KR102298579B1 - 캡시드-변형된 raav3 벡터 조성물, 및 인간 간암의 유전자 요법에서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 차세대 다중 돌연변이된 캡시드 단백질-변형된 rAAV 발현 벡터, 및 또한 감염성 비리온, 및 이를 포함하는 조성물 및 제약 제제를 개시한다. 또한, 본 발명은 이들 고효율 도입 벡터 구축물의 제조 방법 및 다양한 치료 용도에 있어서, 특히 생체내 및/또는 계외 바이러스 벡터-기재의 유전자 요법 프로토콜을 사용하여 질병에 걸린 포유동물에서 하나 이상의 질환 또는 비정상적인 상태를 치료 또는 호전시키기 위한 전달제로서의 사용 방법을 개시한다. 또한, 본 발명은 다중 돌연변이된 캡시드-변형된 rAAV 발현 벡터, 바이러스 입자, 및 감염성 비리온의 대규모 생성 방법, 및 또한 다양한 시험관내 및/또는 생체내 치료 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 상기 개시된 조성물의 용도를 개시한다.

Description

캡시드-변형된 RAAV3 벡터 조성물, 및 인간 간암의 유전자 요법에서의 용도 {CAPSID-MODIFIED, RAAV3 VECTOR COMPOSITIONS AND USES IN GENE THERAPY OF HUMAN LIVER CANCER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 국제 특허 출원은 2007년 4월 9일 출원된 미국 특허 가출원 번호 60/910,798 (만료됨; 대리인 문서 번호 36689.266)을 우선권 주장한, 2008년 4월 8일 출원된 PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/US2008/059647 (국내 단계 진입됨; 대리인 문서 번호 36689.272)의 미국 국내-단계 출원인, 2009년 12월 31일 출원된 미국 특허 출원 번호 12/595,196 (현재 미국 특허 번호 8,445,267; 대리인 문서 번호 36689.305)의 일부 계속 출원인, 2013년 5월 21일 출원된 미국 특허 출원 번호 13/899,481 (계류중; 대리인 문서 번호 36689.331)을 우선권 주장한다. 상기 언급된 각각의 출원의 내용은 그 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 부여한 인가 번호 R01-HL-097088 및 R21-EB-015684 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
공동 연구 계약에 관한 관계자 명칭
적용가능하지 않음
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학 분야, 및 특히 유전자 전달 비히클의 개발에 관한 것이다. 또한, 다양한 진단 및/또는 치료 요법에 사용하기 위해 치료용 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임 구축물을 코딩하는 것을 비롯한 다양한 핵산 절편을 선택된 숙주 세포로 전달하는데 유용한 개선된 rAAV 벡터 조성물이 또한 개시된다. 또한, 다양한 바이러스-기재의 유전자 요법에서 이들 변형된 rAAV-기재의 벡터 구축물을 제조 및 사용하기 위한, 및 특히 인간 질환, 장애, 기능장애, 외상 또는 손상의 증상의 진단, 예방, 치료 및/또는 호전을 위한 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 도입 효율 증가 및/또는 선택된 포유동물 숙주 세포의 바이러스 감염 개선이 수반되는 돌연변이된 rAAV-기재의 바이러스 벡터 전달 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 바이러스 캡시드 단백질의 1개 이상의 표면-노출 잔기에 아미노산 치환을 갖는 입자를 갖는 개선된 rAAV 벡터 및 비리온을 제공한다.
유전자 요법 분야의 주요 진전은 치료적 유전학 물질을 전달하기 위해 바이러스를 사용함으로써 달성되었다. 아데노-관련 바이러스 (AAV)는 그의 낮은 면역원성 및 비-분열 세포를 효과적으로 도입하는 그의 능력으로 인해 유전자 요법을 위한 매우 효과적인 바이러스 벡터로서 상당한 주목을 끌었다. AAV는 다양한 세포 및 조직 유형을 감염시키는 것으로 나타났고, 상기 바이러스 시스템을 인간 유전자 요법에 사용하기 위해 적합화시키려는 상당한 진전이 지난 10년에 걸쳐 이루어졌다.
재조합 AAV (rAAV) DNA는 그의 정상적인 "야생형" 형태에서, 길이가 약 4600개 뉴클레오티드 (nt)인 단일 가닥 분자로서 바이러스 캡시드 내로 패키징된다. 바이러스에 의한 세포의 감염 후에, 세포의 분자 기구는 단일 DNA 가닥을 이중 가닥 형태로 전환시킨다. 이중 가닥 DNA 형태만이, 함유된 유전자(들)을 RNA로 전사하는 세포의 폴리펩티드에 유용하다.
AAV는 유전자 전달 비히클로서 사용하기에 바람직한 많은 특성을 갖는다: 1) 야생형 바이러스는 임의의 병리적 인간 상태와 연관되지 않음; 2) 재조합 형태는 천연 바이러스 코딩 서열을 함유하지 않음; 및 3) 지속적인 트랜스제닉 발현이 많은 적용에서 관찰되었음.
재조합 아데노-관련 바이러스 2 (AAV) 벡터의 도입 효율은 시험관내 및 생체내 상이한 세포 및 조직에서 매우 다르며, 이는 잠재적인 유전자 치료 요법에서 그들 중 다수의 유용성을 제한해왔다. AAV의 생활 주기의 근본적인 단계를 규명하기 위해 체계적인 연구가 수행되었다. 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 (EGFR-PTK)에 의해 티로신 잔기에서 인산화된 세포 단백질 FKBP52는 시험관내 및 또한 생체내에서 AAV 제2 가닥 DNA 합성을 억제하고 따라서 트랜스진 발현을 억제하는 것으로 기록되었다. 또한, EGFR-PTK 신호전달은 유비퀴틴/프로테아솜 경로-매개 세포내 트래픽킹 및 또한 AAV 벡터의 FKBP52-매개 제2 가닥 DNA 합성을 조정하는 것으로 입증되었다. 그러한 연구에서, EGFR-PTK 신호전달의 억제는 AAV 캡시드 단백질의 유비퀴틴화 감소를 유도하였고, 이것은 다시 AAV 벡터의 프로테아솜-매개 분해를 제한함으로써 핵 수송을 촉진하였으며, 이는 AAV 캡시드 상의 티로신 잔기의 EGFR-PTK-매개 인산화와 관련되었음을 나타낸다. 선행 기술에 결핍된 것은 선택된 포유동물 세포를 감염시키기 위한, 및 특히 인간 세포로의 표적화된 유전자 전달을 위한 증진된 도입 효율을 갖는 개선된 rAAV 바이러스 벡터이다.
발명의 요약
본 발명은 상기 폴리펩티드 중 하나 이상의 결핍으로부터 유래된 하나 이상의 질환, 장애 또는 기능장애의 예방, 치료 및/또는 호전을 위한 의약의 제조에 유용한 하나 이상의 치료제를 코딩하는 신규의 개선된 rAAV-기재의 유전학 구축물을 제공함으로써 선행 기술에 내재하는 제한 및 결핍을 극복한다. 특히, 본 발명은 다양한 포유동물 질환, 장애, 기능장애, 외상, 손상 등의 증상의 진단, 예방, 치료 및/또는 호전에 사용하기 위한, 하나 이상의 선택된 분자, 예컨대 예를 들어 하나 이상의 진단제 또는 치료제 (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원 결합 단편, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고- 및 폴리-뉴클레오티드, 리보자임, 및 그의 변이체 및/또는 활성 단편을 포함함)를 코딩하는 VP3 캡시드-단백질-변형된 rAAV-기재의 유전학 구축물을 제공한다.
본 발명은 야생형과 비교하여 1개 이상의 표면-노출 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신, 세린, 트레오닌 및/또는 티로신 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 변형을 포함하는 돌연변이된 AAV VP3 캡시드 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명의 돌연변이된 AAV 캡시드 단백질, 및 또한 본 발명의 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 rAAV 벡터, 및 포유동물 세포의 선택된 집단으로의 전달을 위한 하나 이상의 선택된 진단제 및/또는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 감염성 rAAV 비리온이 제공된다.
유리하게는, 본원에 개시된 바와 같은 신규 rAAV 벡터, 발현 구축물, 및 이들을 포함하는 감염성 비리온 및 바이러스 입자는 바람직하게는 다양한 관심 세포, 조직 및 장기 중 하나 이상에 도입하는데 있어서, 야생형 미변형 발현 구축물 및 이들을 포함하는 상응하는 rAAV 벡터 및 비리온과 비교하였을 때 개선된 효율을 갖는다.
본원에 제공된 개선된 rAAV 벡터는 통상적인 야생형 (즉, "미변형") rAAV 벡터보다 더 높은 효율 (및 종종 훨씬 더 높은 효율)로 하나 이상의 선택된 숙주 세포에 도입된다. 다양한 AAV 혈청형으로부터의 다양한 AAV 캡시드 단백질 상의 2, 3, 4, 5 또는 심지어 6개 이상의 표면-노출 아미노산 잔기의 다양한 개별 및/또는 조합의 부위-지정 돌연변이에 관한 광범위한 분석 및 상세한 실험을 수행함으로써, 본 발명자들은 개선된 도입 효율을 보유하는 단일- 또는 다중-돌연변이된 rAAV 벡터의 거대 수집을 개발하였다. 본 발명자들은 수많은 상이한 AAV 혈청형에서 1개 이상의 비리온 표면-제시 아미노산 잔기의 치환이 돌연변이체가 제조되는 상응하는 비-치환된 벡터의 경우보다 더 높은 효율의 도입을 할 수 있는 개선된 바이러스 벡터를 생성한다는 것을 입증하였다.
이들 새로운 캡시드-돌연변이체 rAAV 바이러스 벡터의 개발은 통상적인 유전자 치료 요법에 대해 필요한 바이러스 입자의 수를 극적으로 감소시킨다. 다양한 포유동물 세포에 대한 개선된 도입 효율을 갖는 것 이외에도, 본원에 기재된 표면-노출 아미노산-변형된 rAAV 벡터는 포유동물 유전자 치료 요법에 현재 사용되는 전형적인 바이러스 벡터보다 더 안정적이고, 덜 면역원성이며, 훨씬 더 낮은 비용으로 생산될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 Y252, Y272, Y444, Y701, Y705, 및 Y731에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 비-티로신 아미노산 잔기를 포함하거나, (b) 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 S459 또는 S663에 상응하는 1개 이상의 위치 각각에서의 비-세린 아미노산 잔기를 포함하거나, (c) 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 T251 또는 T492에 상응하는 1개 이상의 위치 각각에서의 비-트레오닌 아미노산 잔기를 포함하거나, (d) 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 K528, K533, 또는 K545에 상응하는 1개 이상의 위치 각각에서의 비-리신 아미노산 잔기를 포함하거나, (e) (i) 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 위치 Y701, 또는 Y705에서의 비-티로신 아미노산 잔기; 및 (ii) 위치 Y705 또는 Y731에서의 비-티로신 아미노산 잔기, 또는 위치 S663에서의 비-세린 아미노산 잔기를 포함하거나, (f) 상기 (a), (b), (c), 및 (d)에 기재된 3개 이상의 아미노산 치환 각각과 비-천연 아미노산의 조합을 포함하거나, (g) 상기 (a), (b), (c), 및 (d)에 기재된 4개 이상의 아미노산 치환 각각과 비-천연 아미노산의 조합을 포함하거나, 또는 (h) 상기 (a), (b), (c), 및 (d)에 기재된 5개 이상의 아미노산 치환 각각과 비-천연 아미노산의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로는 각각의 아미노산 치환이 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 및 서열 10 각각에 기재된 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, 및 AAV10으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 다른 야생형 벡터 혈청형에서 그에 상응하는 동등한 아미노산 위치에 존재하는 것인, 변형된 rAAV VP3 캡시드 단백질을 제공한다.
본 발명의 예시적인 다중-돌연변이된 단백질은 AAV3 캡시드 상의 3개 이상의 별개의 표면-노출 아미노산 잔기 각각에서 비-천연 아미노산 치환의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 다중-돌연변이체 벡터는 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질의 나타낸 아미노산 잔기에서, 또는 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 또는 서열 10 각각에 기재된 임의의 한 상응하는 야생형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10 캡시드 단백질 또는 이것들의 임의의 조합에서의 동등한 표면-노출 아미노산 잔기에서
(a) Y701F, Y705F, 및 Y731F;
(b) Y705F, Y731F, 및 S663V;
(c) Y705F, Y731F, 및 T492V;
(d) Y705F, Y731F, K533R;
(e) S663V, T492V, 및 K533R;
(f) Y705F, Y731F, S663V, 및 T492V; 및
(g) Y705F, Y731F, S663V, T492V, 및 K533R 치환
을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시에서, 치환된 비-천연 아미노산은 상응하는 야생형 단백질에 정상적으로 존재하지 않는 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 페닐알라닌 (F), 발린 (V), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 알라닌 (A), 류신 (L), 아스파르트산 (D), 아스파라진 (N), 글루탐산 (E), 아르기닌 (R), 세린 (S), 및 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 비-천연 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 개시된 캡시드 단백질-돌연변이된 변이체 중 하나 이상을 코딩하는 단리된 및 정제된 폴리뉴클레오티드, 및 또한 하나 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터 구축물은 상기 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 핵산 절편을 발현할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 진단 또는 치료 분자를 코딩하는 적어도 1개의 핵산 절편을 추가로 포함한다. 본 발명의 실시에서, 변형된 AAV VP3 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 도입 효율은 상응하는 미변형 야생형 단백질의 경우보다 더 높을 것이며, 따라서 바람직하게는 선택된 포유동물 숙주 세포에서 상응하는 미변형 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 경우보다 적어도 2-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 6-배, 적어도 약 8-배, 적어도 약 10-배, 또는 적어도 약 12-배 또는 그 보다 높은 포유동물 세포에서의 도입 효율을 보유할 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 rAAV 벡터의 도입 효율은 상응하는 미변형 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 경우보다 적어도 약 15-배 더 높거나, 적어도 약 20-배 더 높거나, 적어도 약 25-배 더 높거나, 적어도 약 30-배 더 높거나, 또는 적어도 약 40, 45, 또는 50-배 또는 그 초과일 것이다. 또한, 하나 이상의 변형된 AAV VP3 캡시드 단백질을 포함하는 본 발명의 감염성 비리온은 바람직하게는 포유동물 세포로 도입될 때 상응하는 미변형 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 경우보다 유비퀴틴화에 덜 감수성이다.
본 발명은 또한 핵산 절편이 선택된 관심 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 절편에 작동가능하게 연결된 프로모터, 인핸서, 전사후 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인 rAAV 벡터에 관한 것이다.
바람직하게는, 프로모터는 이종 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 구성적 프로모터, 유도가능한 프로모터, 또는 그의 임의의 조합이다.
특정 실시예에서, 본원에 기재된 신규 rAAV 발현 벡터 내로 클로닝된 핵산 절편은 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 그의 임의의 조합을 발현하거나 또는 코딩할 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 유용한 치료제는 하나 이상의 효능제, 길항제, 항-세포자멸 인자, 억제제, 수용체, 시토카인, 세포독소, 조혈제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 하나 이상의 그의 억제제, 세로토닌 수용체, 또는 하나 이상의 그의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 저해제, 진단 분자, 화학요법제, 세포독소, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명자들이 하나 이상의 포유동물 간암의 유전자 요법을 위한 방법에서 도 41에 도시된 rAAV3 벡터의 사용을 특히 고려하지만, 캡시드-돌연변이된 벡터는, 예를 들어 AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 2 (AAV2), AAV 혈청형 4 (AAV4), AAV 혈청형 5 (AAV5), AAV 혈청형 6 (AAV6), AAV 혈청형 7 (AAV7), AAV 혈청형 8 (AAV8), AAV 혈청형 9 (AAV9), AAV 혈청형 10 (AAV10), AAV 혈청형 11 (AAV11), 또는 AAV 혈청형 12 (AAV12)를 포함하는 임의의 공지된 AAV 혈청형의 비리온 내에 제조 및 패키징될 수 있다.
본 발명은 추가로 이러한 캡시드-돌연변이된 rAAV 벡터의 집단 및 복수개, 및 또한 비리온, 감염성 바이러스 입자, 및 이들을 코딩하는 하나 이상의 핵산 절편을 포함하는 포유동물 숙주 세포를 추가로 제공한다.
바람직하게는, 포유동물 숙주 세포는 인간 숙주 세포, 예를 들어 혈액 세포, 줄기 세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유모세포, 또는 포유동물 기원의 임의의 다른 세포, 예를 들어 비제한적으로 간의 (즉, 간) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 장 세포, 횡경막 세포, 신장의 (즉, 신장) 세포, 신경 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 또는 바이러스-기재의 유전자 요법이 고려되는 포유동물의 임의의 하나 이상의 선택된 조직일 것이다.
본 발명은 본 발명의 단백질, 핵산 절편, 바이러스 벡터, 숙주 세포, 또는 바이러스 입자 중 하나 이상을 하나 이상의 제약상 허용되는 완충제, 희석제, 또는 부형제와 함꼐 포함하는 조성물 및 제제를 추가로 제공한다. 이러한 조성물은 포유동물 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기 위한 하나 이상의 진단 또는 치료 키트 내에 포함될 수 있다.
본 발명은 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자를 제공할 필요가 있는 포유동물의 세포, 조직 또는 장기에 rAAV 벡터를 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자 제공에 효과적인 시간 동안 그에 효과적인 양으로 제공하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에게 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자를 제공하는 방법을 추가로 포함한다.
본 발명은 포유동물에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 상태, 또는 외상 중 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키는 방법을 추가로 제공한다. 전반적 및 일반적 의미에서, 상기 방법은 상기 진단, 예방, 치료 또는 호전을 필요로 하는 포유동물에게 하나 이상의 개시된 rAAV 벡터를 포유동물에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 상태, 또는 외상 중 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기에 충분한 시간 동안 그에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. rAAV3-기재의 벡터의 경우에, 이러한 비정상적인 상태는 바람직하게는 예를 들어 HCC를 포함하는 포유동물 간의 하나 이상의 질환 또는 기능장애를 포함하거나; rAAV8-기재의 벡터의 경우에, 이러한 비정상적인 상태는 바람직하게는 포유동물 눈의 하나 이상의 질환 또는 기능장애를 포함하거나; 또는 rAAV6 벡터의 경우에, 예를 들어 겸상 세포 질환, β 지중해빈혈 등을 포함하는 줄기 세포, 혈액 세포, 조혈 세포, 또는 CD35+ 세포의 하나 이상의 질환을 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물 세포의 집단에 도입하는 방법을 제공한다. 전반적 및 일반적 의미에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 개시된 하나 이상의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 적어도 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 VP3 돌연변이체 캡시드 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 단리된 핵산 절편을 제공하며, 본원에 기재 및 시험된 개선된 벡터 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 벡터, 바이러스 입자, 감염성 비리온, 및 단리된 숙주 세포를 제공한다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 추가의 성분과 함께 제제화되거나 또는 하나 이상의 사용 지침서와 함께 제조된, 개시된 벡터 또는 AAv 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 및 또한 치료 및/또는 진단 키트를 제공한다.
본 발명 또한 개시된 개선된 rAAV 캡시드-돌연변이된 벡터의 제조 방법, 및 또는 그를 예를 들어 계외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차, 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용하는 방법을 입증한다. 본원에 기재된 많은 개선된 벡터가 또한 단백질 분해에 내성이 있기 때문에, 그들은 생체내에서 유의하게 증가된 도입 효율을 보유하여, 특히 바이러스 벡터-기재의 인간 유전자 치료 요법에, 및 특히 생체내 및/또는 시험관내에서 선택된 포유동물 세포로의 하나 이상의 유전학 구축물을 전달하는데 매우 적합하게 된다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 유익한 또는 치료 생성물(들)을 코딩하는 유전학 물질을 포유동물 세포 및 조직으로 전달하는 방법에 유용한, 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 및 그의 제약 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 조성물 및 방법은 하나 이상의 포유동물 질환의 증상의 치료, 예방 및/또는 호전에 있어서의 그의 사용을 통해 유의한 진전을 제공한다. 인간 유전자 요법은 특히 많은 다양한 질환, 장애, 및 기능장애의 치료에서 사용하기 위한 새롭고 개선된 바이러스 벡터 구축물을 제공함으로써 본 교시내용으로부터 특히 이로울 것이라고 고려된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 벡터 구축물이 전달되는 포유동물에서 하나 이상의 장애의 예방, 치료 및/또는 호전을 위한 하나 이상의 포유동물 치료제를 코딩하는 변형된 rAAV 벡터에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 포유동물 질환, 기능장애, 손상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 및/또는 호전에 사용하기 위한, 예를 들어 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편 및 또한 그의 변이체 및/또는 활성 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 포유동물 치료제(들)를 코딩하는 rAAV-기재의 발현 구축물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 rAAV 캡시드 단백질에서 1개 이상의 표면 노출된 아미노산 잔기에서 비-천연 아미노산으로의 적어도 제1의 아미노산 치환을 포함하는 적어도 제1의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 벡터를 제공하며, 여기서 벡터는 또한 발현 벡터 구축물을 함유하는 숙주 세포에서 절편을 발현할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 제1의 진단제 또는 치료제를 코딩하는 적어도 제1의 핵산 절편을 추가로 포함한다.
본 발명의 표면-노출 아미노산-변형된 rAAV 벡터는 임의로 추가로, 핵산 절편에 각각의 작동가능하게 연결된 1개 이상의 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 인핸서 서열은, CMV 인핸서, 합성 인핸서, 간-특이적 인핸서, 혈관-특이적 인핸서, 뇌-특이적 인핸서, 신경 세포-특이적 인핸서, 폐-특이적 인핸서, 근육-특이적 인핸서, 신장-특이적 인핸서, 췌장-특이적 인핸서, 및 섬 세포-특이적 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시에 유용한 예시적인 프로모터는, 예를 들어 CMV 프로모터, β-액틴 프로모터, 인슐린 프로모터, 에놀라제 프로모터, BDNF 프로모터, NGF 프로모터, EGF 프로모터, 성장 인자 프로모터, 액손-특이적 프로모터, 수상돌기-특이적 프로모터, 뇌-특이적 프로모터, 해마-특이적 프로모터, 신장-특이적 프로모터, 엘라핀 프로모터, 시토카인 프로모터, 인터페론 프로모터, 성장 인자 프로모터, α1-항트립신 프로모터, 뇌 세포-특이적 프로모터, 신경 세포-특이적 프로모터, 중추 신경계 세포-특이적 프로모터, 말초 신경계 세포-특이적 프로모터, 인터류킨 프로모터, 세르핀 프로모터, 하이브리드 CMV 프로모터, 하이브리드 β-액틴 프로모터, EF1 프로모터, U1a 프로모터, U1b 프로모터, Tet-유도가능한 프로모터, VP16-LexA 프로모터, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 1개 이상의 이종, 조직-특이적, 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 또는 조류 β-액틴 프로모터를 포함할 수 있다.
제1의 핵산 절편은 또한 추가로, 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사후 조절성 요소, 폴리아데닐화 신호 서열, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1개 이상의 전사후 조절 서열 또는 1개 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터 구축물에 의해 숙주 세포로 전달가능한 예시적인 진단제 또는 치료제는 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원 결합 단편, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명의 개선된 rAAV 벡터는 바람직하게는, 분자 마커, 아드레날린성 효능제, 항-세포자멸 인자, 세포자멸 억제제, 시토카인 수용체, 시토카인, 세포독소, 조혈제, 글루탐산 데카르복실라제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 키나제, 키나제 억제제, 신경 성장 인자, 네트린, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 신경발생성 인자, 신경발생성 인자 수용체, 뉴로필린, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 뉴로트로핀 수용체, N-메틸-D-아스파르테이트 길항제, 플렉신, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 단백질분해 단백질, 단백질분해 단백질 억제제, 세마포린, 세마포린 수용체, 세로토닌 수송 단백질, 세로토닌 흡수 억제제, 세로토닌 수용체, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 저해제, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 진단 또는 치료용 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 것이다.
특정 용도에서, 본 발명의 캡시드-변형된 rAAV 벡터는 BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, 고나도트로핀, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, TGF-B2, TNF, VEGF, 프로락틴, 소마토트로핀, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(I87A), 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산 절편을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포에서 1개 이상의 내인성 생물학적 과정의 활성을 변경시키거나, 억제하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 제거하거나 또는 손상시키는 1종 이상의 치료제를 코딩하는 적어도 제1의 핵산 절편을 포함하는, 유전자-변형된 개선된 도입-효율 rAAV 벡터에 관한 것이다. 특별한 실시양태에서, 이러한 치료제는 1개 이상의 대사 과정, 기능장애, 장애 또는 질환의 효과를 선택적으로 억제하거나 감소시키는 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 결함은 치료를 원하는 포유동물에 대한 손상 또는 외상에 의해 유발될 수 있다. 다른 실시양태에서, 결함은 내인성 생물학적 화합물의 과다발현에 의해 유발될 수 있고, 다른 실시양태에서; 결함은 1개 이상의 내인성 생물학적 화합물의 과소발현 또는 심지어 결여에 의해 유발될 수 있다.
벡터로 형질감염되는 특정 세포에 1개 이상의 외인성 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, siRNA 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하기 위해 이러한 벡터의 사용이 고려되는 경우에, 예를 들어 펩티드, 단백질, 폴리펩티드, 항체, 리보자임, siRNA 및 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 비롯한 코딩되는 치료제를 생성하기 위해 벡터를 포함하는 세포 내에 하류에 작동가능하게 위치하는 적어도 제1의 외인성 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드를 발현하는 적어도 제1의 이종 프로모터의 제어 하에 벡터 내에 혼입시킴으로써, 본원에 개시된 변형된 AAV 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자-변형된 rAAV 벡터 및 발현 시스템은 또한 추가로 임의로, 변형된 rAAV 벡터에 의해 발현되는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 변경시키고/거나, 개선시키고/거나, 조절하고/거나, 영향을 미치는 1개 이상의 인핸서, 1개 이상의 조절성 요소, 1개 이상의 전사 요소, 또는 그의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 제2의 별개의 핵산 절편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 rAAV 벡터는 CMV 인핸서, 합성 인핸서, 세포-특이적 인핸서, 조직-특이적 인핸서, 또는 그의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 제2의 핵산 절편을 추가로 포함할 수 있다. 제2의 핵산 절편은 또한 추가로, 1개 이상의 인트론 서열, 1개 이상의 전사후 조절성 요소, 또는 그의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 개선된 벡터 및 발현 시스템은 또한 임의로 추가로, rAAV 벡터 내로 벡터 내의 선택된 부위에 1개 이상의 선택된 유전학 요소, 관심 유전자, 또는 치료 또는 진단 구축물의 삽입 (클로닝)을 용이하게 하는, 1개 이상의 폴리링커, 제한 효소 부위, 및/또는 다중 클로닝 영역(들)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본원에 개시된 개선된, 캡시드-변형된 rAAV 벡터에 의해 적합한 숙주 세포 내로 전달될 수 있는 외인성 폴리뉴클레오티드(들)는 바람직하게는 포유동물 기원이고, 인간, 비-인간 영장류, 돼지, 소, 양, 고양이, 개, 말, 에핀, 염소, 또는 이리 기원의 1개 이상의 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하다.
개시된 캡시드-변형된 바이러스 벡터에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있는 외인성 폴리뉴클레오티드(들)는, 특정 실시양태에서, 1개 이상의 단백질, 1개 이상의 폴리펩티드, 1개 이상의 펩티드, 1개 이상의 효소, 또는 1개 이상의 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)을 코딩할 수 있거나, 또는 대안적으로, 1개 이상의 siRNA, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, PNA 분자, 또는 그의 임의의 조합을 발현할 수 있다. 조합 유전자 요법을 원하는 경우에, 단일 rAAV 발현 시스템으로부터 2개 이상의 상이한 분자를 생성할 수 있거나, 또는 대안적으로, 선택된 숙주 세포를, 각각 치료제를 코딩하는 1개 이상의 별개의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 2개 이상의 고유한 rAAV 발현 시스템으로 형질감염시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 감염성 아데노-관련 바이러스 입자 또는 비리온, 및 또한 복수개의 이러한 비리온 또는 감염성 입자 내에 포함된 캡시드-변형된 rAAV 벡터를 제공한다. 이러한 벡터 및 비리온은 1개 이상의 희석제, 완충제, 생리적 용액 또는 제약 비히클 내에 포함될 수 있거나, 또는 1개 이상의 진단, 치료 및/또는 예방 요법으로 포유동물에게의 투여를 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 벡터, 바이러스 입자, 비리온 및 그의 복수개는 또한 선택된 가축, 외래종, 집동물, 및 반려 동물 (애완동물 등 포함), 및 또한 비-인간 영장류, 동물원 또는 다른 포획 표본 등에의 수의학적 투여를 위해 허용되는 부형제 제제 내에 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 개시된 캡시드 단백질-변형된 rAAV 발현 벡터 중 적어도 1개, 또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 1개 이상의 바이러스 입자 또는 비리온을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 세포는 특히 포유동물 숙주 세포이고, 인간 숙주 세포가 특히 매우 바람직하며, 세포 또는 조직 배양물에서 단리될 수 있다. 유전자 변형된 동물 모델의 경우에, 형질전환된 숙주 세포는 심지어 비-인간 동물 그 자체의 체내에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터 중 1개 이상을 포함하는 재조합 비-인간 숙주 세포 및/또는 단리된 재조합 인간 숙주 세포의 생성은 또한, 예를 들어 본원에 기재된 rAAV 벡터의 대규모 생성을 위한 수단을 비롯하여 다양한 진단 및 실험실 프로토콜에 유용한 것으로 고려된다. 특히 이러한 바이러스 생성 방법은 특히 유전자 요법 도구로서 유용하도록 매우 높은 역가의 바이러스 원액을 필요로 하는 것을 포함하는 기존의 방법론보다 개선된 것으로 고려된다. 본 발명자들은 본 발명의 방법의 하나의 매우 유의한 이점이 형질감염 비율을 적합한 수준으로 계속 유지하면서 포유동물 도입 프로토콜에서 보다 낮은 역가의 바이러스 입자를 이용하는 능력일 것으로 생각한다.
개시된 캡시드-변형된, 개선된 도입-효율 rAAV 벡터, 발현 시스템, 감염성 AAV 입자, 또는 숙주 세포 중 1개 이상을 포함하는 조성물, 및 특히 요법에 사용하기 위한, 및 1개 이상의 포유동물 질환, 장애, 기능장애 또는 외상의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 적어도 제1의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 제약 조성물은 임의로 1개 이상의 희석제, 완충제, 리포좀, 지질, 지질 복합체를 추가로 포함할 수 있거나; 또는 티로신-변형된 rAAV 벡터는 미소구 또는 나노입자 내에 포함될 수 있다.
인간 또는 다른 포유동물의 근육내, 정맥내, 또는 장기 또는 조직 또는 복수개의 세포 또는 조직 내로의 직접 주사에 적합한 제약 제제가 특히 바람직하지만, 본원에 개시된 조성물은 또한 예를 들어 체내 1개 이상의 장기, 조직 또는 세포 유형 내로의 직접 주사에 적합한 제제를 비롯하여 포유동물 신체의 이산 영역에 대한 투여에서 유용성을 발견할 수 있다. 이러한 주사 부위는 뇌, 관절 또는 관절낭, 활막 또는 활막하 조직, 건, 인대, 연골, 골, 관절-주위 근육 또는 포유동물 관절의 관절 공간, 및 또한 예를 들어, 복강내, 흉곽내, 혈관내, 또는 뇌실내 전달을 통한 바이러스 벡터의 도입을 비롯하여, 장기, 예컨대 심장, 간, 폐, 췌장, 장, 뇌, 방광, 신장, 또는 환자의 체내 다른 부위에 대한 직접 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 캡시드-변형된, 개선된 도입 효율 rAAV 벡터 중 1개 이상을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 재조합 아데노-관련 바이러스 비리온 입자, 조성물 및 숙주 세포, 예컨대 예를 들어 적합한 수단을 통해, 예컨대 선택된 포유동물의 근육내, 정맥내, 관절내, 또는 1개 이상의 세포, 조직 또는 장기에 대한 직접 주사에 의해 포유동물에 대한 투여가 의도되는 벡터의 제약 제제에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 하기 기재된 바와 같이 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화될 수 있고, 요법을 원하는 선택된 장기, 조직 및 세포에 대한 투여를 용이하게 하기 위해 1개 이상의 리포좀, 지질, 지질 복합체, 미소구 또는 나노입자 제제를 포함할 수 있다.
개시된 캡시드-변형된 rAAV 벡터 중 1개 이상 (및 또한 1개 이상의 비리온, 바이러스 입자, 형질전환된 숙주 세포 또는 이러한 벡터를 포함하는 제약 조성물)을 포함하는 키트; 및 1개 이상의 치료, 진단 및/또는 예방 임상적 실시양태에서 이러한 키트를 사용하는 것에 대한 지침서가 본 발명에 의해 또한 제공된다. 이러한 키트는 1개 이상의 시약, 제한 효소, 펩티드, 치료제, 제약 화합물 또는 조성물(들)을 숙주 세포 또는 동물에게 전달하기 위한 수단 (예를 들어, 시린지, 주사가능한 것 등)을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 질환, 결핍, 기능장애 및/또는 손상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 호전시키기 위한 것을 포함하거나, 바이러스 벡터 그 자체의 대규모 생성을 위한, 예컨대 상업적 판매를 위한, 또는 예를 들어 바이러스 학자, 의학 전문가 등을 비롯한 타인에 의한 사용을 위한 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 동물, 특히 척추 포유동물에서 질환, 기능장애, 장애, 비정상적인 상태, 결핍, 손상, 또는 외상의 적어도 1개 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기 위한 의약의 제조에서, 본원에 기재된 개시된 rAAV 벡터, 비리온, 발현 시스템, 조성물 및 숙주 세포의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 일반적으로 이환된 동물에서 이러한 질환, 기능장애, 장애, 비정상적인 상태, 결핍, 손상 또는 외상의 1개 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 완화시키는데 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 개시된 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 숙주 세포, 조성물 또는 그의 복수개 중 1개 이상을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 수반한다. 방법은 또한 이러한 상태를 갖는 것으로 의심되는 동물의 예방적 치료, 또는 진단 후에 또는 증상의 개시 전에 이러한 상태가 발생할 위험이 있는 동물에 대한 이러한 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 1개 이상의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 코딩할 것이다. 실제로, 외인성 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 이러한 분자, 또는 원할 수 있는 복수개의 이러한 분자를 코딩할 수 있다. 조합 유전자 요법을 원하는 경우에, 2개 이상의 상이한 분자는 단일 rAAV 발현 시스템으로부터 생성될 수 있거나, 또는 대안적으로, 선택된 숙주 세포는 각각 적어도 2개의 상이한 이러한 분자를 코딩하는 고유한 이종 폴리뉴클레오티드를 제공할 2개 이상의 고유한 rAAV 발현 시스템으로 형질감염될 수 있다.
개시된 rAAV 벡터, 발현 시스템, 감염성 AAV 입자, 숙주 세포 중 1개 이상을 포함하는 조성물, 및 특히 의약의 제조에 사용하기 위한 적어도 제1의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물 및 이러한 rAAV 벡터의 치료적 투여를 수반하는 방법이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 제약 조성물은 임의로 리포좀, 지질, 지질 복합체를 추가로 포함할 수 있거나; 또는 rAAV 벡터는 미소구 또는 나노입자 내에 포함될 수 있다. 인간의 근육내, 정맥내, 또는 장기 또는 조직 내로의 직접 주사에 적합한 제약 제제가 특히 바람직하다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 포유동물에서 다양한 폴리펩티드 결핍의 증상을 치료 또는 호전시키기 위한 의약의 제조에서, 본원에 기재된 개시된 벡터, 비리온, 발현 시스템, 조성물 및 숙주 세포의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 일반적으로 이환된 포유동물에서 이러한 결핍의 증상을 치료 또는 호전시키는데 충분한 양으로 및 충분한 시간 동안 개시된 벡터, 비리온, 숙주 세포 또는 조성물 중 1개 이상을 이를 필요로 하는 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 수반한다. 방법은 또한 이러한 상태를 갖는 것으로 의심되는 동물의 예방적 치료, 또는 진단 후에 또는 증상의 개시 전에 이러한 상태가 발생할 위험이 있는 동물에게 이러한 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 원리의 이해를 촉진시킬 목적으로, 도면에 예시된 실시양태 또는 실시예에 대한 언급이 이제부터 이루어질 것이고, 구체적 표현이 그를 기재하는데 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 그에 의한 본 발명의 범위의 어떠한 제한도 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 기재된 실시양태에서의 임의의 변경 및 추가의 변형, 및 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 원리의 임의의 추가의 적용은 본 발명과 관련된 통상의 기술자에게 정상적으로 일어나는 것과 같이 고려된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 유사 참조 번호가 유사 요소를 식별하는, 첨부된 도면과 함께 제공되는 하기 기재를 참조하여 보다 잘 이해될 수 있고, 여기서:
도 1a, 도 1b, 및 도 1c는 시험관내 HeLa 세포에서 AAV 벡터-매개 EGFP 발현에 대한 NF-κB 경로 억제제 및 활성화제의 효과를 제시한다. 세포를 다양한 농도의 억제제 및 활성화제로 12시간 동안 사전-처리하고, 세포당 2 × 103 AAV-EGFP vgs로 도입시켰다. 도 1a는 트랜스진 발현이 감염후 48시간에 형광 현미경검사에 의해 검출되었음을 제시한다. 대표적인 영상을 제시한다. 도 1b는 도 1a로부터의 데이터의 정량적 분석을 제시한다. 5개의 시야로부터의 영상을 기재된 바와 같이 분석하였다. *P < 0.001. 도 1c는 scAAV 벡터로 NF-κB 조절제의 존재 하에 도입된 HeLa 세포 추출물의 웨스턴 블럿 분석이다. AAV 노출에 대한 반응으로NF-κB 신호전달을 검출하기 위해 항-p65 및 항-IκB 항체 [전통적인 경로], 항-p100/p52 항체 [비-정규 경로]를 사용하여 샘플을 분석하였다. 이러한 결과는 2개의 독립적 실험을 대표한다;
도 2a 및 도 2b는 NF-κB 조절제의 존재 하에서의 1차 인간 단핵구-유래 수지상 세포의 AAV-EGFP 벡터-매개 도입을 제시한다. 도 2a는 트랜스진 발현이 도입후 48시간에 유동 세포계측에 의해 검출되었음을 제시한다. 도 2b는 2,000 vgs/세포의 scAAV 벡터로 NF-κB 조절제의 존재 하에 모의-도입 또는 도입된 수지상 세포로부터의 핵 추출물에서 NF-κB 활성화의 전통적인 및 비-정규 경로의 성분에 대한 웨스턴 블럿 분석이다;
도 3a 및 도 3b는 마우스 생체내 AAV 벡터-유도된 선천성 면역 및 NF-κB 반응을 제시한다. 선천성 면역 매개자 (도 3a) 또는 NF-κB 활성화 (도 3b)의 유전자 발현 프로파일링을 기재된 바와 같이 수행하였다. 2-시간 시점에서의 유전자 발현에서의 배수 변화에 대한 데이터를 Bay11의 존재 하의 AAV 벡터 (파선 또는 개방 막대)와 Bay11의 부재 하의 AAV 벡터 (흑색 또는 회색 막대)를 비교하여 제시한다. 2벌 ΔCT의 가변성을 측정하는 것에 의해 (GAPDH와 비교, 2^-ΔCT(가변성)) 최소 역치 배수-증가 (수평 흑색 선)는 2.5 (도 3a) 또는 3.0 (도 3b)이었다;
도 4a 및 도 4b는 꼬리-정맥을 통한 각각 1 × 1011 vgs의 WT-scAAV-EGFP 또는 TM-scAAV-EFGP 벡터/동물 주사후 10일의 뮤린 간세포에서의 트랜스진 발현을 예시한다. 도 4a는 대표적인 영상을 제시한다. 원래 배율: ×400. 도 4b는 도 4a로부터의 데이터의 정량적 분석을 제시한다. 5개의 시야로부터의 영상을 도 1a의 범례에 기재된 바와 같이 정량적으로 분석하였다;
도 5는 AAV 게놈이 역전된 말단 반복부 (ITR) 내에 NF-κB-반응성 전사 인자에 대한 추정 결합 부위를 함유함을 입증한다. AAV-ITR 내의 추정 NF-κB-반응성 전사 인자-결합 부위는 웹-기반 TRANSFAC 데이터베이스를 사용한 인 실리코 분석에 의해 식별하였다. p300, TFIIB, 및 SpII 전사 인자에 대한 결합 부위는 각각 녹색, 적색 및 청색 밑줄친 폰트로 표시된다. 박스친 서열은 ITR 내의 20-뉴클레오티드, 단일 가닥 D-서열을 나타낸다;
도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 6d, 및 도 6e는 시험관내 HeLa 세포에서 AAV2-EGFP 벡터로부터의 트랜스진 발현에 대한 NF-κB 활성화제 및 억제제의 효과를 제시한다. 세포를 억제제 및 활성화제의 다양한 조합으로 12시간 동안 모의-처리 또는 사전처리하였다. 세척된 세포를 2 × 103 vg/세포의 scAAV2-EGFP (도 6a), ssAAV2-EGFP (도 6b), 또는 TM-scAAV2-EGFP (도 6c)로 감염시켰다. 트랜스진 발현은 감염후 48시간에 형광 현미경검사에 의해 검출되었다. 대표적인 영상을 제시한다; scAAV 벡터로 NF-κB 조절제의 존재 하에 도입된 HeLa 세포로부터의 세포질 (도 6d) 및 핵 (도 6e) 추출물의 웨스턴 블럿 분석. NF-κB 신호전달의 검출을 위해 항-p100/p52 항체를 사용하는 것에 의해 샘플을 분석하였다. 항-GAPDH 및 라민 B 항체를 적절한 대조군으로서 사용하였다. 이러한 결과는 2개의 독립적 실험을 대표한다;
도 7은 Bay11의 이전 투여의 존재 및 부재 하의 (각각 n = 3), scAAV 벡터로 모의-주사 (n = 2) 또는 주사된 후 마우스로부터의 간 균질물의 웨스턴 블럿 분석을 제시한다. AAV 노출에 대한 반응으로 NF-κB 신호전달을 검출하기 위해 항-p52 항체를 사용하여 샘플을 분석하였다. 항-β-액틴 항체를 로딩 대조군으로서 사용하였다;
도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 및 도 8f는 PBS- 또는 Bay11-사전-처리 후에 WT-AAV 또는 TM-AAV 벡터로 주사된 동물로부터 간 샘플로부터 수집된 총 mRNA로부터의 다양한 시토카인/케모카인의 유전자 발현에서의 배수 변화를 제시한다. 도 8a: IL-1α; 도 8b: IL-6; 도 8c: TNF-α; 도 8d: IL-12α, 도 8e: KC; 및 도 8f: RANTES. 값은 2.6 초과 및 0.38 미만으로 유의하고; 이는 특이적 유전자 발현을 측정하기 위해 사용된 96웰 플레이트에서 가변성을 결정하는 것에 의해 계산된다.
도 9는 NF-kB 억제제의 부재 또는 존재 하에서의 AAV 벡터에 대한 체액성 반응을 나타낸다. 항-AAV2 IgG2a 수준은 Bay11을 사전 투여하거나 투여하지 않으면서 scAAV 벡터의 주사 후 제10일에 마우스로부터의 말초 혈액에서 결정하였다 (n = 각각 4마리).
도 10은 HeLa 세포 및 32P-표지된 단일-가닥 D[+]-서열 프로브 (레인 1) (숙주 세포 단백질 (레인 3, 화살촉)과 상호작용함)로부터 제조된 전세포 추출물을 사용하여 수행된 전기영동 이동성-변화 검정을 예시한다. 단일-가닥 D[-]-서열 (레인 2) 프로브를 적절한 대조군으로서 사용하였으며, 이는 또한 세포성 단백질, FKBP52 (레인 4, 화살표)과 상호작용한다. 결합 검정을 또한 비오틴-표지된 ssD[+]-서열 프로브를 사용하여 수행하고, 이어서 스트렙타비딘-비드를 사용하여 선택하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분획화하였다. 관련 단백질 밴드를 염색에 의해 가시화하고, 겔로부터 절제하고, 질량 분광측정법에 적용하였으며, 고유 펩티드 중 하나가 NF-κB-억제인자 (NRF)와 상동성을 공유하는 것으로 밝혀졌다;
도 11a 및 도 11b는 T47D 및 T47D+hHGFR 세포에서의 AAV3-매개 트랜스진 발현의 분석을 보여준다. 도 11a는, 동일한 조건 하에 다양한 표시된 감염 다중도 (MOI)의 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터로 감염시킨 동등한 수의 T47D 및 T47D+hHGFR 세포를 보여준다. 트랜스진 발현을 감염 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 결정하였다. 도 11b는 5 μg/mL의 hHGF의 부재 또는 존재 하에 2,000 vgs/세포의 scAAV3 벡터를 도입한 T47D+hHGFR 세포를 보여준다. 트랜스진 발현을 감염 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 결정하였다;
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 AAV3-매개 트랜스진 발현에 대한 BMS-777607의 효과를 보여준다. 도 12a는 모의-처리되거나, 또는 2,000 vgs/세포의 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터로 감염된 다양한 농도의 BMS-777607로 처리된 T47D+ hHGFR 세포를 보여준다. 트랜스진 발현을 감염 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 결정하였다. 도 12b는 1 μM의 BMS-777607의 부재 또는 존재 하에 10,000 vgs/세포의 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터로 감염된 T47D 및 T47D+hHGFR 세포를 예시한다. 도 12c는 모의-처리되거나, 또는 2시간 동안 BMS-777607로 전처리된 T47D 및 T47D+hHGFR 세포를 보여준다. 전세포 용해물을 제조하고, 다양한 표시된 1차 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 로딩 대조군으로서 β-액틴을 사용하였다.
도 13a 및 도 13b는 다양한 AAV 혈청형-매개 트랜스진 발현에 대한 BMS-777607의 효과를 보여준다. 도 13a에서, 모의-처리되거나 또는 1 μM의 BMS-777607로 처리된 T47D+ hHGFR 세포를 2,000 vgs/세포의 scAAV2-, scAAV3- 또는 scAAV4-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 도 13b에서, 모의-처리되거나 또는 1 μM의 BMS-777607로 처리된 T47D+ hHGFR 세포를 2,000 vgs/세포의 scAAV5-, scAAV7-, scAAV8- 또는 scAAV9-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 트랜스진 발현을 감염 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 결정하였다.
도 14a, 도 14b, 도 14c 및 도 14d는 MG132로 처리하거나 처리하지 않은 Huh7 및 Hep293TT 세포에서의 AAV3-매개 도입 효율의 비교 분석을 보여준다. 도 14a에서, 모의-처리되거나 또는 5 μM의 MG132로 처리된 HeLa 세포를 scAAV2-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 도 14b에서, 모의-처리되거나 또는 다양한 농도의 MG132로 처리된 Huh7 및 Hep293TT 세포를 scAAV3-WT-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 도 14c에서, 모의-처리되거나 또는 200 μM의 Tyr23으로 처리된 HeLa 세포를 scAAV2-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 도 14d에서, 모의-처리되거나 Tyr23으로 처리된 Hep293TT 세포를 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터로 감염시켰다. 트랜스진 발현을 도입 72시간 후에 결정하였다;
도 15a, 도 15b 및 도 15c는 AAV3 캡시드 상의 표면-노출된 티로신 잔기의 부위-지정 돌연변이 분석을 보여준다. 동일한 조건 하에 Huh7 세포에 WT 또는 F501Y scAAV3-CBAp-EGFP 벡터를 도입하고, 트랜스진 발현을 도입 72시간 후에 결정하였다. WT의 도입 효율 (도 15a), 및 Huh7 (도 15b) 및 Hep293TT (도 15c) 세포에서의 다양한 Y-F scAAV3-매개 트랜스진 발현이 제시된다. 트랜스진 발현을 도입 72시간 후에 결정하였다;
도 16a, 도 16b 및 도 16c는 WT, 및 단일, 이중 및 삼중 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터의 도입 효율을 예시한다. 도 16a에서, 동일한 조건 하에 Huh7 세포에 WT 또는 다양한 표시된 Y-F 돌연변이체 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터를 도입하였다. 트랜스진 발현을 도입 72시간 후에 결정하였다. 도 16b에서, Huh7 세포에 5 μg/mL의 hHGF의 존재 또는 부재 하에 5,000 vgs/세포의 WT 또는 Y→F 돌연변이된 scAAV3 벡터를 도입하였다. 도 16c는 감염 72시간 후에 형광 현미경검사에 의해 결정된 트랜스진 발현을 보여준다;
도 17a, 도 17b, 도 17c 및 도 17d는 직접 종양내 주사 후의 생체내 AAV3 벡터의 도입 효율을 보여준다. NSG 마우스의 Huh7- (도 17a) 및 Hep293TT- (도 17b) 유래 종양에서의 WT-AAV3 벡터의 도입 효율이 제시된다. NSG 마우스의 Hep293TT-유래 종양에서의 WT- (도 17c) 및 Y705+731F-AAV3 (도 17d) 벡터의 도입 효율이 또한 제시된다. 각각의 세트의 마우스로부터의 2개의 대표적인 종양 절편의 EGFP 형광 (녹색) 및 DAPI 염색 (청색)이 제시된다;
도 18a, 도 18b 및 도 18c는 꼬리-정맥 주사 후에 NSG 마우스의 Hep293TT-유래 종양에서의 WT- 및 Y705+731F-AAV3 벡터의 도입 효율을 예시한다. PBS (도 18a), WT-AAV3 (도 18b) 또는 Y705+731F-AAV3 (도 18c) 벡터를 주사한 각각의 세트의 마우스로부터의 3개의 대표적인 종양 절편에서의 종양의 EGFP 형광 (녹색) 및 DAPI 염색 (청색)이 제시된다;
도 19a 및 도 19b는 HEK293 세포에서의 ssAAV 및 scAAV 매개 EGFP 발현에 대한 다양한 키나제 억제제의 효과를 보여준다. 세포를 감염 전에 1시간 동안 억제제로 전처리한 후, 1 x 103 vgs/세포를 도입하였다. 도 19a에서, 트랜스진 발현을 감염 48시간 후에 형광 현미경검사에 의해 검출하였다. 도 19b에서, 3가지 시야로부터의 영상을 기재된 바와 같이 분석하였다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 20a 및 도 20b는 개별 부위-지정 scAAV2 캡시드 돌연변이체를 사용한 HEK293 세포의 도입 후의 EGFP 발현의 분석을 보여준다. AAV2 캡시드에서의 각각의 15개의 표면-노출된 세린 (S)을 발린 (V)으로 치환하고, 이어서 트랜스진 발현을 매개하는 그의 효율에 대해 평가하였다. 도 20a는 1 x 103 vgs/세포의 MOI로의 감염 48시간 후의 EGFP 발현 분석을 보여준다. 도 20b는 각각의 세린-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 보여준다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 21a 및 도 21b는 AAV2의 구조를 예시한다. 도 21a에서, AAV2 VP3의 삼량체가 리본 표시로 제시되며, 20면체 3중 축의 하부 (좌측) 및 90° 회전도 (우측)를 보여주고, VP 단량체는 청색, 자주색 및 담청색이고, 세린 잔기 458, 492 및 662의 위치는 각각 황색, 녹색 및 적색 구체로 제시하였다. 20면체 2-, 3- 및 5-중 축의 대략적 위치를 각각 채워진 타원형, 삼각형 및 오각형으로 도시하였다. 도 21b에서, AAV2의 캡시드 표면을 청색으로 나타내었고, 세린 잔기 458, 492 및 662를 상기 유사 도면에 나타낸 것과 동일한 색상으로 강조하였다. S458 및 S492 잔기는 2-중 축 주위의 함몰부에 대면하는 돌출부의 외부 표면 상에 서로 인접하여 위치한다. S662는 20면체 5-중 축 주위의 함몰부의 바닥에 놓인 (코어 8-가닥 베타-배럴의 β-H 및 β-I 가닥 사이의) HI 루프 (백색) 상에 위치한다. 20면체 5-중 축에서 채널을 형성하는 (β-D와 β-E 가닥 사이의) 5-중 대칭 관련 DE 루프는 갈색으로 제시된다. 20면체 2-중 (2F), 3-중 (3F) 및 5-중 (5F) 축의 대략적 위치를 열린 화살표로 표시하였다;
도 22a 및 도 22b는 scAAV2 캡시드의 위치 662에서의, 트랜스진 발현을 조정하는 다양한 아미노산을 사용한 세린 치환의 효과의 평가를 요약한다. 다양한 아미노산을 사용하여 하기 8종의 세린 돌연변이체를 생성하고, 293 세포에서의 이들의 도입 효율을 분석하였다: S662→발린 (V), S662→알라닌 (A), S662→아스파라긴 (N), S662→아스파르트산 (D), S662→히스티딘 (H), S662→이소류신 (I), S662→류신 (L), 및 S662→페닐알라닌 (F). 도 22a는 1 x 103 vgs/세포의 MOI로의 293 세포의 감염 48시간 후의 EGFP 발현 분석을 보여준다. 도 22b는 각각의 세린-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 보여준다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 23a 및 도 23b는 scAAV2-S662V 벡터의 도입 효율과 다양한 세포 유형에서의 p38 MAPK 활성의 상관관계 분석을 보여준다. 도 23a는 HEK293, HeLa, NIH3T3, H2.35 및 moDC에서의 WT- 및 S662V-AAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 보여준다. 도 23b는 p-p38 MAPK 발현 수준에 대한 다양한 세포주로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 총 p38 MAPK 및 GAPDH 수준을 측정하고, 로딩 대조군으로서 사용하였다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 24a, 도 24b 및 도 24c는 단핵구-유래 수시장 세포 (moDC)에서의 scAAV 벡터-매개 트랜스진 발현을 예시한다. 도 24a는 EGFP 발현에 대한 JNK 및 p38 MAPK 억제제, 및 위치 662에서의 세린 잔기의 부위-지정 치환의 효과를 예시한다. 도 24b는 감염 및 성숙 개시 48시간 후의 도 24a로부터의 데이터의 정량화를 요약한다. 도 24c는 5 x 104 vgs/세포의 MOI로 scAAV2-S662V 벡터로 감염된 moDC에서의 CD80, CD83, CD86과 같은 공동-자극 마커의 발현의 분석이다. 시토카인으로 자극되고 본원에 기재된 바와 같이 생성된 iDC (미성숙 수지상 세포) 및 mDC (성숙 수지상 세포)를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 대표적인 예가 제시된다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 25는 K562 세포에 대한 hTERT-특이적 세포독성 T-림프구 (CTL) 사멸 활성의 분석을 예시한다. 말단절단된 인간 텔로머라아제 (hTERT)를 코딩하는 scAAV2-S662V 벡터에 의한 moDC의 도입 후에 CTL을 생성하였다. scAAV2-S662V-EGFP 벡터-도입된 moDC를 사용하여 비-특이적 CTL을 생성하였다. 녹색 형광 막 염색제인 3,3-디옥타데실옥사카르보시아닌 (DiOC18(3))으로 예비염색된 1 x 105개의 표적 K562 세포를 다양한 비의 CTL (80:1, 50:1, 20:1, 10:1, 및 5:1)과 함께 밤새 공동-배양하였다. 막-투과성 핵산 대조-염색제인 아이오딘화프로피듐을 손상된 원형질막을 갖는 세포를 표지하기 위해 첨가하였다. 사멸된 이중 염색-양성 세포의 백분율을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
도 26a 및 도 26b는 개별 부위-지정 AAV2 캡시드 돌연변이체를 사용한 HEK293 세포의 도입 후의 EGFP 발현의 분석을 보여준다. AAV2 캡시드 내의 각각의 17개의 표면-노출된 트레오닌 (T) 잔기를 발린 (V)으로 치환하고, 트랜스진 발현을 매개하는 그의 효율에 대해 평가하였다. 도 26a에서, 감염 48시간 후의 EGFP 발현 분석이 제시된다 (1 × 103 vg/세포의 MOI). 도 26b는 각각의 트레오닌-돌연변이체 scAAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 보여준다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 27a 및 도 27b는 다중 부위-지정 AAV2 캡시드 돌연변이체로 감염된 HEK293 세포에서의 EGFP 발현의 분석을 보여준다. 몇몇 가장 효율적인 트레오닌 돌연변이를 단일 AAV2 캡시드 상에 조합하여 이중- 및 삼중-돌연변이체를 생산하고, 각각의 벡터의 효율을 평가하였다. 도 27a는 1 × 103 vg/세포의 MOI로의 감염 48시간 후의 EGFP 발현 분석을 예시한다. 도 27b는 각각의 트레오닌-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 보여준다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 28a 및 도 28b는 캡시드 최적화된 AAV2 벡터가 도입된 H2.35 세포에서의 EGFP 발현의 평가를 나타낸다. 가장 효율적인 티로신, 세린 및 트레오닌 돌연변이를 단일 AAV2 캡시드 상에 조합하여 몇몇 최적화된 AAV 돌연변이체를 생산하였다. 각각의 벡터의 효율을 불멸화 뮤린 간세포 상에서 평가하였다. 도 28a는 1 × 103 vg/세포의 MOI로의 감염 48시간 후의 EGFP 발현 분석을 보여준다. 도 28b는 각각의 최적화된 scAAV2 벡터의 도입 효율의 정량화를 요약한다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, **P < 0.001;
도 29a 및 도 29b는 캡시드 최적화된 AAV 벡터에 의해 매개된 H2.35 세포에서의 EGFP 발현의 동역학을 예시한다. 도 29a는 1 x 103 vg/세포의 MOI로의 감염 16, 24 및 48시간 후의 EGFP 발현 분석을 보여준다. 도 29b는 각각의 최적화된 scAAV2 벡터의 도입 효율의 정량화로부터의 결과를 예시한다. WT AAV2에 대해 *P < 0.005, P < 0.001;
도 30a 및 도 30b는 핵에 대한 AAV 다중 돌연변이체 벡터의 세포내 트래픽킹의 분석을 보여준다. AAV2-WT, AAV2-Y444F+Y500F+Y730F 또는 AAV2-Y444F+Y500F+Y730F+T491V 다중-돌연변이체로 감염된 H2.35 세포의 핵 및 세포질 분획을 분리하고, qPCR 분석을 수행하여, 감염 16시간 후 (도 30a) 및 48시간 후 (도 30b)의 세포 내의 벡터 게놈 분포를 평가하였다. 핵에서의 WT에 대해 ** P < 0.001을 유의한 것으로 간주하였다;
도 31a 및 도 31b는 다중 부위-지정 AAV2 캡시드 돌연변이체의 꼬리 정맥 주사 후의 루시페라제 유전자 발현의 생체내 영상화를 보여준다. C57BL/6 마우스에 루시페라제 유전자를 보유하는 몇몇 가장 효율적인 돌연변이체 scAAV 벡터를 1 × 1010 vg/동물로 주사하였다. 라이브 영상을 찍어 루시페라제 활성에서의 차이를 분석하였다. 시각적 결과는 가색상 영상으로서의 방출된 광자의 수/초/cm2 (도 31a) (여기서 최대는 적색이고, 최소는 청색임), 및 상대적 신호 강도 (도 31b)를 제시한다. *P < 0.005를 유의한 것으로 간주하였다;
도 32a 및 도 32b는 AAV2 캡시드 표면을 예시한다. 도 32a는 돌연변이된 17개의 표면 트레오닌 잔기를 청색 (251, 329, 330, 454, 503, 581, 592, 597, 660, 671, 701, 713, 716), 녹색 (455), 황색 (491), 갈색 (550) 및 분홍색 (659)으로 나타낸 AAV2의 캡시드 표면 (회색)을 보여준다. T329, T330, T713 및 T716의 표면 위치는 화살표로 표시된다. 5-중 대칭 관련된 DE 루프 (βD와 βE 가닥 사이)는 오렌지색이다. HI 루프 (βH와 βI 가닥 사이)는 백색이고, 이 루프에 위치한 S662는 적색이다. 도 32a에서의 백색 파선 삼각형은 5-중 축과 2개의 3-중 축 (상기 3-중 사이에 2-중 축이 있음)에 의해 경계를 이루는 바이러스 비대칭 유닛을 도시한다. 파선 타원형은 돌연변이시에 도입에 영향을 미치는 트레오닌 잔기의 대략적 발자국 (2/60)을 도시한다. 도 32b는 바이러스 비대칭 유닛 내의 AAV2 캡시드 표면 잔기의 "로드맵" 투사를 보여준다. AAV2 표면 트레오닌 및 S662를 포함하는 영역은 도 32a에서와 같은 색상으로 표시된다. 티로신 삼중 돌연변이체 잔기, 444, 500 및 730의 잔기는 자주색 음영으로 제시된다. 파선 타원형은 도 23a에 기재된 바와 같다. 파선 직사각형 (청색)은 이전에 AAV2 및 AAV6에 대한 헤파린 술페이트 수용체 결합에 있어서 중요한 것으로 결정된 잔기를 보여준다 (Wu et al., 2006; Opie et al., 2003);
도 33a, 도 33b 및 도 33c는 혈청형 AAV1로부터 AAV10의 야생형 캡시드의 아미노산 정렬을 예시한다. 도 33a는 야생형 AAV1-10 혈청형 캡시드 (서열 1 내지 서열 10)의 아미노산 정렬을 보여준다. 도 33b는 야생형 AAV1-AAV10 혈청형 캡시드, 뿐만 아니라 AAV1-AAV10 캡시드 사이에서 보존되는 표면-노출된 세린 및 트레오닌 잔기 (보존된, 표면-노출된 잔기는 볼드체로 나타냄)의 아미노산 정렬을 보여주고; 도 33c는 야생형 AAV1-AAV12 캡시드에서 보존된, 표면-노출된 티로신 잔기, 뿐만 아니라 아미노산 변형의 실시양태를 보여준다. AAV1-12 사이에서 보존된 티로신 잔기는 볼드체로 제시된다.
도 34는 WT AAV2 벡터의 것과 비교한 다양한 세린→발린 돌연변이된 AAV2 벡터의 패키징 및 도입 효율, 및 야생형 AAV1-AAV10 캡시드의 아미노산 정렬을 보여준다;
도 35는 WT AAV2 벡터와 비교한, 다양한 아미노산으로 대체된 세린-돌연변이체 벡터의 패키징 및 도입 효율을 도시한다;
도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d 및 도 36e는 뮤린 이종이식편 모델의 인간 HCC 종양에서의 rAAV3 및 rAAV8 벡터의 생체내 도입 효율을 보여준다. 암컷 및 수컷 Huh7 종양-보유 NSG 마우스에 rAAV3-CBAp-FLuc 또는 rAAV8-CBAp-FLuc 벡터를 1 × 1011 vgs/마우스로 꼬리-정맥 주사하였다. n = 군당 4마리. 도 36a는 벡터 투여 3일 후의 마우스 전신 생물발광 영상의 대표적인 영상을 보여준다. 도 36b는 벡터 투여 3일 후의 마우스의 전신 생물발광 영상으로부터의 트랜스진 발현 데이터의 정량적 분석을 예시한다. 도 36c는 rAAV3-CBAp-FLuc 또는 rAAV8-CBAp-FLuc 벡터를 1 × 1011 vgs/마우스의 보다 낮은 용량 (L) 또는 1 × 1012 vgs/마우스의 보다 높은 용량 (H)으로 직접 종양내 주사한 Huh7 종양-보유 수컷 NSG 마우스를 보여준다. n = 군당 4마리. 벡터 투여 7일 후의 보다 낮은 용량의 대표적인 영상이 제시된다. 도 36d는 벡터 투여 3일 또는 7일 후의, rAAV3 또는 rAAV8 벡터를 주사한 마우스로부터의 종양 및 간에서의 트랜스진 발현에 대한 정량적 데이터를 제시한다. 도 36e는 벡터 투여 7일 후에, 보다 높은 용량의 rAAV3 또는 rAAV8 벡터를 주사한 마우스로부터의 간 조직 샘플에서 지속되는 벡터 게놈 카피수를 보여준다;
도 37a, 도 37b, 도 37c, 도 37d, 도 37e 및 도 37f는 시험관내 인간 간암 세포에서의 WT 및 캡시드-변형된 rAAV3 벡터의 도입 효율을 보여준다. 도 37a는 CBAp-FLuc 발현 카세트를 보유하는 나타낸 바이러스 벡터를 5,000 vgs/세포로 도입한 Huh7 세포를 보여준다. 도 37b는 HepG2 세포를 보여주고, 도 37c는 Hep293TT 세포 (CBAp-EGFP 발현 카세트를 보유하는 나타낸 바이러스 벡터를 5,000 vgs/세포로 도입함)를 보여준다. 도 37d는 낮은 (100 ng/mL) 또는 높은 (100 μg/mL) 용량의 가용성 헤파린의 부재 또는 존재 하에 CBAp-EGFP 발현 카세트를 보유하는 나타낸 바이러스 벡터를 5,000 vgs/세포로 도입한 Huh7 세포를 보여준다. 도 37e는 5 μg/ml hHGF의 부재 또는 존재 하에 CBAp-EGFP 발현 카세트를 보유하는 나타낸 바이러스 벡터를 5,000 vgs/세포로 도입한 Huh7 세포를 보여준다. 도 37f는 CBAp-EGFP 발현 카세트를 보유하는 나타낸 바이러스 벡터를 5,000 vgs/세포로 도입한 인간 T47D 세포 또는 T47D+hHGFR 세포를 보여준다. 모든 트랜스진 발현 수준을 도입 48시간 후에 결정하였다;
도 38a, 도 38b, 도 38c 및 도 38d는 예시적인 rAAV3 캡시드-돌연변이된 벡터의 생체내 도입 효율을 보여준다. 도 38a는 CBAp-FLuc 발현 카세트를 보유하는 나타낸 돌연변이체 바이러스 벡터를 5 × 1010 vgs/마우스로 꼬리-정맥 주사한 인간 Huh7- 또는 Hep293TT 간 종양-보유 NSG 마우스를 보여준다. n = 각각의 군당 4마리. 제3일에, 마우스 전신 생물발광 영상을 획득하고, 성장하는 종양 및 정상 간을 둘 다 해부하였다. 대표적인 영상을 나타내었다. 도 38b는 Huh7- 및 Hep293TT-유래 종양에서의 FLuc 발현을 보여주는 정량적 데이터를 보여준다. Huh7 종양 (도 38c) 및 정상 간 (도 38d)에서의 벡터 게놈 카피수가 제시된다;
도 39a, 도 39b 및 도 39c는 본 발명의 예시적인 실시양태를 보여준다. 도 39a는 TCS 유전자를 발현하는 최적화된 rAAV3 벡터에 의한 뮤린 이종이식 모델에서의 인간 간 종양발생의 억제를 보여주며; 도 39b 및 도 39c는 나타낸 바이러스 벡터를 제0일에 5 × 1010 vgs/마우스로 꼬리-정맥 주사한 Huh7-FLuc 종양-보유 마우스의 결과, 및 제11일까지 경시적으로 모니터링한 종양 성장을 보여준다. 도 39b는 제8일에 두 군 모두로부터의 마우스의 대표적인 전신 생물발광 영상을 도시한다. 도 39c는 제11일에 분광광도측정 방법에 의해 rAAV3-TCS 벡터-주사된 마우스 및 rAAV3-EGFP 벡터-주사된 마우스에서 측정된 AST 및 ALT의 혈청 활성을 요약한다. 데이터는 평균 ± SD로 제시된다. (n = 5마리/군);
도 40a, 도 40b 및 도 40c는 본 발명의 한 측면에 따라 유용한 예시적인 벡터 구축물 및 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다. 도 40a는 이들 연구에 사용된 rAAV 벡터의 개략적 구조를 보여준다. HP: 헤어핀; D: AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)에서의 D-서열; CBAp: CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터; FLuc: 반딧불이 루시페라제; hGH (A)n: 인간 성장 호르몬 폴리A 서열; HP-: 말단 분해 부위 (trs)가 없는 헤어핀 구조; EGFP: 증진된 녹색 형광 단백질; AFPp: 인간 α-페토-단백질 프로모터; TCS :트리코산틴; 도 40b는 본래 TCS 유전자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 개시 코돈 (ATG) 및 정지 코돈 (TAG)은 각각 녹색 및 적색 폰트로 제시된다. 도 40c는 FLAG-태그 부착된 TCS 유전자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 화학적으로 합성된 TCS 유전자를 클로닝하는데 사용된 EcoRI 및 XhoI 제한 효소 부위는 각각 볼드체 이탤릭 폰트로 제시되며, 정지 코돈 (TAA)를 함유하는 FLAG-태그 서열은 밑줄 표시된다;
도 41은 인간 HCC 세포주, Huh7에서의 다양한 단일-, 이중- 및 다중-돌연변이체 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터의 도입 효율을 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 2는 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 3은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 3 (AAV3)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 4는 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 5는 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 6은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 7은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 8은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 9는 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 10은 야생형 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이고;
서열 11은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 12는 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 13은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 14는 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 15는 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 16은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 17은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 18은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 19는 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 20은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 21은 본 발명에 따라 사용하기 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이고;
서열 22는 NF-kB-반응성 전사 인자에 대한 추정 결합 부위를 함유하는 핵산 서열이고 (도 5 참조);
서열 23은 단일-가닥 핵산 서열 프로브이고 (도 10 참조);
서열 24는 이중-가닥 핵산 서열 프로브이고 (도 10 참조);
서열 25는 단일-가닥 핵산 서열 프로브이고 (도 10 참조);
서열 26은 TCS 유전자의 핵산 서열이고 (도 40b 참조); 및
서열 27은 FLAG-태그가 부착된 TCS 유전자의 핵산 서열이다 (도 40c 참조).
예시적인 실시양태의 설명
본 발명의 예시적인 실시양태들이 하기에 기재된다. 명확성을 위해, 실제 구현의 모든 특징이 이 명세서에 기재되지는 않는다. 임의의 이러한 실제 실시양태의 개발에서, 개발자의 특정 목표, 예컨대 시스템-관련 및 비지니스-관련 제약의 준수를 달성하기 위해 수많은 구현-특이적 결정이 이루어져야 하며, 이는 구현에 따라 달라질 것임을 물론 알 것이다. 또한, 이러한 개발 노력은 복잡하고 시간-소비적일 수 있으나, 본 개시내용의 이점을 파악한 통상의 기술자에게는 일상적인 일일 것임을 알 것이다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터는 인간 질환의 수많은 전임상 동물 모델에서의 생체내 유전자 전달에 성공적으로 사용되어 왔으며, 광범위하게 다양한 치료 유전자의 장기 발현에 성공적으로 사용되어 왔다 (Daya and Berns, 2008; Niemeyer et al., 2009; Owen et al., 2002; Keen-Rhinehart et al., 2005; Scallan et al., 2003; Song et al., 2004). AAV 벡터는 또한 면역-특권 부위, 즉 레버(Leber) 선천성 흑암시의 경우의 안구 전달에 표적화될 때 인간에서 장기 임상적 이점을 나타내었다 (Bainbridge et al., 2008; Maguire et al., 2008; Cideciyan et al., 2008). 이 벡터의 주요 이점은, 오직 제한된 염증 반응을 이끌어내며, 일부 경우에는 심지어 트랜스진 생성물에 대한 면역 관용을 지시하는, 그의 비교적 낮은 면역 프로파일이다 (LoDuca et al., 2009). 그럼에도 불구하고, 치료 효율은, 비-면역 특권 기관에 표적화되는 경우에, 바이러스 캡시드에 대한 항체 및 CD8+ T 세포 반응으로 인해 인간에서 제한된 한편, 동물 모델에서는, 트랜스진 생성물에 대한 후천성 반응이 또한 보고되었다 (Manno et al., 2006; Mingozzi et al., 2007; Muruve et al., 2008; Vandenberghe and Wilson, 2007; Mingozzi and High, 2007). 이러한 결과는 면역 반응이 AAV 벡터-매개된 유전자 전달에 대한 관심을 유지하고 있다는 것을 시사하였다.
뮤린 모델로부터의 전임상 데이터에 기초하여 (Snyder et al., 1999), AAV는 이러한 모델에서의 이들 항원의 사전 노출의 부재 및 벡터에 대한 다양한 관용-유도 메카니즘의 존재로 인해 최소로 면역원성인 것으로 간주되었다 (Dobrzynski et al., 2004; Cao et al., 2007). 이는 주목할만한 치료 효율 (F.IX 수준의 5-25%) 및 장기 (2-8년) 및 안정적인 F.IX 발현을 나타내는, B형 혈우병의 뮤린 및 개 모델에서의 유전자 전달 연구에서 가장 잘 설명되었다 (Snyder et al., 1999). B형 혈우병을 앓고 있는 대상체에서 인간 F.IX 유전자를 간으로 전달하기 위해 AAV를 사용한 제1 임상 시험에서, 치료 수준 (~11.8%)의 F.IX 발현이 벡터의 고용량 (2 x 1012 vgs/kg 체중)에서 관찰되었다 (Manno et al., 2006).
그러나, 유전자 전달 4-6주 후에, 간 트랜스아미나제의 상승 및 F.IX 트랜스진 발현의 기준선 수준으로의 저하와 동시에 AAV 캡시드-특이적 T 세포 반응이 관찰되었다. 이러한 CD8+ T 세포-매개된 면역 반응은 어떠한 전임상 동물 모델에서도 관찰된 적이 없었으므로 놀라운 것이었다 (Mingozzi et al., 2007). 이러한 연구 및 몇몇 다른 연구는 숙주 염증성 및 선천성 면역 반응이 형질도입된 간세포의 세포독성 T-림프구 매개된 제거에 연루되었음을 보여주었다 (Zhu et al., 2009; Li et al., 2009; Madsen et al., 2009). 이후에, AAV 벡터에 대한 숙주 면역 반응을 피하기 위해 대단한 노력이 이루어졌다. 이는 대안적 자연 발생 AAV 혈청형, 예컨대 AAV1 (Brantly et al., 2009; Cohn et al., 2007) 또는 AAV8 (Nathwani et al., 2006)의 사용, 셔플링된 캡시드 (Gray et al., 2010), 또는 표면-노출된 티로신-돌연변이체 AAV2 (Markusic et al., 2010) 벡터의 사용을 포함한다. 또한, 면역 반응과 연관된 위험에 대응하기 위한 전략은 숙주 조직에서 표적화되어 발현되는 트랜스진 유전자의 사용 (Wang et al., 2010), 또는 일시적인 면역-저해 프로토콜의 개발 (Jiang et al., 2006)을 포함하였다.
이러한 전략이 AAV 유전자 전달의 안전성을 증진적으로 개선하였을지라도, 인간에서의 그의 효능은 앞으로도 주시되어야 한다. 예를 들어, 시클로스포린 및 MMF를 사용한 면역 저해는 지단백질 리파제가 결핍된 환자에서의 근육-지시된 유전자 전달 동안 낮은 AAV1 벡터 용량 (3 x 1011 vg/kg)에서 효과적이었으나, 고용량 (1 x 1012 vg/kg)에서는 캡시드에 대한 IFN-α CD8+ T 세포 반응을 방지하지 못하였다 (Ross et al., 2006). 이러한 데이터는 AAV 감염에 대한 반응에서 첫번째 "위험 신호"를 확인하기 위한 바이러스-숙주 세포 상호작용의 생물학에 대한 추가의 연구를 추구하는 것의 중요성을 강조한다. 염증성 및 선천성 면역 반응과 연관된 단백질의 잠재적인 활성 및 선택성이 AAV로의 형질도입시에 숙주 세포에서 어떻게 조절되는지 이해하는 것이 캡시드 및/또는 트랜스진 생성물에 대한 숙주 면역 반응의 장애를 해결하기 위한 단서를 제공할 수 있을 것으로 추론되었다. 다른 바이러스 벡터와 비교하여, AAV 벡터가 적절한 APC, 예컨대 DC의 형질도입에 비효율적이더라도, NF-κB를 활성화하는 추가의 신호가 이들 세포에서 트랜스진 발현을 증가시킬 것이며, 이에 의해 트랜스진 생성물에 대한 후천성 반응의 위험이 증가할 것이다.
AAV 혈청형 2 기반의 재조합 벡터가 현재 다수의 유전자 요법 임상 시험에서 사용되고 있으며 (Daya and Berns, 2008), 최근에 레버의 선천성 흑암시의 치료에서 주목할만한 효능을 보여주었다 (Bainbridge et al., 2008; Cideciyan et al., 2008; Maguire et al., 2008). 그러나, 일반적 집단에서 혈청반응-양성의 높은 유병률 (~80 내지 90%)에 기초한 AAV2 벡터에 대한 체액성 반응에 대한 관심이 증가하고 있다 (Boutin et al., 2008; Mendell et al., 2010; Manno et al., 2006). 다수의 신규 AAV 혈청형의 발견이 이러한 잠재적인 문제를 피하기 위한 AAV 벡터의 개발을 촉진하였다 (Muramatsu et al., 1996; Chiorini et al., 1997; Chiorini et al., 199; Rutledge et al., 1998; Gao et al., 2002; Gao et al., 2004).
예를 들어, 재조합 AAV8 벡터는 최근에 간암의 마우스 모델에서 치료적인 것으로 보고되었다 (Kato et al., 2006). 그러나, 몇몇 그룹은 뮤린 모델에서 인간 간암 세포를 표적화하기 위해 AAV2 벡터를 사용하는 다양한 전략을 설명하였다 (Su et al., 1996; Peng et al., 2000; Su et al., 2000; Ma et al., 2005; Wang et al., 2005; Tse et al., 2008; Zhang et al., 2008; Malecki et al., 2009; Wang et al., 2010). 인간 간암 세포를 표적화하는데 가장 효율적인 AAV 혈청형을 확인하기 위해, 3가지 상이한 인간 간암 세포주가 AAV3 벡터에 의해 매우 효율적으로 형질도입되는 것으로 나타났다 (Glushakova et al., 2009). 인간 간세포 성장 인자 수용체 (hHGFR)는 그 후에 AAV3 감염에 대한 세포 보조-수용체로서 확인되었다 (Ling et al., 2010). AAV3-매개된 형질도입에서 hHGFR의 정확한 역할, 특히 hHGFR의 세포내 도메인과 연관된 티로신 키나제 활성의 역할은 처음부터 명확하지 않았다. 실시예 5의 데이터 (하기 참조)는 AAV3-hHGFR 상호작용에 대한 보다 상세한 설명을 제공하고, 인간 간암 세포를 표적화는데 사용하기 위해 최적화된 캡시드-돌연변이된 AAV3 벡터의 개발을 예시하였다.
rAAV 캡시드 단백질
60개의 개별 캡시드 단백질 서브유닛의, 4.7-kb 단일-가닥 DNA 게놈을 보호할 수 있는 비-외피보유 T-1 20면체 격자로의 초분자적 조립(supramolecular assembly)은 헬퍼-의존적 인간 파르보바이러스인 아데노-연관 바이러스2 (AAV2)의 생활 주기에서 결정적인 단계이다. 성숙한 20-nm 직경의 AAV2 입자는 1:1:18의 비의 VP1, VP2, 및 VP3으로 지정된 3가지 구조적 단백질 (각각 분자 질량 87, 73, 및 62 kDa)로 이루어진다. 그의 대칭성 및 이들 분자량 추정치에 기초하여, 상기 입자를 포함하는 60개의 캡시드 단백질 중에서 3개는 VP1 단백질이고, 3개는 VP2 단백질이고, 54개는 VP3 단백질이다. 다른 모든 것들은 오직 2가지 캡시드 단백질로 이루어진 20면체 입자 내에 그의 게놈이 패키징되어 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 3가지 구조적 단백질의 사용은 AAV 혈청형을 파르보바이러스 중에서 특징적인 것이 되도록 하였다. 이들 60개 캡시드 단백질의 역-평행 β-가닥 배럴로이드(barreloid) 배열은 고도의 내열화성으로 정의된 편향성을 갖는 입자를 생성한다. 캡시드 단백질 중 하나 이상에서의 1개 이상의 티로신 잔기의 변형이 본 발명자들에 의해 종래의 프로토콜보다 낮은 용량 및 낮은 비용에서의 우수한 형질감염을 달성하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 캡시드의 표면 상의 1개 이상의 티로신 잔기의 부위-특이적 변형에 의해 형질도입 효율의 유의한 개선을 달성하였다.
개선된, 캡시드 변형 rAAV 벡터에 대한 용도
본 발명은 포유동물 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 호전을 위한, 키트 내에 포함된 1개 이상의 개시된 티로신-변형된 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 키트는 진단, 예방, 및/또는 요법에 유용할 수 있으며, 특히 암, 당뇨병, 자가면역 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 췌장 질환, 장 질환, 간 질환, 신경계 질환, 신경근육 장애, 신경운동 결핍, 신경골격 손상, 신경계 활동제한, 감각신경 기능장애, 졸중, 허혈, 섭식 장애, α1-항트립신 (AAT) 결핍, 배튼병, 알츠하이머병, 겸상 세포 질환, β-지중해빈혈, 헌팅톤병, 파킨슨병, 골격 질환, 외상, 폐 질환, 또는 그의 임의의 조합의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 호전에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한, 질환, 장애, 기능이상, 손상 또는 외상의 증상의 치료, 예방 또는 호전 (비제한적으로, 질환, 장애 또는 기능이상의 치료, 방지 및/또는 예방, 및/또는 이러한 질환, 장애 또는 기능이상의 하나 이상의 증상의 호전 포함)을 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 개시된 조성물의 용도를 제공한다. rAAV 바이러스 기반 유전자 요법이 특정한 유용성을 발견할 수 있는 예시적인 상태는 암, 당뇨병, 겸상 세포 질환, β-지중해빈혈, 자가면역 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 췌장 질환, 안 질환, 장 질환, 간 질환, 신경계 질환, 신경근육 장애, 신경운동 결핍, 신경골격 손상, 신경계 활동제한, 감각신경 기능장애, 졸중, α1-항트립신 (AAT) 결핍, 배튼병, 허혈, 섭식 장애, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 파킨슨병, 골격 질환, 폐 질환, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 포유동물에서 이러한 질환, 손상, 장애 또는 기능장애의 증상의 치료 또는 호전을 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 상기 치료 또는 호전을 필요로 하는 포유동물에게 본원에 개시된 티로신-변형된 rAAV 벡터 중 1개 이상을, 포유동물에서 이러한 질환, 손상, 장애 또는 기능장애의 증상을 치료 또는 혼전시키기에 충분한 양으로 그러한 시간 동안 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
이러한 치료 요법은 특히 하나 이상의 조성물을 치유 대상 포유동물의 기관 또는 조직으로 근육내로, 정맥내로, 피하로, 경막내로, 복강내로, 또는 직접 주사에 의해 투여하는 것을 통하는 인간 요법에서 고려된다.
본 발명은 또한 그를 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명의 rAAV 조성물을, rAAV 벡터 내에 포함된 1개 이상의 핵산 절편에 의해 코딩되는 원하는 치료제(들)의 치료 유효량을 환자에게 제공하기에 효과적인 양으로 그러한 시간 동안 제공하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 치료제는 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 진단 마커, 진단 분자, 리포터 분자, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
AAV 벡터 조성물
본 발명의 방법의 한 중요한 측면은 본원에 기재된 개선된 rAAV 벡터가 보다 높은 수준의 종래의, 비-표면 캡시드 변형된 rAAV 벡터를 사용하여 수득된 것과 동일한 형질도입 효율을 달성하기 위해 보다 작은 역가의 바이러스 입자의 전달을 허용한다는 사실이다. 이러한 목적을 달성하기 위한 AAV 조성물의 양 및 이러한 조성물의 투여 시간은 본 교시내용의 이점을 파악한 통상의 기술자의 지식 범위 내에 있을 것이다. 실제로, 본 발명자들은 치료 유효량의 개시된 조성물의 투여가 이러한 치료를 받고 있는 환자에게 치료 이익을 제공하기에 충분한 수의 감염성 입자의 단일 투여, 예컨대 단일 주사에 의해 달성될 수 있다고 생각하였다. 대안적으로, 일부 상황에서는, 이러한 조성물의 투여를 감독하는 의사에 의해 결정될 수 있는, 비교적 짧은 또는 비교적 긴 기간에 걸친 AAV 벡터 조성물의 다중, 또는 연속 투여를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 포유동물에게 투여되는 감염성 입자의 수는 대략 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013개, 또는 훨씬 더 많은 감염성 입자/mL이며, 치료할 특정한 질환 또는 장애의 치료를 달성하기 위해 요구될 수 있는 바와 같이 단일 용량으로 (또는 2회 이상의 투여 등으로 분할되어) 제공된다. 실제로, 특정 실시양태에서, 특정한 요법 또는 치료의 원하는 효과를 달성하기 위해 2가지 이상의 상이한 rAAV 벡터-기재 조성물을 단독으로 또는 1종 이상의 다른 진단제, 약물, 생물활성제 등과 조합하여 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 대부분의 rAAV-벡터, 유전자 치료-기반 요법에서, 본 발명자들은 본원에 기재된 변형된-캡시드 rAAV 벡터를 사용하는 경우, 동등한 야생형, 또는 상응하는 "비-변형된" rAAV 벡터의 사용과 비교하여 보다 낮은 역가의 감염성 입자가 요구될 것이라고 생각하였다.
본원에 사용된 용어 "조작된" 및 "재조합" 세포는 외인성 폴리뉴클레오티드 절편 (예컨대, 생물학적으로 활성인 분자의 전사로 이어지는 DNA 절편)이 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 조작된 세포는 재조합 방식으로 도입된 외인성 DNA 절편을 함유하지 않는 자연 발생 세포와 구별된다. 따라서, 조작된 세포는, 수동적으로 도입된 적어도 1개 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 절편을 포함하는 세포이다.
본 발명에 따른 치료제를 발현하기 위해, 1종 이상의 프로모터의 제어 하에 치료제-코딩 핵산 절편을 포함하는 티로신-변형된 rAAV 발현 벡터를 제조할 수 있다. 서열을 프로모터의 "제어 하에" 두기 위해, 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을, 일반적으로 선택된 프로모터의 "하류" (즉, 그의 3')의 약 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 내에 위치시킨다. "상류" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고, 코딩된 폴리펩티드의 발현을 촉진한다. 이는 본 문맥에서 "재조합 발현"의 의미이다. 특히 바람직한 재조합 벡터 구축물은 rAAV 벡터를 포함하는 것이다. 이러한 벡터는 본원에서 상세하게 설명된다.
이러한 벡터의 사용이, 하나 이상의 외인성 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의, 벡터로 형질감염된 특정한 세포로의 도입을 위해 고려되는 경우, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 선택된 숙주 세포로 전달하기 위해 본원에 개시된 캡시드 변형된 rAAV를 사용할 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 유전자 구축물은 다양한 조성물로 제조될 수 있고, 또한 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 적절한 제약 비히클 내에 제제화될 수 있다. 본 발명의 rAAV 분자 및 이를 포함하는 조성물은 다양한 장애, 특히 예를 들어 골관절염, 류마티스 관절염, 및 관련 장애를 포함하는 관절 질환, 장애, 및 기능장애의 증상의 치료, 제어, 및 호전을 위한 새로운 유용한 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 개시된 캡시드-변형된 rAAV 벡터, 발현 시스템, 비리온, 바이러스 입자, 포유동물 세포, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 양식의 요법과 조합하여 세포 또는 동물에게 투여하기 위한, 특히 인간에게 유해한 인간 세포, 조직, 및 질환의 치료를 위한, 본원에 개시된 1개 이상의 캡시드-변형된 rAAV 벡터의 제약 제제를 제공한다. 제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제제는, 예를 들어 경구, 비경구, 정맥내, 비내, 관절내, 근육내 투여 및 제제를 비롯한 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 같이 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
예시적인 정의
본 발명에 따르면, 폴리뉴클레오티드, 핵산 절편, 핵산 서열 등은 천연 공급원으로부터 얻거나, 화학적으로 합성되거나, 변형되거나, 또는 다르게는 수동적으로 온전하게 또는 부분적으로 제조되거나 합성된 DNA (게놈 또는 게놈외 DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 유전자, 펩티드 핵산 (PNA), RNA (rRNA, mRNA 및 tRNA를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 뉴클레오시드, 및 적합한 핵산 절편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 조성물이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 다음과 같이 정의된다:
오랜 특허법 협약에 따르면, 청구항을 포함하여 본 출원에 사용되는 경우에 "단수 형태"의 단어는 "하나 이상"을 나타낸다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략"은 상호교환가능하고, 일반적으로 주어진 숫자에 가까운 숫자 범위, 뿐만 아니라 기재된 숫자 범위 내의 모든 숫자를 지칭하는 것으로 이해하여야 한다 (예를 들어, "약 5 내지 15"는 달리 언급하지 않는 한 "약 5 내지 약 15"를 의미한다). 또한, 본원에서 모든 수치 범위는 범위 내의 각각의 모든 정수를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"는 관련 동물로의 투여를 위해 제약상 허용되는 임의의 용매(들), 분산 매질, 코팅(들), 희석제(들), 완충제(들), 등장화제(들), 용액(들), 현탁액(들), 콜로이드(들), 불활성화제(들) 또는 그와 같은 것들, 또는 그의 조합을 포함하는 것을 의도한다. 일반적으로 화학적 화합물을 위한 하나 이상의 전달 비히클, 특히 화학요법제가 제약 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이외에도 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성인 한, 진단, 예방 및 치료 조성물에 있어서 그의 사용이 고려된다. 하나 이상의 보조 활성 성분(들)이 또한 개시된 화학요법제 조성물 중 하나 이상에 포함되거나, 그와 함께 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DNA 절편"은 특정한 종의 전체 게놈 DNA로부터 단리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 중 하나를 사용하여 생물학적 샘플로부터 얻어진 DNA 절편은 이들을 얻는 특정한 종의 전체 게놈 DNA로부터 단리되거나, 또는 이로부터 정제된 하나 이상의 DNA 절편을 지칭한다. 용어 "DNA 절편"에는 DNA 절편 및 이러한 절편의 보다 작은 단편 뿐만 아니라, 재조합 벡터, 예컨대, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 질환 또는 상태를 치료 또는 개선할 수 있는, 또는 다르게는 의도된 치료 효과를 제공할 수 있는 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "예를 들어" 또는 "e.g."는, 제한하려는 의도 없이, 단지 예로서 사용되며, 상세한 설명에서 명백히 열거된 이러한 항목들만을 참조하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 바와 같은 "이종"은 소정의 참조 유전자 서열과 관련하여 정의된다. 예를 들어, 구조적 유전자 서열에 대하여, 이종 프로모터는 참조 구조적 유전자와 자연적으로 가깝게 발생하지 않으나, 실험실 처리에 의해서는 위치가 조정되는 프로모터로서 정의된다. 마찬가지로, 이종 유전자 또는 핵산 절편은 참조 프로모터 및/또는 인핸서 요소와 자연적으로 가깝게 발생하지 않는 유전자 또는 절편으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상보성의 정도를 지칭한다. 단어 "동일성"은 제1 핵산 또는 아미노산 서열이 제2 핵산 또는 아미노산 서열과 완전히 동일한 1차 서열을 가지는 경우에 단어 "상동성"에 대해 대체될 수 있다. 서열 상동성 및 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 둘 이상의 서열을 분석함으로써 측정될 수 있다. 이러한 방법은 소정의 서열이 또 다른 선택된 서열에 대해 동일한지 또는 상동성인지 평가하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성인"은, 폴리뉴클레오티드를 지칭할 때, 상이한 기원으로부터 발생하였을지라도 동일한 필수 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열을 의미한다. 전형적으로, 상동성인 핵산 서열은 하나 이상의 실질적으로 유사한 게놈 서열을 프로세싱하는 밀접하게 연관된 유전자 또는 유기체로부터 유도된다. 대조적으로, "유사한" 폴리뉴클레오티드는 상이한 종 또는 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드와 동일한 기능을 공유하지만, 유사한 기능을 수행하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 현저하게 상이한 1차 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 유사한 폴리뉴클레오티드는 종종 (예를 들어, 유전적으로 또는 계통발생적으로) 밀접하게 연관되지 않은 2 이상의 유기체로부터 유도될 수 있다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 하기 기재된 서열 비교 알고리즘 (또는 통상의 기술자가 사용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정하여 최대 유사성에 대해 비교 및 조정하였을 때 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "치료를 필요로 하는"은 치료로부터 환자가 요구하는 (또는 하나 이상의 방식에서 유익한), 치료자, 예컨대 의사 또는 수의사에 의한 판단을 지칭한다. 이러한 판단은 환자가 아프다는 지식, 예컨대 본원에 제시된 것들과 같은 하나 이상의 화합물 또는 제약 조성물에 의해 치료가능한 질환 상태라는 지식을 포함하여, 치료자의 전문지식 내에서의 다양한 인자를 기반으로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유) 중 하나 이상의 유형, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 개질된 퓨린 또는 피리미딘 염기 (무염기성 부위 포함)의 N-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 또한 전형적으로 서브유닛 사이의 포스포디에스테르 연결에 의해 공유결합으로, 일부 경우에는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등에 의해 결합된 리보뉴클레오시드 또는 데옥시리보뉴클레오시드의 중합체를 포함한다. "핵산"은 단일- 및 이중-가닥 DNA, 뿐만 아니라 단일- 및 이중-가닥 RNA를 포함한다. 예시적인 핵산은 제한 없이, gDNA; hnRNA; mRNA; rRNA, tRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵소체 RNA (snORNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 및 소형 템포랄(temporal) RNA (stRNA) 등, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자연 발생"은 대상에 적용되는 경우에 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간의 손에 의해 의도적으로 변형될 수 없는 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연-발생이다. 본원에 사용된 바와 같은, 전통적인 유전학에 따라 선택적으로 배양할 수 있는 설치류의 실험실 균주는는 자연 발생 동물로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열이 리딩 프레임에서 전형적으로 인접하게, 또는 실질적으로 인접하게 연결되고, 2개의 단백질 코딩 영역의 연결이 필요한 경우에, 인접하게 연결되는 것을 지칭한다. 그러나, 프로모터로부터 수 킬로베이스 만큼 분리된 경우에 인핸서가 일반적으로 기능하고 인트론 서열이 다양한 길이일 수 있기 때문에, 몇몇 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결될 수 있지만 인접하지는 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자" (또한 상호교환적으로 "숙주" 또는 "대상체"로서 지칭됨)는 본원에 개시된 제약 조성물 중 하나 이상을 받는 임의의 숙주를 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 척추동물 동물이며, 임의의 동물 종 (및 바람직하게는, 포유동물 종, 예컨대 인간)을 나타내는 것을 의도한다. 특정 실시양태에서, "환자"는 임의의 동물 숙주, 예컨대 제한 없이 임의의 포유동물 숙주를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 용어는 임의의 포유동물 숙주를 지칭하며, 제한 없이, 인간 및 비-인간 영장류, 소, 개, 염소, 카빈, 까마귀, 에파인, 말, 고양이, 염소, 라핀, 레핀, 루핀, 뮤린, 양, 돼지, 라닌, 라신, 여우 등, 예컨대 가축, 동물학적 표본, 외래종, 뿐만 아니라 반려 동물, 애완동물, 및 수의사 관리 하의 임의의 동물을 포함한다. 환자는 그를 존재하는 백신으로 접종하여 면역 반응을 발생시킴으로써 반응 할 수 있는 임의의 연령의 환자일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 포유동물 환자는 바람직하게는 인간이다.
어구 "제약상-허용되는"은 바람직하게는 포유동물에게 투여하였을 때, 특히 인간에게 투여하였을 때 알레르기성 또는 유사한 부적절한 반응을 나타내지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 염"은 바람직하게는 모 화합물의 목적 생물학적 활성을 유지하고 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 제한 없이, 무기 산 (예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 질산, 등)으로 형성된 산 부가염; 및 유기 산 예컨대, 제한 없이, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산 (엠본산), 알긴산, 나프토산, 폴리글루탐산 산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 산으로 형성된 염; 다가 금속 양이온 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 등으로 형성된 염; N,N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염; 및 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되는 염기, 무기 또는 유기 산으로부터 유도된 본 개시내용의 화합물을 지칭한다. 적합한 산의 예는 제한 없이, 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산, 트리플루오로아세트산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 적절한 염기로부터 유도된 염은 제한 없이, 알칼리, 예컨대 소듐 및 암모니아를 포함한다.
본원에 사용될 때, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다," "예방하는," "예방," "억제하다," "억제하는" 및 "억제"는 질환 상태의 임상 증상의 개시 이전에 화합물을 단독으로 또는 제약 조성물에 함유시켜 투여하여 질환 상태의 임의의 증상, 측면 또는 특성을 예방하는 것을 지칭한다. 이러한 예방 및 억제는 절대적으로 의학적으로 유용한 것으로 간주될 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 전사를 조절하는 핵산 서열의 영역 또는 영역들을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수 "폴리펩티드"를 포함하는 것을 의도하며, 2 이상의 아미노산 중의 임의의 쇄 또는 쇄들을 포함한다. 따라서, 제한 없이 본원에 사용된 바와 같은 "펩티드," "디펩티드," "트리펩티드," "단백질," "효소," "아미노산 쇄" 및 "인접 아미노산 서열"을 비롯한 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 모두 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 사용될 수 있고, 이들 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어는 또한 하나 이상의 번역후 변형(들), 예컨대, 예를 들어, 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질분해적 절단, 후-번역 프로세싱, 또는 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산의 포함에 의한 변형을 겪은 폴리펩티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 구조에 대해 관련 기술분야에 통상적인 명명법이 존재한다. 예를 들어, 1-글자 및 3-글자 약어가 아미노산을 기재하기 위해 널리 사용된다: 알라닌 (A; Ala), 아르기닌 (R; Arg), 아스파라긴 (N; Asn), 아스파르트산 (D; Asp), 시스테인 (C; Cys), 글루타민 (Q; Gln), 글루탐산 (E; Glu), 글리신 (G; Gly), 히스티딘 (H; His), 이소류신 (I; Ile), 류신 (L; Leu), 메티오닌 (M; Met), 페닐알라닌 (F; Phe), 프롤린 (P; Pro), 세린 (S; Ser), 트레오닌 (T; Thr), 트립토판 (W; Trp), 티로신 (Y; Tyr), 발린 (V; Val), 및 리신 (K; Lys). 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "l" 이성질체 형태인 것이 바람직하다. 그러나, "d" 이성질체 형태에서의 잔기는 폴리펩티드가 보유하고 있는 목적 특성을 제공하는 임의의 l-아미노산 잔기를 위해 치환될 수 있다.
"단백질"은 본원에서 "펩티드" 및 "폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용되며, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 시험관내에서 생성된 펩티드 및 폴리펩티드 및 핵산 서열이 숙주 동물 또는 인간 대상체로 투여된 후에 생체내에서 발현되는 펩티드 및 폴리펩티드 둘 다를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 바람직하게는 임의의 아미노산 쇄 길이, 예컨대 약 2 내지 약 20 아미노산 잔기 길이의 짧은 펩티드, 약 10 내지 약 100 아미노산 잔기 길이의 올리고펩티드, 및 약 100 아미노산 잔기를 포함하는 보다 긴 폴리펩티드의 길이 또는 그 초과의 길이를 지칭하는 것을 의도한다. 게다가, 용어는 또한 효소, 즉 적어도 하나의 아미노산 중합체를 포함하는 기능성 생체분자를 포함하는 것을 의도한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 또한 번역후 변형된 폴리펩티드 및 단백질을 포함하며, 백본 아미노산 쇄에 첨가되는 임의의 당 또는 다른 유도체(들) 또는 접합체(들)를 포함한다.
용어 "재조합"은 물질 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)이 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로 (비-자연적으로) 변형되는 것을 지칭한다. 변형은 그의 자연 환경 또는 상태 내에서 또는 그로부터 분리된 물질 상에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 프로모터 서열은 인간의 손에 의해 조작된 핵산 절편의 발현에 의해 생성될 때 "재조합"이다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 예를 들어, 클로닝, DNA 셔플링 또는 다른 절차 동안, 또는 화학적 또는 다른 돌연변이유발에 의해 핵산을 재조합함으로써 생성된 것이고; "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 재조합 핵산의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질이고; "재조합 바이러스," 예를 들어 재조합 AAV 바이러스는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소"는 전사를 조절하는 핵산 서열의 영역 또는 영역들을 지칭한다. 예시적인 조절 요소는 제한 없이, 인핸서, 전사후 요소, 전사 제어 서열 등을 포함한다.
용어 "RNA 절편"은 특정한 종의 전체 세포 RNA로부터 단리된 RNA 분자를 지칭한다. 따라서, RNA 절편은 다른 RNA로부터 단리되거나 정제된 하나 이상의 RNA 절편 (자연적 또는 합성 기원)을 지칭할 수 있다. 용어 "RNA 절편"에는 RNA 절편 및 이러한 절편의 보다 작은 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상응하는," "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적 동일성"은 선택된 핵산 또는 아미노산 서열이 선택된 참조 핵산 또는 아미노산 서열과 비교하여 적어도 약 70 또는 약 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것인 핵산 또는 아미노산 서열의 특성을 나타낸다. 보다 전형적으로, 선택된 서열 및 참조 서열은 적어도 약 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 심지어 85 퍼센트 서열 동일성, 보다 바람직하게는, 적어도 약 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95 퍼센트 서열 동일성을 가질 것이다. 보다 바람직하게는 훨씬 더 높은 상동 서열은 종종 선택된 서열 및 비교되는 참조 서열 사이에 적어도 약 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 서열 동일성을 공유한다.
서열 동일성의 백분율은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있거나, 또는 선택된 참조 서열의 총 약 25 퍼센트 미만의 작은 결실 또는 부가를 제외함으로써 계산될 수 있다. 참조 서열은 보다 큰 서열의 하위세트, 예컨대 유전자 또는 플랭킹 서열의 부분, 또는 염색체의 반복적인 부분일 수 있다. 그러나, 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 서열 상동성의 경우에, 참조 서열은 적어도 약 18-25 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 적어도 약 26 내지 35 뉴클레오티드, 보다 더 전형적으로 적어도 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100 가량의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
고도로 상동성인 단편이 요구되는 경우, 2개 서열 사이의 퍼센트 동일성의 정도는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 및 보다 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상일 것이며, 이는 예컨대 문헌 [Pearson 및 Lipman (1988)]에 의해 기재된 FASTA 프로그램 분석과 같이 당업자에게 널리 공지된 1개 이상의 서열 비교 알고리즘에 의해 쉽게 결정된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 영장류를 포함하는 유기체를 기술하며, 본 발명에 따른 조성물을 사용한 치료가 이들에게 제공될 수 있다. 개시된 치료 방법으로부터 이익을 받을 수 있는 포유동물 종은 유인원; 침팬지; 오랑우탄; 인간; 원숭이; 길들여진 동물, 예컨대 개 및 고양이; 가축, 예컨대 말, 소, 돼지, 양, 염소, 및 닭; 및 다른 동물, 예컨대 마우스, 래트, 기니 피그, 및 햄스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구조적 유전자"는 일반적으로 코딩된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 리보자임, 촉매적 RNA 분자, 또는 안티센스 분자를 제조하기 위해 발현되는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자를 기술하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 포유동물 예컨대 영장류를 포함하는 유기체를 기술하며, 본 발명에 따른 조성물을 사용한 치료가 이들에게 제공될 수 있다. 개시된 치료 방법으로부터 이익을 받을 수 있는 포유동물 종은 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 유인원; 침팬지; 원숭이, 및 오랑우탄, 길들여진 동물, 예컨대 개 및 고양이, 및 또한 가축, 예컨대 말, 소, 돼지, 양, 및 염소, 또는 다른 포유동물 종 예컨대 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 햄스터, 등을 제한 없이 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"전사 조절성 요소"는 전사를 단독으로 또는 1종 이상의 다른 핵산 서열과 조합하여 활성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 전사 조절성 요소는 예를 들어, 1개 이상의 프로모터, 1개 이상의 반응 요소, 1개 이상의 음성 조절성 요소, 및/또는 1개 이상의 인핸서를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "전사 인자 인식 부위" 및 "전사 인자 결합 부위"는 흔히 직접 단백질-DNA 결합의 형태를 취하는, 1개 이상의 전사 인자의 서열-특이적 상호작용을 위한 부위인 것으로 식별되는 폴리뉴클레오티드 서열(들) 또는 서열 모티프(들)을 지칭한다. 전형적으로, 전사 인자 결합 부위는 DNA 풋프린팅(footprinting), 겔 이동성 시프트 검정, 등에 의해 식별될 수 있고/거나 공지된 컨센서스 서열 모티프를 기초로, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 예측될 수 있다.
"전사 단위"는 적어도 제1 시스-작용성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고 임의로 구조적 유전자 서열의 효율적인 전사를 위해 필요한 1종 이상의 다른 시스-작용성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 제1 구조 유전자, 및 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 제어하에 작동가능하게 위치된 구조 유전자 서열의 적절한 조직-특이적 및 발생적 전사를 위해 필요할 수 있는 적어도 제1 원위 조절성 요소, 및 또한 효율적인 전사 및 번역을 위해 필요한 임의의 추가의 시스 서열 (예를 들어, 폴리아데닐화 부위(들), mRNA 안정성 조절 서열(들), 등)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환된 세포"는 숙주 세포의 핵산 보체가 숙주 세포로의 1개 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 변경된 숙주 세포를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 일반적으로 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자)을 숙주 세포내로 또는 외인성 폴리뉴클레오티드가 적어도 제1 염색체내로 혼입되거나 형질전환된 숙주 세포 내부에 자율 복제가 가능한 원형질체내로 도입하는 과정을 기술하는 것으로 의도된다. 형질감염, 전기천공, 및 "네이키드" 핵산 흡수는 숙주 세포를 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는데 사용되는 대표적 예시 기술을 모두 대표한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는 것", 및 "치료"는 질환 상태의 임상적 증상의 개시 이후에 질환 상태의 임의의 증상, 측면 또는 특징을 감소하거나 또는 제거하기 위하여 1종 이상의 화합물 (단독으로 또는 1종 이상의 제약 조성물에 함유된 것으로서)을 투여하는 것을 지칭한다. 이러한 치료는 의학적으로 유용한 것으로 절대적으로 간주될 필요는 없다. 따라서, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는 것"은 요법, 또는 질환의 발달이 환자에게 피해를 입히기 전이든 후든 간에, 질환, 그의 하나 이상의 증상의 정도 또는 중증도에서의 호전 또는 감소를 지칭한다
어구 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 물질이 그의 천연 상태에서 발견되는 때에 물질과 정상적으로 동반되는 성분을 실질적으로, 또는 본질적으로 갖지 않는 물질을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 그의 천연, 또는 계내 환경에서의 그러한 폴리뉴클레오티드와 정상적으로 연관된 물질을 함유하지 않는다.
"연결(link)" 또는 "연결(join)"은 재조합 융합, 공유 결합, 디술피드 결합, 이온성 결합, 수소 결합, 정전기적 결합, 등을 제한없이 포함하는, 1개 이상의 단백질, 펩티드, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드를 기능적으로 연결하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 유전학 물질 (즉, 핵산)로 구성된 유전학 구축물을 지칭한다. 전형적으로, 플라스미드 또는 벡터는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이에서 기능하는 복제 기점, 및 플라스미드를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 검출하기 위한 선별가능한 마커를 함유한다. 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 유전학 요소를, 삽입된 코딩 서열이 적합한 발현 세포에 전사 및 번역될 수 있도록 정렬하여 포함할 수 있다. 추가로, 플라스미드 또는 벡터는 1개 이상의 핵산 절편, 유전자, 프로모터, 인핸서, 활성자, 다중 클로닝 영역, 또는 그의 임의의 조합, 예컨대 1개 이상의 천연 및/또는 인공 공급원으로부터 얻어지거나 유래된 절편을 포함할 수 있다.
용어 "서열 X에 본질적으로 제시된 서열"은 서열 X의 일부에 실질적으로 상응하고 서열 X의 뉴클레오티드 (또는 아미노산)와 동일하지 않거나 또는 생물학적으로 기능적 동등하지 않은 뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드 서열의 경우 아미노산)를 비교적 거의 갖지 않는 서열을 의미한다. 용어 "생물학적으로 기능적 동등한"은 관련 기술분야에서 널리 이해되며, 추가로 본원에서 상세하게 정의된다. 따라서, 본원에서 제공되는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 기능적으로 동등한 뉴클레오티드의 약 85% 내지 약 90%; 또는 더욱 바람직하게는, 약 91% 내지 약 95%; 또는 더욱 바람직하게는, 약 96% 내지 약 99%를 갖는 서열이 본 발명의 실시에서 특히 유용한 것으로 고려된다.
본 발명을 위한 적합한 표준 혼성화 조건은 예를 들어, 42℃에서 16　h 동안 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 5x SSC, 25 mM 인산나트륨, 0.1% SDS 및 100 ㎍/㎖의 변성 연어 정자 DNA에서 혼성화 후, 1 hr 뒤 60℃에서 0.1x SSC, 0.1% SDS 용액으로 순차적 세척하여 배경 신호의 목적 양을 제거하는 것을 포함한다. 본 발명을 위한 덜 엄격한 혼성화 조건은 예를 들어, 42℃에서 16　h 동안 35% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 5x SSC, 25 mM 인산나트륨, 0.1% SDS 및 100 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA 또는 이.　콜라이 DNA에서 혼성화 후, 55℃에서 0.8x SSC, 0.1% SDS로 순차적 세척하는 것을 포함한다. 당업자는 원하는 수준의 엄격도를 얻기 위해 조건을 쉽게 조정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
천연적으로, 본 발명은 또한 본원에서 구체적으로 제시된 적어도 1개 이상의 특이적 뉴클레오티드 서열과 상보적, 본질적으로 상보적, 및/또는 실질적으로 상보적인 핵산 절편을 포함한다. "상보적" 핵산 서열은 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍 형성이 가능한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상보적 서열"은 상기 제시된 동일 뉴클레오티드 비교에 의해 평가될 시 실질적으로 상보적인 핵산 서열, 또는 예컨대 바로 위에 기재된 것과 같이 비교적 엄격한 조건하에 본원에서 개시된 1개 이상의 특이적 핵산 절편에 혼성화 가능한 것으로 정의된 핵산 서열을 의미한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 프로브 및 프라이머는 임의의 길이일 수 있다. 서열에 수치적 값을 부여함으로써 (예를 들어, 제1 잔기는 1, 제2 잔기는 2, 등), 주어진 서열에 함유된 모든 프로브 또는 프라이머를 정의하는 알고리즘을 다음과 같이 제안할 수 있다:
n 내지 n + y, 여기서 n은 1에서 서열의 마지막 수인 정수이고, y는 프로브 또는 프라이머의 길이 빼기 1이며, n + y는 서열의 마지막 수를 초과하지 않는다. 따라서, 25-염기쌍 프로브 또는 프라이머 (즉, "25-mer")에 대하여, 프로브 또는 프라이머의 수집(collection)은 서열의 전체 길이에 있어서 염기 1 내지 25, 염기 2 내지 26, 염기 3 내지 27, 염기 4 내지 28, 등에 상응한다. 유사하게, 35-염기쌍 프로브 또는 프라이머 (즉, "35-mer")에 대하여, 예시적인 프라이머 또는 프로브 서열은 서열의 전체 길이에 있어서 염기 1 내지 35, 염기 2 내지 36, 염기 3 내지 37, 염기 4 내지 38, 등에 상응하는 서열을 제한 없이 포함한다. 마찬가지로, 40-mer에 있어서, 이러한 프로브 또는 프라이머는 제1 염기쌍 내지 bp 40, 서열의 제2 bp 내지 bp 41, 제3 bp 내지 bp 42, 등의 뉴클레오티드에 상응할 수 있으며, 50-mer에 있어서는, 이러한 프로브 또는 프라이머는 bp 1 내지 bp 50, bp 2 내지 bp 51, bp 3 내지 bp 52, bp 4 내지 bp 53, 등으로 확장된 뉴클레오티드 서열에 상응할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 1개 이상의 핵산 절편을 적절한 검출가능한 마커 (즉, "표지")와 조합하여 사용하는 것이 (예컨대 혼성화 검정에서 주어진 표적 서열의 존재를 결정하는데 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하는 경우) 유리할 것이다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 표지화하기 위한 매우 다양한 적절한 지시자 화합물 및 조성물 (적합한 검정에서 검출될 수 있는, 형광, 방사성, 효소 또는 다른 리간드, 예컨대 아비딘/비오틴, 등을 제한 없이 포함함)이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 당업자는 또한 방사성 또는 다른 환경적으로 덜-바람직한 시약 대신에, 1개 이상의 형광 표지 또는 효소 태그 예컨대 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제를 사용할 수 있다. 효소 태그의 경우, 인간 눈에, 또는 섬광조영, 형광측정법, 분광광도측정법, 등과 같은 분석 방법에 의해 보여서, 1개 이상의 상보적 또는 실질적으로 상보적 핵산 서열을 함유하는 샘플과의 특정한 혼성화를 식별할 수 있는, 샘플을 검출하는 방법을 제공하기 위해 사용될 수 있는 비색, 발색성, 또는 불소형성 지시약 기질이 공지되어 있다. 2개 이상의 표지된 프로브가 동시에 또는 순차적으로 검출되는 소위 "멀티플렉스" 검정의 경우, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를 제1 검출 특성 또는 파라미터 (예를 들어, 방출 및/또는 여기 스펙트럼 최대)를 갖는 제1 표지로 표지화하고, 이를 또한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 상이한 (즉, 제1 표지와 분별 또는 구분되는) 제2 검출 특성 또는 파라미터를 갖는 제2 표지로 표지화하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 유전학 증폭/검출 프로토콜의 맥락에서의, 멀티플렉스 검정의 사용은 분자 유전학 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 복제될 수 있고/거나 또 다른 핵산 절편이 작동가능하게 연결되어서 부착된 절편의 복제를 유발하는 핵산 분자 (전형적으로 DNA를 포함함)를 지칭한다. 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스가 예시적인 벡터이다.
실시예
본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위하여 하기 실시예가 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위한, 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 대표하는 것이며, 따라서 그의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 인식되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는 본 개시내용의 측면에서, 개시된 구체적 실시양태에서 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위에 벗어남 없이 비슷한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1 -- 차세대 rAAV2 벡터: 티로신에서 점 돌연변이는 저급 용량에서 높은-효율 형질도입을 유도한다.
본 실시예는 AAV2 캡시드상의 표면-노출 티로신 잔기의 돌연변이가 유비퀴틴화 단계를 회피하여, 이로써 프로테아솜-매개 분해를 피하고, 시험관내에서 인간 세포로 및 생체내에서 뮤린 간세포로 이들 벡터에 의한 높은-효율 형질도입을 야기하여, 감소된 벡터 용량에서 치료 수준의 인간 응고 인자의 생산을 유도한다는 것을 입증한다. 티로신-돌연변이체 벡터에 대해 관찰된 증가된 형질도입 효율은 유비퀴틴화의 결여, 및 핵에 대한 개선된 세포내 트래픽킹에 기인한다. AAV2의 생활 주기의 다양한 단계에서 AAV2 캡시드의 티로신 인산화의 역할에 대한 통찰력을 제공하는 것에 더불어, 이들 연구는 결과적으로 저급 용량에서 높은-효율 형질도입을 가능하게하는 신규 AAV2 벡터를 개발하였다.
재료 및 방법
재조합 AAV2 벡터. 아포지단백질 인핸서/인간 α-1 항트립신 (ApoE/hAAT) 프로모터 (ssAAV2-F.IX)의 제어하에 인자 IX (F.IX) 유전자를 함유하는 ssAAV2 벡터 및 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터로부터 유래된 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자 (scAAV2-EGFP)를 함유하는 scAAV2 벡터의 고도로 정제된 스톡을 공지된 방법을 사용하여 생성하였다.
AAV2 캡시드 상에서 표면-티로신의 국재화. AAV2의 결정 구조를 (PDB 수탁 번호 1lp3) 사용하여 AAV2 캡시드 표면 상에 티로신 잔기를 국재화하였다. 20면체 2-, 3- 및 5-배수 관련 VP3 단량체를 규소 그래픽스 옥탄 워크스테이션 상에서 프로그램 O를 사용하여 참조 단량체에 대해 20면체 대칭 조작자를 적용함으로써 생성하였다. 이어서 티로신 잔기의 위치를 프로그램 COOT을 사용하여 바이러스성 비대칭 단위의 문맥에서 영상화 및 분석하였고, 프로그램 PyMOL 분자 그래픽스 시스템 (PyMOL Molecular Graphics System; 데라노 사이언티픽(DeLano Scientific), 미국 캘리포니아주 산 카를로스 소재)을 사용하여 그래프로 도시하였다.
표면-노출 티로신 잔기 돌연변이체 AAV2 캡시드 플라스미드의 구축. 퀵체인지 II® 부위-지정 돌연변이유발 (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에 기초한 2-단계 절차를 플라스미드 pACG-2를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 단계 1에서, 2개 PCR 연장 반응을 각각의 돌연변이체에 대해 별개의 관에서 수행하였다. 1개 튜브는 순방향 PCR 프라이머를 함유하고, 다른 하나는 역방향 프라이머를 함유한다. 단계 2에서, 2개 반응물을 혼합하고, 표준 PCR 돌연변이유발 검정을 제조업체의 지침서에 따라 수행하였다. PCR 프라이머는 티로신에서 페닐알라닌 잔기까지 변화 뿐만 아니라 스크리닝 목적으로 신규한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 생성하는 침묵 변화를 도입하도록 고안되었다. 모든 돌연변이체는 적절한 제한 효소로 스크리닝하고 사용전 서열분석하였다.
전세포 용해물 (WCL) 및 공동-면역침전의 제조. 모의-처리되거나 또는 MG132로 처리된 대략 2 × 106 HeLa 세포를 또한 모의-감염 또는 WT scAAV2-EGFP 또는 Y730F 돌연변이체 벡터로 2시간 동안 5 × 103 입자/세포로 37℃에서 감염에 적용하였다. 면역침전을 위해, 세포를 0.01% 트립신으로 처리하고 PBS로 광범위하게 세척하였다. WCL을 0.25 mg의 정상 마우스 IgG로 20 μl의 단백질 G-아가로스 비드와 함께 인큐베이션시킴으로써 비-특이적 결합을 제거하였다. 예비제거 후에, 무손상 AAV2 입자에 대한 2 μg의 캡시드 항체 (마우스 모노클로날 IgG3, 클론 A20; 리써치 다이아그노스틱스, 인크.(Research Diagnostics, Inc.) (플랜더스, 뉴저지주, 미국) 또는 2 μg의 정상 마우스 IgG를 (음성 대조군으로서) 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 다음, 단백질 G-아가로스 비드로 침전시켰다. 면역침전을 위해, 재현탁된 펠릿 용액을 SDS-페이지를 위해 사용하였다. 막을 유비퀴틴 (Ub)에 특이적인 모노클로날 HRP-접합된 항-Ub 항체 (1:2,000 희석) (마우스 모노클로날 이뮤노글로불린 G1 γIgG1], 클론 P4D1; 산타 크루즈, 캘리포니아주, 미국)으로 처리하였다. 면역-반응성 밴드를 화학발광 (ECL-플러스, 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 뉴저지주 피스카타웨이, 미국)을 사용하여 시각화하였다.
HeLa 세포로부터 핵 및 세포질 분획의 단리. HeLa 세포로부터 핵 및 세포질 분획을 단리시키고 모의-감염된 또는 재조합 wt scAAV2-EGFP 또는 Y700F 벡터-감염된 세포를 사용하여 세포질 및 핵 분획을 단리시켰다. 각각의 분획의 순도는 >95%인 것으로 결정되었다.
AAV2 트래픽킹을 위한 서던 블롯 분석. 핵 및 세포질 분획으로부터의 낮은-Mr DNA 샘플을 단리시키고 1% 아가로스 겔 또는 1% 알칼리-아가로스 겔 상에서 전기영동한 다음, 32P-표지된 EGFP-특이적 DNA 탐침을 사용하여 서던 블롯 혼성화시켰다.
시험관내 재조합 AAV2 벡터 형질도입 검정. 대략 1 x 105 HeLa 세포를 재조합 AAV2 벡터로 형질도입하기 위해 사용하였다. 형질도입 효율을 형질도입 후 48시간 째에 형광 현미경검사를 사용하여 EGFP 영상화에 의해 측정하였다. 3 내지 5 시야로부터의 영상을 이미지제이(Image J) 분석 소프트웨어 (NIH, 베데스다, 메릴랜드주, 미국)에 의해 정량적으로 분석하였다. 트랜스진 발현을 시야 필드 (평균 ± SD) 당 녹색 형광의 전체 면적 (pixel2)으로서 평가하였다. 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 시험 결과와 대조군을 비교하였고, 이들은 통계학적으로 유의한 것으로 결정되었다.
생체내 재조합 AAV2 벡터 형질도입 연구. scAAV2-EGFP 벡터를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 C57BL/6 마우스에 동물 당 1 x 1010 바이러스 입자로 주입하였다. 모의-주입되고 주입된 마우스의 주입 후 2주 째의 3개의 간엽으로부터의 간 절편을 슬라이드 상에 탑재하였다. 형질도입 효율을 기재한 바와 같이 EGFP 영상화에 의해 측정하였다. ssAAV2-FI.X 벡터를 정맥내로 (꼬리 정맥을 통해) 주입하거나 또는 C57BL/6, BALB/c, 및 C3H/HeJ 마우스의 문맥 내로 동물 당 1 x 1010 또는 1 x 1011 바이러스 입자로 주입하였다. 혈장 샘플을 안와후 방혈에 의해 수득하고, ELISA에 의해 hF.IX 발현을 분석하였다.
결과
표면-노출된 티로신 잔기에서의 돌연변이는 AAV2 벡터의 형질도입 효율을 유의하게 개선시킨다. AAV2 캡시드의 티로신-인산화가 증가된 유비퀴틴화를 유도하고 손상된 세포내 트래픽킹을 유발하고, 그에 따라 바이러스 형질도입이 불리하다는 것을 입증하기 위해, 표면-노출된 티로신 잔기를 AAV2 캡시드 상에서 변형시켰다. AAV2 구조의 캡시드 표면의 검사는 7개의 표면-노출된 티로신 잔기 (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, 및 Y730)를 나타냈다. 부위-지정 돌연변이유발을 7개 티로신 잔기 각각에 대해 수행하였고, 이를 페닐알라닌 잔기로 보존적으로 치환시켰다 (티로신-페닐알라닌, Y-F) (표 1). 각각의 티로신-돌연변이체 캡시드에서 캡시드화된 scAAV2-EGFP 게놈을 연속적으로 포장하였고, 표면-노출된 티로신 잔기의 돌연변이는 감소된 벡터 안정성을 유도하지 않았다.
<표 1>
야생형 (WT) 및 티로신-변형된 Y->F 돌연변이체 AAV2 벡터의 역가
Figure 112021035148424-pat00001
ND = 수행하지 않음.
각각의 티로신-돌연변이체 벡터의 형질도입 효율을 분석하고 시험관내 HeLa 세포에서의 WT scAAV2-EGFP 벡터와 동일한 조건 하에서 비교하였다. 결과로부터, 모의-감염된 세포는 녹색 형광을 나타내지 않는 반면, 각각의 티로신-돌연변이체 벡터의 형질도입 효율은 2,000 바이러스 입자/세포에서 WT scAAV2-EGFP 벡터에 비해 유의하게 높다는 것이 증명되었다. 구체적으로, Y444F, Y500F, Y730F 벡터의 형질도입 효율은 WT 벡터보다 ~8 내지 11배 높았다.
표면-노출된 티로신 잔기에서의 돌연변이는 생체내 뮤린 간세포에서의 AAV2 벡터의 형질도입 효율을 극적으로 개선시킨다. WT 및 티로신-돌연변이체 scAAV2-EGFP 벡터의 효능을 또한 마우스 모델에서 생체내 평가하였다. 티로신-돌연변이체 벡터의 형질도입 효율은 유의하게 높고, 4-29배 범위이고, WT 벡터와 비교되었다. 다른 조직, 예컨대 심장, 폐, 신장, 비장, 췌장, GI관 (공장, 결장), 고환, 골격근, 및 뇌를 1 × 1010 입자의 티로신-돌연변이체 벡터로 주입된 마우스로부터 수확하고, 분석하였을 때, EGFP 유전자 발현의 어떤 증거도 나타나지 않았다. 따라서, 표면-노출된 티로신 잔기에서의 돌연변이는 이들 벡터의 꼬리 정맥 주입의 생체내 주입 후에 간-향성을 변경시키는 것으로 나타나지 않았다.
티로신-돌연변이체 벡터의 증가된 형질도입 효율은 유비퀴틴화, 및 핵에 대한 증가된 세포내 트래픽킹의 결여에 기인한다. 티로신 잔기에서의 캡시드 단백질의 EGFR-PTK-매개 인산화가 AAV2 캡시드의 유비퀴틴화를 위한 선행 요건이라는 가설 및 유비퀴틴화된 비리온은 핵으로 가는 도중에 세포질 프로테아솜에 의해 인식되고 분해된다는 가설을 추가로 확인하기 위해, 일련의 실험을 다음과 같이 수행하였다.
제1 연구에서, 아데노바이러스-유도성 AAV2 rep 및 cap 유전자를 보유하는 HeLa C12 세포를 모의감염시키거나 또는 WT, Y444F 또는 Y730F scAAV2-EGFP 벡터로 감염시켰다. 모의-감염된 세포는 녹색 형광을 나타내지 않았고, ~15%의 세포를 아데노바이러스로의 공동-감염의 부재 하에 WT scAAV2-EGFP 벡터로 형질감염시킨 반면, Y444F 및 Y730F scAAV2-EGFP 벡터의 형질도입 효율을 WT 벡터에 비해 각각 ~9 및 ~18배 증가시켰다. 흥미롭게도, 아데노바이러스로의 공동-감염은 ~11배 증가를 유도한 반면, Y444F 및 Y730F scAAV2-EGFP 벡터의 형질도입 효율은 아데노바이러스의 공동-감염에 의해 추가로 증진되지 않았다. 아데노바이러스가 HeLa 세포에서의 AAV2 벡터 핵의 수송을 개선할 수 있기 때문에, 이들 데이터는 표면-노출된 티로신 잔기가 AAV2의 세포내 트래픽킹에서 역할하고, 그의 제거는 AAV2 벡터의 효율적인 핵 수송을 유도한다는 것을 시사하였다.
제2 연구에서, 모의-처리되거나 또는 AAV 벡터의 형질도입 효율을 증가시키는 것으로 알려진 EGFR-PTK의 특이적 억제제인 Tyr23, 또는 프로테아솜 억제제인 MG132 둘 다로 처리한 HeLa 세포를 모의-감염시키거나 또는 WT 또는 Y730F scAAV2-EGFP 벡터로 감염시켰다. 모의-감염된 세포는 녹색 형광을 나타내지 않았고, ~5%의 세포를 WT scAAV2-EGFP 벡터로 모의-처리된 세포에 형질도입시킨 반면, Tyr23 또는 MG132로의 전처리는 각각 형질도입 효율에서 ~9배 및 ~6배의 증가를 유도하였다. Y730F scAAV2-EGFP 벡터의 형질도입 효율이 WT 벡터에 비해 ~14배 증가하였지만, Tyr23 또는 MG132의 전처리에 의해 추가로 증진되지는 않았다. 이들 데이터는 표면-노출된 티로신 잔기의 부재 (돌연변이체 벡터의 인산화를 방지함)는 캡시드 단백질의 유비퀴틴화를 쉽게 방지하며, 이들 벡터는 핵으로 가는 도중에 인식되고 프로테아솜에 의해 분해될 수 없음 (그의 효율적인 핵 전위를 유도함)을 강하게 시사한다.
제3 연구에서, 모의-처리되거나 또는 MG132으로 처리된 HeLa 세포를 모의-감염시키거나 또는 WT, Y730F, 또는 Y444F scAAV2-EGFP 벡터로 감염시켰다. WCL을 감염 후 4시간째에 제조하고, 등량의 단백질을 항-AAV2 캡시드 항체 (A20)로 먼저 면역침전시킨 다음, 항-Ub 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯 분석하였다. 유비퀴틴화된 AAV2 캡시드 단백질 (Ub-AAV2 Cap)은 모의-감염된 세포에서 검출가능하지 않은 반면, 유비퀴틴화된 AAV2 캡시드 단백질의 신호는 처리되지 않은 세포에서 약하였고 유비퀴틴화된 AAV2 캡시드 단백질의 상당한 축적이 MG132로의 처리 후에 발생하였다. 흥미롭게도, Y730F 또는 Y444F 벡터로의 감염은 MG132-유도된 유비퀴틴화된 AAV2 캡시드 단백질의 축적의 정도까지 극적으로 감소하였다. 이들 결과는 티로신 잔기에서의 돌연변이는 벡터의 프로테아솜-매개 분해를 회피시킨다는 것을 입증하였다.
제4 연구에서, 투입 WT, Y444F, 및 Y730F 벡터 바이러스 DNA의 운명을 HeLa 세포에서 결정하였다. 세포질 [C] 및 핵 [N] 분획으로부터 단리된 낮은-Mr DNA 샘플의 서던 블롯 분석 및 자가방사법의 밀도 측정 스캐닝은 ~36%의 투입 scAAV2 DNA가 WT 벡터로 세포 감염된 핵 분획에 존재한다는 것을 나타냈다. 그러나 흥미롭게도, 핵 분획에서의 투입 Y730F 및 Y444F scAAV2 벡터 DNA의 양은 각각 ~72% 및 ~70% 증가하였다. 이들 결과는 표면-노출된 티로신 잔기에서의 돌연변이는 AAV2 캡시드의 유비퀴틴화를 방지하여 프로테아솜-매개 분해의 감소를 유발하고, 결과적으로 AAV2 벡터의 핵 수송을 촉진한다는 것을 추가로 입증하였다.
티로신-돌연변이체 벡터는 마우스에서 ~10배 감소된 벡터 용량으로 인간 인자 IX 단백질의 치료 수준을 발현한다. 티로신-돌연변이체 AAV2 벡터가 생체내에서 감소된 벡터 용량으로 효율적으로 치료 유전자를 전달할 수 있는지 검사하는 것이 중요하였다. 이를 위해, 단일-가닥, 간세포-특정한 인간 인자 IX (h.FIX) 발현 카세트를 Y730F 벡터에 캡시드화하고, 이 벡터의 효능을 마우스의 3개의 상이한 균주 (BALB/c, C3H/HeJ, 및 C57BL/6)에서 시험하였다. 3개의 모든 균주에서 일관적으로, Y730F 벡터가 꼬리 정맥 또는 문맥 투여 (후자가 더 효율적인 경로임) 후에 WT 벡터에 비해 ~10배 높은 순환 hF.IX 수준을 달성하였다. 이들 결과는 Y730F 벡터가 C57BL/6 마우스에서 문맥 투여에 의해 ~10배 감소된 벡터 용량 (1010 입자/마우스)으로 인간 F.IX 단백질 (~50 ng/mL)의 치료 수준을 발현시킨다는 것을 명백하게 나타냈다. C57BL/6 마우스에서의 간 바이러스 유전자 전달은 일반적으로 다른 2개의 균주에서보다 효율적이라는 것에 주목해야 할 것이다.
이들 결과는 AAV2 캡시드 단백질의 EGFR-PTK-유도된 티로신 인산화가 AAV2의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진함으로써 바이러스 핵 수송의 장애 및 형질도입 효율의 감소를 유도한다는 해석과 일치한다는 것을 본원에서 입증하고 있다. 7개의 표면-노출된 티로신 잔기 각각의 돌연변이 분석은 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서의 유의하게 증가된 형질도입 효율을 갖는 AAV2 벡터를 수득하였다. 구체적으로, Y444F 및 Y730F 돌연변이체 벡터는 유비퀴틴화 단계를 우회하고, 이는 유의하게 개선된 세포내 트래픽킹 및 핵으로 바이러스 게놈의 전달을 유발한다.
전임상 동물 모델에서 WT 캡시드 단백질로 구성된 AAV2 벡터에 의해 달성된 장기 치료 발현에도 불구하고, 최근 유전자 요법 시도에서는 중증 B형 혈우병을 앓는 2명의 환자가 간세포-유도된 hF.IX 발현의 지속기간이 <8주로 제한된 벡터 용량-의존성 트랜사미니티스(transaminitis)를 발생시켰다. 후속 분석은 인간에서의 AAV 캡시드에 대한 기억 CD8+ T 세포의 존재 및 B형 혈우병 환자에서의 MHC I-제한된, 캡시드-특정한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 입증하였고, 이는 트랜사미니티스의 시간 경과를 반영하였다. 투입 캡시드에 대한 이러한 CD8+ T 세포 반응은 AAV2-형질도입된 간세포를 제거한다는 결론을 나타낸다. 이들 데이터는 낮은 캡시드 항원 용량이 730F 벡터로의 휴율적인 유전자 전달에 충분하며, WT 캡시드에 비해 매우 감소된 AAV-Y730F의 유비퀴틴화, MHC I 제시를 위한 선행 요건을 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서, AAV2 캡시드에 대한 T-세포 반응 (간에서의 치료 유전자의 전달을 위한 일련의 허들)은 표면-노출된 티로신-돌연변이체 AAV2 벡터를 사용함으로써 회피할 수 있다.
티로신-돌연변이체 벡터의 극적으로 증가된 형질도입 효율은 원발성 인간 뉴런 및 시험관내 조혈 줄기 세포 및 생체내 마우스에서의 다양한 조직 및 기관에서 또한 관찰되어 왔다. 이중, 삼중, 및 사중 티로신-돌연변이체는 이러한 다중 돌연변이체가 생존가능한지, 이들 벡터의 형질도입 효율이 추가로 논의될 수 있는지를 검사하기 위해 또한 구축되어 왔다. 주목할 것은 약간의 예외 (AAV4에서의 글리신 및 AAV5에서의 아르기닌과 동등하게 위치한 Y444; AAV4 및 AAV5에서의 페닐알라닌과 동등하게 위치한 Y700; 및 AAV7에서의 페닐알라닌과 동등하게 위치한 Y704)인 이들 티로신 잔기가 AAV 혈청형 1 내지 10에서 매우 보존되어 있다는 것이다.
실시예 2 - RAAV 벡터에 의한 NF-кB 경로의 활성화
인간 전사 인자 데이터베이스를 이용하는 인실리코 분석에 의해 아데노-관련 바이러스 (AAV) 게놈에서 세포성 면역 및 염증성 반응의 중심 조절자인 NF-кB를 위한 몇몇 결합 부위의 존재가 입증되었기 때문에, 본 실시예에서는 AAV가 그의 생활 주기 동안에 NF-кB를 이용하는지 여부를 조사하였다. 재조합 AAV 벡터가 도입된 HeLa 세포에서 NF-кB의 소분자 조절제를 사용하였다. NF-кB 활성자인 VP16은 AAV 벡터-매개된 트랜스유전자 발현을 최대 25배로 증가시켰다. 두 가지 NF-кB 억제제 (Bay11) 중에서 표준 및 비-표준 NF-кB 경로 둘 다를 차단하는 것은 트랜스유전자 발현을 완전히 제거한 반면에, 전형적인 NF-кB 경로를 방해하는 피롤리돈 디티오카르바메이트 (PDTC)는 효과가 없었다. 웨스턴 블럿 분석은, Bay11에 의해 제거되는, VP16의 존재하에 비-표준 NF-кB 경로의 핵 p52 단백질 성분의 풍부함을 확인시켜 주며, 이는 비-표준 NF-кB 경로가 AAV 감염 동안에 촉발됨을 시사한다. 유사한 결과가, DC 성숙 마커인 CD83 및 CD86의 시토카인-유도된 발현이 Bay11에 의해 또한 억제되는 일차 인간 수지상 세포 (DC)에 의해 시험관내에서 얻어졌다. 생체내에서 정상적인 C57BL/6 마우스에서의 유전자 전달 이전에 Bay11의 투여는 염증전 시토카인 및 케모카인, 예컨대 IL-1β, IL-6, TNFα, IL-12β, KC 및 RANTES의 AAV 벡터-유도된 생성에서 최대 7개 감소를 나타내었다. 이들 연구는, AAV 벡터가 도입되기 전에 NF-кB 억제제에 의한 일시적인 면역억제가 약화된 면역 반응을 유도하며, 이는 인간 유전자 요법에서 AAV 벡터의 최적 사용에 대한 유의한 암시이다.
최근의 연구는 AAV 유전자 전달로부터 발생하는 초기 활성화 신호를 규정하기 시작하였다. 한 연구에서는 Toll-유사 수용체 9 (TLR9)-골수성 분화 인자 88 (MyD88) 경로를 통한 AAV-유도된 신호전달에 의해 형질세포양 수지상 세포 (pDC)에서 제I형 인터페론 반응이 유도되었으며, 이로써 뮤린 골격근으로의 유전자 전달시 벡터 및 트랜스유전자 생성물에 대한 후속적인 후천성 면역 반응이 구동되었음을 발견하였다 (문헌 [Zhu et al., 2009]). 이들 데이터는 pDC에서 엔도솜 TLR9 수용체에 의한 DNA 게놈의 감지를 나타낸다. AAV에 의한 DC 또는 대식세포의 시험관내 펄싱(pulsing) 이후, 염증성 시토카인의 유도에 대한 증거가 발견되지 않았다. 또한, 보다 이전의 보고는 몇몇 염증전 시토카인의 발현을 포함하여, 간에서 AAV 벡터에 대한 매우 일시적이긴 하지만 신속한 쿠퍼(Kupffer) 세포-의존적 선천성 반응을 입증하였다 (문헌 [Zaiss and Muruve, 2008]; [Zaiss et al., 2008]; [Zaiss and Muruve, 2005]; [Zaiss et al., 2002]).
흥미롭게도, 많은 스트레스- 및 병원체-유래된 신호에 대한 핵심 세포성 반응자 및 염증전 시토카인 발현의 조절자인 NF-кB의 역할 (문헌 [(Hayden and Ghosh, 2004]; [Hiscott et al., 2006]; [Li and Verma, 2002])이 이전에는 AAV 생활 주기에서 연구된 적이 없었다. 본 실시예에서, AAV에 의한 인간 세포의 감염이 비-표준 NF-кB 경로의 활성화를 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, NF-кB의 활성화는 실질적으로 (DC에서) 트랜스유전자 발현을 증가시킨 반면에, NF-кB의 억제는 발현을 둔화시켰다. NF-кB의 일시적인 억제에 의한 염증성 시토카인 유도의 예방은 생체내 AAV에 대한 선천성 반응에서 NF-кB의 역할을 밝혀내었고, 중요하게는 장기 트랜스유전자 발현을 방해하지 않는다.
결과
AAV-ITR은 NF-кB-반응성 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유한다. AAV2 게놈의 좌측 반전 말단 반복부 (ITR)에서 단일 가닥 D[-]-서열과 특이적으로 상호작용하는 세포성 단백질의 존재는 이전에 기재된 적이 있다 (문헌 [Qing et al., 1997]). 우측 ITR에서의 ssD[+]-서열은 좌측 ITR에서의 ssD[-]-서열에 상보적이기 때문에, 추정 세포성 단백질이 또한 존재할 수 있고 우측 ITR에서의 ssD[+]-서열과 상호작용할 수 있는 것으로 판단되었다. ssD[+]-서열 프로브를 이용하는 전기영동 이동성-시프트 검정에서, ssD[+]-서열 결합 단백질 (ssD[+]-BP)로서 지정된 별개의 세포성 단백질이 검출되었다 (문헌 [Qing et al., 1997]). 정제 및 질량 분광측정 이후, ssD[+]-BP가 전사의 음성 조절자인 세포성 NF-кB 억제 인자에 대해 부분적인 아미노산 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 인간 전사 인자 데이터베이스 [TRANSFAC]를 이용한 추가의 인실리코 분석에 의해 NF-кB 결합 보조인자, 예컨대 p300, TFIIB 및 SplI를 위한 몇몇 결합 부위의 존재가 입증되었다. 이들 중 하나는 AAV 게놈과 연관된 것으로 최근에 밝혀진 p300/CREB 전사 인자이다 (문헌 [Dean et al., 2009]). NF-кB 신호전달이 세포 표면 수용체/공동-수용체로의 AAV 결합에 의해 활성화되는지 여부가 알려지지는 않았지만, 최근의 연구에 의해 선천성 면역 반응이 a) Toll 유사 수용체 9 (TLR9)-골수성 분화 인자 88 (MYD88) 경로를 통해, 또는 b) 생체내 마우스 모델에서 세포 표면 상에서 CD40 리간드의 활성화를 통해 촉발될 수 있음이 입증되었다 (문헌 [Zhu et al., 2009]; [Mays et al., 2009]). 이들 리간드 둘 다 그들의 생물학적 활성화 동안에 하류 NF-кB 전사 인자와 상호작용하는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Mineva et al., 2007]; [Loiarro et al., 2005]). 하기 데이터는 NF-кB가 AAV 생활 주기에 관여함을 입증한다.
AAV 감염은 인간 세포에서 비-표준 NF-кB 경로를 활성화시킨다. EGFP를 발현하는 자체-상보적 혈청형 2 벡터 (scAAV-EGFP)가 도입된 HeLa 세포에서 NF-кB 신호전달의 소분자 활성자 및 억제제를 사용하였다. NF-кB 활성자인 VP16 (문헌 [Wu and Miyamoto, 2008])은 EGFP 발현을 대략 25배 증가시켰다 (도 1a 및 도 1b). 시험된 두 억제제 중에서 IKKк 및 IKKк 둘 다의 활성을 차단하는 Bay11는 EGFP 발현을 완전히 제거한 반면에, 전통적인 경로에서 IKB 유비퀴틴 리가제를 차단함으로써 IKB 분해를 억제하는 PDTC (문헌 [Cuzzocrea et al., 2002])는 EGFP 발현에 대해 주목할 만한 효과가 없었다 (도 1a 및 도 1b). 추가로, VP16-매개된 증가된 트랜스유전자 발현은 Bay11에 의해 완전히 제거되었지만, PDTC에 의해서는 그렇지 않았다 (도 6a). 유사한 결과가 ssAAV 벡터 (도 6b) 및 티로신 삼중-돌연변이체 scAAV 벡터 (Y730+500+444F; TM-AAV) 둘 다에 의해 얻어졌으며, 이는 이전 실시예에서 기재되었다 (문헌 [Markusic et al., 2010]) (도 6c). 따라서, AAV 벡터로부터의 트랜스유전자 발현이 NF-кB의 대안적인 (비-표준) 경로에 의해 조절된다고 결론 내려졌다. 이 결론은 웨스턴 블럿 분석 (도 6d 및 도 6e)에 의해 확인되었는데, 비-표준 NF-кB 경로의 시토졸 p100 및 핵 p52 단백질 성분이 VP16의 존재하에 대략 3배 내지 6배 증가된 것으로 밝혀졌다. 더욱이, AAV 벡터 자체의 도입 (즉, 활성자의 부재)은 p100 및 p52를 증가시켰으며 (도 1c), 이는 세포의 감염이 대안적인 NF-кB 경로를 활성화시킴을 나타낸다. 이러한 증가는 Bay11 처리에 의해 제거된 반면에, 전형적인 NF-кB 경로에 대해 사용되는 마커인 p65는 영향을 받지 않았다 (도 1c).
NF-кB 경로는 일차 인간 항원-제시 세포에서 작동가능하다.
AAV 감염 이후. 한편, 일차 인간 수지상 세포 (DC)에서, 트랜스유전자 발현이 NF-кB 활성자에 의해 실질적으로 다시 증가된 반면에 (도 2a), AAV 자체 감염은 NF-кB를 활성화시키지 않았다 (도 2b). VP16의 존재하에, scAAV 벡터가 도입된 DC에 비해 EGFP 발현에서의 대략 20배 증가가 관찰되었다. NF-кB 경로를 활성화시키는 것으로 공지된 시토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2)으로의 처리는 트랜스유전자 발현을 추가로 대략 26%로 증가시켰고, 이는 Bay11로의 처리 이후 대략 12%로 감소되었다 (도 2a). 핵 분획의 웨스턴 블럿 분석은 NF-кB 활성화의 대안적인 경로 (p52 단백질의 축적)가 작동가능함을 추가로 입증하였다 (도 2b). 유사한 결과가 생체내에서 뮤린 간으로의 scAAV 벡터-매개된 유전자 전달 이후에 얻어졌다 (도 7). 본 발명자들은 또한 NF-кB 조절제가 DC에서 표현형 변화를 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 두 가지 DC 성숙 마커인 CD83 및 CD86의 유동 세포계측 분석은, 시토카인 칵테일과 함께 사용될 때 VP16이 단독으로는 공동-자극성 분자를 성숙시키거나 그의 발현을 증진시킬 수 없음을 나타내었다. 그러나, Bay11로의 처리는 APC의 시토카인-매개된 성숙을 유도하였으며, 이는 NF-кB의 관여를 추가로 암시하였다 (표 2). 성숙 마커 발현의 이러한 감소는 항원성 물질을 가공하고 T-세포 활성화 및 증식을 감소시키는 DC의 주요 기능을 약화시킨다. 따라서, 벡터 투여 이전에 NF-кB 활성화의 저해가 AAV에 대한 약화된 선천성 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 가정되었다.
일차 인간 수지상 세포의 성숙 마커의 FACS 분석
군 CD83을 발현하는 세포에서 발현 수준의 게놈적 수단 CD86을 발현하는 세포에서 발현 수준의 게놈적 수단
미성숙 DC 10.38 7.04
DC - 성숙 보충물 없음 18.08 13.63
성숙 DC + 시토카인 20.60 26.80
DC + AAV 18.29 12.65
DC + VP16 16.48 13.70
성숙 DC + AAV + 시토카인 24.25 23.75
성숙 DC + AAV + 시토카인 + VP16 19.92 21.92
성숙 DC + AAV + 시토카인 + Bay11 16.88 10.11
대표적인 실험으로부터의 데이터를 도시함 (n = 3)
생체내에서 마우스에서 AAV 벡터-매개된 유전자 전달 이전에 NF-κB 활성화의 억제는 염증전 시토카인 생성의 저해를 유도하였다. 생체내 연구에서, C57BL/6 마우스에서 벡터 투여 12시간 전에 20 mg/kg 체중의 Bay11의 단일 용량을 복막내 (i.p.)로 투여하였다. 선천성 면역 매개자에 대한 (도 3a) 또는 NF-кB 유전자의 활성화에 대한 (도 3b) 간 균질물로부터의 전사체 수준을 Bay11- 및 벡터-주사된 군으로부터 측정하여 모의-주사된 마우스와 비교하였다. 이들 데이터는, 벡터 투여 2시간 후에 Bay11+AAV 벡터로 주사된 마우스가 모의- 및 AAV 벡터-주사된 동물에 비해 염증전 시토카인 또는 케모카인, 예컨대 IL-1α, IL-6, TNFα, IL-12α, KC 및 RANTES의 유의하게 감소된 수준을 나타내었고 (도 3a), 추가로 NF-кB 유전자 발현 프로파일의 상향조절을 예방하였음을 (도 3b) 밝혀내었다. 이들 선천성 면역 반응 마커의 유사한 하향조절 경항이 더욱 효능이 있는 티로신 삼중-돌연변이체 AAV 벡터 (Y730+500+444F; TM-AAV)로 주사된 마우스에서 확인되었다. 야생형 (WT-AAV) 및 TM-AAV 벡터 둘 다에 의한 제I형 인터페론 발현의 상향조절은 Bay11에 의해 영향을 받지 않았다 (도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 및 도 8f). Bay11의 투여는 또한 이들 마우스에서 항-AAV2 항체 반응을 유의하게 감소시켰다 (도 9). 이러한 모든 결과들은, 생체내 간 AAV 유전자 전달 동안에 전형적으로 발견되는 일시적인 염증성 시토카인 반응이 NF-кB 활성화에 의해 매개됨을 암시한다. 뮤린 간세포에서 AAV 벡터-매개된 트랜스유전자 발현. 도입 48시간 후에 시험관 내에서 Bay11이 HeLa 세포에서 AAV-매개된 트랜스유전자 발현을 강력하게 억제한다는 관찰에 비추어 볼 때 (도 1a 및 도 1b), 이는 생체내에서 장기 트랜스유전자 발현을 달성하는데는 역효과가 있겠지만, 마우스에서 Bay11의 효과를 조사하는데 중요하였다. 도 4a에서 확인되는 바와 같이, Bay11과 함께 또는 없이 주사된 동물은 유전자 전달 2주 후에 분석시 벡터로부터 EGFP 발현의 유사한 수준을 나타내었다. TM-AAV 벡터의 도입 효율은 WT-AAV 벡터에 비해 대략 12배 더 높았으며 (도 4b), 이는 최근 공개된 연구와도 일치한다 (문헌 [Markusic et al., 2010]). 이들 데이터는 Bay11 투여가 장기 트랜스유전자 발현을 상쇄시키지 않고 선천성 면역 반응의 매개자를 안전하고 효과적으로 하향조절할 수 있음을 시사한다.
재료 및 방법
재조합 AAV 벡터. 야생형 (WT) 플라스미드 또는 삼중 티로신-돌연변이체 (TM; Y730+500+444F) 플라스미드를 함유하는 자체-상보적 (sc) AAV2 벡터의 고도로 정제된 원액을 생성하여, HEK-293 세포의 삼중 형질감염에 의한 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터 (WT-scAAV2-EGFP, TM-scAAV2-EGFP)에 의해 구동된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 증진시켰다. 이어서, 벡터를 기재된 바와 같이 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제하고, 멸균 여과하고, 슬럿-블럿 혼성화에 의해 정량화하였다 (문헌 [Liu et al., 2003]; [Kube and Srivastava, 1997]). 티로신-돌연변이체 pACG2-Y730+500+444F-Rep/Cap 플라스미드가 최근에 기재되었다 (문헌 [Markusic et al., 2010]).
시험관내 재조합 AAV 벡터 도입 검정. 최적 농도의 NF-кB-조정 화합물을 IC50으로부터 10배 희석하여 세포 생존율 검정에 의해 결정하거나 또는 이전에 기재된 바와 같이 사용하였다 (문헌 [Wu and Miyamoto, 2008]; [Kumar et al., 2008]). VP16 또는 Bay11 (10 또는 5 μM, 최종 농도), 및 PDTC (50 또는 25 μM 최종 농도)를 단독으로 또는 활성자/억제제와 조합하여 사용하였다. 도입 실험을 위해, 대략 1 × 105 HeLa 세포를 벡터 감염 24시간 전에 이들 화합물로 사전 처리하였다. 이전에 기재된 바와 같이 EGFP 트랜스유전자를 코딩하는 재조합 WT-AAV 또는 TM-AAV 벡터의 세포 당 500 또는 2,000 벡터 게놈 (vgs)을 세포에 도입시켰다 (문헌 [Markusic et al., 2010]). 배양 7일 후, 일차 인간 수지상 세포에 2000 vgs/세포의 AAV 벡터를 도입시키고 48시간 동안 인큐베이션하다. 트랜스유전자 발현을 시야 당 녹색 형광의 총 면적 (픽셀2)으로 평가하거나 (평균 ± SD), 또는 유동 세포계측에 의해 평가하였다. 분산 분석 (ANOVA)을 이용하여 시험 결과와 대조군을 비교하였으며, 이들은 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다.
생체내 재조합 AAV 벡터 도입 연구. 6주령의 정상적인 C57BL/6J 마우스 (잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories), 미국 메인주 바 하버 소재)에게 DMSO로 희석된 200 ㎕ 부피 중 단일 용량 (20 mg/kg)의 NF-кB 억제제 Bay11을 복막내로 투여하였다 (제0일). DMSO 담체 용매만을 주사한 동물을 기준선 (mock) 군 (n = 75)으로 간주하였고, Bay11을 주사한 동물을 시험군으로 하였다 (n = 75). 이 시점에서, mock 및 Bay11 군으로부터의 동물들을 무작위화하여 인산염 완충 염수 (PBS, pH 7.4) 또는 WT-AAV 또는 TM-AAV 벡터 (각각의 군에서 n = 25 마리의 마우스)를 주입하였다. 제1일에, 대략 1 × 1011 바이러스 게놈 (vg) 입자의 WT-AAV2-EGFP 또는 TM-AAV2-EGFP 벡터 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. AAV에 대한 면역 반응을 조정하기 위해, PBS-, WT-AAV-, 또는 TM-AAV 벡터-주사된 군으로부터의 각각 5 마리의 동물들을 벡터 투여 후 상이한 시점 (2, 6, 10, 24시간 및 제10일)에서 탄소-디옥시드 흡입에 의해 희생시켰다. 간엽을 수집하고, 단면절제하고, 슬라이드 상에 마운팅하여 AAV-매개 EGFP 발현에 대한 Bay11의 효과를 연구하였다 (제10일의 마우스로부터의 것임). 모든 동물 연구는 동물 실험 윤리 위원회 지침에 따라 수행하였다.
RT-PCR 검정에 의한 선천성 면역 반응의 유전자-발현 분석. 6주령의 정상적인 C57BL/6J 마우스의 군에 NF-κB 억제제 Bay11의 단일 용량 (20 mg/kg)을 DMSO 중에 200-μL 부피로 희석하여 복강내로 투여하였다 (제0일). 제1일에, 마우스에 인산염 완충 염수 (PBS, pH 7.4), 또는 야생형 (WT) AAV-EGFP 벡터 또는 티로신 삼중-돌연변이체 (TM) AAV-EGFP 벡터 ~1 × 1011 vg를 꼬리-정맥을 통해 정맥내로 주사하였다 (각 군 당 n = 5마리의 마우스). 벡터 투여 후 2시간째에, Toll-유사 수용체 1-9, MyD88, MIP-1, IL-1α, IL-1β, IL-12α, IL6, KC, TNFα, RANTES, MCP-1, IFNα, IFNβ 및 IP-10을 포함하는 선천성 면역 반응의 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. 데이터를 ABI 프리즘 7500 시퀀스 디텍션 시스템(ABI Prism 7500 Sequence Detection System) v 1.1 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 캡쳐하고 분석하였다. 기준선을 18S rRNA에 대해, 그리고 다른 유전자에 대해 자동으로 결정하였다. 역치를 모든 유전자에 대해 수동으로 결정하였다. 유전자 발현을 비교 역치 주기 (Ct) 방법에 의해 측정하였다. 파라미터 역치 주기 (Ct)를 프로브의 절단에 의해 생성된 리포터 형광이 기준선을 넘어 고정된 역치를 통과한 주기 번호로서 정의하였다. 시토카인 유전자 발현을 내생 참조 18S rRNA 유전자를 사용하여 표준화하였고, 모의-감염된 뮤린 mRNA를 참조 샘플로서 사용하였다. 상대적 유전자 발현을 처치 및 미처치 동물군 각각에 대해 결정하였고, > 2.6 및 < 0.38인 값을 군 사이의 유의한 상향조절 및 하향조절로 간주하였으며, 이는 특이적 유전자 발현을 측정하는 데 사용된 96-웰 플레이트에서의 변동성을 평가하여 계산된 것이다.
세포, 항체 및 화학물질. HeLa 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수하고, 10% 신생아 송아지 혈청 (NCS) (론자, 인크.(Lonza, Inc.), 스위스 바젤 소재) 및 항생제로 보충된 이스코브-변형된 둘베코 배지(Iscove's-modified Dulbecco's medium) (IMDM, 인비트로젠(Invitrogen) 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중에서 단층 배양물로서 유지하였다. 백혈구성분채집술-유래 PBMC를 혈청 무함유 AIM-V 배지 (론자) 중에 재현탁시키고, 반-부착성 세포 분획을 재조합 인간 IL-4 (500 U/mL) 및 GM-CSF (800 U/mL) (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 소재)로 보충된 혈청 무함유 AIM-V 배지 중에서 인큐베이션하였다. 세포를 NF-κB 조절제 (10 mM VP16 또는 10 mM Bay11), 및 10 ng/mL TNF-α, 10 ng/mL IL-1, 10 ng/mL IL-6, 1 mg/mL PGE2를 포함하는 시토카인 칵테일 (알앤디 시스템즈)로 20시간 동안 처리하였다. 세포를 수확하고, 이들이 성숙 DC의 전형적인 표현형을 충족시킨다는 것을 확실히 하기 위해 특징분석하였다 (CD83, RPE, 뮤린 IgG1, CD86, FITC, 뮤린 IgG1; 인비트로젠). 모든 원발성 및 속발성 항체는 셀 시그널링 테크놀로지, 인크.(Cell Signaling Technology, Inc., 미국 메사추세츠주 댄버스 소재) 또는 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크(Santa Cruz Biotechnology, Inc, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. NF-kB 활성화제 [에토포시드 (VP16), 아피디콜린, 히드록시우레아 (HU)] 및 NF-kB 억제제 [Bay11-7082 (Bay11), 피롤리딘 디티오카르바메이트 (PDTC)]는 시그마-알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich Co., 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 이들 화합물을 제조업체의 지침서에 따라 DMSO (시그마-알드리치) 또는 멸균, DNAase 무함유, RNAase 무함유 물 (인비트로젠) 중에 재현탁시켰다.
웨스턴 블럿 분석. 2 × 106 HeLa 세포 또는 DC로부터의 세포 펠렛의 균질화된 용해물, 최적의 농도의 NF-κB 활성자 또는 억제제로 모의 처리 또는 전처리된 것이 샘플 제조를 위해 사용되었다. 온전한 세포 단백질을 RIPA 용해 완충제 (시그마-알드리치)를 사용하여 단리시켰고 세포질 및 핵 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 키트 (NE-PER 추출 시약 키트, 피어스 바이오테크(Pierce Biotech), 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용하여 프로테아제 억제제 칵테일 (홀트(Halt)™ 프로테아제 억제제 칵테일 키트, 피어스 바이오테크)의 존재 하에 추출하였다. 단백질 추출물을 환원 조건 [62.5 mM 트리스-HCl (25℃에서 pH 6.8), 2% wt./vol. SDS, 10% 글리세롤, 50 mM DTT, 0.01% (wt./vol.) 브로모-페놀 블루 (셀 시그널링 테크놀로지, 인크.)를 함유하는 SDS-샘플 완충제]에서 5분 동안 가열하고 86℃에서 추가로 분석할 때까지 저장하였다. 동일한 부피의 샘플을 4 내지 15% SDS-PAGE (바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 상에서 분석하였다. 겔을 0.2 μm 니트로셀룰로스 막 (바이오-라드) 상으로 옮기고 밤새 1:1000 희석의 일차 항체 [p100/52, p65, 억제성 키나제-IκBκ, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH), 라민 B (셀 시그널링 테크놀로지, 인크.), β-액틴 (산타 크루즈 바이오테크놀로지)]로 전형적으로 인큐베이션했다. 다음 날, 블럿을 1:2,000-1:5,000의 적절한 항-이디오형 HRP 표지된 IgG 2차 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지)로 인큐베이션했다. 면역블럿 검출을 ECL 플러스 웨스턴 블럿팅 검출 키트 (에머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 수행하였다. 단백질 밴드의 강도를 어도비 포토샵 CS3 소프트웨어(등록상표)를 사용하여 측정하고 부하 대조군으로서 사용된 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 생성물로부터 단백질 수준까지 표준화하였다.
본원 연구의 기반은 숙주 세포 NF-κB가 AAV 역전된 말단 반복부 (ITRs)에 존재하는 20-bp D-서열에 결합할 수 있음을 발견한 것이었고 (칭(Qing) 등, 1997), 이는 전기영동 이동성-시프트 검정 및 후속하는 질량 분광측정법에 의해 식별되었다 (도 10a 및 도 10b). 이러한 예시에 나타낸 데이터는 AAV 감염에서 NF-κB의 관여의 제1 증거를 제공한다. NF-κB 신호전달 경로를 연구하기 위해 다른 조사자들 (우(Wu) 및 미야모토(Miyamoto), 2008; 쿠마르(Kumar) 등, 2008)에 의해 광범위하게 사용되어온 다양한 약리 조절제를 사용하여, 비-정규 NF-κB 경로가 AAV 감염 이전에 상향 조절됨을 보여주었다. NF-κB 전사 프로그램의 활성화가 염증성 및 면역 활성화의 근본적인 극초기 단계이고 (리(Li) 및 베르마(Verma), 2002), NF-κB 신호전달이 바이러스 감수성 또는 간섭에 대한 주요 후보를 나타내는 것 (히스콧(Hiscott) 등, 2006)이 유의한 감안점이다. NF-κB를 활성화하는 바이러스가 인터페론 반응을 통해 선천성 면역 반응에 감수성이고 (소포형 구내염 바이러스, 홍역 바이러스) (히스콧 등, 2003), 톨-유사 수용체 (TLR) 의존적이고 (에볼라 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스) (오쿠무라(Okumura) 등, 2010; 리준디아(Lizundia) 등, 2008), TLR-독립적 신호전달 경로임 (사이토메갈로바이러스, C형 간염 바이러스) (캐스타니에(Castanier) 등, 2010; 구지(Gourzi) 등, 2007)이 나타났다. 반면에, 많은 바이러스는 선천성 면역 반응 및 NF-κB 경로의 구체적인 양태를 표적화하는 다관능성 바이러스 유인(decoy) 단백질을 사용하는 NF-κB를 파괴한다. 인간 면역결핍 바이러스 제I형 (HIV-I), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1 (HTLV-1), 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8) 및 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)를 포함하는 바이러스가 NF-κB 신호전달의 양태를 그들의 라이프사이클 및 병원성에 포함시키고. 따라서 NF-κB 활성화를 이용하여 그들의 생존을 촉진시킨다 (히스콧 등, 2006).
반대로, NF-κB의 비-정규 경로가 선천성 및 적응성 면역 반응에 대해 중요해지고 (Gilmore, 2006), AAV 벡터는 임의의 NF-κB-유사 디코이 단백질을 발달시키는데 필요한 구조적 유전자 요소 복합체가 결여되었기 때문에, AAV 감염 둘 다 이후 NF-κB의 비-정규 경로가 활성화되는 것은 분명하다. 비-정규 경로의 악화된 활성화는 류마티스 관절염, 궤양성 결장염 또는 B 세포 림프종과 같은 광범위한 염증성 장애와 연관되어 있다 (Dejardin, 2006). 골수계의 세포에서만 발현되는 피린-함유 단백질인 모나르치-1(Monarch-1)은 비-정규 NF-κB 경로를 활성화시키는데 필요한 NF-κB 유도 키나제 (NIK)의 억제를 통해 염증유발 시토카인 및 케모카인을 억제한다 (Lich et al., 2007). NF-κB 활성화의 비-정규 경로의 활성화는 전형적 경로의 활성을 차단하는 돌연변이 IκBκ를 과발현하는 DC의 성숙 및 T-세포 프라이밍 활성을 나타내었다 (Lind et al., 2008). NIK 결핍 림프조직무형성 (Aly) 마우스에서, CD8+ T 세포의 DC에서의 외인성 항원과의 교차-프라이밍은 적응 면역에서 이들 경로의 중요성을 시사한다 (Lind et al., 2008). 비-정규 경로 요소에서의 마우스 결핍은 또한 2차 림프성 기관 발달 및 항상성의 결핍이다 (Guo et al., 2008). AAV-결합이 세포 표면 수용체에 대한 NF-κB 신호전달을 활성화시키는지는 공지되지 않았다. 최근 연구는 뮤린 모델에서 세포 표면에 대한 생체내 TLR9-MYD88 경로 또는 CD40 리간드의 활성화를 통해 유발될 수 있는 AAV에 대한 선천성 면역 반응을 입증하였다 (Zhu et al., 2009; Mays et al., 2009). 상기의 둘 다가 증가되는 선천성 면역 반응에 대한 NF-κB 하류 신호전달에 의존하지만 (Mineva et al., 2007; Loiarro et al., 2005), CD40L과 같은 TNF 슈퍼 패밀리 수용체의 활성이 비-정규 NF-κB 경로를 활성화시킬 수 있음에 주목함이 흥미롭다 (Qing et al., 2005).
AAV 벡터에 대항한 면역 감시를 위한 제1의 "위험-신호" 또는 "유발"이 대안적 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다는 증거에 기반하여, 이는 AAV 벡터 투여 동안 NF-κB의 일시적 차단이 숙주 면역 반응을 줄일 수 있음을 알 수 있다. AAV에 의해 NF-κB-프라이밍을 무효화시키는 하나의 가능한 전략은 AAV-ITR에서 NF-κB 반응성 전사 인자 결합 부위에 대한 표적화된 돌연변이를 생성시키는 것이다. 그러나, 세포 생리학에서 NF-κB 단백질의 다면발현성 기능을 고려할 때 (Hayden and Ghosh, 2004), 상이한 NF-κB-반응성 시토카인 프로모터-결합 전사 인자가 상이한 세포 유형에 작동할 수 있음이 가능하다. 대안적으로, NF-κB 경로를 표적화함으로써 일시적인 면역-억제에 대한 프로토콜은 보편적으로 적용가능할 수 있다. 선택적인 NF-κB 억제제인 Bay11은 AAV 벡터가 아직 그의 생체내 트랜스진 발현에 영향을 미치지 않는 염증 및 선천성 면역 반응의 마커를 현저히 감소시킬 수 있다. Bay11은 몇몇 주요 조절제, 즉 IL-1α, IL-6, TNFα, IL-12α, KC 및 RANTES의 활성을 하향-조절할 수 있으며, 이는 상기 약리학적 조절제를 사용하여 AAV 벡터에 대한 염증성 및 선천성 면역 반응을 선택적으로 하향-조절하는 것에 대한 이익을 시사한다. 흥미롭게도, 비-정규 NF-κB 경로의 활성화에 중요한 NIK는 또한 다양한 바이러스 감염에 대한 반응으로 IL-1α, IL-6, IL-12α, TNFα 및 RANTES의 활성을 유도하는 것으로 공지되어 있다 (DiPaolo et al., 2009; Yanagawa and Onoe, 2006; Andreakos et al., 2006; Habib et al., 2001). 또한, NIK가 그의 활성이 항원 특이적 CD4+ 헬퍼 T 세포의 프라이밍에 중요하며, 전달 벡터와 같은 관련 표적에 대한 면역 반응을 유발하는 전문적 휴지 항원 제시 세포인 DC의 활성화 및 기능에 중추적임이 익히 인지되어 있다 (Andreakos et al., 2006; Habib et al., 2001; Martin et al., 2003; Brown and Lillicrap, 2002). 시험관내, NIK는 NF-κB를 우세하게 활성화시키고, 따라서 시토카인 (TNFα, IL-6¸ IL-12, IL-15, 및 IL-18), 케모카인 {IL-8, RANTES, 대식세포 염증성 단백질-1α, 단핵구 화학-유인성 단백질-1, 및 단핵구 화학-유인성 단백질-3}, MHC 항원-제시 분자 (부류 I 및 II), 및 공동-자극 분자 (CD80 및 CD86)의 발현을 상향-조절함으로써 DC 항원 제시를 증가시킨다 (Andreakos et al., 2006). 생체내, NIK는 벡터-코딩 항원에 대한 면역 반응을 증진시키고, 이를 완결된 프로인트 아주반트보다 더 우세하게 반응하는 증가된 IgG2a 수준, T-세포 증식, IFN-g 생성, 및 세포독성 T 림프구 반응으로 T 헬퍼 1 면역 반응을 유도한다 (Andreakos et al., 2006). 본 연구에 사용된 Bay11은 비-정규 경로에서 NIK에 대한 기질인 IKKα 및 β의 활성화를 방지한다 (Pierce et al., 1997). 이들 데이터는 비-정규 NF-κB 경로 표적화 뿐만 아니라 면역 반응의 주요 조절제의 활성화를 방지하는 그의 능력에서 Bay11의 높은 특이성을 나타낸다.
NF-κB 경로 표적화에 의한 일시적인 면역억제를 위한 프로토콜을 면역-독성을 제한하는데에 보편적으로 적용할 수 있었다. 실제로, 최근 보고는 프로테아솜 억제제, 보르테조밉 [벨케이드®] (Bortezomib [Velcade®]) (문헌 [Finn et al., 2010] 참조)을 사용함으로써 감소한 AAV 캡시드 항원 제시를 보여주었다. 보르테조밉은 상당한 항-골수종 효능을 가지며 (문헌 [Kube and Srivastava, 1997] 참조), 이는 크게는 NF-κB 신호전달의 억제 때문인 것으로 보였다. 따라서, AAV 벡터의 안정성 및 치료 효능을 추가로 증진시키기 위해 캡시드 및 염증성 신호의 MHC I 제시를 동시에 차단하거나 또는 보다 선택적인 NF-κB-표적화 요법, 예컨데 이 연구의 Bay11를 사용하거나 또는 보다 새로운 IKK 억제제를 사용하는 것이 가능할 수 있었다.
실시예 3 - 최적화된 AAV3 혈청형 벡터의 개발
비-병원성 인간 파보바이러스인 아데노-관련 바이러스 2 (AAV2)는 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하였고, 종 장벽을 전이시키는 넓은 조직-향성을 가졌다 (문헌 [Muzyczka, 1992] 참조). 재조합 AAV2 벡터는 다양한 인간 질환의 잠재적인 유전 자 요법을 위한 유망한 벡터 시스템으로서 주목받아 왔으며, 현재 다수의 유전자 요법 임상 실험에 사용되고 있다 (문헌 [Daya and Berns, 2008] 참조). 보다 최근에는, 몇몇 추가의 AAV 혈청형이 단리되었으며, 특정한 세포 유형을 효율적으로 전달하는 것으로 보였다 (문헌 [Muramatsu et al., 1996; Chiorini et al., 1997; Chiorini et al., 1999; Rutledge et al., 1998; Gao GP et al., 2002; Vandenberghe et al., 2004] 참조). AAV2의 생존 주기의 다양한 단계에 대해서는 잘 이해되고 있으나 (문헌 [Summerford and Samulski 1998; Qing et al., 1999; Summerford et al. 1999; Hansen et al., 2000; Hansen et al., 2001; Sanlioglu et al., 2000; Douar et al., 2001; Zhao et al., 2006; Thomas et al. 2004; Zhong et al. 2004; Ferrari et al., 1996; Fisher et al. 1996; Qing et al., 2004; Zhong et al., 2004; Zhong et al., 2004; Zhong et al., 2008; McCarty et al., 2004; Bainbridge et al., 2008] 참조), 다른 혈청형에 대해서는 덜 공지되어 있다.
통상적으로 AAV 혈청형으로 사용되는 10개 중에서, AAV3은 세포 및 조직을 불량하게 전달하는 것으로 보고되어 왔다 (문헌 [Zincarelli et al.; Zincarelli et al., 2008] 참조). 그러나, 최근 연구는 AAV3 벡터가 정립된 인간 간모 세포종 (HB) 및 인간 간세포 암종 (HCC) 세포주 뿐만 아니라 1차 인간 간세포를 매우 효율적으로 전달한다는 것을 발견하였다 (문헌 [Glushakova et al., 2009] 참조). 이후, AAV3 감염이 간세포 성장 인자 (HGF), HGF 수용체 (HGFR) 특이적 siRNA 및 항-HGFR 항체에 의해 강력히 억제된다는 것이 기록되었으며, 이는 AAV3가 바이러스 침입에 대한 세포 수용체/공-수용체로서 HGFR을 사용한다는 것을 제시하였다 (문헌 [Ling et al., 2010] 참조).
유비퀴틴-프로테아솜 경로는 AAV 벡터의 세포내 트래픽킹에서 중대한 역할을 하였다 (문헌 [Douar et al., 2001; Zhong et al., 2007; Duan et al., 2000] 참조). 무손상 AAV2 캡시드는 티로신 잔기에서 표피 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 (EGFR-PTK)에 의해 인산화될 수 있으며, 상기 AAV 캡시드의 티로신-인산화는 세포내 트래픽킹 및 트랜스진 발현에 부정적인 영향을 미쳤다. 이러한 관찰은 티로신-인산화를 AAV 캡시드의 유비퀴틴화 및 이어서 프로테아솜-매개 분해에 대한 신호로 제시하도록 야기하였다 (문헌 [Duan et al., 2000; Zhong et al., 2008] 참조). 이는 표면-노출 티로신 잔기 (Y)의 페닐알라닌 (F)으로의 돌연변이가 인산화, 유비퀴틴화 및 프로테아솜-매개 분해를 피하는 벡터를 가능하게 할 수 있다는 가설을 야기하였다. 실제로, AAV2 벡터의 표면-노출 티로신 잔기의 돌연변이가 HeLa 세포 시험관내 및 뮤린 간세포 생체내 모두에서 적은 용량에서 높은 효율의 도입을 야기하였다 (문헌 [Zhong et al., 2008] 참조). 인간 인자 IX의 발현의 치료 수준은 단일 및 다중 티로신-돌연변이체 AAV2 벡터를 사용한 마우스의 몇몇 상이한 균주에서 수득되었다 (문헌 [Zhong et al., 2008; Markusic et al., 2010] 참조). 추가의 연구는 AAV 혈청형 6, 8 및 9의 유사한 Y-내지-F 돌연변이가 또한 트랜스진 발현을 증대시킨다는 것을 입증하였다 (문헌 [Petrs-Silva et al., 2009; Qiao et al., 2010; Taylor and Ussher, 2010] 참조). AAV2의 7개 표면-노출 티로신 잔기 중 6개가 또한 AAV3에 보존되지만, 그들의 AAV3-매개 도입에 대한 관여는 평가되지 않았다.
본 실시예는 (i) hHGFR의 안정적인 형질감염 및 과다-발현 후에, AAV3 벡터-매개 형질도입이 검출불가능한 수준의 내인성 hHGFR을 발현하는 인간 유방암 세포주인 T47D 세포에서 극적으로 증가하고 (Abella et al., 2005); (ii) hHGFR과 연관된 티로신 키나제 활성이 AAV3 벡터의 형질도입 효율에 음성적으로 영향을 미치고; (iii) 프로테아솜 억제제의 사용이 AAV3 벡터-매개 형질도입을 유의하게 개선시키고; (iv) AAV3 캡시드 상 3개의 표면-노출 티로신 잔기의 부위-지정 돌연변이유발이 개선된 형질도입 효율을 유발하고; (v) 2개의 티로신-돌연변이의 특이적 조합이 트랜스진 발현의 정도를 추가로 개선시키고; (vi) 종양내 또는 전신 투여 둘 다 후에, 뮤린 이종이식편 모델 생체내에서 AAV3 벡터가 인간 HB 및 HCC 종양을 효율적으로 형질도입시킴을 입증하였다. 이들 최적화된 AAV3 벡터는 유전자 요법, 특히 인간에서의 간암의 요법에 대한 개선된 도구를 제공하였다.
재료 및 방법
세포주 및 배양. 인간 자궁경부암 (HeLa) 및 간세포 암종 (Huh7) 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스)으로부터 구입하여, 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (FBS, 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (P/S, 론자, 미국 메릴랜드주 워커스빌)으로 보충된 완전 DMEM 배지 (미디어테크, 인크., 미국 버지니아주 마나사스) 중에 유지시켰다. 새롭게 수립된 인간 간모세포종 (Hep293TT) 세포주 (Chen et al., 2009)를 15% 열-불활성화 FBS (시그마-알드리치), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (P/S, 론자, 메릴랜드주 워커스빌)으로 보충된 완전 RPMI 배지 1640 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 카마릴로) 중에 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 중의 가습 분위기 중에서 부착 배양물로서 성장시키고, 2-5분 동안 실온에서 트립신-베르센 혼합물 (론자)로 처리한 후 계대배양하고, 세척하고, 완전 배지 중에 재현탁시켰다. 인간 유방암 세포주 T47D 및 hHGFR 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염시킨 T47D 세포 (T47D+hHGFR)를 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (FBS, 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (론자)으로 보충된, 600 μg/mL의 G418을 포함하거나 포함하지 않는 완전 DMEM 배지 (미디어테크, 인크.) 중에 유지시켰다.
재조합 AAV 플라스미드 및 벡터. 재조합 AAV3 패킹 플라스미드 및 재조합 AAV2-CBAp-EGFP 벡터 플라스미드를 각각 노스캐롤라이나 채플 힐 소재 노스캐롤라이나 유니버시티 채플 힐 캠퍼스의 닥터 알. 주드 사물스키(R. Jude Samulski) 및 샤오 샤오(Xiao Xiao)에 의해 관대하게 제공받았다. 닭 β-액틴 프로모터 (CBAp)에 의해 구동되는 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 함유하는 scAAV2 및 scAAV3 벡터의 고도로 정제된 원액을 이전에 기재된 인산칼슘 삼중-플라스미드 형질감염 프로토콜 (Wu et al., 2007; Kube and Srivastava, 1997)에 의해 패킹시켰다. 재조합 벡터 원액의 물리적 입자 역가를 정량적 DNA 슬롯-블롯 분석 (Kube and Srivastava, 1997)에 의해 결정하였다.
표면-노출 티로신 잔기 돌연변이체 AAV3 캡시드 플라스미드의 구축. 퀵체인지(QuikChange) II® 부위-지정 돌연변이유발 (스트라타진)에 기반한 2-단계 절차를 이전에 기재된 플라스미드 pAAV3을 사용하여 수행하였다 (Glushakova et al., 2009; Ling et al., 2010). 간략하게 설명하면, 단계 1에서는 2개의 PCR 연장 반응을 각각의 돌연변이체에 대한 별도의 튜브 내에서 수행하였다. 한 튜브는 정방향 PCR 프라이머를 함유하였고, 다른 것은 역방향 프라이머를 함유하였다 (표 3).
단계 2에서는, 2개의 반응물을 혼합하고, 표준 PCR 돌연변이유발 검정을 제조업체의 지침서에 따라 수행하였다. PCR 프라이머는 티로신에서 페닐알라닌 잔기로의 변화 및 침묵 변화를 도입하여 스크리닝 목적의 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 생성하도록 디자인되었다 (표 3). 모든 돌연변이체를 적절한 제한 효소로 스크리닝하고, 사용 전에 서열분석하였다.
표 3
부위-지정 돌연변이유발에 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열
Figure 112021035148424-pat00002
코돈 트리플렛은 볼드체로 나타냈고; 적색 폰트는 티로신에서 페닐알라닌 잔기로의 돌연변이를 나타내고, 녹색 폰트는 원하는 클론을 확인하는 데 사용된 제한 효소 부위 (밑줄표시)를 제거/생성하는 침묵 돌연변이를 가리킨다.
AAV 벡터 형질도입 검정. Huh7 또는 HeLa 세포를 96웰 플레이트에 완전 DMEM 배지 중 웰 1개당 5,000개 세포의 농도로 접종하였다. AAV 감염을 혈청- 및 항생제-무함유 DMEM 배지 중에서 수행하였다. Hep293TT 세포를 96웰 플레이트에 완전 RPMI 배지 중 웰 1개당 10,000개 세포의 농도로 접종하였다. 감염을 혈청- 및 항생제-무함유 RPMI 배지 중에서 수행하였다. EGFP의 발현을 72시간 형질도입 후 직접 형광 영상화에 의해 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석. 세포를 수확하여 방사선면역침전 검정 (RIPA) 용해 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1 mM EDTA (프로테아제 억제제 칵테일 포함), 1 mM NaF 및 1 mM Na3VO4) 중에서 파괴시켰다. 전체 단백질 농도를 브래드포드 시약 (바이오-래드)를 사용하여 측정하고, 동량 (50 μg)의 온전한 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분해하였다. 전기영동 후에, 샘플을 니트로셀룰로스 막 (바이오-래드)으로 전기전달하고, 관련 1차 항체로 4℃에서 밤새 프로빙하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 인큐베이션하고, 증진된 화학-발광 기질 (아머샴)로 검출하였다. 포스포-c-Met (Y1234/1235), 전체 c-Met, 포스포-Akt (S473) 및 포스포-ERK (T202/Y204)에 대한 항체는 셀 시그널링으로부터 구입하였고, 항-β-액틴 (AC-74) 항체는 시그마-알드리치로부터 입수하였다.
마우스 이종이식편 모델에서의 재조합 AAV3 벡터 형질도입 연구. 6-주령 NSG 마우스 (잭슨 래버러토리즈) 그룹에 5 × 106개의 Hep293TT 또는 Huh7 세포를 피하 주사하였다. 주사 4주 후에, 지시된 수의 AAV3 벡터 게놈 (vg)을 종양내로 또는 꼬리-정맥을 통해 투여하였다. 벡터 투여 4일 후에, 종양을 절제하고, 절편화하고, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 발현에 대해 평가하였다. 절편을 또한 DAPI로 염색하여 세포 핵을 가시화하였다. 모든 동물 연구는 승인된 제도적 가이드라인에 따라 수행하였다.
통계적 분석. 결과를 평균 ± 표준 편차 (SD)로 제시하였다. 그룹 간의 차이는 스튜던트 T 검정의 그룹화-독립표본 양측 분포를 사용하여 확인하였다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
인간 HGFR이 AAV3 감염성에 요구되었다. AAV3은 인간 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR)를 세포 공-수용체로서 이용하였다 (Ling et al., 2010). 이 발견을 명백하게 확증하기 위해, 검출불가능한 수준의 hHGFR을 발현하는 인간 유방암 세포주 T47D (Abella et al., 2005), 뿐만 아니라 hHGFR 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염시킨 T47D 세포 (T47D+hHGFR)를 사용하였다 (Abella et al., 2005). 수립된 세포주 T47D+hHGFR 내 hHGFR 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다 (도 12c 참조). 동등한 수의 T47D 및 T47D+hHGFR 세포를 동일한 조건 하에서 다양한 감염 다중도 (MOI)의 자기-상보적 (sc) AAV3-CBAp-EGFP 벡터로 형질도입시키고, 트랜스진 발현을 72시간 형질도입 후에 결정하였다. 도 11a에 나타낸 이들 결과는, AAV3 벡터의 형질도입 효율이 hHGFR을 발현하지 않는 세포보다 발현하는 세포에서 ~8-13배 더 높음을 입증하였다. T47D+hHGFR 세포의 AAV3 벡터-매개 형질도입은 5 μg/mL의 hHGF의 존재 하에 완전하게 차단될 수 있었다 (도 11b). 종합하면, 이들 데이터는 hHGFR의 세포 표면 발현이 AAV3 벡터에 의한 성공적인 형질도입에 요구된다는 결정적 증거를 제공하였다.
HGFR 단백질 티로신 키나제 활성의 억제는 AAV3 벡터의 형질도입 효율을 증진시켰다. 세포외 도메인에 더하여, 단백질 티로신 키나제 활성을 함유하는 HGFR의 세포내 도메인이 또한 AAV3 감염에 관여하는지를 조사하기 위해, 추가의 연구를 수행하였다. 그의 리간드 HGF의 결합은 수용체의 이량체화 및 세포내 도메인 내 다중 티로신 잔기의 분자간 인산 전달을 유도하였다 (Nguyen et al., 1997). T47D+hHGFR 세포를 2시간 동안 증가하는 농도의 특이적 HGFR 키나제 억제제 BMS-77760707 (BMS)로 처리하였다 (Schroeder et al., 2009; Dai and Siemann, 2010). 세포를 이어서 2,000 vg/세포의 scAAV3 벡터로 감염시켰다. 이들 결과를 도 12a에 나타내었다. BMS-777607-처리는 AAV3 형질도입 효율에서의 ~2배 증가를 유발함이 명백하였다. p-값은 BMS-777607을 1 μM의 보다 낮은 농도보다 10 μM의 가장 높은 농도로 사용했을 때 더 높았지만, 이러한 변화는 약물 독성으로 인한 것일 가능성이 높다. 이전의 연구에서, BMS-777607 처리는 용량 ≤1 μM에서 세포 성장에 유의한 효과를 나타내지 않는 것으로 보고되었다. 그러나, 10 μM의 용량은 세포 증식에서의 유의한 감소를 유도하였고, 이는 이 농도가 세포에 독성임을 시사하였다 (Dai and Siemann, 2010). 다음 실험에서는, 이 약물의 임의의 가능한 비-특이적 성질을 배제하기 위해, 모 T47D 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 둘 다의 세포 유형을 1 μM BMS-777607로 2시간 동안 처리한 다음, 10,000 vg/세포의 scAAV3 벡터로 감염시켰다. 도 12b에 나타낸 결과는, BMS-777607-처리는 T47D+hHGFR 세포에서의 AAV3 감염성을 유의하게 증진시킨 반면, hHGFR의 발현이 결여된 T47D 세포에서는 효과가 없었음을 가리켰다.
HGFR 키나제의 억제가 하류 신호전달 경로에 관여하는 특이적 세포 단백질의 인산화 상태 변경을 유발하는지 조사하기 위해, 2시간 약물-인큐베이션 기간 후에 T47D 및 T47D+hHGFR 용해물 둘 다에서의 HGFR 단백질의 전체 및 인산화 수준을 결정하였다. HGFR 키나제, ERK1/2 및 Akt로부터 하류인 신호전달 경로의 활성화를 인산화-특이적 항체를 사용하여 분석하였다. 도 12c에 나타낸 이들 결과는, hHGFR 발현이 T47D 세포에서는 거의 발생하지 않은 반면, 전체 HGFR 및 인산화 HGFR 둘 다에 대해 T47D+hHGFR 세포에서는 발현의 수준이 유의하게 높았음을 확인시켜 주었으며, 이는 이전에 공개된 보고서와 일치하였다 (Abella et al., 2005). T47D+hHGFR 세포의 BMS-777607로의 처리는 HGFR의 인산화를 완전하게 차단하였지만 전체 HGFR에 대해서는 아니었다. 또한, BMS-777607-처리는 인산화 AKT 및 ERK1/2의 발현에 대해서는 효과가 없었다. 이들 결과는 BMS-777607-처리에 의한 AAV3 벡터 감염성의 증진이 HGFR 키나제의 억제에 기인함을 시사하였다.
현재까지는, AAV2만 hHGFR을 공-수용체로서 사용하는 것으로 보고되어 있다 (Yan et al., 2002). 다른 AAV 혈청형에 대한 hHGFR 및 hHGFR 키나제 억제제의 역할은 공지되어 있지 않다. BMS-777607에 의한 형질도입의 임의의 비-특이적 증진을 배제하기 위해, HGFR에 의존하지 않는 AAV의 다른 혈청형, 뿐만 아니라 AAV2 벡터를 BMS-777607로의 세포 처리 후 형질도입 효율에 대해 비교하였다. 도 13에 나타낸 이들 결과는, AAV2 및 AAV3 벡터는 T47D+hHGFR 세포를 효율적으로 형질도입시킬 수 있는 반면, 다른 혈청형 (AAV4-AAV9)은 이들 세포를 매우 낮은 효율로만 형질도입시킬 수 있음을 가리켰다. 이러한 결과는 hHGFR이 이들 AAV 혈청형의 생활 주기에 관여하지 않음을 시사하였다. 세포의 BMS-777607로의 처리는 AAV2 및 AAV3 벡터 둘 다의 형질도입 효율을 유의하게 증가시켰지만, 다른 AAV 혈청형에 대해서는 그렇지 않았고, 이는 BMS-777607-처리의 효과가 AAV 혈청형-특이적임을 시사하였다.
프로테아솜 억제제는 AAV3 벡터의 형질도입 효율을 증가시켰다. 이전의 연구는 프로테아솜 억제제, 예컨대 MG132가 세포내 트래픽킹을 용이하게 함으로써 AAV2 벡터의 형질도입 효율을 유의하게 증진시킬 수 있음을 보여주었다 (Zhong et al., 2007; Yan et al., 2002). MG132가 또한 표적 세포에서의 AAV3 트래픽킹을 개선시킬 수 있는지 평가하기 위해, 잘 수립된 인간 간세포 암종 세포주인 Huh7 (Nakabayashi et al., 1982) 및 최근에 수립된 인간 간모세포종 세포주인 Hep293TT (Chen et al., 2009)를 모의-처리 또는 증가하는 농도의 MG132로 처리하였다. 2시간 처리 후에, 세포를 scAAV3-EGFP 벡터로 감염시켰다. 5 μM MG132로 처리하고 scAAV2 벡터로 형질도입시킨 HeLa 세포를 양성 대조군으로서 포함시켰다. 트랜스진 발현을 72시간 형질도입 후 형광 현미경검사에 의해 결정하였다. 이들 데이터를 도 14a 및 도 14b에 나타내었다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, MG132로의 전처리는 HeLa 세포에서 scAAV2 벡터의 형질도입 효율을 유의하게 증가시켰고, 이는 이전의 결과와 일치하였다 (Zhong et al., 2008). 흥미롭게도, Huh7 및 Hep293TT 세포 둘 다에서의 scAAV3 벡터의 형질도입 효율의 용량-의존적 증가가 MG132-처리 후에 발생하였고, 이는 AAV3 벡터 또한 유비퀴틴화에 이어 프로테아솜-매개 분해를 겪음을 시시하였다.
이전의 연구는 또한 EGFR-PTK의 특이적 억제제인 티르포스틴 23 (Tyr23)에 의한 EGFR-PTK 신호전달의 억제 (May et al., 1998)가 Ub/프로테아솜 경로를 조정하고, 이는 다시 AAV2 벡터에 의해 매개되는 세포내 트래픽킹 및 트랜스진 발현을 용이하게 함을 보여주었다 (Zhong et al., 2007). Hep293TT 세포를 모의-처리 또는 Tyr23으로 2시간 동안 처리하고, scAAV3 벡터로 형질감염시켰다. Tyr23으로 전처리하고 scAAV2 벡터로 형질도입시킨 HeLa 세포를 적절한 대조군으로서 포함시켰다. 트랜스진 발현을 72시간 형질도입 후에 결정하였다. 도 14c 및 도 14d에 나타낸 이들 결과는, Tyr23-처리가 scAAV2 및 scAAV3 벡터 둘 다의 형질도입 효율에서의 유의한 증가를 유발함을 가리켰다. 증가된 트랜스진 발현은 벡터 진입과 독립적이었는데, 이는 MG132 또는 Tyr23의 존재 또는 부재 하의 내재화된 바이러스 DNA의 양에 유의한 차이가 존재하지 않았기 때문이었다. 이들 결과는 추가로 AAV3 벡터의 생활 주기에 대한 숙주 세포 Ub/프로테아솜 기구의 관여를 또한 확증시켜주었다.
표면-노출 Tyr 잔기의 부위-지정 돌연변이유발은 scAAV3 벡터의 형질도입 효율을 유의하게 개선시켰다. 이전 실시예에서, 본 발명자들은 EGFR-PTK에 의해 인산화되고 AAV2 벡터의 형질도입 효율에 음성적으로 영향을 미치는 AAV2 캡시드 상 7개의 표면-노출 티로신 잔기 (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 및 Y730)가 존재함을 입증하였다 (Zhong et al., 2008). AAV2 및 AAV3 캡시드로부터의 아미노산 서열 정렬은 7개의 티로신 잔기 중 6개 (Y252, Y272, Y444, Y701, Y705 및 Y731)가 AAV3 캡시드에서 보존됨을 가리켰다 (표 4).
[표 4]
Figure 112021035148424-pat00003
AAV2 및 AAV3 캡시드 상의 표면-노출 티로신 (Y) 잔기가 제시되어 있으며; 화살표는 AAV3 캡시드 상에서 Y로부터 페닐알라닌 (F) 잔기로의 부위-지정 돌연변이를 나타낸다.
AAV2에서의 하나의 티로신 잔기, Y500는 AAV3에서 F501로 존재한다. 여러 AAV 혈청형에서 Y에서 F로의 돌연변이가 유비퀴틴화 및 프로테아솜-매개 분해를 회피함으로써 트랜스진 발현을 증진시키는 것으로 나타났기 때문에 (Zhong et al., 2008; Petrs-Silva et al., 2009; Qiao et al., 2010; Taylor and Ussher et al., 2010), F501의 티로신 잔기로의 역 돌연변이는 AAV3 벡터의 도입 효율을 감소시킬 것으로 추론되었다. 페닐알라닌 잔기가 티로신 잔기로 치환된 돌연변이체 AAV3 벡터 (F501Y)를 생성함으로써 이 가설을 테스트하였다. 동일한 조건 하에서 Huh7 세포를 사용하여 돌연변이체 벡터의 도입 효율을 그의 야생형 (WT) AAV3 대응물과 비교하였다. 도 15A에서 알 수 있는 바와 같이, F501Y 돌연변이체 벡터에 의해 매개된 트랜스진 발현의 정도는 WT AAV3 벡터와 비교하여 대략 50% 정도 감소하였다.
AAV3 캡시드 상의 티로신-돌연변이가 EGFR-PTK-매개 인산화의 감소를 초래하고, 이어서 유비퀴틴화의 감소 및 프로테아솜-매개 분해의 손상을 초래하여, 트랜스진 발현의 증가를 가져올 것이라는 가설을 추가로 테스트하기 위해, AAV3 캡시드 상의 6개 표면-노출 티로신 잔기 모두를 페닐알라닌 잔기로 변형 및 치환시켰다 (티로신-페닐알라닌, Y-F). scAAV2-CBAp-EGFP 게놈을 캡시드화하는 각각의 단일 티로신-돌연변이체 벡터를 성공적으로 패키징할 수 있었다. 정량적 DNA 슬롯 블럿팅 및 qPCR 둘 다에 의해 각각의 돌연변이체에 대한 벡터 역가를 결정하였으며, 패키징 효율에 있어 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각각의 티로신-돌연변이체 벡터의 도입 효율을 분석하고, 동일한 조건 하에서 Huh7 (도 15B) 및 Hep293TT (도 15C) 세포 둘 다에서 WT scAAV3-CBAp-EGFP 벡터와 비교하였다. 이들 결과로부터, 티로신-돌연변이체 벡터 중 3가지 (Y701F, Y705F 및 Y731F)의 도입 효율이 WT scAAV3 벡터와 비교하여 유의하게 더 높은 것이 명백하다. 구체적으로, Y731F 벡터의 도입 효율은 WT 벡터보다 약 8배 더 높았고, 다음으로 Y705F (약 3배) 및 Y701F (약 2배) 벡터였다.
표면-노출 티로신 잔기에서의 다중-돌연변이는 AAV3 벡터의 도입 효율을 추가로 개선시킨다. Y-F 돌연변이체 AAV2 벡터가 연루된 이전의 실시예에서, 표면-노출 티로신 잔기의 가장 효율적인 단일-돌연변이의 특정 조합이 AAV2 벡터의 도입 효율을 추가로 증대시키는 것으로 관찰되었다 (Markusic et al., 2010). AAV3 벡터를 이용하는 경우에도 유사한 증진이 달성될 수 있는지 조사하기 위해, 이하의 이중- 및 삼중-돌연변이체 AAV3 벡터를 구축하였다: Y701+731F, Y705+731F, 및 Y701+705+731F. 각각의 이들 돌연변이체 벡터를, 정량적 DNA 슬롯 블럿팅 및 qPCR 둘 다에 의해 결정한 바, 유사한 역가가 되도록 패키징하였다. 이들 다중-돌연변이체의 도입 효율을 동일한 조건 하에서 Huh7 세포에서 WT 및 Y731F 단일-돌연변이체 AAV3 벡터와 비교하였다. 이 결과는 도 16A에 나타나 있다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, Y731F 돌연변이가 이전에 관찰된 바와 같이 AAV3 벡터의 도입 효율을 유의하게 증가시킨 반면, 이중-돌연변이 중 단 하나 (Y705+731F)만이 트랜스진 발현을 추가로 유의하게 증가시켰다. 흥미로운 것은, 이중 돌연변이체 (Y701+731F) 및 삼중 돌연변이체 (Y701+705+731F) 벡터 둘 다의 도입 효율이 WT AAV3 벡터와 유사한 수준으로 감소되었다는 것이다. 이어서, 인간 간암 세포 상에서 수행능이 가장 우수한 단일 및 다중 티로신-돌연변이체를 대상으로 T47D 및 T74D+hHGFR 세포의 도입을 평가하였다 (도 16B). 인간 간암 세포와 유사하게, 티로신-돌연변이체 rAAV3 벡터는 hHGFR 발현과 함께 또는 이의 발현 없이 두 세포 유형 모두의 높은 도입 효율을 초래하였다.
관찰된 Y-F 돌연변이체 벡터의 도입 효율의 증진이 1종 이상의 추가의 추정 세포 수용체/보조-수용체 기능의 관여에 기인했을 가능성을 조사하기 위해, WT, Y731F, 및 Y705+731F 돌연변이체 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터를 이용하여 동일한 조건 하에서 5 μg/ml hHGF의 존재 또는 부재 하에서 Huh7 세포를 형질도입하였다. 이들 결과는 도 16C에 제시되어 있다. 여기서 명백한 바, hHGF의 존재는 모든 3개 AAV3 벡터의 도입 효율 및 트랜스진 발현을 극적으로 억제하였는데, 이는 티로신-돌연변이체 벡터가 또한 바이러스 진입을 위한 세포 수용체/보조-수용체로서 hHGFR을 이용한다는 해석과 일치한다.
AAV3 벡터는 뮤린 이종이식편 모델에서 인간 간 종양을 도입한다. AAV3 벡터가 또한 생체내 이종이식편 마우스 모델에서 인간 HB 및 HCC 종양을 도입할 수 있다는 것을 입증하기 위해, NOD/Scid 감마 (NSG) 마우스에 약 5 × 106 HCC (Huh7) 또는 HB (Hep293TT) 세포를 피하 주사하였다. 종양이 두 동물 군 모두에서 명백히 가시적이고 감지가능했던 4주 후에, 약 2 × 1010 vgs의 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터를 종양 내로 직접적으로 주사하였다. 벡터 주사 4일 후에, 종양을 절제하고, 얇은 절편을 형광 현미경 하에서 조사하였다. 이들 결과는 AAV3 벡터가 생체내에서 인간 HCC (도 17A) 및 HB (도 17B) 종양 둘 다를 도입하는데 효과적인 것을 나타내었다. 시험관내 데이터와 일치하는 것으로서, AAV3 벡터의 도입 효율은 Huh7 세포-유래 종양에서보다 Hep293TT 세포-유래 종양에서 더 높았다.
최적화된 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터는 뮤린 이종이식편에서 인간 간 종양을 도입하는데 고도로 효율적이다. 이어서, 수행능이 가장 우수한 이중 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터를 생체내에서 이종이식편 인간 간 종양 유전자 전달에 대해 추가로 평가하였다. 제1 연구 세트에서, 인간 HB (Hep293TT) 종양을 보유한 NSG 마우스에 약 5 × 1010 vgs의 야생형 (WT) scAAV3- 또는 Y705+731F-AAV3-CBAp-EGFP 벡터 중 하나를 종양내로 주사하였다. 벡터 주사 후 4일 후에, 종양을 절제하고, 얇은 절편을 형광 현미경 하에서 조사하였다 (도 17C). 여기서 알 수 있는 바와 같이, WT-AAV3 벡터가 주사된 종양은 검출가능한 수준의 EGFP 발현을 나타내었다. 이중 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터의 도입 효율은 WT AAV3 벡터와 비교하여 유의하게 더 높았는데, 이는 시험관내 데이터와 일치한다.
제2 연구 세트에서, 약 5 × 1011 vgs의 WT-scAAV3-CBAp-EGFP 벡터 또는 Y705+731F-scAAV3-CBAp-EGFP 벡터 중 하나를 인간 HB (Hep293TT) 종양을 보유한 NSG 마우스에 꼬리-정맥을 통해 주사하였다. 적절한 대조군으로서 인산염 완충 염수 (PBS) 주사를 사용하였다. pBS 주사된 마우스로부터의 종양에서는 트랜스진 발현이 거의 일어나지 않았으나 (도 18A), AAV3 벡터의 전신 투여 후에 직접적인 종양-표적화가 달성될 수 있었다. 최적화된 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터의 도입 효율 (도 18C)은, 다시 한번, WT AAV3 벡터의 도입 효율보다 유의하게 더 높았다 (도 18B). 이들 데이터는 관찰된 티로신-돌연변이체 AAV3 벡터의 도입 효율의 증가가 바이러스 투여 경로와는 무관하다는 것을 시사한다.
HGFR은 트랜스-막 수용체 티로신 키나제이며, 그의 리간드인 HGF의 결합은 세포내 도메인에서 상기 수용체의 이량체화 및 다중 티로신 잔기의 분자간 인산 전달을 가져온다. (Liu et al., 2008) AAV3 캡시드가 hHGFR의 세포외 도메인과 상호작용하는 것이 명백하지만, hHGFR에 대한 AAV3-결합이 또한 그의 활성화 및 하류 표적 단백질의 인산화를 촉발하는지 여부는 덜 명백하다. 데이터들은 실제로,hHGFR-PTK 활성에 대한 저해가 AAV3 벡터-매개 트랜스진 발현의 약간의 증가를 초래한다는 것을 입증한다. 이러한 맥락에서, AAV3 벡터의 도입 효율이 거의 30년 전에 확립된 HB 세포주인 Huh6에서와 비교하여 보다 최근에 확립된 인간 간모세포종 (HB) 세포주인 Hep293TT에서 유의하게 더 높다는 것을 주목하는 것이 흥미롭다. 두 세포주 간에 미묘한 차이가 존재할 수 있지만, 특이적 돌연변이가 Hep293TT 세포에서 hHGFR의 티로신 키나제 도메인에서 확인되었는데, 이는 그를 불활성이도록 만드는 것이며, Huh6 세포에서 도입 효율을 증대시키는 hHGFR-특이적 키나제 억제제인 BMS-777607은 Hep293TT 세포에서 AAV3 도입 효율에 대해서는 거의 효과가 없다.
AAV2 (hFGFR1) 및 AAV3 (hHGFR)에 의한 보조-수용체로서 2가지 별개의 세포 성장 인자 수용체의 이용에도 불구하고, 상기 두 혈청형은 특정 수용체 진입 후 및 세포내 트래픽킹 경로를 공유하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 두 캡시드 모두, 아마도 후기 엔도솜에서, EGFR-PTK에 의해 티로신 잔기에서 인산화되고, 이어서 유비퀴틴화되며, 이는 프로테아솜-매개 분해로 이어진다. (Zhong et al., 2008) 그러나, AAV2 내 7개 표면-노출 티로신 중 6개가 AAV3에서 보존되어 있지만, 상응하는 Y-F 돌연변이체의 거동 양식은 다소 상이하다. 예를 들어, Y730F (AAV2의 경우) 및 Y731F (AAV3의 경우)가 가장 효율적인 단일-돌연변이체이며, 이어서 Y444F (AAV2의 경우), 및 Y705F (AAV3의 경우)이고, Y444F (AAV3의 경우)의 도입 효율은 변화가 없다. 유사하게, Y730+444F 이중-돌연변이체 (AAV2의 경우)의 도입 효율은 Y730F의 도입 효율과 유의하게 상이한 반면, Y705+731F 이중-돌연변이체 (AAV3의 경우)의 도입 효율은 Y731F보다 유의하게 더 높다. 추가로, Y730+500+444F 삼중-돌연변이체 (AAV2의 경우)가 가장 효율적이며, Y731+501+705F 삼중-돌연변이체 (AAV3의 경우)가 가장 효율적이고, Y501 잔기는 WT AAV3 캡시드에서 이미 돌연변이되어 있다. 흥미로운 것은, 심지어 WT AAV3 벡터가 종양내 주사 후에 생체내 마우스 이종이식편 모델에서 합당하게 충분히 인간 간 종양을 도입시킬 수 있었다는 것이다. 그러나, 티로신-돌연변이체 벡터가 생체내에서 더 높은 유전자 전달 효율을 초래하였다는 증거가 입증되었다.
인간 간암, 특히 간세포 암종 (HCC)은 가장 공격적인 악성 종양 중 하나이다. HCC에 있어 생존의 가장 주요한 장애물은 HCC 절제 후의 재발이다 (Tang, 2005). 따라서, 상기 종양을 완전히 제거하기 위해서는 100%의 표적 세포의 도입이 바람직하다. 이전의 연구에서, 벌 독에서 유래한 독성 펩티드인 멜리틴이 Rac1-의존적 경로의 저해 (Liu et al., 2008) 및 미토콘드리아 막 단백질 7A6의 상향조절 (Zhang et al., 2007)를 통해 시험관내 및 생체내 둘 다에서 HCC 세포의 생존율 및 운동성을 억제하는 것으로 관찰되었다. 멜리틴은 잠재적으로 CaMKII/TAK1/JNK/p38 신호전달 경로의 활성화에 의해 HCC 세포의 세포자멸을 유도하는 것으로 나타났다 (Wang et al., 2009).
간암 세포-특이적 프로모터에 의해 구동되는 멜리틴 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여 시험관내 및 생체내 둘 다에서 간암 세포의 특이적 사멸을 달성한 이전의 연구에 기초하여 (Ling et al., 2005), 이 예는 원발성 및 전이성 간암 둘 다를 선택적으로 표적으로 하도록 사용될 수 있는 간암 세포-특이적 프로모터의 제어하에 최적화된 티로신-돌연변이체 AAV3-멜리틴 벡터를 제공한다.
실시예 4 - 캡시드-변형된 재조합 AAV2 벡터에 의한 인간 단핵구-유래 수지상 세포의 고-효율 도입
수지상 세포 (DC)는 항원-제시 세포 (APC)로서, 후천성 면역 반응의 조절에서 결정적인 역할을 한다. DC는 독특한 APC이며, "전문적인" APC로 지칭되어 왔는데, 그 이유는 DC의 주요 기능이 항원을 제시하는 것이며, 또한 DC만이 유일하게 휴지 중인 나이브 T 림프구에서 1차 면역 반응을 유도하는 능력을 갖기 때문이다. (Banchereau and Steinman, 1998) 천연 발생 항종양 면역 반응이 환자에서 검출가능하지만, 이 반응은 종양 성장을 제어하는 데는 실패한다. 한편, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 인터류킨 4 (IL-4)의 존재 하에서 생체외 생성된 단핵구-유래 DC (moDC)는 내인성 항원 발현 후에 항원-특이적 T-세포를 자극하는 능력을 보유한다. (Chapuis et al., 1997; den Brok et al., 2005) 이러한 이유로, 유전자-변형된 DC가 광범위하게 연구되어 왔고, 암 환자에서 DC의 효능을 평가하는 수많은 I상 및 II상 임상 시험이 개시되었다. (Figdor et al., 2004; Palucka et al., 2011) 그러나, DC 적재를 위한 현재의 방법은 세포 생존율, 항원 제시의 장기 지속성에 대한 불확실성, 및 환자의 반수체형에 의한 제한의 측면에서 부적절하다. (Palucka et al., 2011)
생물공학 기술에 의해 바이러스 게놈을 조작할 수 있는 가능성은 최근의 많은 종양-관련 항원 (TAA)의 규명과 더불어, 환자에서 보호성 항종양 면역 반응을 유도할 것을 기대하여 재조합 바이러스를 사용하여 TAA를 발현하는 것에 대한 관심을 촉발시켰다. (Liu, 2010; Robert-Guroff, 2007) 유전자 전달에 대한 상이한 방법 중에, 인간 파보바이러스인 아데노-관련 바이러스 혈청형 2 (AAV2)에 기반한 벡터가 많은 관심을 끌었는데, 그 이유는 주로 상기 바이러스의 비-병원성 성질, 및 장기간의 지속적인 치료 유전자 발현을 매개할 수 있는 그의 능력 때문이다. (Daya and Berns, 2008; Mueller and Flotte, 2008; Srivastava, 2008) 통상 사용되는 AAV 벡터의 혈청형 중 상이한 것에 의한 DC의 상이한 하위세트의 성공적인 도입이 입증되었고, AAV-기반 항종양 백신의 잠재적인 이점이 논의되었다. (Pannazhagan et al., 2001; Veron et al., 2007; Mahadevan et al., 2007; Shin et al., 2008; Taylor and Ussher, 2010) 그러나, 항종양 백신으로서 사용될 때 유의한 영향을 달성하기 위해 특이성 및 도입 효율 측면에서 재조합 AAV 벡터에 의한 DC로의 유전자 전달의 추가 개선이 타당하게 인정된다.
세포성 표피 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 (EGFR-PTK)는, 주로 표면 티로신 잔기에서 캡시드의 인산화에 기인하여, 재조합 AAV2 벡터에 의한 핵 수송 및 후속적인 트랜스진 발현에 부정적인 영향을 끼친다. (Zhong et al., 2007) 이들 연구는 야생형 (WT) 벡터와 비교하여 다양한 세포 및 조직을 고-효율로 및 보다 낮은 용량으로 도입시키는, 표면 노출된 티로신 잔기에서 점 돌연변이를 함유하는 차세대 재조합 AAV2 벡터의 개발을 가져왔다. (Zhong et al., 2008) 그러나, 이러한 단일 또는 다중 티로신-돌연변이체 AAV 벡터는 단핵구-유래 DC (moDC)의 도입 효율을 2배 초과로 증가시키는 데는 실패했는데, 가장 가능성 높은 이유는 HeLa 세포 또는 간세포에서와 비교하여 보다 낮은 수준의 EGFR-PTK의 발현 및/또는 활성때문인 것으로 보인다. (Taylor and Ussher, 2010)
세린/트레오닌 단백질 키나제는 광범위하게 다양한 세포 과정, 예컨대 분화, 전사 조절 및 면역 세포를 비롯한 많은 세포 유형의 발생에 관여한다. 또한, 이러한 키나제는 바이러스 캡시드 상의 표면-노출 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 인산화에 의해 재조합 AAV 벡터-매개 유전자 전달의 효율을 음성적으로 조절하며, 프로테아솜-매개 분해를 위한 벡터를 표적화한다. 본 실시예에서, 하기가 입증되었다: (i) AAV2 캡시드 상의 15개의 표면-노출 세린 (S) 잔기의 발린 (V) 잔기로의 부위-지정 돌연변이유발은 WT AAV2 벡터와 비교하여 S458V, S492V 및 S662V 돌연변이체 벡터의 개선된 형질도입 효율을 유발한다; (ii) S662V 돌연변이체 벡터는 통상적인 AAV 벡터에 의해 쉽게 형질도입 가능하지 않은 세포 유형인 인간 단핵구-유래 수지상 세포 (moDC)에 효율적으로 형질도입된다; (iii) S662V 돌연변이체에 의한 moDC의 고-효율 형질도입은 이들 세포에서의 임의의 표현형 변화를 유도하지 않는다; 및 (iv) 형질도입된 DC에 사용되는 말단절단형 인간 텔로머라제 (hTERT) 유전자를 코딩하는 재조합 S662V-벡터는 신속하고 특이적인 T-세포 클론 증식 및 견고한 CTL의 생성을 유발하며, 이는 K562 세포의 특이적 세포 용해를 유발한다.
재료 및 방법
세포 및 항체. HEK293, HeLa 및 NIH3T3 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻고, 10% FBS (Sigma) 및 항생제 (Lonza) 보충된 DMEM (Invitrogen)에서 단층 배양으로서 유지하였다. 백혈구성분채집술(Leukapheresis)-유래 말초혈 단핵 세포 (PBMC) (AllCells)를 피콜-패크(Ficoll-Paque; GEHeathCare) 상에서 정제하고, 혈청 무함유 AIM-V 배지 (Lonza) 중에 재현탁시키고, 반-부착성 세포 분획을 재조합 인간 IL-4 (500 U/mL) 및 GM-CSF (800 U/mL) (R&D 시스템)와 함께 7일 동안 인큐베이션하였다. 48시간 동안 10 ng/mL TNF-α, 10 ng/mL IL-1, 10 ng/mL IL-6 및 1 mg/mL PGE2 (R&D 시스템)를 포함하는 시토카인 혼합물로 세포 성숙이 개시되었다. EGFP 발현 이전에, 세포를 공동-자극성 분자 발현에 대하여 특징분석하여, 이들이 성숙 수지상 세포 (mDC)의 전형적인 표현형 (CD80, RPE, 뮤린 IgG1; CD83, RPE, 뮤린 IgG1; CD86, FITC, 뮤린 IgG1; Invitrogen)을 충족한다는 것을 보장하였다 (Jayandharan et al., 2011).
부위-지정 돌연변이유발. 2-단계 PCR을 터보 푸(Turbo Pfu) 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 이전에 기재된 것과 같이 플라스미드 pACG2로 수행하였다 (Wang 및 Malcolm, 1999). 간략하게 설명하면, 단계 1에서, 2개의 PCR 신장 반응을 3 사이클 동안 정방향 및 역방향 PCR 프라이머에 대하여 별도의 튜브에서 수행하였다. 단계 2에서, 2개 반응물을 혼합하고, PCR 반응을 추가 15 사이클 동안 수행하고, 이어서 1시간 동안 DpnI 소화시켰다. 프라이머를 돌연변이된 잔기 각각에 대하여 세린 (TCA 또는 AGC)으로부터 발린 (GTA 또는 GTC)으로의 변화를 도입하기 위하여 디자인하였다.
재조합 AAV 벡터의 생성. 닭 β-액틴 프로모터에 의해 구동되는 EGFP 유전자를 함유하는 재조합 AAV2 벡터를 이전에 기재된 것과 같이 생성하였다 (Zologukhin et al., 2002). 간략하게 설명하면, HEK293 세포를 폴리에틸렌이민 (PEI, 선형, MW 25,000, Polyscinces, Inc.)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에, 세포를 수확하고, 벡터를 아이오딕사놀(iodixanol; Sigma) 구배 원심분리 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (HiTrap Sp Hp 5 mL, GE Healthcare)에 의해 정제하였다. 이후, 바이러스를 농축시키고, 원심 스핀 농축기(centrifugal spin concentrators; Apollo, 150-kDa 컷-오프, 20-mL 용량, CLP)를 사용하여 완충제를 락테이트 링거 용액과 3 사이클 교환하였다 (Cheng et al., 2011). 10 μL의 정제된 바이러스를 37℃에서 2시간 동안 DNAse I (Invitrogen)로 처리하고, 56℃에서 추가의 2시간 동안 프로테이나제 K (Invitrogen)로 처리하였다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 정제하고, 이어서 클로로포름 처리하였다. 패키징된 DNA를 20 μg 글리코겐 (Invitrogen)의 존재 하에 에탄올로 침전시켰다. DNAse I-내성 AAV 입자 역가를 CBA 프로모터에 특이적인 하기 프라이머-쌍으로 RT-PCR에 의해 결정하였다:
정방향 5′ TCCCATAGTAACGCCAATAGG 3′ (서열 18),
역방향 5′ CTTGGCATATGATACACTTGATG 3′ (서열 19)
및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (SYBR GreenER PCR Master Mix; Invitrogen) (Aslanidi et al., 2009).
시험관내 재조합 AAV 벡터 형질도입 검정. HEK293 또는 단핵구-유래 수지상 세포 (moDC)가 각각 1,000 vgs/세포 또는 2,000 vgs/세포를 갖는 AAV2 벡터로 형질도입되고, 이를 48시간 동안 인큐베이션하였다. 대안적으로, 형질도입 1시간 전에 세포를 50 μM의 선택적 세린/트레오닌 키나제 억제제 2-(2-히드록시에틸아미노)-6-아미노헥실카르밤산 tert-부틸 에스테르-9-이소프로필퓨린 (CaMK-II), 안트라[1,9-cd]피라졸-6(2H)-온, 1,9-피라졸로안트론 (JNK) 및 4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸 (MAPK) (CK59, JNK 억제제 2, PD 98059, Calbiochem)로 예비처리하였다. 트랜스진 발현을 이전에 기재된 바와 같이 시야 당 녹색 형광 (pixel2)의 총 구역 (평균±SD)으로서 평가하였다 (Markusic et al., 2011; Jayandharan et al., 2011). 분산의 분석을 사용하여 시험 결과 및 대조군을 비교하였으며, 이를 통계적으로 유의한 것으로 결정하였다.
웨스턴 블럿 분석. 웨스턴 블럿 분석을 이전에 기재된 것과 같이 수행하였다 (Akache et al., 2006). 세포를 원심분리에 의해 수확하고, PBS로 세척하고, 프로테아제 및 포스포타아제 억제제 혼합물 (세트 2 및 3, Calbiochem)이 보충된 50 mM TrisHCl, pH 7.5, 120 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 10 mM Na4P2O7, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오린화물 (PMSF), 1 mM EDTA 및 1 mM EGTA를 함유하는 용해 완충제 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 4℃에서 14,000 rpm으로 30분 동안 원심분리에 의해 정화하였다(clarify). 단백질 농도에 대한 표준화에 이어서, 샘플을 12% 폴리아크릴아미드/SDS 전기영동을 사용하여 분리시키고, 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 1차 항체, 항 p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 토끼 mAb, 총 p38 MAPK 토끼 mAb 및 GAPDH 토끼 mAb (1:1000, 세포신호전달), 이어서 2차 양고추냉이 퍼옥시다제-결합 결합된 항체 (1:1000, 세포신호전달)로 프로빙하였다.
특이적 세포독성 T-림프구 생성 및 세포독성 검정. 단핵구-유래 수지상 세포 (moDC)를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 미성숙 DC를 인간 텔로머라제 cDNA를 코딩하는 AAV2-S662V 벡터로 감염시키고, MOI 2,000 vgs/각 세포에서 2개의 중첩하는 ORF - hTERT838-2229 및 hTERT2042-3454로 분리하였다. 이어서, 세포를 보충물로 자극하도록 하여 성숙을 유도하였다. 48시간 이후에, hTERT를 발현하는 성숙 DC를 수확하고, 20:1의 비율로 PBMC와 혼합하였다. CTL을 25 cm2 플라스크 내의 20×106 세포에서 재조합 인간 IL-15 (20 IU/mL) 및 IL-7 (20 ng/mL)을 함유하는 AIM-V 배지에서 배양하였다. 신선한 시토카인을 2일마다 첨가하였다. 프라이밍 후 7일 이후에, 세포를 수확하고, 사멸 검정을 위해 사용하였다 (Heiser et al., 2002). 사멸 곡선을 생성하고, 특이적 세포 용해를 이전에 기재된 것과 같이 생존/사멸 세포 비율의 FACS 분석에 의해 결정하였다 (Mattis et al., 1997). 인간 불멸화 골수성 백혈병 세포주, K562를 표적으로서 사용하였다.
통계적 분석. 결과를 평균±S.D로서 제시한다. 군 간의 차이를 스튜던츠 T-검정의 그룹화된 독립표본 양측 분포를 사용하여 확인하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
결과
특이적 세포 세린/트레오닌 키나제의 억제는 rAAV2 벡터의 형질도입 효율을 증가시킨다. 이전의 연구에서, 7개의 표면-노출 티로신 잔기의 세포 표피 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 (EGFR-PTK) 활성 및 부위-지정 돌연변이유발의 억제는 이들 잔기의 인산화의 방지에 의해 AAV2 벡터의 도입 효율을 유의하게 증가시키며, 이에 의해 벡터의 유비퀴틴화 및 후속적인 프로테아솜-매개 분해를 회피하는 것으로 나타났다 (Zhong et al., 2008). 그러나, AAV2 캡시드는 또한 15개의 표면-노출 세린 잔기를 함유하며, 이는 다양한 세포 유형 및 조직에서 광범위하게 발현되는 세포 세린/트레오닌 키나제에 의해 잠재적으로 인산화될 수 있다. 이러한 키나제 활성의 억제가 표면-노출 세린 잔기의 인산화를 방지하며, 따라서 AAV2 벡터의 세포내 트래픽킹 및 핵 수송을 개선시킬 수 있다는 가설을 시험하기 위하여, 칼모둘린-의존적 단백질 키나제 II (CamK-II), c-Jun N-말단 키나제 (JNK) 및 유사분열촉진인자-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK)를 비롯한 여러 시판되는 세포 세린/트레오닌 키나제의 특이적 억제제를 사용하였다. HEK293 세포를 다양한 농도에서 1시간 동안 특이적 억제제, 예컨대 2-(2-히드록시에틸아미노)-6-아미노헥실카르밤산 tert-부틸 에스테르-9-이소프로필퓨린 (CaMK-II), 안트라[1,9-cd]피라졸-6(2H)-온, 1,9-피라졸로안트론 (JNK) 및 4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸 (p38 MAPK)로 예비-처리하였다. 후속적으로, 세포가 세포 당 1,000 벡터 게놈 (vgs)의 단일 가닥 (ss) 또는 자가-상보적 (sc) AAV2 벡터 중 하나로 형질도입되었다. 이러한 결과는 50 μM의 최적의 농도에서 모든 억제제가 ssAAV2 및 scAAV2 벡터의 형질도입 효율을 유의하게 증가시켰으며, p38 MAPK 억제제가 가장 효과적임을 나타내었다 (도 19A 및 19B). 이러한 관찰은 비록 입증된 것은 아니지만 형질도입 효율의 증가가 개선된 바이러스 제2-가닥 DNA 합성보다는 벡터 캡시드의 인산화의 방지로 인한 것일 가능성이 매우 높다는 것을 시사한다.
AAV2 캡시드 상의 표면-노출 세린 잔기의 부위-지정 돌연변이유발은 AAV2 벡터-매개 트랜스진 발현을 개선시킨다. AAV2 캡시드는 3개의 캡시드 바이러스 단백질 (VP)의 VP3 공통 영역에 50개의 세린 (S) 잔기를 함유하며, 이중 15개 (S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, S721)는 표면-노출되어 있다 (Xie et al., 2002). 각각의 15개의 S 잔기는 기재된 것과 같이 부위-지정 돌연변이유발에 의해 발린 (V)으로 치환되었다 (Zhong et al., 2008). 대부분의 돌연변이체는 S261V, S276V 및 S658V (이들은 대략 10배 낮은 역가에서 생성됨), 및 S267V 및 S668V (이들은 검출가능하지 않은 수준의 DNAse Ι-내성 벡터 입자를 생성함)를 제외하고는 WT AAV2 벡터와 유사한 역가에서 생성될 수 있다. S468V 및 S384V 돌연변이체의 역가는 WT AAV2 벡터에 비해 대략 3-5배 높았다. 각각의 S-V 돌연변이체 벡터를 HEK293 세포에서의 형질도입 효율에 대하여 평가하였다. 도 20에서 나타난 이러한 결과는 형질도입된 15개의 돌연변이체 중 S662V 돌연변이체가 WT 대응부에 비해 대략 20배 더 효율적으로 HEK293 세포에 형질도입되었음을 나타낸다. S458V 및 S492V 돌연변이체 벡터의 형질도입 효율은 각각 대략 4배 및 2배 증가되었다. AAV2 캡시드 상의 이들 3개의 중요한 표면 노출된 세린 잔기의 위치는 도 21A 및 21B에 나타나 있다. 형질도입 효율에서의 추가의 증가가 없음이 이중-돌연변이체 (S458+662V 및 S492+662V) 또는 삼중-돌연변이체 (S458+492+662V)에서 관찰되어, 티로신-돌연변이체 중의 일부와는 달리, 세린 잔기에서의 다중 돌연변이의 조합은 상가작용 또는 상승작용 둘 다 아니었음을 나타낸다. 흥미롭게도, WT AAV2 벡터에 비해 높은 역가에서 생성되는 S468V 및 S384V 돌연변이체의 형질도입 효율은 동일 감염 다중도 (MOI)에서 변화가 없거나 (S468V) 또는 대략 10배 감소되었다 (S384V). 이들 데이터는 도 34에 요약되어 있다.
상이한 아미노산으로의 S662의 치환은 AAV2 캡시드 조립 및 AAV2 벡터-매개 트랜스진 발현에 대한 다양한 효과를 갖는다. 위치 662에서의 S→V 치환 이외에, 상이한 아미노산으로의 하기 7가지 돌연변이체 또한 생성하였으며 (S662→알라닌 (A), S662→아스파라진 (N), S662→아스파르트산 (D), S662→히스티딘 (H), S662→이소류신 (I), S662→류신 (L) 및 S662→페닐알라닌 (F)), 293개 세포에서의 그의 형질도입 효율을 평가하였다. 도 22에서 나타나 있으며 도 35에 요약되어 있는 이러한 결과는 S→V 치환이 벡터 역가에서의 임의의 변화 없이 가장 효율적인 돌연변이체의 생성을 유발함을 입증한다. S→N, I, L 또는 F 대체는 형질도입 효율에 대한 유의한 효과 없이 패키징 효율을 대략 10배 감소시키는 반면, S→D 또는 H 치환은 벡터 역가에 대한 효과 없이 형질도입 효율을 각각 대략 8배 및 4배 증가시켰다. 흥미롭게도, S→A 치환은 WT AAV2 벡터와 비교하여 바이러스 역가를 최대 대략 5배 증가시켰으며, 트랜스진 발현을 대략 3배 증진시켰다. 역가에서의 관찰된 다양성(variability) 및 위치 662에서의 세린-돌연변이체의 감염성은 각각의 아미노산이 AAV2 패키징 효율 및 생물학적 활성 둘 다의 조정에서 역할을 한다는 중요한 역할을 시사한다.
S662V 벡터의 도입 효율은 p38 MAPK 활성과 상관관계가 있다. 이제까지 모든 S662V 벡터-매개 트랜스진 발현 데이터는 293 세포를 사용하여 유래되었기 때문에, 이들 연구는 하기 세포 유형들을 포함하는 것까지 확대된다: (i) NIH3T3 (마우스 배아 섬유모세포), (ii) H2.35 (마우스 태아 간세포), (iii) HeLa (인간 자궁경부암 세포), 및 (iv) 일차 인간 단핵구-유래 수지상 세포 (moDC). 이들 세포 유형들을 동일한 조건하에서 세포 당 2,000 vgs의 MOI로 WT scAAV2-EGFP 또는 S662V scAAV2-EGFP 벡터로 도입한다. EGFP 유전자 발현을 HeLa, 293 및 moDC에 대해서는 후-감염 (p.i.) 48시간째, 및 H2.35 및 NIH3T3 세포에 대해서는 p.i. 5일째 평가하였다. 이러한 결과를 도 23A에 나타낸다. 제시된 바와 같이, WT 및 S662V 돌연변이체 벡터 사이의 도입 효율의 절대적인 차이가 약 3배 (H2.35 세포에서) 내지 약 20배 (293 세포에서)의 범위에 걸쳐 있지만, 돌연변이체 벡터는 시험된 각각의 세포 유형에서 일관되게 보다 효율적이었다. 세포성 p38 MAPK의 억제제로의 세포의 전처리가 도입 효율을 증가시키는데 가장 효과적이기 때문에 (도 19A 및 도 19B), 본 발명자들은 WT 및 돌연변이체 벡터의 도입 효율에서 관찰되는 차이가 발현 수준 및/또는 세포성 p38 MAPK의 활성에서의 변동으로 인한 것인지의 여부를 조사하였다. 각각의 세포 유형으로부터 제조된 세포 용해물을 특이적 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿팅 상에서 분석하여 총 p38 MAPK 및 포스포-p38 MAPK 수준 둘 다를 검출하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 이들 결과는 도 23B에 나타낸 바와 같이, p38 MAPK 단백질 수준은 유사한 반면, 인산화 수준에 의해 측정된 키나제 활성은 상이한 세포 유형들 사이에서 유의하게 변화하였고, S662V 돌연변이체 벡터의 도입 효율은 p38 MAPK 활성과 대략 상관관계가 있음을 보여준다. p38 MAPK 활성 및 S662V 돌연변이체 벡터의 효율 사이의 이러한 대략적인 상관관계는 아마도 AAV 감염에 대한 상이한 세포 감수성, 일차 감염 후 바이러스 입자가 들어간 세포의 총수에 의해 설명될 수 있다. AAV의 생활 주기에서 어느 정확한 단계가 p38 MAPK-매개 인산화에 의해 조정되는지는 불분명하다. 또한, 다른 세린/트레오닌 키나제가 S662V 및 WT 벡터에 의한 도입의 효율의 차이에 기여할 수도 있다. 그러나, 놀랍게도, WT-AAV2 벡터에 의한 도입은 293 세포 또는 moDC에서 p38 MAPK의 인산화의 상향조절을 야기하지 않아, AAV가 moDC에서 강력한 표현형 변화를 유도하지 않는다는 종래 보고를 추가로 지지한다 (문헌 [Markusic et al., 2011]).
일차 인간 moDC의 S662V 벡터-매개 도입은 표현형 변경을 야기하지 않는다. MAPK 부류 구성원은 APC의 발생 및 성숙에서 중요한 역할을 한다. 건강한 공여자 백혈구성분채집술로부터 단리된 moDC를 상기 기재된 바와 같은 50 μM 선택적 키나제 억제제로 처리한 다음, WT scAAV2-EGFP 벡터로 도입시켰다. p.i. 2시간째, 세포를 보충물 (TNF-α, IL-1β, Il-6, PGE2)로 처리하여 성숙을 유도하였다. EGFP 트랜스진 발현을 형광 현미경검사에 의해 p.i. 48시간째 평가하였다. JNK 및 p38 MAPK의 특이적 억제제로의 moDC의 전처리는 EGFP 발현 수준을 각각 약 2배 및 약 3배 증가시켰으며, 도입 효율은 S662V 돌연변이체 벡터로 약 5배까지 증진되었다 (도 24). 이들 키나제의 억제는 이전에 수지상 세포의 성숙을 방지하는 것으로 보고되었기 때문에 (문헌 [Beisleve et al., 2005; Nakahara et al., 2006; Nakahara et al., 2004; Harley, 2008]), DC에서 표현형 변화를 유도하는 S662V 돌연변이체의 능력 또한 평가하였다. moDC를 세포 당 50,000 vgs까지 점점 높아지는 MOI로 감염시키고, p.i. 48시간에서 수확하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 공-자극성 분자의 상향조절에 대해 분석하였다. DC 성숙 마커, 예컨대 CD80, CD83 및 CD86의 유동 세포계측 분석으로부터, WT AAV2 벡터와 유사한 S662V 돌연변이체 벡터 역시 moDC의 성숙을 야기하지 않음을 알 수 있다 (도 24C). 이러한 관찰은 종래 기재된 AAV 벡터의 낮은 면역원성을 지지한다 (문헌 [Shin et al., 2008; Jayandharan et al., 2011])
AAV2-S662V 벡터로 도입된 moDC에 의한 hTERT-특이적 CTL 생성. moDC에서의 세린-돌연변이체 AAV2 벡터-매개 트랜스진 발현이 WT-AAV2 벡터와 비교하여 유의하게 개선되었기 때문에, 세포독성 T-림프구의 생성을 자극하여 표적 세포의 특이적 사멸에 영향을 미치는 S662V-로딩된 moDC의 능력을 조사하였다. 인간 텔로머라제가 대부분의 암 세포에서 공통적으로 발현되는 유일한 항암 표적 (문헌 [Harley, 2008; Beatty and Vonderheide, 2008])으로서 인식되는 것을 고려하여, 말단절단형 인간 텔로머라제 (hTERT) 유전자를 닭 β-액틴 프로모터의 제어하에 클로닝하고, DNA를 AAV2 S662V 돌연변이체 내에 패키징하였다. CD8 양성 세포를 최대 25% 함유하는 비-부착 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 S662V 벡터에 의해 전달되는 moDC/hTERT로 1회 자극시켰다. 불멸화시킨 골수성 백혈병 세포주 K562를 세포-매개 세포독성의 2색 형광 검정에 사용하여 후속적으로 감소된 표적 세포에 대한 이펙터 비를 갖는 사멸 곡선을 생성하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 이들 실험의 결과는 hTERT로 로딩된 moDC가 GFP를 발현하는 moDC와 비교하여 특이적 T 세포 클론 증식 및 사멸 활성을 효과적으로 자극할 수 있음을 시사한다. 따라서, 신속하고 효능있는 이펙터 반응을 생성하는 면역화 전략이 효과적인 면역요법에 대해 필수적이기 때문에, 이러한 결과는 예방접종 연구를 위한 AAV-기재의 전달 방법의 효능을 지지한다.
논의
특이적 항종양 세포독성 T 세포 반응을 자극하는 유전적으로 변형된 수지상 세포의 가능성이 수많은 임상 시험에서 증명되었으나, 치료적 항원 로딩, 발현 제어 및 항원 제공에 대한 신뢰성 높은 방법은 이전에는 아직 제시되지 않았다 (문헌 [O'Neill and Bhardwaj, 2007; Tacken et al., 2007]). 거의 10년 전에 통상적인 ssAAV 벡터로 수지상 세포를 도입하기 위한 제1 시도 (문헌 [Pannazhagan et al., 2001]) 이후, 이들 벡터의 도입 효율을 증가시키는데 있어서 상당한 진행이 이루어졌다. 예를 들어, 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터의 발생은 바이러스 제2 가닥 DNA 합성의 주요 속도 제한 단계를 무력화시키며, 이는 상이한 하위세트의 수지상 세포의 트랜스진 발현 수준을 급격하게 증가시킨다 (문헌 [Shin et al., 2008; Aldrich et al., 2006; Wang et al., 2003]). 수지상 세포로의 AAV 벡터-기재의 항원 전달은 다수의 암 모델에 성공적으로 이용되고 있다 (문헌 [Mahadevan et al., 2007; Eisold et al., 2007; Yu et al., 2008]).
AAV 구조적 및 조절성 바이러스 성분의 천연 유연성은 빠른 분자 진화 및 수많은 혈청학적으로 명백한 혈청형의 형성을 촉진시킨다 (문헌 [Gao et al., 2003; Vandenberghe et al., 2009; Wu et al., 2006]). 수많은 연구는 이러한 AAV의 가소성을 이용하여 상이한 세포 및 조직 친화성을 갖는 신규 벡터를 생성할 수 있다는 것을 보여준다 (문헌 [Wu et al., 2000; Girod et al., 1999]). 다른 연구들은 바이러스 캡시드 상에서의 단일 아미노산의 치환이 바이러스 역가, 세포성 수용체와의 상호작용, 조직-친화성, 및 엔도솜으로부터 핵소체로의 트래픽킹에 강력하게 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다 (문헌 [Zhong et al., 2008; Wu et al., 2006]). 우(Wu) 등 (2006)은 AAV6 캡시드 상의 위치 531에서의 리신의 글루타민으로의 대체 (K531E)가 생체내 마우스 간세포로의 유전자 전달 및 헤파린에 대한 친화도를 감소시킨다는 것을 보고하였다. AAV1 캡시드 상의 역 돌연변이 (E531K)는 간 도입을 증가시키고, 헤파린 결합을 부여한다.
AAV2 혈청형 벡터 데이터는 티로신의 페닐알라닌으로의 단일 치환 (Y→F)이 캡시드 인산화의 방지, 후속적인 유비퀴틴화 및 프로테아솜에 의한 분해에 의해 엔도솜으로부터 핵소체로의 바이러스 트래픽킹을 현저히 개선시키는 것을 보여준다 (문헌 [Zhong et al., 2008]). 이들 연구로 인해 상이한 세포 유형 및 조직에서 도입 효율이 증가된 수많은 벡터가 생성되었다. 이러한 벡터를 사용하여 혈우병 B의 표현형 보정을 위한 뮤린 간세포로의 F.IX 유전자 전달을 개선시킨다 (문헌 [Markusic et al., 2011]). 이들 티로신-돌연변이체 AAV 벡터는 또한 안구 질환의 잠재적인 치료를 위한 마우스 망막의 높은 도입 효율을 야기한다 (문헌 [Petrs-Zilva et al., 2009]). 비록 AAV6 혈청형이 수지상 세포에서의 AAV2보다 높은 도입 효율을 나타내지만 (문헌 [Veron et al., 2007; Taylor and Ussher, 2010]), 이들 벡터는 기초 연구 및 임상적 세팅 둘 다에서 보다 광범위하게 연구되기 때문에 이들 연구는 AAV2에 중점을 두고 있으나, AAV6 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 유사한 전략으로 개발될 수 있다.
AAV2 캡시드 상에서의 표면-노출 티로신-잔기의 인산화는 이들 벡터의 도입 효율에 부정적인 영향을 주며, 이는 상기 잔기를 인산화하는 것으로 공지된 세포성 EGFR-PTK의 특이적 억제제를 사용함으로써 현저하게 증가될 수 있다는 것이 분명히 명확하게 밝혀졌다 (문헌 [Zhong et al., 2008]). 제공된 예에서, AAV2 벡터의 생활 주기에서 세린 잔기의 인산화의 역할은 보다 충분히 설명되었다.
실제로, ssAAV 및 scAAV 벡터의 도입 효율은 JNK 및 p38 MAPK의 특이적 억제제로의 세포의 전처리에 의해 증가될 수 있으며, 이는 AAV2 캡시드 상에서의 1개 이상의 표면-노출 세린 및/트레오닌 잔기가 숙주 세포 내부에서 인산화되고 이러한 변형은 핵으로의 캡시드 트래픽킹에 유해하다는 것을 내포한다.
다음으로, 15개 각각의 표면-노출 세린 잔기를 개별적으로 돌연변이시켰으나, 이들 돌연변이 중 단지 3개만이 약 2배 내지 약 20배의 범위로 상이한 세포 유형에서 도입 효율을 증가시켰다. 그러나, 티로신-돌연변이체 (문헌 [Markusic et al., 2011])와는 달리, 복수 돌연변이의 조합은 시험관내 이중-돌연변이체 (S458+662V 및 S492+662V) 또는 삼중-돌연변이체 (S458+492+662V) AAV2 벡터의 도입 효율을 증가시키지 않는다. 이러한 맥락에서, 디프리미오(DiPrimio) 등에 의한 보고서에서 (문헌 [DiPrimio et al., 2008]), 보존된 코어 β-배럴의 H와 I 가닥 사이에 위치하고 잔기 S662를 함유하는 HI 루프를 특성화하고, 부위-지정 돌연변이유발 및 펩티드 치환 둘 다로부터 제시된 이 캡시드 영역이 AAV 캡시드 조립 및 바이러스 게놈 패키징 (도 22A 및 도 22B)에서 중대한 역할을 한다는 것은 주목할 만한 것이었다 (문헌 [Xie et al., 2002]). S662 잔기는 상기 연구에서 특이적으로 표적화되지 않았으나, 이들 돌연변이체 대부분의 도입 효율은 변화되지 않거나, 또는 최대 27배까지 감소되었다. 정이십면체의 5중 대칭 관련된 VP 사이의 상호작용을 형성하고, 상기 축 주위의 움푹한 곳의 바닥에 위치한 HI 루프는 또한 정이십면체의 5중 축에 위치한 채널을 개방시켜 AAV2에 의한 헤파린 결합이 일어나도록 입체적 재배열되어 있는 것으로 제시된다 (문헌 [Levy et al., 2009]). 잔기 S458 및 492는 2중 축에서의 움푹한 곳에 대면한 (정이십면체의 3중 축을 둘러싼) 돌출부의 외표면 상에 서로 인접하도록 위치한다 (대칭 관련 VP의 원인이 됨). S458A, S492A 및 S492T에 인접한 잔기의 이전 돌연변이는 캡시드 조립에 영향을 미치지 않으며, 그 결과 특정 아미노산이 패키징 효율 및 AAV의 생물학적 활성에서 갖는 중대한 역할을 확인하는 도입 효율에 대한 효과가 없었다 (문헌 [Lochrie et al., 2006]). 이들 데이터의 추가의 구조적 분석으로 하기를 밝혀냈다: 수율이 낮은 3개의 돌연변이체에 대해, 잔기의 측쇄가 동일 VP 단량체로부터의 주쇄 원자와 상호작용하고, 낮은 역가를 갖는 S267V는 동일 단량체로부터의 D269와 상호작용한다. HI 루프에 위치하고 캡시드 조립에서 역할을 하는 것으로 제시된 (문헌 [DiPrimio et al., 2008]) 또 다른 캡시드 돌연변이체 S668V에 대해, 치환으로 상호작용의 분명한 파괴는 관찰되지 않았다. 놀랍게도, 모든 이들 잔기는 조립 표현형에 상관없이 계면 위치에 있으나, 458 및 492만이 VP 사이의 상호작용에 관여한다. 다른 잔기들은 있다해도 VP 내 상호작용에만 관여한다. 따라서, 캡시드가 없거나 또는 낮은 캡시드 생산 돌연변이체에서의 변화는 그들의 VP에 대해 미스폴딩 또는 알라닌으로 변화되는 경우 조립에 대해 요구되는 다량체 형태의 형성의 파기를 야기한다.
종양 면역요법의 세팅에 있어서, T 세포 활성화 시간, 및 CD8 T 세포 반응의 효력 및 수명은 치료 성과를 결정하는 중대한 인자이다. 따라서, 투자자는 T 세포의 보다 우수한 초회감작과 상관관계가 있는 세린-돌연변이체 AAV2 벡터에 의한 moDC의 도입 효율의 증가 여부를 추가로 평가하였다. 인간 텔로머라제는 수많은 연구 및 임상 시험에 있어서 많은 암 환자에 널리 발현된 거부 항원의 주목받는 후보로 나타났기 때문에 인간 텔로머라제는 특이적 표적으로 사용되었다 (문헌 [Harley, 2008; Beatty and Vonderheide, 2008]). 이러한 결과는 AAV2 캡시드의 변형이 유전자 전달을 위한 보다 특이적이고 효과적인 벡터 생산의 관점에서 유익할 수 있다는 점을 제시한다.
주요 방해물 중 하나인 벡터-유래 및 이식 유전자-유래 에피토프에 대한 세포적 면역 반응에서의 면역-경쟁의 유도가 복제-결핍, 및 재조합 AAV2에 의해 발현된 바이러스 단백질의 부족에 의해 아마도 극복될 수 있는 것, 및 또한 변형된 바이러스 입자의 더 적은 캡시드가 숙주 프로테오솜에 의해 분해되고 따라서 표현을 위한 물질의 제공이 적어질 것이란 것 또한 중요하다.
실시예 5 -- RAAV2 벡터의 캡시드의 최적화
아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터는 치료적 유전자의 지속적인 발현을 달성하기 위해 다양한 조직을 표적으로 하는 전달 비히클로서 현재 수많은 I/II상 임상 시험에서 사용되고 있다 (문헌 [Daya and Berns 2008; Mueller and Flotte 2008; Srivastava 2008; Asokan et　al., 2012; Flotte et　al., 2012]). 그러나, 치료학적 이점을 달성하기 위해서는 더 큰 벡터 용량이 필요하다. 충분량의 벡터 요건은 제조상의 도전과제뿐 아니라 벡터에 대한 숙주 면역 반응의 개시 위험을 제기한다 (문헌 [High and Aubourg, 2011; Mendell et　al., 2012, Mingozzi and High, 2011]). 보다 구체적으로, AAV2 혈청형에 기재한 재조합 벡터는 초기에는 혈우병 B의 잠재적인 유전자 요법을 위한 임상 시험에 사용되었지만, 이 시험에서, 낮은 벡터 용량에서는 인간 인자 IX (hF.IX)의 치료적 수준의 발현이 달성되지 않았고, 높은 벡터 용량에서는 AAV2 캡시드에 대한 세포독성 T 세포 (CTL) 반응때문에 hF.IX의 치료적 수준의 발현은 수명이 짧았다 (문헌 [Manno et　al., 2006; Mingozzi and High, 2007; Mingozzi et　al., 2007])
AAV8 혈청형에 기재한 재조합 벡터를 사용한 보다 최근의 시험에서는, hF.IX의 치료적 수준의 발현은 달성되었지만, AAV8 캡시드 단백질의 면역 반응이 관찰되었다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012]). 따라서, 높은 도입 효율을 가지면서 더 낮은 용량으로 사용할 수 있는 신규 AAV 벡터를 개발하는 것은 중대하다. 세포적 표피 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 (EGFR-PTK)는, 주로 티로신 잔기에서의 AAV2 캡시드의 인산화로 인해 재조합 AAV2 벡터로부터의 이식 유전자의 발현에 악영향을 주며, 이어서 티로신-인산화된 캡시드가 숙주 프로테아솜 기구에 의해 분해된다 (문헌 [Zhong et al., 2008; Markusic et al., 2010]). JNK 및 p38 MAPK 세린/트레오닌 키나제의 선택적 억제제 또한 AAV2 벡터의 도입 효율을 개선하며, 이는 특정 표면-노출 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 인산화가 또한 이들 벡터의 도입 효율을 저하시킴을 제시한다. 이들 연구는 티로신- 및 세린-돌연변이체 AAV2 벡터의 개발을 유도하였으며, 이는 WT 벡터보다 상당히 높은 효율로 다양한 세포 유형을 도입하는 것으로 알려졌다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Zhong et al., 2008; Markusic et al., 2010; Petrs-Silva et al., 2009]). 티로신 및 세린 잔기 이외에, 부위-지정 돌연변이유발에 의한 표면-노출 트레오닌 잔기의 제거는 더 낮은 벡터 용량에서의 도입 효율을 증가시켰다. 본 실시예에서, 17개의 표면-노출 트레오닌 잔기 각각은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 발린 (V) 잔기로 치환되었고, 이들 돌연변이체 중 4개, T455V, T491V, T550V, T659V는 인간 HEK293 세포에서의 도입 효율이 약 2 내지 4배 증가한 것으로 나타났다. 티로신 삼중-돌연변이체 (Y730F+500+444F) 벡터는 WT보다 가장 효율적으로 뮤린 간세포를 도입하므로 (문헌 [Aslanidi et　al., 2012; Zhong et　al., 2008; Markusic et　al., 2010; Petrs-Silva et　al., 2009]), 이들 돌연변이체는 이어서 최고 성능의 단일 세린-돌연변이체 (S662V) 및 단일 트레오닌-돌연변이체 (T491V)와 결합하여 다음 벡터들을 생성한다: 2개의 4중조(quadruple) (Y444+500+730F+S662V; Y730+500+44F+T491V) 및 1개의 5중조(quintuple) (Y444+500+730F+S662V+T491V). 4중-돌연변이체 (Y444+500+730F+T491V) 벡터는 감소된 용량으로 뮤린 간세포 세포주를 시험관내 및 또한 주요 뮤린 간세포를 생체내에 효율적으로 도입하며, 이는 일반적으로 인간 유전자 요법 및 특히 혈우병에서 이들 벡터의 용도를 시사하였다.
재료 및 방법
세포. 인간 배아 신장 세포주, HEK293, 및 뮤린 간세포 세포주, H2.35, 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 얻었으며, 10% 태아 소 혈청 (FBS; 시그마) 및 항생제 (론자)가 보충된 DMEM (인비트로젠)에서 단층 배양물로 유지하였다.
재조합 벡터의 생성. 닭 β-액틴 프로모터 (CBA)에 의해 구동된 EGFP (scAAV2-GFP) 또는 파이어플라이 (firefly) 루시퍼라제 유전자 (Fluc) (ssAAV2-Fluc)를 함유하는 재조합 AAV2 벡터는 상술한 바와 같이 생성되었다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Aslanidi et al., 2009; Zolotukhin et al., 2002; Kohlbrenner et al., 2005]). 간략하게 설명하면, HEK293 세포를 폴리에틸렌이민 (PEI, 선형, MW 25,000, 폴리사이언즈, 인크. (Polysciences, Inc.))을 사용하여 형질감염시켰다. 72시간의 후-형질감염 후, 세포를 수확하고, 벡터를 아이오디사놀(iodixanol) (시그마) 구배 원심분리 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (하이트랩 (HiTrap) Sp Hp 5 mL, GE 헬스케어 (GE Healthcare))로 정제하였다. 이어서, 바이러스를 농축하고, 원심 회전 농축기 (아폴로 (Apollo), 150-kDa 컷-오프, 20-mL 용량, CLP)를 사용하여 3 사이클 동안 완충제를 락테이트화 링거액으로 교환하였다. 게놈 역가를 결정하기 위해, 정제된 바이러스 10 μl를 디나제 (DNase) I (인비트로젠)로 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 프로테이나제 K (인비트로젠)로 55 ℃에서 추가의 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 정제하고, 이어서 클로로포름 추출하였다. 패키지 DNA를 20 μg 글리코겐 (인비트로젠)의 존재 하에 에탄올로 O/N 침전하였다. 디나제 I-내성 AAV2 입자 역가는 CBA 프로모터에 특이적인 다음의 프라이머-쌍을 사용한 qPCR에 의해 결정되었다:
정방향(Forward): 5'-TCCCATAGTAACGCCAATAGG-3' (서열 20),
역방향(Reverse): 5'-CTTGGCATATGATACACTTGATG-3' (서열 21),
및 SYBR 그린이아르(greenER) PCR 마스터 믹스 (Master Mix) (인비트로젠) (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Aslanidi et al., 2009]).
부위-지정 돌연변이유발. 터보 (Turbo) Pfu 폴리머라제 (스트라타진)를 사용하여, 상술한 바와 같은 플라스미드 pACG2에 대해 2단계 PCR을 수행하였다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Wang and Malcolm, 1999]). 간략하게 설명하면, 단계 1에서, 2종의 PCR 확장 반응을 3 사이클 동안 정방향 및 역방향 PCR 프라이머에 대해 개별 튜브에서 수행하였다. 단계 2에서, 2종의 반응을 섞어서 추가의 15 사이클 동안 PCR 반응을 수행하고, 이어서 1시간 동안 DpnI 소화를 행하였다. 프라이머는 돌연변이된 잔기 각각에 대해 트레오닌 (ACA)으로부터 발린 (GTA)으로의 변화를 도입하기 위해 디자인되었다.
시험관내 재조합 AAV 벡터 도입 검정. 인간 HEK293을 1 × 103 vgs/세포로 도입하고, 뮤린 간세포 H2.35 세포를 각각 WT 및 돌연변이체 scAAV2-GFP 벡터를 사용하여 2 × 103 vgs/세포로 도입하고, 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 이식 유전자 발현을 상술한 바와 같이, 시계 (평균 ± SD)당 녹색 형광 (픽셀2)의 총 구역으로 평가하였다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Zhong et al., 2008; Markusic et al., 2010]). 분산 분석을 사용하여, 통계적으로 유의미하다고 결정된, 시험 결과와 대조군을 비교하였다.
세포질 및 핵 분획에서의 벡터 게놈 분포의 분석. 대략 1 × 106 H2.35 세포를 WT 또는 돌연변이체 scAAV2-GFP 벡터로 MOI 1 × 104 vgs/세포로 감염시켰다. 다양한 시점에 세포를 수집하고 트립신 처리에 의해 임의의 흡착 및 비흡착 바이러스 입자를 제거하고 이어서 PBS로 광범위하게 세척하였다. 핵 및 세포질 분획을 제조업체 설명서에 따라 핵 및 세포질 추출 시약 키트 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))로 분리하였다. 바이러스 게놈을 상술한 바와 같은 CBA 특이적 프라이머를 사용한 qPCR 분석에 의해 추출 및 검출하였다. 세포질 및 핵 분획 사이의 바이러스 게놈 양의 차이는 다음 룰에 따라 결정하였다: 바이러스로 처리된 세포로부터의 각각의 샘플의 CT 값을 모의 처리된 세포의 상응하는 CT로 표준화하였다 (ΔCT). 샘플 각각의 쌍별 세트에 대해, 존재하는 패키지 게놈에서의 배수 변화를 배수 변화 = 2-(ΔCT-세포질 - ΔCT-핵)으로 계산하였다. 3개의 독립적 실험 데이터는 핵 및 세포질 분획에서 패키지 게놈의 총량의 백분율을 나타내었다.
생체내 생물발광 영상화. 기관의 정책에 따라 모든 동물 실험을 수행하였고, 모든 절차를 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침 (National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 원칙에 따라 수행하였다. 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 다하였다. 10주령 C57BL/6 수컷 마우스 (잭슨 래버러토리, 미국 메인주 바 하버 소재)에 WT 및 돌연변이체 ssAAV2-Fluc 벡터 (n = 3)를 1 × 1010 vgs/동물로 정맥내 주사하였다. 루시퍼라제 활성을 주사 2주 후, 제노진(Xenogen) IVIS 루미나 시스템 (Lumina System) (캘리퍼 라이프 사이언즈 (Caliper Life Sciences))을 사용하여 분석하였다. 간략하게 설명하면, 마우스를 2% 이소플루오란으로 마취시키고, 루시페린 기질 (비틀 루시페린 (Beetle luciferin), 캘리퍼 라이프 사이언즈)을 체중 1 g당 150 μg의 용량으로 복강내 주사하였다. 마우스를 가볍게 죈 챔버에 놓고, 기질 주사 5분 후에 영상을 수집하였다. 영상을 리빙 이미지 (Living Image) 3.2 소프트웨어 (캘리퍼 라이프 사이언즈)로 분석하여 상대적인 신호 강도를 결정하였다.
AAV2 캡시드에 대한 돌연변이체 잔기의 위치 가시화. AAV2 VP3 결정 구조의 원자 배치 (잔기 217 내지 735, VP1 번호) (단백질 데이터 은행 (Protein Data Bank) (PDB) 접근 번호 1lp3; 문헌 [Xie et al., 2002])를 내려받아, VIPERdb에서 올리고머 생성기 어플리케이션을 사용하여 완전한 캡시드 모델을 생성하는 데 사용하였다 (문헌 [Carrillo-Trip et al., 2009]). 이는 매트릭스 증식을 통해 T = 1 20면체 캡시드를 생성하기 위한 60 VP3 카피를 생성한다. 구조를 프로그램 COOT로 도시하고 (문헌 [Xie et al., 2002]), 컴퓨터 프로그램 PyMOL (슈뢰딩거, 엘엘씨 (Schrodinger, LLC)) 및 RIVEM (샤오 앤드 로스만 (Xiao and Rossman), 2007) 중 어느 하나를 사용하여 도면을 만들었다.
통계적 분석. 결과를 평균 ± S.D로 나타낸다. 그룹간 차이는 스튜던트(Student)의 t-테스트의 그룹화된-쌍을 형성하지 않은 2개의 테일링된(two-tailed) 분포로 확인하였다. P-값 < 0.05는 통계적으로 유의하다고 여겨진다.
결과
AAV2 캡시드 상의 표면-노출 트레오닌 잔기의 부위-지정 돌연변이유발. AAV2 캡시드는 3종의 캡시드 VP, 즉, VP1, VP2 및 VP3의 캡시드 바이러스 단백질 3 (VP3) 공통 영역에서 45개의 트레오닌 (T) 잔기를 함유한다. 이들 중 17개 (251, 329, 330, 454, 455, 503, 550, 592, 581, 597, 491, 671, 659, 660, 701, 713, 716)는 표면-노출이다 (문헌 [Xie et al., 2002]). 17개의 T 잔기 각각을 상술한 바와 같이 부위-지정 돌연변이유발에 의해 발린 (V)으로 치환하였다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012; Zhong et al., 2008]). T329V 및 T330V가 약 10배 낮은 역가로 생성되고, T713V 및 T716V가 DNase Ι-내성 벡터 입자의 검출 불가능한 수준으로 생성된 것을 제외하고는 대부분의 돌연변이체는 WT AAV2 벡터와 유사한 역가로 생성될 수 있었다. 각각의 T-V 돌연변이체 벡터를 HEK293 세포에서 도입 효율에 대해 평가하였다. 이들 결과는 도 26a 및 도 26b에 도시된 바와 같이, 17개의 돌연변이체 중 T491V 돌연변이체가 그의 WT 대응체보다 약 4배 더 효율적으로 HEK293 세포로 도입된 것으로 나타났다. T455V, T550V, T659V 돌연변이체 벡터의 도입 효율은 약 2배 증가하였다. 이들 데이터는 세포 키나제에 의한 AAV2 캡시드 상의 특이적 티로신, 세린, 및 트레오닌 잔기의 인산화가 이들 벡터의 도입 효율의 중요한 결정자임을 나타내었다.
표면-노출 트레오닌 잔기의 다중 돌연변이가 AAV2 벡터의 도입 효율을 추가로 개선시킨다. 트레오닌-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율이 추가로 증진될 수 있는지를 평가하기 위해서, 다음의 다중-돌연변이체 벡터를 생성하였다: 3개의 이중-돌연변이체 (T455+491V; T550+491V; T659+491V), 2개의 삼중-돌연변이체 (T455+491+550V; T491+550+659V) 및 1개의 사중-돌연변이체 (T455+491+550+659V). 각각의 다중-돌연변이체 벡터를 WT AAV2 벡터와 유사한 게놈 역가로 패키징하였다. 병렬 비교에서, 각각의 다중-돌연변이체 벡터는 WT 및 단일-트레오닌 돌연변이체 AAV2 벡터보다 효율적으로 HEK293으로 도입된 것으로 나타났다 (도 27a 및 도 27b). 가장 양호하게 수행된 벡터는 삼중-돌연변이체 (T491+550+659V)인 것으로 확인되었고, 이는 WT 벡터보다 약 10배 더 높은 도입 효율 및 가장 양호한 단일-돌연변이체 (T491V) 벡터보다 약 3배 더 높은 도입 효율을 가졌다. 이들 데이터를 통해, 단일 바이러스 캡시드 상의 다수의 트레오닌-돌연변이를 조합하는 것이 도입 효율을 증대시키는데 있어 상승적 효과를 유발한다는 것이 확인되었다.
최적화된 트레오닌-돌연변이체 AAV2 벡터가 시험관내에서 뮤린 간세포로 효율적으로 도입된다. 최대 7개의 표면 티로신에서 페닐알라닌으로의 교환을 함유한 벡터에 비해 상기 실시예에 기재된 티로신 삼중-돌연변이체 (Y444+550+730F) 벡터가 뮤린 간세포로 도입되는데 효율적인 것으로 나타났다 (문헌 [Markusic et al. 2010]; [Jayandharan et al., 2011]). 따라서, 가장 양호하게 수행된 단일-세린 (S662V) 및 단일-트레오닌 (T491V) 돌연변이와 삼중-티로신 돌연변이체를 조합하는 것이 이들 벡터의 도입 효율을 추가로 증가시켜 본원에 기재된 방법에 따라 추가 개선된 발현 벡터를 생성할 수 있는 지를 평가하는 것이 중요하였다.
이를 위해, 다수의 다중-돌연변이체를 다음과 같이 생성하였다: 2개의 사중 (Y444+500+730F+T491V; Y444+500+730F+S662V) 및 1개의 오중 (Y444+500+730F+T491V+S662V) 돌연변이체 벡터. H2.35 세포에서 이들 돌연변이체와 WT 및 티로신 삼중-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율을 비교한 결과, Y444+500+730F+T491V 돌연변이체의 발현 수준이 티로신 삼중-돌연변이체 AAV2 벡터보다 약 2-3배 더 높고, WT AAV2 벡터보다 약 24배 더 높은 것으로 나타났다 (도 28a 및 도 28b). 흥미롭게도, S662V 돌연변이와 티로신 삼중-돌연변이체 벡터의 조합, 또는 S662V 돌연변이와 티로신-트레오닌 사중-돌연변이체 벡터의 조합은 이들의 도입 효율에 부정적인 영향을 끼쳤다. 여러 다른 트레오닌 돌연변이, 예컨대 T550V 및 T659V의 부가 또한 Y444+500+730F+T491V 사중-돌연변이체 AAV2 벡터의 도입 효율을 증대시키지 않았다. 추가의 연구는 이러한 표면-노출 Y, S, 및 T 잔기, 및 또한 이들의 인산화 상태의 복합 상호작용에 대해 보다 나은 이해를 얻는 것을 보장한다.
다중-돌연변이가 AAV2 벡터의 세포내 트래픽킹 및 핵 전좌를 증진시킨다. AAV2 캡시드 상의 표면-노출 티로신 잔기의 인산화의 예방은 티로신-돌연변이체 벡터의 세포내 트래픽킹을 개선시키고, 핵으로 전위되는 바이러스 게놈의 수를 증가시킨다 (문헌 [Zhong et al., 2008; Zhong et al., 2008]). 본 실시예에서, T491V 돌연변이체의 티로신 삼중-돌연변이체 벡터로의 부가는 이들 벡터의 핵 수송을 추가로 증가시킴으로써 도입 효율을 증대시키는 능력을 부여하였다. 이를 위해, Y444+500+730F+T491V 사중-돌연변이체에 의해 매개된 H2.35 세포에서의 트랜스진 발현의 역학을 평가하고, 이를 Y444+500+730F 삼중-돌연변이체 및 WT AAV2 벡터와 비교하였다. 이들 결과는 도 29a 및 도 29b에 도시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 티로신-트레오닌 사중-돌연변이체 벡터로부터의 EGFP 발현은 각각의 시험 시점에서 약 2-3배 더 높았고, 감염 16시간 후와 같이 조기에 검출될 수 있었다. 이러한 결과는 사중-돌연변이체 벡터로부터의 트랜스진 발현의 조기-발생이 이들 벡터의 보다 효율적인 핵 수송으로 인한 것일 수 있음을 제시하였다. 이러한 가능성을 실험적으로 시험하기 위해서, qPCR 분석을 이용하여 다양한 시점에 WT 및 2개의 돌연변이체 AAV2 벡터로 감염된 H2.35 세포의 세포질 및 핵 분획에서의 벡터 게놈을 정량화하였다. 2개의 세포 분획 내 벡터 게놈 비율을 도 30a 및 도30b에 도시하였다. WT AAV2 벡터로부터의 게놈의 약 20% 및 삼중-돌연변이체 벡터로부터의 게놈의 약 45%가 감염 16시간 후 핵 분획에서 검출된 반면에, 사중-돌연변이체로부터의 벡터 게놈의 70% 초과가 동일한 시점에 검출되었다. 유사하게, WT AAV2 벡터로부터의 게놈의 약 45%만이 감염 48시간 후 핵 분획에서 검출되었고, 삼중-돌연변이체 벡터로부터의 게놈의 약 80% 및 사중-돌연변이체로부터의 벡터 게놈의 약 90% 가 동일한 시점에 핵 분획에서 검출되었다. 따라서, 이러한 데이터를 통해, 트레오닌 (T491V) 돌연변이와 티로신 삼중-돌연변이체 (Y444+500+730F) 벡터의 조합이 이들 벡터의 핵 전좌를 가장 많이 개선시키며, 이는 보다 빠른 유전자 발현의 개시 및 도입 효율의 관찰된 개선과 상관관계가 있다는 가설이 확증되었다.
최적화된 AAV2 벡터가 생체내에서 뮤린 간세포로 도입되는데 고도로 효율적이다. 최적화된 AAV2 벡터의 도입 효율을 생체내 뮤린 모델에서 평가하였다. 각각의 다중-돌연변이체 벡터를 단일 가닥 반딧불이 루시퍼라제 (Fluc) AAV2 게놈과 함께 패키징하고, 각각의 벡터의 약 1 × 1010 vgs를 C57BL/6 마우스 (각 그룹당 n = 3)로 정맥내 주사하였다. 주사 2주 후 생물발광 영상화로 평가한 Fluc 유전자의 발현 수준은, Y444+500+730F+T491V 사중-돌연변이체 벡터로부터의 발현이 티로신 삼중-돌연변이체 벡터로부터의 발현보다 약 3배 더 높다는 것을 나타내었다. 각 그룹의 대표 동물 1마리 및 이들 데이터의 정량화는 도 31a 및 도 31b에 나타나 있다. 시험관내 수득 데이터와 일치하는 바와 같이, S662V 돌연변이의 부가는 티로신-삼중-돌연변이체 및 티로신-트레오닌 사중-돌연변이체 벡터 둘 모두의 도입 효율에 부정적인 영향을 끼쳤다. 본 발명의 예시적인 단일 및 다중-돌연변이 캡시드 단백질은 하기 표 5에 예시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
<표 5>
AAV2 캡시드 상의 표면-노출 티로신 (Y), 세린 (S) 및 트레오닌 (T) 잔기의 예시적인 돌연변이의 요약
Figure 112021035148424-pat00004
Figure 112021035148424-pat00005
첫번째 문자는 야생형 AAV2 캡시드의 아미노산에 상응하고, 숫자는 돌연변이된 VP3 아미노산 위치이며, 마지막 문자는 돌연변이체 아미노산이다.
논의
재조합 AAV-기재의 벡터는 다양한 유전자 장애에 대한 잠재적인 치료로서 유전자 대체 요법에 있어서 주목받는 전달 비히클이다. AAV 벡터가 많은 동물 모델에서 성공적으로 사용되어 왔고, 최근 몇몇 임상 시험에서 효능이 나타났으며, AAV의 라이프 사이클에서의 수많은 단계는 계속해서 유전자 요법에서 이들 벡터의 효과를 제한한다고 여겨진다. 이들 단계의 일부는 세포내 트래픽킹, 핵 수송, 탈외피(uncoating), 및 바이러스 제2-가닥 DNA 합성을 포함한다 (문헌 [Ding et al., 2005]; [Harbison et al., 2005]; [Nonnenmacher and Weber, 2012]).
AAV 구조적 및 조절성 성분의 단순 조직화 및 천연 가소성은 독특한 특성을 갖는 주문제작된 재조합 벡터를 개발하기 위한 바이러스 캡시드 및 게놈을 조작할 유일한 기회를 제공한다. 재조합 AAV 벡터의 특이성 및 도입 효율을 개선하기 위한 유의한 진행은 지난 십년간 행해져왔다. 예를 들어, 바이러스 반전 말단 반복부(ITR) 서열에서의 특이적 돌연변이는 자가-보완적인 AAV(scAAV) 벡터의 개발로 이어지고, 이는 바이러스 제2-가닥 DNA 합성의 속도 제한 단계를 극복하고, 다양한 유형의 세포 및 조직에서의 트랜스진 발현 수준을 극적으로 증가시킨다 (문헌 [McCarty et al., 2003]; [Wang et al., 2003]). 캡시드 유전자에 대한 돌연변이유발 연구로부터 발하는 많은 정보를 동반한 캡시드 구조 분석에 대한 추가 연구는 이들 벡터의 세포내 트래픽킹, 조직-향성(tropism), 및 벡터 캡시드화에서 중요한 역할을 하는 특이적 영역의 확인으로 이어졌다 (문헌 [Lochire et al., 2006]; [Muzyczka and Warrington, 2005]; [Wu et al., 2006]; [Gao et al., 2003]; [Vandenberghe et al., 2009]; [Wu et al., 2006]).
이전 실시예에서, AAV2 캡시드에서의 표면-노출 특이적 티로신 (Y) 및 세린 (S) 잔기의 치환은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 아마도 인산화, 후속 유비퀴틴화, 및 프로테아솜-매개 분해를 막음으로써 이들 벡터의 도입 효율이 유의하게 증가되었음을 확인하였다. AAV2 캡시드에서의 표면-노출 특이적 트레오닌 (T) 잔기는 마찬가지로 인산화를 겪을 것으로 예상되므로, 이 실시예에서 각각의 17 표면-노출 T 잔기는 조직적으로 돌연변이를 일으키고, 몇몇의 단일-돌연변이체 벡터는 도입 효율을 최대 4배 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 단일 캡시드에서의 많은 T 돌연변이의 조합은, 도입 효율이, HEK293 세포에서의 WT AAV2 벡터의 것과 비교하여, 최대 ~10배 추가 증가되는 변형이 확인되었다.
2개의 독립적인 그룹은 AAV2 캡시드에서의 특이적 T 잔기의 돌연변이를 이미 보고하였다. 예를 들어, 문헌 [Lochrie et al., 2006]에서는, 위치 330, 454, 455, 491, 503 및 550에서의 T 잔기의 항체 결합 표면 영역을 확인하려고 했고, 문헌 [DiPrimio et al. (2008)]에서는, 위치 659에서의 T 잔기의 캡시드 조립 및 게놈 패키징에 중요한 영역을 확인하려고 했다. 상기 두 연구에서, T 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 또는 리신 (K) 잔기로, 또는 펩티드 치환에 의해 치환되어 있다. 그러나, 임의의 돌연변이체 벡터의 도입 효율에서의 증가는 관찰되지 않았다. 반대로, 실시예에서, 표면-노출 T 잔기는 발린 잔기로 치환되었다. 이는 추가로, 최근 AAV 벡터의 생물학적 활성을 조정하는 데 있어서 특이적 아미노산 유형으로 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Aslanidi et al., 2012]; [Li et al., 2012]).
가장 효율적인 트레오닌-돌연변이 (T491V)는 이미 보고된 티로신 삼중-돌연변이 (Y444+500+730F) (문헌 [Markusic et al. 2010])와 조합하여 Y-T 사중-돌연변이체 (Y444+500+730F+T491V) 벡터를 생성시킬 때, 이 벡터의 도입 효율은 시험관내 및 생체내 둘 다에서, 뮤린 간세포에서의 티로신 삼중-돌연변이체 벡터보다 ~2-3-배 더 높았다. 그러나, 가장 효율적인 S-돌연변이 (S662V) (문헌 [Aslanidi et al., 2012])를 티로신 삼중-돌연변이와 조합하는 것은 Y-S 사중 돌연변이체 (Y444+500+730F+S662V) 벡터 및 또한 Y-S-T 오중-돌연변이체 (Y444+500+730F+S662V+T491V) 벡터의 도입 효율에 부정적으로 영향을 미친다. 몇몇의 다른 조합이 WT AAV2 벡터와 비교하여 더 높은 도입 효율을 보였지만, 유사한 (사중, 오중 또는 육중-티로신; 및 삼중 및 사중-트레오닌 돌연변이체) 조합도, 가장 잘 수행하는 YST 돌연변이의 조합도 삼중-티로신 돌연변이체 벡터로부터의 발현 수준에 도달하지 못했다. 많은 수의 시험된 돌연변이의 조합을 고려하여, 삼중-티로신 돌연변이체 벡터보다 도입 효율이 유의하게 증가된 돌연변이만을 본원에 상세하게 기술하였다.
17 AAV2 표면-노출 트레오닌 잔기는 캡시드 전체에 걸쳐 산재되어 있다. 4종의 돌연변이 (T329V, T330V, T713V, 및 T716V)는 조립 및 벡터 생성에서 유의한 결함을 일으켰고, 이들은 추가로 특성화할 수 없었다. 잔기 329 및 330은 AAV2 VP3 구조의 코어 β-배럴의 βD 및 βE 가닥 사이에 위치한 α 표면 루프 (DE 루프)에 위치하고 있다 (Xie et al., 2002). 20면체 5-중 대칭 관련 VP3 조립으로부터의 5종의 이들 루프는 캡시드의 내부 및 외부 표면을 연결하는 상기 축에서의 채널이다 (도 32a). 이전 연구 (Bleker et al., 2006)에서 관찰된 바와 같이, 이들 돌연변이체에 대한 역가는 게놈 패키징에서의 상기 채널에 대한 역할과 일치하여 유의하게 감소하였다. 잔기 713 및 716은 각각 20면체 2- 및 5-중 축에서의 및 이를 둘러싸는 함몰부 사이의 벽/상승된 캡시드 영역 상에 위치하고 있다 (도 32a 및 도 32b). 이들 측쇄는 대칭 관련 VP3 단량체와의 극성 상호작용에 참여하며, 돌연변이가 캡시드 조립에서의 결함을 일으킬 가능성이 크다. 20면체 2중 축에 위치한 잔기에 대한 캡시드 조립에서의 역할은, 조립-활성화 단백질 (AAP)과의 상호작용을 매개하는 AAV2 잔기가 상기 캡시드 영역에 위치한다는 것이 관찰된 최근의 보고 (Naumer et al., 2012)와 일치한다.
돌연변이 시 발린 또는 알라닌으로의 증가된 도입 표현형을 나타내는 잔기 T455, T491, T550, 및 T659는 20면체 3-중 축을 둘러싸는 돌출부 상에 (T455, T491, 및 T550), 또는 AAV2 캡시드의 20면체 5-중 축에서의 채널을 둘러싸는 함몰부 상에 놓이는 (코어 β-배럴의 βH 및 βI 사이의) HI 루프 상에 (T659) 위치하고 있다. 2종의 VP3 단량체로부터 조립된 캡시드 상의 주요한 특징인 돌출부 상의 잔기는 각각 돌출부의 상부에 근접하여 (455), 2배 함몰부의 측면을 향하여 (491), 그리고 5-중을 둘러싸는 함몰부의 측면을 향하여 (550) 위치하고 있다. 이러한 AAV 영역은 서열 및 구조에서의 가장 큰 가변성을 함유하며, 잔기 659를 제외한, 다른 3종의 트레오닌 잔기는 VP3 가변 영역 (VR)을 규정하도록 위치하고 있다 (Govindasamy et al., 2006). T659와 함께, 이들 잔기는 20면체 5-중 축을 둘러싸는 함몰부를 향하여 돌출부의 상부에 걸쳐 연장되는 캡시드 표면 상의 풋프린트를 형성한다 (도 32a 및 도 32b). 이들의 표면 노출은 키나제를 포함할 수 있는 숙주 분자와 상호작용하는 잠재성과 일치한다. 흥미롭게, 이 풋프린트는, 캡시드 표면 아미노산의 도식 (도 32b)에서 티로신 잔기 Y730에 대해 근위에 위치하고 있는 T491과 함께, 삼중-티로신 돌연변이체에서의 잔기 Y444, Y500, 및 Y730에 의해 플랭킹된다. 캡시드의 20면체 축에서의 함몰부를 차지하는 상기 잔기는, 7 표면-노출 티로신이 페닐알라닌으로 돌연변이되는 경우 WT AAV2와 비교하여 도입에서의 가장 높은 증가를 나타냈다 (Zhong et al. 2008). 유의하게, 상동성 AAV8을 세포내이입 경로에서의 트래픽킹 동안 접하는 상태에서 조사한 경우, 2-중 캡시드 영역은 pH-매개 구조적 전이를 겪는 것으로 관찰된다 (Nam et al., 2011). AAV2의 돌연변이가 변경된 수용체 결합 메카니즘을 통해 도입 효율을 개선시키는 것이 가능하다. 각각 헤파란 술페이트 수용체 R585 및 R588, 및 K531 (AAV2에서의 E530와 구조적으로 동등함)과의 AAV2 및 AAV6 상호작용을 매개하는 잔기는 이러한 풋과 근접해 있고 (도 26b), VRV에서의 잔기 491 및 500은 AAV8에서의 LamR 수용체와의 결합에 관여한 (Akache et al., 2006) AAV2 캡시드의 표면 상의 2개의 큰 영역 중 하나에 위치하고 있다. VRV에서의 아미노산은 또한 그의 글리칸 수용체, 갈락토스에 대한 AAV9 캡시드 결합에서 소정의 역할을 한다.
S662V 돌연변이를 함유하는 돌연변이체의 감소된 도입 효율 표현형은 잠재적인 인산화를 제거하도록 돌연변이 시 도입을 증진시키는 잔기에 의해 기술되는 풋프린트 (도 32a 및 도 32b) 내의 상기 잔기의 위치를 고려하여 설명하는 것이 어렵다. 또한, 상기 잔기의 발린으로의 돌연변이가 WT AAV2에 대해 도입을 개선시키는 것으로 나타났다 (Aslanidi et al., 2012). T659와 같은 잔기 S662는 인접한 5-중 대칭 관련 VP3 단량체에 걸쳐 연장되는 HI 루프에 위치하고 있고, 펜타머 서브유닛의 안정화에 소정의 역할을 할 가능성이 있다. 그러나, 세린 측쇄는 임의의 서브유닛간 또는 서브유닛내 상호작용에 관여하지 않고, HI 루프는 캡시드 조립 및 게놈 패키징의 결정자인 것으로 보고된 한편 (DiPrimio et al., 2008), 이는 단일 아미노산 치환을 용인하였다 (Aslanidi et al., 2012). 따라서, 이의 효과는 삼중-티로신 돌연변이체 잔기 및 T491을 함유하는 풋프린트를 이용한 캡시드 상호작용의 폐기로 인한 가능성이 크다. 유의하게, 세린 (mut45subSer14) 또는 FLAG 에피토프 (mut45SubFLAG10)를 치환한, HI 루프를 구성하는 인근 아미노산, 예를 들어 아미노산 잔기 664에서의 돌연변이에 대한 표현형은 비-감염성이거나 또는 바이러스 캡시드로 조립되지 않았다 (Wu et al., 2000). 그러나, 동일 위치에서의 HA 삽입은 부분적으로 결함을 갖지만, 여전히 헤파린 결합된 캡시드를 생성하였다 (Wu et al., 2000).
감염 후 48시간에 WT AAV2 벡터에 의해 전달된 벡터 게놈의 ~45%만이 핵에 존재한 반면, 동일 시점에 Y-T 4중-돌연변이체 벡터에 의해 전달된 벡터 게놈의 >90%가 존재하였다. 이는, 프로테아솜으로의 감소된 재-지향과 일치하는, 돌연변이체에 대한 개선된 트래픽킹 역학을 나타낸다. 삼중-돌연변이체 벡터와 비교하여 이들 벡터의 도입 효율에서의 완만한 (~2-3-중) 증가는 또한 핵 벡터 게놈 전달에서의 ~10% 증가, 즉 ~80%과 비교하여 ~90%와 일치한다.
표면 티로신, 세린, 및 트레오닌 변형의 다양한 조합은 최대 증가를 달성하기 위한 최적의 조합이 존재함을 명백히 나타내었다. 이들 연구는 또한 감염 동안 AAV 상호작용에서의 특이적 잔기 유형에 대한, 그리고 도입을 증진시키기 위한 요구사항을 강조하였다. 단일 변화 시에는 도입 효율에서의 유의한 증가를 나타내지 않았던 개별 돌연변이가 단일 캡시드와 조합된 경우에 보다 우수한 벡터를 형성할 수 있는 것이 가능하다.
<표 6>
AAV 혈청형에서의 티로신 잔기의 비교
(표면 노출된 잔기는 이들 아미노산 위치 다음에 "*"로 나타냄)
Figure 112021035148424-pat00006
Figure 112021035148424-pat00007
<표 7>
AAV 혈청형에서의 리신 잔기의 비교
(표면 노출된 잔기는 이들 아미노산 위치 다음에 "*"로 나타냄)
Figure 112021035148424-pat00008
Figure 112021035148424-pat00009
Figure 112021035148424-pat00010
볼드체의 잔기는 표면-관련 리신임 = *
캡시드의 내부 상에 위치하는 잔기 = I
해당 혈청형에 대한 해당 위치에서 상동성 리신이 존재하지 않음 = NA
AAV의 결정 구조에서 보이지 않는 잔기는 회색으로 음영 처리하였다; 그러나, 생화학적 데이터는 이들 아미노산이 이어서 외부화되는 바이러스 생명 주기의 일부 지점까지 AAV 캡시드 내부에 위치한다는 것을 시사하였다.
실시예 6 - AAV3 벡터에 의한 인간 간 종양 형성의 저해
매년 전 세계적으로 695,900명에 이르는 고체 암 사망자에서 간세포 암종(HCC)은 5위를 차지한다(문헌[Thomas and Zhu, 2005]; [Jemal et al., 2011]). 지난 20년 동안 5년 생존율은 12% 미만으로 유지되어 온 반면, 미국 내에서의 HCC 발생률은 3배가 되었다(문헌[El-Serag, 2011]). 이는 아시아 및 아프리카에서 더 심각한데, 중국에서는 3,000명당 1명의 연간 발생률을 나타내고 있다(문헌[Chen, et al., 2013]). 현재, HCC의 병기분류는 최적의 요법을 계획하는데 있어 중대하게 고려되고 있다(문헌[Bruix et al., 2005]). 초기 HCC 환자는 라디칼(치유적) 요법으로부터 이득을 얻을 수도 있으며, 중간 병기의 환자는 고식적 치료로부터 이득을 얻을 수도 있다. 그러나 재발이 빈번한 합병증이고, 치료 실패율이 높다. 후기 HCC 환자에 대해서는, 불행하게도 최선의 지지적 치료가 유일한 선택 사항이다(문헌[Verslype et al., 2009]). 비록, 후기 HCC 환자를 위한 하나의 의약으로서 미국 식약청이 승인한 소라페닙이 있지만, 대규모 제III상 임상 시험에서 생존율 중앙값이 단지 7.9에서 10.7개월로 증가하였다(문헌[Llovet et al., 2008]).
AAV 벡터는 레베르 선천적 흑내장(문헌[Bainbridge et al., 2008]; [Maguire et al., 2008]; [Cideciyan et al., 2008]; [Cideciyan, 2010]), 혈우병 B(문헌[Nathwani et al., 2011]) 및 방향족 L-아미노산 카르복실라아제 결핍(문헌[Hwu et al., 2012])의 치료에 주목할만한 효능을 나타내어왔다. 지단백질 리파제 결핍을 치료하기 위한 rAAV1 벡터인 글리베라는 서양에서의 첫번째 유전자 요법 생성물이다(문헌[Melchiorri et al., 2013]). 2000년대 초반에는, 연구원들은 생체내 HCC 표적을 위해 통상적인 단일 가닥(ss) rAAV2 벡터를 사용하였다(문헌[Su et al., 2000]). 불행하게도, ssAAV2 벡터의 도입 효율이 낮기 때문에, 전신 투여를 통한 2-mm보다 큰 종양에서의 도입은 관찰되지 않았다(문헌[Peng et al., 2000]). 보다 최근에는, rAAV8 벡터를 사용한 마우스 내인성 HCC 모델에 있어서 특이적 miRNA의 전달이 암 세포 증식의 억제를 야기하는 것으로 나타났다(문헌[Kota et al., 2009]; [Hsu et al., 2012]). 그러나, rAAV8 벡터는 뮤린 모델(문헌[Zincarelli et al., 2008]; [Gao et al., 2002]; [Wang et al., 2005]) 및 비-인간 영장류(문헌[Nathwani, et al., 2006]; [Nathwani et al., 2007])에 있어서, 간보다 다른 정상적인 조직에 광범위한 친화성을 갖고 있다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 임의의 정상적인 뮤린 조직의 효율적인 생체내 도입에 실패한 rAAV3 벡터(문헌[Zinarelli et al., 2008]; [Palomeque et al., 2007]; [Markakis et al., 2010]; [Ling et al., 2010])가, 인간 HCC 세포를 시험관내(문헌[Ling et al., 2010]; [Glushakova et al., 2009]) 및 생체내(문헌[Cheng et al., 2012]) 모두 높은 효율로 도입하는 것으로 나타남을 입증하였다. 비록 rAAV3 벡터가 1차 인간 간세포 또한 도입하지만, 트랜스진 발현은 HCC-특이적 프로모터, α-태아단백질 프로모터(AFPp)를 사용함으로써 악성 세포로 제한될 수 있다. 후속적인 연구에 있어서, 본 발명자들은 rAAV3 벡터가 세포성 보조수용체로서, 인간 간세포 성장 인자 수용체(hHGFR, 또한 c-Met로도 명명함)를 이용하는 것을 관찰하였는데(문헌[Ling et al., 2010]), 이는 hHGFR이 대부분의 HCC 세포에서 과발현되기 때문에(문헌[You et al., 2011]), 인간 간암을 표적함에 있어서 rAAV3 기재의 벡터를 활용할 수 있는 기회를 시사한다. 추가로, AAV3은 다른 흔하게 사용되는 AAV 혈청형과 비교하여, 인간에 있어서 기존 중화 항체의 발생률이 낮기 때문에(문헌[van der Marel et al., 2011]), 인간 간암의 유전자 요법을 위한 선택적 바이러스 벡터로서 발전될 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 본 실시예는 인간 간암 세포에 있어서 rAAV3 매개 도입 효율의 추가적인 증가가 바이러스 캡시드 상의 특이적으로 표면 노출된 티로신(Y), 세린(S) 및 트레오닌(T) 잔기의 제거를 통해 달성될 수 있음을 입증한다. 시험관내 및 바이러스-친화성 생체내 세포성 수용체 상호작용에서 유의한 변경이 관찰되지 않은 것은 이들 변형과 관계가 있다. 추가로, 인간 간암 이종이식편 모델에서의 종양 형성의 유의한 억제는, 전통적인 중국 의약인 트리코산틴(Trichosanthin)으로부터의 신규의 치료적 유전자를 운반하는 최적화된 rAAV3 벡터의 전신 투여를 통해 달성되었다.
재료 및 방법
화학물질, 플라스미드 및 프라이머. 등급 I-A 헤파린 나트륨 염을 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 재조합 hHGF를 라이프 테크놀로지로부터 구입하였다. 플라스미드 p헬퍼를 애질런트 테크놀로지로부터 구입하였다. 플라스미드 pdsAAV-CBAp-EGFP 및 pAAV-CBAp-FLuc를 채플 힐 소재의 노스 캐롤라이나 대학의 샤오샤오 박사(Dr. Xiao Xiao)로부터 얻었다. 플라스미드 pdsAAV-AFPp-EGFP에 대해서는 전술하였다(문헌[Glushakova et al., 2009]). TCS 유전자(문헌[Shaw et al., 1994])는 공개된 서열(문헌[T. kirilowii trichosanthin (TCS) mRNA, complete cds]; [GenBank: M34858.1])에 기재하여 라이프 테크놀로지에 의해 합성하였고, AgeI 및 HindIII 제한 효소 부위를 사용한 플라스미드 pdsAAV-AFPp-EGFP로 서브클로닝하였다. 모든 플라스미드는 사용하기 전에 서열분석하였다.
최적화된 rAAV3 캡시드 플라스미드의 구축. 전술되어 있는 바와 같이, rAAV3 캡시드에서 부위-특이적 돌연변이를 도입하기 위해 터보 Pfu 폴리머라제(스트라타진)를 수행하였다(문헌[Zhong et al., 2008]; [Markusic et al., 2010]; [Aslanidi et al., 2013]). 간략하게 설명하면, 1단계에서는 각각의 돌연변이체에 대해 별개의 튜브에서 2개의 PCR 연장 반응을 수행하였다. 하나의 튜브는 전방향 PCR 프라이머를 함유하였고, 다른 것은 역방향 프라이머를 함유하였다. 2단계에서는 2개의 반응물을 혼합하고, 표준 PCR 돌연변이유발 검정을 제조업체의 지침서에 따라 수행하였다. 모든 돌연변이체 플라스미드는 사용하기 전에 서열분석하였다.
세포주 및 배양. 인간 간세포 암종(Huh7) 세포에 대해서는 전술하였으며(문헌[Ling et al., 2010]; [Cheng et al., 2012]), 10% 열-불활성화 태아 소 혈청(FBS, 시그마-알드리치), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(론자)으로 보충한 둘베코 변형 이글 완전 배지(C-DMEM, 메디아테크, 인크.)에 유지하였다. 새롭게 수립한 인간 간아세포종(Hep293TT) 세포주를 샌 안토니오 소재의 텍사스 헬스 사이언스 센터 대학의 게일 이. 톰린슨 박사(Dr. Gail E. Tomlinson)로부터 얻고, 15% 열-불활성화 FBS(시그마-알드리치) 및 1% P/S(론자)로 보충된 RPMI 완전 배지 1640 (라이프 테크놀리지)에 유지하였다. 세포를 37℃의 습한 대기 중에서 5%의 CO2에서 부착 배양으로 성장시키고, 실온에서 2 내지 5분간 트립신-베르센(versene) 혼합물(론자)로 처리한 후에 계대배양하고, 세척하고, 완전 배지 중에 재현탁하였다.
rAAV 벡터 생성. rAAV 벡터의 고도로 정제된 원액을 삼중-플라스미드 형질감염 프로토콜에 의해 생성하였다. 간략하게 설명하면, HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(선형, MW 25000, 폴리사이언시즈, 인크.)을 사용하여 3개의 플라스미드로 공동 형질감염시키고, 배지를 6시간 후속 형질감염시킨 것으로 대체하였다. 세포를 72시간 후속 형질감염시킨 후에 수확하고, 3회 왕복의 동결-해동 처리하고, 이어서 벤조나아제(라이프 테크놀로지)로 소화시켰다. 바이러스 벡터를 이오딕사놀(시그마-알드리치) 구배 초원심분리로 정제한 후, HiTrap SP/Q HP(GE 헬스케어) 이온 교환 크로마토그래피를 행하고, 인산염 완충 염수(PBS, 메디아테크, 인크.)로 세척하고, 150 Kda 분자량 컷오프(MWCO)로 원심 스핀 농축기에 의해 농축하였다. 재조합 벡터 원액의 물리적 게놈 역가를 정량적 DNA 슬럿-블럿 및 써던 블럿 분석에 의해 결정하였다.
시험관내 rAAV 벡터 도입. 세포를 C-DMEM에서 웰 1개당 5,000 또는 10,000 세포로 96웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 세포를 아무것도 처리하지 않거나, 또는 명시된 화학물질로 2시간 동안 처리하였다. 이어서 rAAV 감염(MOI: 5×103)을 혈청- 및 항생제-무함유 DMEM 배지에서 명시된 화학물질로, 또는 명시된 화학물질 없이 2시간 동안 수행하고, 이어서 PBS로 대규모 세척하여 벡터 접종물을 제거하였다. 트랜스진 발현을 형광 현미경검사 또는 72시간 후속 형질감염 유동 세포계측에 의해 분석하였다.
hHGF 경쟁 검정. Huh7 세포를 scAAV3-CBAp-EGFP 벡터로 5×103 vgs/세포의 MOI에서 도입하였다. 벡터를 재조합 hHGF의 농도를 증가하면서 사전 혼합하였다. 72시간 후속 도입의 EGFP 발현 수준에 대해 세포를 분석하였다.
동물 취급. 모든 동물 실험은 적절한 규제 기관에 의해 승인된 것이며, 동물 관리에 대해 명시된 지침에 따라 수행하였다. 6주령 내지 10주령의 비-비만 당뇨병성/중증의 복합면역결핍된, IL2-감마-결핍된(NSG) 남성 마우스는 잭슨 레버러토리로부터 구입하였다.
인간 간암 이종이식편 모델. 6 내지 10주령의 수컷 NSG 마우스에 견갑골 사이 목의 배쪽면에 5 × 106개의 Huh7 또는 Hep293TT 세포를 피하 주사하였다. 동물을 실험 종료시까지 멸균 케이지 내에 유지하였다.
생체내 FLuc 검정. rAAV 벡터를 NSG 마우스에 꼬리-정맥을 통해 정맥내로 주사하거나, 또는 종양 내로 직접 주사하였다. 생체내 FLuc 영상화를 위해, 마우스를 칭량하여 기질인 D-루시페린-K+ 염 (칼리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences))의 부피를 4 mg/kg 체중의 용량에 따라 계산하고, 마취시켰다. 계산된 부피의 5 mg/mL의 원액 기질 용액을 100 μL의 PBS와 혼합하고, 복강내로 주사하였다. 생체내 생물발광 영상을 냉각된 전하결합소자 카메라가 장착된 제노겐(Xenogen) 기계 (제노겐)를 사용하여 5분의 기간에 걸쳐 즉시 획득하였다. 신호 강도를 카메라 제어 프로그램인 리빙 이미지(Living Image) 소프트웨어를 이용하여 정량화하고, 광자/초/cm2/스테라디안 (p/s/cm2/sr)으로서 제공하였다.
통계적 분석. 결과를 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 제공하였다. 군 사이의 차이를 그래프패드 프리즘 6(GraphPad Prism 6) 소프트웨어 내의 시닥 다중 비교 검정(Sidak's multiple comparison test)에 의한 일원 ANOVA를 이용하여 확인하였다.
결과
rAAV3 벡터는 생체내에서 인간 간 종양을 선택적으로 형질도입시킨다. 연구의 제1 세트에서, 인간 HCC 종양에서의 rAAV3 및 rAAV8 벡터의 형질도입 효율을 생체내 뮤린 이종이식편 모델에서 비교하였다. 비-비만, 당뇨성 (NOD), 중증-복합 면역-결핍 (scid), 인터류킨 2-결핍 (IL2-) (NSG) 마우스, 수컷 및 암컷 둘 다 (n = 4)에, 견갑골 사이 배쪽면에 5 × 106개의 인간 Huh7 세포를 피하 주사하였고, 종양이 형성되었다. 4주 후, 마우스에 모의제제를 주사하거나, 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/닭 β-액틴 하이브리드 프로모터 (CBAp) 제어 하의 반딧불이 루시퍼라제 유전자 (FLuc)를 운반하는 rAAV3 또는 rAAV8 벡터 1 × 1011 바이러스 게놈 (vg)/마우스를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다 (도 40a). 전신 생체발광 영상화를 벡터 투여 3일 후에 수행하였다. 상기 결과를 도 36a에 나타내었다. 보이는 바와 같이, rAAV3 벡터를 주사한 수컷 및 암컷 마우스 둘 다에서는 FLuc 발현이 종양에 국한된 반면에, rAAV8 벡터를 주사한 마우스에서는 FLuc 발현이 상대적으로 보다 넓게 퍼져 있으나 간에 우세하게 국소화되었으며, rAAV8 벡터의 형질도입 효율은 수컷 마우스에서 유의하게 더 높았는데, 이러한 관측은 이전에 공개된 연구 (문헌 [Davidoff et al., 2003])와 일치하는 것이었다. 정량적 데이터는 rAAV3 벡터-매개 트랜스진 발현이 종양에 국한되었으며, 트랜스진 발현이 간에서는 거의 검출되지 않았음을 추가로 입증하였다. 반대로, rAAV8 벡터를 주사한 마우스에서는, 단지 저수준의 트랜스진 발현만이 종양에서 일어난 반면에, 간에서의 발현이 유의하게 더 높았다. 상기 결과를 추가로 확증하기 위해, 실험의 제2 세트에서, rAAV3 및 rAAV8 벡터 1 × 1011 vg/마우스를 인간 Huh7 종양을 보유하는 수컷 NSG 마우스 (n = 4)에 직접 종양내로 주사하고, 전신 생물발광 영상을 벡터 주사 3일 후에 획득하였다. 도 36c에서 보이는 바와 같이, rAAV3 벡터를 주사한 마우스에서는 고수준의 트랜스진 발현이 종양에 국소화된 반면에, rAAV8 벡터를 주사한 마우스에서는 종양 이외에 간에서의 유의한 트랜스진 발현도 또한 검출되었다. 따라서, rAAV8 벡터와는 대조적으로, rAAV3 벡터는 상기 생체내 실험 모델에서 인간 간 종양-편향성을 갖는다.
예비 실험에서, 트랜스진 발현의 감소가 또한 종양에서 벡터 투여 후 5일차에 인지되었고, 이는 HCC 종양의 빠른 성장 때문이었다. 따라서, 이러한 결과를 추가로 확증하기 위해서, 다음 세트의 실험에서, rAAV3 및 rAAV8 벡터의 직접적 종양내 주사를 저용량 (L = 1 x 1011 vgs/마우스) 및 고용량 (H = 1 x 1012 vgs/마우스)으로 수행하였다. 3일차 및 7일차 둘 다에서 수득한 전신 생물발광 영상화 데이터가 도 36d에 도시된다. 용량 및 시간 의존적 면에서, 심지어 고용량에서도, rAAV3 벡터-주사된 마우스에서 간에서의 이소성 발현이 최소인 반면, rAAV8 벡터의 종양내 주사는 간에서의 강한 트랜스진 발현을 초래함이 명백하였다. 벡터 주사 후 7일차에, 마우스를 희생시키고 간 조직 샘플에서 지속되는 바이러스 게놈 카피 수를 비교하였다. 도 36e에 도시된 이러한 결과는 다량의 rAAV8 벡터 게놈이 간에 존재한 반면에, rAAV3 벡터 게놈의 수는 최소이고, 이전의 결과들을 확증함을 나타낸다. 이러한 연구는 선행 업적 (링(Ling) 등, 2010; Glushakova et al., 2009; Cheng et al., 2012; Ling et al., 2011)과 함께, HCC에 대해 rAAV3 벡터-매개 유전자 요법을 이용하는 것에 대한 명백한 근거를 제공한다.
시험관내 인간 간암 세포 중 rAAV3 벡터-매개 트랜스진 발현의 추가적인 증가는 바이러스 캡시드의 변형을 통해 성취될 수 있다. rAAV3 벡터의 도입 효율을 추가로 증진시키기 위해서, rAAV3 캡시드의 부위-지정 돌연변이유발을 수행했다. 페닐알라닌 (F) 잔기에 대한 표면-노출 티로신 (Y)의 돌연변이유발 (쳉(Cheng) 등, 2012)에 더해, 표면-노출 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 리신 (K) 잔기를 또한 각각 발린 (V) 및 글루탐산 (E) 또는 아르기닌 (R) 잔기에 대해 돌연변이유발시켰다. 우선권은 다양한 AAV 혈청형 중에 보존된 위치에 주어졌고, rAAV2 벡터의 도입 효율을 증가시키는 것으로 앞서 나타났다 (중(Zhong) 등, 2008; 마르쿠식(Markusic) 등, 2010; 아슬라니디(Aslanidi) 등, 2013; 아슬라니디 등, 2012). CBAp-유도 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 운반하는 야생형 (WT) 및 모든 돌연변이체 rAAV3 벡터 (도 40a)를 사용하여 동일한 상태하의 인간 HCC 세포주, Huh7에서의 그들의 도입 효율을 평가하였다. 이들 데이터의 요약이 도 41에서 제공된다. 2개의 K-돌연변이체 (K528E; K533E)의 도입 효율이 10배 초과로 감소되었고, 여러 Y- 및 T-돌연변이체 (Y272F; Y444F; T251V; Y705+731F+T492V)의 도입 효율이 2배 초과로 감소되었다. 나머지 돌연변이체의 도입 효율은 증가되었고, 이는 2배 미만 내지 10배 초과의 범위였다. 7개의 최고 돌연변이체 뿐만 아니라 CBAp-유도 FLuc 리포터 유전자를 운반하는 WT rAAV3 벡터를 그 후에 사용하여 Huh7 세포를 동일한 상태 하에서 도입시켰다. 이러한 결과 (도 37a에 도시됨)는 WT rAAV3 벡터와 비교하여 Y705+731F 및 S663V+T492V+K533R 돌연변이체의 도입 효율이 10배 만큼 증가했고, S663V+T492V 돌연변이체의 도입 효율은 15배 만큼 증가했음을 나타낸다. 이러한 돌연변이체의 관찰된 증가된 도입 효율을 추가로 입증하기 위해서, CBAp 프로모터-유도 EGFP 리포터 유전자를 운반하는 3개의 최고 돌연변이체 rAAV3 벡터를 사용하여 상이한 인간 HCC 세포주, HepG2를 동일한 상태 하에서 도입시켰다. 결과 (도 37b에 도시됨)는 WT rAAV3 벡터와 비교하여 S663V+T492V+K533R 및 Y705+731F 돌연변이체의 도입 효율이 2 내지 3배 만큼 증가했고, S663V+T492V 돌연변이체의 도입 효율이 5배 만큼 증가했음을 입증했다. 최고 돌연변이체 (S633V+T492V)의 도입 효율이 또한 더욱 최근-구축된 인간 간모세포종 (HB) 세포주, Hep293TT (창(Cheng) 등, 2012)에서 평가되었다 (도 37c). 따라서, 최적화된 rAAV3 벡터가 인간 간암의 잠재적인 유전자 요법에서 유용함을 입증할 수도 있다
rAAV3 캡시드 상에서의 특이적 아미노산의 변형은 바이러스-세포 수용체 상호작용을 변경시키지 않는다. 바이러스-수용체 상호작용을 담당하는 바이러스 캡시드 아미노산의 불확실성 때문에, 본원 발명자들은 또한, 이전에 WT rAAV3 벡터의 수용체(라비노비츠(Rabinowitz) 등, 2004) 및 공동 수용체(링 등, 2010)로서 식별되었던 세포 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG) 및 인간 간세포 성장 인자 수용체 (hHGFR)가, 본 발명의 최적화된 rAAV3 벡터에 의해 도입에 관여되었는지를 조사하였다. 하기의 3개 세트의 연구를 수행하였다. 첫번째로, rAAV3-CBAp-EGFP 벡터와 함께 Huh7 세포 또는 2개의 최고 돌연변이체 벡터의 도입을 저용량 (100 ng/mL) 또는 고용량 (100 μg/mL)의 가용성 헤파린 중 어느 하나의 존재 하에 수행하였다. 이러한 결과 (도 37d에 도시됨)는 Y705+731F 및 S663V+T492V 돌연변이체 둘 다 유사한 방식으로 WT rAAV3 벡터로서 수행하였고, 그 중 저용량의 헤파린이 바이러스 벡터-매개 도입 효율을 증진시킨 반면에 고용량이 이를 감소시켰음을 나타낸다. 두번째로, 도입 검정을 5 μg/mL 인간 간세포 성장 인자 (hHGF)의 존재하여 수행하였고, 이는 이전에 WT rAAV3 벡터의 도입 효율을 유의하게 억제하는 것으로 나타났었다(링 등, 2010). 이러한 결과 (도 37e에 도시됨)는 WT 및 돌연변이체 바이러스 벡터 둘 다의 도입 효율이 유의하게 영향을 받았음을 입증하였다. 세번째로, WT 및 2개의 돌연변이체 rAAV3 벡터를 사용하여 검출 불가능한 수준의 내인성 hHGFR를 발현하는 인간 유방암 세포주, T47D를 도입하였을 뿐만 아니라, 또한 T47D 세포를 hHGFR 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염시켰다 (T47D+hHGFR). 이러한 결과 (도 37f에 도시됨)는 WT 및 돌연변이체 rAAV3 벡터 둘 다 모 T47D 세포에 비해 T47D+hHGFR 세포를 더욱 효율적으로 (5배 초과) 도입시킴을 나타냈다. 종합하면, 이들 데이터는 최적화된 rAAV3 벡터가 또한 세포 HSPG 및 hHGFR를 이들의 도입을 위한 수용체/공동 수용체로서 이용함을 확인시켜준다.
rAAV3 캡시드 상에서의 특이적 아미노산의 변형이 전신 투여 전 생체 내 바이러스 도입 효율을 추가로 증진시킨다. 본원 발명자들은 뮤린 이종이식편 모델에서 생체내 2개의 최적화된 rAAV3 벡터의 도입 효율을 다음으로 평가하였다. 이를 위해, 인간 Huh7 또는 Hep293TT 종양-함유 NSG 마우스를 사용하였고 (n = 4), 비교적 저용량 (5 x 1010 vgs/마우스)의 rAAV3-Y705+731F-CBAp-FLuc 또는 rAAV3-S663V+T492V-CBAp-FLuc 벡터를 꼬리 혈관을 통해 전달하였다. 전신 생체발광 영상화를 벡터 주사 후 3일차에 수행하였다. 도 38a에 도시된 결과로부터, Huh7 및 Hep293TT 종양 둘 다 최적화된 rAAV3 벡터에 의해 효율적으로 표적화되었음이 명백하였고, 이전에 생체내에서 WT rAAV3 벡터에 비해 유의하게 더욱 효율적인 것으로 나타났던 rAAV3-Y705+731F 벡터 (쳉 등, 2012)에 비해 종양의 두 가지 유형 모두에서의 트랜스진 발현이 rAAV3-S663V+T492V 벡터에 의해 유의하게 증진되었음이 명백하였다 (도 38b). 벡터 주사 후 3일차에, 마우스를 희생시켰고, 간 및 종양 조직을 수확하였다. 총 DNA 샘플을 간 및 종양 조직 둘 다로부터 단리시켰고, qPCR 분석하여 벡터-게놈 카피 수를 결정하였다. 도 38c 및 도 38d에 도시된 데이터로부터, 종양 중 rAAV3-S663V+T492V 돌연변이체의 지속되는 벡터 게놈이 rAAV3-Y705+731F 돌연변이체의 것들보다 유의하게 높은 것이 명백하였고 (도 38c), 아마도 더욱 효율적인 세포내 트래픽킹 및 핵 입성 때문이며 (아슬라니디 등, 2013), 이는 또한 FLuc 트랜스진 발현과 꽤 상관관계가 있다 (도 38a 및 도 38b). 간 중 2개의 벡터의 지속되는 벡터 게놈에서의 유의한 차이를 관찰하였고, 이는 또한 이전에 보고된 것 (진카렐리(Zincarelli) 등, 2008)과 비교할만하다. 그러나 간 중 대략 5배 더 높은 벡터 게놈 카피 수의 존재에도 불구하고, 종양과 비교하여, 간에서 2개의 최적화된 rAAV3 벡터 중 어느 하나를 갖는 더 적은 트랜스진 발현이 검출되었음이 주목할만 하다.
신규 치료 유전자를 발현하는 최적화된 rAAV3 벡터의 전신 투여에 따라 생체내 인간 간암 이종이식편 모델에서 종양발생이 억제된다. 따라서, 모든 연구는 치료 가치가 결여된 리포터 유전자로 수행하는 것까지를 설명하였다. 따라서, 잘-설립된 다수의 아폽토시스촉진 및 "자살" 유전자의 사용이 고려됨에도 불구하고, 한의약제 허브인 트리코산테스 크릴로위(Trichosanthes kirilowii) (Sha et al., 2013)로부터 단리된 리보솜-불활성화 단백질인 트리코산틴(trichosanthin) (TCS)을 코딩하는 새롭게-확인된 치료 유전자에 초점을 맞추었다. TCS 유전자의 뉴클레오티드 서열이 20년 이전에 측정되었지만 (Shaw et al., 1994), TCS를 세포 내로 코딩하는 유전자의 전달은 계속되지 않았다. 그의 세포내 발현이 인간 HCC 세포주 시험관내의 성장을 유의하게 억제하는 AFPp의 조절 하의 TCS 유전자-발현 카세트를 합성하였다 (도 40a에 상세히 설명됨).
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이어서, 신규 치료 유전자를 보유한 rAAV3-S663V+T492 돌연변이 벡터를 생성시켰다. 또한, 종양을 감지할 수 있기 전에, 조기 시점에서 치료를 시작할 수 있도록, CBAp 프로모터의 조절 하의 FLuc 유전자를 안정하게 형질감염시킨 유전자-변형된 인간 HCC 세포 주 Huh7-FLuc도 생성시켰고, 이를 또한 전신 생물발광 영상화에 의해 종양 성장을 모니터링할 수 있도록 하였다. NSG 마우스 (n=10)에 5　X　106 Huh7-FLuc 세포를 견갑골 사이의 복측 편에 피하로 주입하였다. 이종이식편 이식 후 4주째에, 마우스를 2개의 군으로 나누고, 5　X　1010 vgs의 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS 벡터를 제1 군의 꼬리-혈관을 통해 주입시켰다 (0일째). 마우스 제2 군은 5　X　1010 vgs의 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 벡터를 주입하여 적절한 대조로서 작용하도록 하였다. 벡터-투여 후 0일째, 3일째, 8일째, 및 11일째에 마우스의 전신 생물발광 영상화를 수행하였다. 이들 결과는 도 39a에 나타내었으며, rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 벡터를 주입한 마우스에서 Huh7-FLuc 종양은 계속해서 성장하였지만, rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS 벡터를 주입한 마우스에서의 종양 성장은 벡터-투여 후 8일째에 최대 성장 억제를 나타내었고 (p　<　0.01), 11일째까지 유의하게 억제되었다 (p　<　0.05). 벡터-투여 후 8일째에 수행한 마우스의 전신 생물발광 영상화를 도 39b에 나타내었다. 또한, 11일째에, 모든 마우스를 희생시켰으며, 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 및 알라닌 트랜스아미나제 (ALT)의 혈청 수준을 측정하였다. TCS-처리 군 및 대조군 사이에서의 유의차는 관찰되지 않았으며, 이는 마우스에서의 간 손상이 거의 없었음을 시사하였다 (도 39c).
논의
상기에 기재한 바와 같이, 인간에서의 고형 종양 중 5번째인 HCC는 전세계적으로 매년 ~695,900명의 사망자를 발생시킨다. HCC의 조기 진단을 받은 환자들이 수술 및/또는 화학요법제 개입으로 이익을 얻을 수 있지만, 질환의 재발이 종종 발생하고, 치료 실패의 비율이 높다. 진행성 HCC를 진단받은 환자에 대해서는, 지지 요법에 대한 선택이 크게 제한되어 있다. 미국 식품의약국 (FDA)이 진행성 HCC를 앓는 환자에 대한 소라페닙의 사용을 승인하였지만, 중앙 생존기간은 단지 ~3개월이 증가하였다. 따라서, HCC에 대한 신규 치료 옵션의 개발이 절실히 필요하며, 한의약 (TCM)과 유전자 요법의 조합이 유망한 옵션이라는 것은 매우 명백하다. 주요 상호보완적 대체 의약 요법으로서의 TCM 의약은 이미 중국에서 HCC에 대해 통상적으로 사용되는 치료이다 (Zhai et al., 2013). 최근에, TCM 허브로부터 추출한 생물활성 단량체성 화합물이 rAAV 벡터에 의해 매개되는 치료 효율을 유의하게 증진시키는 능력이 있음이 보고되었다 (Zhang et al., 2010; Mitchell et al., 2013; Wang et al., 2014; Ling et al., 2014). 여기서, 허브로부터 단리된 치료적 자살 유전자가 rAAV 벡터를 통해 악성 세포 내로 생체내 전신으로 전달되는, TCM 투여와 유전자 요법을 조합한 신규 전략이 개발되었다.
HCC의 재조합 AAV 벡터-매개 유전자 요법은 과거에 시도되었다. 예를 들어, 생체내 HCC를 표적으로 하는 단일-가닥 (ss) rAAV2 벡터의 통상적인 사용이 보고되어 있지만 (Su et al., 2000), 이들 벡터의 전달 효율은 낮다. 후속적인 연구에서 (Peng et al., 2000), 전신 투여 후 2mm 초과의 종양에서는 전달이 관찰되지 않았다. 보다 최근 연구에서, rAAV8 벡터를 사용하여 마우스 내인성 HCC 종양 모델에서의 특이적 miRNA-26A 및 miRNA-122의 전달을 매개하는 것은 종양 성장의 억제를 나타내었다 (Kota et al., 2009; Hsu et al., 2012). 그러나, rAAV8 벡터는 뮤린 모델 (Zincarelli et al., 2008; Gao et al., 2002; Wang et al., 2005) 및 비-인간 영장류 (Nathwani, et al., 2006; Nathwani et al., 2007)에서 간 외에 정상 조직에 대한 광범위한 향성을 나타낸다. 이러한 예는 또한 시험관내 인간 간암 세포에 대한 rAAV3 벡터의 현저한 향성을 이용하여 이들 벡터를 이종이식편 마우스 모델에서 인간 간 종양에 생체내 표적화 전달을 달성하게 할 수 있음을 입증한다. 또한, rAAV3 캡시드에 대한 특이적 아미노산 잔기의 부위-지정 돌연변이 유발은 rAAV3 벡터의 전달 효율을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 신규 치료 유전자를 발현하는 최적화된 rAAV3 벡터를 또한 뮤린 이종이식편 모델에서 사용하여 인간 간 종양발생을 억제할 수 있다. 이들 연구가 잘-확립된 종양에서 수행되었고, 벡터의 의도된 낮은 용량의 사용으로 종양-표적화를 확립하였음이 강조되어야 한다. 따라서, 종양이 잘 확립되기 전에, 벡터의 높은 용량의 사용 및/또는 조기의 개입이 보다 바람직한 치료 종점을 달성할 가능성이 있을 것으로 여겨진다. 또한, 특히 간 미세환경에서 원발성 인간 간 종양 이종이식편으로의 추가 연구 및 대형 동물 모델에서의 안전성 및 효능에서의 성공적인 완성이 이루어질 때까지, rAAV3-S663V+T492V 벡터가 인간 간암의 잠재적 유전자 요법에서의 유용성이 입증될 것이라는 추측이 또한 가능하다.
참고문헌
하기 참고문헌은 예시적 절차 또는 본원에 제시된 다른 상세한 설명에 대한 보충을 제공하는 정도로 본원에 참조로 특별히 포함된다.
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본원에서 설명되는 실시예 및 실시양태는 예시의 목적을 위한 것이고, 그를 고려하여 통상의 기술자에게 다양한 변형 또는 변화가 제안될 것이고 본원의 취지와 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 함을 이해해야 한다.
본원에 인용되는 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 개별적으로 및 구체적으로 나타내지고 그 전체가 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 그 전체가 구체적으로 참조로 포함된다.
본원에서 일정 범위의 값의 언급은 본원에서 달리 지시하지 않으면 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 것을 단지 약칭하는 방법으로서 사용하고자 의도되고, 각각의 별개의 값은 이들이 마치 개별적으로 본원에서 언급되는 것처럼 본원 명세서에 포함된다.
본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 지시하거나 문맥상 명백하게 모순되지 않으면 임의의 적합한 순서로 수행할 수 있다.
본원에서 제시되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨데")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하기 위한 것으로서, 달리 나타내지 않으면 본 발명의 범위에 대한 제한을 제시하지 않는다. 명백하게 언급되지 않는 한, 명세서의 어떠한 용어도 임의의 요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "갖는", "포괄하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용한 본원에서 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태의 설명은 달리 설명하거나 문맥상 명백하기 모순되지 않으면, 특정 요소 또는 요소들로 "이루어지는", 이로 "본질적으로 이루어지는", 또는 이를 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 측면 또는 실시양태에 대한 지지를 제공하고자 의도된다 (예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로서 본원에서 설명되는 조성물은 달리 설명하거나 문맥상 명백하게 모순되지 않으면 그 요소로 이루어지는 조성물을 또한 설명하는 것으로 이해하여야 한다).
본원에 개시되고 특허청구된 모든 조성물 및 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험을 수행하지 않으면서 제조 및 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 측면에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 설명되는 조성물 및 방법에 대한, 및 방법의 단계에 또는 단계의 순서에 대한 변경이 적용될 수 있음은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및/또는 생리학적으로 관련되는 특정 작용제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에서 설명되는 작용제를 치환할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 상기 유사한 치환 및 변형은 첨부되는 청구의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 해당하는 것으로 간주된다.
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Srivastava, Arun Zhong, Li Zolotukhin, Sergei Aslanidi, George V Agbbandje-McKenna, Mavis Van Vliet, Kim <120> CAPSID-MODIFIED, RAAV3 VECTOR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE IN GENE THERAPY OF HUMAN LIVER CANCER <130> 36689.357 <150> US 13/899,481 <151> 2013-05-21 <150> US 12/595,196 <151> 2009-12-31 <150> PCT/US2008/059647 <151> 2008-04-08 <150> US 60/910,798 <151> 2007-04-09 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Adeno-associated virus serotype 1 <400> 1 Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln 65 70 75 80 Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu 100 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Adeno-associated virus serotype 2 <400> 2 Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Arg 65 70 75 80 Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu 100 105 110 Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu Gly 115 120 125 Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val 130 135 140 Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Lys Ala 145 150 155 160 Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp 165 170 175 Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala 180 185 190 Pro Ser Gly Leu Gly Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala 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Oligonucleotide Primer <400> 11 accagaacct gggctctgcc cactttcaac aaccatctct acaag 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Oligonucleotide Primer <400> 12 caatcaggag cttcgaacga caaccacttc tttggctaca gcacc 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 13 cttatcgatc agtatctgta cttcctgaac agaacgcaag gaaca 45 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 14 gctaacgaca acaacaacag taactatcca tggacagcgg ccagcaaa 48 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 15 tggaatccag agattcagtt cacgtccaac tacaacaagt ctgtt 45 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 16 gagattcagt acacgtccaa cttcaacaag tctgttaatg tggac 45 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 17 gtgaacctcg ccctattgga acccggtttc tcacacgaaa cttg 44 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 18 tcccatagta acgccaatag g 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 19 cttggcatat gatacacttg atg 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 20 tcccatagta acgccaatag g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 21 cttggcatat gatacacttg atg 23 <210> 22 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 22 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 23 ctccatcact aggggttcct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 24 ctccatcact aggggttcct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 25 gaggtagtga tccccaagga 20 <210> 26 <211> 870 <212> DNA <213> Trichosanthes kirilowii <400> 26 atgatcagat tcttagtcct ctctttgcta attctcaccc tcttcctaac aactcctgct 60 gtggagggcg atgttagctt ccgtttatca ggtgcaacaa gcagttccta tggagttttc 120 atttcaaatc tgagaaaagc tcttccaaat gaaaggaaac tgtacgatat ccctctgtta 180 cgttcctctc ttccaggttc tcaacgctac gcattgatcc atctcacaaa ttacgccgat 240 gaaaccattt cagtggccat agacgtaacg aacgtctata ttatgggata tcgcgctggc 300 gatacatcct attttttcaa cgaggcttct gcaacagaag ctgcaaaata tgtattcaaa 360 gacgctatgc gaaaagttac gcttccatat tctggcaatt acgaaaggct tcaaactgct 420 gcaggcaaaa taagggaaaa tattccgctt ggactccctg ctttggacag tgccattacc 480 actttgtttt actacaacgc caattctgct gcgtcggcac ttatggtact cattcagtcg 540 acgtctgagg ctgcgaggta taaatttatt gagcaacaaa ttgggaagcg tgttgacaaa 600 accttcctac caagtttagc aattataagt ttggaaaata gttggtctgc tctctccaag 660 caaattcaga 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600 gacaaaacct tcctaccaag tttagcaatt ataagtttgg aaaatagttg gtctgctctc 660 tccaagcaaa ttcagatagc gagtactaat aatggacagt ttgaaagtcc tgttgtgctt 720 ataaatgctc aaaaccaacg agtcacgata accaatgttg atgctggagt tgtaacctcc 780 aacatcgcgt tgctgctgaa tagaaacaat atggcagcca tggatgacga tgttcctatg 840 acacagagct ttggatgtgg aagttatgct attctcgagg actacaagga tgacgatgac 900 aaggattaca aagacgacga tgataaggac tataaggatg atgacgacaa ataa 954

Claims (27)

  1. 서열 3에 기재된 야생형 AAV3 캡시드 단백질에
    (a) Y701F 및 Y705F(Y731F는 포함하지 아니함);
    (b) T492V 및 S663V(Y444F, Y500F 또는 Y730F는 포함하지 아니함); 또는
    (c) Y705F, Y731F, 및 T492V;
    의 비-천연 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 포함하거나, 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10 각각에 기재된 야생형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 캡시드 단백질 중 어느 하나 또는 이들의 조합의 동등한 표면-노출 아미노산 잔기에 상기 비-천연 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 포함하거나, 또는
    하나 이상의 아미노산 치환이 서열 2에 기재된 야생형 AAV2 캡시드 단백질, 또는 서열 1, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10 각각에 기재된 야생형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 캡시드 단백질 중 어느 하나 또는 이들의 조합의 동등한 표면-노출 아미노산 잔기의
    (d) Y444F 및 T550V;
    (e) Y730F 및 T491V(Y444F, Y500F 또는 S662V는 아님);
    (f) S458F 및 S492V(S662V는 아님)
    로부터 선택되는 것인,
    변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자.
  2. 제1항에 있어서, 입자의 형질도입 효율이, 선택된 포유동물 숙주 세포에서 상응하는 미변형 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 입자의 경우보다 2- 내지 50-배, 6- 내지 40-배, 또는 8- 내지 30-배 더 높거나; 또는
    입자가 포유동물 세포로 도입될 때 상응하는 미변형 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 입자의 경우보다 유비퀴틴화에 덜 감수성인 rAAV 입자.
  3. 제1항에 있어서, 입자가, rAAV 입자를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 진단제, 치료제 또는 화학요법제를 코딩하는 핵산 절편을 발현할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 핵산 절편을 추가로 포함하는 rAAV 입자.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 핵산 절편에 작동가능하게 연결된 제1의 포유동물 인트론 서열을 추가로 포함하는 rAAV 입자.
  5. 제3항에 있어서, 프로모터가 이종 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 구성적 프로모터, 유도가능한 프로모터, 또는 이것들의 조합인 rAAV 입자.
  6. 제3항에 있어서, 핵산 절편이 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이것들의 조합을 발현 또는 코딩하는 것인 rAAV 입자.
  7. 제3항에 있어서, 핵산 절편이 화학요법제를 코딩하는 것인 rAAV 입자.
  8. 제3항에 있어서, 진단제, 치료제 또는 화학요법제가 효능제, 길항제, 항-세포자멸 인자, 억제제, 수용체, 시토카인, 세포독소, 조혈제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 그의 억제제, 세로토닌 수용체, 또는 그의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 저해제, 세포독성제, 세포증식억제제, 항염증제, 또는 이것들의 조합인 rAAV 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 변형된 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 절편.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자를 포함하는 단리된 포유동물 숙주 세포.
  11. (I) (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자, 또는
    (b) 상기 (a)의 rAAV 입자의 변형된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 절편; 및
    (II) 제약상 허용되는 완충제, 희석제 또는 부형제
    를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 지질, 리포좀, 지질 복합체, 에토좀(ethosome), 니오좀(niosome), 나노입자, 마이크로입자, 지방구(liposphere), 나노캡슐, 또는 이것들의 조합을 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 조성물.
  14. (1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자; 및
    (2) 인간에서 간암의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 호전에 상기 rAAV 입자를 사용하는 것에 관한 지침서
    를 포함하는 키트.
  15. 제11항에 따른 조성물을 포함하는, 포유동물 암의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기 위한 의약.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자를 포함하고, 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자를 제공할 필요가 있는 포유동물의 세포, 조직 또는 장기에, 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자 제공에 효과적인 시간 동안 그에 효과적인 양으로 제공되는, 상기 포유동물에게 진단 또는 치료 유효량의 선택된 생물학적 분자를 제공하기 위한 제약 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자를 포함하고, 포유동물에서 HCC를 포함하는 간암의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 호전에 충분한 시간 동안 그에 충분한 양으로 HCC를 포함하는 간암의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시킬 필요가 있는 포유동물에게 투여되는, 포유동물에서 HCC를 포함하는 간암의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기 위한 제약 조성물.
  18. 인간에게 간 세포 또는 간 종양 세포의 집단을 형질도입시키기에 효과적인 시간 동안 투여되는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 입자의 유효량을 포함하는, 인간에서 간 세포 또는 간 종양 세포의 집단을 형질도입시키기 위한 제약 조성물.
  19. 제3항에 있어서, 핵산 절편이, 그에 작동가능하게 연결된 인핸서, 전사후 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 또는 이것들의 조합을 추가로 포함하는 것인 rAAV 입자.
  20. 제5항에 있어서, 조직-특이적 프로모터가 간-특이적 프로모터, 종양 세포-특이적 프로모터, 또는 이것들의 조합인 rAAV 입자.
  21. 제10항에 있어서, 숙주 세포가 줄기 세포, 조혈 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 망막 세포, 상피 세포, 내피 세포, 췌장 세포, 암 세포, 근육 세포, 혈관 세포, 횡경막 세포, 위 세포, 간 세포, 종양 세포 또는 CD34+ 세포인, 단리된 포유동물 숙주 세포.
  22. 제11항에 있어서, 간암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 호전시키기 위한 키트 내에 포함된 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 간암이 HCC인 조성물.
  24. 제13항에 있어서, 치료 또는 예방이 인간 암에 대한 것인 조성물.
  25. 제15항에 있어서 포유동물 암이 인간 간암인 의약.
  26. 제17항에 있어서, 포유동물이 인간인 제약 조성물.
  27. 제18항에 있어서, 인간이 HCC로 진단되거나, HCC를 갖고 있거나, 또는 HCC를 갖는 것으로 의심되는 제약 조성물.
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