KR102309911B1

KR102309911B1 - 신규한 아커만시아 뮤시니필라 ak32 균주의 발견 및 장 손상의 예방 또는 치료를 위한 응용

Info

Publication number: KR102309911B1
Application number: KR1020200056034A
Authority: KR
Inventors: 권미나; 김승일
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-10-07
Also published as: JP2023525322A; US20230321160A1; WO2021230581A1

Abstract

본 발명은 신규한 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 및 이를 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주는 소장 움 높이 및 술잔 세포 수를 증가시킬 뿐만 아니라, 소장 상피세포 증식과 관련된 유전자 발현을 촉진시키고, 소장 조직 및 소장 오가노이드의 재생 및 성장에 효과적이기 때문에, 이를 이용한 식품, 약학적, 정장용, 생균제, 프로바이오틱스 등의 제조에 효과적이다.

Description

신규한 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주의 발견 및 장 손상의 예방 또는 치료를 위한 응용 {Discovery of novel Akkermansia muciniphila AK32 strain and application for preventing or treating intestinal injury}

본 발명은 신규한 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 및 이를 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

염증성 장 질환은 특발성 질환으로 소화기관에 만성 및 재발성 염증과 장 점막 조직에 손상이 유발되는 질환이다.

통상적으로 크론병(Crohn's disease, CD)과 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)을 염증성 장 질환으로 명명하며, 그 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 유전적 소견, 면역과 환경적 요인 및 일부 미생물(병원균)에 의해 발병한다고 제시되고 있다.

보다 구체적으로는, 장벽의 면역 기능 이상 또는 장내 환경적 항원의 침입으로 인한 염증성 사이토카인의 증가와 병원균 감염 등으로 인한 장내 세균총의 장내 불균형(dysbiosis)이 주요한 원인으로 제시되고 있다. 특히 장내 세균의 다양성이 저하되고 특정 공생 세균인 프로테오박테리아(Proteobacteria) 중 장내세균과(Enteribacteriaceae)의 과잉 증식 및 부착, 및 침습성 대장균(AIEC)과 마이코박테리움(Mycobacterium)과 같은 특정 병원균의 감염에 의해 장내 불균형이 야기되는 것으로 알려져 있다.

한편, 유산균의 항균 효과 및 체내 면역 조절 작용을 통한 염증성 질환 완화 효과가 확인되면서, 유산균을 이용한 대장염 예방 또는 증상을 개선하고자 하는 연구들이 수행되었다.

특히 프로바이오틱스 유산균은 병원성 세균의 장내 부착을 방지하고, 젖산, 박테리오신과 같은 자체 항균 물질을 생산하여 병원성 세균의 침입을 막는다. 이러한 병원성 미생물에 의해 장내 불균형(dysbiosis)이 일어난 장내 균총을 조절하여 숙주의 특정 기관에 영향을 미칠 수 있으며, 장내 균총과 장 점막 간 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 장 점막 부착능과 점액질 분비량, 뮤신(mucin)과 같은 방어물질의 생성 및 장 점막의 밀착 연접 보전(tight junction integrity)을 증가시켜 장 점막의 기능을 개선시킬 수 있다.

락토바실러스 종(Lactobacillus sp), 비피도박테리움 종(Bifidobacterium sp), 사카로마이세스 보울라디 (Saccharomyces boulardii), 에세케리아 콜라이(Escherichia coli) Nissle1917 및 복합유산균 제품인 VSL#3가 가장 보편적으로 염증성 장 질환의 치료에 사용되고 있다. 특히 프로바이오틱스의 염증성 장 질환에 대한 효과는 외과 수술을 마친 궤양성 대장염 환자의 낭염 치료에서 가장 우수하게 나타났다.

그러나 이러한 프로바이오틱스 미생물의 잠재적 효과에도 아직까지 프로바이오틱스에 대한 작용 기작이 명확하게 밝혀지지 않았으며, 이에 따른 추가적인 연구 결과가 요구되고 있다.

Journal of Functional Foods, 2018, Vol. 47, pp. 304-315

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주를 제공하는 것으로서, 본 발명자들은 본 발명의 신규한 AK32 균주가 소장 움 (crypt) 높이 및 술잔 세포 (goblet cell) 수를 증가시킬 뿐만 아니라, 소장 상피세포 증식과 분화에 관련된 유전자 발현을 촉진시키고, 소장 조직의 재생 및 성장에 효과적임을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스 (probiotics)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 또한, 본 발명은 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스 (probiotics)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 손상을 예방 또는 개선할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 MMD (methylmalonylCoA/oxaloacetate decarboxylase beta subunit) 효소를 생산할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 상피세포 증식을 촉진할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 장 손상은 방사선 조사에 의한 장 손상, 약물에 의한 장 손상, 알코올성 장 손상 및 염증성 장질환에 의한 장 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 염증성 장질환은 십이지장궤양, 장폐색증, 급성 위장관 출혈, 크론씨 질환(Crohn's desease), 장관형 베체트병, 회장낭염(pouchitis), 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물의 장 손상의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액의 장 손상에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주는 소장 움 높이 및 술잔 세포 수를 증가시킬 뿐만 아니라, 소장 상피세포 증식과 관련된 유전자 발현을 촉진시키고, 소장 조직 및 소장 오가노이드의 재생 및 성장에 효과적이기 때문에, 이를 이용한 식품, 약학적, 정장용, 생균제, 프로바이오틱스 등의 제조에 효과적이다.

도 1a는 A. muciniphila BAA-835 또는 대변으로부터 채집된 A. muciniphila 균주 AK14, AK21 또는 AK32의 배양 상청액으로 처리된 소장 오가노이드의 명시야 이미지 및 표면적을 나타낸 것이다. scale bar = 50μm.
도 1b는 Gpr41 / Gpr43 길항제의 존재 또는 부존재 하에 배양 상청액으로 처리된 소장 오가노이드의 명시야 이미지 및 표면적을 나타낸 것이다. scale bar = 50μm.
도 1c는 PDH (pyruvate dehydrogenase) E1 component 및 MMD (methylmalonylCoA/oxaloacetate decarboxylase beta subunit)의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 A. muciniphila BAA-835 또는 AK32 식이 마우스의 소장 오가노이드의 명시야 이미지 및 표면적을 나타낸 것이다. scale bar = 50μm.
도 1e는 A. muciniphila BAA-835 또는 AK32 식이 마우스 소장에서의 술잔 세포 수 및 움의 높이를 나타낸 것이다. scale bar = 10μm.
도 1f는 AK32 균주 식이 마우스 소장 조직에서 Lgr5, Lyz1, Muc2, Wnt3, Axin2 및 Ctnnb1의 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 AK32 균주의 전체 게놈 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 AK32 균주와 BAA-835균주의 PDH 및 MMD 아미노산 서열을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 AK32 균주와 BAA-835균주의 균 배양액에서의 SCFA를 비교한 결과 (A) 및 각 균주를 마우스에 4주간 구강 투여 후 맹장 내용물에서 SCFA를 비교한 결과 (B)를 나타낸 것이다.

본 발명은 아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주를 제공한다.

본 발명의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 손상을 예방 또는 개선할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 MMD (methylmalonylCoA/oxaloacetate decarboxylase beta subunit) 효소를 생산할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 상피세포 증식을 촉진할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 AK32 균주가 기존의 다른 균주들과 비교하여 소장 오가노이드 증식능이 우수함을 확인하였다.

본 발명에서 용어 '배양'이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서는 '발효'를 포함하는 개념이다.

상기 '아커만시아 뮤시니필라 AK32'의 균체는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 용어 '배양액'은 '발효액'을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.

본 발명에서, 상기 장 손상은 방사선 조사에 의한 장 손상, 약물에 의한 장 손상, 알코올성 장 손상 및 염증성 장질환에 의한 장 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 방사선은 세포 내의 물과 반응하여 활성산소를 생성하고 이로 인해 유발된 독성이 세포 및 조직에 영향을 미치고, 염증 반응을 야기한다. 정상 조직이 방사선에 노출되면 정상 조직 내에 존재하는 방사선 감수성이 높은 세포들, 특히 혈관세포 및 면역세포가 영향을 받는다. 이 혈관세포와 면역세포는 염증 반응에 관여하는 대표적인 세포들이다. 따라서 방사선에 의해 나타나는 부작용 가운데 가장 높은 빈도를 차지하는 것이 장 염증, 예컨대 장염, 폐렴과 같은 염증 반응이다. 본 발명에 따르면, 상기 장 손상은 급성 위장관 증후군 (acute gastrointestinal syndrome, GIS) 이다.

본 발명에서, 상기 염증성 장질환은 십이지장궤양, 장폐색증, 급성 위장관 출혈, 크론씨 질환(Crohn's desease), 장관형 베체트병, 회장낭염(pouchitis), 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 장 기능 개선은 예를 들어, 장내 균총을 개선하는 것; 장내 유익균의 증식을 촉진하는 것; 장내 단쇄 지방산의 함량을 증가시키는 것; 유해균의 증식을 억제하는 것; 또는 장내 상피세포의 증식을 유도하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과가 나타나는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물 내의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주는 생균이나 프로바이오틱스로 인간 및 동물의 장 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 식품첨가용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하 여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 아커만시아 뮤시니필라 AK32, 이의 파쇄물 및 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.

담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여 방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32를 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛형으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 AK32로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 발효유, 빵 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 또는 이의 배양물은 발효제품 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 치즈, 김치, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 또는 이의 배양물을 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 AK32 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 발효 생식제품을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물의 염증성 장질환 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액의 염증성 장질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험예 1. 실험 방법

실험예 1-1. 마우스 준비

본 발명 실시예에서 사용된 모든 동물은 8-10 주령 암컷 마우스이며, 무균 음식과 물을 자유롭게 섭식하였다. C57BL/6 마우스는 OrientBio (Korea)에서 구입하였다. 마우스는 아산 병원 (Korea)의 동물 시설에 수용하고 특정 병원체가 없는 조건에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 Asan Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 2019-12-251)로부터 승인받았다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.

실험예 1-2. 인간 대변에서 A. muciniphila 균주의 분리

A. muciniphila의 새로운 11개의 균주를 32 명의 지원자 건강한 사람의 대변에서 분리하였다. 대변을 PBS로 용해하고, GasPak 100 시스템 (BD Bioscience)을 사용하여 혐기성 조건 하에서 37 ℃에서 덱스트로스가 포함되어 있지 않은 0.4 % 뮤신 첨가 BHI 한천 배지 (KisanBio)에 분주하였다. A. muciniphila를 단리하고 프라이머 세트 5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3' (서열번호 1) 및 5'- CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3' (서열번호 2) 를 사용하여 PCR로 확인하였다.

실험예 1-3. A. muciniphila의 경구 투여

A. muciniphila (ATCC BAA-835^T) 및 새로 분리된 A. muciniphila AK32 균주를 0.4 % mucin (Sigma)이 보충된 뇌 심장 주입 배지 (BD Bioscience)에서 배양하고, 37 ℃에서 GasPak 100 시스템 (BD Bioscience)을 사용하여 혐기성 배양하였다. 배양된 배양물을 농축시키고 혐기성 PBS에 현탁시킨 뒤, 경구용 Zonde 바늘로 4 주 동안 매일 마우스 (용량 당 8 x 10⁸ CFU)에 투여 하였다.

실험예 1-4. 움 (crypt) 분리

소장 (Small intestinal, SI)을 종 방향으로 개방하고 PBS로 세척하였다. 움을 분리하기 위해, 조직을 PBS 중의 1 mM EDTA에서 4 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, PBS에서 세척 한 후, 4 ℃에서 추가 1 시간 동안 인큐베이션하기 위해, PBS에서 5 mM EDTA로 옮겼다. 이어서, 샘플을 PBS에 현탁시킨 뒤, 70㎛ 세포 스트레이너 (BD Falcon)로 여과하였다.

실험예 1-5. 오가노이드 배양

오가노이드 배양을 위해, 웰당 200-500 개의 움을 Matrigel (Corning)에 부유시켰다 (suspended).

Advanced DMEM/F12 (Gibco), ×100 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 1 mM N-아세틸 시스테인 (Sigma-Aldrich), B27 보충제 (Thermo Fisher Scientific), N2 보충제 (Thermo Fisher Scientific), EGF (Thermo Fisher Scientific), Noggin (R & D Systems) 및 R-spondin-1-조절 배지를 포함하는 완전 ENR 배지 (노긴이 보충된 ER 배지) 에서 배양하였다. ENR 배지는 2 ~ 3 일마다 교체하였다. 오가노이드의 표면적은 반전 현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 웰에서 오가노이드의 임의의 겹치지 않는 사진을 찍음으로써 현미경으로 측정하였다. ImageJ 소프트웨어 (NIH) 및 Zen 이미지 프로그램 (Carl Zeiss)을 사용하여 각 사진을 분석하였다. 면적 측정을 위한 오가노이드 둘레는 수동 및 자동화 된 ImageJ 소프트웨어로 측정하였다.

실험예 1-6. 조직학

소장 회장을 제거하고 종 방향으로 개방하였다. 이어서, 스위스 롤에 의해 조직을 제조하고, 4 % 파라포름알데히드 (PFA)에 고정시킨 후, 파라핀에 포매시켰다. 조직 섹션은 헤마톡실린-에오신 (H & E) 또는 Periodic acid-Schiff (PAS)로 염색하였다.

실험예 1-7. 오가노이드에 대한 맹장 (cecum) 내용물 처리

각 100mg의 맹장 내용물을 1ml의 무혈청 DMEM/F12 (Gibco) 배지에 희석하고 1 시간 동안 볼텍스로 회전시켰다. 내용물을 4,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, 배양하기 전에 상청액을 0.22-μm 주사기 필터 (Pall Corporation)를 통과시켰다. 맹장 내용물의 구성에 대한 효과를 다루기 위해, 고급 DMEM/F12에서 부유된 맹장 내용물의 0.01 % 상청액으로 ENR 배지를 보충하였다. Gpr43 길항제 (GLPG0974, 0.1 μM, Tocris) 및 Gpr41 길항제 (β-하이드록시 부티레이트, 3 mM, Sigma)를 사용 하였다.

실험예 1-8. 전체 게놈 시퀀싱

아가로스 겔 전기영동을 실행하여 gDNA의 완전성을 점검하고, Quant-IT PicoGreen (Invitrogen)을 사용하여 gDNA를 정량화 하였다. 이어서, 서열 라이브러리는 PacBio DNA 템플릿 준비 키트 1.0을 사용하는 BluePippin^TM 사이즈 선택 시스템을 사용한 20-kb 템플릿 제제의 지침서에 따라 제조하였다. 라이브러리는 Quant-IT PicoGreen을 사용하여 정량화하고, 고감도 DNA 칩 (Agilent Technologies)을 사용하여 검증하였다. 이어서, 라이브러리를 PacBio RSII의 8-웰-SMART cell v3에서 PacBio P6C4 chemistry을 사용하여 시퀀싱하였다. AK32의 게놈은 새로운 PacBio 시퀀싱 데이터로 구축되었다. 이어서, Chunlab, Inc.에서 시퀀싱 분석을 수행하였다. PacBio 시퀀싱 데이터는 HGAP2 프로토콜 (Pacific Biosciences)을 사용하여 PacBio SMRT Analysis 2.3.0으로 수집하였다. PacBio 시퀀싱 데이터로부터 얻은 결과물은 서클레이터 1.4.0 (Sanger Institute)을 사용하여 원형화하였다. 전체 게놈의 유전자 찾기 및 기능 주석 파이프 라인 (functional annotation pipeline)은 EzbioCloud 게놈 데이터베이스를 사용하였다. 단백질 코딩 서열은 Prodigal 2.6.2에 의해 예측되었다. tRNA를 코딩하는 유전자를 tRNAscan-SE 1.3.1을 사용하여 검색하였다. rfam 및 기타 비코딩 RNA는 Rfam 12.0 데이터베이스에서 검색하였다. 비교 전체 게놈은 평균 뉴클레오티드 동일성 염기 BLAST (ANIb)로 연구하였다. ANIb 값은 Kostas lab (http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani)의 ANI 계산기로 계산하였다.

실험예 1-9. Real-time PCR

소장 및 오가노이드로부터의 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하고, cDNA를 Supercript Ⅱ 역전사 효소 및 올리고 dT 프라이머 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 합성하였다. A. muciniphila의 총 RNA는 Trizol (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 추출하였다. 박테리아 RNA를 사용한 cDNA 합성을 위해, gDNA 리무버 (Toyobo)와 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix를 사용하였다. cDNA는 Real-time PCR 시스템 (Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 화학 (Affymetrix)을 사용하여 수행된 Real-time PCR의 주형으로 사용되었다.

사용한 프라이머는 다음과 같다 : Muc2, 5’-CCTTAGCCAAGGGCTCGGAA-3’ 및 5’-GGCCCGAGAGTAGACCTTGG-3’; Lyz1, 5’-ATGGCGAACACAATGTCAAA-3’ 및 5’-GCCCTGTTTCTGCTGAAGTC-3’; Wnt3, 5’-CTTCTAATGGAGCCCCACCT-3’ 및 5’- GAGGCCAGAGATGTGTACTGC-3’;Axin2, 5’-AACCTATGCCCGTTTCCTCT-3’ 및 5’-GAGTGTAAAGACTTGGTCCA-3’; Ctnnb1, 5’-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3’ 및 5’-TGGGAGGTGTCAACATCTTC-3’; Lgr5, 5’-CCTGTCCAGGCTTTCAGAAG-3’ 및 5’-CTGTGGAGTCCATCAAAGCA-3’; β-actin, 5’- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’ 및 5’- TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’; pdh, 5’- AACCGATTATTGAAGCGGCA-3’ 및 5’-ATATTGGCGGCTTCGTGAAA-3’; mmd, 5’- GACCAAGAAGGAACGCCTCA-3’ 및 5’-GTTCCGTCACCTTGCATTCG-3’; Universal 16S rDNA. 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 및 5’- ATTACCGCGGCTGCTGG-3’; A. muciniphila 16S rDNA, 5’-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3’ 및 5’-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3’.

실험예 1-10. SCFA (Short-chain fatty acid)의 정량적 측정

대사 산물 분석을 위한 모든 시약 및 용매는 Sigma에서 구입하였다. 마우스 맹장 내용물의 경우, 10-20 mg의 맹장 내용물을 400 ㎕의 내부 표준 용액 (1 mM의 프로피온산 (C3)-d6, 100 μM의 부티르산 (C4)-d7)으로 격렬하게 균질화시켰다. 균 배양 상청액의 분석을 위해, 100 ㎕의 배양 상청액을 200 ㎕의 내부 표준 용액과 혼합하였다. 원심 분리 후, 상청액을 여과 제거 하였다. AABD-SH (20 ㎕, 20 mM), TPP (Triphenylphosphine, 20 ㎕, 20 mM) 및 DPDS (2,2-dipyridyl disulfide, 20 ㎕)가 포함된 디클로로메탄을 여과액에 첨가하였다. 볼텍싱하면서 상기 용액을 실온에서 10 분 동안 배양하고, 진공 건조시켰다. 샘플을 80 μL 메탄올로 재구성하고 LC-MS/MS 분석을 준비하였다. 1290 HPLC (Agilent Technologies, Denmark), Qtrap 5500 (ABSciex) 및 역상 컬럼 (Pursuit 5 C18 150 × 2.0 mm, Agilent Technologies)이 장착된 LC-MS/MS 시스템을 사용하였다. 각 대사 산물에 대한 특정 전이에 해당하는 추출된 이온 크로마토 그램 (EIC, Extracted ion chromatogram)을 정량에 사용하였다. 각 EIC의 곡선 아래 면적은 내부 표준의 EIC 면적으로 정규화하였다. 각각의 대사 산물 대 내부 표준물의 피크 면적 비율을 샘플에서의 혈청 부피 또는 조직 중량을 사용하여 표준화한 다음, 상대적인 비교를 위해 사용하였다.

실험예 1-11. 통계 분석

통계 분석은 프리즘 소프트웨어 (GraphPad, La Jolla, CA)를 사용하여 수행 하였다. Pairwise 및 2 개의 독립적인 그룹의 비교를 위해 two-tailed t-test을 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시하였으며, p <0.05, p <0.01, p <0.001은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1. A. muciniphila AK32 균주의 분리 및 기탁

ISC-매개 상피 발달에서 일반적으로 사용되는 유형 균주 (즉, ATCC BAA-835^T) 보다 더 나은 A. muciniphila 균주를 발견하기 위해, 건강한 인간 대변으로부터 A. muciniphila를 분리하였다. 선택적 배지 및 종 특이적 PCR을 사용하여, 3개의 A. muciniphila 균주 (AK14, AK21,AK32)를 수득하였다.

ISC 매개 상피 발달에 대한 단리된 A. muciniphila 균주의 효과를 평가하기 위해, 각각의 단리 된 균주로부터 수득된 배양 상청액의 존재 하에서 장 오가노이드를 사용하는 스크리닝 시스템을 채택하였다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 3 개의 새로 분리 된 균주 중에서 AK32의 배양 상청액만이 기존의 A. muciniphila 또는 다른 이소 타입 균주와 비교했을 때 오가노이드 크기가 유의하게 증가함을 확인하였다.

즉, 분리된 3개의 균주 중, A. muciniphila AK32 균주를 하기 실시예에 따라 가장 우수한 균주로 최종적으로 결정하였고, 아커만시아 뮤시니필라 에이케이32 (A. muciniphila AK32, AK32)로 명명하였다 (기탁번호 : KCTC 14172BP).

실시예 2. A. muciniphila AK32 균주의 장 손상 개선 효과 확인

먼저, AK32에 의해 증가된 ISC 매개 상피 발달이 SCFA에 의존하는지 여부를 확인하기 위하여, Gpr41/43 길항제를 채택하였다.

도 1b에 나타난 바와 같이, Gpr41/43 길항제를 사용한 군에서 AK32의 배양 상청액에 의해 상향 조절된 소장 오가노이드 크기가 상당히 감소되었다.

또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 기존의 ATCC BAA-835^T균주와 비교하여, AK32 균주에서 SCFA 분비에 영향을 미치는 효소 pdh (pyruvate dehydrogenase E1 component) 및 mmd (Na+ translocating methymalonyl-CoA/oxaloacetate decarboxylase) 발현이 유의하게 높음을 확인하였다.

또한, 도 1d에 나타난 바와 같이, 생체 내 AK32 균주의 상향 조절 기능을 추가로 확인하기 위해, 마우스에 4주 동안 AK32 또는 전형적인 A. muciniphila ATCC BAA-835^T를 식이하였다.

흥미롭게도, 기존의 ATCC BAA-835^T 식이 마우스와 비교하여 AK32 균주 식이 마우스에서의 소장 오가노이드 크기가 상당히 증가한 것으로 나타났다.

또한, 도 1e에 나타난 바와 같이, AK32 식이 마우스는 ATCC BAA-835^T와 비교하여 소장에서 움 높이 및 점액 생성 술잔 세포의 수를 증가시키는 것으로 나타났다.

또한, 도 1f에 나타난 바와 같이, AK32 식이 마우스는 ATCC BAA-835^T보다 소장에서 Lgr5, Lyz1, Muc2, Wnt3, Axin2 및 Ctnnb1의 mRNA 발현 수준을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다.

또한, 도 2에 AK32 균주의 전체 게놈 지도를 나타내었다.

또한, 도 3에 AK32 균주와 BAA-835 균주의 pdh 및 mmd의 아미노산 서열을 비교하였는 바, mmd 서열이 상이한 것으로 나타났다.

또한, 하기 표 1에 AK32 균주와 BAA-835 균주의 게놈 기능정보(genome annotation)을 분석한 결과를 나타내었다.

상기 결과로부터, 새로 발견된 AK32 균주가 ISC 매개 상피 발달 측면에서 특징적인 게놈을 가지면서, 기존의 A. muciniphila 균주와 비교하여 그 효과가 우수하며, strain 중에서도 그 효과가 단연 가장 우수함을 알 수 있었다.

실시예 3. A. muciniphila AK32 균주의 SCFA 분비 촉진 효과 확인

미생물 유래 대사 산물은 장 항상성을 유지하기 위한 주요 요인 중 하나이므로, A. muciniphila AK32 및 BAA-835 균 배양액에서의 SCFA를 비교하고,

마우스에 4주간 구강투여 후 맹장 내용물에서 SCFA의 양을 비교하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 AK32 균주는 BAA-835 균주와 유사하거나 그보다 우수한 SCFA 분비 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC14172BP

20200420

<110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Discovery of novel Akkermansia muciniphila AK32 strain and application for preventing or treating intestinal injury <130> MP20-053 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 cagcacgtga aggtggggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ccttgcggtt ggcttcagat 20 <210> 3 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AK32 MMD (Na+ translocating methymalonyl-CoA/oxaloacetate decarboxylase) <400> 3 Met Ser Leu Phe Asp Ser Leu Ile Thr Phe Leu Gln Gly Met Gly Val 1 5 10 15 Phe Ser Leu Ser Trp Gln Met Val Gly Met Trp Gly Ile Ala Ile Leu 20 25 30 Leu Leu Tyr Leu Gly Val Ala Lys Gln Tyr Glu Pro Leu Leu Met Val 35 40 45 Pro Ile Ala Phe Gly Ala Leu Ile Ala Asn Ile Pro Asp Asn Gly Met 50 55 60 Leu Ile Thr Gln Leu Asn Gln Gln Val Ile Ser Ser Asn Glu Gln Gly 65 70 75 80 Glu Val Thr Ser Thr Ser Leu Asn Asn Val Gly Tyr Leu Arg Val His 85 90 95 Val Ala Pro Leu Gln Gln Thr Pro Ala Lys Val Pro Ala Asn Leu Thr 100 105 110 Thr Pro Glu Ala Arg Ala Gln Tyr Leu Glu Thr Met Gln Gln Pro Met 115 120 125 Gln Val Tyr Pro Gly Ser Gln Leu Thr Val Ser Lys Ile Lys Ser Val 130 135 140 Arg Glu Ser Gln Glu Lys Ala Lys Ala Asp Ala Ala Arg Leu Gly Asp 145 150 155 160 Asp Ser Leu Thr Val Asp Pro Asn Leu Lys Asp Phe Gln Asn Val Glu 165 170 175 Asp Asn Gly Asn Glu Pro Val Phe Leu Leu Thr Asn Gly Glu Gly Thr 180 185 190 Thr Val Val Arg Gln Gln Gly Val Asn Tyr Phe Asp Thr Ser Gly Asn 195 200 205 Arg Val Pro Val Asp Leu Lys Thr Gln Lys Leu Glu Pro Leu Val Val 210 215 220 Ser Ala Ala Gly Lys Tyr Val Ala Val Gly Gln His Thr Gln Glu Leu 225 230 235 240 Leu Val Thr Ser Ile His Gly Gly Leu Tyr Asp Trp Ile Gly Leu Gly 245 250 255 Ile Lys Ala Glu Ile Phe Pro Pro Ile Ile Phe Leu Gly Val Gly Ala 260 265 270 Leu Thr Asp Phe Gly Pro Leu Leu Ala Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu 275 280 285 Gly Ala Ala Ala Gln Val Gly Val Ala Ala Thr Phe Phe Met Ala Leu 290 295 300 Phe Met Gly Phe Asn Pro Asn Glu Ala Ala Ser Ile Gly Ile Ile Gly 305 310 315 320 Gly Ala Asp Gly Pro Thr Ser Ile Phe Leu Thr Met Lys Leu Ala Pro 325 330 335 His Leu Leu Gly Ala Val Ala Val Ala Ala Tyr Thr Tyr Met Ser Leu 340 345 350 Val Pro Leu Ile Gln Pro Pro Ile Met Ala Leu Leu Thr Thr Lys Lys 355 360 365 Glu Arg Leu Ile Arg Met Lys Ser Leu Arg Thr Val Ser Lys Ser Glu 370 375 380 Lys Leu Phe Phe Ala Val Leu Val Thr Ile Val Thr Ile Leu Leu Ile 385 390 395 400 Pro Asp Ala Ser Pro Leu Ile Gly Met Leu Met Leu Gly Asn Phe Leu 405 410 415 Arg Glu Cys Lys Val Thr Glu Arg Leu Val Gln Ala Ser Gln Asn Glu 420 425 430 Ile Ile Asn Ile Val Thr Ile Phe Leu Gly Thr Ser Val Gly Leu Thr 435 440 445 Met Gln Gly Asp Arg Phe Leu Gln Ala Glu Thr Leu Leu Ile Ile Leu 450 455 460 Leu Gly Ile Val Ala Phe Gly Val Ala Thr Ala Gly Gly Val Ile Ala 465 470 475 480 Ala Lys Leu Met Asn Leu Ile Trp Arg Lys Asn Pro Val Asn Pro Leu 485 490 495 Ile Gly Ser Ala Gly Val Ser Ala Val Pro Met Ala Ala Arg Val Ser 500 505 510 His Asn Val Gly Gln Lys Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Leu Leu Met His 515 520 525 Ala Met Gly Pro Asn Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Ala Val Ile Ala 530 535 540 Gly Tyr Tyr Ile Ala Thr Leu Ala Lys 545 550 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Muc2 forward primer <400> 4 ccttagccaa gggctcggaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Muc2 reverse primer <400> 5 ggcccgagag tagaccttgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lyz1 forward primer <400> 6 atggcgaaca caatgtcaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lyz1 reverse primer <400> 7 gccctgtttc tgctgaagtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wnt3 forward primer <400> 8 cttctaatgg agccccacct 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wnt3 reverse primer <400> 9 gaggccagag atgtgtactg c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 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Sequence <220> <223> pdh forward primer <400> 18 aaccgattat tgaagcggca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdh reverse primer <400> 19 atattggcgg cttcgtgaaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmd forward primer <400> 20 gaccaagaag gaacgcctca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmd reverse primer <400> 21 gttccgtcac cttgcattcg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal 16S rDNA forward primer <400> 22 actcctacgg gaggcagcag 20 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal 16S rDNA reverse primer <400> 23 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A. muciniphila 16S rDNA forward primer <400> 24 cagcacgtga aggtggggac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A. muciniphila 16S rDNA reverse primer <400> 25 ccttgcggtt ggcttcagat 20

Claims

아커만시아 뮤시니필라 AK32 (Akkermansia muciniphila AK32)(기탁번호: KCTC 14172BP) 균주.
제1항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 손상을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 MMD (methylmalonylCoA/oxaloacetate decarboxylase beta subunit) 효소를 생산하는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 AK32는 장 상피세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 장 손상은 방사선 조사에 의한 장 손상, 약물에 의한 장 손상, 알코올성 장 손상 및 염증성 장질환에 의한 장 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 십이지장궤양, 장폐색증, 급성 위장관 출혈, 크론씨 질환(Crohn's desease), 장관형 베체트병, 회장낭염(pouchitis), 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 기능 개선용 식품 조성물.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스 (probiotics).
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
제1항의 아커만시아 뮤시니필라 AK32 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물.