KR102211590B1 - 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법 - Google Patents

메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메르스 바이러스 진단용 나노선 어레이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기판에 나노선을 성장시키고, 성장된 나노선 위에 작용기를 도입한 후 메르스 바이러스를 항원으로 인식하는 포획항체를 고정하는 단계를 포함하는 메르스 바이러스 진단용 나노선 어레이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 나노선 어레이는 검출감도가 향상되어 메르스의 보다 정확한 진단이 가능하다.

Description

메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법{Preparation method of nanowire array for diagnosis middle east respiratory syndrome virus}
본 발명은 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법에 관한 것이다.
형광면역분석법은 항원-항체 반응을 형광(fluorescence)을 이용하여 검출하는 분석법으로, 형광은 생체 내 약물·단백질의 위치 추적과 생체분자 검출 등을 포함하는 의학, 약학, 유전학 분야를 비롯하여 포토닉스, 분자 생물학, 재료과학, 화학 등 다양한 분야에 응용 가능하다. 형광을 이용한 분석방법은 높은 검출감도를 제공하지만, 표지(labeling)의 간접 방식으로 인한 양자효율의 한계, 분자간 회합(aggregate)에 따른 소광현상, 형광분자 외 다른 물질 자체의 형광으로 인한 중첩현상 및 형광신호 안정성 등의 문제가 있다. 형광분자의 형광 세기는 형광 기반 기술의 성능을 결정짓는 주요 요소로서, 형광 신호 향상을 위한 연구로 나노 물질 이용 기술이 연구되고 있다.
나노 물질은 최근, 나노입자, 나노선, 나노튜브 등 여러 형태로서 그 독특한 물리적, 화학적, 광학적 및 전기적 특성을 이용하여 다양한 기술분야에 활용되고 있으며, 나노구조체는 나노입자의 조성이나 형상, 배열에 따라 다양한 특성 조절이 가능하다. 이 중 1차원 나노 소재인 나노선(nanowire)은 직경이 10 nm 미만부터 수백 nm로, 우수한 결정성을 가지며, 넓은 비표면적으로 인해 높은 화학적 반응성, 양자제한 효과(quantum confinement effect), 자기조립(self-assembly), 응력 완화(stress relaxation) 등의 특징을 갖는다. 나노선은 Si을 비롯하여 ZnO, GaN, SnO2 등 다양한 재료를 기반으로 합성할 수 있으며, 그 중 산화아연(ZnO) 나노선은 우수한 광전자적 특성과 생체적합성, 낮은 독성, 손쉬운 표면개질 특성으로 인해 주목받고 있다.
나노선을 바이오소자에 이용시, 생체분자 고정을 위한 넓은 표면적을 제공하여 생체분자의 면역반응에 따른 감지신호를 향상시킬 수 있으며, 고민감성의 구현이 가능하다. 이에 따라 나노구조체 위에 생체분자의 정확한 고정을 통해 형광 신호를 향상시키는 기술이 개발되고 있다. 일 예로, 한국등록특허 제10-1837827호는 기판; 상기 기판에 고정되고, 상기 기판으로부터 수직하게 성장되어 있는 하나 이상의 나노구조물; 및 상기 나노구조물 표면에 고정되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며, 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅(intercalating)되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA을 포함하는 압타머 복합체;를 포함하는 생화학 분자 검출 장치에 대해 개시하고 있으며, 나노구조물의 특성을 제어하여 생화학 분자의 결합 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 한국등록특허 제10-1163535호는 나노틀 위에 나노선을 노출시켜 생체나노입자를 연결하고, 물리적 결합으로 나노 표면에 항체를 방향성 있게 배열하여 3차원적 부피 대 표면적 비율을 극대화시켰다.
한편, 중동호흡기증후군(Middle East Respiratory Syndrome; MERS)은 베타코로나바이러스의 한 종인 메르스-코로나바이러스(MERS-CoV)에 의한 급성호흡기감염증으로, 2012년 사우디아라비아에서 새로 발견된 신종 바이러스이다. 치사율이 20~55%에 이르며, 높은 치사율 뿐 아니라 폐렴, 호흡부전, 패혈성 쇼크, 급성신부전 등의 합병증을 동반한다. 한국은 중동 외에 메르스가 가장 크게 유행했던 지역으로, 국가별 메르스 발생 현황 중 국내 공식 감염자 수는 세계 2위로 비중동 국가 중 1위를 차지하며, 2015년 국내 유행시 확진자가 186명, 사망자가 38명(20.4%)에 이른다.
현재까지 개발되어 시판되고 있는 유전자 검출 기반의 메르스 체외진단기기는 메르스의 특이유전자인 upE, ORF1a 또는 ORF1b를 동시 또는 분리 검출하도록 설계된 것이 가장 일반적이다. 메르스의 조기 확산 방지를 위해서는 신속하고 정확한 체외진단 기술이 요구되나, 유전자 검출 기반 기술의 경우 정확성이 높은 반면, 확진을 위해 걸리는 시간이 길어 신속성 측면에서 개선이 필요하다.
한편, 항원·항체 기반의 메르스 체외진단기술의 경우, 샌드위치 ELISA 기법을 이용한 면역크로마토그래피법 기반의 현장진단 가능 제품 및 재조합된 MERS-CoV의 N 단백질 항원을 사용한 간접 ELISA 기법의 제품이 개발되었으며, 면역형광법 기반 및 단백질 마이크로어레이 기반의 MERS-CoV 항체 검출을 통한 메르스 진단 기술이 연구되었다. 항원·항체 기반의 진단 기술은 유전자 검출 기반보다 진단 소요시간이 매우 짧고 특이도가 더욱 우수한 장점이 있지만, 민감도가 낮은 문제가 있어 이에 대한 개선이 필요하다.
메르스 발생은 반복 유행되고 있으며, 이에 따라, 메르스의 확산을 방지하기 위한 신속하고 정확한 진단기술 개발이 필요한 실정이다.
한국등록특허 10-1068972호 한국등록특허 10-1163535호
A. Dorfman et al., "Nanoscale ZnO-enhanced fluorescence detection of protein interactions", Advanced materials, 2006, 18(20), 2685-2690 L. E. Green et al., "Solution-grown zinc oxide nanowires", Inorg. Chem., 2006, 45(19) 7535-7543
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 기판에 나노선을 성장시켜 항체를 고정하므로써 항체 고정력 및 신호 강도가 향상되어 메르스 바이러스의 고감도 진단이 가능한 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,
(a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계;
(b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
(c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
(d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계;
(e) 상기 작용기에 포획항체를 고정하는 단계;를 포함하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법을 제공한다.
상기 나노선은 산화아연이며, 상기 나노선의 직경은 50 내지 100 nm이다.
상기 기판은 유리 또는 실리콘 웨이퍼이다.
상기 포획항체는 메르스 바이러스의 스파이크 단백질을 항원으로 인식한다.
상기 (c)단계는 수열합성법으로 수행되며, i) 상기 아연 시드용액을 기판에 도포하여 시드층을 형성하는 단계; 및 ii) 상기 시드층을 아래로 향하게 하여 기판을 상기 아연 전구체용액에 담근 후 95℃에서 반응시키는 단계;를 포함한다. 상기 (c)단계의 반응시간을 조절하여 나노선의 길이를 조정할 수 있다. 바람직하게는 3 ~ 5 시간 합성하며, 보다 바람직하게 5시간 동안 합성하여 50 ~ 100 nm 직경 분포를 가지는 2 μm 길이의 나노선을 얻을 수 있다.
상기 아연 시드용액은 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate)를 포함하며, 상기 아연 전구체용액은 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함한다.
상기 (d)단계는 i) 상기 나노선이 성장된 기판을 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액에 담가 상온에서 2시간 동안 반응시키는 단계; 및 ii) 상기 기판을 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 담가 4℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계;를 포함한다.
상기 (e)단계는 상기 (e)단계는 상기 작용기가 부착된 기판에 포획항체를 4℃에서 밤새, 37℃에서 1시간, 또는 상온에서 2~3시간 동안 배양하여 고정한다.
또한, 본 발명은 다른 측면에서, 상기 제조방법으로 제조되고, 기판상에 성장된 나노선에 메르스 바이러스 항원을 인식하는 포획항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 측면에서, 상기 나노선 어레이; 및 메르스 바이러스 항원을 인식하고 형광표지자가 결합된 검출항체; 또는 메르스 바이러스 항원을 인식하는 1차항체와 상기 1차항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 2차항체;를 포함하는 메르스 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 기판에 나노선을 성장시켜 항체를 고정함에 따라 항체의 고정력이 향상되고, 이로써 민감성, 선택성 및 안정성이 증가하여 신속하고 정확한 메르스 바이러스 항원 검출이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 메르스 바이러스 항원 진단키트의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선 어레이의 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선의 SEM 이미지 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선의 SEM 이미지 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노선 어레이의 (a) 형광 이미지 및 (b) 형광신호 측정결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
본 발명은 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계; (e) 상기 작용기에 포획항체를 고정하는 단계;를 포함한다.
상기 나노선은 산화아연인 것이 바람직하며, 산화아연은 극성표면이 매우 안정하여 여러 나노 구조를 형성하기 용이하다. 상기 기판에 나노선을 성장시킬 경우 항체의 고정화를 위한 넓은 표면적을 제공하므로 항원-항체 면역 반응을 위한 기질로 효율적이다. 반면, 나노선 대신 0차원 나노입자를 이용할 경우 나노입자의 넓은 크기 분포와 기판상의 불균일한 분포로 인해 신호의 정확한 증강 효과나 재현성 구현에 어려움이 있을 수 있다. 또한, 2차원 플레이트의 경우, 항체의 자유도가 떨어져 항체 활성을 저하시킬 수 있다.
상기 나노선의 직경은 50 내지 100 nm인 것이 바람직하다.
상기 (c)단계에서, 나노선은 수열합성법을 이용하여 성장시킬 수 있으며, 상기 (c)단계는 i) 상기 아연 시드용액을 기판에 도포하여 시드층을 형성하는 단계; 및 ii) 상기 시드층을 아래로 향하게 하여 기판을 상기 아연 전구체용액에 담근 후 95℃에서 반응시키는 단계;를 포함한다. 이때 산화아연 시드층과 아연 전구체용액의 반응시간을 조절하여 나노선의 길이를 조정할 수 있다.
상기 산화아연 시드층을 형성하기 위한 시드용액은 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate)를 포함할 수 있다.
상기 아연 전구체용액은 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함할 수 있다. 상기 헥사메틸렌테트라민 및 폴리에틸렌이민은 아연 전구체가 산화아연으로 전환될 때 기재상에서 특정 면 방향(1차원 방향)으로 성장할 수 있도록 하는 것으로, 나노선의 형태학적 특징에 영향을 주는 바, 구체적으로 특정 결정면의 성장을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 즉, 아연전구체가 산화물로 전환되고 나노선의 1차원적 구조로 성장하도록 측 방향의 성장을 억제하는 역할을 한다. 이때, 상기 헥사메틸렌테트라민은 환원제의 기능을 하며, 폴리에틸렌이민은 1차원 구조의 어레이 형성을 유도한다.
상기 포획항체는 상기 나노선 위에 중간 가교 역할을 하는 링커를 통해 고정화될 수 있다. 항체의 배향성이 고려되지 않은 무작위적인 고정화는 고정화된 항체의 양이 많더라도 항원 결합 부위가 외부로 노출되지 않을 경우 항원 결합에 사용될 수 없거나 항원 결합 성능이 저하되므로 표적 탐지의 성능 저하를 수반하게 된다. 링커는 나노선에 작용기를 도입하여 포획항체를 나노선에 부위 특이적(site specific)으로 고정화하기 위한 것으로, 링커는 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 글루타르알데히드인 것이 바람직하다.
상기 (d)단계는 i) 상기 나노선이 성장된 기판을 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액에 담가 상온에서 2시간 동안 반응시키는 단계; 및 ii) 상기 기판을 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 담가 4℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계;를 포함한다. 3-아미노프로필에톡시실란으로 나노선 표면을 개질하고, 글루타르알데히드와 반응시킨 후 포획항체를 결합시킴에 따라 손쉽게 항체를 고정할 수 있으며, 항체의 고정력이 향상될 수 있다. 상기 포획항체는 MERS CoV Spike 또는 nucleoprotein을 항원으로 인식하는 항체를 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
상기 (e)단계는 상기 작용기가 부착된 기판에 포획항체를 4℃에서 밤새, 37℃에서 1시간, 또는 상온에서 2~3시간 동안 배양하여 고정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어, 상기 기판은 유리 또는 실리콘 웨이퍼인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 다른 측면에서, 상기 제조방법에 의해 제조되고, 기판상에 성장된 나노선에 메르스바이러스 항원을 인식하는 포획항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이를 제공한다.
또한, 다른 측면에서, 본 발명은 상기 나노선 어레이; 및 메르스 바이러스 항원을 인식하고 형광표지자가 결합된 검출항체; 또는 메르스 바이러스 항원을 인식하는 1차항체와 상기 1차항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 2차항체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.
도 1은 본 발명의 메르스 바이러스 항원 진단키트의 모식도로서, 도 1을 참조하면, 본 발명의 메르스 바이러스 항원 진단키트는 나노선이 성장된 기판, 나노선 위에 고정된 메르스 바이러스를 항원으로 인식하는 포획항체, 상기 항원을 인식하는 1차항체, 및 상기 1차항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 2차항체를 포함하는 구성일 수 있으며,
또한, 나노선이 성장된 기판, 나노선 위에 고정된 메르스 바이러스를 항원으로 인식하는 포획항체, 및 상기 항원을 인식하는 형광표지자가 결합된 검출항체를 포함하는 구성일 수 있다.
중동호흡기증후군 바이러스(MERS-CoV)의 표면에는 인체에 침투, 감염하는 데 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질(spike protein)이 존재하며, 상기 스파이크 단백질에 결합하는 항원-항체 반응을 통해 중동호흡기증후군 바이러스를 검출할 수 있다.
상기 포획항체는 나노선 위에 고정된 항체를 의미하며, 중동호흡기증후군 바이러스의 스파이크 단백질을 항원으로 인식하여 이와 결합하는 특징을 갖는다.
또한, 상기 1차항체는 중동호흡기증후군 바이러스의 스파이크(spike) 단백질 또는 핵단백질(nucleoprotein)을 항원으로 인식하는 항체로서, 상기 포획항체와 결합된 항원과 결합한다.
또한, 상기 2차항체는 상기 1차항체에 특이적인 항체로서, 형광표지자가 결합된다. 2차항체에 표지함으로써 1차항체의 면역반응에 영향을 주지 않으며, 신호를 증폭시켜 감도가 향상되어 보다 정확한 검출이 가능하다.
또한, 상기 검출항체는 상기 중동호흡기증후군 바이러스의 스파이크 단백질을 항원으로 인식하는 항체로서, 형광표지자가 결합된다. 포획항체에 결합된 표적 항원에 검출항체가 결합하고, 검출항체에 표지된 형광신호를 직접적(direct)으로 검출할 수 있다.
구체적으로, 메르스 바이러스 항원 검출기작을 살펴보면, 기판상에 성장된 나노선 위에 고정되어 있는 포획항체에 표적 항원을 반응시키고, 상기 표적 항원과 특이적으로 상호반응하는 1차항체와 형광이 표지된 2차항체를 반응시켜 형광신호를 검출하여 바이러스 항원 존재 여부를 최종 검출한다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나노선 어레이의 제조예
1-1. 나노선 시드용액 제조
0.01 M Zinc acetate dihydrate in methanol (Zn(CH3COO)2 ·2H2O) 용액과 0.03 M Sodium hydroxide in methanol 용액을 각각 60℃로 가열한 후 상기 Zinc acetate dihydrate 용액을 상기 Sodium hydroxide 용액에 한 방울씩 천천히 떨어트리며 200 rpm으로 교반하였다. 그 후 혼합액의 부피가 절반이 될 때까지 교반시키며 가열하였다.
1-2. 나노선 전구체용액 제조
Zinc nitrate hexahydrate (Zn(NO3)2·6H2O), Hexamethylene tetramine (C6H12N4) 및 polyethylenimine (H(NHCH2CH2)nNH2)을 각각 탈이온수에 넣고 200 rpm으로 교반시켜 25 mM Zinc nitrate hexahydrate, 25 mM Hexamethylene tetramine 및 5 mM polyethylenimine의 전구체용액을 제조하였다.
1-3. 나노선 합성
기판에 상기 시드용액을 떨어트려 얇게 도포한 후 완전히 마르기 전에 에탄올로 세척하고 에어건을 이용하여 질소로 건조하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 그 후 기판을 핫플레이트를 이용하여 350℃로 5분 동안 가열하여 시드층을 형성하였다. 완전히 식은 기판에 원하는 패턴을 갖는 폴리이미드 테이프를 붙여 나노선을 합성시킬 부분만 노출시켰다. 상기 기판의 표면을 아래로 향하게 하여 용기에 넣고 전구체용액을 기판이 완전히 잠기도록 채운 후 이를 대류오븐에 넣어 95℃에서 5시간 동안 나노선을 합성하였다. 5시간 후 나노선이 합성된 기판을 꺼내 테이프를 제거하고, 탈이온수로 세척한 후 질소로 건조시켰다. 이때 나노선 합성시간은 원하는 나노선의 길이에 따라 달라질 수 있다.
1-4. 항체 고정을 위한 작용기 형성
상기 나노선이 합성된 기판을 에탄올 기반 4% 3-aminopropyltriethoxysilane 용액에 담근 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음 상기 기판을 PBS 기반 2% glutaraldehyde 용액에 담근 후 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 탈이온수로 충분히 씻어준 후 에어건으로 질소를 불어 건조시켰다. 문헌으로 L. Wang et. al., “surface plasmon resonance biosensor based on water-soluble ZnO-Au nanocomposites,” Analytica Chimica Acta, 2009, 653, 109-115을 참고하였다.
1-5. 항체 고정
상기 작용기가 형성된 기판에 포획항체(1 mg/mL를 1:1000으로 희석)를 4℃에서 밤새, 37℃에서 1시간 혹은 상온에서 2~3시간 동안 배양하여 포획항체를 부착시킨 후 0.05% tween®20 in Tris-buffered saline (TBS-T) 세척용액으로 세척하였다. 각기 다른 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 μm)의 MERS CoV S antigen을 반응시킨 후, 1차항체(1 mg/mL를 1:500으로 희석)를 상기 기판에 상온에서 2시간 동안 반응시켜 부착한 후 상기 세척용액을 이용하여 세척하였다. 형광입자가 부착된 2차항체(1 mg/mL를 1:200으로 희석)를 상기 기판에 2시간 동안 반응시켜 부착한 후 상기 세척용액을 이용하여 세척하였다. 이때, 희석용액은 Invitrogen Coating Buffer B, 0.1% skim milk in TBS-T를 이용하였다.
실시예 2. 나노선 직경 및 길이 특성평가
도 3 및 도 4의 SEM 이미지에서 보는 바와 같이, 수열합성법으로 합성한 나노선의 직경은 50~100 nm로 나타났다. 나노선의 길이는 5시간 동안 합성하였을 때 2 μm를 나타내었으며, 나노선의 길이는 합성시간에 따라 조절 가능하다.
실시예 3. MERS CoV spike 단백질 항원 검출
나노선 기판 위에 포획항체를 부착시키고 각기 다른 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 μm)의 MERS CoV Spike antigen을 반응시킨 후, 1차항체와 형광표지자가 부착된 2차항체를 반응시켜 현미경 이미지로 형광 신호를 관찰하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 각 농도에서의 형광 신호 세기를 측정한 결과, 0~1 μg/mL의 항원을 반응시켰을 때 50 ng/mL 농도에서부터 밝은 신호 확인이 가능하였으며, 이를 통해 낮은 검출한계를 가져 감도가 우수함을 알 수 있다.
상기 실시예의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이는 기판에 나노선을 성장시켜 항체의 고정력을 증가시키고, 이에 따라 신호감도가 증강되어 50 ng/mL의 낮은 검출한계를 보였으며, 고감도로 메르스 바이러스의 진단이 가능하다. 또한, 형광표지자가 결합된 항체를 이용하여 진단함으로써 신속한 진단 또한 가능함에 따라 메르스 바이러스의 진단에 있어 우수성을 확보하였다.
이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계;
    (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
    (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
    (d) 상기 나노선에 작용기를 도입하는 단계;
    (e) 상기 작용기에 포획항체를 고정하는 단계;를 포함하고,
    상기 포획항체는 메르스 바이러스의 스파이크 단백질을 항원으로 인식하는 것이며,
    상기 (d)단계는 i) 상기 나노선이 성장된 기판을 4% 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액에 담가 상온에서 2시간 동안 반응시키는 단계; 및 ii) 상기 기판을 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 담가 4℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노선은 산화아연인 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 나노선의 직경은 50 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리 또는 실리콘 웨이퍼인 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 아연 시드용액은 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  8. 제1항에 있어서, 상기 아연 전구체용액은 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate), 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine) 및 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계는 수열합성법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계는 i) 상기 아연 시드용액을 기판에 도포하여 시드층을 형성하는 단계; 및 ii) 상기 시드층을 아래로 향하게 하여 기판을 상기 아연 전구체용액에 담근 후 90 내지 95℃에서 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 반응시간을 3 내지 5시간 동안하여 나노선의 길이를 조정하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  12. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계는 상기 작용기가 부착된 기판에 포획항체를 4℃에서 밤새, 37℃에서 1시간, 또는 상온에서 2~3시간 동안 배양하여 고정하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이의 제조방법
  13. 제1항에 따른 제조방법으로 제조되고, 기판상에 성장된 나노선에 메르스 바이러스 항원을 인식하는 포획항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단용 나노선 어레이
  14. 제13항의 나노선 어레이; 및 메르스 바이러스 항원을 인식하고 형광표지자가 결합된 검출항체; 또는 메르스 바이러스 항원을 인식하는 1차항체와 상기 1차항체를 인식하는 형광표지자가 결합된 2차항체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 바이러스 항원 진단키트
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230102652A (ko) 2021-12-30 2023-07-07 한국화학연구원 결핵균 항원 또는 항체 검출용 산화아연 나노선 어레이의 제조방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100040482A (ko) * 2008-10-10 2010-04-20 한국전자통신연구원 반도체 나노와이어 센서 소자의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 반도체 나노와이어 센서 소자
KR101068972B1 (ko) 2008-12-29 2011-09-30 한국과학기술원 형광 신호가 향상된 생체분자 어레이 및 그 제조방법
KR101163535B1 (ko) 2009-03-06 2012-07-06 고려대학교 산학협력단 나노헤어 구조물 및 그 응용
KR101782862B1 (ko) * 2016-04-26 2017-09-29 원광대학교산학협력단 메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트
KR20190073691A (ko) * 2017-12-19 2019-06-27 한국과학기술원 다공성 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100040482A (ko) * 2008-10-10 2010-04-20 한국전자통신연구원 반도체 나노와이어 센서 소자의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 반도체 나노와이어 센서 소자
KR101068972B1 (ko) 2008-12-29 2011-09-30 한국과학기술원 형광 신호가 향상된 생체분자 어레이 및 그 제조방법
KR101163535B1 (ko) 2009-03-06 2012-07-06 고려대학교 산학협력단 나노헤어 구조물 및 그 응용
KR101782862B1 (ko) * 2016-04-26 2017-09-29 원광대학교산학협력단 메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트
KR20190073691A (ko) * 2017-12-19 2019-06-27 한국과학기술원 다공성 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Dorfman et al., "Nanoscale ZnO-enhanced fluorescence detection of protein interactions", Advanced materials, 2006, 18(20), 2685-2690
L. E. Green et al., "Solution-grown zinc oxide nanowires", Inorg. Chem., 2006, 45(19) 7535-7543

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230102652A (ko) 2021-12-30 2023-07-07 한국화학연구원 결핵균 항원 또는 항체 검출용 산화아연 나노선 어레이의 제조방법

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