자.
  32. 청구항 25에 있어서,
    눈 질환의 치료에 사용하기 위한, 세포.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 눈 질환이 망막 신경절 세포 변성 또는 광수용기 세포 변성과 관련된 눈 질환이거나 또는 유전성 시각 신경병증인, 세포.
  34. 청구항 27에 있어서,
    상기 눈 질환이 망막 신경절 세포 변성 또는 광수용기 세포 변성과 관련된 눈 질환이거나 또는 유전성 시각 신경병증인, 약제학적 조성물.
  35. 청구항 14에 있어서,
    상기 광유전학적 작동인자가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 광유전학적 광활성화제(optogenetic activator)인, 바이러스 벡터:
    ReaChR, 크림손, 및 크림손R으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적색-이동 스펙트럼 특성을 갖는 미생물 옵신(microbial opsin);
    단파장의 척추동물 옵신 및 장 파장의 척추동물 옵신으로 이루어진 그룹에서 선택되는, Gi/o 시그날링을 보충할 수 있는 척추동물 옵신; 및
    채널로돕신-1 및 채널로돕신-2 (클라마이도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)로부터)으로 이루어진 군에서 선택되는 클리마이도모나스(Chlamydomonas) 속의 미세조류로부터의 채널로돕신.
  36. 청구항 15에 있어서,
    상기 광유전학적 작동인자가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 광유전학적 억제제인, 바이러스 벡터:
    할로로돕신(NpHR), 향상된 할로로돕신(eNpHR2.0 및 eNpHR3.0) 및 적색-이동된 할로로돕신 Halo57으로 이루어진 그룹에서 선택되는 할로로돕신; 및
    향상된 박테리오로돕신(eBR).
  37. 삭제
  38. 삭제
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