JP2019503664A - プロモーター及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトγシヌクレインの制御領域由来で且つ網膜神経節細胞においてプロモーター活性を有する核酸配列に関する。また、本発明は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された前記プロモーターを含む発現カセット又はベクター、及び該発現カセット又はベクターを含むウィルス粒子又は宿主細胞に関する。また、本発明は、眼疾患、特に網膜神経節細胞又は光受容体細胞の変性に関連する眼疾患の治療のための、前記発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は細胞の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬分野に関し、特に網膜神経節細胞又は光受容細胞の変性に関連する疾病の治療及び予防に関する。

網膜は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）と網膜神経感覚上皮の２つの部分に分けることができる。ＲＰＥは、網膜神経感覚上皮の機能を維持することに積極的に関わる。網膜神経感覚上皮は、光受容体と網膜神経節細胞（ＲＧＣ）とを含むニューラルネットワークとして組織される。光受容体は、光情報をＲＧＣに向かう電気情報に変換し、後者はその上皮から視覚野に視覚情報の送達することを担う。これらの異なる細胞タイプの間において、我々は、種々の光強度の状態及びコントラスト情報の増大に応答する網膜の適応を可能とするネガティブフィードバックを誘導する水平細胞等の制御機能を有する細胞を発見できる。

ＲＧＣの大部分は、網膜の内面（神経節細胞層）に位置するグルタミン酸作動性ニューロンである。それらの軸索は視神経を形成する。ＲＧＣのタイプは１５〜２０種程度存在する。ＲＧＣは視覚過程において重要な役割を担い、ＲＧＣの機能障害又は変性は失明を引き起こし得る。

視神経症と呼ばれる種々の病態は、ＲＧＣの根本的不足により引き起こされる。それらのいくつかは、ミトコンドリア遺伝子の変異により引き起こされるレーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）等の遺伝子疾患である。しかしながら、世界で７千万人が罹患し、先進国で失明を引き起こす２番目に重要な緑内障等の後天的視神経症も蔓延している。

これらの疾患の原因となる遺伝子又は神経保護因子をコードする遺伝子の健康な場合の神経節細胞における標的発現は、これらの視神経症の治療を可能とし得る。従って、遺伝子治療を提供するために、これらの細胞における強く且つ特異的な遺伝子発現を得ることができることが必須である。

さらに、ＲＧＣは、変性過程に直接に関わることなく処置標的となり得る。例えば、ＲＧＣは、光遺伝子ツールを用いて網膜を回復する処置のための標的となる遺伝性疾患（すなわち網膜色素変性）又は後天性疾患によって光受容体が失われた場合、疾患における光受容体の変性後に長期間存続する。これに関連して、ＲＧＣは、強く且つ制限された方法における感光性タンパク質の発現が視力回復の成功のために必須となる場合、細胞の変性と独立して細胞標的となる。

ＲＧＣのそれぞれのタイプのサイズ、形状及び突起は異なるのでＲＧＣの機能を研究することには多大の関心が持たれており、それらは視覚機能において全く異なるおそらく独立した役割を果たすと考えられているが、この問題について、現在は比較的わずかにしか知られていない。これらの細胞における遺伝子発現を作動できるプロモーター配列は、ＲＧＣを識別又は追跡でき、遺伝的にコードされた電圧又はカルシウム感受性タンパク質（すなわちＧＣａＭＰ）の発現を介してそれらの活性を観察できるであろう。

以前の最先端技術において、ＲＧＣにおける遺伝子発現は、ユビキタスプロモーター又は組織に特異的なプロモーターのいずれかの使用を通して得られていた。ユビキタスプロモーターは、組織において強いが制限されない発現パターンを供給する。真核生物ユビキタスプロモーターは、チキンβアクチン（ＣＢＡ）遺伝子若しくはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）由来のプロモーター、又は伸長因子１α（ＥＦ１アルファ）のプロモーターのいずれかである。ウィルス由来の他のユビキタスプロモーターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター又はＣＡＧ等の合成プロモーター配列を含む。しかしながら、ＣＭＶプロモーターの制御は、導入遺伝子の発現を変更することができる多くの細胞シグナル経路に依存することが証明されている。さらに、これらのプロモーターは、所定の細胞の型に制限されず、それらが導入された網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜のミュラーグリア細胞、及び毛様体、虹彩、角膜等の網膜の外部における他の視覚組織等の全ての細胞において発現を引き起こす。

網膜細胞に制限された遺伝子発現は、ＲＰＥ又は光受容体における発言を引き起こす組織特異的プロモーターを用いて得られてきた。ＲＰＥ６５、ＶＭＤ２及びＯＡ１に基づくプロモーターは、ＲＰＥ細胞において遺伝子発現を引き起こし、一方、ヒト（ＲＫ）若しくはウシ（ＲＨＯ）ロドプシンキナーゼのプロモーター、又はマウスオプシン（ｍＯＰ）のプロモーターは、光受容体に制限された発現を引き起こす。これらのプロモーターは、網膜に対して制限的であるが、ＲＧＣに有効ではない。

いくつかのタンパク質は、網膜のＲＧＣにおいて発現されると述べられてきた。これらのタンパク質の中で、Ｔｈｙ１−１（胸腺細胞抗原１−１）又はＢｒｎ３−ａタンパク質は、従来から神経節細胞のマーカーとして用いられている。しかしながら、Ｔｈｙ１−１タンパク質は、マクロファージ及び小膠細胞においても発現されるためＲＧＣに特異的ではない。さらに、Ｔｈｙ−１及びＢｒｎ３−ａは、神経節細胞のサブセットでのみ両方発現される。従って、これらのマーカーのプロモーター領域は、神経節細胞の全個体群における導入遺伝子の特異的発現を可能としないであろう。

近年、網膜に移送後に、網膜神経節細胞に制限的発現を引き起こすいくつかのプロモーター配列について述べられている。一つの配列は、ヒトコネキシン３６（ｃｘ３６）に基づく２．８ｋｂの配列であり、マウスのＲＧＣのサブタイプ及び非ヒト霊長類の小窩周辺のＲＧＣ特異的に発現を作動する(Yinet al., IOVS, 2011;52(5):2775-8; Dalkara et al., Sci Trans Med,2013;5(189):189ra76)。Simpson及びその共同研究者は、ＲＧＣで発現を作動する約３．３ｋＢの他のプロモーターエレメント（Ｐｌｅ２５、Ｐｌｅ５３及びＰｌｅ６７）を発表した(de Leeuw et al., Mol Ther Meth and Clin Dev, 2014;1:5)。

ガンマシヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＧ）も、網膜において発現されると説明されており、特に、ヒト及びげっ歯類のＲＧＣにおいてＢｒｎ３タンパク質とガンマシヌクレインの共局在について説明されている(Surgucheva et al, Mol Vis, 2008, 14, 1540-8)。しかしながら、その筆者らは、網膜の網状細胞及び筆者らによって識別されていない細胞におけるガンマシヌクレインに対する免疫反応性について述べ、また、Ｂｒｎ３−ａタンパク質は発現しない。さらに、その筆者らは、更なる非ＲＧＣ細胞株の研究において、非ＲＧＣ細胞株でガンマシヌクレインプロモーター活性が、開始ＡＴＧコドン、並びにＳＮＣＧ遺伝子の発現を制御する本質的役割を有すると説明されていたエクソン１及びイントロン１の上流の１２６０ｂｐの非コード５’フランキング領域を含むγ−シヌクレイン遺伝子の２１９５ｂｐ断片により支持されることを示した(Surgucheva et al., J Mol Neurosci, 2008, 35: 267-71)。

多くの組換型ウィルスベクターは、遺伝子治療の適用のためのインビボへの有効な遺伝子移入を可能とすることが説明されてきた。それらの中で、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、その非病原性、非挿入性及び低免疫原性の特性により重要な移送機構となる可能性が高い。加えて、ＡＡＶは、げっ歯類のＲＧＣにおいて極めて有効な形質導入を可能とすると説明されてきた。実際に、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）又はそのチロシン変異型の硝子体中への注射がマウスにおいてＲＧＣでのレポーター遺伝子の極めて有効な発現を引き起こすことを異なる研究チームにより示されている(Petrs-Silva et al., Mol Ther. 2009 Mar;17(3):463-71; Petrs-Silva etal., Mol Ther. 2011 Feb;19(2):293-301)。しかしながら、小サイズであるため、ＡＡＶのＤＮＡペイロードは大幅に制限され、従来技術において述べられていたＲＧＣ特異的プロモーター等の大きいプロモーターの使用と互換性がない。

結果として、ＲＧＣにおいて導入遺伝子の強くて安定し且つ特異的な発現を可能とし、ＡＡＶベクターを用いて遺伝子導入するのに特に適する小型のプロモーターを開発する強い必要性がある。

本発明者らは、ここで、ＡＡＶベクターと組み合わせて使用するのに適し、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に特異的に高レベルの遺伝子発現を作動できる新規の短い転写プロモーターを提供する。

従って、第１の態様において、本発明は、網膜神経節細胞においてプロモーター活性を有する単離された核酸に関し、該核酸は、１．５ｋｂ未満の長さを有し、
配列番号１の配列、
配列番号１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、
配列番号１の配列のうち連続する少なくとも５００ヌクレオチドを含む配列、及び、
配列番号１の核酸配列又はその相補鎖と中度の厳格条件下でハイブリダイズできる配列、からなる群から選択される配列を含む。

好ましくは、単離された核酸は、網膜神経節細胞に特異的なプロモーター活性を有する。

好ましくは、本発明の核酸は、１．５ｋｂ未満の長さを有し、配列番号１の配列、及び配列番号１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するその機能性変異体の配列からなる群から選択される配列を含む又はからなる。特に、本発明の核酸は、配列番号１の配列に対して少なくとも８０％若しくは９０％の同一性を有する配列を含み得る若しくはからなり得る、又は配列番号１の配列を含み得る若しくはからなり得る。

好ましくは、本発明の核酸は、１．２ｋｂ未満、より好ましくは１ｋｂ未満の長さを有する。

第２の態様において、本発明は、目的のポリペプチド又は核酸、好ましくは目的のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された本発明の核酸を含む発現カセットに関する。

特に、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、光遺伝学的アクチュエータ又はレポータータンパク質であってもよい。好ましくは、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質又は光遺伝学的アクチュエータである。

特に、治療用タンパク質は、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７及びＡＣＯ２からなる群から選択されてもよく、又は好ましくはＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ及びＥＰＯからなる群から選択される神経栄養因子、好ましくはＢＣＬ２及びＢＣＬ２Ｌ１からなる群から選択される抗アポトーシスタンパク質、好ましくはエンドスタチン、アンジオスタチン及びｓＦｌｔからなる群から選択される抗血管新生因子、好ましくはＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ及びＩＬ４からなる群から選択される抗炎症因子、若しくは杆体由来の錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）であってもよい。

光遺伝学的アクチュエータは、好ましくはロドプシン、フォトプシン、メラノプシン、ピノプシン、パラピノプシン、ＶＡオプシン、ペロプシン、ニューロプシン、エンセファロプシン、レチノクロム、ＲＧＲオプシン、赤色にシフトした分光特性を有するＲｅａＣｈＲ、Ｃｈｒｉｍｓｏｎ若しくはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ等の微生物性オプシン、Ｇ_ｉ／Ｏシグナルをリクルートできる短波長脊椎動物オプシン若しくは長波長脊椎動物オプシン等の脊椎動物オプシン、Chlamydomonas属の微細藻類由来のチャンネルロドプシン−１及びチャンネルロドプシン−２（Chlamydomonas reinhardtii由来）等のチャンネルロドプシン、並びにそれらの変異体からなる群から選択される光遺伝学的活性化因子であってもよく、又は好ましくはハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、増強型ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ２．０及びｅＮｐＨＲ３．０）及び赤色にシフトしたハロロドプシン、Ｈａｌｏ５７、古細菌ロドプシン−３（ＡＲ−３）、古細菌ロドプシン（Ａｒｃｈ）、増強型バクテリオロドプシン（ｅＢＲ）等のバクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、Leptosphaeria maculans真菌オプシン（Ｍａｃ）、クラックスハロロドプシンＪａｗｓ、並びにそれらの変異体からなる群から選択される光遺伝学的阻害因子であってもよい。

また、目的のポリペプチドは、好ましくは蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びそれらの変異体から選択されるレポータータンパク質であってもよい。

好ましい実施形態において、目的のポリペプチドは、ＳＮＣＧタンパク質及び／又はルシフェラーゼではない。

代替的に、本発明の核酸は、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムからなる群から選択される目的の核酸をコードする核酸に作動可能に連結されていてもよい。

第３の態様において、本発明は、好ましくはウィルスベクター、より好ましくはレトロウィルスベクター、特にレンチウィルスベクター又は非病原性パルボウィルスといった本発明の発現カセットを含むベクターに関する。該ベクターはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであってもよく、目的のポリペプチド又は核酸をコードする核酸に隣接する２つのＩＴＲを含んでいてもよい。

他の態様において、本発明は、本発明のベクターを含むウィルス粒子に関する。特に、ＡＡＶ粒子は、当該ベクター、及び好ましくはＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７ｍ８（ＡＡＶ２−７ｍ８）、ＡＡＶ−９及びＡＡＶ−８血清型カプシド、より好ましくはＡＡＶ−２又はＡＡＶ２−７ｍ８カプシド等のＡＡＶ−２由来カプシドから選択されるＡＡＶ由来カプシドを含む。

更なる態様において、本発明は、本発明の発現カセット、ベクター又はウィルス粒子により形質転換された細胞、好ましくは網膜神経節細胞に関する。

更なる態様において、本発明は、本発明の核酸、発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は細胞、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。

他の態様において、本発明は、眼疾患の治療に用いるための、本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は細胞に関する。

好ましくは、該眼疾患は、網膜神経節細胞変性に関連する疾患から選択され、より好ましくはレーバー遺伝性視神経萎縮症又は優性視神経萎縮症等の遺伝性神経症、及び加齢黄斑変性、錐体杆体変性、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜剥離、ベスト病、網膜色素変性、先天性脈絡膜欠如又は色素上皮網膜変性等の光受容体細胞変性に関連する疾患から選択される。

更なる態様において、本発明は、目的のポリペプチド又は核酸をコードする核酸を網膜神経節細胞に発現する、好ましくは網膜神経節細胞に特異的に発現するための、本発明の核酸、発現カセット、ベクター又はウィルス粒子の使用に関する。また、本発明は、網膜神経節細胞に本発明の核酸、発現カセット、ベクター又はウィルス粒子を導入することを含む網膜神経節細胞に目的のポリペプチド又は核酸を発現する方法、好ましくは網膜神経節細胞に特異的に目的のポリペプチド又は核酸を発現する方法に関する。

ＳＮＣＧ遺伝子及びプロモーター配列を示す略図である。ＳＮＣＧ遺伝子は第１０染色体（１０ｑ２３．３）に位置する。それは、＋１転写サイトから５番目のエクソンの最後まで３．５ｋｂ以上に亘る５つのエクソンを含む。マルチメリン２遺伝子（ＭＭＲＮ２）の１番目のエクソンは、＋１ＳＮＣＧ転写サイトの８６３ｂｐ下流に位置する。ＳＮＣＧプロモーターのヒト配列を抽出するために、−７８５から＋１６３の領域（矢印で示す）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ−Ｄ／ＴＯＰＯ内にサブクローニングし、配列決定を行った。その配列は、ＧｅｎｅＩＤ６６２３のＩＤでＧｅｎｅｂａｎｋ登録された配列と同一であった。そして、ＳＮＣＧプロモーター配列（配列番号１）の制御下でｅＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶベクターを生成した。 上段：ｈＳＮＣＧプロモーターは、マウスＲＧＣにおいて高い発現を引き起こす。Ａ〜Ｃは、AAV2-y444f-hSNCG-GFPの硝子体内注射後４週間のマウスの網膜における写真であり、Ａは眼底の画像であり、Ｂは網膜のフラットマウントであり、Ｃはクリオスタット切片である。下段：ＰＧＫプロモーターは、網膜における複数の細胞タイプにわたって高い発現を引き起こす。Ｄ〜Ｆは、AAV2-y444f-PGK-GFPの硝子体内注射後４週間のマウスの網膜における写真であり、Ｄは眼底の画像であり、Ｅは網膜のフラットマウントであり、Ｆはクリオスタット切片である。 ＡはAAV2-CMV-GFP(上段)及びAAV2-hSNCG-GFP (下段)の硝子体内注射後におけるマウス網膜の網膜フラットマウントの共焦点顕微鏡画像であり、ＢはAAV2-hSNCG-GFPの硝子体内注射後のマウス網膜の断片の共焦点顕微鏡画像である。 眼底の蛍光画像によりカニクイザルの網膜の黄斑部におけるＧＦＰの発現の評価である。ＡはＳＮＣＧプロモーター、ＢはＣＭＶプロモーターをそれぞれ含むＡＡＶ−ＧＦＰベクターを硝子体内注射で投与した。ＧＦＰが発現した領域は暗視野において白く現れる。カメラは露光時間を自動で調節し、導入箇所（網膜中心窩輪の周辺）及びバックグラウンドにほとんど差がないものの、Ａの画像では暗視野において非常に大きい強度のＧＦＰ発現が見られたが、Ｂの画像では弱いＧＦＰ発現が見られた。 ＳＮＣＧプロモーターは、マウスＲＧＣにおいてＣＭＶプロモーターよりもhCatCh-GFPを高いレベルで発現する。Ａは５×１０^９ｖｇのAAV2-SNCG-hCatCh-GFP(右)又はAAV2-CMV-hCatCh-GFP (左)のいずれかをｒｄ１マウスの網膜に注射した後の代表的な眼底画像である。Ｂは同一の注射投与系から得られた網膜のフラットマウントであり、ＳＮＣＧプロモーター（右）及びＣＭＶプロモーター（左）で得られたCatCh-GFPの蛍光を示す。ＣはAAV2-SNCG-hCatCh-GFP又はAAV2-CMV-hCatCh-GFPのいずれかをｒｄ１マウスの網膜に注射して、Ｂｒｎ３ａ陽性、ＧＦＰ陽性及び二重標識細胞を定量した結果を示す。網膜の中心領域及び周縁領域において選択された視野における細胞計測のための神経節細胞層を横断する共焦点多層投影を用いた。その領域は、各四分円で選択し、細胞数はｍｍ^２毎のＢｒｎ３ａ陽性、ＧＦＰ陽性及び共標識細胞の数の平均である。エラーバーはＳＥＭを示す。ＤはSNCG-CatCh-GFPが導入されたｒｄ１マウスの網膜のＲＧＣ層を横断する代表的な共焦点多層投影像であり、Ｂｒｎ３ａ（赤色）及び抗ＧＦＰ（緑色）抗体で共標識した。ＥはSNCG-CatCh-GFPが注射された網膜における代表的な網膜フラットマウントから得られた横断面であり、Ｂｒｎ３ａ（赤色）及び抗ＧＦＰ（緑色）で共標識し、核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。 ｒｄ１マウスの網膜及び皮質における機能的ＣａｔＣｈ応答を示す。Ａ及びＢは、５×１０^７、５×１０^８及び５×１０^９ｖｇ／眼（ｎ＝４）でＣＭＶ（黒色）又はＳＮＣＧ（灰色）の制御下でＣａｔＣｈを発現する網膜において、１０^１４ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓ（Ａ）又は１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓ（Ｂ）のいずれかで４８０ｎｍにおける光応答を示す自発的活動を有する細胞の割合を示す。５×１０^９ウィルス粒子量（ｎ＝４、１５５細胞）でのＣＭＶプロモーターの制御下でＣａｔＣｈを発現する網膜における光強度の関数として応答の大きさ（最大輝度で得られた応答に正規化）を示す。Ｄは５×１０^７ウィルス粒子量（ｖｇ／眼）（明灰色、ｎ＝４網膜、１５８細胞）、５×１０^８ウィルス粒子量（ｖｇ／眼）（暗灰色、ｎ＝４網膜、２２１細胞）及び５×１０^９ウィルス粒子量（ｖｇ／眼）（黒色、ｎ＝４網膜、２６１細胞）でのＳＮＣＧプロモーターの制御下でＣａｔＣｈを発現する網膜における光強度の関数として応答の大きさ（最大輝度で得られた応答に正規化）を示す。ＥはＳＮＣＧプロモーターの制御下でＣａｔＣｈを発現する網膜において４８０ｎｍでの全視野におけるフラッシュの際の光応答又はスパイク頻度の増大を示すラスタープロット及び刺激前後時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ）である。なお、ＳＮＣＧプロモーターを用いると、そのカーブは最大ＡＡＶベクター量でプラトーに達した。Ｆ、Ｇ、Ｈは、３つの異なる増大する光強度（１０^１５、１０^１６及び１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓ）での全視野における４７５ｎｍのフラッシュに応答してＳＮＣＧ−ＣａｔＣｈを発現するｒｄ１マウスの視覚野ニューロンのＰＳＴＨ（上段）及び対応するラスタープロット（下段）である。Ｉは５×１０^９ｖｇ量を用いてＳＮＣＧ−ＣａｔＣｈ処理されたｒｄ１の網膜において、非処理のｒｄ１の網膜及び野生型マウスの網膜と比較して記録された視覚誘発電位（ＶＥＰ）の結果を示す。Ｊは４７５ｎｍでの光強度の関数としての正規化された皮質活性（スパイク及びＶＥＰ）を示す（ｎ＝３マウス）。エラーバーはＳＥＭを示す。 ＡＡＶ−ＣａｔＣｈが導入されたＮＨＰにおけるインビボ眼科学的試験を示す。Ａは後部ブドウ膜炎の弱いから強いまでのグレードを示し、Ｂは硝子体混濁の最小から重症までのグレードを示す。 高用量のＡＡＶ２−ＣａｔＣｈを導入されたＮＨＰの導入後３ヶ月における眼の病理組織学的試験を示す。Ａは４０倍の分解能で画像化された眼の垂直軸を横断する網膜切片を示す。Ｂ〜Ｆは、Ａからの拡大画像における繊維柱帯網（Ｂ）、毛様体（Ｃ）、視神経（Ｄ）、虹彩（Ｅ）及び網膜（Ｆ）において、リンパ球、マクロファージ又は眼構造へのダメージが検出されないことを示す。 Ａは導入後３ヶ月の小窩輪の周辺におけるＣａｔＣｈ発現を示す解剖前のＮＨＰ１の黄斑部である。ＢはＭＥＡ記録及びＲＧＣ免疫標識後の同一の小窩領域の半分を示す。網膜フラットマウントはＢｒｎ３ａ（赤色）及びＧＦＰ抗体（緑色）で染色した。Ｃは同一の用量で導入された他のマカクの導入後３ヶ月における網膜の小窩領域を示す。網膜フラットマウントは抗チャンネルロドプシン抗体（緑色）で染色した。核はＤＡＰＩで染色した。Ｄは１０Ｅ１２ｖｇ／眼の量でAAV2-SNCG-CatCh（上段）又はAAV2-CMV-CatCh（下段）を導入されて６ヵ月後のマカクの網膜の小窩の代表的部分を示す。網膜フラットマウントは抗チャンネルロドプシン抗体（緑色）で染色した。 ＣａｔＣｈ媒介単一細胞の光応答の特性を示す。ＡはＡＡＶ２−ｈＣａｔＣｈ（ＧＦＰタグ無し）が導入されたＮＨＰ２の小窩周辺領域を示す網膜切片であり、そこに光応答性神経節細胞をパッチした。Ｂは記録の上のスパイク頻度のカーブに見られるように光刺激の際のスパイク及びその頻度の増加を示すセルアタッチモードにおけるＲＧＣ記録を示す。Ｃは−６０ｍＶでパッチクランプされた細胞の光電流応答を示す。Ｄは４５０ｎｍ付近の光電流振幅ピークを示すパッチされたＲＧＣの作用スペクトルを示す。Ｅは２〜２２Ｈｚの範囲の頻度の増大におけるフリッカー刺激を示す。Ｂ〜Ｅにおける細胞は、Ｌ−ＡＰ４パーフュージョン下で１．４６×１０^１６ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓの光強度の４７０ｎｍにおいてＡで示す領域から記録された。Ｆ、Ｇは膜結合発現で形質移入された高密度の細胞を示すAAV2-hCatCh-GFPを導入されたＮＨＰ１の小窩周辺領域の二光子画像を示す。Ｈは−６０ｍＶでパッチクランプされ、光電流を示す（左）又はセルアタッチモードで記録され、光刺激の際に増加したスパイク頻度を示す（右）代表的な２つの細胞の応答である。 導入後６ヶ月のＮＨＰの網膜におけるＣａｔＣｈを発現するＲＧＣからの単一細胞の記録である（セルアタッチ及びパッチクランプ）。５×１０^１１ｖｇ／眼の濃度でAAV2-CMV-hCatCh（左）又はAAV2-SNCG-hCatCh（右）を導入され、導入後６ヶ月の霊長類の網膜において、光応答を示す又は示さない小窩周辺の記録細胞の総数を示す。ＢはＡと同一試験であるが１×１０^１２ｖｇ／眼の濃度とした。Ｃはウィルス量（５×１０^１１又は１×１０^１２ｖｇ／眼）及びプロモーター（ＣＭＶ又はＳＮＣＧ）の関数としての応答細胞の割合を示す。Ｄは導入６ヵ月後の増大する強度の光に応答するＲＧＣの最大発生頻度を示す。応答細胞の４つの異なる群は図に示されており、低用量及び高用量で試験された２つのプロモーターを示す。Ｅは導入６ヶ月後の増大する強度の光に応答するＲＧＣのピーク光電流（−６０ｍＶで記録された内向き電流）を示す。２つのカーブは１×１０^１２ｖｇ／眼で試験された２つのプロモーターを示す。 導入から３ヶ月及び６ヶ月後のＮＨＰの網膜において、ＣａｔＣｈを発現するＲＧＣのＭＥＡを記録した。Ａは５×１０^１１ｖｇ／眼でのAAV2-SNCG-hCatCh-GFP（上段）及びAAV2-SNCG-hCatCh（下段）を導入された霊長類の網膜における導入から３ヵ月後の光強度の増大に伴う応答するニューロンの発火率（それらの自発的活動の割合として示す）に基づくグレースケールマップを示す。黄斑領域は写真中で破線の楕円で示す。ＢはAAV2-SNCG-hCatCh-GFPを導入された霊長類の網膜におけるＬ−ＡＰ４の適用後に、４８０ｎｍで視野全体にフラッシュを行った際の神経節細胞の応答のラスタープロット及び刺激前後時間ヒストグラムを示す。ＣはｈＣａｔＣｈを発現する霊長類の網膜におけるＬ−ＡＰ４の適用後の１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓでの平均スペクトル同調を示す。Ｄは異なる刺激強度に対する平均正規化応答を示す。Ｅは導入から６ヵ月後の増大する強度の光に応答するＲＧＣの放電周波数を示す。各線は、高用量群でｎ＝２の網膜、及び低容量群でｎ＝３の網膜における正規化された放電周波数を示す AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomatoが導入された２匹のマカクの眼底の蛍光画像を示す。画像は、導入した日、導入後１ヶ月及び２ヶ月に得られた画像であり、それらの時点で検出可能な蛍光は示さない。ＬＥは左目、ＲＥは右目である。 AAV2-7m8-SNCG-ChrimsonR-tdTomatoが導入された２匹のマカクの眼底の蛍光画像を示す。画像は、導入した日、導入後１ヶ月及び２ヶ月に得られた画像であり、導入後１ヶ月からChrimson-tdTomatoに関わる強い蛍光（白色）が見られる。ＬＥは左目、ＲＥは右目である。 Ａ、Ｃ、Ｅ、ＧはＣＡＧプロモーター（Ａ及びＣ）並びにＳＮＣＧプロモーター（Ｅ及びＧ）における霊長類の中心窩近傍のマルチ電極アレイの画像を示し、黒い点は電極アレイによるものである（１００μｍ間隔）。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈは全ての記録領域における１０ｍｓｅｃでの全視野刺激（強度：×１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ^２．ｓｅｃ^−１）に対する応答を色分けした図であり、Ｂ及びＤはＣＡＧプロモーターを用い、Ｆ及びＨはＳＮＣＧプロモーターを用いた。全て同一の色スケールを用いた。 落射蛍光顕微鏡（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び二光子顕微鏡（Ｄ）で観察された霊長類の中心窩近傍の自然蛍光を示す画像である。ＡはＣＡＧプロモーターを用い、異なる倍率で２匹の霊長類の左及び右の中心窩近傍から得られた画像である（上段はＮＨＰ４霊長類、下段はＮＨＰ３霊長類）。ＢはＳＮＣＧプロモーターを用い、異なる倍率でＮＨＰ１霊長類の左の中心窩近傍から得られた画像であり、ChrimsonR-tdTomatoの発現の蛍光スポットを示す中心窩の周縁領域を示す。ＣはＢと同様であるが、ＮＨＰ１霊長類の右の中心窩近傍である（矢印で示す）。Ｄは２つの異なるプロモーター（左がＣＡＧ、右がＳＮＣＧ）を用いた２匹のサルの中心窩周縁から得られた二光子ライブ画像を示す。

本発明者らは、ヒトγシヌクレイン遺伝子の制御領域由来のプロモーター配列を同定した。このプロモーターは１ｋｂ未満の長さを有し、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に特異的に高レベルの遺伝子発現をさせ得る。その短さのおかげでこのプロモーターは、ＡＡＶ関連遺伝子輸送に簡便に用いられ、長い遺伝子の輸送に特に適する。本発明者らは、ＡＡＶカプシドと組み合わせられたこのプロモーターがマウス及び非ヒト霊長類の両方のＲＧＣにおいて強く且つ特異的な導入遺伝子の発現を引き起こすことを証明した。実際に、同一用量のＡＡＶにおいて、このプロモーターはユビキタスＣＭＶプロモーターよりも、ＲＧＣにおける導入遺伝子の強い発現を引き起こした。さらに、本発明者らは、霊長類においてもこのプロモーターがＣＭＶプロモーターよりも強かったことを示した。

（定義）
本明細書で用いられる「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸といった任意の長さの高分子型ヌクレオチドを意味する。従って、この用語は、以下のものに限られないが、一本鎖、二本鎖若しくは多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、若しくは他の天然の、化学的若しくは生化学的修飾を受けた、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドの骨格は、（典型的にＲＮＡ又はＤＮＡで見られるように）糖及びリン酸基を含み、又は修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含み得る。代替的に、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミダート等の合成サブユニットを含んでもよく、またオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダート（Ｐ−ＮＨ_２）又はホスホロアミダート−ホスホジエステルオリゴマー混合物であってもよい。本発明の核酸は、化学的合成、組換え及び突然変異誘発を含む当業者に周知のいずれの方法により調製されてもよい。好ましい実施形態に置いて、本発明の核酸は、好ましくは当業者に周知の組換え方法により合成されたＤＮＡ分子である。

本明細書において用いられる「単離された核酸」は、自然環境の構成成分から同定及び分離及び／又は回収された核酸分子を意味する。特に、この用語は、核酸の自然発生源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を意味する。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」の用語は、ゲノムＤＮＡが自然に関連する染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に天然に隣接する配列から離れている。

本明細書において用いられる「プロモーター」の用語は、作動可能に連結された核酸の転写を指示する調節エレメントを意味する。プロモーターは、作動可能に連結された核酸の転写の割合及び効率の両方を制御できる。プロモーターは、核酸のプロモーター依存的転写の増強（エンハンサー）又は抑制（リプレッサー）する他の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。

本明細書において用いられる「プロモーター活性」の用語は、作動可能に連結された核酸の転写を開始するプロモーターの能力を意味する。プロモーター活性は、周知の方法又は実施例において説明する方法を用いて測定され得る。例えば、プロモーター活性は、ノーザンブロッティング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより、転写されたｍＲＮＡの量で測定され得る。代替的に、プロモーター活性は、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、比色分析法、レポーター遺伝子アッセイを含む他の活性分析法、及び他の周知又は実施例に記載の方法によって翻訳されたタンパク質生成物の量で測定され得る。

本明細書において用いられる「作動可能に連結された」の用語は、一つの核酸配列の機能が他の核酸配列により影響されるように単一の核酸分子において複数の核酸配列同士が関連されることを意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合に、コード配列に作動可能に連結されている。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するものとして互換可能に用いられ、最小の長さについて限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然アミノ酸残基を含んでもよく、以下のものに限られないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体及び多量体を含み得る。全長タンパク質及びその断片の両方は、上記定義に含まれる。また、その用語は、例えばグリコシル化、シアル化、アセチル化及びリン酸化等のポリペプチドの発現後修飾体を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質の所望の活性が維持される限り、天然配列に対して欠失、付加及び置換（通常、自然に保存されている）等の変異を含むタンパク質を意味し得る。それらの変異は、特定部位の突然変異誘発等の意図的なものであってもよく、又はタンパク質を生成する宿主における変異若しくはＰＣＲ増幅によるエラー等の偶然のものであってもよい。

本明細書で用いられる「網膜神経節細胞」又は「ＲＧＣ」の用語は、置換されたアマクリン細胞を除いて網膜の最も内側の層のニューロンを意味する。それらは、網膜の双極細胞を介して光受容体から情報を統合し、脳に投影し、それらは視床、視床下部及び上丘におけるシナプスである。神経系転写因子ＢＲＮ３Ａ（ＧｅｎｅＩＤ：５４５７）は、ＲＧＣに特異的に発現することが発見され、このタンパク質に対する抗体は、ＲＧＣの同定及び定量のための信頼できるマーカーと考えられている(Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604)。従って、特定の実施形態に置いて、「網膜神経節細胞」又は「ＲＧＣ」の用語は、ＢＲＮ３Ａを発現する網膜の最も内側の層のニューロンを意味する。

本明細書において用いられる「配列同一性」又は「同一性」の用語は、２つのポリヌクレオチド配列のアライメントからの位置における一致（同一の核酸残基）の数（％）を意味する。配列同一性は、オーバーラップ及び同一性を最大化する一方でシークエンスギャップを最小化するように整列された配列同士の比較により決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、多数の数学的なグローバル又はローカルアライメントアルゴリズムのいずれかを用いて決定されてもよい。類似する長さの配列同士は、全体の長さにわたって最適に配列同士を整列するグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970）を用いて整列されることが好ましく、一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えばスミス・ウォーターマンアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）又はアルチュールアルゴリズム（Altschulet al., 1997; Altschul et al., 2005））を用いて整列されることが好ましい。核酸配列の同一性の割合を決定する目的のためのアライメントは、例えばhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/等のウェブサイトで公に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて当業者に周知の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較される配列同士の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要とされるアルゴリズムを含むアライメントを測定するための適切なパラメーターを決定できる。本明細書において、この目的のために、核酸配列同一性の値（％）は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを用いて２つの配列の最適なグローバルアライメントを生成する対配列アライメントプログラムであるEMBOSS Needleを用いて生成された値を意味し、全てのサーチパラメーターは初期値に設定し、すなわち、Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gappenalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5とした。

「対象」又は「患者」の用語は、網膜を有する動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味し、それは大人、子供及び胎児期のヒトを含む。

第１の態様において、本発明は、網膜神経節細胞においてプロモーター活性を有し、２ｋｂ未満の長さを有し、配列番号１の配列及びその機能性変異体からなる群から選択される配列を含む又はからなる核酸、好ましくは単離された核酸に関する。

配列番号１のヌクレオチド配列は、ヒトγシヌクレイン遺伝子（シンボル：ＳＮＣＧ；ＧｅｎｅＩＤ：６６２３）の制御領域由来である。この遺伝子は、神経変性疾患の病因に関わると考えられているシヌクレインファミリータンパク質のメンバーである。さらに、その遺伝子の変異は乳がんの増殖に関連することが発見されている。当該遺伝子は、第１０染色体に位置する（１０ｑ２３．２−ｑ２３．３）（Genebank accession number NC_000010.11、86958531位置から86963260まで）。図１に示すように、配列番号１のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子の５’制御領域の９５３ヌクレオチドを含む（−７８９位置から＋１６４位置まで、タンパク質の開始コドンは＋１６８位置）。

本発明の核酸は、ＲＧＣにおいてプロモーター活性を示す、すなわちＲＧＣに導入された場合にそれに作動可能に連結された核酸の転写が開始され得る。好ましくは、プロモーター活性はＲＧＣ特異的である。「ＲＧＣ特異的」の用語は、網膜神経節細胞においてプロモーターが主に活性であることを意味すると理解されるであろう。他の組織又は細胞における概して低い残余の発現は完全には除去されないと理解されるであろう。好ましい実施形態において、本発明のプロモーターは、双極性細胞、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラー細胞又は光受容体の細胞において非活性である。

一実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１の配列を含む又はからなる。

他の実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１の機能性変異体を含む又はからなる。

本明細書において用いられる「変異体」の用語は、元の配列と異なるヌクレオチド配列を意味するが、元の本質的特性を維持する。一般に、変異体は全体として元のポリヌクレオチドと極めて類似しており、多くの領域においては同一である。変異体の配列は、その配列において１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入により異なっていてもよく、それはプロモーター活性を損なっていない。変異体は、元の配列と同一の長さを有していてもよく、又はより短い若しくは長くてもよい。

「機能性変異体」の用語は、配列番号１のプロモーター活性を示す、すなわちＲＧＣにおけるプロモーター活性を示す、好ましくはＲＧＣ特異的なプロモーター活性を示す配列番号１の変異体を意味する。

一実施形態において、本発明のプロモーターは、
配列番号１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、
配列番号１の少なくとも１００の連続するヌクレオチドを含む配列、及び、
配列番号１の核酸配列又はその相補鎖に対して低い、中度又は高い厳格条件下でハイブリダイズできる配列、からなる群から選択される配列番号１の機能性変異体を含む又はからなる。

特定の実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１の配列に対して少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、好ましくは配列番号１の全体配列を有する機能性変異体を含む又はからなる。本発明のプロモーターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の置換、欠失及び／又は挿入によって配列番号１のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。

他の特定の実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００の連続するヌクレオチドを含む配列を有する機能性変異体を含む又はからなる。好ましくは、それは、配列番号１の少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含む配列を有する機能性変異体を含む又はからなる。

更なる特定の実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１の核酸配列又はその相補鎖に対して低い、中度又は高い厳格条件下で、好ましくは中度の厳格条件下、より好ましくは高い厳格条件下でハイブリダイズできる配列を有する機能性変異体を含む又はからなる。

本明細書において用いられる「低い厳格条件」は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの断片化変性サケ***ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミドを含む溶液中で、標準のサザンブロッティング法に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２〜２４時間行うことを意味する。最後に、キャリア材料に対して、５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて１５分間の洗浄を３回行った。

本明細書において用いられる「中度の厳格条件」は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの断片化変性サケ***ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミドを含む溶液中で、標準のサザンブロッティング法に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２〜２４時間行うことを意味する。最後に、キャリア材料に対して、５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて１５分間の洗浄を３回行った。

本明細書において用いられる「高い厳格条件」は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの断片化変性サケ***ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミドを含む溶液中で、標準のサザンブロッティング法に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２〜２４時間行うことを意味する。最後に、キャリア材料に対して、６５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて１５分間の洗浄を３回行った。

本発明のプロモーター配列の主な利点の１つは、その小さいサイズである。実際に、本発明のプロモーターは、２ｋｂ未満の長さを有し、従って、ＡＡＶベクターに用いるのに特に適し、ＤＮＡペイロードが厳格に制限される。

好ましい実施形態において、本発明のプロモーターの長さは１．５ｋｂ未満であり、好ましくは１．４、１．３、１．２、１．１又は１ｋｂ未満の長さであり、より好ましくは９９０、９８０、９７０又は９６０ｂ未満の長さである。

いくつかの実施形態において、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子、特にヒトのＳＮＣＧ遺伝子に作動可能に連結しない。いくつかの他の実施形態において、本発明のプロモーターは、レポータータンパク質をコードする遺伝子、特にルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結しない。好ましくは、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子、又はルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結しない。

第２の態様において、本発明は、目的の核酸に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む発現カセットに関する。

本発明のプロモーターに作動可能に連結された核酸は、目的のポリペプチド又は目的の核酸をコードしてもよい。

本明細書において用いられる「発現カセットの用語」は、コード配列及び該コード配列の発現のために必要な１つ又はそれ以上の制御配列を含む核酸コンストラクトを意味する。特に、それらの制御配列の１つは、本発明のプロモーターである。一般に、発現カセットは、コード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要な前記コード配列の前の（５’非コード配列）及び後ろの（３’非コード配列）制御配列とを含む。従って、発現カセットは、通常、プロモーター配列と、コード配列と、ポリアデニル化領域及び／又は転写ターミネーターを通常含む３’非翻訳領域とを含む。また、発現カセットは、例えばエンハンサー配列、ベクター内へのＤＮＡ断片の挿入を促進するポリリンカー配列、及び／又はスプライシングシグナル配列等の追加の調節エレメントを含んでもよい。発現カセットは、通常クローニング及び形質転換を容易にするためにベクター内に含まれる。

好ましくは、本発明のプロモーターは、異種核酸に作動可能に連結されている。本明細書において用いられる「異種」の用語は、天然起源のゲノムにおいて当該プロモーターに作動可能に連結された核酸以外の核酸を意味する。特に、いくつかの実施形態において、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子、特にはヒトＳＮＣＧ遺伝子に作動可能に連結されていない。いくつかの他の実施形態において、本発明のプロモーターは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されていない。好ましくは、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子にもルシフェラーゼをコードする遺伝子にも作動可能に連結されていない。

一実施形態において、本発明のプロモーターに作動可能に連結される核酸は、目的のポリヌクレオチドをコードする。

目的のポリヌクレオチドは、ＲＧＣにおいて発現が望まれるいずれかのポリペプチドであってもよい。特に、目的のポリペプチドは、治療用ポリペプチド、レポータータンパク質又は光遺伝学的アクチュエータであってもよい。

一実施形態において、本発明のプロモーターに作動可能に連結される核酸は、治療用遺伝子、すなわち治療用ポリペプチドをコードする遺伝子である。

本明細書において用いられる「治療用遺伝子」の用語は、病態の治療に有益である治療用タンパク質をコードする遺伝子を意味する。発現された治療用遺伝子は、それが存在する細胞又は組織に有益な効果を与える。有益な効果の例は、体調若しくは疾病の兆候若しくは症状の改善、体調若しくは疾病の予防若しくは抑制、又は所望の特性の付与を含む。治療用遺伝子は、患者における遺伝子欠損の部分的又は全体的な改善をする遺伝子を含む。特に、治療用遺伝子は、以下のものに限られないが、対象の細胞又は組織においてタンパク質の欠損、欠陥又は最適量以下により引き起こされる欠乏症を緩和するための遺伝子治療に有用なタンパク質をコードする核酸であってもよい。治療用ポリペプチドは、例えばＲＧＣにおいて存在しない、欠陥がある又は最適量以下で存在するポリペプチド及び／又は酵素活性を提供してもよく、また、ＲＧＣにおいて不安定を間接的に中和するポリペプチド及び／又は酵素活性であってもよい。また、治療用ポリペプチドは、例えばドミナントネガティブポリペプチドとして作用することによりポリペプチドの活性を低減するのに用いられてもよい。好ましくは、治療用ポリペプチドは、ＲＧＣにおいて存在しない、欠陥があるまたは最適量以下存在するポリペプチド及び／又は酵素活性、より好ましくはＲＧＣにおいて存在しない又は欠陥があるポリペプチド及び／又は酵素活性を提供する。

治療用遺伝子の例は、以下のものに限られないが、ＭＴ−ＮＤ４（ＧｅｎｅＩＤ：４５３８）、ＭＴ−ＮＤ１（ＧｅｎｅＩＤ：４５３５）、ＭＴ−ＮＤ６（ＧｅｎｅＩＤ：４５４１）、ＭＴ−ＣＹＢ（ＧｅｎｅＩＤ：４５１９）、ＭＴ−ＣＯ３（ＧｅｎｅＩＤ：４５１４）、ＭＴ−ＮＤ５（ＧｅｎｅＩＤ：４５４０）、ＭＴ−ＮＤ２（ＧｅｎｅＩＤ：４５３６）、ＭＴ−ＣＯＩ（ＧｅｎｅＩＤ：４５１２）、ＭＴ−ＡＴＰ６（ＧｅｎｅＩＤ：４５０８）、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ（ＧｅｎｅＩＤ：４５３９）、ＯＰＡ１（ＧｅｎｅＩＤ：４９７６）、ＯＰＡ３（ＧｅｎｅＩＤ：８０２０７）、ＯＰＡ７（ＧｅｎｅＩＤ：８４２３３）及びＡＣＯ２（ＧｅｎｅＩＤ：５０）等の網膜疾患の原因として知られている遺伝子の欠損又は変異を置き換えるための核酸を含む。

また、治療用遺伝子は、ＧＤＮＦ（ＧｅｎｅＩＤ：２６６８）、ＣＮＴＦ（ＧｅｎｅＩＤ：１２７０）、ＦＧＦ２（ＧｅｎｅＩＤ：２２４７）、ＢＤＮＦ（ＧｅｎｅＩＤ：６２７）及びＥＰＯ（ＧｅｎｅＩＤ：２０５６）等の神経栄養因子、ＢＣＬ２（ＧｅｎｅＩＤ：５９６）及びＢＣＬ２Ｌ１（ＧｅｎｅＩＤ：５９８）等の抗アポトーシス遺伝子、エンドスタチン、アンジオスタチン及びｓＦｌｔ等の抗血管新生因子、ＩＬ１０（ＧｅｎｅＩＤ：３５８６）、ＩＬ１Ｒ１（ＧｅｎｅＩＤ：３５５４）、ＴＧＦＢＩ（ＧｅｎｅＩＤ：７０４５）及びＩＬ４（ＧｅｎｅＩＤ：３５６５）等の抗炎症因子、又は杆体由来の錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（ＧｅｎｅＩＤ：１１５８６１）をコードしてもよい。

好ましくは、ＭＴ−ＮＤ４（ＧｅｎｅＩＤ：４５３８）、ＭＴ−ＮＤ１（ＧｅｎｅＩＤ：４５３５）、ＭＴ−ＮＤ６（ＧｅｎｅＩＤ：４５４１）、ＭＴ−ＣＹＢ（ＧｅｎｅＩＤ：４５１９）、ＭＴ−ＣＯ３（ＧｅｎｅＩＤ：４５１４）、ＭＴ−ＮＤ５（ＧｅｎｅＩＤ：４５４０）、ＭＴ−ＮＤ２（ＧｅｎｅＩＤ：４５３６）、ＭＴ−ＣＯＩ（ＧｅｎｅＩＤ：４５１２）、ＭＴ−ＡＴＰ６（ＧｅｎｅＩＤ：４５０８）及びＭＴ−ＮＤ４Ｌ（ＧｅｎｅＩＤ：４５３９）からなる群から選択される。より好ましくは、治療用遺伝子は、ＭＴ−ＮＤ４（ＧｅｎｅＩＤ：４５３８）、ＭＴ−ＮＤ１（ＧｅｎｅＩＤ：４５３５）及びＭＴ−ＮＤ６（ＧｅｎｅＩＤ：４５４１）からなる群から選択される。

追加のシグナルペプチドは、細胞から治療用タンパク質を分泌させる又は細胞膜内にそれらを挿入するために、特に所定のオルガネラ（ミトコンドリア等）の内部に治療用タンパク質を移入するために治療用タンパク質に付加されてもよい。

他の実施形態において、目的のポリペプチドは、光遺伝学的アクチュエータである。

本明細書において用いられる「光遺伝学的アクチュエータ」の用語は、発色団としてビタミンＡ又はそのアイソフォームを用いる光化学的反応性ポリペプチドを意味する。光遺伝学的アクチュエータは、光を吸収し、光により活性化される光駆動性イオンポンプ又はチャンネルである。光遺伝学的アクチュエータは、原核生物又は真核生物由来であってもよい。特に、それは、微生物性オプシン又は脊椎動物性オプシンであってもよい。光遺伝学的アクチュエータは、光遺伝学的活性化因子又は光遺伝学的阻害因子であってもよい。

光遺伝学的活性化因子は、光に曝露されることで細胞に脱分極を引き起こす。細胞が脱分極すると、細胞の負の内部電荷が一時正となる。細胞内環境の負から正へのシフトは、細胞内及び任意に細胞間の両方に電気インパルスが伝達される。光遺伝学的活性化因子の例は、以下のものに限られないが、ロドプシン、フォトプシン、メラノプシン、ピノプシン、パラピノプシン、ＶＡオプシン、ペロプシン、ニューロプシン、エンセファロプシン、レチノクロム、ＲＧＲオプシン、赤色にシフトした分光特性を有するＲｅａＣｈＲ、Ｃｈｒｉｍｓｏｎ若しくはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ等の微生物性オプシン、Ｇ_ｉ／Ｏシグナルをリクルートできる短波長脊椎動物オプシン若しくは長波長脊椎動物オプシン等の脊椎動物オプシン、Chlamydomonas属の微細藻類由来のチャンネルロドプシン−１及びチャンネルロドプシン−２（Chlamydomonas reinhardtii由来）等のチャンネルロドプシン、並びにそれらの変異体を含む。チャンネルロドプシンの種々の変異体（例えばコドン最適化変異体、ミュータント、キメラ）は、これらのタンパク質の特定の機能を改善するために生成されたものである。これらの変異体の例は、以下のものに限られないが、ｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、ＣｈＥＴＡ（Ｅ１２３Ｔ）、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２／１６２Ｔ）、ｈＣｈＲ２（Ｃ１２８Ａ）、ｈＣｈＲ２（Ｃ１２８Ｓ）、ｈＣｈＲ２（Ｃ１２８Ｔ）、ｈＣｈＲ２（Ｃ１２８Ａ／Ｈ１３４Ｒ）、ｈＣａｔｃｈ（Ｔ１５９Ｓ）、ｈＣｈｉｅｆ、ｈＣｈＲ２（Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａ）、ｈＣｈＲ２（Ｔ１５９Ｃ）、ｈＣｈＲ２（Ｅ１２３Ｔ／Ｔ１５９Ｃ）、ｈＣｈＲ２ｃ（Ｃ１２８Ｔ）、ＣｈＲ２ｃ（Ｃ１２８Ｔ）、ＣｈＲ２ｅ（Ｑ１１７Ｃ）及びＳｗｉｔＣｈＲ (Prakash et al. Nat Methods. 2012 Dec;9(12):1171-9を参照)を含む。

光遺伝学的阻害因子は、光に曝露されることで細胞に過分極を引き起こす。細胞が過分極すると、細胞の負の内部電荷が一時過剰に負となる。過剰な負へのシフトは、活動電位閾値にまで膜電位を移すために必要となる刺激を増大することにより活動電位を抑制する。特定の実施形態において、光遺伝学的阻害因子は、フォトンの吸収に基づいて塩化物イオンを内部に輸送する及び／又はカチオンを外部に輸送する光駆動性イオンポンプである。フォトンの吸収に基づいて塩化物イオンを内部に輸送する又はカチオンを外部に輸送するいくつかの適切な光駆動性の網膜依存性イオンポンプは、光遺伝学的阻害因子として用いられ得る。光遺伝学的阻害因子の例は、以下のものに限られないが、ハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、増強型ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ２．０及びｅＮｐＨＲ３．０）及び赤色にシフトしたハロロドプシン、Ｈａｌｏ５７等のハロロドプシン、古細菌ロドプシン−３（ＡＲ−３）、古細菌ロドプシン（Ａｒｃｈ）、増強型バクテリオロドプシン（ｅＢＲ）等のバクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、Leptosphaeria maculans真菌オプシン（Ｍａｃ）、クラックスハロロドプシンＪａｗｓ、並びにそれらの変異体を含む。

特に好ましい実施形態において、光遺伝学的アクチュエータは、光遺伝学的活性化因子であり、好ましくはチャンネルロドプシン、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ及びそれらの変異体から選択され、より好ましくはｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ｈＣａｔｃｈ及びＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏから選択される。

特に好ましい実施形態において、光遺伝学的アクチュエータは、光遺伝学的活性化因子であり、好ましくはチャンネルロドプシン及びその変異体から選択され、より好ましくはｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ｈＣａｔｃｈである。

更なる実施形態において、本発明のプロモーターに作動可能に連結される核酸は、レポータータンパク質をコードする。好ましくは、レポータータンパク質は、生存するＲＧＣにおいて検出可能である。本発明のプロモーターの制御下でのレポータータンパク質の発現は、ＲＧＣを特異的に検出する又は同定させ得る。レポータータンパク質は、例えば蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、カルシウムインジケーター（例えばＧＣａｍＰ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びそれらの変異体であってもよい。特定の実施形態において、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びそれらの変異体から選択される。

他の実施形態において、本発明のプロモーターに作動可能に連結された核酸は、目的の核酸をコードする。

目的の核酸は、ＲＧＣにおいて発現されることを望む核酸のいずれかであってもよい。特に、目的の核酸は、治療用核酸であってもよい。

そのような核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム又はＤＮＡザイムであってもよい。

特定の実施形態において、核酸は、本発明のプロモーターに作動可能に連結された核酸から転写されたときに、眼疾患に関連する異常又は過剰なタンパク質の翻訳又は転写を妨げることにより眼疾患を治療又は予防できるＲＮＡをコードする。例えば、目的の核酸は、異常及び／又は過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡを高い特異性で除去又は低減させることによりその疾患を治療するＲＮＡをコードしてもよい。

本発明の発現カセットは、本発明のプロモーターに作動可能に連結された１つ又はそれ以上の核酸を含んでもよい。例えば、そのプロモーターは、１つ若しくはそれ以上の治療用遺伝子及びレポータータンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されていてもよく、又は治療用遺伝子及び光遺伝学的アクチュエータに作動可能に連結されていてもよい。

本発明のプロモーターの全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

第３の態様において、本発明は、本発明のプロモーター又は本発明の発現カセットを含むベクターに関する。

本明細書において用いられる「ベクター」の用語は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、遺伝子材料を輸送する、特に宿主細胞内に核酸を輸送するための媒体として用いられる核酸分子を意味する。ベクターは、以下のものに限られないが、プラスミド、ファスミド、コスミド、転位因子、ウィルス及び人工染色体（例えばＹＡＣ）を含む。

好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子又は細胞治療に用いるのに適する、特にＲＧＣを標的にするのに適するベクターである。

本発明のベクターは、好ましくは、例えば本発明のプロモーター等のプロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル及び／又は複製起点等の宿主細胞に目的のポリペプチドを発現するのに必要なエレメントを含むウィルスゲノムベクターである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、モロニーマウス白血病ウィルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ若しくはＳＮＶ、レンチウィルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）若しくウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）由来）、アデノウィルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウィルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウィルスベクター、エプスタイン・バールウィルス、ヘルペスウィルスベクター、ワクチニアウィルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウィルスベクター、マウス乳がんウィルスベクター及びラウス肉腫ウィルスベクターに由来するベクター等のウィルスベクターである。

特定の実施形態において、ベクターはレトロウィルスベクターであり、好ましくはレンチウィルスベクター又は非病原性パルボウィルスである。

本技術分野において周知であるように、使用が考慮された特定のウィルスベクターに依存して、ＡＡＶベクターのためのＡＡＶＩＴＲ又はレンチウィルスベクターのためのＬＴＲのように、適する配列が機能性ウィルスベクターを得るために本発明のベクターに導入されるべきである。

好ましい実施形態において、ベクターはＡＡＶベクターである。

ヒトパルボウィルスであるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、潜伏感染を確立するように感染された細胞のゲノム内に統合でき、複製については天然に欠陥があるディペンドウィルスである。その最後の特性は、第１９染色体（１９ｑｌ３．３−ｑｔｅｒ）に位置するＡＡＶＳＩと呼ばれるヒトゲノム内の特定の領域でその統合が生じるため、哺乳動物のウィルスの中で独特であると思われる。従って、ＡＡＶは、ヒトの遺伝子治療のための潜在的なベクターとして特に興味深いものと考えられている。そのウィルスの有益な特性が、ヒトの疾患との関連の欠如であり、***細胞及び非***細胞の両方、並びに感染できる種々の組織に由来する広い範囲の細胞株に感染する能力である。

本明細書において用いられる「ＡＡＶベクター」の用語は、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、好ましくは２つのＩＴＲに隣接する１つ又はそれ以上の異種配列（すなわちＡＡＶ起源でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを意味する。そのようなＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウィルスに感染され（又は適切なヘルパー機能を発現する）、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞に存在する場合に、複製可能であり、感染性ウィルス粒子内に入れられ得る。

「末端逆位配列」又は「ＩＴＲ」は、本技術分野において周知の用語であり、逆向きであるウィルスゲノムの末端において見られる比較的に短い配列を意味する。「ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）」は、ネイティブ一本鎖ＡＡＶゲノムの両端に存在する約１４５ヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間で、及び単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間で異種性を引き起こすように、２つの方向のいずれかに存在し得る。また、最も外側の１２５ヌクレオチドは、ＩＴＲのこの部分内で生じる鎖内塩基対合され得る自己相補性（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ及びＤ領域と示される）の複数の短い領域を含む。本発明のベクターに用いるためのＡＡＶＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有してもよく、又は挿入、欠失若しくは置換により変異されていてもよい。ＡＡＶベクターの末端逆位配列（ＩＴＲ）の血清型は、周知のヒト又は非ヒトＡＡＶ血清型から選択され得る。

ＡＡＶベクターが長いポリヌクレオチド（例えば染色体、又はクローニング若しくはトランスフェクションに用いられるプラスミド等の他のベクター）に組み込まれる場合、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージ機能及び適切なヘルパー機能の存在下での複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得る「プロベクター」を意味してもよい。本発明のＡＡＶベクターは、以下のものに限られないが、プラスミド、直鎖人工染色体、複合脂質、リポソームによるカプセル化及びウィルス粒子におけるカプシド形成（例えばＡＡＶ粒子）を含む多くの型のいずれかであってもよい。

本発明のプロモーター又は発現カセットは、当業者に周知の方法によりベクター内に導入され得る。

ベクターは、さらに、栄養要求性マーカー（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１若しくはＨＩＳ３）等の選択マーカー、蛍光若しくは発光タンパク質（例えばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ，ＣＦＰ）等の検出ラベル、又は化学的／毒性化合物に対する耐性を与えるタンパク質（例えばテモゾロミドに対する耐性を与えるＭＧＭＴ遺伝子）をコードする１つ又はそれ以上の核酸配列を含んでもよい。これらのマーカーは、そのベクターを含む宿主細胞を選択又は検出するために用いられることができ、また、宿主細胞に従って当業者により容易に選択され得る。

本発明のプロモーター及び発現カセットの全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

本発明のベクターは、「ウィルス粒子」を生成するためにウィルスカプシド内にパッケージされ得る。従って、更なる態様において、本発明は、本発明のベクターを含むウィルス粒子に関する。

特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターであり、「アデノ随伴ウィルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」を生成するためにＡＡＶ由来カプシド内にパッケージされる。従って、本明細書において用いられる「ＡＡＶ粒子」の用語は、少なくともＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたＡＡＶベクターゲノムで構成されたウィルス粒子を意味する。

カプシドの血清型は、ＡＡＶ粒子の屈性範囲を決定する。

１２のヒトの血清型及び非ヒト霊長類の１００を超える血清型を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の複数の血清型は、現在において同定されている（Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10）。これらの血清型のうち、ヒト血清型２は、遺伝子移入ベクターとして開発された最初のＡＡＶである。近年用いられている他のＡＡＶ血清型は、以下のものに限られないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶｄｊ等を含む。さらに、非天然の人工変異体及びキメラＡＡＶも有益となり得る。特に、カプシドタンパク質は、１つ又はそれ以上の形質導入効率を増強するアミノ酸置換を含む変異体であってもよい。

種々のＡＡＶ血清型は、特定の標的細胞の形質移入を最適化する、又は特定の標的組織（例えばＲＧＣ）内における特定の細胞型を標的とするために用いられる。ＡＡＶ粒子は、同一の血清型のウィルスタンパク質及びウィルス核酸、又はＡＡＶの天然若しくは人工配列変異体を含み得る。例えば、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質と、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ２ＩＴＲを含み得る。ＡＡＶ粒子の生成のためのＡＡＶ血清型のいずれかの組み合わせは、各組合せは本明細書において明確に述べられているように、本明細書にて提供される。

好ましい実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７ｍ８（ＡＡＶ２−７ｍ８、Dalkara et al. Sci Transl Med (2013), 5, 189ra76）、ＡＡＶ９又はＡＡＶ８カプシドからなる群から選択されるＡＡＶ由来カプシドを含む。

ＡＡＶウィルスは、核酸配列の細胞特異的輸送のために、免疫原性の最小化のために、安定性及び粒子寿命の調整のために、効率的な分解のために、又は核への輸送の促進のために、これらの粒子を最適化できるように、従来の分子生物技術を用いて設計され得る。

ＡＡＶの天然の血清型を用いる代わりに、以下のものに限られないが非天然起源カプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む人工ＡＡＶ血清型が本発明において用いられ得る。そのような人工カプシドは、異なる選択されたＡＡＶ血清型から、同一のＡＡＶ血清型の非連続的部分、非ＡＡＶウィルス源から又は非ウィルス源から得られ得る異種配列と組み合わされる選択されたＡＡＶ配列（例えばＶＰｌカプシドタンパク質の断片）を用いて、適切な技術により生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、以下のものに限られないが、キメラＡＡＶカプシド又は変異型ＡＡＶカプシドであってもよい。

キメラカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型由来のＶＰカプシドタンパク質を含む、又は少なくとも２つのＡＡＶ血清型由来のＶＰタンパク質領域若しくはドメインに結合する少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。

カプシドタンパク質は、特に形質移入効率を増大するように変異されていてもよい。変異型ＡＡＶカプシドは、エラープローンＰＣＲ及び／又はペプチド挿入により挿入されたカプシド変異から、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって得られ得る。特に、変異は、天然又は非天然カプシドタンパク質（例えばＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３）の１つ又はそれ以上のチロシン残基に生じさせてもよい。好ましくは、変異された残基は、表面に露出されたチロシン残基である。例示的変異は、以下のものに限られないが、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２７５Ｆ、Ｙ２８１Ｆ、Ｙ５０８Ｆ、Ｙ５７６Ｆ、Ｙ６１２Ｇ、Ｙ６７３Ｆ及びＹ７２０Ｆ等のチロシンからフェニルアラニンへの置換を含む。

好ましい実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２由来カプシドを含む。この実施形態において、カプシドは、好ましくはＹ４４４Ｆ置換を含む１つ又はそれ以上のチロシンからフェニルアラニンへの置換を含み得る。

さらに、ＡＡＶ粒子のゲノムベクター（すなわち本発明のベクター）は、一本鎖又は自己相補性二本鎖ゲノムのいずれかであってもよい。自己相補性二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復の１つからターミナルリソリューションサイト（ｔｒｓ）を欠失することにより生成される。これらの変異型ベクターは、その複製ゲノムが野生型ＡＡＶゲノムの半分の長さであり、ＤＮＡダイマーをパッケージする傾向を有する。好ましい実施形態において、本発明の実施において用いられるＡＡＶ粒子は、一本鎖ゲノムを有する。

ウィルス粒子、特にＡＡＶ粒子の生成のための多くの方法が知られており、それは、トランスフェクション、安定細胞株生成、並びにアデノウィルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウィルス−ＡＡＶハイブリッド（Conway, JE et al., (1997) Virology 71(11):8780-8789）及びバキュロウィルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウィルス生成システムを含む。

ＡＡＶウィルス粒子の生成のためのＡＡＶ生成培養は、１）例えばバキュロウィルスの生成の場合、ＨｅＬａ、Ａ５４９若しくは２９３細胞等のヒト由来細胞株、又はＳＦ−９等の昆虫由来細胞株を含む適切な宿主細胞、２）野生型若しくは変異型アデノウィルス（温度感受性アデノウィルス等）、ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、又はヘルパー機能を与えるプラスミドコンストラクトにより与えられる適切なヘルパーウィルス機能、３）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びに遺伝子産物、４）少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲ配列に隣接された目的の核酸（例えば本発明のベクター）、並びに５）本技術分野において周知のＡＡＶ生成を支持する適切な培地及び培地成分を全て必要とする。

本発明の実施において、ＡＡＶ粒子の生成のための宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物及び酵母を含む。宿主細胞は、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞内で安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、又はＡＡＶベクターゲノムが安定に維持されるプロデューサー細胞であってもよい。例示的パッケージ細胞及びプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞由来である。ＡＡＶ粒子は、本技術分野において周知の標準技術を用いて精製及び構築される。

本発明のプロモーター、発現カセット及びベクターの全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

他の態様において、本発明は、本発明の発現カセット、ベクター又はウィルス粒子を用いて形質転換又はトランスフェクションされた単離宿主細胞に関する。

宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞又は酵母のいずれかであってもよい。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。より好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。

好ましい実施形態において、宿主細胞は、網膜神経節細胞、特にヒトＲＧＣである。

本発明の発現カセット又はベクターは、以下のものに限られないが、カルシウムリン酸−ＤＮＡ沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、リポフェクション又はウィルス感染を含む周知の技術を用いて宿主細胞内に移入されてもよく、それらは、異所型で宿主細胞内に維持されてもよく又はゲノムに統合されてもよい。

好ましい実施形態において、本発明の発現カセット又はベクターは、好ましくは本発明のウィルス粒子を用いた、より好ましくは本発明のＡＡＶ粒子を用いたウィルス感染により宿主細胞内に移入される。

本発明の発現カセット、ベクター及びウィルス粒子の全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

本発明は、本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は細胞を含む医薬組成物に関する。

そのような組成物は、治療有効量の治療剤（本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は細胞）と、医薬的に許容可能な賦形剤とを含む。本明細書において用いられる「医薬的に許容可能な」の用語は、動物及び／又はヒトに使用するための、監督機関又は欧州薬局方等の公認薬局方により承認されることを意味する。「賦形剤」の用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、キャリア又はビヒクルを意味する。

本技術分野において周知の通り、医薬的に許容可能な賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする相対的に不活性の物質であり、溶液、懸濁液、乳液、又は使用前に液体に溶解若しくは懸濁するのに適する固体で提供される。例えば、賦形剤は、形状若しくは粘性を与えることができ、希釈剤として作用できる。適切な賦形剤は、以下のものに限られないが、安定剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変更するための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝液、並びにバッファーを含む。そのような緩衝液は、不適当な毒性無く投与され得る眼に直接に輸送するのに適する薬剤を含む。医薬的に許容可能な賦形剤は、以下のものに限られないが、ソルビトール、種々のｔｗｅｅｎ化合物のいずれか、並びに水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等の液体を含む。医薬的に許容可能な塩は、その中に含まれてもよく、それは、例えば塩酸、臭化水素、リン酸及び硫酸等の無機酸塩、並びに酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸等の有機酸塩である。医薬的に許容可能な賦形剤の十分な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciencesの第１５版において得られる。

好ましくは、組成物は、特に眼内注射、例えば網膜下及び／又は硝子体中投与により眼に投与されるために製剤化される。従って、組成物は、生理食塩水、リンガー平衡塩溶液（ｐＨ７．４）等の医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせられ得る。

本明細書に記載された医薬組成物は、単回用量又は複数回用量の形態でパッケージされ得る。

一実施形態において、医薬組成物は、本発明のベクター又はウィルス粒子、より好ましくはＡＡＶベクター又は粒子を含む。

他の実施形態において、医薬組成物は、本発明の宿主細胞、好ましくは本発明のヒト宿主細胞、すなわち本発明の発現カセット、ベクター又はウィルス粒子、好ましくはＡＡＶ粒子を用いて形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を含む。任意に、宿主細胞を含む組成物は、その細胞の保存に適する温度で保存するために凍結されてもよい。例えば、細胞は、約−２０℃、−８０℃又は他の適切な温度で凍結されてもよい。低温で凍結された細胞は、細胞のダメージの蓄積を低減し且つその細胞が生存した状態で融解される可能性を最大にする保存のために、適切な容器内で保存され、調製され得る。代替的に、細胞は、例えば約４℃の冷却された室温で維持されてもよい。

投与される医薬組成物の量は、当業者により周知の標準的な方法により決定され得る。患者の生理的データ（例えば年齢、サイズ及び重量）並びに治療する疾病の型及び重症度は、適切な用量を決定するために考慮されなければならない。

本発明の医薬組成物は、単回投与又は複数回投与で投与され得る。

特定の実施形態において、組成物は、本発明のウィルス粒子を含み、各単位用量は、１０^８から１０^１３のウィルス粒子、好ましくは１０^９から１０^１２の粒子を含む。

医薬組成物は、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子又はそれらの組合せ等１つ又は複数の追加の活性化合物をさらに含み得る。

本発明のプロモーター、発現カセット、ベクター、ウィルス粒子及び宿主細胞の全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

更なる態様において、本発明は、
眼疾患の治療に用いるための本発明の医薬組成物、
眼疾患の治療に用いるための本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は宿主細胞、
眼疾患の治療のための薬剤の製造のための本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は宿主細胞の使用、及び、
本発明の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む眼疾患の治療のための方法、に関する。

一実施形態において、眼疾患は、網膜神経節細胞の変性に関連する疾患である。

網膜神経節細胞の変性に関連する疾患の例は、以下のものに限られないが、遺伝性視神経症（レーバー遺伝性視神経萎縮症、優性視神経萎縮症）、圧迫性視神経症（眼窩偽腫瘍、甲状腺眼症）、自己免疫性視神経症（Ｌｕｐｕｓ）、糖尿病性網膜症、緑内障を含む緑内障性視神経疾患（ＧＯＮＤ）、動脈炎性虚血性視神経症（巨細胞性動脈炎）、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症（サルコイドーシス）、感染性視神経症（梅毒、ライム病、トキソプラズマ病、帯状疱疹）、脱髄疾患による視神経炎、放射線治療後視神経症及び腸性肢端皮膚炎を含む。

特定の実施形態において、眼疾患は、遺伝性視神経症であり、好ましくはレーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ；ＯＭＩＭ＃５３５０００）、視神経萎縮１（Ｋｊｅｒタイプ視神経萎縮；ＯＭＩＭ ＃１６５５００）、視神経萎縮及び白内障（視神経萎縮３；ＯＭＩＭ ＃１６５３００）、並びにオーディトリーニューロパシーと併発する又はしない視神経萎縮７（ＯＭＩＭ＃６１２９８９）から選択される。

好ましくは、眼疾患は、例えばＬＨＯＮ又は優性視神経症等の網膜神経節細胞の変性に関連する遺伝性眼疾患であり、本発明の発現カセット、ベクター又はウィルス粒子から発現される目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、特に患者における遺伝子欠損を正す治療用タンパク質である。

好ましい実施形態において、眼疾患は、ＬＨＯＮ及び優性視神経萎縮症から選択され、好ましくは視神経萎縮１、視神経萎縮及び白内障（視神経萎縮３）、並びにオーディトリーニューロパシーと併発する又はしない視神経萎縮７から選択され、目的のポリペプチドは、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７及びＡＣＯ２からなる群から選択される。

ＲＧＣは、光受容体が遺伝性又は後天性疾患により失われた場合に、疾患における光受容体変性後に長期間持続する。従って、ＲＧＣは、光遺伝学を用いて網膜を回復させるための処置の標的となる。これに関連して、ＲＧＣは、強く且つ制限された方法での光感受性タンパク質、すなわち光遺伝学的アクチュエータの発現が視力回復の成功に本質的である場合に、変性細胞に独立した細胞標的である。

従って、他の実施形態において、眼疾患は、光受容体細胞の変性に関連した疾患である。好ましくは、この実施形態において、目的のポリペプチドは、上記光遺伝学的アクチュエータであり、治療は光遺伝学的治療である。

光受容体細胞の変性に関連する疾患の例は、以下のものに限られないが、加齢黄斑変性、レーバー遺伝性視神経萎縮症、錐体杆体変性、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜剥離、ベスト病、網膜色素変性、先天性脈絡膜欠如及び色素上皮網膜変性を含む。

代替的に、眼疾患は、網膜神経節細胞又は光受容体細胞の変性に必ずしも又は明確には関連しないが、網膜神経節細胞に目的のポリペプチド又は核酸をコードする核酸を特異的に発現することにより治療又は予防できる疾患から選択される（例えば緑内障）

本明細書において用いられる「治療（treatment treat又はtreating）」の用語は、疾患の治療、防止、予防及び抑制等の患者の健康状態を改善することを意図する行為を意味する。特定の実施形態において、そのような用語は、疾患又は疾患に関連する症状の改善又は根絶を意味する。他の実施形態において、この用語は、そのような疾患を罹患する対象に１つ又はそれ以上の治療剤を投与した結果、その疾患の蔓延又は悪化を最小化することを意味する。

特に、「眼疾患の治療」の用語は、増強された視力を提供する、全盲への疾患の進行を防止する、傷害を受けていない眼細胞のダメージの拡大を防止する、傷害を受けた眼細胞のダメージを改善する、網膜のダメージの発生を防止する、又は軽度若しくは進行中の疾患を有する眼を救うための治療を意味し得る。いくつかの実施形態において、この用語は、患者の遺伝子欠損を正す治療用タンパク質を提供することによりＲＧＣ変性を予防、抑制又は止める治療を意味する。いくつかの他の実施形態において、この用語は、光遺伝学を用いて網膜を回復する又は視力を回復するための治療を意味する。

「治療有効量」は、眼疾患の上記治療を構成するのに十分となる対象に投与される本発明の医薬組成物の量を意図する。

医薬組成物は、単回投与又は複数回投与で投与されてもよい

特定の実施形態において、医薬組成物は、本発明のウィルス粒子を含み、各単位用量は、１０^８から１０^１３ウィルス粒子、好ましくは１０^９から１０^１２粒子を含む。

本発明の眼疾患を治療する方法において、本発明の医薬組成物は、好ましくは眼内投与、より好ましくは網膜下又は硝子体中投与される。

本発明の方法は、対象に少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含み得る。特に、その治療剤は、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子又はそれらの組合せからなる群から選択され得る。

本発明の組成物は、疾患が症状を示す前又は後に投与され、例えば部分的若しくは完全にＲＧＣ若しくは光受容体細胞が変性する前若しくは後に、及び／又は部分的若しくは完全に視力を失う前若しくは後に投与され得る。

本発明のプロモーター、発現カセット、ベクター、ウィルス粒子、宿主細胞及び医薬組成物の全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

ＲＧＣは、画像形成及び非画像形成視覚情報を、活動電位の形態で網膜からまとめて脳に伝送する。ＲＧＣのそれぞれのタイプのサイズ、形状及び突起は異なり、また、それらは視覚機能において全く異なるおそらく独立した役割を果たすと考えられているので、ＲＧＣの機能を研究することには多大の関心が持たれている。

従って、他の態様において、本発明は、本発明の発現カセット、ベクター、ウィルス粒子又は宿主細胞を含む非ヒト動物モデルに関する。

そのような動物モデルは、ＲＧＣ機能のインビボ研究のために用いられ得る。本発明のプロモーター、カセット、ベクター又はウィルス粒子を用いて、例えばレポータータンパク質、電位又はカルシウム感受性タンパク質の発現を介して、ＲＧＣを同定若しくは追跡する、又はそれらの活性を観察することができる。

非ヒト動物モデルは、ＲＧＣにおいて作用する薬剤を同定又は選択するためのスクリーニング方法にも用いられ得る。

好ましくは、非ヒト動物モデルは、哺乳動物、より好ましくは霊長類、げっ歯類、ウサギ又はミニブタである。

プロモーター、発現カセット又はベクターは、このモデルの細胞内でエピソームの形態で維持されてもよく、又はそのゲノム内に組み込まれてもよい。

選択されたプロモーター、すなわち本発明のプロモーターの制御下で目的の核酸配列を発現する動物細胞をトランスフェクトする若しくは形質転換する、又はトランスジェニック動物を作製するための方法は、当業者に周知であり、細胞及び動物に従って容易に適合され得る。

本発明のプロモーター、発現カセット、ベクター、ウィルス粒子、宿主細胞の全ての実施形態は、この態様において熟慮される。

本明細書で参照された又は引用された全ての特許、特許出願、仮出願及び公報は、全ての図面及び表を含めてそれらの全体が、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、参照として本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、本発明の説明を目的とするものであり、本発明の限定を目的とするものではない。

＜方法及び材料＞
（動物）
全ての試験を、国立衛生研究所における実験動物の管理と使用のガイドに従って行った。プロトコールは地方動物倫理委員会により承認され、欧州議会の２０１０／６３／ＥＵ指令に従って行った。この試験で用いられた全てのマウスは、JanvierLaboratories (Le Genest Saint Isle, France)から入手されたＣ３Ｈ／ＨｅＮ（ｒｄ１マウス）若しくはＣ５７Ｂｌ６Ｊマウス（野生型）であり、又は外国起源のカニクイザル（macaca fasicularis）が用いられた。

（ＡＡＶの作製）
組換型ＡＡＶをプラスミドコトランスフェクション法（Choi et al. Curr. Protoc. Hum. Genet. 2007;Chapter 12:Unit 12.9）により作製し、それに記載されているように、得られた溶解液をイオジキサノール勾配超遠心法により精製した。簡単に４０％イオジキサノール分画を濃縮し、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unitsを用いてバッファー置換を行った。その後、ベクターストックを、標準に関連して（Aurnhammer C et al. Hum Gene Ther Methods. 2012 Feb;23(1):18-28）リアルタイムＰＣＲによって、ＤＮａｓｅ耐性ベクターゲノムに作用した。

（注射）
マウスをケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ Rompum）を用いて麻酔した。瞳孔を広げ、超微細な３０ゲージの使い捨て針を赤道にあり角膜縁に隣接する強膜に通過させ、硝子体腔内に入れた。１０^７から１０^１１粒子のＡＡＶを含む１μｌのストックの注射を、硝子体腔の中心における針の直接観察により行った。霊長類では、１０：１ｍｇ／ｋｇのケタミン：キシラジンを用いて麻酔した。瞳孔を広げ、１×１０^１１又は５×１０^１１のウィルス粒子を含む１００μＬのウィルスベクターを、それぞれの眼の硝子体内に、３０ゲージの針を用いて角膜縁の約４ｍｍ後ろの胸膜を通って注射した。眼科用ステロイド及び化膿止めを注射後の角膜に適用した。

（免疫組織化学）
形質導入されたマウスの網膜を、解剖し、４％ホルムアルデヒドにより３０分間室温で固定しＰＢＳで洗浄した。その後、網膜を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び５％ウシ血清アルブミンブロッキングバッファーを含むＰＢＳにより室温で１時間処理した。マウスの網膜を抗ＧＦＰポリクローナル抗体（Life Technologies; 1:2000）及び抗Ｂｒｎ３ａモノクローナル抗体（MilliporeChemicon; 1:100）を含む半希釈ブロッキングバッファーにより４℃で一晩インキュベートした。その後、網膜をそれぞれAlexa TM594、Alexa TM488及びAlexa TM647とコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ二次抗体を含む半希釈ブロッキングバッファーにより１時間室温でインキュベートした。霊長類の網膜を、類似の条件で、抗Ｂｒｎ３ａ、抗ＧＦＰ及び抗チャンネルロドプシン抗体を用いてラベルした。その後、細胞核を、検体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Sigma-Aldrich; 10μg/mL）とを共にインキュベートすることにより染色した。網膜をリンスし、共焦点観察を開始する前に、２つのカバーガラスの間にマウンティング媒体を用いてフラットマウンティングした。先にラベルされたフラットマウントの組織切片を、マウントの解除、凍結保存及び凍結切片（１５μｍ）の前にＯＣＴで包埋することにより得て、共焦点顕微鏡により観察した。

（共焦点顕微鏡観察）
共焦点顕微鏡観察は、オリンパスＦＶ１０００レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて行った。画像は、励起及び放射のクロストークを低減するために連続的に、一行ごとに得て、ステップサイズをナイキスト・シャノン標本化定理に従って規定した。最終画像における過飽和な画素を最小化する露光設定を用いた。その後、ＦＩＪＩを用いて１２ビットイメージを処理し、Ｚ断面を、Ｚ−投影機能下での最大強度を用いて単一平面に投影し、最終的に８ビットのＲＧＢカラーモードに変換した。

形質導入の効率は、マウス及び霊長類の網膜の中心窩におけるＣａｔｃｈ−ＧＦＰと共に形質導入されたＢｒｎ３ａ（＋）細胞をカウントすることにより評価した。ＲＧＣ層の共焦点スタックを２０×を用いて得た。

（単離された網膜のＭＥＡの記録）
マウスを麻酔し、迅速な頚椎脱臼によって屠殺し、霊長類には致死量のペントバルビタールを与えた。眼球を取り出し、Ａｍｅｓメディウム（Sigma Aldrich A1420）において、室温で９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２で泡立てた。単離された網膜をセルロース膜上に置き、ＲＧＣに対する電極を有するＭＥＡ（MEA256 100/30 iR-ITO, Multichannel systems,ドイツ）に対して穏やかに押し付けた。網膜を、試験中１〜２ｍｌ／ｍｉｎで３４℃の泡立つＡｍｅｓメディウムを連続的に浸み込ませた。代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるＬ−（＋）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（LAP-4, Tocris Bioscience, cat No. 0103）及びグリシン受容体アンタゴニストであるストリキニン塩酸塩（Sigma Aldrich S8753）を、それぞれ５０μＭ及び１０μＭの濃度に新しく希釈し、記録前に灌流システムに１０分間適用した。全視野の光刺激を、ＳＴＧ２００８刺激発生器（ＭＣＳ）により作動されるPolychrome V monochromator（オリンパス）を用いて行った。アウトプットライトの強度を、１．１０^１４ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓから１．１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓの範囲に調整した。刺激は１０秒間隔で２秒間行った。反応の波長感度は、４００ｎｍから６５０ｎｍまでを１０ｎｍ刻みで１０回刺激することにより決定した。試験された波長の順序は、網膜の適応を防ぐためにランダムにした。

生の細胞外ＲＧＣ活性を増幅させ、２０ｋＨｚでサンプリングした。得られたデータを保存し、Spike2ソフトウェアv.7 (CED Co, UK)を用いて次のオフライン分析のために２００Ｈｚｈｉｇｈ ｐａｓｓフィルタでフィルタリングした。単一ユニットラスタープロットを、波形の主成分分析に基づいたテンプレートマッチング及びクラスターグルーピングの組合せを用いて得た。我々のポピュレーション分析において、顕著な反応をＺスコア分析に基づいて決定した。我々は、刺激前の活性の平均値及び標準偏差を算出し、刺激（ビンサイズ５０ｍｓ）のオンセット又はオフセットの２秒後において、活性が標準偏差の４倍以上の平均値を超える場合に反応を検出した。エラーバーは異なる試験にわたって算出した。異なる波長の光に対する反応のために、我々は、刺激後の１ｓウィンドウにおいて各フラッシュに対する反応を測定した。その後、我々は、その最大の反応発火率によって各細胞の反応を正規化した。異なる強度での光反応のために、記録された細胞一式に亘ったブートストラッピングによってエラーバーを推定した。

（二光子画像及びパッチクランプ法）
２５倍の水浸対物レンズ(XLPLN25xWMP/NA1.05,オリンパス)、フェムト秒パルスレーザ(InSightDeepSee - Newport Corporation)を備えた特注の二光子顕微鏡を、ＣａｔＣｈ−ＧＦＰ陽性網膜神経節細胞をイメージングするために用いた。ｒｄ１マウスからのＡＡＶ処理網膜を、酸素を入れた(95% O₂, 5% CO₂)Ａｍｅｓメディウム(Sigma-Aldrich)において単離した。ライブ二光子イメージングのために、網膜切片（３００μｍ）をrazor blade tissue chopper (Stoelting)を切断して顕微鏡の記録チャンバに置き、Ｚスタックを９３０ｎｍの波長の励起レーザを用いて得た。画像をImageJを用いてオフラインで処理した。イメージングの際に、網膜に対して、酸素を入れたＡｍｅｓメディウムで表面を灌流した。

我々は、細胞全体の記録のためにAxonMulticlamp 700B増幅器を用いた。パッチ電極はホウケイ酸ガラス(BF100-50-10,Sutter Instruments)からなり、８〜１０ＭΩに引かれた。ピペットを112.5 mM CsMeSO4、1 mM Mg SO4、7.8×10^-3 mM CaCl2、0.5 mM BAPTA、10 mM HEPES、4 mM ATP-Na2、0.5 mM GTP-Na3、5 mM lidocaine N-ethyl bromide (QX314-Br) (pH 7.2)で満たした。細胞を、興奮性電流を単離するために−６０ｍＶの電位でクランプした。

（視覚野におけるインビボ記録）
マウスを低容量のケタミン−キシラジン注射（ケタミン：１００ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン：１０ｍｇ／ｋｇ）により鎮静させ、その後ウレタン(1.0 g/kg, 生理食塩水中10% w/v)を用いて麻酔した。動物を定位ホルダに置いた。温度は３７℃に維持し、ビタミンＡ(Allergan)で覆われたカバーガラスを、角膜脱水を防止するために両目の上に置いた。処理された眼の反対側における半球におけるＶ１の上の開頭（１ｍｍ^２）は、ラムダ点から３ｍｍ横側で且つ０．５ｍｍ吻側を中心とした。硬膜を除き、電極を皮質表面に３０°の角度で３軸マイクロマニピュレーター(Sutter Instruments)を用いて挿入した。それを８００μｍ進めて、露出表面をアガロース（１．２％、cortexバッファー中）で覆った。

視覚刺激は、眼から１ｃｍの位置における４７０ｎｍの視準されたＬＥＤ(model M470L3, Thorlabs)により行われた。単離された錐体が、照光が刺激される眼に制限されることを確実にした。リニアマルチサイトシリコンマイクロプローブ（５０μｍ間隔で１６の電極）を記録のために用いた。各取得のために、２００以上の試験を平均した後、最大のピーク振幅を有するＶＥＰを示す電極を定量のために選択した。刺激は、Digidata (Axon)により起こされる１Ｈｚで２００回繰り返される青色光の２００ｍｓパルスからなる。シグナルを、カスタムスクリプトを用いてMatlabで分析した。局所電場電位のために、シグナルは３００Ｈｚでlow passフィルタし、２００以上の試験を平均した。

（非ヒト霊長類におけるインビボイメージング及び眼科的試験）
ＧＦＰの蛍光画像（眼底自発蛍光モード：励起波長４８８ｎｍ及びバリアフィルタ５００ｎｍ）及び眼底の赤外線写真及びＯＣＴ画像は、瞳孔拡張後にSpectralis HRA+OCTシステム（HeidelbergEngineering, Heidelberg, Germany）を用いて得られた。細隙灯生体顕微鏡（PortableSlit Lamp model SL-14, Kowa）及び倒像検眼鏡(Indirect BinocularOphthalmoscope model HK 150-1 uno, Heine)からなる眼科的試験を、投薬前２週間、その後毎月、全てのマカクで行った。

（マカクの網膜における病理組織学的試験）
高用量が注射されたＮＨＰからの眼を注射後３ヶ月で摘出し、針を挿入し、眼球が膨張するまで０．１５〜０．３ｍｌの固定液を注射した。眼を固定液に浸漬して一晩固定し、全体構造を横切る水平方向断面を作製するように処理した。所望の眼構造のすべてが存在する網膜の断面をNanozoomer (Hamamatsu, Japan)で画像化した。

［実施例１］
＜ｈＳＮＣＧのプロモーター配列＞
ＳＮＣＧ遺伝子は第１０染色体（１０ｑ２３．３）に位置する（図１）。それは＋１転写サイトから５番目のエクソンの端部まで３．５ｋｂにわたって延びる５つのエクソンを含む。マルチメリン２遺伝子（ＭＭＲＮ２）の第１のエクソンは、＋１ＳＮＣＧ転写サイトの８６３ｂｐ下流に位置する。ＳＮＣＧプロモーターのヒト配列を抽出するために、−７８５から＋１６３の領域（図１において矢印で示す）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から増幅させた。

増幅プライマーは以下の通りであり：
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＡＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣ−３’ (配列番号２)、及び、
リバースプライマー：５’−ＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧ−３’ （配列番号３）。

プロモーター配列は、９４℃の変性ステップ３０秒、それに続く５４℃のアニーリングステップ１分、及び７２℃の伸長ステップ１分からなる３０回の連続サイクルにより増幅した。

その後、ＰＣＲ産物（配列番号１）を、ＤＮＡトポイソメラーゼＩを用いた方法によりpENTR-D/TOPOプラスミド内にサブクローニングし、シークエンシングを行った。その配列は、ＧｅｎｅＩＤ番号６６２３でＧｅｎｂａｎｋに配列が公開されている配列と同一であることが確認された。

このプラスミドから、本発明者らは、配列番号１のプロモーターの制御下でＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶベクター及びＨＩＶ−１由来レンチウィルスベクターを生成した（図１）。

＜ｍＰＧＫ又はｈＳＮＣＧプロモーター及びＧＦＰタンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶ−２／Ｙ４４４Ｆベクターの構築及び生成＞
（構築）
ＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）及びＰＧＫプロモーター配列を、Gateway法を用いた相同組換えにより、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまで：（Gatewayシステムを用いた相同組換えを許容する）Ｒｆａインサート、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡ及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）を含むＡＡＶ産物のためのシャトルプラスミドに導入した。

このベクターを、Ｙ４４４Ｆ置換した点変異を有する血清型２カプシドで偽型化した。その変異を、ＡＡＶ２のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするパッケージプラスミドから特定部位突然変異導入により導入した。

（生成）
発現カセット、ｒｅｐ２及びｃａｐ２−Ｙ４４４Ｆ遺伝子を含む組換型ＡＡＶ２ゲノムを運ぶプラスミドと、ヘルパープラスミドとのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのコトランスフェクション（カルシウムリン酸共沈法を使用）によりＡＡＶ粒子を生成した。その後、不連続勾配イオジキサノール超遠心法により、トランスフェクションされた細胞の細胞質抽出液からＡＡＶ粒子を精製及び濃縮した。ウィルス力価を、ＡＡＶ粒子のゲノムＤＮＡにおけるＩＴＲ配列の定量的ＰＣＲ増幅により測定した。

［実施例２］
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊの成体マウス（６週）に、ＰＢＳで１０^１１ｖｇ（ベクターゲノム）の量に希釈された配列番号１のプロモーター及びＧＦＰタンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶ−２／Ｙ４４４Ｆベクター（実施例１及び図１を参照）を硝子体内注射した。注射から１ヵ月後に、眼底及び網膜は、ベクター又は手術による毒性が無いことを示し、正常外観を有していた（図２Ａ）

直接蛍光を用いた眼底のインビボ画像により、網膜におけるＧＦＰレポーター遺伝子の発現が観察された（図２Ａ）。ケタミン及びキシラジンの混合液を腹腔内注射することにより動物を麻酔し、ネオシネフリン及び散瞳薬の局所適用により瞳孔を広げた。その動物において、全瞳孔の拡大後、げっ歯類の眼底を見るために特別に設定された蛍光カメラにより試験した(MicronIII, PhoenixLaboratories)。

蛍光によって、ＧＦＰを発現する多数の細胞体を検出し、神経乳頭又は視神経頭に向かって収束する神経線維も観察した（図示せず）。これらの神経線維の存在は、ＧＦＰがＲＧＣで発現していることを証明した。

［実施例３］
網膜におけるｈＳＮＣＧプロモーターの発現パターンを特徴付けるために、本発明者らは、ｈＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）を、網膜において高いレベルで発現することが知られているユビキタスプロモーターであるｍＰＧＫプロモーターと比較した。

Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの２つの群に、１０^１１ｖｇの量にＰＢＳで希釈したＡＡＶ２−Ｙ４４４Ｆベクター、及びｍＰＧＫ又はｈＳＮＣＧプロモーターの制御下でＧＦＰをコードするベクターを硝子体内注射した。注射の１ヵ月後、ＧＦＰ発現について上記のようにインビボ分析を行った。その後、動物を安楽死させて、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液の心臓内灌流により組織を固定した。その後、眼球を取り出し、同一の固定液で後固定し、２５％スクロースを含むＰＢＳ溶液で凍害保護し、その後１６μｍの薄さでクライオスタットを用いて切断した。その後、直接蛍光の可視化により顕微鏡下でＧＦＰ発現を分析し、神経節細胞の特異的マーカーであるＢｎｒ３ａを用いて免疫標識した。

ユビキタスプロモーターｍＰＧＫを含むＡＡＶベクターを注射されたマウスにおいて、ＲＧＣ層における多数の形質導入細胞が存在するが、双極細胞層（ＩＮＬ）及び光需要体層（ＯＮＬ）にも存在した（図２Ｆ）。光受容体又はミュラー細胞の形態を有する細胞も明確に検出された。さらに、ＩＮＬにおける形質導入細胞の位置は、双極又はアマクリンニューロンが形質導入されたことが示唆される。

配列番号１のプロモーターを含むＡＡＶベクターを注射されたマウスにおいて、ＲＧＣは非常に強く標識されていた。ＧＦＰは、分枝の層状組織を示す内網状層におけるそれらの細胞体及びそれらの樹状分枝において検出された（図２Ｃ）。少数の水平細胞を除き、ＧＦＰの発現は神経節細胞に限定されていた。

［実施例４］
我々は、Ｂｒｎ３ａとの共標識による発現の位置を調べることにより、ＲＧＣにおける遺伝子発現の強さ及び特異性を評価した。Ｂｒｎ３ａは、ＲＧＣに特異的に発現し、この転写因子に対する抗体は、マウスＲＧＣを同定する信頼できるマーカーとして考えられる(Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604)。

Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの２つの群に対して、１０１１ｖｇの量にＰＢＳで希釈され、ＣＭＶ又はｈＳＮＣＧプロモーターの制御下でＧＦＰをコードするＡＡＶ２ベクターを、硝子体内注射した。注射の１ヵ月後に動物を安楽死させ、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液を心臓内に灌流させることにより組織を固定した。次に、眼球を取り出し、同一の固定液で１時間の後固定を行い、２５％スクロースを含むＰＢＳ溶液で凍害保護し、クリオスタットを用いて１６μｍの薄さに切断した。その後、神経節細胞の特異的マーカーのＢｎｒ３ａを用いて免疫標識し、直接蛍光による可視化によって顕微鏡下でＧＦＰ発現を分析した。

配列番号１のプロモーターを含むＡＡＶ２ベクターを注射されたマウスにおいて、ＲＧＣは非常に強く標識されていた。ＧＦＰは、分枝の層状組織を示す内網状層におけるそれらの細胞体及びそれらの樹状分枝において検出された。ＳＮＣＧ−ＧＦＰ網膜の断面（図３Ｂ）の共焦点顕微鏡像は、ＲＧＣにおいて強いＧＦＰ発現を示し、この発現の多くは、Ｂｎｒ３ａ標識と共局在していた。

［実施例５］
ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ又はＡＡＶ２−ＳＮＣＧ−ＧＦＰベクターのそれぞれの５×１０^１１ウィルス粒子を、１００μｌの容量で、正常のマカク（macaca fascicularis）の眼に硝子体内注射した。我々は、眼底の蛍光イメージングにより、カニクイザルの網膜におけるＧＦＰ発現を評価した。ＧＦＰの蛍光画像（眼底自然蛍光モード：励起波長４８８ｎｍ、バリアフィルタ５００ｎｍ）は、瞳孔拡張後に、Spectralis HRA+OCTシステム(Spectralis HRA+OCT;Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)を用いて得られた。蛍光画像は、ＣＭＶプロモーターを含むＡＡＶ−ＧＦＰベクターの場合（図４Ｂ）と比較して、形質導入領域（中心窩の周縁の輪）やＳＮＣＧプロモーターを含むＡＡＶ−ＧＦＰベクターのバックグラウンドできわめて強いＧＦＰ発現を示した。この試験は、高い導入遺伝子発現がＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）を用いた非ヒト霊長類で得られることを証明する。

［実施例６］
（配列番号１のプロモーター配列を用いたマウス網膜における強いＲＧＣ特異的発現）
ヒトγシヌクレイン（ＳＮＣＧ）の制御領域由来の実施例１で得られたプロモーター配列を、ＧＦＰの上流にクローニングした。我々は、マウスの網膜におけるＡＡＶを介した発現パターンを特徴付け、ＲＧＣにおける高レベルのＧＦＰ発現を観察した。また、我々は、ＡＡＶ骨格におけるヒト化ＣａｔＣｈ（Ｌ１３２Ｃ変異を有するヒトコドン最適化チャンネルロドプシン）の上流にこの配列をクローニングした。ＡＡＶ２ベクターを、ＧＦＰと融合したｈＣａｔｃｈの発現を作動するＣＭＶ又はＳＮＣＧプロモーターを用いて作製した。５つのｒｄ１マウスの眼にｈＣａｔＣｈ−ＧＦＰの発現を作動するＣＭＶ又はＳＮＣＧを注射した。

蛍光眼底画像は、ＣＭＶを注射した眼に対して、ＳＮＣＧを注射した眼の全てにおいてより高い傾向を示した（図５Ａ）。注射の８週後に眼球除去をし、網膜のフラットマウントが、ＣＭＶよりもＳＮＣＧプロモーターを用いた方が高い強度の蛍光を示すことを確認した（図５Ｂ）。我々は、Ｂｒｎ３ａを用いた共標識による発現の位置を調べることにより、ＲＧＣにおける遺伝子発現の強さ及び効率を評価した。Ｂｒｎ３ａは、ＲＧＣに特異的に発現し、この転写因子に対する抗体は、マウスＲＧＣを同定及び定量するための信頼できるマーカーと考えられている（Quina et al. J. Neurosci. 2005;25(50):11595-11604）。ＳＮＣＧ−ＣａｔＣｈ−ＧＦＰの網膜のフラットマウント（図５Ｄ）及び断面（図５Ｅ）の共焦点顕微鏡画像は、ＲＧＣにおける強いＧＦＰ発現を示し、この発現はＢｒｎ３ａ標識と多く共局在されている。そのような画像の細胞定量化において、我々は、ＳＮＣＧ又はＣＭＶプロモーターがトランスフェクションされた網膜におけるＲＧＣにおいて、Ｂｒｎ３ａ抗体で標識された数は同じであることを示した。ＳＮＣＧの網膜において、Ｂｒｎ３ａ陽性ＲＧＣの５７％がＧＦＰを発現し、一方、ＣＭＶの網膜においてこの割合が２１％に減少した（図５Ｃ）。ＳＮＣＧ及びＣＭＶの網膜の違いは、統計的に顕著であった。ＧＦＰ発現Ｂｒｎ３ａ陽性ＲＧＣの大きな比は、ＲＧＣにおける高レベルの遺伝子発現を作動するためのＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）の高い有効性を証明した。

（配列番号１のＳＮＣＧプロモーター下でのｒｄ１網膜のＲＧＣにおけるＣａｔＣｈ発現に従う網膜及び皮質の反応）
ｈＣａｔＣｈ−ＧＦＰの選択的ＲＧＣ標的化が、盲目のｒｄ１の網膜（１２週齢超過）において視覚機能を回復できることを証明するために、我々は、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて網膜神経節細胞からのスパイク活動を記録した。ＣＭＶ又はＳＮＣＧ（配列番号１）下でｈＣａｔＣｈ−ＧＦＰをコードするＡＡＶ２を３つの用量で誕生から４〜８週のマウスに注射し、注射後８〜１２週にＭＥＡ記録を行った（図６Ａ〜Ｃ）。光遺伝学的反応の光感受性は、１０^１４から１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓの範囲の光条件において２５２の電極アレイで読み出された情報として測定された。光励起スパイク活動は、２秒の全視野フラッシュを用いて処置されたｒｄ１網膜を刺激した際に観察され（図６Ａ〜Ｅ）、一方で、コントロールのｒｄ１網膜では光に応答したスパイク活動の増大は示されなかった（図示せず）。光に反応する細胞の割合は、ウィルス量に依存した（図６Ａ〜Ｂ）。１０^１４ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓの刺激により、高用量のＡＡＶのＳＮＣＧプロモーターで注射されたｒｄ１動物において多くの細胞が反応した（図６Ａ）。この改善された感受性は、ＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）がＲＧＣで高レベルのＣａｔＣｈ発現を作動し、高い割合の細胞が同一のウィルス力価で光感受性になることを裏付ける。発火率頻度は強度依存的であり、５×１０^９ｖｇ／眼のウィルス用量で、ＳＮＣＧプロモーター下で発現するＣａｔＣｈにおける１０^１４ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓでの強い光応答が起こる（図６Ａ）。正規化された発火率は、光強度の上昇に従って増大する（図６Ｃ〜Ｄ）。なお、ＣＭＶプロモーターを有する最も高いウィルス用量でのみ、１０^１４ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓでの光応答が生じた（図６Ａ）。さらに、わずかの細胞がこれらの条件で光に反応した。最も高い光強度でさえ、中程度のウィルス用量（５×１０^８ｖｇ／眼）において反応する細胞はほとんど無かった（図６Ｂ）。この試験は、ＲＧＣにおける機能性タンパク質の発現の作動のための、ＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）の高い有効性を証明した。

このＲＧＣの活性が脳に伝送されることを証明するために、我々は、インビボでの網膜刺激に基づく皮質レベルの光応答を記録した。この試験のために、ｒｄ１マウスの他の系としてAAV2-SNCG-hCatCh-GFPを注射し、我々は光強度の増大に応じて視覚野におけるスパイク活動及び局所電場電位（ＶＥＰ）を記録するためにそれらのマウスを用いた。ＲＧＣの反応ｈ、視覚野における高い光感受性活性に変換した（図６Ｆ〜Ｊ）。処置された眼（記録する半球の反対側）を１Ｈｚで２００回繰り返された２００ｍｓパルスの青色光（１．７×１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓ以下の光強度）で刺激した（図６Ｆ〜Ｈ）。処置されていないｒｄ１マウスの記録においてＶＥＰは見られなかった（平坦な記録）。野生型マウスのＶＥＰ測定と比較すると、ＣａｔＣｈ作動ＶＥＰはより遅い潜伏時間を有する（図６Ｉ）。光伝達カスケード及びその後の網膜評価がバイパスされるので、より短い潜伏時間が期待される。図６Ｆ〜Ｈ及びＪは、より高い光強度でより短い潜伏期間の傑出したピークの進行性出現を有するスパイク応答の強度依存性を示す。ＣａｔＣｈ処理したｒｄ１マウスのスパイクの潜在期間は、野生型マウス（５２．９８＋／−３．８３ｍｓ、ｎ＝３）における平均ＯＮ潜在期間よりも短い（１９．１＋／−２ｍｓ、ｎ＝３）。これらの反応は光刺激の期間に密接に関連し、ＣａｔＣｈ誘発ＲＧＣ活性の結果である。これらの機能的結果は、ＳＮＣＧプロモーター下でのＣａｔＣｈｎｏＡＡＶ作動性発現が光感受性を回復するために盲目マウスの網膜でＲＧＣを活性化できること、及びこれらの細胞が光信号を脳の視覚野にまで伝送することを明確に証明する。

（ＮＨＰの眼におけるインビボ炎症反応）
マウスの試験において、我々は、５×１０^７から５×１０^９ｖｇ／眼の範囲の用量を用いた。我々は、ヒトにおける光毒性を最小にするために低光強度を用いることが必要であることを観察し（１０^１４〜１０^１５ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓの範囲）、ＭＥＡにおける光応答を得るのに必要な特定の数字は、５×１０^８から５×１０^９ｖｇ／眼の範囲である。マカクの硝子体の容積はマウスの硝子体容積の約１００倍大きいので、我々は、我々の非ヒト霊長類試験におけるこの用量範囲の医薬的等量を使用することを決めた。５匹の非ヒト霊長類は、それらの血清におけるＡＡＶ２に対する中和抗体力価が無いことに基づいて選択された（Kotterman et al. Gene Ther. 2015 Feb;22(2):116-26）。これらの成体のマカクの４匹に、ＳＮＣＧプロモーター下でｈＣａｔＣｈをコードする１×１０^１１（ｎ＝４眼）又は５×１０^１１粒子（ｎ＝４眼）のＡＡＶ２を硝子体内注射した（表１）。

表１：非ヒト霊長類への注射：動物番号、硝子体内注射されるＡＡＶベクター及びウィルス量

ＧＦＰは免疫原性になり得るので、ＧＦＰとｈＣａｔＣｈとの潜在的炎症反応とを区別するために、我々は、蛍光タグが付いていないｈＣａｔＣｈを用いた。しかしながら、１匹の霊長類には、同一の２つの用量で注射されるが（一方の眼には低用量、他方の眼には高用量）、インビボでの遺伝子発現をモニターするためにＧＦＰ融合ｈＣａｔＣｈをコードするものが注射された。

硝子体混濁のための評価尺度（図７の下段）に定義されるように炎症の重度が進行しないので、透明性が十分に維持された。眼底の可視化のわずかな障害が、低用量群の一方の眼において注射後１及び３ヶ月で検出され、高用量群の全ての眼において注射後２ヶ月で検出された（図７の下段）。

後部ぶどう膜炎のグレードによる評価（図７の上段）は、全ての試験群の硝子体の注射後１ヶ月から硝子体内での細胞の持続的存在が開始することを示した（図７の上段）。注射後５〜６ヶ月において、硝子体内のほとんどの細胞は古くなると思われる。

硝子体内の細胞の定量及び分析は、中用量及び高用量群で行われ、炎症性反応の二波曲線を示した（図７）。両方の群の全ての眼は、注射後１ヶ月の時点で第１波の硝子体炎症反応を示し、硝子体細胞の炎症反応のレベルは、両方のウィルスコンストラクト（ＳＮＣＧ−Ｃａｔｃｈ及びＣＭＶ−Ｃａｔｃｈ）の高用量群及びＣＭＶ−Ｃａｔｃｈコンストラクトの中用量群で高かった。注射後３〜４ヶ月後の時点における第２波炎症性硝子体細胞の反応は、同一のプロファイルで、低いレベルであった。

スリットランプ及び倒像検眼鏡を用いた眼底の試験は、網膜、網膜血管、視神経乳頭及び脈絡膜で炎症のサインは見られなかった。

上記炎症のサインは、遺伝子治療される眼の自然免疫反応をよく反映する。これを介する詳細な分析の目的は、遺伝子治療に対する炎症反応の動態を理解することである。５〜６ヶ月の観察期間を通した炎症反応の減少の観察は、視野に顕著な影響は無かった。

（高用量群の一つの眼の病理組織学的試験は炎症性細胞を示さない）
注射後３ヶ月の高用量群においてわれわれが観察した１つの眼でのみ組織学的病変が見られた。眼全体を固定し、切断し、断面を４０倍の分解能を有するnanozoomer技術を用いて観察した（図８）。炎症を示す構造的変化（繊維柱帯網及び虹彩角膜角におけるリンパ球若しくはプラズマ細胞、硝子体における炎症性細胞、又は網膜における血管周囲リンパ球の存在）は無かった（図８Ｂ〜Ｆ）。重要なことに、５×１０^１１ｖｇ用量群のこの動物（ＮＨＰ３）は、注射後１〜２ヶ月における倒像検眼鏡による評価において、硝子体混濁及び細胞の可変レベルを示した（図７）。３ヶ月において炎症細胞及び網膜のダメージがないことは、進行性の前眼房フレア又は硝子体混濁が網膜構造において永続的変化を引き起こさないこと、並びに網膜全体及び眼の前領域がダメージ又は炎症のサインを回避したことを示す。従って、ＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）の制御下での光遺伝子発現は、炎症反応を誘導しないことが明らかである。

（ＮＨＰの中心窩周縁領域におけるＣａｔＣｈを発現するＲＧＣの割合）
ＭＥＡ記録後に、網膜フラットマウントを抗チャンネルロドプシン抗体（Busskamp et al. Science 2010;3(June):413-7）、抗Ｂｒｎ３ａ抗体及びＧＦＰ抗体（存在する場合）で染色した。ＮＨＰ１からの組織を、緑色の抗ＧＦＰ抗体及び赤色の抗Ｂｒｎ３ａ抗体で標識した（図９Ｂ）。Ｂｒｎ３ａ及び抗チャンネルロドプシン抗体が同一種で生産されているため、ＣａｔＣｈの局在を示す抗体と共に我々がＲＧＣ特異的マーカーであるＢｒｎ３ａを用いることができたのは、網膜のみである。中心窩の中心から１ｍｍ未満におよぶ四角形の範囲のこの組織において、我々は中心窩の周囲の６００μｍの半径の半円内におけるＢｒｎ３ａ（＋）及びＣａｔｃｈ−ＧＦＰ（＋）細胞をカウントした。この領域において、約３７％のＢｒｎ３ａ（＋）細胞はＧＦＰ陽性であった（１４１３個のＢｒｎ３ａ陽性細胞中、５２３個のＧＦＰ陽性細胞）。ＮＨＰ２から得られた組織において、我々は、一つの眼の半分において１３５１個のＣａｔＣｈ陽性細胞をカウントし、反対側の眼の中心窩の中心から６００μｍにわたる範囲において４５５個カウントした。高用量群の網膜の１つはＭＥＡ記録後に損傷し、免疫蛍光標識を用いることができなかった。これらの結果は、中心窩の周縁におけるＲＧＣ細胞の少なくとも４分の１が、５×１０^１１ｖｇで注射した後にＣａｔＣｈで標識されたことを示す。

（単一細胞のパッチクランプ記録が中心窩の周縁の個々のＲＧＣにおいてＣａｔＣｈ作動性光電流を示す）
AAV2-SNCG-hCatCh-GFPが注射されたＮＨＰ１を注射の３ヵ月後に屠殺した。網膜を解剖し、ＧＦＰ由来緑色蛍光が中心窩領域で最大であるため（図９Ａ）、中心窩領域をＭＥＡ及びパッチクランプ記録のために注意深く二等分した。この発現パターンは以前のＮＨＰ研究と一致していた（Dalkara et al. Sci Transl Med. 2013 Jun 12;5(189):189ra76; Yin etal. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Apr 25;52(5):2775-83）。我々の試験の全てにおいて、ＮＨＰの網膜における内在性光反応を、浴用液中の５０μＭの代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるＬ−（＋）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４）を用いて防止した。我々は、以前に、マウス（Nagel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003;100(24):13940-5）及びヒト（Tomita et al. Mol Ther. 2014 Aug;22(8):1434-40）の網膜における野生型網膜の全てのＯＮ反応に対するＬ−ＡＰ４防止を検証している。

単一細胞レベルにおいて、パッチクランプ記録は、AAV2-SNCG-hCatCh及びAAV2-SNCG-hCatCh-GFPの両方の条件（それぞれｎ＝２細胞、ｎ＝３細胞）由来のＲＧＣにおける４７０ｎｍでの１．４６×１０^１６ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓで光応答を証明した（図１０）。AAV2-SNCG-hCatChのＲＧＣは、蛍光標識による補助なくパッチされなければならなかった。全ての反応細胞は、中心窩の中心の周りの乳頭（５００〜６００μｍ）で見られた（図１０Ａ）。いくつかの場合において、細胞接触形態において記録された細胞は速く且つ強いスパイクパターンを示した（図１０Ｂ）。我々は、リドカインの存在下で−６０ｍＶの保持電位において、細胞全体の形態で定常電流が後に続く速い過渡電流からなる典型的なチャンネルロドプシン誘発光電流を観察した（図１０Ｃ）。その光電流は４５０ｎｍでの刺激においてピークを示し、５００ｎｍまでで発生が維持され（図１０Ｄ）、それらは２２Ｈｚの光パルスが続くのに十分な速さであった（図１０Ｅ）。二光子レーザでスキャンされた場合、ＣａｔＣｈ−ＧＦＰ神経節細胞は、中心窩周縁領域で強い膜結合ＧＦＰ標識を示した（図１０Ｆ〜Ｇ）。

５×１０^１１又は１×１０^１２ｖｇ／ｄｏｓｅのAAV2-CMV-hCatCh又はAAV2-SNCG-hCatChを注射されたサルを注射の６ヵ月後に屠殺した。単一細胞記録技術（細胞接触及びパッチクランプ記録）を用いて、我々は、低用量ＳＮＣＧ群で観察された例を含む図１０Ｈに示すように、全ての群からの光応答（光電流及びスパイク活動）を記録できた。

（注射後６ヶ月におけるＮＨＰの網膜でＣａｔＣｈを発現するＲＧＣの単一細胞記録（細胞接触及びパッチクランプ））
我々は、光強度の関数として、反応性細胞の数（図１１Ａ〜Ｃ）及び最大発火頻度（図１１Ｄ）又は光電流（図１１Ｅ、高用量のみ）に関して４つの群を比較した。我々は、両ウィルス用量において、AAV2-SNCG-hCatChを注射された動物由来の記録された中心窩周辺細胞が、AAV2-CMV-hCatChを注射された動物由来の記録された細胞よりも光応答する可能性が高いことを発見した。また、我々の結果は、ＳＮＣＧ応答性細胞群（両用量）がＣＭＶプロモーターを含む群よりも光感受性が高い（発火活動が速い）ことを示した。

（ＮＨＰの網膜のマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）記録により測定されたＣａｔＣｈを発現するＲＧＣの機能性反応）
これらの光電流が個体群レベルでＲＧＣ活性をどのように制御しているか定義するために、網膜フラットマウントをマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）技術で記録した。図１２Ｂは、ＮＨＰ１の左眼の単一ユニット記録からのラスタープロットを示す（高用量）。光反応は、網膜フラットマウントで見られる中心窩周辺のＧＦＰ発現と相関した（図１２Ａ〜Ｄ）。５倍低い用量を注射した反対側の眼では反応は得られなかった。次に、我々は、ＧＦＰタグが付いていない高用量のAAV2-hCatChを注射された他の動物を屠殺した。高用量群から得られた４つの網膜の全ては、９０％以下の光に反応する記録されたＲＧＣを含むＬ−ＡＰ４での阻害下で同様の光反応を示した（図１２Ａ）。同様に、光応答性細胞の分布は、AAV2-SNCG-hCatChベクターを含む場合でさえ中心窩領域が常に中心であった。これらの結果は、ＧＦＰタグがＲＧＣにおける機能的ＣａｔＣｈ発現を得るのに必要でないことを示す。発火頻度のスペクトル同調を算出し、４８０ｎｍの光に対する最も高い周波数応答を示し、それはＣｈＲ２の励起ピークに対応する。応答性細胞の発火率頻度は、１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ^２／ｓで適用された最大光強度で最大に達する強度依存性であった（図１２Ｄ）。

低用量群において、５つの記録した網膜のうち２つは、光遺伝学的光応答を示し、１０％未満の記録されたＲＧＣがそれらの網膜において光応答をした。他の網膜は、自発的なＲＧＣ活性を示したが、Ｌ−ＡＰ４存在下で光反応は無かった。これらの結果は、我々がＣａｔＣｈの発現を介するＲＧＣの信頼できる光遺伝学的活性を期待できる閾値が１０^１１粒子であることを示す。

注射後６ヶ月において、ＲＧＣのＣａｔＣｈの発現は、３ヶ月時点の反応に相当した。ＣａｔＣｈを介した光応答は、試験した網膜の全てで観察された。光応答の間の放電周波数は、１．１０^１４から１．１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ^−２．ｓ^−１の範囲の強度において、AAV2-SNCG-hCatChベクターが感染された組織の方がAAV2-CMV-hCatChが感染された網膜と比較して高かった（図１２Ｅ）。光応答を起こす閾値は、ＳＮＣＧ網膜においてより低かった（それぞれ６．１０^１４及び８．１０^１５ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ^−２．ｓ^−１）。ＳＮＣＧ組織において、全ての強度における放電周波数は、ウィルス粒子の用量に相関し、より高いウィルス用量を含む組織は最も強い反応を示した。これらの結果は、ＳＮＣＧプロモーターがＣＭＶプロモーターと比較してマカクの網膜神経細胞におけるＣａｔＣｈ発現の作動により有効であり、より暗い光レベルでより強い光応答が可能であることを全体的に示す。

注射後６ヶ月において、ＲＧＣのＣａｔＣｈの発現は、３ヶ月時点の反応に相当した。ＣａｔＣｈを介した光応答は、試験した網膜の全てで観察された。光応答の間の放電周波数は、１．１０Ｅ１４から１．１０Ｅ１７ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ^−２．ｓ^−１の範囲の強度において、AAV2-SNCG-hCatChベクターが感染された組織の方がAAV2-CMV-hCatChが感染された網膜と比較して高かった。光応答を起こす閾値は、ＳＮＣＧ網膜においてより低かった（それぞれ６．１０Ｅ１４及び８．１０Ｅ１５ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ^−２．ｓ^−１）。ＳＮＣＧ組織において、全ての強度における放電周波数は、ウィルス粒子の用量に相関し、より高いウィルス用量を含む組織は最も強い反応を示した。これらの結果は、ＳＮＣＧプロモーターがＣＭＶプロモーターと比較してマカクの網膜神経細胞におけるＣａｔＣｈ発現の作動により有効であり、より暗い光レベルでより強い光応答が可能であることを全体的に示す。

［実施例７］
（配列番号１のプロモーター配列を用いた霊長類網膜における強いＲＧＣ特異的発現）
このベクターは、ＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）の制御下でChrimsonR-tdTomato（Klapoetke et al., NatMethods, 2014 Mar;11(3):338-46）のコード配列をカプシドで包み、網膜への導入を最適化されたＡＡＶカプシド変異体であるＡＡＶ２−７ｍ８（Dalkara et al., Sci Trans Med, 2013 Jun 12;5(189):189ra76）からなる。

血清中に抗ＡＡＶ２中和抗体力価が無いことに基づいて、４匹の非ヒト霊長類を選択した（Kotterman et al. Gene Ther. 2015 Feb;22(2):116-26）。それら４匹の成体マカクにＳＮＣＧプロモーター下でChrimsonR-tdTomatoをコードする５×１０^１１粒子のＡＡＶ２−７ｍ８を硝子体内注射した（表２）。

表２：非ヒト霊長類への注射：動物番号、ＡＡＶベクター及び硝子体内注射したウィルス用量

ＮＨＰにおいて、眼底の蛍光は２ヶ月間続いた。蛍光眼底画像では、ＣＡＧプロモーターを注射された眼に対して、ＳＮＣＧプロモーターを注射された全ての眼の方がより強い蛍光を示した（図１３及び１４）。末梢から広い範囲にわたるChrimsonR-tdTomato発現が、ＮＨＰ２の右眼及び他の眼において明確に見えた。

（ＮＨＰの網膜のマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）記録により測定されたChrimsonRを発現するＲＧＣの機能性反応）
ChrimsonR-tdTomatoの選択的ＲＧＣ標的化が霊長類における視覚機能を修復できることを証明するために、我々は、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて網膜神経節細胞からのスパイク活動を記録した。ＭＥＡ記録を注射の６ヶ月後に行った（図１５）。

MCRackソフトウェア及び異なる記録電極における代表的活性を用いて、色分けされた反応画像を生成した。１０ミリ秒の全視野フラッシュ（６００＋／−２０ｎｍで２×１０^１７ｐｈｏｔｏｎｓ．ｃｍ²．ｓｅｃ^−１）を含む３００ミリ秒の時間ウィンドウに存在するスパイクの数に基づいて頻度を算出した。スパイクは、２００Ｈｚハイパス二次バターワースフィルタで、また、２０μＶでフィルタリングされた信号が生じる閾値で検出された。同一のパラメーターが、異なる網膜の全てにおいて、全ての電極のために用いられる。ＭＥＡ記録グリッドにおけるChrimsonR-tdTomato蛍光の画像は、ChrimsonRの発現が非特異的ＣＡＧプロモーターよりもＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）での方がより広い領域で得られることを確認した。さらに、ＲＧＣにおけるスパイク活動は、ＣＭＶプロモーターよりもＳＮＣＧプロモーター（配列番号１）で広い領域において記録された。この試験は、ＣＡＧプロモーターよりもＳＮＣＧプロモーターの方がより大きい領域の光遺伝学活性を起こす証拠を提供する。

全てのマカクの網膜を、単一細胞電気生理学的試験前に画像化した。試験期間の間、神経節細胞が上を向くように網膜片の半分を、３６℃の酸素を含む（９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２）Ａｍｅｓメディウムを含む顕微鏡の記録チャンバに置いた。落射蛍光イメージング又はライブ二光子イメージング（図１６）のために、td-tomato蛍光の取得は、それぞれtd-tomatoフィルタ及びＣＣＤカメラ（Hamamatsu Corp., Bridgewater, NJ）を用いて、又は１０３０ｎｍの波長での２光子レーザ励起を用いて行った。５倍及び４０倍の倍率の対物レンズを用いた。さらに、これらの蛍光の観察は、ＣＡＧプロモーターよりもＳＮＣＧプロモーターによりChrimsonR-tdTomatoの広い発現を確認し、それらは、中心窩周辺の輪の外部の発現が蛍光スポット（図１５Ｂ）により示されるようにＳＮＣＧプロモーターを用いることにより得られることを示す。最後に、二光子顕微鏡下で、ChrimsonR-tdTomatoの局在は、ＳＮＣＧプロモーターを含む細胞膜に制限されることを明らかにした（図１５Ｄ右欄）。

Claims (38)

1. 目的のポリペプチド又は核酸をコードする核酸に作動可能に連結された網膜神経節細胞においてプロモーター活性を有する核酸を含む発現カセットであって、
   前記プロモーター活性を有する核酸は、１．５ｋｂ未満の長さを有し、且つ、配列番号１の配列又は配列番号１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列番号１の配列の機能性変異体を含む又はからなる発現カセット。
2. 前記プロモーター活性を有する核酸は、網膜神経節細胞に特異的なプロモーター活性を有する請求項１に記載の発現カセット。
3. 前記プロモーター活性を有する核酸は、配列番号１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む又はからなる請求項１又は２に記載の発現カセット。
4. 前記プロモーター活性を有する核酸は、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む又はからなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現カセット。
5. 前記プロモーター活性を有する核酸は、配列番号１の配列からなる請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセット。
6. 前記プロモーター活性を有する核酸は、１．２ｋｂ未満の長さを有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセット。
7. 前記プロモーター活性を有する核酸は、１ｋｂ未満の長さを有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現カセット。
8. 前記プロモーター活性を有する核酸は、目的のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。
9. 前記目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、光遺伝学的アクチュエータ又はレポータータンパク質である請求項８に記載の発現カセット。
10. 前記目的のポリペプチドは、治療用タンパク質である請求項９に記載の発現カセット。
11. 前記治療用タンパク質は、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７及びＡＣＯ２からなる群から選択される請求項１０に記載される発現カセット。
12. 前記治療用タンパク質は、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ及びＥＰＯからなる群から好ましくは選択される神経栄養因子、ＢＣＬ２及びＢＣＬ２Ｌ１からなる群から好ましくは選択される抗アポトーシスタンパク質、エンドスタチン、アンジオスタチン及びｓＦｌｔからなる群から好ましくは選択される抗血管新生因子、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ及びＩＬ４からなる群から好ましくは選択される抗炎症因子、又は杆体由来の錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）である請求項１０に記載の発現カセット。
13. 前記目的のポリペプチドは、光遺伝学的アクチュエータである請求項９に記載の発現カセット。
14. 前記光遺伝学的アクチュエータは、ロドプシン、フォトプシン、メラノプシン、ピノプシン、パラピノプシン、ＶＡオプシン、ペロプシン、ニューロプシン、エンセファロプシン、レチノクロム、ＲＧＲオプシン、赤色にシフトした分光特性を有するＲｅａＣｈＲ、Ｃｈｒｉｍｓｏｎ若しくはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ等の微生物性オプシン、Ｇ_ｉ／Ｏシグナルをリクルートできる短波長脊椎動物オプシン若しくは長波長脊椎動物オプシン等の脊椎動物オプシン、Chlamydomonas属の微細藻類由来のチャンネルロドプシン−１及びチャンネルロドプシン−２（Chlamydomonas reinhardtii由来）等のチャンネルロドプシン、並びにそれらの変異体からなる群から好ましくは選択される光遺伝学的活性化因子である請求項１３に記載の発現カセット。
15. 前記光遺伝学的アクチュエータは、ハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、増強型ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ２．０及びｅＮｐＨＲ３．０）及び赤色にシフトしたハロロドプシン、Ｈａｌｏ５７、古細菌ロドプシン−３（ＡＲ−３）、古細菌ロドプシン（Ａｒｃｈ）、増強型バクテリオロドプシン（ｅＢＲ）等のバクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、Leptosphaeria maculans真菌オプシン（Ｍａｃ）、クラックスハロロドプシンＪａｗｓ、並びにそれらの変異体からなる群から好ましくは選択される光遺伝学的阻害因子である請求項１３に記載の発現カセット。
16. 前記目的のポリペプチドは、蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びそれらの変異体からなる群から好ましくは選択されるレポータータンパク質である請求項９に記載の発現カセット。
17. 前記プロモーター活性を有する核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムからなる群から好ましくは選択される目的の核酸をコードする核酸に作動可能に連結されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。
18. 前記目的のポリペプチドは、ＳＮＣＧタンパク質ではない請求項１〜１７のいずれか１項に記載の発現カセット。
19. 前記目的のポリペプチドは、ルシフェラーゼではない請求項１〜１８のいずれか１項に記載の発現カセット。
20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
21. ウィルスベクターである請求項２０に記載のベクター。
22. 前記ウィルスベクターは、モロニーマウス白血病ウィルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ若しくはＳＮＶ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）若しくウマ伝染性貧血ウィルスに好ましくは由来するレンチウィルスベクター、アデノウィルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウィルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウィルスベクター、エプスタイン・バールウィルス、ヘルペスウィルスベクター、ワクチニアウィルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウィルスベクター、マウス乳がんウィルスベクター及びラウス肉腫ウィルスベクターからなる群から選択される請求項２１に記載のベクター。
23. 前記ウィルスベクターは、レトロウィルスベクターであり、好ましくはレンチウィルスベクター又は非病原性パルボウィルスである請求項２１又は２２に記載のベクター。
24. アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のベクター。
25. 請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクターを含むウィルス粒子。
26. 請求項２４に記載のベクター及びＡＡＶ由来カプシドを含むＡＡＶ粒子。
27. 前記ＡＡＶ由来カプシドは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ２−７ｍ８、ＡＡＶ−９及びＡＡＶ−８血清型カプシドから選択される請求項２６に記載のＡＡＶ粒子。
28. 前記ＡＡＶ由来カプシドは、ＡＡＶ−２由来カプシドであり、好ましくはＡＡＶ−２及びＡＡＶ２−７ｍ８カプシドから選択される請求項２７に記載のＡＡＶ粒子。
29. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクター又は請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のウィルス粒子により形質転換された細胞。
30. 網膜神経節細胞である請求項２９に記載の細胞。
31. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクター、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のウィルス粒子又は請求項２９若しくは３０に記載の細胞と、医薬的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
32. 眼疾患の治療のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクター、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のウィルス粒子、請求項２９若しくは３０に記載の細胞、又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
33. 前記眼疾患は、網膜神経節細胞変性又は光受容体細胞変性に関連する疾患である請求項３２に記載の使用。
34. 前記眼疾患は、網膜神経節細胞変性に関連する疾患であり、遺伝性視神経症、圧迫性視神経症、自己免疫性視神経症、糖尿病性網膜症、緑内障を含む緑内障性視神経疾患、動脈炎性虚血性視神経症、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症、感染性視神経症、脱髄疾患による視神経炎、放射線治療後視神経症及び腸性肢端皮膚炎からなる群から選択される請求項３３に記載の使用。
35. 前記眼疾患は、レーバー遺伝性視神経萎縮症又は優性視神経萎縮症から選択される遺伝性視神経症であり、好ましくはレーバー遺伝性視神経萎縮症、視神経萎縮１、視神経萎縮３及び視神経萎縮７から選択される請求項３３に記載の使用。
36. 前記眼疾患は、光受容体細胞変性に関連する疾患であり、加齢黄斑変性、レーバー遺伝性視神経萎縮症、錐体杆体変性、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜剥離、ベスト病、網膜色素変性、先天性脈絡膜欠如又は色素上皮網膜変性から選択される請求項３３に記載の使用。
37. 網膜神経節細胞に目的のポリペプチド又は核酸をコードする核酸を発現するための、請求項１〜１９のいずれか１項において定義された網膜神経節細胞においてプロモーター活性を有する核酸、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のウィルス粒子の使用。
38. 網膜神経節細胞に目的のポリペプチド又は核酸を発現させる方法であって、
    網膜神経節細胞に、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のウィルス粒子を導入することを含む方法。