KR102309495B1 - 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도 - Google Patents

사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기판에 나노선을 성장시키고, 성장된 나노선 위에 작용기를 도입한 후 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 산화아연 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 나노선 어레이는 검출감도가 향상되어 사스 코로나바이러스 2 항체 생성 여부에 대한 보다 정확한 진단이 가능하다.

Description

사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도{Nanowire-based immunofluorescence kits for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 antibodies and uses thereof}
본 발명은 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
형광면역분석법은 항원-항체 반응을 형광(fluorescence)을 이용하여 검출하는 분석법으로, 형광은 생체 내 약물·단백질의 위치 추적과 생체분자 검출 등을 포함하는 의학, 약학, 유전학 분야를 비롯하여 포토닉스, 분자 생물학, 재료과학, 화학 등 다양한 분야에 응용 가능하다. 형광을 이용한 분석방법은 높은 검출감도를 제공하지만, 표지(labeling)의 간접 방식으로 인한 양자효율의 한계, 분자간 회합(aggregate)에 따른 소광현상, 형광분자 외 다른 물질 자체의 형광으로 인한 중첩현상 및 형광신호 안정성 등의 문제가 있다. 형광분자의 형광 세기는 형광 기반 기술의 성능을 결정짓는 주요 요소로서, 형광 신호 향상을 위한 연구로 나노 물질 이용 기술이 연구되고 있다.
나노 물질은 최근, 나노입자, 나노선, 나노튜브 등 여러 형태로서 그 독특한 물리적, 화학적, 광학적 및 전기적 특성을 이용하여 다양한 기술분야에 활용되고 있으며, 나노구조체는 나노입자의 조성이나 형상, 배열에 따라 다양한 특성 조절이 가능하다. 이 중 1차원 나노 소재인 나노선(nanowire)은 직경이 10 nm 미만부터 수백 nm로, 우수한 결정성을 가지며, 넓은 비표면적으로 인해 높은 화학적 반응성, 양자제한 효과(quantum confinement effect), 자기조립(self-assembly), 응력 완화(stress relaxation) 등의 특징을 갖는다. 나노선은 Si을 비롯하여 ZnO, GaN, SnO2 등 다양한 재료를 기반으로 합성할 수 있으며, 그 중 산화아연(ZnO) 나노선은 우수한 광전자적 특성과 생체적합성, 낮은 독성, 손쉬운 표면개질 특성으로 인해 주목받고 있다.
나노선을 바이오소자에 이용시, 생체분자 고정을 위한 넓은 표면적을 제공하여 생체분자의 면역반응에 따른 감지신호를 향상시킬 수 있으며, 고민감성의 구현이 가능하다. 이에 따라 나노구조체 위에 생체분자의 정확한 고정을 통해 형광 신호를 향상시키는 기술이 개발되고 있다. 일 예로, 한국등록특허 제10-1837827호는 기판; 상기 기판에 고정되고, 상기 기판으로부터 수직하게 성장되어 있는 하나 이상의 나노구조물; 및 상기 나노구조물 표면에 고정되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며, 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅(intercalating)되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA을 포함하는 압타머 복합체;를 포함하는 생화학 분자 검출 장치에 대해 개시하고 있으며, 나노구조물의 특성을 제어하여 생화학 분자의 결합 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 한국등록특허 제10-1163535호는 나노틀 위에 나노선을 노출시켜 생체나노입자를 연결하고, 물리적 결합으로 나노 표면에 항체를 방향성 있게 배열하여 3차원적 부피 대 표면적 비율을 극대화시켰다.
한편, 사스 코로나바이러스 2는 제1급감염병 신종감염병증후군으로 분류되어 있고 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스다. 현재까지는 비말(침방울), 접촉을 통해 전파되고 있는데 특히 기침이나 재채기를 할 때 생긴 비말(침방울)을 통한 전파와 사스 코로나바이러스 2에 오염된 물건을 만진 뒤 눈, 코, 입을 만지는 경우 전파가 가능한 것으로 알려져 있다. 보통 1 내지 14일의 잠복기로 알려져 있고 평균 4 내지 7일 정도의 잠복기를 갖는다. 주요 증상으로는 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증가지 다양한 호흡기 감염증이 나타나고 그 외 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등을 동반하고 이를 치료하기 위해 수액 보충, 해열제 등 대증치료와 범용 항바이러스제를 임상에서 투약하고 있으나, 특이적인 항바이러스제는 전무한 상태이다. 이러한 사스 코로나바이러스 2의 감염을 진단하기 위해서는 상기도 또는 하기도 검체에서 바이러스를 분리하여 특이 유전자를 실시간 유전자 증폭을 통해서 감염 여부를 진단하고 있다.
기존 바이러스 검출은 PCR(유전자 증폭) 등의 분자생물학적 방법을 사용하는데 PCR 기법은 시간에 비례해서 지수적으로 증폭되기 때문에 민감도는 높지만 전문적인 전처리가 필요하고 복잡하고 전문적인 실험의 수행과 장비가 필요해 현장 적용의 어려움이 있다. 현재 사스 코로나바이러스 2 감염 환자의 검체로부터 실험실에서 바이러스 RNA를 추출하고 이를 DNA로 역전사하여 얻은 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및/또는 프로브를 이용해 실시간 유전자 증폭(Real-time RT-PCR)을 통해 바이러스 감염 여부를 진단하고 있다. 그러나 이러한 실시간 유전자 증폭은 신속한 현장진단(point-of-care)에 활용이 어렵다는 단점이 있다.
항원·항체 기반의 메르스 체외진단기술의 경우, 샌드위치 ELISA 기법을 이용한 면역크로마토그래피법 기반의 현장진단 가능 제품 및 재조합된 단백질 항원을 사용한 간접 ELISA 기법의 제품이 개발되었으며, 면역형광법 기반 및 단백질 마이크로어레이 기반의 항체 검출을 통한 바이러스 진단 기술이 연구되었다. 항원·항체 기반의 진단 기술은 유전자 검출 기반보다 진단 소요시간이 매우 짧고 특이도가 더욱 우수한 장점이 있지만, 민감도가 낮은 문제가 있어 이에 대한 개선이 필요하다.
이에 본 발명에서는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트를 개발하고자 하였다.
한국등록특허 제1837827호 한국등록특허 제1163535호 한국등록특허 제2005366호 한국등록특허 제980738호
A. Dorfman et al., "Nanoscale ZnO-enhanced fluorescence detection of protein interactions", Advanced materials, 2006, 18(20), 2685-2690 L. E. Green et al., "Solution-grown zinc oxide nanowires", Inorg. Chem., 2006, 45(19) 7535-7543
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 사스 코로나바이러스 2 항체 검출을 위하여 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도를 제공하는 것으로, 나노선 표면에 고정된 항원을 포함하는 나노선 어레이를 이용하여 사스 코로나바이러스 2 검출 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원인 것이고, 상기 키트는 사스 코로나바이러스 2 항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 항체를 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 기판은 유리, 실리콘 웨이퍼, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이고, 상기 나노선은 산화아연인 것이며, 상기 나노선은 시드용액으로, 0.01 M 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate) 및 0.03 M 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 포함하는 것이고, 상기 나노선은 전구체 용액으로, 25 mM 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 25 mM 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 5 mM 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함하는 것이며, 상기 나노선 표면은 작용기 형성을 위하여 4 부피% 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 및 2 부피% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리된 것이다.
본 발명의 또 다른 예에서, 상기 사스 코로나 바이러스 2 항체는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분리된 시료로부터 검출되는 것이다.
또한, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 항체 진단용 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및 (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및 (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;로 제조된 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이를 제공한다.
본 발명은, 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트 및 이의 용도에 관한 것으로, 사스 코로나바이러스 2에 감염된 개체에서 생성된 개별 항원에 대한 항체 검출 및 항체 진단 검사에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 일 실시예에 따른 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 기반 면역형광 키트의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 일 실시예에 따른 나노선 어레이의 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선의 SEM 이미지 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선 어레이의 합성시간(좌) 또는 GFP 농도(우)에 따른 형광신호 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뉴클레오캡시드를 코팅하고 면역반응을 통해 항체를 측정한 나노선 어레이의 형광신호 측정결과(좌) 및 형광 이미지(우)를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 스파이크 항원을 코팅하고 면역반응을 통해 항체를 측정한 나노선 어레이의 형광신호 측정결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트를 제공한다.
도 1은 본 발명의 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트의 모식도로서, 나노선이 성장된 기판, 나노선 위에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원, 상기 항원에 반응하는 분리된 시료 내 항체, 및 상기 항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 항체를 포함하는 구성일 수 있다.
상기 사스 코로나바이러스 2 항원 또는 항체는 사스 코로나바이러스 2 상에 존재하는 모든 항원 또는 이에 결합할 수 있는 모든 항체를 의미하는 것이며, 바람직하게는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원 또는 이에 결합할 수 있는 항체인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 용어 "사스 코로나바이러스 2 항체"는 일반적으로 면역반응을 이용하는 검사법에서 사용하는 1차 항체와 동일한 개념으로 사용될 수 있다.
상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 상기 나노선 위에 중간 가교 역할을 하는 링커를 통해 고정화 될 수 있다. 항원의 배향성이 고려되지 않은 무작위적인 고정화는 고정화된 항원의 양이 많더라도 항체와 결합 부위가 외부로 노출되지 않을 경우 항원-항체 결합에 사용될 수 없거나 항원-항체 결합 성능이 저하되므로 표적 탐지의 성능 저하를 수반하게 된다. 링커는 나노선에 작용기를 도입하여 항원을 나노선에 부위 특이적(site specific)으로 고정화하기 위한 것으로, 링커는 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 글루타르알데히드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 부피% 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 및 2 부피% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 사스 코로나바이러스 2 항체를 검출하기 위하여 사용하는 항체는 사스 코로나바이러스 2 항원에 결합하는 모든 종류의 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로, 본 명세서에서 면역반응을 이용하는 검사법에서 사용하는 2차 항체와 동일한 개념으로 사용될 수 있다.
또한, 항체의 결합 여부를 측정하기 위한 프로브는 해당 분야에 알려진 모든 수단을 사용할 수 있으나, 분석의 용이성 등을 고려하여, 본 발명에서는 형광표지자가 결합된 형태가 바람직하다. 형광 표지자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있다.
본 발명에서, 사스 코로나바이러스 2 항체를 검출하기 위한 항체는 바람직하게는 상기 형광표지자가 결합된 항체로서, 항체의 면역반응에 영향을 주지 않으며, 신호를 증폭시켜 감도가 향상되어 보다 정확한 검출이 가능한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 사스 코로나바이러스 2 항체 검출기작을 살펴보면, 기판상에 성장된 나노선 위에 고정되어 있는 항원에 혈액 등의 분리된 시료를 반응시키고, 상기 항원과 특이적으로 결합한 분리된 시료 내 항체에 이를 특이적으로 인식할 수 있는 형광이 표지 된 항체를 반응시켜 형광신호를 검출하여 사스 코로나바이러스 2 항체의 존재 여부를 최종 검출한다.
본 발명에서, 상기 기판은 유리, 실리콘 웨이퍼, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노선은 산화아연인 것이 바람직하며, 산화아연은 극성표면이 매우 안정하여 여러 나노 구조를 형성하기 용이하다. 상기 기판에 나노선을 성장시킬 경우 항체의 고정화를 위한 넓은 표면적을 제공하므로 항원-항체 면역 반응을 위한 기질로 효율적이다. 반면, 나노선 대신 0차원 나노입자를 이용할 경우 나노입자의 넓은 크기 분포와 기판상의 불균일한 분포로 인해 신호의 정확한 증강 효과나 재현성 구현에 어려움이 있을 수 있다. 또한, 2차원 플레이트의 경우, 항체의 자유도가 떨어져 항체 활성을 저하시킬 수 있다.
상기 산화아연 시드층을 형성하기 위한 시드용액은 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.01 M 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate) 및 0.03 M 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아연 전구체용액은 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함할 수 있다. 상기 헥사메틸렌테트라민 및 폴리에틸렌이민은 아연 전구체가 산화아연으로 전환될 때 기재상에서 특정 면 방향(1차원 방향)으로 성장할 수 있도록 하는 것으로, 나노선의 형태학적 특징에 영향을 주는 바, 구체적으로 특정 결정면의 성장을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 즉, 아연전구체가 산화물로 전환되고 나노선의 1차원적 구조로 성장하도록 측 방향의 성장을 억제하는 역할을 한다. 이때, 상기 헥사메틸렌테트라민은 환원제의 기능을 하며, 폴리에틸렌이민은 1차원 구조의 어레이 형성을 유도한다. 바람직하게는 나노선의 전구체 용액으로, 25 mM 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 25 mM 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 5 mM 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 사스 코로나 바이러스 2 항체는 항체가 존재하는 모든 분리된 시료에서 검출될 수 있으며, 바람직하게는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분리된 시료로부터 검출되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 항체 진단용 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및 (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및 (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;로 제조된 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이를 제공한다.
상기 나노선의 직경은 50 내지 100 nm인 것이 바람직하다.
상기 (c)단계에서, 나노선은 수열합성법을 이용하여 성장시킬 수 있으며, 상기 (c)단계는 i) 상기 아연 시드용액을 기판에 도포하여 시드층을 형성하는 단계; 및 ii) 상기 시드층을 아래로 향하게 하여 기판을 상기 아연 전구체용액에 담근 후 95℃에서 반응시키는 단계;를 포함한다. 이때 산화아연 시드층과 아연 전구체용액의 반응시간을 조절하여 나노선의 길이를 조정할 수 있다.
상기 (d)단계는 i) 상기 나노선이 성장된 기판을 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액에 담가 상온에서 2시간 동안 반응시키는 단계; 및 ii) 상기 기판을 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 담가 4℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계;를 포함한다. 3-아미노프로필에톡시실란으로 나노선 표면을 개질하고, 글루타르알데히드와 반응시킨 후 사스 코로나바이러스 2 항원을 결합시킴에 따라 손쉽게 항원를 고정할 수 있으며, 고정력도 향상될 수 있다.
상기 (e)단계는 상기 작용기가 부착된 기판에 사스 코로나바이러스 2 항원을 실온에서 1시간 동안 배양하여 고정하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> 나노선 어레이의 제조
1-1. 나노선 시드용액 제조
0.01 M Zinc acetate dihydrate in methanol (Zn(CH3COO)2·2H2O) 용액과 0.03 M Sodium hydroxide in methanol 용액을 각각 60℃로 가열한 후 상기 Zinc acetate dihydrate 용액을 상기 Sodium hydroxide 용액에 한 방울씩 천천히 떨어트리며 200 rpm으로 교반하였다. 그 후 혼합액의 부피가 절반이 될 때까지 교반시키며 가열하였다.
1-2. 나노선 전구체용액 제조
Zinc nitrate hexahydrate (Zn(NO3)2·6H2O), Hexamethylene tetramine (C6H12N4) 및 polyethylenimine (H(NHCH2CH2)nNH2)을 각각 탈이온수에 넣고 200 rpm으로 교반시켜 25 mM Zinc nitrate hexahydrate, 25 mM Hexamethylene tetramine 및 5 mM polyethylenimine in deionized water의 전구체용액을 제조하였다.
1-3. 나노선 합성
기판에 상기 시드용액을 떨어트려 얇게 도포한 후 완전히 마르기 전에 에탄올로 세척하고 에어건을 이용하여 질소로 건조하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 그 후 기판을 핫플레이트를 이용하여 350℃로 5분 동안 가열하여 시드층을 형성하였다. 완전히 식은 기판에 원하는 패턴을 갖는 폴리이미드 테이프를 붙여 나노선을 합성시킬 부분만 노출시켰다. 상기 기판의 표면을 아래로 향하게 하여 용기에 넣고 전구체용액을 기판이 완전히 잠기도록 채운 후 이를 대류오븐에 넣어 95℃에서 5시간 동안 나노선을 합성하였다. 5시간 후 나노선이 합성된 기판을 꺼내 테이프를 제거하고, 탈이온수로 세척한 후 질소로 건조시켰다. 이때 나노선 합성시간은 원하는 나노선의 길이에 따라 달라질 수 있다.
1-4. 사스 코로나바이러스 2 항원 고정을 위한 작용기 형성
상기 나노선이 합성된 기판을 에탄올 기반 4 부피% 3-aminopropyltriethoxysilane 용액에 담근 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응후 에탄올로 충분히 세척하였고, 탈이온수로 충분히 씻어준 후 에어건으로 질소를 불어 건조시켰다. 그 다음 상기 기판을 PBS 기반 2 부피% glutaraldehyde 용액에 담근 후 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 탈이온수로 충분히 씻어준 후 에어건으로 질소를 불어 건조시켰다. 문헌으로 L. Wang et. al., “surface plasmon resonance biosensor based on water-soluble ZnO-Au nanocomposites,” Analytica Chimica Acta, 2009, 653, 109-115을 참고하였다.
1-5. 사스 코로나바이러스 2 항원 고정
대조군 샘플(Maxisorp)는 표면 변형(작용기 형성) 없이 3 시간 동안 성장시킨 나노선을 사용하였고, 사스 코로나바이러스 2 항원은 1000 또는 2000 ng/mL로 코팅하여 제조하였다.
상기 작용기가 형성된 기판에 사스 코로나바이러스 2 뉴클레오캡시드(1000 또는 2000 mg/mL을 100 ㎕/well) 또는 스파이크 단백질 항원(150 ng/mL)을 실온(room temperature; RT)에서 1시간 동안 배양하여 부착시킨 후 0.05% tween®20 Tris-buffered saline (TBS-T) 세척용액으로 3회 세척하였다. 블로킹(blocking)은 Invitrogen blocking buffer를 300 ㎕/well 사용하여 RT에서 1시간 동안 반응시켰다. 추가적으로 0.05% TBS-T 세척용액으로 3회 세척하였다.
<실시예 2> 나노선 직경 및 길이 특성평가
도 3의 SEM 이미지에서 보는 바와 같이, 수열합성법으로 합성한 나노선의 직경은 50~100 nm로 나타났다. 나노선의 길이는 5시간 동안 합성하였을 때 2 μm를 나타내었으며, 나노선의 길이는 합성시간에 따라 조절 가능하다(약 500 nm/hr).
<실시예 3> 나노선 기판의 표면적 평가
표면적의 증가를 직접적으로 확인하기 위해 GFP 단백질을 농도별로 상기 산화아연 나노선이 적용된 기판과 기존 기판에 농도별로 고정하고 표면적 증가에 따른 단백질 고정 효율을 형광신호로 확인하였다. 나노선을 1시간 또는 3시간 합성했을 때 각각 기존 기판에 비해 25배 또는 48배 형광신호가 증가하였다.
상기 실시예의 결과에서 알 수 있듯이, 기존 기판은 GFP 농도 15.626 μg/mL 이상에서 포화되는 것이 관찰되었으나, 본 발명의 나노선 어레이 기판은 농도의존적으로 형광 밀도가 증가되었고, GFP 농도 250 μg/mL에서는 약 7배 이상 증가하여 기존 기판과 비교하여 표면적이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
<실시예 4> 사스 코로나바이러스 2 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질 항체 검출
나노선 기판 위에 사스 코로나바이러스 2 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질 항원을 부착시킨 후 항체의 반응성을 확인하기 위하여, 각기 다른 농도(0.01 내지 10000 ng/mL)의 anti NP polyclonal antiobdy 또는 anti spike monoclonal antiobdy을 상온에서 1시간 동안 반응시켜 부착한 후 상기 세척용액을 이용하여 세척하였다. 형광입자가 부착된 2차 항체(Alexa 488 secondary antiobdy; ThermoFisher Scientific Inc.; 1 mg/mL를 1:1000으로 희석; 100 ㎕/well)를 상기 기판에 1시간 동안 반응시켜 부착한 후 상기 세척용액을 이용하여 세척하였다. 이때, 항체 희석용액은 Invitrogen Coating Buffer B, 0.1% skim milk in TBS-T를 이용하였다.
각기 다른 농도(800, 160, 32, 6.4, 1.28 ng/mL)의 anti NP polyclonal antiobdy를 반응시킨 후, 형광표지자가 부착된 2차항체를 반응시켜 형광리더기를 사용하여 형광 신호를 관찰하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 각 농도에서의 형광 신호 세기를 측정한 결과, 1.28 ng/mL부터 의미있는 형광밀도가 관찰되었고, 32 ng/mL 농도에서부터 밝은 신호 확인이 가능하였으며, 이를 통해 낮은 검출한계를 가져 감도가 우수함을 알 수 있다.
상기 실시예의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 사스 코로나바이러스 2 항원에 대한 항체 검출용 나노선 어레이는 기판에 나노선을 성장시켜 항체의 고정력을 증가시키고, 이에 따라 신호감도가 증강되어 2배 이상 증강되어 32 ng/mL의 낮은 검출한계를 보였으며, 고감도로 사스 코로나바이러스 2 항원에 대한 항체 검출이 가능하다. 또한, 형광표지자가 결합된 항체를 이용하여 진단함으로써 신속한 진단 또한 가능함에 따라 사스 코로나바이러스 2 항원에 대한 항체 생성능 검출에 있어 우수성을 확보하였다.
스파이크 항원의 경우도 항원이 150 ng/mL로 코팅된 나노선이 집적된 기판에 각기 다른 농도의 (5000, 1000, 200, 40, 8 ng/mL)의 anti S1 monoclonal antibody를 반응시킨 후, 앞서 사용한 형광표지자가 부착된 2차 항체를 반응시켜 형광신호를 확인하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 항체의 농도 변화에 따라 형광신호가 비례하여 변화하는 것을 확인하였다. 실제 사스 코로나바이러스 2에 감염된 환자의 혈액에는 스파이크 항원에 대한 polyclonal antibody가 형성되는 것으로 향후 anti S1 polyclonal antibody로 실험하는 경우 더욱 민감한 형광신호를 검출할 수 있을 것으로 보인다.

Claims (12)

  1. 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하고,
    상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 키트는 사스 코로나바이러스 2 항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  4. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 실리콘 웨이퍼, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노선은 산화아연인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노선은 시드용액으로, 0.01 M 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate) 및 0.03 M 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노선은 전구체 용액으로, 25 mM 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 25 mM 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 5 mM 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  8. 제1항에 있어서, 상기 나노선 표면은 작용기 형성을 위하여 4 부피% 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 및 2 부피% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  9. 제1항에 있어서, 상기 사스 코로나 바이러스 2 항체는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 분리된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 키트
  10. 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선 표면에 고정된 사스 코로나바이러스 2 항원을 포함하고,
    상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 진단용 조성물
  11. (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계;
    (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
    (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
    (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및
    (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;를 포함하고,
    상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이의 제조방법
  12. (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계;
    (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
    (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
    (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; 및
    (e) 상기 작용기에 사스 코로나바이러스 2 항원을 고정하는 단계;로 제조되고,
    상기 사스 코로나바이러스 2 항원은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 항체 검출용 나노선 어레이
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