KR102308387B1 - 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료에 있어서 항암제의 병용 투여를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더하여 병용 처리하였을 때 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제를 제시한다. 본 발명에서 상기 항암제로서 선별한 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin)으로, 이들은 각각 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하여 3중 약물의 조합으로 병용 처리할 때, 각각의 단독 처리군 및 고시폴+펜포르민의 이중약물 처리군에 비해 암 증식 억제 효과 및 암세포 사멸 효과에 있어서 유의적으로 시너지 효과를 제공할 수 있다.

Description

고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer comprising gossypol, phenformin and anti-cancer drug}
본 발명은 암 치료에 있어서 항암제의 병용 투여를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더하여 병용 처리하였을 때 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제를 제시한다.
암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다.
암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 췌장암, 유방암, 구강암, 간암, 난소암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생하며, 이들의 치료방법으로 최근 글리벡 또는 허셉틴과 같은 소수의 표적치료제가 특정 암의 치료에 이용되고 있으나 현재까지는 수술이나 방사선 요법 및 세포증식을 억제하는 화학요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 그러나 표적치료제가 아니기 때문에 기존 화학요법제의 가장 큰 문제는 세포독성으로 인한 부작용과 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 따라서, 이러한 화학요법제의 한계를 극복하기 위해서는 항암작용 기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.
종래 수많은 연구를 통해 다양한 항암 약물들이 개발 및 시판되고 있다. 이 중 암세포 내의 ATP 합성 경로를 차단하여 세포의 증식 억제 및 세포사멸을 유도하는 과정을 타겟으로 하는 약물들 또한 사용되고 있다. 이러한 세포내 경로를 사용한 항암 화합물로서 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)이 알려져 있다(대한민국 등록공보 제 10-1579371호, 대한민국 등록특허 제 10-145806호).
고시폴은 조면실유 (Gossypium sp.)로부터 유도되는 천연적으로 존재하는 이중 비페놀성 화합물이다. 생체 내에서 Aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 억제제로서 알려져 있어, 이를 이용한 치료 용도에 대하여 연구되고 있다. 남성 피임제로서의 고시폴의 인체 실험은 이들 화합물의 장기간 투여의 안전성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다.
펜포르민(Phenformin)은 메트포르민(Metformin)과 같은 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약물로 당뇨병 치료제로 알려져 있다. 그러나, 펜포르민과 같은 바이구아나이드 계열 약물들이 탄수화물 대사와 지질 대사를 생리적으로 조절하는 핵심 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 p53 유전자가 결여된 암의 치료에 효과적인 것으로 알려지기 시작하면서, 펜포르민 약물의 항암 효과에 대한 연구가 진행되었고, 펜포르민의 항암 효과에 대한 가능성이 입증되었다.
이와 같이, 고시폴 및 펜포르민에 대한 각각의 항암 효과에 대하여는 알려져 있으나, 이들을 이용하여 보다 높은 활성의 항암 효과를 나타낼 수 있음에 대하여는 보고된 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 적은 용량으로도 상승적 항암 효과를 나타낼 수 있는 암 치료약물을 발굴하기 위해 노력한 결과, 고시폴 및 펜포르민과 항암제를 혼합하여 3중 약물의 병용 투여를 통해 각각의 항암제 간의 시너지 효과가 나타날 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 고시폴 및 펜포르민과 함께 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib) 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 또는 독소루비신(Doxorubicin)을 혼합하였을 때, 다양한 암종에서 암세포 증식 억제 효과가 현저히 상승하였고, 마우스 모델에 이종이식된 종양의 성장 억제 수준 역시 시너지 효과를 나타내므로, 본 발명에서 선별한 항암제를 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합한 3중 약물의 구성이 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분이 될 수 있을 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 각각의 항암제를 적은 용량으로 투여하여도 혼합에 따라 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 화합물이고, 상기 펜포르민은 하기 [화합식 2]의 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112021062442421-pat00001
; 및
[화학식 2]
Figure 112021062442421-pat00002
.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합하여 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 항암제로서 선별한 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin)으로, 이들은 각각 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하여 3중 약물의 조합으로 병용 처리할 때, 각각의 단독 처리군 및 고시폴+펜포르민의 이중약물 처리군에 비해 암 증식 억제 효과 및 암세포 사멸 효과에 있어서 유의적으로 시너지 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 사용하여 암을 치료하는 경우, 낮은 농도의 약물 만으로도 유의적인 암 세포 증식 억제 및 종양 성장 억제 효과를 나타낼 수 있으므로, 정상 세포의 생존에는 영향을 미치지 않으면서 특이적으로 암 만을 사멸할 수 있어, 효과적이다.
도 1은 신장암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 소라페닙의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 2는 흑색종 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 3은 대장암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 4은 폐암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 5는 유방암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 파클리탁셀의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 6은 난소암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 7은 전립선암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 8은 간암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 9는 비소세포성폐암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 투여(triple combination)군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다:
도 9a는 사육 일수에 따른 종양의 크기 변화를 확인한 도이고;
도 9b는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 크기를 비교한 사진이며; 및
도 9c는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 무게를 확인한 도이다.
도 10은 비소세포성폐암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 젬시타빈의 병용 투여군에서의 종양의 크기 변화를 확인한 도이다.
도 11은 흑색종 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙의 병용 투여(triple combination)군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다.
도 12는 위암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 투여군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다.
도 13은 전립선암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신의 병용 투여군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하고, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물의 “고시폴”은 세포 내에서 ALDH의 발현 억제제 및 활성 억제제로서 역할을 가진다. 구체적으로, 고시폴은 세포 내 serine-folate 기작에서 ALDH가 NDAH를 생성하여 이로부터 ATP가 생성되는 세포 기작에서, 고시폴이 ALDH 발현 및 활성 억제제로서 작용하여 세포 내 ATP 결핍을 유발함에 따라 암세포가 사멸될 수 있다. 상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 구조를 가진다:
[화학식 1]
Figure 112021062442421-pat00003
.
본 발명에서 제공하는 조성물의 “펜포르민”은 세포 내에서 미토콘드리아 복합체 I의 억제제 역할을 한다. 구체적으로, 펜포르민은 미토콘드리아 복합체 I의 활성 억제를 통해 미토콘드리아 막 전위를 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 세포 내 ATP의 합성이 저하되기 때문에 암세포가 효과적으로 사멸될 수 있다. 상기 펜포르민은 하기 [화학식 2]의 구조를 가진다:
[화학식 2]
Figure 112021062442421-pat00004
.
본 발명에서 제공하는 조성물의 유효성분으로서 포함되는 고시폴 및 펜포르민에 있어서, 약학적으로 동일 또는 유사한 수준의 효과를 나타내는 것으로 당업자에게 인정되는, 동등물 및 등가물의 범위를 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 고시폴 및 펜포르민은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 선택하여 사용할 수 있다.
즉, 상기 고시폴은 ALDH 발현 및 활성 저해제로서 세포 내 ATP 결핍이 유발되어 암세포가 사멸될 수 있는 역할을 하며, 상기 펜포르민은 미토콘드리아 복합체 I의 억제제로서 미토콘드리아 막전위를 감소시켜 ATP 결핍 현상의 상승 효과를 나타낼 수 있으므로, 고시폴 및 펜포르민을 병용 처리하는 것을 통해 증가된 암 성장 억제 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서는 상기 고시폴 및 펜포르민 뿐 아니라 항암제의 조합을 더하여 보다 암세포 성장 억제에 있어서 보다 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 구성을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 항암제로서 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나를 제공한다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서, 본 발명자들은 신장암, 흑색종, 대장암, 비소세포성폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암 및 위암 세포주에 대하여 고시폴 및 펜포르민에 더해 다양한 항암제를 혼합하여 병용 처리하였고, 이에 의한 시너지 효과를 나타내는 항암제만을 선별하였다.
보다 구체적으로, 상기 소라페닙은 신장암, 간암 및 전립선암 등의 치료에 주로 사용될 수 있는 kinase 억제제로 알려져 있다. 소라페닙은 다양한 티로신 단백질 인산화효소(tyrosine protein kinase)인, VEGFR, PDGFR 및 Raf족 인산화효소 등의 소분자 억제제이다.
또한, 상기 베무라페닙은 V600E mutated BRAF inhibition의 약어로서 명명된 화합물로서, B-Raf 효소 억제제이다. 베무라페닙은 주로 말기 흑색종의 치료에 사용되는 항암제로서, 흑색종 환자의 약 60%가 가지고 있는 V600E BRAF 변이 흑색종에서 특이적으로 치료 효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다.
이리노테칸은 대장암, 소세포성 폐암 및 췌장암의 치료에 널리 사용되는 항암제로서, 주로 다른 항암제와 혼합하여 병용처리를 통해 시너지 효과를 도모할 수 있는 것으로 알려진 항암제이다. 이리노테칸은 토포이성화효소(topoisomerase)의 억제제로서 역할을 하여, 암세포 내 topoisomerase 1의 활성을 차단하여 DNA 파괴 및 세포 사멸 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
시스플라틴은 고환암, 방광암, 난소암, 전립선암, 머리 및 목에 생긴 암 등의 치료에 사용되는 항암제이다. 시스플라틴은 암세포의 DNA에 특이적으로 반응하여, DNA 사슬간 또는 사슬 내에 가교를 형성해 암세포의 DNA 합성을 저해함으로서 세포 장애 및 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
파클리탁셀은 난소암, 유방암, 폐암 및 췌장암 등 다양한 암에 대한 치료제로 사용되는 약물이다. 파클리탁셀은 세포 분열시 마이크로튜브 형성에 영향을 미침으로서 세포 생장을 억제하는 역할을 하나, 탈모, 골수 기능의 억제, 알러지 반응, 근육통 및 폐염증과 같은 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다.
독소루비신은 Streptomyces peucetius var. caesius가 생산하는 항생물질의 일종으로, 악성림프종, 유방암 및 폐암 등에 대해 항암효과를 나타내어 사용되는 항암제이다. 암세포의 DNA 염기쌍 간에 삽입되면, 토포이성화효소 II 활성, RNA 중합효소 및 DNA 중합 효소반응을 저해하며, single strand DNA의 사슬을 절단하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 고시폴, 상기 펜포르민 및 상기 항암제를 병용 투여하는 것을 통해, 암 증식 억제 및 사멸 유도 효과에 있어서 유의적인 시너지 효과를 얻을 수 있다. 이 때 고시폴, 펜포르민 및 항암제는 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1 내지 7 : 50 내지 200 : 1의 몰비율로 혼합되는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물을 통해 적은 농도의 항암제를 사용하여 유의적으로 암 예방 및 치료 효과를 얻고자 하는 관점에서, 상기 고시폴 및 펜포르민은 2.5 내지 5 : 100 : 1의 몰비율로 혼합되는 것이 보다 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 선택되는 항암제를 20 nM 내지 10 μM 농도로 포함할 수 있으며, 이 때 고시폴 및 펜포르민의 농도는 상술한 혼합 비율로 혼합할 수 있다. 즉, 상기 고시폴은 0.002 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.02 μM 내지 70 μM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 50 μM의 농도 범위에서 통상의 기술자에 의해 선택적으로 사용 가능하다. 또한, 펜포르민 또한 상술한 혼합 비율로 혼합할 수 있어, 0.2 μM 내지 5 mM, 바람직하게는 1 μM 내지 2 mM, 보다 바람직하게는 2 μM 내지 1 mM의 농도 범위에서 통상의 기술자에 의해 선택적으로 사용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "암"은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 위암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 "암"이 "신장암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 소라페닙의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 소라페닙을 사용하지 않고, 수니티닙(sunitinib) 또는 파조파닙(pazopanib)을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "흑색종"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 베무라페닙을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 옥살리플라틴을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "대장암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 이리노테칸을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 카페시타빈을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "폐암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 이리노테칸을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 5-FU를 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "유방암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 파클리탁셀의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 파클리탁셀을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 독소루비신을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "난소암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 시스플라틴을 사용하지 않고, 파클리탁셀 또는 이리노테칸을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "전립선암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 독소루비신을 사용하지 않고, 도세탁셀 또는 이리노테칸을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "간암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 시스플라틴을 사용하지 않고, 소라페닙을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "위암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
신장암 (renal cell carcinoma)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
본 발명에서는 종래 사용되는 항암제를 혼합하여 병용 처리하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 선별하고자 하였다. 이에, 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더해 추가 항암제를 혼합하여 3종 투여(triple combination)함으로써 항암 효과가 상승되도록 하는 항암제 약물을 선발하였다. 먼저, 신장암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib) 및 파조파닙(pazopanib)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 신장암 세포주인 ACHN 세포주 또는 CAKI-1 세포주를 각각 배양하면서, 배양 시간의 증폭기에 따라 각각의 세포를 5000 내지 20,000 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후, 하기 [표 1] 내지 [표 3]의 항암제 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고 24 시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 항암제 혼합물은 원액(stock) 농도에서 각각 혼합 후, 100 ㎕ 씩 첨가하여 각각의 항암제 약물의 최종 농도가 적절히 첨가될 수 있도록 준비하였다. 항암제를 처리한 후 48 시간 동안 세포를 추가 배양한 다음, 각각의 웰에 10%(w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 가하고 4℃에서 60 분간 배양하여 세포를 고정하였다. 고정한 세포 외의 상층액을 제거하고 수돗물로 5 회 정도 플레이트를 세척한 다음 공기에서 건조(air dry)하였다. 건조 후 각각의 웰에 1% 아세트산을 포함하는 0.4%(w/v) 술포로다민 B 완충용액(Sulforhodamine B solution) 100 ㎕을 가하고, 실온에서 5 분동안 방치하여 세포를 염색하였다. 세포의 염색 후에 1% 아세트산으로 5 회 세척하여 착색되지 않은 염색약을 제거한 다음 공기에서 건조하였다. 착색된 염색약은 10 mM 트리즈마 염기(trizma base)로 고정화한 후, 플레이트 리더기를 사용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리 대조군(control)으로서, 항암제를 처리하지 않고 배양한 세포주의 세포 증식 정도를 측정하였으며, 상기 무처리 대조군에 대한 각각의 실험군의 세포 증식 정도를 상대적인 비율로 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.
소라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 소라페닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 소라페닙(10 μM)
수니티닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 수니티닙 단독처리군 - - 수니티닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 수니티닙(10 μM)
파조파닙를 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 파조파닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 파조파닙(10 μM)
그 결과, 먼저 도 1a에서 나타난 바와 같이 각각의 신장암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 소라페닙의 각각의 항암제를 단독으로 처리하였을 때 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 또한, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군은 소라페닙 단독처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과를 나타내며, 특히 고시폴, 펜포르민 및 소라페닙을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 소라페닙은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 1a).
이에 비해, 도 1b 및 도 1c에서 나타난 바와 같이 수니티닙(도 1b) 및 파조파닙(도 1c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
흑색종 (Melanoma)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
흑색종에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 베무라페닙(Vemurafenib, PLX032), 시스플라틴(cisplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 흑색종 세포주인 UACC62 세포주 또는 A375 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 흑색종 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 4] 내지 [표 6]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
베무라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 베무라페닙 단독처리군 - - 베무라페닙(0.5 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 베무라페닙(0.5 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(10 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(10 μM)
옥살리플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 옥살리플라틴 단독처리군 - - 옥살리플라틴(10 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 옥살리플라틴(10 μM)
그 결과, 먼저 도 2a에서 나타난 바와 같이 각각의 흑색종 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 베무라페닙의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 베무라페닙은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 2a).
이에 비해, 도 2b 및 도 2c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 2b) 및 옥살리플라틴(도 2c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
대장암 (colorectal cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
대장암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin) 및 카페시타빈(capecitabin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 대장암 세포주인 HT29 세포주 또는 Colo205 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 대장암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 7] 내지 [표 9]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(50 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(50 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(50 μM) 이리노테칸(1 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(75 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) 시스플라틴(10 μM)
카페시타빈을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(75 μM) -
3 카페시타빈 단독처리군 - - 카페시타빈 (10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) 카페시타빈 (10 μM)
그 결과, 먼저 도 3a에서 나타난 바와 같이 각각의 대장암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 3a).
이에 비해, 도 3b 및 도 3c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 3b) 및 카페시타빈(도 3c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
비소세포성폐암(NSCLC)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
비소세포성폐암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin) 및 5-플루로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 비소세포성 폐암 세포주인 A549 세포주 또는 H522 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 비소세포성폐암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 10] 내지 [표 12]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(1 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(20 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(20 μM)
5-FU를 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 5-FU 단독처리군 - - 5-FU(5 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 5-FU(5 μM)
그 결과, 먼저 도 4a에서 나타난 바와 같이 각각의 비소세포성폐암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 4a).
이에 비해, 도 4b 및 도 4c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 4b) 및 5-FU(도 4c)는 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
유방암(Breast cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
유방암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 파클리탁셀(parclitaxel), 시스플라틴 및 독소루비신(Doxorubicin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 유방암 세포주인 BT549 세포주 또는 MB231 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 유방암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 13] 내지 [표 15]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
파클리탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 파클리탁셀 단독처리군 - - 파클리탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 파클리탁셀(50 nM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 μM)
독소루비신을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 독소루비신 단독처리군 - - 독소루비신(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 독소루비신(1 μM)
그 결과, 먼저 도 5a에서 나타난 바와 같이 각각의 유방암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 5a).
이에 비해, 도 5b 및 도 5c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 5b) 및 독소루비신(도 5c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
난소암(ovarian cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
난소암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 시스플라틴, 파클리탁셀 및 이리노테칸을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 난소암 세포주인 SK-OV-3 또는 OVCAR3 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 난소암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 16] 내지 [표 18]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 nM)
파클리탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 파클리탁셀 단독처리군 - - 파클리탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 파클리탁셀(50 nM)
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(0.5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(0.5 uM)
그 결과, 먼저 도 6a에서 나타난 바와 같이 각각의 난소암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 시스플라틴의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 OVCAR3 세포주의 경우, 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 시스플라틴은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 6a).
이에 비해, 도 6b 및 도 6c에서 나타난 바와 같이 파클리탁셀(도 6b) 및 이리노테칸 (도 6c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
전립선암(Prostate cancer) 에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
전립선암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 독소루비신, 도세탁셀(Docetaxel) 및 이리노테칸을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 전립선암 세포주인 PC3 세포주 또는 DU145 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 전립선암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 19] 내지 [표 21]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
독소루비신을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 독소루비신 단독처리군 - - 독소루비신(1 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 독소루비신(1 nM)
도세탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 도세탁셀 단독처리군 - - 도세탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 도세탁셀(50 nM)
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(0.5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(0.5 uM)
그 결과, 먼저 도 7a에서 나타난 바와 같이 각각의 전립선암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 독소루비신의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 독소루비신은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 7a).
이에 비해, 도 7b 및 도 7c에서 나타난 바와 같이 도세탁셀(도 7b) 및 이리노테칸(도 7c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
간암(liver cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
간암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 시스플라틴 및 소라페팁을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 간암 세포주인 SNU449 또는 Huh7 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 간암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 22] 및 [표 23]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 8a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 uM)
소라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 8b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 소라페닙(5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 소라페닙(5 uM)
그 결과, 먼저 도 8a에서 나타난 바와 같이 각각의 전립선암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 시스플라틴의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 OVCAR3 세포주의 경우, 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 시스플라틴은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 8a).
이에 비해, 도 8b에서 나타난 바와 같이 소라페닙은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
비소세포성 폐암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
고시폴 및 펜포르민과 더불어 상기 실시예들에서 선별한 항암제들을 혼합하여 삼중약물을 처리하는 것이 각각을 단독 처리하는것에 비해 시너지로 상승된 암세포 생장 억제 효과를 나타낼 수 있음을 세포 수준(In vitro)에서 확인하였으므로, 이후 생체 내(In Vivo) 수준에서도 동일한 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.
먼저, 폐암 마우스 모델을 만들기 위하여 6 내지 8 주령의 Balb/c-nu 마우스(Central Lab. Animal, Highland Heights, KY, USA)를 준비하였다. 또한, 7.5×106의 A549 세포주를 배양하고 상기 준비한 마우스에 1 ㎖ 실린지로 피하 주사하였다. 1 주 동안 마우스를 사육하여 각각 8 마리씩 총 4 군으로 나누고, 이들을 하기 [표 24] 및 [표 25]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다. 용매 대조군, 이중약물 처리군 및 삼중약물 처리군의 마우스에는 용매 또는 약물을 매일 1회씩, 주당 6일로 경구 투여하였으며, 이리노테칸 단독처리군의 마우스에는 약물을 매일 1회씩, 주당 1일로 정맥 주사하면서, 총 49일 동안 동일 환경에서 사육하였다. 사육하면서, 매 7일마다 마우스 군의 체중 및 종양의 크기를 확인하여 평균을 구하였다. 폐암 세포 주입 후 초기 종양의 크기는 캘리퍼(calliper)를 사용하여 특정하였다. 종양 부피는 하기 [수학식 1]을 사용하여 구하였다.
[수학식 1]
Figure 112021062442421-pat00005
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴
(80 ㎎/㎏/100㎕)		 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 -
3 이리노테칸 단독투여군 - - 이리노테칸(20 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 이리노테칸
(20 ㎎/㎏/100㎕)
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴
(80 ㎎/㎏/100㎕)		 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 -
3 젬시타빈 단독투여군 - - 젬세타빈(40 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 젬시타빈
(40 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 이리노테칸을 투여한 실험군에서 폐암 종양이 성장하는 마우스 모델에서 종양 부피 및 무게에서 약물 처리에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 폐암 세포주 주입을 통해 폐암 종양을 이식한 마우스 모델 중 약물을 투여하지 않은 용매 대조군에서 지속적으로 종양 부피가 증가하였다. 이에 비해, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 투여군과 이리노테칸 단독투여군은 종양 부피의 증가 크기가 다소 감소하는 경향을 나타내었고, 그 수준은 서로간 유사한 수준인 것으로 확인하였다. 그러나, 이러한 종양 부피 증가가 억제되는 효과는 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 삼중약물로 병용 투여한 경우에서 보다 시너지 효과를 나타내어, 총 7주간의 폐암 마우스 모델 사육 후에도 유의적으로 종양이 증가하지 않음을 확인하였다(도 9a). 사육 종료 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 9b 및 도 9c).
반면, 도 10에서 나타난 바와 같이, 젬시타빈 투여 실험군의 경우에는 삼중 약물 투여에 의한 항암 시너지 효과가 나타나지 않았다(도 10). 젬시타빈 단독 투여군은 용매 투여군과 유사한 수준으로 종양이 성장하였으며, 고시폴 및 펜포르민의 이중 약물 투여군에서 유의적인 종양 성장 억제 효과를 나타내는 것으로 확인하였다. 이와 함께, 고시폴 및 펜포르민에 젬시타빈을 더해 삼중으로 약물을 투여함에도 불구하고, 이중 약물 투여군과 종양 크기의 성장 수준이 유사한 정도인 것으로 확인하였다.
흑색종 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 흑색종을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 흑색종 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, A375 세포를 이종이식하여 흑색종 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 흑색종 마우스 모델을 하기 [표 26]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴
(80 ㎎/㎏/100㎕)		 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 -
3 베무라페닙 단독투여군 - - 베무라페닙(30 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 베무라페닙
(30 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 흑색종 세포주의 이종이식으로 인해 종양이 성장하는 마우스 모델에서 종양 부피 및 무게가, 항암제 약물 처리에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 용매 대조군에 비해, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 투여군과 베무라페닙 단독투여군은 종양 부피의 증가 크기의 수준이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나, 이러한 종양 부피 증가가 억제되는 효과는 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙을 삼중약물로 병용 투여한 경우에서 보다 시너지 효과를 나타내는 것으로 확인하였다(도 11a). 사육 종료 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 11b 및 도 11c).
위암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 위암을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 위암 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, SNU638 세포(1.5×107)를 이종이식하여 위암 마우스 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 위암 마우스 모델을 하기 [표 27]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 고시폴 단독투여군 고시폴
(80 ㎎/㎏/100㎕)		 - -
3 펜포르민 단독투여군 - 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
4 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 -
5 이리노테칸 단독투여군 - - 이리노테칸(30 ㎎/㎏/100㎕)
6 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 이리노테칸
(30 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 용매 대조군, 고시폴 단독투여군 및 펜포르민 단독 투여군은 위암 종양의 성장 수준이 유사한 수준인 것으로 확인하였다(도 12a 및 도 12b). 이에 비해, 이중약물 투여군 및 이리노테칸 투여군은 종양의 성장 수준이 유의적으로 감소하였다. 또한, 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 모두 혼합하여 병용 투여한 삼중 약물 투여군에서는 종양 성장이 거의 나타나지 않은 것으로 확인하였다. 총 35일간 사육한 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 12b 및 도 12c).
전립선암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 전립선암을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 전립선암 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, PC3 세포(5×106)를 이종이식하여 전립선암 마우스 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 전립선암 마우스 모델을 하기 [표 287에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴
(80 ㎎/㎏/100㎕)		 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 -
3 독소루비신 단독투여군 - - 독소루비신(5 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민
(100 ㎎/㎏/100㎕)		 독소루비신
(5 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 용매 대조군에 비해 이중약물 투여군 및 독소루비신 단독 투여군이 유의적으로 종양 성장 억제가 유도된 것으로 확인하였으며, 이에 더하여 삼중 약물 투여군에서의 종양 성장 수준이 가장 낮은 것으로 확인하였다(도 13a 및 도 13b). 총 16일간 사육한 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 13b 및 도 13c).
이와 같이, 본 발명에서는 고시폴 및 펜포르민과 함께 병용 투여하여 항암 효과의 시너지 활성을 나타낼 수 있는 항암제 조합을 선별하였다. 암종에 따라 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합이 각기 다르며, 이를 요약하면 하기 [표 29]에서 나타난 바와 같다.
고시폴 및 펜포르민과 함께 병용 투여하여 시너지 효과 나타내는 약물
암 종 시너지 효과 유 시너지 효과 무
신장암 소라페닙 수니티닙 , 파조파닙
흑색종 베무라페닙 시스플라틴, 옥살리플라틴
대장암 이리노테칸 시스플라틴 , 카페시타빈
폐암 이리노테칸 시스플라틴, 5-FU
유방암 파클리탁셀 시스플라틴, 독소루비신
난소암 시스플라틴 파클리탁셀, 이리노테칸
전립선암 독소루비신 도세탁셀, 이리노테칸
간암 시스플라틴 소라페닙
위암 이리노테칸 -

Claims (4)

  1. 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 신장암일 경우에 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib)이며,
    상기 암이 흑색종일 경우에 상기 항암제는 베무라페닙(vemurafenib)이며,
    상기 암이 대장암일 경우에 상기 항암제는 이리노테칸(irinotecan)이며,
    상기 암이 전립선암일 경우에 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)인 것인, 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 화합물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021062442421-pat00006
    .
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펜포르민은 하기 [화학식 2]의 화합물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112021062442421-pat00007
    .
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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