CN111763690A - 衣壳修饰的raav3载体组合物以及在人肝癌基因治疗中的用途 - Google Patents

衣壳修饰的raav3载体组合物以及在人肝癌基因治疗中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及衣壳修饰的RAAV3载体组合物以及在人肝癌基因治疗中的用途。本发明公开了下一代多重突变衣壳蛋白修饰的rAAV表达载体，以及包含所述表达载体的感染性病毒体、组合物和药物制剂。还公开了这些高转导效率载体构建体的制备方法和在多种治疗应用中的使用方法，尤其包括作为用于使用体内和/或离体基于病毒载体的基因治疗方案来治疗或改善受影响哺乳动物中的一种或更多种疾病或异常状况的递送物质。还公开了多重突变衣壳修饰的rAAV表达载体、病毒颗粒和感染性病毒体的大规模生产方法，以及所公开的组合物在制备用于多种体外和/或体内治疗方法之药物中的用途。

Description

衣壳修饰的RAAV3载体组合物以及在人肝癌基因治疗中的 用途
本申请是申请号为201480041247.6的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年5月21日提交的PCT国际申请PCT/US2014/039015于2016年1月20日进入中国国家阶段的申请。
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求2013年5月21日提交的美国专利申请No.13/899,481(未决；代理人案卷号36689.331)的优先权，其是2009年12月31日提交的美国专利申请No.12/595,196(现在的美国专利No.8,445,267；代理人案卷号36689.305)的部分继续申请，申请No.12/595,196是2008年4月8日提交的PCT国际专利申请No.PCT/US2008/059647(国家化；代理人案卷号36689.272)的美国国家阶段文件，国际专利申请No.PCT/US2008/059647要求2007年4月9日提交的美国临时专利申请No.60/910,798(期满的，代理人案卷号36689.266)的优先权。每一个前述申请的内容均通过明确提及以其整体并入本文。
关于联邦赞助研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.R01-HL-097088和R21-EB-015684的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
联合研究协议的当事人的名称
不适用。
技术领域
本发明一般地涉及分子生物学和病毒学领域，特别地涉及基因递送载体(genedelivery vehicle)的开发。还公开了用于多种诊断和/或治疗方案的可用于向选定的宿主细胞递送多种核酸区段的改进rAAV载体组合物，所述核酸区段包括编码治疗性蛋白质多肽、肽、反义寡核苷酸和核酶构建体的那些。还提供了这些基于经修饰rAAV载体构建体的制备方法及其在多种基于病毒的基因治疗，特别是用于诊断、预防、治疗和/或改善人疾病、紊乱、功能障碍、创伤或损伤之症状中的使用方法。本发明还提供了突变的基于rAAV的病毒载体递送***，其对选定的哺乳动物宿主细胞具有提高的转导效率和/或改进的病毒感染性。特别地，本发明提供了具有这样颗粒的改进的rAAV载体和病毒体，所述颗粒在病毒衣壳蛋白的一个或更多个表面暴露残基中具有氨基酸替换。
背景技术
通过使用病毒来递送治疗性遗传物质，已经在基因治疗领域中取得了重大进步。由于其低的免疫原性和有效转导非***细胞的能力，腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)作为用于基因治疗的高效病毒载体已经引起了相当的注意。已经发现AAV感染多种细胞和组织类型，并且近十年对于使这种病毒***适于在人基因治疗中使用取得了显著的进展。
在其正常的“野生型”形式中，重组AAV(rAAV)DNA作为长度为约4600个核苷酸(nt)的单链分子被包装在病毒衣壳中。在病毒感染细胞后，细胞的分子机构将该单DNA链转化成双链形式。只有双链DNA形式对于将所包含的基因转录成RNA的细胞多肽来说是有用的。
AAV具有许多有利于其作为基因递送载体的特性：1)野生型病毒与任何病理学人病症均没有联系；2)重组形式不包含天然病毒编码序列；以及3)在许多应用中观察到了持续的转基因表达。
重组腺相关病毒2(AAV)载体的转导效率在体外和体内的不同细胞和组织中变化很大，这限制了它们中的许多在潜在的基因治疗方案中的有用性。已经进行了***的研究以阐明AAV生命周期中的基本步骤。例如，有记录表明，在体外以及在体内，通过表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)在酪氨酸残基处磷酸化的细胞蛋白质FKBP52抑制AAV第二链的DNA合成，从而抑制转基因表达。还已经证明，EGFR-PTK信号转导调节泛素/蛋白酶体途径介导的细胞内运输(intracellular trafficking)以及FKBP52介导的AAV载体第二链DNA合成。在那些研究中，EGFR-PTK信号转导的抑制导致AAV衣壳蛋白的泛素化降低，这进而通过限制蛋白酶体介导的AAV载体降解来促进核转运，表明AAV衣壳上酪氨酸残基的EGFR-PTK介导的磷酸化。现有技术中缺少对用于感染选定的哺乳动物细胞，特别是用于向人细胞递送靶基因之具有增强转导效率的改进的rAAV病毒载体。
发明内容
本发明通过提供编码一种或更多种治疗剂之新的改进的基于rAAV的遗传构建体克服了现有技术中固有的限制和缺陷，其可用于制备用来预防、治疗和/或改善由此类多肽中的一种或更多种的缺陷所造成的一种或更多种疾病、紊乱或功能障碍的药物。特别地，本发明提供了VP3衣壳蛋白修饰的基于rAAV的遗传构建体，其编码一种或更多种选择的分子，例如用于诊断、预防、治疗和/或改善多种哺乳动物疾病、紊乱、功能障碍、创伤、损伤等的症状的一种或更多种诊断剂或治疗剂(包括，例如，蛋白质、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸和多核苷酸、核酶及其变体和/或活性片段)。
本发明提供了与野生型相比，包含一个或更多个表面暴露氨基酸残基(包括但不限于例如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基)修饰的突变的AAV VP3衣壳蛋白。还提供了包含本发明的突变AAV衣壳蛋白的感染性rAAV病毒体，以及编码本发明的突变AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体，以及编码用于向选定的哺乳动物细胞群递送的一种或更多种选定的诊断剂和/或治疗剂的核酸。
有利地，与野生型未经修饰的表达构建体和包含它们的对应rAAV载体和病毒体相比，本文所公开的新rAAV载体、表达构建体以及包含它们的感染性病毒体和病毒颗粒优选地在转导多种目的细胞、组织和器官的一种或更多种方面具有改进的效率。
本文提供的改进的rAAV载体以比常规野生型(即，“未经修饰”)的rAAV载体更高的效率(通常高得多的效率)转导一种或更多种选定的宿主细胞。通过进行以下广泛分析和详细实验：其涉及对来自多种AAV血清型的多种AAV衣壳蛋白上之的多种单独的表面暴露氨基酸残基和/或二、三、四、五或甚至六或更多个表面暴露氨基酸残基组合的位点定向诱变，本发明人开发了具有改进转导效率之单或多重突变的rAAV载体的大集合。本发明人已经证明，在许多不同的AAV血清型中，一个或更多个病毒体表面展示氨基酸残基的替换产生了改进的病毒载体，其能够以比制备所述突变体的对应未替换载体更高效率地转导。
这些新衣壳突变rAAV病毒载体的开发大幅降低了常规基因治疗方案所需的病毒颗粒数目。除了对多种哺乳动物细胞具有改进的转导效率之外，本文所述的表面暴露氨基酸修饰的rAAV载体与目前哺乳动物基因治疗方案中使用的常规病毒载体相比更稳定、免疫原性更低，并且可以以低得多的成本生产。
在一个特定实施方案中，本发明提供了经修饰rAAV VP3衣壳蛋白，其包含：(a)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的Y252、Y272、Y444、Y701、Y705和Y731的一个或更多个位置处的非酪氨酸残基；(b)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的S459或S663的一个或更多个位置的每个位置处的非丝氨酸残基；(c)在对应于SEQ IDNO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的T251或T492的一个或更多个位置的每个位置处的非苏氨酸残基；(d)在SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的K528、K533或K545的一个或更多个位置的每个位置处的非赖氨酸残基；(e)在SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的(i)Y701或Y705位处的非酪氨酸残基；和(ii)Y705或Y731位处的非酪氨酸残基，或S663位处的非丝氨酸残基；(f)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的三个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换；(g)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的四个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换，或者(h)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的五个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换；或者，其中每个氨基酸替换位于任意一种其他野生型载体血清型中对应的等同氨基酸位置处，所述其他野生型载体血清型选自：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10，其分别在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中示出。
本发明的示例性多重突变蛋白质包括但不限于AAV3衣壳上的三个或更多个不同表面暴露氨基酸残基中的每一个处的非天然氨基酸替换组合。这些多重突变载体包括但不限于：在SEQ ID NO：3中示出的野生型AAV3衣壳蛋白的以下所指示氨基酸残基处：
(a)Y701F、Y705F和Y731F；
(b)Y705F、Y731F和S663V；
(c)Y705F、Y731F和T492V；
(d)Y705F、Y731F、K533R；
(e)S663V、T492V和K533R；
(f)Y705F、Y731F、S663V和T492V；以及
(g)Y705F、Y731F、S663V、T492V和K533R替换，
或者在分别于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中示出的对应野生型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10的任一种的等同表面暴露氨基酸残基处，或者其任意组合。
在本发明的实践中，经替换的非天然氨基酸可以包括在对应野生型蛋白质的特定残基处通常不存在的一个或更多个氨基酸的替换，并且优选地包括选自以下的一个或更多个非天然氨基酸替换：苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)和异亮氨酸(I)。
本发明还提供了编码本文所述的一种或更多种公开的衣壳蛋白突变变体的经分离和纯化的多核苷酸，以及包含一种或更多种此类多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)载体。优选地，本发明的载体构建体还包含至少一个编码诊断性或治疗性分子的核酸区段，其与能够在包含所述载体的合适宿主细胞中表达所述核酸区段的启动子有效连接。在本发明的实践中，包含经修饰AAV VP3衣壳蛋白的病毒体的转导效率比对应未经修饰的野生型蛋白质的转导效率高，就此而论，优选地在选择的哺乳动物宿主细胞中具有的哺乳动物细胞转导效率为包含对应未经修饰的衣壳蛋白之病毒体转导效率的至少2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍或至少约12倍或更高。在某些实施方案中，本文提供的rAAV载体的转导效率为包含对应未经修饰的衣壳蛋白的病毒体转导效率的至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、或者至少约40、45或50倍或更高。此外，与包含对应未经修饰的衣壳蛋白的病毒体相比，本发明之包含一种或更多种经修饰AAV VP3衣壳蛋白的感染性病毒体优选地在引入到哺乳动物细胞中时对泛素化更不易感。
本发明还涉及rAAV载体，其中所述核酸区段还包含与编码选定的目的多核苷酸的核酸区段有效连接的启动子、增强子、转录后调控序列、多腺苷酸化信号或其任意组合。
优选地，启动子是异源启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子或其任意组合。
在某些实施方案中，克隆到本文所述的新rAAV表达载体中的核酸区段将表达或编码一种或更多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任意组合。
如本文提到的，可用于本发明的治疗剂可以包括一种或更多种激动剂、拮抗剂、抗凋亡因子、抑制剂、受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂(erythopoietic agent)、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、神经生长因子、神经活性肽、神经活性肽受体、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、酶、受体结合蛋白、转运蛋白或其一种或更多种抑制剂、血清素受体或其一种或更多种摄取抑制剂(uptake inhibitor)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、丝氨酸蛋白酶抑制剂受体、肿瘤抑制剂(tumor suppressor)、诊断分子、化学治疗剂、细胞毒素或其任意组合。
尽管本发明人特别预期了在用于一种或更多种哺乳动物肝癌的基因治疗的方法中使用图41中指出的rAAV3载体，然而衣壳突变载体可以制备并且包装在任何已知的AAV血清型病毒体内，包括例如AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
本发明还提供了大量此类衣壳突变rAAV载体以及包含编码它们的一个或更多个核酸区段的病毒体、感染性病毒颗粒和哺乳动物宿主细胞和其群。
优选地，所述哺乳动物宿主细胞是人宿主细胞，包括例如：血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、胰细胞、神经细胞、眼细胞或视网膜细胞、上皮细胞或内皮细胞、树突细胞、成纤维细胞或者哺乳动物来源的任何其他细胞，包括但不限于：肝脏(即，肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰细胞、肠细胞、膈细胞、肾(即，肾脏)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或者预期基于病毒的基因治疗所用于的任何一种或更多种选定的哺乳动物组织。
本发明还提供了组合物和制剂，其包含与一种或更多种可药用缓冲剂、稀释剂或赋形剂一起的本发明蛋白质核酸区段病毒载体、宿主细胞或病毒颗粒中的一种或更多种。此类组合物可以包含在用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾病、损伤、紊乱、创伤或功能障碍之一种或更多种症状的一种或更多种诊断或治疗药盒中。
本发明还包括向有此需要的哺乳动物提供诊断或治疗有效量的选定生物分子的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物的细胞、组织或器官提供rAAV载体，其量和持续时间有效地向所述哺乳动物提供诊断或治疗有效量的所述选定生物分子。
本发明还提供了用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物中的疾病、紊乱、功能障碍、损伤、异常状态或创伤之至少一种或更多种症状的方法。在整体和一般含义中，所述方法包括至少以下步骤：以足以诊断、预防、治疗或改善所述哺乳动物中的疾病、紊乱、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的至少一种或更多种症状的量和时间，向有此需要的哺乳动物施用一种或更多种所公开的rAAV载体。在基于rAAV3载体的情况下，此类异常状况优选地包括哺乳动物肝的一种或更多种疾病或功能障碍，包括例如HCC；在基于rAAV8载体的情况下，此类异常状况优选地包括哺乳动物眼的一种或更多种疾病或功能障碍；或者在rAAV6载体的情况下，干细胞、血细胞、造血细胞或CD35+细胞的一种或更多种疾病，包括例如镰状细胞病、β-地中海贫血等。
本发明还提供了转导哺乳动物细胞群的方法。在整体和一般含义中，所述方法至少包括向所述群的一种或更多种细胞引入包含有效量的本文公开的一种或更多种rAAV载体之组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明还提供了编码一种或更多种本文所述VP3突变衣壳蛋白的分离的核酸区段，并且提供了包含一种或更多种本文所述并且测试的改进载体序列的重组载体、病毒颗粒、感染性病毒体和分离的宿主细胞。
另外，本发明提供了包含一种或更多种所公开的载体或AAv组合物的组合物以及治疗和/或诊断药盒，其与一种或更多种另外的成分一起配制或者与用于其使用的一个或更多个说明一起制备。
本发明还以多种方式证明了所公开的改进的rAAV衣壳突变载体的制备方法和使用方法，包括例如离体(ex situ)、体外和体内应用，方法，诊断程序和/或基因治疗方案。因为本文所述的许多改进载体还抗蛋白酶体降解，所以其在体内具有显著提高的转导效率，使得其特别适合于基于病毒载体的人基因治疗方案，特别是在体外和/或体内向选定的哺乳动物细胞递送一种或更多种基因构建体。
在一个方面，本发明提供了包含重组腺相关病毒(AAV)载体、病毒体、病毒颗粒的组合物及其药物制剂，其可用于向哺乳动物细胞和组织递送编码一种或更多种有益或治疗性产物之遗传物质的方法。特别地，通过其在治疗、预防和/或改善一种或更多种哺乳动物疾病症状中的使用，本发明的组合物和方法在本领域中提供了显著的进步。预期通过提供用于治疗许多不同疾病、紊乱和功能障碍之新的和改进的病毒载体构建体，人基因治疗将特别受益于本教导。
在另一个方面，本发明涉及经修饰的rAAV载体，其编码用于预防、治疗和/或改善递送了载体构建体的哺乳动物中之一种或更多种紊乱的一种或更多种哺乳动物治疗剂。
特别地，本发明提供了用于治疗、预防和/或改善哺乳动物疾病、功能障碍、损伤和/或紊乱之一种或更多种症状的基于rAAV的表达构建体，其编码一种或更多种哺乳动物治疗剂，包括但不限于例如蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、抗原结合片段及其变体和/或活性片段。
在一个实施方案中，本发明提供了rAAV载体，其包含至少第一衣壳蛋白，所述第一衣壳蛋白包含在rAAV衣壳蛋白中的一个或更多个表面暴露氨基酸残基处替换成非天然氨基酸的至少第一氨基酸，并且其中所述载体还额外包含编码至少剂第一诊断或治疗剂的至少第一核酸区段，其与能够在包含所述表达载体构建体的宿主细胞中表达所述片段的启动子有效连接。
本发明的表面暴露氨基酸修饰的rAAV载体可以任选地还包含一个或更多个增强子序列，其各自与所述核酸区段有效连接。示例性增强子序列包括但不限于选自以下的一种或更多种：CMV增强子、合成增强子、肝特异性增强子、血管特异性增强子、脑特异性增强子、神经细胞特异性增强子、肺特异性增强子、肌肉特异性增强子、肾特异性增强子、胰特异性增强子和胰岛细胞特异性增强子。
可用于本发明实践的示例性启动子包括但不限于：一种或更多种异源组织特异性组成型或诱导型启动子，包括但不限于例如选自以下的启动子：CMV启动子、β-肌动蛋白启动子、胰岛素启动子、烯醇化酶启动子、BDNF启动子、NGF启动子、EGF启动子、生长因子启动子、轴突特异性启动子、树突特异性启动子、脑特异性启动子、海马特异性启动子、肾特异性启动子、抑弹性蛋白酶蛋白(elafin)启动子、细胞因子启动子、干扰素启动子、生长因子启动子、α1-抗胰蛋白酶启动子、脑细胞特异性启动子、神经细胞特异性启动子、中枢神经***细胞特异性启动子、外周神经***细胞特异性启动子、白介素启动子、丝氨酸蛋白酶抑制剂启动子、杂合CMV启动子、杂合β-肌动蛋白启动子、EF1启动子、U1a启动子、U1b启动子、Tet诱导型启动子、VP16-LexA启动子或其任意组合。在一些示例性实施方案中，启动子可以包括哺乳动物或鸟类β-肌动蛋白启动子。
第一核酸区段还可以包含一个或更多个转录后调控序列或者一个或更多个多腺苷酸化信号，包括但不限于例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件、多腺苷酸化信号序列或其任意组合。
可通过本发明载体构建体向宿主细胞递送的示例性诊断剂或治疗剂包括但不限于选自以下的试剂：多肽、肽、抗体、抗原结合片段、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸及其任意组合。
在一些示例性实施方案中，本发明改进的rAAV载体将优选地编码选自以下的至少一种诊断性或治疗性蛋白质或多肽：分子标志物、肾上腺素能激动剂、抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、导蛋白(netrin)、神经活性肽、神经活性肽受体、神经原性因子(neurogenicfactor)、神经原性因子受体、神经毡蛋白(neuropilin)、神经营养因子、神经营养蛋白、神经营养蛋白受体、N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、丛蛋白(plexin)、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、脑信号蛋白(semaphorin)、脑信号蛋白受体、血清素转运蛋白、血清素摄取抑制剂、血清素受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂受体、肿瘤抑制剂及其任意组合。
在某些应用中，本发明的衣壳修饰rAAV载体可以包含一个或更多个核酸区段，所述核酸区段编码选自以下的多肽：BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、***、IFN、IFG-1、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、TGF-B2、TNF、VEGF、促乳素、促生长素(somatotropin)、XIAP1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10(I87A)，病毒IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18及其任意组合。
在另一个实施方案中，本发明涉及遗传修饰的改进传导效率的rAAV载体，其包含至少第一核酸区段，所述第一核酸区段编码改变、抑制、降低、防止、消除或削弱细胞中一种或更多种内源生物过程之活性的一种或更多种治疗剂。在一些特定实施方案中，此类治疗剂可以是选择性抑制或降低一种或更多种代谢过程、功能障碍、紊乱或疾病之作用的那些。在某些实施方案中，缺陷可以由期望治疗的哺乳动物的损伤或创伤引起。在另一些实施方案中，缺陷可以由内源生物化合物的过表达造成，而在另一些实施方案中缺陷可以由一种或更多种内源生物化合物的表达不足或甚至缺乏而造成。
当预期使用此类载体向用载体转染的特定细胞引入一种或更多种外源蛋白质、多肽、肽、核酶、siRNA和/或反义寡核苷酸时，可以如下使用本文公开的经修饰AAV载体：向载体中并入至少第一外源多核苷酸，所述第一外源多核苷酸有效位于至少第一异源启动子的下游并在其控制之下，所述第一异源启动子在包含所述载体的细胞中表达多核苷酸以产生被编码的治疗剂，包括例如肽、蛋白质、多肽、抗体、核酶、siRNA以及反义寡核苷酸或多核苷酸。
本发明遗传修饰的rAAV载体和表达***还可以任选地包含第二不同核酸区段，所述第二不同核酸区段包含：改变、改进、调节和/或影响经修饰rAAV载体表达的目的核酸序列之转录的一个或更多个增强子、一个或更多个调控元件、一个或更多个转录元件或其任意组合，基本上由它们组成或者由它们组成。
例如，本发明rAAV载体还包含第二核酸区段，所述第二核酸区段包含：CMV增强子、合成增强子、细胞特异性增强子、组织特异性增强子或其任意组合，基本上由它们组成或者由它们组成。所述第二核酸区段还包含：一个或更多个内含子序列、一个或更多个转录后调控元件或其任意组合，基本上由它们组成或者由它们组成。
本发明改进的载体和表达***还可以任选地进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含一个或更多个多接头、限制性位点和/或多克隆区(基本上由它们组成或由它们组成)，以有助于将一个或更多个选定的基因元件、目的基因或者治疗性或诊断性构建体在载体内的选定位点***(克隆)入rAAV载体。
在本发明的另一些方面，可以通过本文公开的改进的衣壳修饰rAAV载体将外源多核苷酸递送到合适的宿主细胞中，所述外源多核苷酸优选为哺乳动物来源，特别优选编码人、非人灵长类动物、猪、牛、绵羊、猫、犬、马、epine、山羊或狼来源的一种或更多种多肽或肽的多核苷酸。
可以通过所公开的衣壳修饰病毒载体递送到宿主细胞中的外源多核苷酸在某些实施方案中可以编码一种或更多种蛋白质、一种或更多种多肽、一种或多种肽、一种或更多种酶或者一种或更多种抗体(或其抗原结合片段)，或者，可以表达一种或更多种siRNA、核酶、反义寡核苷酸、PNA分子或其任意组合。当期望组合的基因治疗时，可以从单个rAAV表达***产生两种或更多种不同的分子，或者，可以用两种或更多种独特的rAAV表达***转染选定的宿主细胞，其可以各自包含一种或更多种编码治疗剂的不同多核苷酸。
在另一些实施方案中，本发明还提供了包含在感染性腺相关病毒颗粒或病毒体内的衣壳修饰的rAAV载体，以及多种这样的病毒体或感染性颗粒。这样的载体和病毒体可以包含在一种或更多种稀释剂、缓冲剂、生理溶液或药物载剂内，或者配制成用于在一个或更多个诊断、治疗和/或预防方案中向哺乳动物施用。本发明的载体、病毒颗粒、病毒体以及其多种还可以以可接受的赋形剂制剂提供以在兽医中用于向选择的家畜、外来物种(exotics)、驯养的动物和伴侣动物(包括宠物等)以及非人灵长类动物、动物园的(zoological)或以其他方式圈养的标本(specimen)等施用。
本发明还涉及包含至少一种所公开衣壳蛋白修饰的rAAV表达载体或者一种或更多种包含此类表达载体的病毒颗粒或病毒体的宿主细胞。这样的宿主细胞特别是哺乳动物宿主细胞，人宿主细胞是特别高度优选的，其可以是分离的，在细胞或组织培养物中。在遗传修饰的动物模型中，转化的宿主细胞甚至可以包含在非人动物自己的身体内。
在某些实施方案中，还预期了包含一种或更多种所公开的rAAV载体的重组非人宿主细胞和/或分离的重组人宿主细胞的产生可用于多种诊断性和实验室方案，包括例如用于大规模大量生产本文所述rAAV载体的手段。特别预期了这样的病毒生产方法，其是对现有方法的改进，特别包括需要非常高病毒储液效价以可用作基因治疗工具的那些方法。本发明人预期了本方法一个非常显著的优点在于在哺乳动物转导方案中使用较低效价的病毒颗粒而依然保持适当水平的转染率的能力。
包含一种或更多种所公开的衣壳修饰的改进转导效率的rAAV载体、表达***、感染性AAV颗粒或宿主细胞的组合物也形成了本发明的一部分，特别是还包含至少第一可药用赋形剂的那些组合物，其用于治疗以及用于制备用来治疗一种或更多种哺乳动物疾病、紊乱、功能障碍或创伤的药物。这样的药物组合物还可以任选地包含一种或更多种稀释剂、缓冲剂、脂质体、脂质、脂质复合物；或者酪氨酸修饰的rAAV载体还可以包含在微球或纳米颗粒内。
适合用于向人或其他哺乳动物的器官或者组织或者多种细胞或组织中肌内、静脉内或直接注射的药物制剂是特别优选的，但是，还发现本文公开的组合物还可用于向哺乳动物身体的谨慎区域(discreet area)施用，包括例如适合于直接注射到身体中的一种或更多种器官、组织或细胞类型中的制剂。这样的注射部位包括但不限于脑、关节或关节囊、滑膜或滑膜下(subsynovium)组织、腱、韧带、软骨、骨、哺乳动物关节的关节周围肌肉或关节空间，以及向器官(例如心脏、肝、肺、胰、肠、脑、膀胱、肾脏)直接施用，或者患者体内的其他部位，包括例如通过腹内、胸内(intrathorascic)、血管内或脑室内(intracerebroventricular)递送引入病毒载体。
本发明的另一些方面涉及包含一种或更多种本文公开的衣壳修饰的改进转导效率的rAAV载体(基本上由它们组成或者由它们组成)的重组腺相关病毒病毒体颗粒、组合物和宿主细胞，例如，旨在通过合适的手段(如通过肌内、静脉内、关节内或者直接注射)到选定哺乳动物的一个或更多个细胞、组织或器官来向哺乳动物施用的载体的药物制剂。通常，这样的组合物可以与下文所述的可药用赋形剂配制，并且可以包含一种或更多种脂质体、脂质、脂质复合物、微球或纳米颗粒制剂以有助于向期望治疗的选定器官、组织和细胞施用。
本发明还提供了药盒，其包含一种或更多种所公开的衣壳修饰的rAAV载体(以及包含这样载体的一个或更多个病毒体、病毒颗粒、转化的宿主细胞或药物组合物)；以及在一种或更多种治疗、诊断和/或预防临床实施方案中使用这样的药盒的说明。这样的药盒还可以包含一种或更多种试剂、限制酶、肽、治疗剂(therapeutics)、药物化合物或者用于向宿主细胞或向动物递送组合物的装置(例如，注射器、可注射剂(injectables)等)。示例性药盒包含用于治疗、预防或改善疾病、缺陷、功能障碍和/或损伤之症状的那些，或者可以包含用于大规模生产病毒载体本身(例如用于商业销售)，或用于其他人(包括例如病毒学家、医务人员等)使用的组分。
本发明的另一个重要方面涉及使用本文所述的所公开rAAV载体、病毒体、表达***、组合物和宿主细胞来制备用于诊断、预防、治疗或改善动物(特别是脊椎哺乳动物)的疾病、功能障碍、紊乱、异常状况、缺陷、损伤或创伤的至少一种或更多种症状之药物的方法。这样的方法一般包括向有此需要的哺乳动物施用一种或更多种所公开的载体、病毒体、病毒颗粒、宿主细胞、组合物或其多种，施用量和施用时间足以诊断、预防、治疗或减轻受影响动物中的此类疾病、功能障碍、紊乱、异常状况、缺陷、损伤或创伤的一种或更多种症状。所述方法还可包括怀疑患有这样的病症之动物的预防性治疗，或者在诊断后或在症状发作之前向具有出现这样病症风险的那些动物施用这样的组合物。
如上文所述，外源多核苷酸将优选地编码一种或更多种蛋白质、多肽、肽、核酶或反义寡核苷酸，或者这些的组合。事实上，外源多核苷酸可以编码两种或更多种这样的分子，或者可期望编码多种这样的分子。当期望组合基因治疗时，可以由单个rAAV表达***产生两种或更多种不同的分子，或者，可以用两种或更多种独特的rAAV表达***转染选定的宿主细胞，其各自将提供编码至少两种不同的此类分子的独特异源多核苷酸。
包含一种或更多种所公开的rAAV载体、表达***、感染性rAAV颗粒、宿主细胞的组合物也形成了本发明的一部分，特备是还包含至少第一可药用赋形剂的那些组合物，其用于制造药物和包括治疗性施用这样的rAAV载体的方法。这样的药物组合物还可任选地包含脂质体、脂质、脂质复合物；或者所述rAAV载体可以包含在微球或纳米颗粒内。适合于肌内、静脉内或直接注射到人的器官或组织中的药物制剂是特别优选的。
本发明的另一个重要方面涉及使用本文所述的所公开载体、病毒体、表达***、组合物和宿主细胞制备用于治疗或改善哺乳动物中多种多肽缺陷症状之药物的方法。这样的方法一般包括向有此需要的哺乳动物或人施用一种或更多种所公开的载体、病毒体、宿主细胞或组合物，施用量和施用时间足以治疗或改善受影响哺乳动物中的此类缺陷的症状。所述方法还可以包括怀疑患有此类病症的动物的预防性治疗，或者在诊断后或在症状发作之前向具有出现这样病症之风险的那些动物施用这样的组合物。
附图说明
为了有助于理解本发明的原理，现在参考在附图中示出的实施方案或实施例，并且将使用特定语言对其进行描述。然而，将理解的是并未旨在以此限制本发明的范围。预期本发明所属领域的普通技术人员通常将想到所述实施方案的任何改变和进一步修改，以及本文所述的本发明原理的任何进一步应用。
以下附图形成了本说明书的一部分，并且被包括以证明本发明的某些方面。通过参考结合附图的以下描述，可以更好地理解本发明，其中相同的参考数字表示相同的元件，并且其中：
图1A、图1B和图1C示出了NF-κB途径抑制剂和活化剂对体外HeLa细胞中AAV载体介导的EGFP表达的作用。将细胞用多种浓度的抑制剂和活化剂预处理12小时并且以2×103AAV-EGFP vgs/细胞转染。图1A示出了在转染后48小时通过荧光显微术检测的转基因表达。示出了代表性图像。图1B示出了来自图1A数据的定量分析。如所述分析来自五个视野的图像。＊P＜0.001.图1C是用scAAV载体转导并且在NF-κB调节物存在下的HeLa细胞提取物的Western印迹分析。通过使用抗p65和抗IκB抗体[经典途径]、抗-p100/p52抗体[非经典途径]来分析样品以检测响应于AAV暴露的NF-κB信号转导。这些结果代表两个独立实验；
图2A和图2B示出了在NF-κB调节物的存在下，原代人单核细胞衍生树突细胞的AAV-EGFP载体介导的转导。图2A示出了转导后48小时通过流式细胞术检测的转基因表达。图2B是在NF-κB调节物的存在下，来自模拟转导或用2,000vgs/细胞的scAAV载体转导之树突细胞的细胞核提取物中NF-κB活化的经典途径和非经典途径之组分的Western印迹分析；
图3A和图3B示出了小鼠体内AAV载体诱导的先天性免疫和NF-κB应答。还如所描述的进行了先天性免疫调节物(图3A)或NF-κB活化(图3B)的基因表达谱分析(geneexpression profiling)。示出了在2小时间点时比较具有Bay11的AAV载体(阴影或空白柱)与不具有Bay11的AAV载体(黑色或灰色柱)基因表达的倍数变化数据。通过测量二重ΔCT的可变性(与GAPDH相比，2^-ΔCT(可变性))，最小阈值提高倍数(水平的黑线)为2.5(图3A)或3.0(图3B)；
图4A和图4B说明了在通过尾静脉注射1×1011vgs的每种WT-scAAV-EGFP或TM-scAAV-EFGP载体/动物后10天鼠肝细胞中的转基因表达。图4A示出了代表性图像。原始放大倍数：×400。图4B示出了来自图4A之数据的定量分析。如图1A标记所述，定量分析来自5个视野的图像；
图5证明了AAV基因组在反向末端重复(ITR)内包含用于NF-κB响应性转录因子的假定结合位点。通过使用基于网络的TRANSFAC数据库的电脑模拟分析鉴定了AAV-ITR中假定的NF-κB-响应性转录因子结合位点。p300、TFIIB和SpII转录因子的结合位点分别用绿色、红色和蓝色下划线字体表示。框中的序列表示ITR内的20个核苷酸的单链D序列；
图6A、图6B、图6C、图6D和图6E示出了NF-κB活化剂和抑制剂对体外HeLa细胞中来自AAV2-EGFP载体之转基因表达的作用。将细胞模拟处理或用抑制剂和活化剂的多种组合预处理12小时。将经洗涤细胞用2×103vg/细胞的scAAV2-EGFP(图6A)、ssAAV2-EGFP(图6B)或TM-scAAV2-EGFP(图6C)感染。在感染后48小时通过荧光显微术检测转基因表达。示出了代表性图像；在NF-κB调节物的存在下，提取自用scAAV载体转导的HeLa细胞的细胞质(图6D)和细胞核(图6E)的Western印迹分析。通过使用抗p100/p52抗体来分析样品以检测NF-κB信号转导。使用抗GAPDH和核纤层蛋白B抗体作为适当的对照。这些结果代表两个独立实验；
图7示出了模拟注射(n＝2)或在提前施用或不提前施用Bay11的情况下用scAAV载体注射(n＝3每种情况)后，来自小鼠的肝脏匀浆的Western印迹分析。通过使用抗p52抗体来分析样品以检测响应于AAV暴露的NF-κB信号转导。使用抗β-肌动蛋白抗体作为上样对照(loading control)；
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E和图8F示出了在PBS或Bay11预处理后，从来自用WT-AAV或TM-AAV载体注射的动物肝脏样品收集的总mRNA中的多种细胞因子/趋化因子之基因表达的倍数变化。图8A：IL-1α；图8B：IL-6；图8C：TNF-α；图8D：IL-12α，图8E：KC；以及图8F：RANTES。值显著高于2.6和低于0.38；通过测定用于测量特定基因表达的96-孔板中的可变性来计算；
图9证明了在不存在或存在NF-κB抑制剂的情况下对于AAV载体的体液应答。在预先施用或不施用Bay11的情况下，注射scAAV载体(n＝4每种情况)后第10天测定来自小鼠外周血中的抗-AAV2IgG2a水平；
图10说明了利用由HeLa细胞制备的全细胞提取物和32P-标记的单链D[+]-序列探针(泳道1)进行的电泳迁移位移测定，所述探针与宿主细胞蛋白质(泳道3，楔形)相互作用。使用单链D[-]-序列(泳道2)探针作为合适的对照，所述探针也与细胞蛋白质FKBP52(泳道4，箭头)相互作用。在用链霉亲和素珠选择并且通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分级后，还使用生物素标记的ssD[+]-序列探针进行结合测定。通过银染色使相关蛋白质带可视化，从凝胶切除，并且进行质谱，发现一种独特肽与NF-κB-抑制因子(NF-κB-repressing factor，NRF)具有同源性；
图11A和图11B示出了T47D和T47D+hHGFR细胞中AAV3-介导的转基因表达的分析。图11A表明，在相同条件下，相等数目的T47D和T47D+hHGFR细胞被多种指定感染复数(multiplicity-of-infection，MOI)的scAAV3-CBAp-EGFP载体感染。在感染后72小时，通过荧光显微术测定转基因表达。图11B示出了，在不存在或存在5μg/mL hHGF的情况下，用2,000vgs/细胞的scAAV3载体转导T47D+hHGFR细胞。在感染后72小时，通过荧光显微术测定转基因表达；
图12A、图12B和图12C示出了BMS-777607对AAV3-介导的转基因表达的作用。图12A示出了经模拟处理或者用多种浓度的BMS-777607处理的T47D+hHGFR细胞，其被2,000vgs/细胞的scAAV3-CBAp-EGFP载体感染。在感染后72小时通过荧光显微术测定转基因表达。图12B说明了，在不存在或存在1μM BMS-777607的情况下，用10,000vgs/细胞的scAAV3-CBAp-EGFP载体感染T47D和T47D+hHGFR细胞。图12C示出了模拟处理或用BMS-777607预处理T47D和T47D+hHGFR细胞2小时。制备全细胞裂解物并且使用多种指定的一抗在Western印迹上进行分析。使用β-肌动蛋白作为上样对照；
图13A和图13B示出了BMS-777607对多种AAV血清型介导的转基因表达的作用。在图13A中，将模拟处理或用1μM BMS-777607处理的T47D+hHGFR细胞用2,000vgs/细胞的scAAV2-CBAp-EGFP载体、scAAV3-CBAp-EGFP载体或scAAV4-CBAp-EGFP载体感染。在图13B中，将模拟处理或用1μM BMS-777607处理的T47D+hHGFR细胞用2,000vgs/细胞的scAAV5-CBAp-EGFP载体、scAAV7-CBAp-EGFP载体、scAAV8-CBAp-EGFP载体或scAAV9-CBAp-EGFP载体感染。在感染后72小时通过荧光显微术测定转基因表达；
图14A、图14B、图14C和图14D示出了用MG132处理或不处理的Huh7和Hep293TT细胞中AAV3介导的转导效率的比较分析。在图14A中，用scAAV2-CBAp-EGFP载体感染经模拟处理或用5μM MG132处理的HeLa细胞。在图14B中，用scAAV3-WT-CBAp-EGFP载体感染经模拟处理或用多种浓度的MG132处理的Huh7和Hep293TT细胞。在图14C中，用scAAV2-CBAp-EGFP载体感染经模拟处理或用200μM Tyr23处理的HeLa细胞。在图14D中，用scAAV3-CBAp-EGFP载体感染经模拟处理或用Tyr23处理的Hep293TT细胞。在转导后72小时测定转基因表达；
图15A、图15B和图15C示出了AAV3衣壳上表面暴露的酪氨酸残基的位点定向突变分析。在相同条件下用WT或F501Y scAAV3-CBAp-EGFP载体转导Huh7细胞，并且在转导后72小时测定转基因表达。示出了在Huh7(图15B)和Hep293TT(图15C)细胞中WT(图15A)和多种Y-F scAAV3-介导的转基因表达的转导效率。在转导后72小时测定转基因表达；
图16A、图16B和图16C说明了WT以及单个、双重和三重酪氨酸突变AAV3载体的转导效率。在图16A中，在相同条件下用WT或多种指定的Y-F突变scAAV3-CBAp-EGFP载体转导Huh7细胞。在转导后72小时测定转基因表达。在图16B中，在不存在或存在5μg/mL hHGF的情况下，用5,000vgs/细胞的WT或Y→F突变的scAAV3载体转导Huh7细胞。图16C示出了在感染后72小时通过荧光显微术测定转基因表达；
图17A、图17B、图17C和图17D示出了直接瘤内注射后体内AAV3载体的转导效率。示出了NSG小鼠中Huh7(图17A)衍生肿瘤和Hep293TT(图17B)衍生肿瘤中WT-AAV3载体的转导效率。还示出了NSG小鼠中Hep293TT衍生肿瘤中WT-AAV3(图17C)和Y705+731F-AAV3(图17D)载体的转导效率。示出了每一组小鼠的两个代表性肿瘤切片的EGFP荧光(绿色)和DAPI染色(蓝色)；
图18A、图18B和图18C说明了在尾静脉注射后NSG小鼠中Hep293TT衍生肿瘤中WT-AAV3和Y705+731F-AAV3载体的转导效率。示出了来自每一组用PBS(图18A)、WT-AAV3(图18B)或Y705+731F-AAV3(图18C)载体注射之小鼠的***性肿瘤切片中肿瘤的EGFP荧光(绿色)和DAPI染色(蓝色)；
图19A和图19B示出了多种激酶抑制剂对HEK293细胞中ssAAV和scAAV介导的EGFP表达的作用。细胞在感染前用抑制剂预处理1小时，然后以1×103vgs/细胞转导。在图19A中，在感染后48小时通过荧光显微术检测转基因表达。在图19B中，如所描述的分析来自三个视野的图像。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图20A和图20B示出了单位点定向scAAV2衣壳突变体转导HEK293细胞后EGFP表达的分析。将AAV2衣壳中的15个表面暴露丝氨酸(S)的每一个替换成缬氨酸(V)，然后评估其介导转基因表达的效率。图20A示出了在以1×103vgs/细胞的MOI感染后48小时的EGFP表达分析。图20B示出了每种丝氨酸突变AAV2载体转导效率的定量。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图21和图21B说明了AAV2的结构。在图21A中，AAV2 VP3的三聚体以带图(ribbonrepresentation)示出，沿着二十面体三倍轴(左)向下观察并且旋转90°(右)，VP单体着色为蓝色、紫色和淡蓝色，分别以黄色、绿色和红色球示出了丝氨酸残基458、492和662的位置。二十面体二倍、三倍和五倍轴的大致位置分别用填充的椭圆、三角形和五角形描绘。在图21B中，如之前在类似图中示出的，AAV2的衣壳表面以蓝色示出，丝氨酸残基458、492和662以相同颜色突显。S458和S492残基彼此相邻地位于朝向围绕二倍轴的凹陷(depression)之突出的外表面上。S662位于HI环(白色)(核心八链β-桶状结构(beta-barrel)的β-H和β-I链之间)上，其位于围绕二十面体五倍轴之凹陷的底部。以棕色示出了五倍对称性相关DE环(β-D和β-E链之间)，其在二十面体五倍轴处形成通道。二十面体二倍(2F)、三倍(3F)和五倍(5F)轴的大致位置以空心箭头表示；
图22A和图22B概括了对将scAAV2衣壳中662位处的丝氨酸替换成不同氨基酸在介导转基因表达中之作用的评估。利用不同氨基酸产生了以下八种丝氨酸突变体：S662→缬氨酸(V)、S662→丙氨酸(A)、S662→天冬酰胺(N)、S662→天冬氨酸(D)、S662→组氨酸(H)、S662→异亮氨酸(I)、S662→亮氨酸(L)和S662→苯丙氨酸(F)，并且分析了其在293细胞中的转导效率。图22A示出了在以1×103vgs/细胞的MOI感染293细胞后48小时时的EGFP表达分析。图22B示出了每一种丝氨酸突变AAV2载体之转导效率的定量。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图23A和图23B示出了scAAV2-S662V载体的转导效率与在多种细胞类型中的p38MAPK活性的相关性分析。图23A说明了HEK293、HeLa、NIH3T3、H2.35和moDC中WT-AAV2载体和S662V-AAV2载体之转导效率的定量。图23B是来自不同细胞系的裂解物之p-p38 MAPK表达水平的Western印迹分析。测量总p38 MAPK和GAPDH水平并且用作上样对照。相对于WTAAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图24A、图24B和图24C说明了单核细胞衍生的树突细胞(monocyte-deriveddendritic cell，moDC)中scAAV载体介导的转基因表达。图24A说明了JNK和p38 MAPK抑制剂以及662位处的丝氨酸残基位点定向替换对EGFP表达的作用。图24B概括了在感染后48小时以及开始成熟时来自图24A数据的定量。图24C是在以5×104vgs/细胞的MOI用scAAV2-S662V载体感染的moDC中共刺激标志物(如CD80、CD83、CD86)表达的分析。将用如本文所述产生的细胞因子刺激的iDC(不成熟树突细胞)和mDC(成熟树突细胞)分别用作阴性和阳性对照。示出了一个代表性实例。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图25说明了hTERT特异性细胞毒性T-淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)对K562细胞之杀伤活性的分析。CTL在通过编码截短的人端粒酶(hTERT)的scAAV2-S662V载体转导moDC后产生。使用scAAV2-S662V-EGFP载体截短的moDC产生非特异性CTL。用绿色荧光膜染色剂3，3-dioctadecyloxacarbocyanine(DiOC18(3))预染色，将1×105靶K562细胞与CTL以不同的比(80∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1)共培养过夜。添加可透过膜的核酸复染剂碘化丙啶来标记具有被破坏质膜的细胞。通过流式细胞术分析被杀伤的双重染色阳性细胞的百分比；
图26A和图26B示出了用单位点定向的AAV2衣壳突变体转导HEK293细胞后EGFP表达的分析。AAV2衣壳中的17个表面暴露苏氨酸(T)中的每一个被替换成缬氨酸(V)并且评估其介导转基因表达的效率。在图26A中，示出了感染后48小时的EGFP表达分析(1×103vg/细胞的MOI)。图26B示出了每个苏氨酸突变scAAV2载体之转导效率的量化。相对于WTAAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图27A和图27B示出了用多位点定向的AAV2衣壳突变体感染的HEK293细胞中EGFP表达的分析。在单个AAV2衣壳上合并了多个最有效的苏氨酸突变以产生双重和三重突变体并且评估各载体的效率。图27A说明了以1×103vg/细胞的MOI感染后48小时的EGFP表达分析。图27B示出了每个苏氨酸突变AAV2载体之转导效率的量化。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图28A和图28B证明了用衣壳优化的AAV2载体转导的H2.35细胞中EGFP表达的评估。在单个AAV2衣壳上合并了最有效的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸突变以产生多种优化的AAV突变体。在无限增殖化鼠肝细胞上估计每个载体的效率。图28A示出了以1×103vg/细胞的MOI感染后48小时的EGFP表达分析。图28B概括了每个优化的scAAV2载体之转导效率的量化。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图29A和图29B示出了由衣壳优化的AAV载体介导的H2.35细胞中EGFP表达的动力学。图29A示出了在以1×103vg/细胞的MOI感染后16、24和48小时的EGFP表达分析。图29B说明了来自每个优化的scAAV2载体转导效率之量化的结果。相对于WT AAV2，＊P＜0.005，＊＊P＜0.001；
图30A和图30B示出了AAV多重突变载体向细胞核的细胞内运输的分析。在感染后16小时(图30A)和48小时(图30B)分离用AAV2-WT、AAV2-Y444F+Y500F+Y730F或AAV2-Y444F+Y500F+Y730F+T491V多重突变体感染的H2.35细胞的细胞核和细胞质级分并且进行qPCR分析以评估载体基因组在细胞内的分布。细胞核中与WT相比，＊＊P＜0.001被认为是显著的；
图31A和图31B示出了在尾静脉注射多位点定向的AAV2衣壳突变体后，体内荧光素酶基因表达的成像。用携带荧光素酶基因的多个最有效突变scAAV载体以1×1010vg/动物注射C57BL/6小鼠。取得实时图像以分析荧光素酶活性的差异。可视输出代表了作为其中最大值为红色并且最小值为蓝色的假彩色图像的发射光子数/秒/cm2(图31A)和相对信号强度(图31B)。＊P＜0.005被认为是显著的；
图32A和图32B说明了AAV2衣壳表面。图32A示出了AAV2的衣壳表面(灰色)，其具有为蓝色(251、329、330、454、503、581、592、597、660、671、701、713、716)、绿色(455)、黄色(491)、棕色(550)和粉色(659)的17个突变的表面苏氨酸残基。以箭头表示T329、T330、T713和T716的表面位置。5倍对称性相关的DE环(βD和βE链之间)着色为橙色。HI环(βH和βI链之间)着色为白色，而位于该环中的S662为红色。图32A中的白色虚线三角形描绘了由5倍轴和两个三倍轴以及三倍之间的二倍轴界定的病毒不对称单元。虚线椭圆描绘了当突变时影响转导之苏氨酸残基的大致足迹(2/60)。图32B示出了病毒不对称单元内的AAV2衣壳表面残基的“路标”投影(“roadmap”projection)。图32A中对AAV2表面苏氨酸和S662覆盖的区域进行了着色。以紫色阴影示出了酪氨酸三突变残基444、500和730中的残基。图23A中描绘了虚线椭圆。虚线矩形(蓝色)示出了之前确定对硫酸肝素受体与AAV2和AAV6结合重要的残基(Wu等，2006；Opie等，2003)；
图33A、图33B和图33C说明了来自血清型AAV1至AAV10的野生型衣壳的氨基酸比对。图33A示出了野生型AAV1-10血清型衣壳的氨基酸比对(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10)。图33B示出了野生型AAV1-AAV10血清型衣壳的氨基酸比对以及在AAV1-AAV10衣壳中保守的表面暴露的丝氨酸和苏氨酸残基(保守的表面暴露残基以粗体示出)；并且图33C示出了野生型AAV1-AAV12衣壳中保守的表面暴露酪氨酸残基以及氨基酸修饰的一些实施方案。AAV1-AAV12中保守的酪氨酸残基以粗体示出；
图34示出了多种丝氨酸→缬氨酸突变的AAV2载体相对于WT AAV2载体的包装和转导效率，以及野生型AAV1-AAV10衣壳的氨基酸比对；
图35描绘了利用多种氨基酸替换的丝氨酸突变载体相对于WT AAV2载体的包装和转导效率；
图36A、图36B、图36C、图36D和图36E示出了体内鼠异种移植模型中人HCC肿瘤中rAAV3和rAAV8载体的转导效率。使用雌性和雄性具有Huh7肿瘤的NSG小鼠用rAAV3-CBAp-FLuc或rAAV8-CBAp-FLuc载体以1×1011vgs/小鼠来进行尾静脉注射。每组n＝4。图36A示出了在施用载体后3天的小鼠全身生物发光图像的代表性图像。图36B说明了来自施用载体后3天的小鼠全身生物发光图像之转基因表达数据的定量分析。图36C示出了使用具有Huh7肿瘤的雄性NSG小鼠，用rAAV3-CBAp-FLuc或rAAV8-CBAp-FLuc载体以1×1011vgs/小鼠的较低剂量(L)或1×1012vgs/小鼠的较高剂量(H)直接瘤内注射。每组n＝4。示出了施用载体后7天的较低剂量的代表性图像。图36D表示在施用载体后3天或7天时，来自用rAAV3或rAAV8载体注射的小鼠之肿瘤和肝脏中转基因表达的定量数据。图36E示出了在施用载体后7天时，来自较高剂量rAAV3或rAAV8载体注射的小鼠之肝脏组织样品中持续的载体基因组拷贝数；
图37A、图37B、图37C、图37D、图37E和图37F示出了体外人肝癌细胞中WT和衣壳修饰的rAAV3载体的转导效率。图37A示出了用携带CBAp-FLuc表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导Huh7细胞。图37B示出了用携带CBAp-EGFP表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导HepG2细胞，而图37C示出了用携带CBAp-EGFP表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导Hep293TT细胞。图37D示出了在不存在或存在低(100ng/mL)或高(100μg/mL)剂量的可溶性肝素的情况下，用携带CBAp-EGFP表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导Huh7细胞。图37E示出了在不存在或存在5μg/mL hHGF的情况下，用携带CBAp-EGFP表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导Huh7细胞。图37F示出了用携带CBAp-EGFP表达盒的所指定病毒载体以5,000vgs/细胞转导人T47D细胞或T47D+hHGFR细胞。在转导后48小时测定所有转基因表达水平；
图38A、图38B、图38C和图38D示出了体内示例性rAAV3衣壳突变载体的转导效率。图38A示出了使用具有人Huh7或Hep293TT肝脏肿瘤的NSG小鼠，用携带CBAp-FLuc表达盒的所指定突变病毒载体以5×1010vgs/小鼠进行尾静脉注射。每组n＝4。在第3天，获得小鼠全身生物发光图像，然后解剖生长的肿瘤和正常肝脏二者。示出了代表性图像。图38B示出了表示Huh7衍生肿瘤和Hep293TT衍生肿瘤中FLuc表达的定量数据。示出了Huh7肿瘤(图38C)和正常肝脏(图38D)中的载体基因组拷贝数；
图39A、图39B和图39C示出了本发明的一些示例性实施方案。图39A示出了表达TCS基因的优化rAAV3载体对鼠异种移植物模型中人肝脏肿瘤发生的抑制；图39B和图39C示出了这样的结果：使用具有Huh7-FLuc肿瘤的小鼠，使用指定的病毒载体以5×1010vgs/小鼠在第0天进行尾静脉注射，并且监视随时间的肿瘤生长，直到第11天。图39B描绘了在第8天来自两个组的小鼠代表性全身生物发光图像。图39C概括了在第11天通过分光光度方法在rAAV3-TCS载体注射小鼠和rAAV3-EGFP载体注射小鼠中测量的AST和ALT的血清活性。数据表示为平均值±SD(n＝5/组)；
图40A、图40B和图40C示例性地示出了根据本发明一个方面的有用的载体构建体和多核苷酸序列。图40A示出了用于这些研究的rAAV载体的示意结构。HP：发夹；D：AAV反向末端重复(ITR)中的D序列；CBAp：CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子；FLuc：萤火虫荧光素酶；hGH(A)n：人生长激素poly A序列；HP-：不具有末端解离位点(terminal resolution site，trs)的发夹结构；EGFP：增强的绿色荧光蛋白；AFPp：人α-甲胎蛋白启动子；TCS：天花粉蛋白(Tricosanthin)；图40B示出了原始TCS基因的核苷酸序列。分别以绿色和红色字体示出了起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)。图40C示出了FLAG标记的TCS基因的核苷酸序列。分别以粗斜字体示出用于克隆化学合成的TCS基因的EcoRI和XhoI限制酶位点，而含有终止密码子(TAA)的FLAG-标签序列具有下划线；以及
图41示出了多种单个、双重和多重突变scAAV3-CBAp-EGFP载体在人HCC细胞系Huh7中的转导效率。
序列简述
SEQ ID NO：1是野生型腺相关病毒血清型1(AAV1)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2是野生型腺相关病毒血清型2(AAV2)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3是野生型腺相关病毒血清型3(AAV3)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：4是野生型腺相关病毒血清型4(AAV4)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5是野生型腺相关病毒血清型5(AAV5)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：6是野生型腺相关病毒血清型6(AAV6)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7是野生型腺相关病毒血清型7(AAV7)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：8是野生型腺相关病毒血清型8(AAV8)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9是野生型腺相关病毒血清型9(AAV9)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：10是野生型腺相关病毒血清型10(AAV10)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：11是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：12是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：13是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：14是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：15是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：16是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：17是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：18是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：19是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：20是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：21是根据本发明有用的寡核苷酸引物序列；
SEQ ID NO：22是含有NF-κB响应性转录因子之假定结合位点的核酸序列(参见图5)；
SEQ ID NO：23是单链核酸序列探针(参见图10)；
SEQ ID NO：24是双链核酸序列探针(参见图10)；
SEQ ID NO：25是单链核酸序列探针(参见图10)；
SEQ ID NO：26是TCS基因的核酸序列(参见图40B)；以及
SEQ ID NO：27是FLAG-标记的TCS基因的核酸序列(参见图40C)。
具体实施方式
以下描述了本发明的说明性实施方案。为了清楚起见，本说明书中并未描述实际实施的所有特征。无疑应当理解，在任何此类实际实施方案的开发中，必须做出许多实施特定的决策以实现开发者的特定目的，例如符合***相关的和商业相关的限制，其在不同实施之间不同。此外，应当理解的是，这样的开发努力可能是复杂并且耗时的，但是对受益于本公开的本领域普通技术人员来说将是常规任务。
重组腺相关病毒(AAV)载体已经被成功用于人疾病之多种临床前动物模型中的体内基因转移，并且已经成功用于长期表达多种治疗性基因(Daya和Berns，2008；Niemeyer等，2009；Owen等，2002；Keen-Rhinehart等，2005；Scallan等，2003；Song等，2004)。当靶向免疫赦免(immune-privilege)部位时，即用于Leber先天性黑矇的眼递送时，AAV载体已经在人中产生了长期临床益处(Bainbridge等，2008；Maguire等，2008；Cideciyan等，2008)。该载体的一个主要优点在于其比较低的免疫谱(immune profile)，仅引起有限的炎性应答，并且在一些情况下，甚至指导对于转基因产物的免疫耐受(LoDuca等，2009)。但是，当靶向非免疫赦免的器官时，由于对病毒衣壳的抗体和CD8+T细胞应答，在人中的治疗效力被限制，而在动物模型中，已经报道了对于转基因产物的适应性应答(Manno等，2006；Mingozzi等，2007；Muruve等，2008；Vandenberghe和Wilson，2007；Mingozzi和High，2007)。这些结果表明，免疫应答依然是AAV载体介导的基因转移的关注点。
基于来自鼠模型的临床前数据(Snyder等，1999)，许多年来AAV被认为是最低免疫原性，这是因为缺少之前这些抗原在这些模型中的暴露，以及对载体存在多种耐受诱导机制(Dobrzynski等，2004；Cao等，2007)。这在血友病B的鼠和犬模型中的基因转移研究中得到了最好的说明，其表现出明显的治疗效力(5-25％的F.IX水平)以及长期(2-8年)且稳定的F.IX表达(Snyder等，1999)。在第一临床试验中，使用AAV递送人F.IX基因到患有血友病B之对象的肝脏中，观察高剂量载体(2×1012vgs/kg体重)下F.IX的治疗水平表达(～11.8％)(Manno等，2006)。
但是，在基因转移后4-6周，观察到了AAV衣壳特异性T细胞应答，其符合肝脏转氨酶的升高和F.IX转基因表达水平向基线水平的降低。这种CD8+T细胞介导的免疫应答是出人意料的(Mingozzi等，2007)，因为这在任何临床前动物模型中均未观察到。本研究和多个其他研究已经涉及对于细胞毒性T淋巴细胞介导的转导的肝细胞之消除的宿主炎性和先天性免疫应答(Zhu等，2009；Li等，2009；Madsen等，2009)。随后，进行了大量努力来解决对于AAV载体的宿主免疫应答。这些包括使用替代的天然存在的AAV血清型，例如AAV1(Brantly等，2009；Cohn等，2007)或AAV8(Nathwani等，2006)，使用改组的衣壳(shuffled capsid)(Gray等，2010)或表面暴露的酪氨酸突变AAV2(Markusic等，2010)载体。此外，逆转与免疫应答相关风险的策略已经包括使用在宿主组织中靶向表达的转基因构建体(Wang等，2010)，或者开发短暂的免疫抑制方案(Jiang等，2006)。
尽管这样的策略已经递增地改进了AAV基因转移的安全性，然而其在人中的效力依然有待观察。例如，利用环孢菌素和MMF的免疫抑制在较低的AAV载体剂量(3×1011vg/kg)下有效，但是在具有脂蛋白脂肪酶缺陷的患者中于肌肉定向的基因转移期间，未能阻止对于高剂量(1×1012vg/kg)衣壳的IFN-αCD8+T细胞应答(Ross等，2006)。这些数据强调了继续对病毒-宿主细胞相互作用生物学进一步研究以鉴定响应于AAV感染的第一“危险信号”的重要性。合理的是，理解经AAV转导后宿主细胞中与炎性和先天性免疫应答相关的蛋白质的潜在活性和选择性是如何被控制的，可能为解决衣壳和/或转基因产物的宿主免疫应答的障碍提供了线索。尽管与其他病毒载体相比，AAV载体在转导专职性APC(如DC)中效率低，但是激活NF-κB的另外信号会导致这些细胞中提高的转基因表达，从而增加对于转基因产物的适应性应答的风险。
基于AAV血清型2的重组载体目前用于若干基因治疗临床试验(Daya和Berns，2008)，并且最近在治疗Leber先天性黑矇中表现出明显效力(Bainbridge等，2008；Cideciyan等，2008；Maguire等，2008)。但是，基于一般群体中血清阳性的高盛行率(～80％至90％)，已经引起了对AAV2载体之体液应答的关注(Boutin等，2008；Mendell等，2010；Manno等，2006)。许多新AAV血清型的发现促进开发AAV载体来解决该潜在问题(Muramatsu等，1996；Chiorini等，1997；Chiorini等，199；Rutledge等，1998；Gao等，2002；Gao等，2004)。
例如，最近报道重组AAV8载体是肝癌小鼠模型中的治疗剂(Kato等，2006)。但是，多个研究组已经描述了多种策略来使用AAV2载体靶向鼠模型中的人肝癌细胞(Su等，1996；Peng等，2000；Su等，2000；Ma等，2005；Wang等，2005；Tse等，2008；Zhang等，2008；Malecki等，2009；Wang等，2010)。为了鉴定对于靶向人肝癌细胞最有效的AAV血清型，发现三种不同的人肝癌细胞系被AAV3载体极有效地转导(Glushakova等，2009)。随后鉴定了人肝细胞生长因子受体(hHGFR)是用于AAV3感染的细胞共受体(Ling等，2010)。在AAV3介导的转导中hHGFR的确切作用，尤其是与hHGFR的细胞内结构域相关的酪氨酸激酶活性的作用最初依然不清楚。实施例5(参见下文)中的数据提供了对AAV3-hHGFR相互作用的更详细的解释，并且说明了用于靶向人肝癌细胞的优化衣壳突变AAV3载体的开发。
rAAV衣壳蛋白
如下步骤是辅助病毒(helper)依赖性人细小病毒，腺相关病毒2(AAV2)生命周期中的关键步骤：将60个单独的衣壳蛋白亚基超分子组装成能够保护4.7kb单链DNA基因组之无包膜的T-1二十面体网格(lattice)。成熟的直径为20-nm的AAV2颗粒由由三种结构蛋白以比1∶1∶18构成，这三种蛋白被命名为VP1、VP2和VP3(分子质量分别为87、73和62kDa)。基于其对称性和这些分子量的估计，在包含颗粒的60个衣壳蛋白中，三个是VP1蛋白，三个是VP2蛋白，且五十四个是VP3蛋白。三种结构蛋白的使用使得AAV血清型是细小病毒中独特的，因为已知所有其他病毒在仅由两种衣壳蛋白构成的二十面体颗粒中包装其基因组。这些60个衣壳蛋白的反平行β-链桶状排列导致了高度抗降解的具有限定向性的颗粒。本发明人已经发现一个或更多个衣壳蛋白中的一个或更多个酪氨酸残基的修饰在较低剂量和较低成本下取得了比常规方案优异的转染。通过对衣壳表面的一个或更多个酪氨酸残基进行位点特异性修饰，本发明人已经取得了转导效率的显著改进。
改进的衣壳修饰rAAV载体的用途
本发明提供了包含一种或更多种所公开酪氨酸修饰的rAAV载体的组合物，所述组合物包含在用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾病、损伤、紊乱、创伤或功能障碍的一种或更多种症状的药盒内。这样的药盒可用于诊断、预防和/或治疗，特别是可用于治疗、预防和/或改善以下疾病的一种或更多种症状：癌症、糖尿病、自身免疫病、肾疾病、心血管疾病、胰疾病、肠疾病、肝疾病、神经***疾病、神经肌肉障碍、神经运动缺陷、神经骨骼损伤、神经失能、感觉神经功能障碍、中风、缺血、进食障碍、α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、巴腾病(Batten’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、镰状细胞病、β-地中海贫血、亨廷顿病(Huntington’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、骨骼疾病、创伤、肺疾病或其任意组合。
本发明还提供了本文所公开组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或改善疾病、紊乱、功能障碍、损伤或创伤的症状，包括但不限于治疗、阻止和/或预防疾病、紊乱或功能障碍，和/或改善这样的疾病、紊乱或功能障碍的一种或更多种症状。可特别使用基于rAAV病毒的基因治疗的示例性病症包括但不限于：癌症、糖尿病、镰状细胞病、β-地中海贫血、自身免疫病、肾疾病、心血管疾病、胰疾病、眼疾病、肠疾病、肝疾病、神经***疾病、神经肌肉障碍、神经运动缺陷、神经骨骼损伤、神经失能、感觉神经功能障碍、中风、α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、巴腾病、缺血、进食障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、骨骼疾病、肺疾病及其任意组合。
本发明还提供了用于治疗或改善哺乳动物中这样的疾病、损伤、紊乱或功能障碍之症状的方法。这样的方法一般至少包括以足以治疗或改善哺乳动物中这样的疾病、损伤、紊乱或功能障碍之症状的量和时间向有此需要的哺乳动物施用一种或更多种本文公开的酪氨酸修饰的rAAV载体的步骤。
特别预期了人治疗中这样的治疗方案，通过肌内、静脉内、皮下、鞘内、腹膜内，或者通过直接注射到被护理哺乳动物的器官或组织中来施用一种或更多种组合物。
本发明还提供了用于以向患者有效地提供治疗有效量的期望治疗剂的量和时间来向有此需要的哺乳动物提供治疗有效量的本发明rAAV组合物的方法，所述治疗剂由包含在rAAV载体内的一个或更多个核酸区段编码。优选地，所述治疗剂选自多肽、肽、抗体、抗原结合片段、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、诊断标志物、诊断分子、报道分子及其任意组合。
AAV载体组合物
本发明方法的一个重要方面在于以下事实：本文所述改进的rAAV载体允许递送更小效价的病毒颗粒以实现与使用更高水平的常规非表面衣壳经修饰的rAAV载体获得相同的转导效率。为此，AAV组合物的量和此类组合物的施用时间将在受益于本发明教导的本领域技术人员的知识范围之内。事实上，本发明人预期了可通过单次施用，例如单次注射足够数目的感染性颗粒来实现治疗有效量的所公开组合物的施用，以向经受此类治疗的患者提供治疗益处。或者，在一些情况下，可期望在相对短的或相对延长的时期来提供AAV载体组合物的多次或连续施用，如可以由监督此类组合物之施用的医生确定。例如，向哺乳动物施用的感染性颗粒的数目可以为约107、108、109、1010、1011、1012、1013或甚至更多感染性颗粒/mL，考虑到可能需要单剂量(或分成两次或更多次施用等)以取得对治疗的特定疾病或病症的治疗。事实上，在某些实施方案中，可期望单独地或与一种或更多种其他诊断剂、药物、生物活性剂等组合来施用两种或更多种不同的基于rAAV载体的组合物，以实现特定方案或治疗的预期效果。在大部分基于rAAV载体之基因治疗的方案中，本发明人预期与使用等同的野生型或对应“未修饰”rAAV载体相比，当使用本文所述的经修饰衣壳rAAV载体时将需要较低效价的感染性颗粒。
本文使用的术语“工程”或“重组”细胞旨在是指其中引入了外源多核苷酸片段(例如，导致生物活性分子转录的DNA片段)的细胞。因此，工程细胞不同于天然存在的细胞，所述天然存在的细胞不含重组引入的外源DNA片段。因此，工程细胞是包含至少一种或更多种人为引入的异源多核苷酸片段的细胞。
为了表达根据本发明的治疗剂，可以制备包含处于一个或更多个启动子控制之下的治疗剂编码核酸区段的酪氨酸修饰的rAAV表达载体。为了使序列处于启动子“控制之下”，通常将转录阅读框的转录起始位点的5′端放置在选定的启动子(即，3′端)下游的约1至约50个核苷酸之间。“上游”启动子刺激DNA的转录并且促进所编码多肽的表达。在此情形下，这是“重组表达”的含义。特别优选的重组载体构建体是包含rAAV载体的那些。此类载体在本文中进行了详细描述。
当预期使用此类载体来向载体转染的特定细胞引入一种或更多种外源蛋白质、多肽、肽、核酶和/或反义寡核苷酸时，可以使用本文公开的衣壳修饰的rAAV载体来向选定的宿主细胞递送一种或更多种外源多核苷酸。
药物组合物
本发明的遗传构建体可以制备在多种组合物中，并且还可以配制在合适的药物载剂中以用于向人或动物对象施用。本发明的rAAV分子和包含它们的组合物提供了新的和有用的治疗，以用于治疗、控制和改善多种紊乱(特别是关节疾病、紊乱和功能障碍，包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎和相关紊乱)的症状。
本发明还提供了包含一种或更多种所公开的衣壳修饰rAAV载体、表达***、病毒体、病毒颗粒、哺乳动物细胞或其组合的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了一种或更多种本文公开的衣壳修饰rAAV载体的药物制剂，其用于向细胞或动物单独地或者与一种或更多种其他形式的治疗(特别是用于影响人的人细胞、组织和疾病的治疗)组合施用。可药用赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员公知的，如开发在多种治疗方案中使用本文所述特定组合物的合适给药和治疗方案，包括例如经口、胃肠外、静脉内、鼻内、关节内、肌内施用和配制。
示例性定义
根据本发明，多核苷酸、核酸区段、核酸序列等包括但不限于由天然来源获得，化学合成、修饰或以其他方式人为全部或部分制备或合成的DNA(包括但不限于基因组DNA或基因组外DNA)、基因、肽核酸(PNA)、RNA(包括但不限于rRNA、mRNA和tRNA)、核苷和合适的核酸区段。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然可以使用任何与本文描述的那些类似或等同的方法和组合物来实施或测试本发明，但是本文描述了一些优选方法和组合物。为了本发明的目的，下文定义了以下术语：
根据存在已久的专利法惯例，当在本申请(包括权利要求书)中使用时，未用数量词限定的名词是指“一个/种或更多个/种”。
本文使用的术语“约”和“大约”可互相使用，并且一般应理解为是指给定数值周围的数值范围，以及所列数值范围内的所有数值(例如，“约5至15”意指“约5至约15”，除非另有说明)。此外，本文的所有数值范围应理解为包括该范围内的每一个全整数。
本文所述的术语“载体(carrier)”旨在包括对于向相关动物施用来说可药用的任何溶剂、分散介质、包衣、稀释剂、缓冲剂、等张剂、溶液、混悬液、胶体、惰性物质等，或者其组合。使用用于通常化合物以及特别地化学治疗剂的一种或更多种递送载体(deliveryvehicle)是药物领域普通技术人员公知的。除了任何常规介质或药剂与活性成分不相容外，预期了其在诊断性、预防性和治疗性组合物中的用途。还可以向一种或更多种所公开化学治疗组合物中并入一种或更多种补充的活性成分，或者将它们联合施用。
本文使用的术语“DNA区段”是指与特定物种的总基因组DNA分离的DNA分子。因此，使用一种本文所公开组合物从生物样品获得的DNA区段是指已经与获得它们之特定物种的总基因组DNA分离或者从其纯化的一种或更多种DNA区段。术语“DNA区段”包括DNA区段以及这样区段的更小片段，以及重组载体，包括例如质粒、黏粒、噬菌体、病毒等。
本文使用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症或者另外能够产生预期治疗效果的量。本文使用的术语“例如”或“如”仅用于举例，而不是旨在限制，并且不应解释为仅提及说明书中明确列举的那些项。
本文使用的“异源”是相对于预定参照基因序列定义的。例如，对于结构基因序列，将异源启动子定义为并不与参照结构基因天然地相邻存在，但是通过实验室操作放置的启动子。同样地，将异源基因或核酸区段定义为并不与参照启动子和/或增强子元件天然地相邻存在的基因或片段。
本文使用的术语“同源性”是指两个或更多个多核苷酸或多肽序列之间的互补程度。当第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列具有完全相同的一级序列时，词语“同一性”可以代替词语“同源性”。可以使用本领域中已知的算法和计算机程序通过分析两个或更多个序列来确定序列同源性和序列同一性。这样的方法可用于评估给定序列是否与另一选定的序列同一或同源。
当提及多肽时，本文使用的术语“同源”意指尽管来自不同来源，但是具有相同的基本核苷酸序列的序列。通常，同源核酸序列来源于密切相关的基因或具有一个或更多个基本类似的基因组序列的生物体。相比之下，“类似的”多核苷酸是这样的多核苷酸，其与来自不同物种或生物体的多核苷酸具有相同功能，但是可能具有显著不同的一级核苷酸序列，其编码实现类似功能或具有类似生物活性的一种或更多种蛋白质或多肽。类似的多核苷酸通常可能来源于(例如，基因或***化发生上)不密切相关的两种或更多种生物体。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“同一”或“同一性”百分比是指当用于最大对应的比较和比对时，如使用以下描述的一种序列比较算法(或者普通技术人员可获得的其他算法)测量或通过目视检查，相同的或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。
本文使用的短语“需要治疗”是指由护理者(例如医生或兽医)做出的患者需要(或者将以一种或更多种方式受益于)治疗的判断。这样的判断可以基于护理者的专门知识范围内的多种因素做出，并且可包括这样的知识：由于患有可通过一种或更多种化合物或药物组合物(例如本文给出的那些)治疗的疾病状态而使患者生病。
本文使用的术语“核酸”包括以下一种或更多种类型：多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)，以及为嘌呤或嘧啶碱基或者经修饰嘌呤或嘧啶碱基(含脱碱基位点)的N-糖苷的任何其他类型多核苷酸。本文使用的术语“核酸”还包括共价结合的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，所述共价结合通常通过亚基之间的磷酸二酯键进行，但是在一些情况下通过硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等进行。“核酸”包括单链DNA和双链DNA，以及单链RNA和双链RNA。示例性核酸包括但不限于：gDNA；hnRNA；mRNA；rRNA、tRNA、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snORNA)、小核RNA(snRNA)和小时序RNA(smalltemporal RNA，stRNA)等及其任意组合。
当应用于物体时，本文使用的术语“天然存在”是指物体可以在自然界找到的事实。例如，存在于这样生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，其可以从天然来源分离并且没有在实验室故意人为修饰。如本文使用的，根据经典遗传学选择性繁殖的啮齿类动物的实验室品系被认为是天然存在的动物。
本文使用的术语“有效连接”是指被连接的核酸序列通常是邻接的或基本上邻接的，并且当有必要结合两个蛋白质编码区时，其是邻接的并且在阅读框中。但是，由于增强子通常在与启动子相距数千碱基的情况下作用并且内含子序列的长度可变，因此一些多核苷酸元件可以有效连接的但是不邻接。
本文使用的术语“患者”(还可互换地称为“宿主”或“对象”)是指可以接受一种或更多种本文公开的药物组合物的任何宿主。优选地，所述对象是脊椎动物，其旨在表示任何动物物种(优选哺乳动物物种，例如人类)。在某些实施方案中，“患者”是指任何动物宿主，包括但不限于任何哺乳动物宿主。优选地，该术语是指任何哺乳动物宿主，后者包括但不限于人和非人灵长类动物、牛、犬、山羊、cavines、鸦(corvines)、epines，马、猫、山羊(hircines)、兔(lapines)、兔(leporines)、狼、鼠、绵羊、猪、蛙(ranines)、racines，狐狸等，包括家畜、动物园标本、外来物种以及伴侣动物、宠物以及在兽医从业者护理之下的任何动物。患者可以为任何年龄，在该年龄患者能够通过产生免疫应答来响应于本发明疫苗的接种。在一些特定实施方案中，哺乳动物患者优选为人。
短语“可药用”是指在向哺乳动物施用时，特别是向人施用时，优选地不产生***或类似不良反应的分子实体和组合物。本文使用的“可药用盐”是指优选地保持亲本化合物的期望生物活性并且不产生任何不期望的毒理学作用的盐。这样的盐的实例包括但不限于：与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；以及与有机酸形成的盐，所述有机酸包括但不限于乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、帕莫酸(亚甲基双羟萘酸)(pamoic(embonic)acid)、藻酸、萘甲酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸；与多价金属阳离子(例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等)形成的盐；与由N，N′-二苄基乙二胺或乙二胺形成之有机阳离子形成的盐；及其组合。
本文使用的术语“可药用盐”是指衍生自可药用碱、无机或有机酸酸的本公开化合物。合适的酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、2-萘磺酸、三氟乙酸和苯磺酸。衍生自合适的碱的盐，所述碱包括但不限于碱金属(如钠和铵)。
本文使用的术语“阻止”、“防止”、“预防”、“抑制”和“阻抑”是指在疾病状态的临床症状开始之前单独或以包含在药物组合物中来施用化合物，以预防疾病状态的任何症状、方面或特征。这样的预防和阻抑不必是绝对被认为医学上有用的。
本文使用的术语“启动子”是指调节转录的核酸序列的区域。
本文使用的术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”和复数“多肽”，并且包括两个或更多个氨基酸的任何链。因此，如本文使用的，该术语包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、“氨基酸链”和“连续氨基酸序列”均涵盖在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于代替任何这些术语或者与其互换。该术语还包括经历了一种或更多种翻译后修饰的多肽，所述翻译后修饰包括但不限于例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割、翻译后加工或者通过包含一个或更多个非天然存在氨基酸的修饰。本领域中对于多核苷酸和多肽结构存在常规的命名法。例如，单字母和三字母缩写被广泛用于描述氨基酸：丙氨酸(A；Ala)、精氨酸(R；Arg)、天冬酰胺(N；Asn)、天冬氨酸(D；Asp)、半胱氨酸(C；Cys)、谷氨酰胺(Q；Gln)、谷氨酸(E；Glu)、甘氨酸(G；Gly)、组氨酸(H；His)、异亮氨酸(I；Ile)、亮氨酸(L；Leu)、甲硫氨酸(M；Met)、苯丙氨酸(F；Phe)、脯氨酸(P；Pro)、丝氨酸(S；Ser)、苏氨酸(T；Thr)、色氨酸(W；Trp)、酪氨酸(Y；Tyr)、缬氨酸(V；Val)和赖氨酸(K；Lys)。本文所述的氨基酸残基优选地为“l”同分异构形式。但是，可以用“d”同分异构形式的残基替换任何l-氨基酸残基，只要保持了期望的多肽特性即可。
“蛋白质”在本文中可与“肽”和“多肽”互换使用，并且包括合成、重组或者体外产生的肽和多肽二者，以及在向宿主动物或人对象施用核酸序列后在体内表达的肽和多肽。术语“多肽”优选地旨在涉及任何长度的氨基酸链，包括长度为从约2至约20个氨基酸残基的短肽，长度为从约10至约100个氨基酸残基的寡肽，以及包含长度为约100或更多个氨基酸残基的更长多肽。此外，该术语还旨在包括酶，即包含至少一种氨基酸聚合物的功能性生物分子。本发明的多肽和蛋白质还包括被或已经被翻译后修饰的多肽和蛋白质，并且包括添加至骨架氨基酸链的任何糖或者其他衍生物或缀合物。
术语“重组”表明材料(例如，多核苷酸或多肽)已经通过人为干涉被人为地或合成地(非天然地)改变。改变可以在其天然环境或状态内或者从其天然环境或状态移出的材料上进行。特别地，例如，当启动子序列由通过人为工程化之核酸区段的表达产生时，其为“重组的”。例如，“重组核酸”是在例如克隆、DNA改组或其他程序期间通过重组核酸或者通过化学或其他诱变产生的核酸；“重组多肽”或“重组蛋白质”是通过重组核酸的表达产生的多肽或蛋白质；而“重组病毒”(例如，重组AAV病毒)是通过重组核酸的表达产生的。
本文使用的术语“调控元件”是指调节转录的核酸序列区。示例性的调控元件包括但不限于增强子、转录后元件、转录控制序列等。
术语“RNA区段”是指已经从特定物种的总细胞RNA分离的RNA分子。因此，RNA区段可以指已经从其他RNA分离或纯化的一种或更多种RNA区段(天然或合成来源)。术语“RAN区段”包括RNA区段和此类区段的更小片段。
本文使用的术语“基本对应于”、“基本同源”或“基本同一”表示核酸或氨基酸序列的特征，其中选定的核酸或氨基酸序列与选定的参照核酸或氨基酸序列相比具有至少约70％或约75％序列同一性。更通常地，选定的序列与参照序列将具有至少约76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或甚至85％序列同一性，并且更优选地，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％序列同一性。更优选地，高度同源的序列通常在选定的序列和与之比较的参照序列之间具有大于至少约96％、97％、98％或99％的序列同一性。
序列同一性百分比可以在待比较的序列的整个长度上计算，或者可以通过排除总数少于所选参照序列之约25％左右的小缺失或添加来计算。参照序列可以是较大序列的亚组，例如基因或侧翼序列的一部分，或者染色体的重复部分。但是，在两个或更多个多核苷酸序列的序列同源性的情况下，参照序列将通常包含至少约18-25个核苷酸，更通常至少约26至35个核苷酸，甚至更通常至少约40、50、60、70、80、90或甚至100个左右核苷酸。
当期望高度同源的片段时，两个序列之间的同一性百分比程度将为至少约80％，优选至少约85％，更优选约90％或95％或更高，如通过本领域技术人员公知的一种或更多种序列比较算法(如由Pearson和Lipman(1988)描述的FASTA程序分析)容易地确定。本文使用的术语“对象”描述可以提供利用根据本发明组合物之治疗的生物体，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可能受益于本公开治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于：猿；黑猩猩；猩猩；人；猴；驯养动物，如狗和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
本文使用的术语“结构基因”旨在一般性地描述多核苷酸(例如基因)，其表达以产生编码的肽、多肽、蛋白质、核酶、催化性RNA分子或反义分子。
本文使用的术语“对象”描述可以提供利用根据本发明组合物之治疗的生物体，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可能受益于本公开治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于人、非人灵长类动物如猿；黑猩猩；猴和猩猩；驯养动物，包括狗和猫；以及家畜，如马、牛、猪、绵羊和山羊，或者其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠等。
“转录调控元件”是指单独地或者与一种或更多种其他核酸序列组合激活转录的多核苷酸序列。转录调控元件可以包括例如一个或更多个启动子、一个或更多个应答元件、一个或更多个负调控元件和/或一个或更多个增强子。
本文使用的“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”是指被认为用于一种或更多种转录因子的序列特异性相互作用(通常表现为直接的蛋白质-DNA结合形式)的多核苷酸序列或序列基序。通常，转录因子结合位点可以通过DNA足迹、凝胶迁移位移测定等鉴定，和/或可以基于已知的共有序列基序或通过本领域技术人员已知的其他方法预测。
“转录单位”是指这样的多核苷酸序列，其包含：至少第一结构基因，所述第一结构基因与至少第一顺式作用启动子序列有效连接并且任选地与结构基因序列的有效转录所必需的一个或更多个其他顺式作用核酸序列有效连接，并且对于有效定位在启动子和/或增强子元件控制之下的结构基因序列的适当组织特异性和开始转录来说可能是需要的至少第一远端调控元件，以及对于有效转录和转导必要的任何另外的顺式序列(例如，多腺苷酸化位点、mRNA稳定控制序列等)。
本文使用的术语“转化的细胞”旨在意指通过向该细胞中引入一种或更多种外源多核苷酸来改变其核酸互补的宿主细胞。
本文使用的术语“转化”旨在一般性描述将外源多核苷酸序列(例如，病毒载体、质粒或者重组DNA或RNA分子)引入到宿主细胞或原生质体中的过程，其中所述外源多核苷酸并入至少第一染色体或者能够在转化的宿主细胞内自主复制。转染、电穿孔和“裸”核酸摄取均代表了用于利用一种或更多种多核苷酸转化宿主细胞的技术的实例。
本文使用的术语“治疗”是指在疾病状态的临床症状发作后施用一种或更多种化合物(单独地或包含在一种或更多种药物组合物中)，以降低或消除所述疾病状态的任何症状、方面或特征。这样的治疗不必绝对被认为是医学上有用的。因此，术语“治疗”可以指在疾病的发展折磨患者之前或之后，在疾病的程度和严重性方面，治疗或者改善或减轻其一种或更多种症状。
短语“分离的”或“生物纯”是指大体上或基本上不含在材料的天然状态下通常伴随着所述材料之组分的材料。因此，根据本发明的分离的多肽优选地不含在那些多肽的天然或原位环境中通常伴随着那些多肽的材料。
“连接”或“结合”是指用于功能性连接一个或更多个蛋白质、肽、核酸或多核苷酸的任何本领域已知方法，包括但不限于重组融合、共价结合、二硫键结合、离子键结合、氢键结合、静电结合等。
本文使用的术语“质粒”或“载体”是指由遗传物质(即，核酸)构成的遗传构建体。通常，质粒或载体包含在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli))中具有功能的复制起点和用于检测包含质粒之细菌宿主细胞的可选择标志物。本发明的质粒和载体可以包含一种或更多种本文所述的遗传元件，将其排列以使得***的编码序列可以在合适的表达细胞中转录和翻译。此外，质粒或载体可以包含一种或更多种核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区或其任意组合，包括获自或衍生自一种或更多种天然和/或人工来源的片段。
术语“基本上如SEQ ID NO：x示出的序列”意指该序列基本上对应于SEQ ID NO：x的一部分，并且具有相对少的与SEQ ID NO：X的核苷酸(或氨基酸)不相同或生物学功能不等同的核苷酸(或者在多肽序列的情况下为氨基酸)。术语“生物学功能等同”是本领域中充分理解的，并且在本文进一步详细定义。因此，特别预期了以下序列可用于本发明的实践：其具有约85％至约90％，或者更优选约91％至约95％，或者甚至更优选约96％至约99％的核苷酸与本文提供的一个或更多个核苷酸序列相同或功能等同。
用于本发明的合适的标准杂交条件包括，例如在42℃下于50％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精DNA中杂交16小时，然后在60℃下用0.1×SSC、0.1％SDS溶液依次洗涤1小时以除去期望量的背景信号。本发明较低的严格杂交条件包括，例如在42℃下于35％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精DNA中杂交16小时，然后在55℃下用0.8×SSC、0.1％SDS溶液依次洗涤。本领域技术人员将认识到可以容易地调节条件以获得期望的严格水平。
自然地，本发明还涵盖与至少一种或更多种本文明确给出的特定核苷酸序列互补、基本互补和/或充分互补的核酸区段。“互补”的核酸序列是能够根据标准沃森-克里克互补原则进行碱基配对的那些。本文使用的术语“互补序列”意指充分互补的核酸序列，如可以通过上文给出的相同核苷酸比较来评估，或者定义为能够在相对严格的条件(例如上文刚刚描述的那些)下与本文公开的一种或更多种特定核酸区段杂交。
如上文所述，本发明的探针和引物可以是任意长度。通过为序列分配数值，例如第一个残基为1，第二个残基为2，等等，可以提出定义了给定序列中包含的所有探针或引物的算法：
n至n+y，其中n是从1至序列的最后号数的整数，y是探针或引物的长度减一，其中n+y不超过序列的最后号数。因此，对于25个碱基对的探针或引物(即，“25聚体”)，探针或引物的集合对应于整个序列长度上的碱基1至25，碱基2至26，碱基3至27，碱基4至28等。类似地，对于35个碱基对的探针或引物(即，“35聚体”)，示例性的引物或探针序列包括但不限于对应于整个序列长度上的碱基1至35、碱基2至36、碱基3至37、碱基4至38等的序列。同样地，对于40聚体，这样的探针或引物可以对应于从第一个碱基对至bp 40、从序列的第二个碱基对至bp 41、从第三bp至bp 42的核苷酸等，而对于50聚体，这样的探针或引物可以对应于从bp 1至bp 50、从bp 2至bp 51、从bp 3至bp 52、从bp 4至bp 53的核苷酸序列等。
在某些实施方案中，有利的是使用将本发明一种或更多种核酸区段与与合适的可检测标志物(即，“标签)组合使用，例如在使用标记的多核苷酸探针在杂交测定中确定给定的靶序列之存在的情况下。多种合适的指示化合物和组合物是本领域中已知用于标记寡核苷酸探针的，包括但不限于能够在合适的测定中检测的荧光、放射性、酶促或其他配体，例如抗生物素蛋白/生物素等。在某些特定实施方案中，还可以使用一种或更多种荧光标记或酶标签，例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性或其他在环境方面不太期望的试剂。在酶标签的情况下，已知可以使用比色、发色或荧光指示底物来提供人眼可见的或者通过分析方法(如闪烁扫描法、荧光测定法、分光光度法等)的样品检测方法，以鉴定与含有一种或更多种互补或基本互补的核酸序列之样品的特异性杂交。在其中同时或依次检测两种或更多种标记探针的所谓的“多重(multiplexing)”测定的情况下，期望的是用具有第一检测性质或参数(例如，发射和/或激发光谱最大值)的第一标记来标记第一寡核苷酸探针，还用具有第二检测性质或参数的不同于(即，区别于)第一标记或可与第一标记辨别开的第二标记来标记第二寡核苷酸探针。特别是在基因扩增和/或检测方案的情况下，多路复用测定的使用是分子遗传学领域中普通技术人员公知的。
本文使用的术语“载体(vector)”是指能够在宿主细胞中复制和/或与另一核酸区段有效连接以使得所连接片段复制的核酸分子(通常由DNA构成)。质粒、黏粒或病毒是示例性载体。
实施例
引入以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解的是，下文实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实践中良好运行的技术，因此可以认为其构成了用于本发明实践的一些优选方式。但是，本领域技术人员在本公开内容的教导下应理解，可以对公开的特定实施方案进行许多改变并且依然获得相同或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1-下一代rAAV2载体：酪氨酸中的点突变导致较低剂量下的高效转导
本实施例证明，AAV2衣壳上的表面暴露的酪氨酸残基的突变绕过了泛素化步骤，从而避免了蛋白酶体介导的降解，并导致这些载体在体外人细胞中以及体内鼠肝细胞中高效转导，导致在降低的载体剂量下产生治疗水平的人凝血因子。观察到的酪氨酸突变载体之提高的转导效率是由于缺少泛素化以及改进了向细胞核的细胞内运输。除了产生对AAV2衣壳的酪氨酸磷酸化在AAV2生命周期的多个步骤中之作用的深刻理解外，这些研究导致开发了能够以较低剂量高效转导的新AAV2载体。
材料和方法
重组AAV2载体.使用已公开的方法产生包含由鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子驱动的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的scAAV2载体(scAAV2-EGFP)和包含处于载脂蛋白增强子/人α-1抗胰蛋白酶(ApoE/hAAT)启动子控制下的因子IX(F.IX)的ssAAV2载体(ssAAV2-F.IX)的高度纯化储液。
AAV2衣壳上表面酪氨酸的定位。使用AAV2的晶体结构(PDB登录号1lp3)定位AAV2衣壳表面上的酪氨酸残基。在Silicon graphics Octane工作站上，通过使用程序O对参照单体应用二十面体对称操纵子来产生二十面体二、三和五倍相关VP3单体。然后使用程序COOT在病毒不对称单位的情况下使酪氨酸残基的位置可视化并且进行分析，并且使用程序PyMOL Molecular Graphics System(DeLano Scientific，San Carlos，CA，USA)进行图形化表示。
表面暴露的酪氨酸残基突变AAV2衣壳质粒的构建。基于QuikChange
Figure BSA0000211436760000391
位点定向诱变(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，使用质粒pACG-2进行两阶段程序。简单地说，在阶段一中，在每种突变体的不同的管中进行两个PCR延伸反应。一个管包含正向PCR引物，而另一个包含反向引物。在阶段二中，将两个反应混合并且根据制造商的说明进行标准PCR诱变测定。PCR引物被设计为引入从酪氨酸到苯丙氨酸残基的变化以及沉默变化以产生用于筛选目的的新限制性核酸内切酶位点。所有突变体在使用前用合适的限制酶筛选并且测序。
全细胞裂解物(Whole Cell Lysates，WCL)的制备和共免疫沉淀。还在37℃下对经模拟处理或用MG132处理的约2×106HeLa细胞进行模拟感染或者用WT scAAV2-EGFP或Y730F突变载体以5×103颗粒/细胞感染2小时。对于免疫沉淀，将细胞用0.01％胰蛋白酶处理并且用PBS充分洗涤。通过与0.25mg正常小鼠IgG和20μl蛋白G琼脂糖珠孵育来从WCL中清除非特异性结合。在预清除后，添加2μg抗完整AAV2颗粒的衣壳抗体(小鼠单克隆IgG3，克隆A20；Research Diagnostics，Inc.(Flanders，NJ，USA))，或2μg正常小鼠IgG(作为阴性对照)并且在4℃下孵育1小时，然后用蛋白G琼脂糖珠沉淀。对于免疫沉淀，将重悬的沉淀溶液用于SDS-PAGE。用泛素(Ub)特异性的单克隆HRP缀合的抗Ub抗体(1∶2,000稀释)(小鼠单克隆免疫球蛋白G1γIgG1]，克隆P4D1；Santa Cruz，CA，USA)处理膜。使用化学发光(ECL-plus，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)使免疫反应带可视化。
从HeLa细胞分离细胞核和细胞质级分。从HeLa细胞分离细胞核和细胞质级分，并且使用模拟感染的或者重组wt scAAV2-EGFP或Y700F载体感染的细胞来分离细胞质和细胞核级分。确定每一种级分的纯度＞95％。
AAV2运输的Southern印迹分析。分离来自细胞核和细胞质级分的低-MrDNA样品并且在1％琼脂糖凝胶或1％碱性琼脂糖凝胶上电泳，然后使用32P标记的EGFP特异性DNA探针进行Southern印迹杂交。
重组AAV2载体的体外转导测定。将约1×105HeLa细胞用于重组AAV2载体的转导。在转导后48小时使用荧光显微术通过EGFP成像来测量转导效率。通过ImageJ分析软件(NIH，Bethesda，MD，USA)定量分析来自三至五个视野的图像。以每个视野绿色荧光的总面积(像素2)评估转基因表达(平均值±SD)。使用方差分析(ANOVA)来比较测试结果和对照，并且确定其是统计学显著的。
重组AAV2载体的体内转导研究。通过尾静脉将scAAV2-EGFP载体以每只动物1×1010病毒颗粒静脉内注射到C57BL/6小鼠中。在注射后2周，将来自模拟注射小鼠和注射小鼠三个肝叶的肝切片装片在载玻片上。通过所述的EGFP成像来测量转导效率。将ssAAV2-FI.X载体以每只动物1×1010或1×1011病毒颗粒静脉内注射(通过尾静脉)或者注射到C57BL/6、BALB/c和C3H/HeJ小鼠的门静脉中。通过眶后采血(retro-orbital bleed)获得血浆样品并且通过ELISA分析hF.IX的表达。
结果
表面暴露酪氨酸残基的突变显著改进了AAV2载体的转导效率。为了证明AAV2衣壳的酪氨酸磷酸化导致泛素化提高以及导致细胞内运输受损并且因此不利于病毒转导，对AAV2衣壳上的表面暴露酪氨酸残基进行修饰。AAV2结构之衣壳表面的检查揭示了七个表面暴露的酪氨酸残基(Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704和Y730)。对七个残基中的每一个进行位点定向诱变，将其保守替换为苯丙氨酸残基(酪氨酸-苯丙氨酸，Y-F)(表1)。在每种酪氨酸突变衣壳中包裹(encapsidate)的scAAV2-EGFP基因组被成功包装，而表面暴露酪氨酸残基的突变并不导致载体稳定性降低。
表1
野生型(WT)和酪氨酸修饰Y→F的突变AAV2载体的效价
Figure BSA0000211436760000411
ND＝未进行
在相同条件下体外分析HeLa细胞中的每一种酪氨酸突变载体的转导效率并且与WT scAAV2-EGFP载体比较。从这些结果，明显地是尽管模拟感染细胞没有表现出绿色荧光，但是在2,000病毒颗粒/细胞下每种酪氨酸突变载体的转导效率显著高于WT scAAV2-EGFP载体。特别地，Y444F、Y500F、Y730F载体的转导效率为WT载体的～8至11倍。
表面暴露酪氨酸残基的突变大幅改进AAV2载体在鼠肝细胞中的体内转导效率。还在小鼠模型中体内评估WT和酪氨酸突变scAAV2-EGFP载体的效力。酪氨酸突变载体的转导效率显著更高，为WT载体的4-29倍。当从用1×1010颗粒的酪氨酸突变载体注射的小鼠收获其他组织(例如心脏、肺、肾、脾、胰、GI道(空肠、结肠)、睾丸、骨骼肌和脑)时，没有发现EGFP基因表达的证据。因此，在体内通过尾静脉注射这些载体后，表面暴露酪氨酸残基的突变似乎并不改变肝向性(liver-tropism)。
酪氨酸突变载体改进的转导效率是由于缺少泛素化，以及向细胞核之细胞内运输的改进。为了进一步确认EGFR-PTK介导的衣壳蛋白在酪氨酸残基处的磷酸化是AAV2衣壳泛素化的先决条件的假设，以及泛素化病毒体在去往细胞核的道路上被细胞质蛋白酶体识别和降解，从而导致低效的细胞核运输的假设，进行了如下一系列实验。
在第一项研究中，将携带腺病毒可诱导的AAV2 rep和cap基因的HeLa C12细胞模拟感染或者用WT、Y444F或Y730F scAAV2-EGFP载体感染。尽管模拟感染的细胞未表现出绿色荧光，并且在没有与腺病毒共感染的情况下～15％的细胞被WT scAAV2-EGFP载体转导，但是与WT载体相比，Y444F和Y730F scAAV2-EGFP载体的转导效率分别提高了～9倍和～18倍。有趣的是，尽管用腺病毒共感染导致提高了～11倍，但是Y444F和Y730F scAAV2-EGFP载体的转导效率没有通过与腺病毒共感染而进一步增强。由于腺病毒可以改进HeLa细胞中AAV2载体的核运输，因此这些数据表明表面暴露酪氨酸残基在AAV2的细胞内运输中具有作用，并且将其移除导致AAV2载体有效的细胞核运输。
在第二项研究中，将经模拟处理或者用Tyr23(EGFR-PTK的特异性抑制剂)或MG132(蛋白酶体抑制剂)(已知二者均提高AAV载体的转导效率)处理的HeLa细胞模拟感染或者用WT或Y730F scAAV2-EGFP载体感染。尽管在模拟处理的细胞中，模拟感染的细胞未表现出绿色荧光，并且～5％的细胞被WT scAAV2-EGFP载体转导，但是Tyr23或MG132的预处理导致转导效率分别提高～9倍和～6倍。虽然与WT载体相比，Y730F scAAV2-EGFP载体的转导效率提高了～14倍，但是其未被Tyr23或MG132的预处理进一步增强。这些数据强烈地表明，表面暴露酪氨酸残基的不存在阻止突变载体的磷酸化，可能阻止了衣壳蛋白的泛素化，并且这些载体在其通往细胞核的道路上不能被蛋白酶体识别和降解，这导致其有效的核转运。
在第三项研究中，将经模拟处理或者MG132处理的HeLa细胞模拟感染或者用WT、Y730F或Y444F scAAV2-EGFP载体感染。在感染后4小时制备WCL，并且将相等量的蛋白质首先用抗AAV2衣壳蛋白抗体(A20)免疫沉淀，然后用抗Ub单克隆抗体进行Western印迹分析。虽然泛素化AAV2衣壳蛋白(Ub-AAV2 Cap)在模拟感染的细胞中不可检测，但是未处理细胞中泛素化AAV2衣壳蛋白的信号更弱，而且在用MG132处理后发生了泛素化AAV2衣壳蛋白的显著累积。有趣的是，Y730F或Y444F载体的感染急剧降低了MG132诱导的泛素化AAV2衣壳蛋白的累积程度。这些结果证实，酪氨酸残基的突变绕过了蛋白酶体介导的载体降解。
在第四项研究中，在HeLa细胞中确定输入的WT、Y444F和Y730F载体病毒DNA的命运。分离自细胞质[C]和细胞核[N]级分的低MrDNA样品的Southern印迹分析和放射性自显影仪(autoradiograph)的光密度扫描(densitometric scanning)显示，～36％输入的scAAV2 DNA存在于WT载体感染细胞的细胞核级分中。但是，有趣的是，细胞核级分中输入的Y730F和Y444F scAAV2载体DNA的量分别提高到了～72％和～70％。这些结果进一步证明，表面暴露酪氨酸残基的突变阻止了AAV2衣壳的泛素化，导致蛋白酶体介导的降解减少，继而有利于AAV2载体的核转运。
小鼠中酪氨酸突变载体在降低10倍的载体剂量下表达治疗水平的人因子IX蛋白。重要的是检查酪氨酸突变AVV2载体在体内是否能够在降低的载体剂量下有效地递送治疗性基因。为此，将单链肝细胞特异性人因子IX(h.FIX)表达盒包裹在Y730F载体中，并且在三个不同的小鼠品系(BALB/c、C3H/HeJ和C57BL/6)中测试该载体的效力。在所有三个品系中一致地，在尾静脉或门静脉施用(后者是更有效的途径)后Y730F载体取得了WT载体～10倍的循环hF.IX水平。这些结果清楚地表明，通过门静脉注射的C57BL/6小鼠中，Y730F载体在降低～10倍的载体剂量(1010颗粒/小鼠)下表达治疗水平的人F.IX蛋白(～50ng/mL)。应注意的是，C57BL/6小鼠中的肝病毒基因转移通常比另外两种品系更有效。
本文证明的这些结果与以下解释一致：AAV2衣壳蛋白的EGFR-PTK诱导的酪氨酸磷酸化促进了AAV2的泛素化和降低，因此导致病毒核转运的损失和转导效率的降低。七个表面暴露酪氨酸残基中每一个的突变分析产生了在体外和体内均具有显著提高的转导效率的AAV2载体。特别地，Y444F和Y730F突变载体绕过了泛素化步骤，这导致病毒基因组向细胞核之细胞内运输和递送的显著改进。
尽管由WT衣壳蛋白构成的AAV2载体在临床前动物模型中取得了长期的治疗性表达，但是在最近的基因治疗试验中两位具有严重血友病B的患者出现了载体剂量依赖性转氨酶炎(transaminitis)，这将肝细胞衍生hF.IX表达的持续时间限制为＜8周。随后的分析证明了在人中对于AAV衣壳的记忆性CD8+T细胞，以及一位血友病B患者中的MHC I限制的衣壳特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的存在，这反映了转氨酶炎的时间进程。推断这种对于输入衣壳的CD8+T细胞应答消除了AAV2转导的肝细胞。这些数据证明，利用Y730F载体，较低的衣壳抗原剂量对于有效的基因转移是足够的，并且与WT衣壳相比表现出降低了许多的AAV-Y730F泛素化，这是MHC I呈递的先决条件。因此，可以通过使用表面暴露酪氨酸突变AAV2载体来避免对于AAV2衣壳的T细胞应答(用于肝脏中治疗性基因转移的严重障碍)。
还在体外的原代人神经元和造血干细胞以及小鼠体内的多种组织和器官中观察到了酪氨酸突变载体转导效率的明显提高。构建了双重、三重和四重酪氨酸突变体以检查这样的多重突变体是否有活力，以及这些载体的转导效率是否可以进一步增强。值得注意的是，除了一些例外(Y444位置等同于AAV4中的甘氨酸和AAV5中的精氨酸；Y700位置等同于AAV4和AAV5中的苯丙氨酸；以及Y704位置等同于AAV7中的苯丙氨酸)，这些酪氨酸残基在AAV血清型1至10中高度保守。
实施例2-rAAV载体对NF-κB途径的激活
由于利用人转录因子数据库的电脑模拟分析证明了在腺相关病毒(AAV)基因组中存在多个对于NF-κB(细胞免疫和炎性响应的中枢调节物)的结合位点，本实施例研究了AAV是否在其生命周期中利用NF-κB。在用重组AAV载体转导的HeLa细胞中使用NF-κB的小分子调节物。VP16(一种NF-κB激活剂)，其使AAV载体介导的转基因表达增强至25倍。在两种NF-κB抑制剂中，阻断经典和非经典NF-κB途径二者的(Bay11)完全消除了转基因表达，而干扰经典NF-κB途径的二硫代氨基甲酸吡咯烷酮(pyrrolidone dithiocarbamate，PDTC)对转基因表达没有作用。Western印迹分析证实了在VP16的存在下丰富的非经典NF-κB途径的核p52蛋白质组分，而其被Bay11消除，证明在AAV感染期间引发了非经典NF-κB途径。利用体外原代人树突细胞(DC)获得了类似结果，其中细胞因子诱导的DC成熟标志物(CD83和CD86)的表达也被Bay11抑制。在体内，在正常C57BL/6小鼠中进行基因转移前施用Bay11导致AAV载体诱导的促炎细胞因子和趋化因子(如IL-1β、IL-6、TNFα、IL-12β、KC和RANTES)的产生降低7倍。这些研究表明，在用AAV载体转导之前NF-κB抑制剂的瞬时免疫抑制导致免疫应答降低，这在人基因治疗中AAV载体的优化使用方面具有重要启示。
最近的研究已经开始限定AAV基因转移引起的初始激活信号。一项研究发现，在向鼠骨骼肌进行基因转移后，AAV诱导的通过Toll样受体9(TLR9)-髓样分化因子88(MyD88)途径的信号转导在浆细胞样树突细胞(pDC)中诱导I型干扰素应答，从而驱动随后对载体和转基因产物的适应性免疫应答(Zhu等，2009)。这些数据表明，pDC中通过内体TLR9受体感应DNA基因组。未发现在用AAV对DC或巨噬细胞体外脉冲后诱导促炎细胞因子的证据。依然，较早报道证明了肝中对于AAV载体的迅速但是非常短暂的Kupffer细胞依赖性先天应答，其包括多种炎性细胞因子的表达(Zaiss和Muruve，2008；Zaiss等，2008；Zaiss和Muruve，2005；Zaiss等，2002)。
有趣的是，之前尚未研究作为许多应激和病原体驱动的信号的关键细胞应答物和促炎性细胞因子表达调节物的NF-κB(Hayden和Ghosh，2004；Hiscott等，2006；Li和Verma，2002)在AAV生命周期中的作用。在本实施例中，发现用AAV感染人细胞可以导致非经典NF-κB途径的激活。此外，NF-κB的激活大幅提高了转基因表达(包括在DC中)，而NF-κB的抑制削弱了表达。通过短暂抑制NF-κB阻止了炎性细胞因子的诱导，其揭示了NF-κB在对于体内AAV的先天应答中的作用，并且重要的是，并未干扰长期转基因表达。
结果
AAV-ITR包含NF-κB响应性转录因子的结合位点。之前已经描述了与AAV2基因组的左反向末端重复(ITR)中的单链D[-]序列特异性相互作用的细胞蛋白质的存在(Qing等，1997)。由于右ITR中的ssD[+]序列与左ITR中的ssD[-]序列互补，还可能存在与右ITR中的ssD[+]序列相互作用之假定的细胞蛋白质是合理的。在电泳迁移位移测定中，使用ssD[+]序列探针，确实检测到了一种不同的细胞蛋白质，将其称为ssD[+]序列结合蛋白(ssD[+]-BP)(Qing等，1997)。在纯化和质谱分析后，发现ssD[+]-BP与细胞NF-κB抑制因子(一种转录负调节物)具有局部氨基酸同源性。利用人转录因子数据库[TRANSFAC]的额外电脑模拟分析证明了NF-κB结合辅因子(如p300、TFIIB和SplI)的多个结合位点的存在。这些中的一个是p300/CREB转录因子，其最近被发现与AAV基因组相关联(Dean等，2009)。尽管尚不清楚NF-κB信号转导是否通过AAV与细胞表面受体/共受体的结合来激活，但是最近的研究已经证明，在小鼠模型，可以如下体内引发先天性免疫应答：a)通过Toll样受体9(TLR9)-髓样分化因子88(MYD88)途径，或b)通过细胞表面上的CD40配体的激活(Zhu等，2009；Mays等，2009)。已知这两种配体在NF-κB转录因子生物激活期间与其在下游相互作用(Mineva等，2007；Loiarro等，2005)。以下数据证明NF-κB参与AAV生命周期。
AAV感染激活人细胞中的非经典NF-κB途在。在用表达EGFP的自互补血清型2载体(scAAV-EGFP)转导的HeLa细胞中使用NF-κB信号转导的小分子激活剂和抑制剂。VP16(一种NF-κB激活剂)(Wu和Miyamoto，2008)使EGFP表达增强～25倍(图1A和图1B)。在测试的两种抑制剂之间，阻断IKKκ和IKKκ二者活性的Bay11完全地消除了EGFP表达，而通过阻断经典途径中的IKB泛素连接酶来抑制IKB降解的PDTC(Cuzzocrea等，2002)对EGFP表达没有明显作用(图1A和图1B)。此外，VP16介导的增强的转基因表达被Bay11完全消除，但是不被PDTC消除(图6A)。利用ssAAV载体(图6B)和之前实例中描述的酪氨酸三重突变scAAV载体(Y730+500+444F；TM-AAV)二者获得了类似结果(Markusic等，2010)(图6C)。因此，推断来自AAV载体的转基因表达由NF-κB的替代(非经典)途径调节。该结论被Western印迹分析(图6D和图6E)证实，其表明在VP16存在下，非经典NF-κB途径的细胞质p100和细胞核p52蛋白质组分提高～3至6倍。另外，利用AAV载体自身转导(即，不存在激活剂)增加了p100和p52(图1C)，表明细胞的感染激活了替代NF-κB途径。这种增加被Bay11处理消除，而用于经典NF-κB途径的标志物p65不受影响(图1C)。
NF-κB途径在原代人抗原呈递细胞中运行(operational)。
AAV感染后。另一方面，在原代人树突细胞(DC)中，尽管转基因表达再次被NF-κB激活剂明显提高(图2A)，但是AAV感染自身并不激活NF-κB(图2B)。在VP16存在下，观察到与scAAV载体转导的DC相比，EGFP表达提高～20倍。用已知激活NF-κB途径的细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2)处理导致转基因表达进一步提高至～26％，在用Bay11处理后其降低至～12％(图2A)。细胞核级分的Western印迹分析进一步证实NF-κB激活的替代途径是运行的(图2B)。在将scAAV载体介导的基因体内递送到鼠肝脏中后得到了类似结果(图7)。本发明人还测试了NF-κB调节物诱导DC中表型变化的能力。两种DC成熟标志物CD83和CD86的流式细胞术分析表明，当与细胞因子混合物一起使用时，单独VP16并不能够诱导成熟或增强共刺激分子的表达。但是，Bay11处理导致细胞因子介导的APC的成熟被抑制，进一步暗示NF-κB的参与(表2)。该成熟标志物表达的降低削弱了DC处理抗原材料的主要功能并且减少了T细胞激活和增殖。因此，假设在载体施用之前，NF-κB激活的抑制可能导致削弱的对AAV的先天免疫应答。
表2
原代人树突细胞之成熟标志物的FACS分析
Figure BSA0000211436760000471
示出了来自代表性实验的数据(n＝3)。
在小鼠中体内AAV载体介导的基因转移之前，对NF-κB激活的抑制导致促炎性细胞因子产生的抑制。在体内研究中，在C57BL/6小鼠中施用载体前12个小时，腹膜内(i.p.)施用20mg/kg体重的单剂量Bay11。测量Bay11和载体注射组中来自肝脏匀浆的先天性免疫介体(图3A)或用于激活NF-κB(图3B)基因的转录水平，并且与假注射小鼠相比较。这些数据表明，在载体施用后2小时，与假注射(sham-inject)和AAV载体注射的动物相比，用Bay11+AAV载体注射的小鼠显著降低了促炎细胞因子或趋化因子(包括IL-1α、IL-6、TNFα、IL-12α、KC和RANTES)的水平(图3A)，并且额外地，阻止了NF-κB基因表达谱的上调(图3B)。在用更有效的酪氨酸三重突变AAV载体(Y730+500+444F；TM-AAV)注射的小鼠中观察到了这些先天性免疫应答标志物类似的下调趋势。野生型(WT-AAV)和TM-AAV载体二者对I型干扰素表达的上调不受Bay11的影响(图8A、图8B、图8C、图8D、图8E和图8F)。Bay11的施用还显著降低了这些小鼠中的抗AAV2抗体应答(图9)。这些结果的总和表明，通常在体内肝AAV基因转移期间见到的短暂炎性细胞因子应答由NF-κB激活来介导。
鼠肝细胞中AAV载体介导的转基因表达。鉴于观察到转导后48小时Bay11强烈地体外抑制HeLa细胞中AAV介导的转基因表达(图1A和图1B)，其可以产生实现体内长期的转基因表达的相反结果，这对于检查小鼠中Bay11的作用是重要的。由图4A可以看出，当在基因转移后2周分析时，用Bay11注射或不用Bay11注射的动物具有类似的来自任一种载体的EGFP表达水平。TM-AAV载体的转导效率是WT-AAV载体的转导效率的～12倍(图4B)，符合最近公开的研究(Markusic等，2010)。这些数据表明，Bay11的施用可以安全且有效地下调先天性免疫应答介体而不会损害长期转基因表达。
材料和方法
重组AAV载体。通过HEK-293细胞的三重转染产生含有野生型(WT)质粒或三重酪氨酸突变(TM；Y730+500+444F)质粒以及由鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子驱动的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因之自互补(self-complemetary，sc)AVV2载体(WT-scAAV2-EGFP，TM-scAAV2-EGFP)的高度纯化储液。然后如描述的将载体通过CsCl梯度离心纯化，过滤灭菌，并且通过狭缝印迹杂交(slot-blot hybridization)量化(Liu等，2003；Kube和Srivastava，1997)。最近已经描述了酪氨酸突变pACG2-Y730+500+444F-Rep/Cap质粒(Markusic等，2010)。
重组AAV载体的体外转导测定。利用从IC50开始的十倍稀释通过细胞生存力测定来确定NF-κB调节化合物的最佳浓度或者如之前描述使用(Wu和Miyamoto，2008；Kumar等，2008)。VP16或Bay11(10或5μM，终浓度)以及PDTC(50或25μM终浓度)单独使用或以激活剂/抑制剂组合使用。对于转导实验，在载体感染之前将约1×105HeLa细胞用任一这些化合物预处理24小时。如之前描述用500或2,000载体基因组(vgs)/细胞之编码EGFP转基因的重组WT-AAV或TM-AAV载体来转导细胞(Markusic等，2010)。培养7天后，将原代人树突细胞以2000vgs/细胞用AAV载体转导，并且孵育48小时。以每个视野绿色荧光的总面积(像素2)(平均值±SD)或通过流式细胞术来评估转基因表达。使用方差分析(ANOVA)来比较测试结果和对照，并且确定它们是统计学上显著的。
体内重组AAV载体转导研究。向6周大的正常C57BL/6J小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME，USA)组腹膜内施用单剂量(20mg/kg)之在DMSO中稀释为200μL体积的NF-κB抑制剂Bay11(第0天)。仅用DMSO载体溶剂注射的动物被认为是基线(模拟)组(n＝75)，而用Bay11注射的动物是测试组(n＝75)。此时，来自模拟组和Bay11组的动物随机接受磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)或者WT-AAV或TM-AAV载体(每组n＝25只小鼠)。在第1天，通过尾静脉经静脉内施用～1×1011病毒基因组(vg)颗粒的WT-AAV2-EGFP或TM-AAV2-EGFP载体或者PBS。为了测量对于AAV的免疫应答的调节，将来自PBS、WT-AAV载体或TM-AAV载体注射组的各5只动物在施用载体后的不同时间点(2小时、6小时、10小时、24小时和第10天)通过二氧化碳吸入处死。收集肝叶，切片并且装片在载玻片上以研究Bay11对AAV介导的EGFP表达的作用(从第10天小鼠)。根据实验动物管理和使用委员会(institutionalanimal care and use committee)指南进行所有动物研究。
通过RT-PCR测定进行先天性免疫应答的基因表达分析。向6周大的正常C57BL/6J小鼠组腹膜内施用单剂量(20mg/kg)之在DMSO中稀释为200μL体积的NF-κB抑制剂Bay11(第0天)。在第1天，通过尾静脉经静脉内注射磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)或者～1×1011vg的野生型(WT)AAV-EGFP载体或酪氨酸三重突变(TM)AAV-EGFP载体(每组n＝5只小鼠)。施用载体后2个小时，进行先天性免疫应答的基因表达谱，其包括Toll样受体1-9、MyD88、MIP-1、IL-1α、IL-1β、IL-12α、IL6、KC、TNFα、RANTES、MCP-1、IFNα、IFNβ和IP-10。使用具有v 1.1软件的ABI Prism 7500序列检测***(Applied Biosystems)捕获并且分析数据。自动确定18SrRNA和其他基因的基线。手动确定所有基因的阈值。通过比较阈值循环(comparativethreshold cycle，Ct)方法测量基因表达。将参数阈值循环(Ct)定义为探针切割所产生的报告荧光通过了高于基线之固定阈值时的循环数。使用内源参照18S rRNA基因将细胞因子基因的表达归一化，并且使用模拟感染的鼠mRNA作为参照样品。确定每组处理和未处理动物的相对基因表达，并且组之间＞2.6和＜0.38的值被认为是显著上调和下调，并且通过评估用于测量特定基因表达之96孔板中的变化性来计算。
细胞、抗体和化学物质。从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，MD，USA)获得HeLa细胞并且在补充有10％新生牛血清(NCS)(Lonza，Inc.，Basel，Switzerland)和抗生素的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Invitrogen Carlsbad，CA，USA)中保持为单层培养物。将白细胞去除术得到的PBMC重悬在无血清AIM-V培养基(Lonza)中，并且将半粘附细胞级分在补充有重组人IL-4(500U/mL)和GM-CSF(800U/mL)(R&D Systems，MN，USA)的无血清AIM-V培养基中孵育。将细胞用NF-κB调节物(10mM VP16或10mM Bay11)和细胞因子混合物处理20小时，所述细胞因子混合物包含10ng/mL TNF-α、10ng/mL IL-1、10ng/mL IL-6、1mg/mL PGE2(R&D Systems)。收获细胞，将其表征以确保它们符合成熟DC的典型表型(CD83，RPE，鼠IgG1，CD86，FITC，鼠IgG1；Invitrogen)。所有一抗和二抗均购自Cell Signaling Technology，Inc.(Danvers，MA，USA)或Santa Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA)。NF-κB激活剂[依托泊苷(VP16)、艾菲地可宁、羟基脲(HU)]和NF-κB抑制剂[Bay11-7082(Bay11)，二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)]购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO，USA)。将这些化合物根据制造商的说明重悬在DMSO(Sigma-Aldrich)或者无菌无DNAase无RNAase的水(Invitrogen)中。
Western印迹分析。将来自经模拟处理或用最适浓度的NF-κB激活剂或抑制剂预处理的～2×106HeLa细胞或DC之细胞沉淀的均匀化裂解物用于样品制备。在蛋白酶抑制剂混合物(HaltTM Protease Inhibitor Cocktail Kit，Pierce Biotech)的存在下，使用RIPA裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)分离全细胞蛋白质，并且根据制造商的方案使用商品化试剂盒(NE-PER Extraction Reagent Kit，Pierce Biotech，Rockford，IL，USA)提取细胞质和细胞核蛋白质。将蛋白质提取物在还原条件[SDS-样品缓冲液，含有62.5mM Tris-HCl(25℃下pH 6.8)、2％wt./vol.SDS、10％甘油、50mM DTT、0.01％(wt./vol.)溴酚蓝(CellSignaling Technology，Inc.)]下煮5分钟并且储存在-86℃下直到进一步分析。使等体积的样品在4-15％SDS-PAGE(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上跑。将凝胶转移到0.2-μm硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上并且通常与1∶1000稀释的一抗[p100/52、p65、抑制性激酶IκBκ、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核纤层蛋白B(Cell Signaling Technology，Inc.)、β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)]孵育过夜。次日，将印迹用1∶2,000-1∶5,000的合适抗独特型HRP标记的IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)孵育。使用ECL plus Western印迹检测试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，US)进行免疫印迹检测。用AdobePhotoshop CS3
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测量蛋白质带的强度并且以用作上样对照之管家基因产物的蛋白质水平归一化。
本研究的基础是发现宿主细胞NF-κB可以与AAV反向末端重复(ITR)中存在的20-bp D序列结合(Qing等，1997)，其通过电泳迁移位移测定随后通过质谱来鉴定(图10)。本实施例中展示的数据提供了NF-κB参与AAV感染的第一证据。使用多种其他研究者已经广泛使用的药理学调节物(Wu和Miyamoto，2008；Kumar等，2008)来研究NF-κB信号转导途径，发现非经典NF-κB途径在AAV感染后被上调。这是很重要的，因为NF-κB转录程序的激活是炎性和免疫激活的基本立即早期步骤(Li和Verma，2002)，并且NF-κB信号转导代表了用于病毒易感性或干扰的主要候选(Hiscott等，2006)。已经发现激活NF-κB的病毒通过干扰素应答(水泡性口炎病毒、麻疹病毒)(Hiscott等，2003)、toll样受体(TLR)依赖性(埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒)(Okumura等，2010；Lizundia等，2008)和TLR依赖性信号转导途径(巨细胞病毒、丙型肝炎病毒)(Castanier等，2010；Gourzi等，2007)而对先天性免疫应答易感。另一方面，许多病毒使用靶向NF-κB途径之特定方面的多功能病毒诱饵蛋白破坏先天性免疫应答以及NF-κB。包括人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、人疱疹病毒8(HHV8)和EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)在内的病毒具有将NF-κB信号转导整合到其生命周期和致病性中的方面，因此利用NF-κB激活剂促进其生存(Hiscott等，2006)。
相比之下，显然NF-κB的非经典途径在AAV感染后被激活是由于已知非经典NF-κB激活对于先天性和适应性免疫应答的重要性(Gilmore，2006)，以及AAV病毒缺少形成任何NF-κB样诱饵蛋白必需的复杂结构基因元件。非经典途径激活的加剧与多种炎性病症相关联，例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或B细胞淋巴瘤(Dejardin，2006)。仅在骨髓样谱系细胞中表达的含比林蛋白质(pyrin-containing protein)Monarch-1通过抑制激活非经典NF-κB途径所必需的NF-κB诱导激酶(NIK)来抑制促炎性细胞因子和趋化因子(Lich等，2007)。已经发现NF-κB激活的非经典途径的激活导致了过表达突变IκBκ之DC的成熟和T细胞敏化(prime)活性，所述突变IκBκ阻断经典途径的激活(Lind等，2008)。在NIK缺陷的淋巴组织发育不全(Aly)小鼠中，CD8+T细胞对于DC中外源抗原的交叉敏化受到影响，表明了这种途径在适应性免疫中的重要性(Lind等，2008)。非经典途径组分缺陷的小鼠也在二级淋巴样器官发育和体内稳态中具有缺陷(Guo等，2008)。不知道AAV结合是否激活NF-κB信号转导到细胞表面受体。最近的研究证明，在鼠模型中，对于AAV的先天性免疫应答可以通过TLR9-MYD88途径或通过细胞表面上的CD40配体的激活体内引发(Zhu等，2009；Mays等，2009)。有趣的是，注意到尽管二者都依赖于NF-κB信号转导下游来促进先天性免疫应答(Mineva等，2007；Loiarro等，2005)，TNF超家族受体(如CD40L)的激活可以激活非经典NF-κB途径(Qing等，2005)。
基于针对AAV载体的免疫监督的第一“危险信号”或“引发剂”可以是替代NF-κB信号转导途径之激活的证据，在AAV载体施用期间短暂阻断NF-κB可以削弱宿主免疫应答是合理的。一种消除AAV的NF-κB敏化的可能策略是在AAV-TIR中产生针对NF-κB响应性转录因子结合位点的靶向突变。但是，考虑到NF-κB蛋白在细胞生理学中的多效功能(Hayden和Ghosh，2004)，可能的是不同NF-κB响应性细胞因子启动子结合转录因子可在不同细胞类型中运行。或者，用于通过靶向NF-κB途径的短暂免疫抑制方案可能是普遍适用的。选择性NF-κB抑制剂Bay11可以明显减少AAV载体的炎症和先天性免疫应答的标志物，而不影响其体内转基因表达。Bay11能够下调多种关键调节物，即IL-1α、IL-6、TNFα、IL-12α、KC和RANTES的活性，表明了使用这种药理学调节物来选择性下调针对AAV载体之炎症和先天性免疫应答的益处。有趣的是，NIK对于激活非经典NF-κB途径是关键的，还知道其响应于多种病毒感染而诱导IL-1α、IL-6、IL-12α、TNFα和RANTES的激活(DiPaolo等，2009；Yanagawa和Onoe，2006；Andreakos等，2006；Habib等，2001)。此外，充分意识到NIK对于静息专职抗原呈递细胞DC的激活和功能是关键的，DC的活性对于抗原特异性CD4+辅助T细胞的敏化是关键的，导致对相关靶标(如递送载体)的免疫应答(Andreakos等，2006；Habib等，2001；Martin等，2003；Brown和Lillicrap，2002)。在体外，NIK通过有效激活NF-κB以及因此上调细胞因子(TNFα、IL-6，IL-12、IL-15和IL-18)、趋化因子{IL-8、RANTES、巨噬细胞炎性蛋白-1α、单核细胞化学引诱蛋白-1和单核细胞化学引诱蛋白-3}、MHC抗原呈递分子(I和II类)以及共刺激分子(CD80和CD86)的表达来提高DC抗原呈递(Andreakos等，2006)。在体内，NIK增强对于载体编码的抗原的免疫应答并且比完全弗氏佐剂更有效地使其迁移向具有提高的IgG2a水平、T细胞增殖、IFN-γ产生和细胞毒性T淋巴细胞应答的T辅助细胞1免疫应答(Andreakos等，2006)。本研究中使用的Bay11阻止了IKKα和β的活性，其是非经典途径中NIK的底物(Pierce等，1997)。这些数据指出了Bay11靶向非经典NF-κB途径的高特异性以及其阻止主要免疫应答调节物激活的能力。
通过靶向NF-κB途径的短暂免疫抑制方案可以是普遍适用的以限制免疫毒性。事实上，最近的报道显示通过使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米
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降低了AAV衣壳抗原呈递(Finn等，2010)。硼替佐米具有相当大的抗骨髓瘤效力(Kube和Srivastava，1997)，这在很大程度上可能是由于NF-κB信号转导的抑制。因此可能的是，同时阻断衣壳的MHC I呈递和炎性信号或者使用更高选择性的NF-κB靶向治疗，例如本研究中的Bay11或者更新的IKK抑制剂，以进一步增强AAV载体的安全性和治疗效力。
实施例3-经优化AAV3血清型载体的开发
腺相关病毒2(AAV2)是非致病性人细小病毒，其含有单链DNA基因组，并且具有跨越物种屏障的广泛组织向性(Muzyczka，1992)。重组AAV2载体作为用于多种人类疾病潜在基因治疗的有前途载体***已经得到了关注，并且目前用于若干基因治疗临床试验(Daya和Berns，2008)。最近，已经分离了多种另外的AAV血清型，并且发现其有效地转导特定细胞类型(Muramatsu等，1996；Chiorini等，1997；Chiorini等，1999；Rutledge等，1998；Gao GP等，2002；Vandenberghe等，2004)。尽管已经相当充分地理解了AAV2生命周期中的多个步骤(Summerford和Samulski 1998；Qing等，1999；Summerford等，1999；Hansen等，2000；Hansen等，2001；Sanlioglu等，2000；Douar等，2001；Zhao等，2006；Thomas等，2004；Zhong等，2004；Ferrari等，1996；Fisher等，1996；Qing等，2004；Zhong等，2004；Zhong等，2004；Zhong等，2008；McCarty等，2004；Bainbridge等，2008)，但是关于其他血清型了解得较少。
在10种常用的AAV血清型中，已经报道了AAV3不良地转导细胞和组织(Zincarelli等，Zincarelli等，2008)。但是，最近的研究表明，AAV3载体非常有效地转导建立的人肝母细胞瘤(HB)和人肝细胞癌(HCC)细胞系以及原代人肝细胞(Glushakova等，2009)。随后，有记录AAV3感染被肝细胞生长因子(HGF)、HGF受体(HGFR)特异性siRNA和抗HGFR抗体强烈地抑制，这表明AVV3利用HGFR作为用于病毒进入的细胞受体/共受体(Ling等，2010)。
泛素-蛋白酶体途径在AAV载体的细胞内运输中具有关键作用(Douar等，2001；Zhong等，2007；Duan等，2000)。可以通过表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)在酪氨酸残基处磷酸化完整的AAV2衣壳，而且该AAV衣壳的酪氨酸磷酸化不利地影响病毒细胞内运输和转基因表达。这些观察导致酪氨酸磷酸化是AAV衣壳泛素化之信号的暗示，随后是蛋白酶体介导的降解(Duan等，2000；Zhong等，2008)。这导致以下假设：表面暴露的酪氨酸残基(Y)突变成苯丙氨酸(F)可能允许载体避开磷酸化、泛素化和蛋白酶体介导的降解。事实上，AAV2载体中表面暴露酪氨酸残基的突变导致了在体外HeLa细胞和体内鼠肝细胞二者中较低剂量下的高效转导(Zhong等，2008)。使用单个和多重酪氨酸突变AAV2载体，已经在多种不同的小鼠品系中获得了人因子IX的治疗水平表达(Zhong等，2008；Markusic等，2010)。另外的研究已经证实，AAV血清型6、8和9中类似的Y到F的突变也可以导致转基因表达增强(Petrs-Silva等，2009；Qiao等，2010；Taylor和Ussher，2010)。AAV2中7个表面暴露酪氨酸残基中的6个也在AAV3中保守，但是尚未评估其参与AA3介导的转导。
本实施例证明：(i)在稳定转染并且过表达hHGFR后，AAV3载体介导的转导在T47D细胞中大幅提高，T47D细胞是一种人乳腺癌细胞系，其表达不可检测水平的内源hHGFR(Abella等，2005)；(ii)与hHGFR相关联的酪氨酸激酶活性不利地影响AAV3载体的转导效率；(iii)使用蛋白酶体抑制剂显著改进了AAV3载体介导的转导；(iv)AAV3衣壳上三个表面暴露酪氨酸残基的位点定向诱变导致转导效率改进；(v)两个酪氨酸突变的特定组合进一步提高了转基因表达的程度；以及(vi)在瘤内或全身施用后，AAV3载体在鼠异种移植模型中有效体内转导人HB和HCC肿瘤。这些经优化AAV3载体提供了用于基因治疗，特别是用于治疗人中肝癌治疗的改进工具。
材料和方法
细胞系和培养。人***(HeLa)和肝细胞癌(Huh7)细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)，并且保持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、1％青霉素和链霉素(P/S，Lonza，Walkersville，MD，USA)的完全DMEM培养基(Mediatech，Inc.，Manassas，VA，USA)中。新建立的人肝母细胞瘤(Hep293TT)细胞系(Chen等，2009)保持在补充有15％热灭活FBS(Sigma-Aldrich)、1％青霉素和链霉素(P/S，Lonza，Walkersville，MD)的完全RPMI培养基1640(Invitrogen，Camarillo，CA，USA)中。细胞在37℃、5％CO2的潮湿气氛中贴壁培养生长，并且在室温下用胰蛋白酶-versene混合物(Lonza)处理2-5分钟、洗涤并且重悬在完全培养基后传代培养。将人乳腺癌细胞系T47D和用hHGFR表达质粒稳定转染的T47D细胞(T47D+hHGFR)保持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、1％青霉素和链霉素(Lonza)之具有或不具有600μg/mL G418的完全DMEM培养基(Mediatech，Inc.)中。
重组AAV质粒和载体。重组AAV3包装质粒和重组AAV2-CBAp-EGFP载体质粒分别由Chapel Hill，Chapel Hill，NC的北卡罗莱纳大学(University of North Carolina)的Dr.R.Jude Samulski和Dr.Xiao Xiao慷慨提供。通过之前描述的磷酸钙三重质粒转染方案来包装包含由鸡β-肌动蛋白启动子(CBAp)驱动的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因之scAAV2和scAAV3载体的高度纯化储液(Wu等，2007；Kube和Srivastava，1997)。通过定量DNA狭缝印迹分析确定重组载体储液的物理(physical)颗粒效价(Kube和Srivastava，1997)。
表面暴露酪氨酸残基突变AAV3衣壳质粒的构建。如之前描述的通过使用质粒pAAV3进行基于QuikChange
Figure BSA0000211436760000551
位点定向诱变(Stratagene)的两阶段程序(Glushakova等，2009；Ling等，2010)。简单地说，在阶段一中，在每种突变体的不同的管中进行两个PCR延伸反应。一个管包含正向PCR引物，而另一个包含反向引物(表3)。
在阶段二中，将两个反应混合并且根据制造商的说明进行标准PCR诱变测定。PCR引物被设计为引入从酪氨酸到苯丙氨酸残基的变化以及沉默变化以产生用于筛选目的的新限制性核酸内切酶位点(表3)。在使用前用合适的限制酶筛选并且测序所有突变体。
表3
用于位点定向诱变之引物的核苷酸序列
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密码子三联体以粗体示出；红色字体表示从酪氨酸残基突变成苯丙氨酸残基，而绿色字体表示消除/产生限制酶位点(下划线)的沉默突变，其用于鉴定期望的克隆。
AAV载体转导测定。将Huh7或HeLa细胞在完全DMEM培养基中以每孔5,000细胞的浓度接种到96孔板中。在无血清且无抗生素的DMEM培养基中进行AAV感染。将Hep293TT细胞在完全RPMI培养基中以每孔10,000细胞的浓度接种到96孔板中。在无血清且无抗生素的RPMI培养基中进行感染。在转导后72小时通过直接荧光成像来分析EGFP的表达。
Western印迹分析。收获细胞并且在放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液(50mMTris-HCl、pH 8.0，150mM NaCl、0.1％SDS、1％NP-40、具有蛋白酶抑制剂混合物的1mM EDTA和0.25％脱氧胆酸钠、1mM NaF和1mM Na3VO4)中进行破坏。使用Bradford试剂(Bio-Rad)测量总蛋白质浓度，并且通过SDS-PAGE解析等量(50μg)的全细胞裂解物。在电泳后，将样品电转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，用相关一抗在4℃下探测过夜，用辣根过氧化物酶缀合的二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)孵育，并且用增强的化学发光底物(Amersham)检测。抗磷酸c-Met(Y1234/1235)、总c-Met、磷酸Akt(S473)和磷酸-ERK(T202/Y204)的抗体购自Cell Signaling，而抗β-激动蛋白(AC-74)抗体获自Sigma-Aldrich。
小鼠异种移植模型中重组AAV3载体的转导研究。向6周大的NSG小鼠(JacksonLaboratories)组皮下注射5×106Hep293TT或Huh7细胞。注射后四周，瘤内或通过尾静脉施用指定数目的AAV3载体基因组(vgs)。载体施用后四天，切割肿瘤，切片并且使用荧光显微镜评估EGFP表达。切片还用DAPI染色以可视化细胞核。根据批准的制度指南进行所有动物研究。
统计学分析。结果表示为平均值±标准差(SD)。使用分组未配对双尾分布的学生T检验鉴定组之间的差异。P值＜0.05被认为是统计学显著的。
结果
人HGFR是AAV3感染必需的。AAV3利用人肝细胞生长因子受体(HGFR)作为细胞共受体(Ling等，2010)。为了明确地证实这种发现，使用表达不可检测水平hHGFR的人乳腺癌细胞系T47D(Abella等，2005)以及用hHGFR表达质粒稳定转染的T47D细胞(T47D+hHGFR)(Abella等，2005)。通过Western印迹分析确认建立的细胞系T47D+hHGFR中hHGFR蛋白的表达(参见图12C)。在相同的条件下用多个感染复数(MOI)的自互补(sc)AAV3-CBAp-EGFP载体转导相等数目的T47D和T47D+hHGFR细胞，并且在转导后72小时确定转基因表达。示出在图11A中的这些结果表明，AAV3载体在表达hHGFR的细胞中的转导效率是在不表达的细胞中的～8-13倍。AAV3载体介导的T47D+hHGFR细胞的转导可以在5μg/mL hHGF的存在下被完全阻断(图IIB)。总之，这些数据提供了确凿的证据，细胞表面hHGFR的表达是AAV3载体成功转导所需的。
HGFR蛋白酪氨酸激酶活性的抑制增强AAV3载体的转导效率。为了检查除胞外结构域外，包含蛋白酪氨酸激酶活性的HGFR胞内结构域是否也参与AAV3感染，进行了进一步的研究。其配体HGF的结合导致受体的二聚化以及胞内结构域中多个酪氨酸残基的分子间转磷酸化(trans-phosphorylation)(Nguyen等，1997)。用提高浓度的特异性HGFR激酶抑制剂BMS-77760707(BMS)处理T47D+hHGFR细胞2小时(Schroeder等，2009；Dai和Siemann，2010)。随后用scAAV3载体以2,000vgs/细胞感染细胞。这些结果示出在图12A中。很明显BMS-777607处理导致AAV3转导效率提高～2倍。尽管当以10μM的最高浓度使用BMS-777607时p值较高，然而与1μM的较低浓度相比，这种变化很可能是由于药物毒性。在之前的研究中报道了BMS-777607处理在≤1μM的剂量下对细胞生长没有显著作用。但是10μM的剂量确实导致了细胞增殖的显著降低，这表明该浓度对细胞有毒性(Dai和Siemann，2010)。在接下来的实验中，为了排除这种药物的任何可能的非特异性性质，引入亲本T47D细胞作为对照。将这两种细胞类型用1μM BMS-777607处理2小时，然后用scAAV3载体以10,000vg/细胞感染。示出在图12B中的结果表明，虽然BMS-777607处理显著增强了T47D+hHGFR细胞中AAV3的感染性，但是其对缺少hHGFR表达的T47D细胞没有作用。
为了检查HGFR激酶的抑制是否导致参与下游信号转导途径的特定细胞蛋白质之磷酸化状态的改变，并且在2小时的药物孵育期之后，确定T47D和T47D+hHGFR裂解物二者中HGFR蛋白的总水平和磷酸化水平。使用磷酸化特异性抗体来分析HGFR激酶、ERK1/2和Akt下游的信号传导途径的激活。示出在图12C中的这些结果证实，虽然T47D细胞几乎不发生hHGFR的表达，然而T47D+hHGFR细胞中总HGFR和磷酸化HGFR二者的表达水平显著更高，这符合之前公开的报道(Abella等，2005)。用BMS-777607处理T47D+hHGFR细胞完全阻断了HGFR的磷酸化，但是不阻断总HGFR。此外，BMS-777607处理对磷酸化AKT和ERK1/2的表达没有作用。这些结果表明，BMS-777607处理增强AAV3载体感染性是由于抑制了HGFR激酶。
迄今为止，仅AAV2被报道使用hHGFR作为共受体(Yan等，2002)。尚不知道hHGFR和hHGFR激酶抑制剂对于其他AAV血清型的作用。为了排除BMS-777607对转导的任何非特异性增强，比较了在用BMS-777607处理细胞后不依赖于HGFR的其他AAV血清型以及AAV2载体的转导效率。示出在图13中的这些结果表明，虽然AAV2和AAV3载体可以有效地转导T47D+hHGFR细胞，然而其他血清型(AAV4-AAV9)仅可以以非常低的效率转导这些细胞。该结果表明，hHGFR不参与这些AAV血清型的生命周期。用BMS-777607处理细胞显著提高了AAV2和AAV3载体二者的转导效率，但是不影响其他AAV血清型，这表明BMS-777607处理的效果是AAV血清型特异性的。
蛋白酶体抑制剂提高AAV3载体的转导效率。之前的研究已经发现，蛋白酶体抑制剂(如MG132)可以通过促进细胞内运输而显著增强AAV2载体的转导效率(Zhong等，2007；Yan等，2002)。为了评估MG132是否还可以改进靶细胞中AAV3的运输，将良好建立的人肝细胞癌细胞系Huh7(Nakabayashi等，1982)和最近建立的人肝母细胞瘤细胞系Hep293TT(Chen等，2009)模拟处理或用提高浓度的MG132处理。在2小时处理后，用scAAV3-EGFP载体感染细胞。引入用5μM MG132处理并且用scAAV2载体转导的HeLa细胞作为阳性对照。在转导后72小时通过荧光显微术确定转基因表达。这些数据示出在图14A和图14B中。可以看到，用MG132预处理显著提高了HeLa细胞中scAAV2的转导效率，这符合之前的结果(Zhong等，2008)。有趣的是，在Huh7和Hep293TT细胞二者中，MG132处理后发生了scAAV3载体转导效率的剂量依赖提高，表明AAV3载体也经历了泛素化，随后的蛋白酶体介导的降解。
之前的研究还已经表明，通过EGFR-PTK的特异性抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂23(Tyrphostin23，Tyr23)抑制了EGFR-PTK信号转导，调节了Ub/蛋白酶体途径，其继而促进了AAV2载体介导的细胞内运输和转基因表达(Zhong等，2007)。将Hep293TT细胞模拟处理或用Tyr23处理2小时，并且用scAAV3载体转导。引入用Tyr23预处理并且用scAAV2载体转导的HeLa细胞作为适当的对照。在转导后72小时测定转基因表达。示出在图14C和图14D中的这些结果表明，Tyr23处理导致scAAV2载体和scAAV3载体二者转导效率的显著提高。提高的转基因表达不依赖于载体进入，因为在MG132或Tyr23的存在或不存在下，内在化的病毒DNA的量没有显著差异。这些结果进一步证实在AAV3载体的生命周期中也包括宿主细胞的Ub/蛋白酶体机制。
表面暴露Tyr残基的位点定向诱变显著改进scAAV3载体的转导效率。在前面的实施例中，本发明人已经证明了AAV2衣壳上有七个表面暴露酪氨酸残基(Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704和Y730)被EGFR-PTK磷酸化并且不利地影响AAV2载体的转导效率(Zhong等，2008)。AAV2和AAV3衣壳的氨基酸序列比对表明，七个酪氨酸残基中的六个(Y252、Y272、Y444、Y701、Y705和Y731)在AAV3衣壳中保守(表4)。
表4
AAV衣壳上的表面暴露Tyr残基，以及将其转变成苯丙氨酸残基的位点定向诱变
Figure BSA0000211436760000601
示出了AAV2和AAV3衣壳上的表面暴露酪氨酸(Y)残基；箭头表示AAV3衣壳上从Y到苯丙氨酸(F)残基的位点定向突变。
AAV2中的一个酪氨酸残基Y500在AAV3中以F501存在。由于已经表明多种AAV血清型中Y到F的突变通过绕过泛素化和蛋白酶体介导的降解而增强转基因表达(Zhong等，2008；Petrs-Silva等，2009；Qiao等，2010；Taylor和Ussher等，2010)，合理地认为F501突变回酪氨酸残基会降低AAV3载体的转导效率。通过产生其中将苯丙氨酸替换成酪氨酸残基(F501Y)的突变AAV3载体来测试该假设。在相同条件下使用Huh7细胞比较突变载体与其野生型(WT)AAV3对应体的转导效率。从图15A中可以看出，与WT AAV3载体相比，由F501Y突变载体介导的转基因表达程度降低了～50％。
为了进一步测试AAV3衣壳上的酪氨酸突变会导致EGFR-PTK介导的磷酸化降低，随后降低泛素化并且损害蛋白酶体介导的降解，从而导致转基因的表达升高的假设，对AAV3衣壳上的所有6个表面暴露酪氨酸残基进行修饰并且替换成苯丙氨酸残基(酪氨酸-苯丙氨酸，Y-F)。每个单酪氨酸突变载体包裹的scAAV2-CBAp-EGFP基因组可以被成功包装。通过定量DNA狭缝印迹和qPCR确定每种突变体的载体效价，未观察到包装效率的显著差异。在相同的条件下在Huh7(图15B)和Hep293TT(图15C)细胞二者中分析每一种酪氨酸突变载体的转导效率并且与WT scAAV3-CBAp-EGFP载体相比较。从这些结果，明显的是，三种酪氨酸突变载体(Y701F、Y705F和Y731F)的转导效率显著高于WT scAAV3载体。特别地，Y731F载体的转导效率为WT载体的～8倍，然后是Y705F(～3倍)和Y701F(～2倍)载体。
表面暴露酪氨酸残基的多重突变进一步改进AAV3载体的转导效率。在之前涉及Y-F突变AAV2载体的实施例中，观察到表面暴露酪氨酸残基的最有效单突变的特定组合进一步增强了AAV2载体的转导效率(Markusic等，2010)。为了检查利用AAV3载体是否可以实现类似的增强，构建了以下的双重和三重突变AAV3载体：Y701+731F、Y705+731F和Y701+705+731F。如通过定量DNA狭缝印迹和qPCR二者测定的，将这些突变载体中的每一种包装至类似效价。在相同条件下在Huh7细胞中将这些多重突变体的转导效率与WT和Y731F单突变AAV3载体相比较。这些结果示出在图16A中。可以看出，虽然如之前观察到的Y731F突变显著提高了AAV3载体的转导效率，但是仅一种双重突变(Y705+731F)导致转基因表达的额外显著提高。有趣的是，双重突变(Y701+731F)和三重突变(Y701+705+731F)载体二者的转导效率降低至与WT AAV3载体类似的水平。然后评估在人肝癌细胞上表现最佳的单和多重酪氨酸突变体对于T47D和T74D+hHGFR细胞的转导(图16B)。类似于人肝癌细胞，酪氨酸突变rAAV3载体导致高效转导具有或不具有hHGFR表达的两种细胞类型。
为了检查所观察到的Y-F突变载体转导效率的增强是否是由于涉及一种或更多种额外的假定细胞受体/共受体功能的可能性，在相同条件下在不存在或存在5μg/ml hHGF的情况下，使用WT、Y731F和Y705+731F突变scAAV3-CBAp-EGFP载体来转导Huh7细胞。这些结果示出在图16C中。很明显，hHGF的存在大幅抑制所有三种AAV3载体的转导效率和转基因表达，这符合酪氨酸突变载体也利用hHGFR作为用于病毒进入的细胞受体/共受体的解释。
AAV3载体转导小鼠异种移植模型中的人肝肿瘤。为了证明AAV3载体还可以体内转导异种移植小鼠模型中的人HB和HCC肿瘤，将～5×106HCC(Huh7)或HB(Hep293TT)细胞皮下注射到NOD/Scidγ(NSG)小鼠中。四周后，当两组动物中的肿瘤清晰可见和可感知时，将～2×1010vgs的scAAV3-CBAp-EGFP载体直接注射到肿瘤中。载体注射后四天，切除肿瘤并且在荧光显微镜下检查薄切片。这些结果表明，AAV3载体有效地体内转导人HCC(图17A)和HB(图17B)肿瘤二者。与体外数据相符，AAV3载体在Hep293TT细胞衍生肿瘤中的转导效率高于在Huh7细胞衍生肿瘤中的转导效率。
经优化的酪氨酸突变AAV3载体高效率地转导鼠异种移植物中的人肝肿瘤。接下来，进一步在体内评估表现最好的双重酪氨酸突变AAV3载体的异种移植人肝肿瘤基因转移。在第一组研究中，将～5×1010vgs的野生型(WT)scAAV3-或Y705+731F-AAV3-CBAp-EGFP载体瘤内注射到具有人HB(Hep293TT)肿瘤的NSG小鼠中。载体注射后四天，切除肿瘤，并且在荧光显微镜下检查薄切片(图17C)。可以看出，用WT-AAV3载体注射的肿瘤表现出可检测水平的EGFP表达。双重酪氨酸突变AAV3载体的转导效率显著高于WT AAV3载体，这与体外数据相符。
在第二组研究中，将～5×1011vgs的WT-scAAV3-CBAp-EGFP载体或Y705+731F-scAAV3-CBAp-EGFP载体通过尾静脉注射到具有人HB(Hep293TT)肿瘤的NSG小鼠中。使用磷酸缓冲盐水(PBS)注射作为适当的对照。虽然在用pBS注射的小鼠的肿瘤中几乎不发生转基因表达(图18A)，但是在全身性施用AAV3载体后可以实现直接的肿瘤靶向。再一次，经优化的酪氨酸突变AAV3载体的转导效率(图18C)显著高于WT AAV3载体的转导效率(图18B)。这些数据表明，观察到的酪氨酸突变AAV3载体的转导效率的提高不依赖于病毒施用途径。
HGFR是跨膜受体酪氨酸激酶，其配体HGF的结合导致受体二聚化以及胞内结构域中多个酪氨酸残基的分子间转磷酸化(Liu等，2008)。虽然很清楚的是AAV3衣壳与hHGFR的胞外结构域相互作用，但是不太清楚的是AAV3与hHGFR的结合是否也引发其下游靶蛋白的激活和磷酸化。数据确实证明了hHGFR-PTK活性的抑制导致AAV3载体介导的转基因表达的适度提高。在这种情况下，感兴趣的是注意到，与将近三十年前建立的人肝母细胞瘤(HB)细胞系Huh6相比，AAV3载体在最近建立的HB细胞系Hep293TT中的转导效率显著更高。虽然这两种细胞系之间可能存在细微差别，但是已经在Hep293TT细胞的hHGFR酪氨酸激酶结构域中鉴定了使其无活性的特定突变，并且增强Huh6细胞中的转导效率的hHGFR特异性激酶抑制剂BMS-777607对Hep293TT细胞中的AAV3转导效率几乎没有作用。
尽管AAV2(hFGFR1)和AAV3(hHGFR)利用两种不同的细胞生长因子受体作为共受体，但是这两种血清型似乎共有某些受体后进入(post-receptor entry)和细胞内运输途径。例如，在两种衣壳通过EGFR-PTK(推测在晚期内体中)在酪氨酸残基处磷酸化，随后泛素化，这导致蛋白酶体介导的降解(Zhong等，2008)。但是，尽管AAV2中7个表面暴露酪氨酸中的6个在AAV3中是保守的，但是相应Y-F突变体的行为模式稍有差异。例如，Y730F(AAV2)和Y731F(AAV3)是最有效的单突变体，然后是Y444F(AAV2)和Y705F(AAV3)，Y444F(AAV3)的转导效率保持未改变。类似地，虽然Y730+444F双重突变体(AAV2)的转导效率与Y730F的转导效率没有显著差异，但是Y705+731F双重突变体(AAV3)的转导效率显著高于Y731F。此外，Y730+500+444F三重突变体(AAV2)是最有效的，Y731+501+705F三重突变体(AAV3)是最有效的，Y501残基在WT AAV3衣壳中已经突变。有趣的是，甚至WT AAV3载体也能够在瘤内注射后相当好地体内转导小鼠异种移植模型中的人肝肿瘤。但是，已经证明了酪氨酸突变载体导致更高的体内基因转移效率的证据。
人肝癌，尤其是肝细胞癌(HCC)是最具侵入性的恶性肿瘤之一。患有HCC时生存的主要障碍是HCC切除后的复发(Tang，2005)。因此，为了完全清除肿瘤，理想的是转导100％的靶细胞。在之前的研究中，观察到来源于蜂毒的毒性肽蜂毒肽(melittin)通过抑制Rac1依赖性途径(Liu等，2008)以及上调线粒体膜蛋白7A6(Zhang等，2007)来体外和体内抑制HCC细胞的生存力和运动性。已经发现蜂毒肽通过激活CaMKII/TAK1/JNK/p38信号转导途径来潜在地诱导HCC细胞的凋亡(Wang等，2009)。
基于利用包含由肝癌细胞特异性启动子驱动的蜂毒肽基因的重组腺病毒载体来实现体外和体内特异性杀伤肝癌细胞的之前的研究(Ling等，2005)，本实施例提供了可用于选择性靶向原发的和转移的肝癌二者之由肝癌细胞特异性启动子控制的经优化酪氨酸突变AAV3-蜂毒肽载体。
实施例4-衣壳修饰的重组AAV2载体高效转导人单核细胞衍生的树突细胞
树突细胞(DC)是抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)，其在调节适应性免疫应答中起关键作用。DC是独特的APC并且已经被称为“专职(professional)”APC，这是因为DC的主要功能是呈递抗原，并且因为只有DC才具有在静息幼稚T淋巴细胞中诱导初次免疫应答的能力(Banchereau和Steinman，1998)。尽管可以在患者中检测到天然存在的抗肿瘤免疫应答，但是这种应答不能控制肿瘤生长。在另一方面，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)的存在下离体产生的单核细胞衍生DC(moDC)在内源表达抗原后具有刺激抗原特异性T细胞的能力(Chapuis等，1997；den Brok等，2005)。由于该原因，已经对遗传修饰的DC进行了大量研究并且开始了许多评估DC在癌症患者中之效力的I期和II期临床试验(Figdor等，2004；Palucka等，2011)。然而，当前用于DC负载的方法在细胞生存力方面不充分，对于抗原呈递寿命有不确定性以及受到患者单元型(haplotype)的限制(Palucka等，2011)。
通过生物技术来操作病毒基因组的可能性，以及最近许多肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定，已经引起了使用重组病毒来表达TAA，以期望在患者中诱导保护性抗肿瘤免疫应答的兴趣(Liu，2010；Robert-Guroff，2007)。在不同的基因递送方法中，基于人细小病毒腺相关病毒血清型2(AAV2)的载体受到了许多关注，这主要是因为该病毒的非致病性性质，以及其介导长期持续的治疗性基因表达的能力(Daya和Berns，2008；Mueller和Flotte，2008；Srivastava，2008)。已经证明了通过不同的常用AAV载体血清型来成功转导不同的DC子集，并且讨论了基于AAV的抗肿瘤疫苗的潜在优点(Pannazhagan等，2001；Veron等，2007；Mahadevan等，2007；Shin等，2008；Taylor和Ussher，2010)。但是，当用作抗肿瘤疫苗时，对于通过重组AAV载体向DC进行基因转移，亟待在特异性和转导效率方面的进一步改进以实现重大影响。
细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)不利地影响重组AAVB2载体的核转运以及随后的转基因表达，这主要是由于衣壳表面酪氨酸残基的磷酸化(Zhong等，2007)。这些研究导致开发了在表面暴露酪氨酸残基中包含点突变的下一代重组AAV2载体，其与野生型(WT)载体相比，在较低剂量下高效率地转导多种细胞和组织(Zhong等，2008)。但是，这样的单或多重酪氨酸突变AAV载体不能将单核细胞衍生DC(moDC)的转导效率提高超过2倍，最可能是由于与HeLa细胞或肝细胞相比，EGFR-PTK的表达水平和/或活性较低(Taylor和Ussher，2010)。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶参与多种细胞过程，例如分化、转录调节和许多细胞类型(包括免疫细胞)的发育。此类激酶还可以通过病毒衣壳上表面暴露丝氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化并且靶向载体以进行蛋白酶体介导的降解来负调节重组AAV载体介导的基因转移的效力。在本实施例中，证明了以下：(i)将AAV2衣壳上的15个表面暴露丝氨酸(S)残基位点定向诱变成缬氨酸(V)残基导致了S458V、S492V和S662V突变载体的转导效力比WT AAV2载体改进；(ii)S662V突变载体有效地转导人单核细胞衍生树突细胞(moDC)，这是一种不容易被常规AAV载体转导的细胞类型；(iii)S662V突变体对moDC的高效转导不在这些细胞中诱导任何表型改变；以及(iv)将编码截短的人端粒酶(hTERT)基因的重组S662V载体用于转导DC，导致迅速、特异性的T细胞克隆增殖和稳健的CTL的产生，这导致K562细胞的特异性细胞裂解。
材料和方法
细胞和抗体。从美国典型培养物保藏中心获得HEK293、HeLa和NIH3T3细胞并且在补充有10％FBS(Sigma)和抗生素(Lonza)的DMEM(Invitrogen)中保持为单层培养物。将白细胞去除术得到的外周血单核细胞(PBMC)(AllCells)在Ficoll-Paque(GEHeathCare)上纯化，重悬在无血清AIM-V培养基(Lonza)中，并且将半粘附细胞级分用重组人IL-4(500U/mL)和GM-CSF(800U/mL)(R&D Systems)孵育7天。用细胞因子混合物起始细胞成熟，持续48小时，所述细胞因子混合物包含10ng/mL TNF-α、10ng/mL IL-1、10ng/mL IL-6和1mg/mL PGE2(R&D Systems)。在EGFP表达之前，表征细胞的共刺激分子表达以确保其满足成熟树突细胞(mDC)的典型表型(CD80，RPE，鼠IgG1；CD83，RPE，鼠IgG1；CD86，FITC，鼠IgG1；Invitrogen)(Jayandharan等，2011)。
位点定向诱变。使用Turbo Pfu聚合酶(Stratagene)，如之前描述(Wang和Malcolm，1999)利用质粒pACG2进行两阶段PCR。简单地说，在阶段一中，在正向和反向PCR引物的不同管中进行两个PCR延伸反应3个循环。在阶段二中，将两个反应混合并且进行PCR反应另外15个循环，然后进行DpnI消化1小时。每一突变残基的引物被设计为引入从丝氨酸(TCA或AGC)向缬氨酸(GTA或GTC)的变化。
重组AAV载体的产生。如之前描述产生包含由鸡β-肌动蛋白启动子驱动之EGFP基因的重组AAV2载体(Zologukhin等，2002)。简单地说，使用聚氮丙啶(polyethelenimine，PEI，线性，MW 25,000，Polysciences，Inc.)转染HEK293细胞。转染后72小时收获细胞并且通过碘克沙醇(Sigma)梯度离心和离子交换柱色谱法(HiTrap Sp Hp 5mL，GE Healthcare)来纯化载体。然后使用离心旋转浓缩机(centrifugal spin concentrator)(Apollo，150-kDa截断，20-mL容量，CLP)将病毒浓缩并且在三个循环中将缓冲液更换成乳酸林格溶液(Cheng等，2011)。将10μL经纯化病毒在37℃下用DNAse I(Invitrogen)处理2小时，然后在56℃下用蛋白酶K(Invitrogen)另外处理2小时。将反应混合物通过苯酚/氯仿纯化，然后用氯仿处理。包装的DNA在20μg糖原(Invitrogen)的存在下用乙醇沉淀。利用特别用于CBA启动子的以下引物对和SYBR Green PCR Master Mix(Invitrogen)(Aslanidi等，2009)通过RT-PCR来确定DNAse I抗性的AAV颗粒效价：
正向：5′-TCCCATAGTAACGCCAATAGG-3′(SEQ ID NO：18)，
反向：5′-CTTGGCATATGATACACTTGATG-3′(SEQ ID NO：19)。
重组AAV载体的体外转导测定.将HEK293或单核细胞衍生树突细胞(moDC)用AAV2载体分别以1,000vgs/细胞或2,000vgs/细胞转导并且孵育48小时。或者，在转导前1小时，将细胞用50μM选择性丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂2-(2-羟乙基氨基)-6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯-9-异丙基嘌呤(用于CaMK-II)、蒽[1，9-cd]吡唑-6(2H)-酮、1，9-吡唑并蒽酮(用于JNK)和4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑(用于MAPK)(CK59，JNK抑制剂2，PD 98059，Calbiochem)预处理。如之前的描述来以每个视野的绿色荧光总面积(像素2)(平均值±SD)评估转基因表达(Markusic等，2011；Jayandharan等，2011)。使用方差分析比较测试结果和对照，其被确定是统计学上显著的。
Western印迹分析。如之前描述的进行Western印迹分析(Akache等，2006)。通过离心收获细胞，用PBS洗涤，并且重悬在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Set 2和3，Calbiochem)的裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液含有50mM TrisHCl、pH 7.5，120mM NaCl、1％Nonidet P-40、10％甘油、10mM Na4P2O7、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、1mM EDTA和1mMEGTA。将混悬液在冰上孵育1小时，并且通过在4℃下以14,000rpm离心30分钟来澄清。在蛋白质浓度归一化后，使用12％聚丙烯酰胺/SDS电泳分离样品，转移到硝酸纤维素膜，并且用一抗抗p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)兔mAb、总p38 MAPK兔mAb和GAPDH兔mAb(1∶1000，CellSignaling)探测，然后用辣根过氧化物酶连接的二抗(1∶1000，CellSignaling)探测。
特异性细胞毒性T-淋巴细胞产生和细胞毒性测定。如上所述产生单核细胞衍生树突细胞(moDC)。用编码分离在两个重叠ORF-hTERT838-2229和hTERT2042-3454中的人端粒酶cDNA的AAV2-S662V载体各自以2,000vgs/细胞的MOI感染未成熟DC。然后，使细胞经历补充物的刺激以诱导成熟。48小时后，收获表达hTERT的成熟DC并且与PBMC以20∶1的比混合。将CTL在25cm2瓶中以20×106细胞培养在含重组人IL-15(20IU/mL)和IL-7(20ng/mL)的AIM-V培养基中。每两天添加新鲜细胞因子。敏化后7天后，收获细胞并且用于杀伤测定(Heiser等，2002)。如之前描述产生杀伤曲线并且通过活/死细胞比的FACS分析来确定特异性细胞裂解(Mattis等，1997)。使用人无限增殖骨髓性白血病细胞系K562作为靶标。
统计学分析。结果表示为平均值±S.D。使用分组未配对双尾分布的学生T检验鉴定组之间的差异。P值＜0.05被认为是统计学显著的。
结果
特异性细胞丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制提高了rAAV2载体的转导效率。在之前的研究中，发现细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)活性的抑制和7个表面暴露酪氨酸残基的位点定向诱变通过阻止这些的残基磷酸化从而绕过泛素化和随后的蛋白酶体介导的载体降解而显著提高了AAV2载体的转导效率(Zhong等，2008)。但是，AAV2衣壳还包含15个表面暴露丝氨酸残基，其可以潜在地被在多种细胞类型和组织中广泛表达的细胞丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。为了测试抑制此类激酶活性可以阻止表面暴露丝氨酸残基的磷酸化从而改进AAV2载体的细胞内运输和核转运的假设，使用了细胞丝氨酸/苏氨酸激酶(包括钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CamK-II)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和促丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK))的多种市售特异性抑制剂。用特异性抑制剂(如2-(2-羟乙基氨基)-6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯-9-异丙基嘌呤(用于CaMK-II)、蒽[1，9-cd]吡唑-6(2H)-酮、1，9-吡唑并蒽酮(用于JNK)和4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑(用于p38 MAPK))在多种浓度下预处理HEK293细胞1小时。随后用单链(ss)或自互补(sc)AAV2载体以1,000载体基因组(vgs)/细胞转导细胞。这些结果表明，在50μM的最佳浓度下所有抑制剂显著提高ssAAV2和scAAV2载体的转导效率，p38 MAPK抑制剂是最有效的(图19A和图19B)。即使不能证明，该观察结果也表明，转导效率的提高最可能是有由于阻止了载体衣壳的磷酸化而不是提高了病毒第二链DNA合成。
AAV2衣壳上表面暴露丝氨酸残基的位点定向诱变提高了AAV2载体介导的转基因表达。AAV2衣壳在三个衣壳VP中的共同区病毒蛋白质3(VP3)中包含50个丝氨酸(S)残基，其中15个(S261、S264、S267、S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707、S721)是表面暴露的(Xie等，2002)。如所述将15个S残基中的每一个通过位点定向诱变替换成缬氨酸(v)(Zhong等，2008)。大部分突变体可以产生类似于WT AAV2载体的效价，例外是S261V、S276V和S658V产生低～10倍的效价，以及S267V和S668V产生不可检测水平的DNAseI抗性载体颗粒。S468V和S384V突变体的效价为WT AAV2载体的约3-5倍。评估每一种S-V突变载体在HEK293细胞中的转导效率。示出在图20中的这些结果表明，在15种突变体中，S662V突变体以其WT对应体转导的～20倍更有效地转导HEK293细胞。S458V和S492V突变载体的转导效率分别提高～4倍和2倍。图21A和图21B中示出了这三个关键的表面暴露丝氨酸残基在AAV2衣壳上的位置。利用双重突变体(S458+662V和S492+662V)或者三重突变体(S458+492+662V)未观察到转导效率的进一步提高，表明不同于一些酪氨酸突变体，丝氨酸残基中组合的多重突变既无叠加也无协同作用。有趣的是，在相同的感染复数(MOI)下，与WT AAV2载体相比，以更高效价产生的S468V和S384V突变体的转导效率保持未改变(S468V)或降低～10倍(S384V)。这些数据总结在图34中。
将S662替换成不同的氨基酸对AAV2衣壳的组装和AAV2载体介导的转基因表达具有不同作用。除了662位S到v的替换外，还产生了具有不同氨基酸的以下7种突变体：S662→丙氨酸(A)、S662→天冬酰胺(N)、S662→天冬氨酸(D)、S662→组氨酸(H)、S662→异亮氨酸(I)、S662→亮氨酸(L)和S662→苯丙氨酸(F)，并且在293细胞中评估了其转导效率。示出在图22并且总结在图35中的这些结果证明，将S替换成v导致产生了最有效的突变体，而无载体效价的任何改变。将S替换成N、I、L或F使包装效率降低了～10倍，而不显著影响转导效率；而将S替换成D或H分别使转导效率提高了～8倍和～4倍，而对载体效价没有影响。有趣的是，将S替换成A使得与WT AAV2载体相比，病毒效价提高至～5倍，并且使转基因表达增强～3倍。观察到的662位处丝氨酸突变体效价和转染性的变化表明每一种氨基酸在调节AAV2包装效率和生物活性二者中的关键作用。
S662V载体的转导效率与p38 MAPK活性相关。由于迄今为止所有S662V载体介导的转基因表达数据都是使用293细胞得到的，因此将这些研究扩展为包括以下细胞类型：(i)NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)，(ii)H2.35(小鼠胎肝细胞)，(iii)HeLa(人***细胞)，和(iv)原代人单核细胞衍生树突细胞(moDC)。在相同条件下用WT scAAV2-EGFP或S662VscAAV2-EGFP载体以2,000vgs/细胞的MOI转导这些细胞类型。在感染后(post-infection，p.i.)48小时评估HeLa、293和moDC的EGFP基因表达以及转染后5天评估H2.35和NIH3T3细胞的EGFP基因表达。这些结果示出在图23A中。可以看出，尽管WT和S662V突变载体之间转导效率的绝对差为～3倍(H2.35细胞中)至～20倍(293细胞中)，但是突变载体在每一种测试细胞类型中一致地更有效。由于用细胞p38 MAPK的抑制剂预处理细胞在提高转导效率中最有效(图19A和图19B)，因此本发明人检查了所观察的WT和突变载体转导效率的差异是否是由于细胞p38 MAPK的表达和/或活性水平的变化导致。用检测总p38 MAPK和磷酸-p38 MAPK水平二者的特异性抗体探测的Western印迹上分析由每一种细胞类型制备的细胞裂解物。使用GAPDH作为上样对照。示出在图23B中的这些结果表明，虽然p38 MAPK蛋白水平类似，但是不同细胞类型之间通过磷酸化水平确定的激酶活性显著不同，而且S662V突变载体的转导效率大致与p38 MAPK活性相关。p38 MAPK活性和S662V突变载体的效率之间的这些近似相关性可能可以通过不同细胞对于AAV感染的易感性，在初次感染后进入细胞的病毒颗粒的总数来解释。依然不清楚p38 MAPK介导的磷酸化调节AAV生命周期中的哪一个确切步骤。还可能是其他丝氨酸/苏氨酸激酶促近了S662V和WT载体转导效率的差异。但是有趣的是，WT-AAV2载体的转导并不导致293细胞或moDC中磷酸化的上调，进一步支持了之前AAV不在moDC中诱导稳健的表型改变的报道(Markusic等，2011)。
S662V载体介导的原代人moDC转导不导致表型改变。MAPK家族成员在APC的发育和成熟中具有重要作用。如上所述，用50μM选择性基因抑制剂处理从健康供体白细胞去除术分离的moDC，然后用WT scAAV2-EGFP载体转导。感染后2小时，用补充剂(TNF-α、IL-1β、Il-6、PGE2)处理细胞以诱导成熟。在感染后48小时通过荧光显微术评估EGFP转基因表达。用JNK和p38 MAPK的特异性抑制剂预处理moDC分别使EGFP表达水平提高～2倍和～3倍，S662V突变载体使转导效率增加～5倍(图24)。由于之前已经报道了抑制这些激酶来阻止树突细胞成熟(Beisleve等，2005；Nakahara等，2006；Nakahara等，2004；Harley，2008)，还评估了S662V突变体在DC中诱导表型改变的能力。用逐渐提高至50,000vgs/细胞的MOI感染moDC，在感染后48小时收获moDC，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)来分析表面共刺激分子的上调。DC成熟标志物(如CD80、CD83和CD86)的流式细胞术分析表明，与WT AAV2载体类似，S662V突变载体也不诱导moDC的成熟(图24C)。该观察结果支持之前描述的AAV载体的低免疫原性(Shin等，2008；Jayandharan等，2011)。
通过AAV2-S662V载体转导的moDC产生hTERT特异性CTL。由于与WT-AAV2载体相比，moDC中丝氨酸突变AAV2载体介导的转基因表达显著提高，因此检查了S662V负载moDC刺激产生细胞毒性T淋巴细胞和实现对于靶细胞特异性杀伤的能力。考虑到人端粒酶被认为是大部分癌细胞中通常表达的独特的抗癌靶标(Harley，2008；Beatty和Vonderheide，2008)，在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下克隆截短的人端粒酶(hTERT)基因并且将DNA包装到AAV2S662V突变体中。通过S662V载体递送的moDC/hTERT刺激含有至多25％CD8阳性细胞的非粘附外周血单核细胞(PBMC)一次。将无限增殖化骨髓性白血病细胞系K562用于细胞介导细胞毒性的双色荧光测定，以产生具有随后降低的效应物与靶细胞之比的杀伤曲线。这些实验结果示出在图25中，表明与表达GFP的moDC相比，负载有hTERT的moDC可以有效地刺激特异性T细胞克隆增殖以及杀伤活性。因此，由于产生迅速和强力的效应物应答是有效免疫治疗所必需的免疫策略，因此这些结果支持了基于AAV的递送方法用于疫苗研究的效力。
讨论
尽管已经在多种临床试验中证明了基因修饰的树突细胞刺激特异性抗肿瘤细胞毒性T细胞应答的可能性，然而之前尚未开发出用于治疗性基因负载、控制表达和抗原呈递的可靠方法(O’Neill和Bhardwaj，2007；Tacken等，2007)。自从差不多十年前用常规ssAAV载体转导树突细胞的初次尝试(Pannazhagan等，2001)以来，在提高这些载体的转导效率中已经取得了显著的进展。例如，自互补AAV(scAAV)载体的开发已经绕过了病毒第二链DNA合成的主要限速步骤，其大幅提高了不同树突细胞子集中的转基因表达水平(Shin等，2008；Aldrich等，2006；Wang等，2003)。基于AAV载体向树突细胞的抗原递送已经成功用于多种癌症模型(Mahadevan等，2007；Eisold等，2007；Yu等，2008)。
AAV结构和调节性病毒组分的天然灵活性促进了迅速的分子进化和众多血清学上不同的血清型形成(Gao等，2003；Vandenberghe等，2009；Wu等，2006)。多项研究已经表明，可以利用AAV的这种可塑性来产生具有不同细胞和组织向性的新载体(Wu等，2000；Girod等，1999)。另一些研究揭示，替换病毒衣壳上的单个氨基酸可以强烈影响病毒效价，与细胞受体的相互作用，组织向性和从内体到核仁的运输(Zhong等，2008；Wu等，2006)。Wu等(2006)已经报道将AAV6衣壳上531位处的赖氨酸替换成谷氨酰胺(K531E)降低了向小鼠肝细胞的体内基因转移以及对于肝素的亲和力。AAV1衣壳上的逆向突变(E531K)提高了肝转导并且赋予了肝素结合。
AAV2血清型载体的数据表明，从酪氨酸到苯丙氨酸的单替换(Y→F)通过阻止衣壳磷酸化、随后的泛素化以及借助蛋白酶体的降解而大幅改进病毒从内体到核仁的运输(Zhong等，2008)。这些研究导致产生了多种在不同细胞类型和组织中具有提高转导效率的载体。这样的载体用于提高向鼠肝细胞的F.IX基因转移，以用于血友病B的表型修正(Markusic等，2011)。这些酪氨酸突变AAV载体还导致高效转导小鼠视网膜，以用于潜在地治疗眼疾病(Petrs-Zilva等，2009)。虽然AAV6血清型在树突细胞中表现出比AAV2更高的转导效率(Veron等，2007；Taylor和Ussher，2010)，但是这些研究集中于AAV2，因为这些载体在基础研究和临床环境二者中研究得更广泛，但是，可以以与本文所述类似的策略开发AAV6载体。
已经非常清楚的是，AAV2衣壳上表面暴露酪氨酸残基的磷酸化不利地影响这些载体的转导效率，其可以通过使用已知使这些残基磷酸化的细胞EGFR-PTK的特异性抑制剂来大幅增强(Zhong等，2008)。在本实施例中，更详细描绘了丝氨酸残基磷酸化在AAV2载体生命周期中的作用。
事实上，可以通过用JNK和p38 MAPK的特异性抑制剂预处理细胞来增强ssAAV和scAAV载体二者的转导效率，暗示着AAV2衣壳上的一个或更多个表面暴露丝氨酸和/苏氨酸残基在宿主细胞内部被磷酸化，并且这种修饰不利于衣壳向细胞核运输。
接下来，将15个表面暴露丝氨酸残基中的每一个单独突变，但是这些突变中仅3个导致在不同细胞类型中转导效率从～2倍至～20倍的提高。但是，不同于酪氨酸突变体(Markusic，2011)，组合的多重突变并不增强双重突变(S458+662V和S492+662V)或者三重突变(S458+492+662V)AAV2载体的体外转导效率。关于这一点，值得注意的是DiPrimio等(DiPrimio等，2008)的报道，其中表征了位于保守核心β-桶状结构的H链和I链之间并且包含残基S662的HI环，位点定向诱变和肽替换二者均表明该衣壳区在AAV衣壳组装和病毒基因组包装中具有重要作用(图22A和图22B)(Xie等，2002)。尽管那些研究中并没有特异性以S662残基为目标，这些突变体中大部分的转导效率未改变或者降低了至多27倍。对于形成二十面体五倍对称性相关VP之间的相互作用并且位于围绕该轴之凹陷底部的HI环，还提出在AAV2结合肝素后，其经历了构象重排以打开位于二十面体五倍轴处的通道(Levy等，2009)。残基S458和492彼此相邻定位(由对称性相关VP促成)在二倍轴处朝向凹陷的突出(围绕二十面体三倍轴)的外表面上。之前S458A、S492A和S492T相邻残基的突变对衣壳组装没有影响并且对转导效率不产生影响(Lochrie等，2006)，这证实了特定氨基酸在AAV的包装效率和生物活性中具有重要作用。这些数据的另外结构分析揭示了以下内容：对于具有低产率的三个突变体，残基的侧链与相同VP单体的主链原子相互作用，而具有低效价的S267V与来自相同单体的D269相互作用。对于位于HI环中并且表明在衣壳组装中具有作用的另一种衣壳突变体S668V(DiPrimio等，2008)，利用替换未观察到相互作用的破坏。有趣的是，无论组装表型如何，所有这些残基均处于界面位置，但是只有458和492参与VP间相互作用。其他残基仅参与VP内相互作用(如果有的话)。因此，可能的是，当变为丙氨酸时，无衣壳或低衣壳产率突变体中的变化导致其VP错误折叠或消除了组装时所需的多聚体形式的形成。
在肿瘤免疫治疗环境中，T细胞激活的时间以及CD8T细胞应答的效力和持续时间是决定治疗结果的关键因素。因此，本发明人进一步评估了丝氨酸突变AAV2载体对moDC转导效率的提高是否与优异的T细胞敏化相关。使用人端粒酶作为特定靶标，因为在众多研究和临床试验中已经发现它是用于许多癌症患者广泛表达排斥抗原的有吸引力的候选物(Harley，2008；Beatty和Vonderheide，2008)。这些结果表明，AAV2衣壳的修饰可能有益于产生更加特异性和有效的载体以用于基因递送。
同样重要的是，一个主要障碍，诱导针对载体衍生和转基因衍生表位之细胞免疫应答中的免疫竞争(immuno-competition)可能会被克服，不仅是通过复制缺陷和重组AAV2表达的病毒蛋白质的缺失，而且通过以下事实：经修饰病毒颗粒有较少衣壳被宿主蛋白酶体降解，因此提供较少用于呈递的材料。
实施例5--rAAV2载体衣壳的优化
腺相关病毒(AAV)载体目前在许多I/II期临床试验中被用作靶向多种组织的递送载体，以实现治疗性基因的持续表达(Daya和Berns 2008；Mueller和Flotte 2008；Srivastava 2008；Asokan等，2012；Flotte等，2012)。但是，需要大的载体剂量以实现治疗益处。足够量载体的需要造成了生产挑战，以及引起对于载体的宿主免疫应答的风险(High和Aubourg，2011；Mendell等，2012，Mingozzi和High，2011)。更特别地，基于AAV2血清型的重组载体最初用于临床试验以用于血友病B的潜在的基因治疗，但是在该试验中，在较低载体剂量下不能实现人因子Ix(hF.IX)的治疗水平表达，并且在较高载体剂量下，由于针对AAV2衣壳的细胞毒性T细胞(CTL)应答，hF.IX的治疗水平表达是短暂的(Manno等，2006；Mingozzi和High，2007；Mingozzi等，2007)。
在利用基于AAV8血清型的重组载体的最近试验中，实现了hF.IX的治疗水平表达，但是观察到了对于AAV8衣壳蛋白的免疫应答(Aslanidi等，2012)。因此，关键的是开发可以以较低剂量使用的具有高转导效率的新AAV载体。细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)不利地影响来自重组AAV2载体的转基因表达，主要是由于AAV2衣壳在酪氨酸残基处的磷酸化，以及酪氨酸磷酸化衣壳随后被宿主蛋白酶体机制降解(Zhong等，2008；Markusic等，2010)。JNK和p38 MAPK丝氨酸/苏氨酸激酶的选择性抑制剂也改进AAV2载体的转导效率，表明某些表面暴露丝氨酸和/或丝氨酸残基的磷酸化可能也降低这些载体的转导效率。这些研究导致开发了酪氨酸和丝氨酸突变AAV2载体，已经发现其以比WT载体显著更高的效率转导多种细胞类型(Aslanidi等，2012；Zhong等，2008；Markusic等，2010；Petrs-Silva等，2009)。除了酪氨酸和丝氨酸残基外，通过位点定向诱变消除表面暴露苏氨酸残基也导致较低载体剂量下转导效率的提高。在本实施例中，通过位点定向诱变将17个表面暴露苏氨酸残基各自替换成缬氨酸(V)残基，发现这些突变体中四个T455V、T491V、T550V、T659V使在人HEK293细胞中的转导效率提高～2-4倍。由于与WT相比，酪氨酸三重突变(Y730F+500+444F)载体最有效地转导鼠肝细胞(Aslanidi等，2012；Zhong等，2008；Markusic等，2010；Petrs-Silva等，2009)，因此随后将这些突变与表现最佳的单丝氨酸突变体(S662V)和单苏氨酸突变体(T491V)组合以产生以下载体：两个四重的(Y444+500+730F+S662V；Y730+500+44F+T491V)和一个五重的(Y444+500+730F+S662V+T491V)。四重突变(Y444+500+730F+T491V)载体在降低的剂量下有效转导体外鼠肝细胞系以及体内原代鼠肝细胞，这表明通常在人基因治疗以及特别地在血友病中使用这些载体。
材料和方法
细胞。人胚肾细胞系HEK293细胞和鼠肝细胞系H2.35细胞获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)，并且在补充有10％胎牛血清(FBS；Sigma)和抗生素(Lonza)的DMEM(Invitrogen)中保持为单层培养物。
重组载体的产生。如之前的描述产生包含由鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)驱动之EGFP(scAAV2-GFP)或萤火虫荧光素酶基因(Fluc)(ssAAV2-Fluc)的重组AAV2载体(Aslanidi等，2012；Aslanidi等，2009；Zolotukhin等，2002；Kohlbrenner等，2005)。简单地说，使用聚氮丙啶(PEI，线性，MW 25,000，Polysciences，Inc.)转染HEK293细胞。转染后72小时，收获细胞并且通过碘克沙醇(Sigma)梯度离心和离子交换柱色谱法(HiTrap Sp Hp5mL，GE Healthcare)来纯化载体。然后使用离心旋转浓缩机(Apollo，150-kDa截断，20-mL容量，CLP)将病毒浓缩并且在三个周期中将缓冲液更换成乳酸林格溶液。为了确定基因组效价，将10μL纯化病毒在37℃下用DNase I(Invitrogen)孵育2小时，然后在55℃下用蛋白酶K(Invitrogen)另外孵育2小时。将反应混合物通过苯酚/氯仿纯化，然后用氯仿萃取。在20μg糖原(Invitrogen)的存在下，用乙醇沉淀O/N包装的DNA。利用特别用于CBA启动子的以下引物对和SYBR Green PCR Master Mix(Invitrogen)(Aslanidi等，2012；Aslanidi等，2009)通过qPCR来确定DNase I抗性的AAV2颗粒的效价：
正向：5′-TCCCATAGTAACGCCAATAGG-3′(SEQ ID NO：20)，
反向：5′-CTTGGCATATGATACACTTGATG-3′(SEQ ID NO：21)。
位点定向诱变。使用Turbo Pfu聚合酶(Stratagene)，如之前描述(Aslanidi等，2012；Wang和Malcolm，1999)利用质粒pACG2进行两阶段PCR。简单地说，在阶段一中，在正向和反向PCR引物的不同管中进行两个PCR延伸反应3个循环。在阶段二中，将两个反应混合并且另外进行PCR反应15个循环，然后进行DpnI消化1小时。每一突变残基的引物被设计为引入从苏氨酸(ACA)到缬氨酸(GTA)的变化。
重组AAV载体的体外转导测定。将人HEK293以1×103vgs/细胞，鼠肝细胞H2.35细胞以2×103vgs/细胞分别用WT和突变scAAV2-GFP载体转导并且孵育48小时。如之前描述以每个视野的绿色荧光总面积(像素2)(平均值±SD)来评估转基因表达(Aslanidi等，2012；Zhong等，2008；Markusic等，2010)。使用方差分析来比较测试结果和对照，其被确定是统计学上显著的。
细胞质和细胞核级分中载体基因组分布的分析。通过WT或突变scAAV2-GFP载体以MOI 1×104vgs/细胞感染约1×106H2.35细胞。在多个时间点通过胰蛋白酶处理以除去任何吸附的和未吸附的病毒颗粒，然后用PBS充分洗涤来收集细胞。利用Nuclear andCytoplasmic Extraction Reagents试剂盒(Thermo Scientific)根据制造商的说明分离细胞核和细胞质级分。利用上文所述的CBA特异性引物通过qPCR分析提取和检测病毒基因组。通过以下规则确定细胞质和细胞核级分之间病毒基因组量的差异：将来自用病毒处理之细胞的每一个样品的CT值归一化到来自模拟处理细胞的相应CT(ΔCT)。对于每一对样品的组，以倍数变化＝2-(ΔCT-细胞质-ΔCT-细胞核)计算存在的包装基因组的倍数变化。来自三个独立实验的数据表示为细胞核和细胞质级分中包装基因组总量的百分比。
体内生物发光成像。根据制度政策进行所有动物实验，而且根据国家研究委员会的实验动物管理和使用指南(National Research Council′s Guide for the Care andUse of Laboratory Animals)的原则进行所有程序。尽一切努力使痛苦最小化。向10周大的C57BL/6雄性小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)以1×1010vgs/动物静脉内注射WT和突变ssAAV2-Fluc载体(n＝3)。注射后两周使用Xenogen IVIS Lumina System(Caliper Life Sciences)分析荧光素酶活性。简单地说，将小鼠用2％异氟烷麻醉并且以150μg/g体重的剂量腹膜内注射荧光素底物(Beetle luciferin，Caliper LifeSciences)。将小鼠置于不透光(light-tight)室中并且在底物注射后5分钟采集图像。通过Living Image 3.2软件(Caliper Life Sciences)分析图像以确定相对信号强度。
AAV2衣壳上突变残基位置的可视化。下载AAV2 VP3晶体结构的原子坐标(残基217至735，VP1编号)(Protein Data Bank(PDB)登录号1lp3；[Xie等，2002])并且用于使用VIPERdb的Oligomer generator application(Carrillo-Trip等，2009)产生完整的衣壳模型。这通过矩阵乘法产生了用于产生T＝1二十面体衣壳的60个VP3拷贝。利用程序COOT(Xie等，2002)观察结构并且使用计算机程序PyMOL(Schrodinger，LLC)和RIVEM(Xiao和Rossman，2007)中的任一种产生图。
统计学分析。结果表示为平均值±S.D。使用分组未配对双尾分布的学生T检验鉴定组之间的差异。P值＜0.05被认为是统计学显著的。
结果
AAV2衣壳上的表面暴露苏氨酸残基的位点定向诱变。AAV2衣壳在三个衣壳VP(VP1、VP2和VP3)的共同区衣壳病毒蛋白3(VP3)中包含45个苏氨酸(T)残基。这些中的17个(251、329、330、454、455、503、550、592、581、597、491、671、659、660、701、713、716)是表面暴露的(Xie等，2002)。如之前描述将17个T残基中的每一个通过位点定向诱变替换成缬氨酸(V)(Aslanidi等，2012；Zhong等，2008)。大部分突变体可以产生类似于WT AAV2载体的效价，例外是T329V和T330V产生低～10倍的效价，以及T713V和T716V产生不可检测水平的DNAse I抗性载体颗粒。评估每一种T-V突变载体在HEK293细胞中的转导效率。示出在图26A和图26B中的这些结果表明，在17种突变体中，T491V突变体以其WT对应体转导的～4倍更有效地转导HEK293细胞。T455V、T550V、T659V突变载体的转导效率提高～2倍。这些数据表明，AAV2衣壳上特定酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基被细胞激酶磷酸化是这些载体转导效率的关键决定因素。
表面暴露苏氨酸残基的多重突变进一步提高AAV2载体的转导效率。为了评估苏氨酸突变AAV2载体的转导效率是否可以被进一步增强，产生了以下多重突变载体：三个双重突变体(T455+491V；T550+491V；T659+491V)，两个三重突变体(T455+491+550V；T491+550+659V)和一个四重突变体(T455+491+550+659V)。每一种多重突变载体包装的基因组效价类似于WT AAV2载体。在并排比较(side by side comparison)中，发现每一种多重突变载体比WT和单苏氨酸突变AAV2载体更有效地转导HEK293(图27A和图27B)。最佳性能载体被认为是三重突变体(T491+550+659V)，转导效率为WT载体的～10倍，为最佳单突变(T491V)载体的～3倍。这些数据证实，单个病毒衣壳上多个苏氨酸突变的组合导致在增强转导效率方面的协同作用。
经优化苏氨酸突变AAV2载体有效体外转导鼠肝细胞。已经发现之前实施例中描述的酪氨酸三重突变(Y444+550+730F)载体与包含多至7个表面酪氨酸到苯丙氨酸变化的载体相比有效转导鼠肝细胞(Markusic等，2010；Jayandharan等，2011)。因此，感兴趣的是评估最佳性能单丝氨酸(S662V)和单苏氨酸(T491V)突变与三重酪氨酸突变体的组合是否可以进一步提高这些载体的转导效率以根据本发明所述方法产生甚至进一步改进的表达载体。
为此，产生以下的多种多重突变体：两个四重(Y444+500+730F+T491V；Y444+500+730F+S662V)和一个五重(Y444+500+730F+T491V+S662V)突变载体。在H2.35细胞中这些突变体与WT和酪氨酸三重突变AAV2载体的转导效率的比较表明，Y444+500+730F+T491V突变体的表达水平为酪氨酸三重突变AAV2载体的～2-3倍，为WT AAV2载体的～24倍(图28A和图28B)。有趣的是，S662V突变与酪氨酸三重突变载体，或者与酪氨酸-苏氨酸四重突变载体的组合不利地影响其转导效率。添加多种其他苏氨酸突变(如T550V和T659V)，也不增强Y444+500+730F+T491V四重突变AAV2载体的转导效率。亟待另外的研究以获得对这些表面暴露的Y、S和T残基以及其磷酸化状态之间复杂相互作用的更好的理解。
多重突变增强AAV2载体的细胞内运输和核转运。阻止AAV2衣壳上表面暴露酪氨酸残基的磷酸化改进了酪氨酸突变载体的细胞内运输并且增加了转运至核仁的病毒基因组的数目(Zhong等，2008；Zhong等，2008)。在本实施例中，向酪氨酸三重突变载体添加T491V突变体通过进一步提高这些载体的核转运赋予其增强该转导效率的能力。为此，评估了H2.35细胞中Y444+500+730F+T491V四重突变体介导的转基因表达的动力学并且与Y444+500+730F三重突变体和WT AAV2载体相比较。这些结果示出在图29A和图29B中。可以看出，在每个测试时间点来自酪氨酸-苏氨酸四重突变载体的EGFP表达为～2-3倍，并且可以早在感染后16小时检测到。这些结果表明，早期开始的来自四重突变载体的转基因表达可能是由于这些载体更有效的核转运。为了通过实验测试这种可能性，使用qPCR分析在不同时间点定量用WT和两种突变AAV2载体转染的H2.35细胞之细胞质和细胞核级分中的载体基因组。两种细胞级分中载体基因组的比示出在图30A和图30B中。虽然在感染后16小时于细胞核级分中检测到了～20％的来自WT AAV2载体的基因组和～45％的来自三重突变载体的基因组，但是在相同的时间点检测到了超过70％的来自四重突变体的载体基因组。类似地，在感染后48小时于细胞核级分中仅检测到～45％的来自WT AAV2载体的基因组，在相同的时间点，在细胞核级分中检测到了～80％的来自三重突变载体的基因组，以及～90％的来自四重突变体的载体基因组。因此，这些数据证实了以下假设：组合苏氨酸(T491V)突变和酪氨酸三重突变(Y444+500+730F)载体导致这些载体的核转运适度改进，这与更快的基因表达开始以及观察到的转导效率的提高相关。
经优化AAV2载体高效体内转导鼠肝细胞。在鼠模型中体内评估经优化AAV2载体的转导效率。每一种多重突变载体用单链萤火虫荧光素酶(Fluc)AAV2基因组一起包装，并且将～1×1010vgs的每一载体静脉内注射到C57BL/6小鼠(每组n＝3)中。注射后两周通过生物发光成像评估的Fluc基因表达水平表明，Y444+500+730F+T491V四重突变载体的表达为酪氨酸三重突变载体的表达的～3倍。图31A和图31B中示出了来自每一组的一个代表性动物和这些数据的量化。与体外获得的数据一致，添加S662V突变对酪氨酸三重突变载体和酪氨酸-苏氨酸四重突变载体二者的转导效率具有不利影响。本发明的示例性单和多重突变衣壳蛋白包括但不限于表5中示出的那些：
表5
AAV2衣壳上的表面暴露酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的示例性突变概述
Figure BSA0000211436760000791
第一个字母对应于野生型AAV2衣壳中的氨基酸，数字是突变的VP3氨基酸位置，而最后的字母是突变氨基酸。
讨论
作为多种遗传病的潜在治疗，重组基于AAV的载体是用于基因替代疗法的有吸引力的递送载体。虽然AAV载体已经被成功用于许多动物模型，并且最近在多种临床试验中显示出效力，但是AAV生命周期中的多个步骤依然似乎显著限制这些载体在基因治疗中的效力。这些步骤中的一些包括细胞内运输、核转运、脱壳和病毒第二链合成(Ding等，2005；Harbison等，2005；Nonnenmacher和Weber，2012).
AAV结构和调节组件的简单组织结构和天然可塑性提供了操作病毒衣壳和基因组以开发具有区别特征之定制的重组载体的独特机会。过去十年在改进重组AAV载体的特异性和转导效率方面已经做出了重大进展。例如，病毒反向末端重复(ITR)序列中的特定突变导致开发了自互补AAV(scAAV)载体，其克服了病毒第二链DNA合成的限速步骤，并且极大提高了多种类型细胞和组织中的转基因表达水平(McCarty等，2003；Wang等，2003)。对于衣壳结构分析的另外研究与来自衣壳基因诱变研究的大量信息的组合导致鉴定了在这些载体的载体衣壳化、组织向性和细胞内运输中具有关键作用的特定区域(Lochire等，2006；Muzyczka和Warrington，2005；Wu等，2006；Gao等，2003；Vandenberghe等，2009；Wu等，2006)。
在之前的实施例中，发现AAV2衣壳上表面暴露的特定酪氨酸(Y)和丝氨酸(S)残基的替换显著提高了这些载体的体外和体内二者情况下的转导效率，假设是通过阻止磷酸化、随后的泛素化和蛋白酶体介导的降解来实现。由于预期AAV2衣壳上的表面暴露的特定苏氨酸(T)残基会同样地经历磷酸化，因此在本实施例中，将17个表面暴露的T残基的每一个***地诱变，并且鉴定出多种单突变载体可以使转导效率提高至4倍。在HEK293细胞中，与WTAAV2载体相比，鉴定出单个衣壳上多重T突变的组合将转导效率进一步增强至～10倍的修饰。
两个独立的研究组之前已经报道了AAV2衣壳上特定T残基的突变。例如，Lochrie等，2006以330、454、455、491、503和550位处的T残基为目标努力尝试(tour de forceeffor)来鉴定与抗体结合的表面区域，而DiPrimio等(2008)以659位处的T残基为目标尝试鉴定对于衣壳组装和基因组包装关键的区域。在这两个研究中，将T残基替换成了丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或赖氨酸(K)残基，或者通过肽替换。但是，未观察到任何突变载体转导效率的提高。相比之下，在本实施例中，将表面暴露T残基替换成了缬氨酸残基。这进一步证实了特定氨基酸类型在调节AAV载体的生物活性中具有关键作用的最近的观察结果(Aslanidi等，2012；Li等，2012)。
当最有效的苏氨酸突变(T491V)与之前报道的酪氨酸三重突变(Y444+500+730F)(Markusic等，2010)组合以产生Y-T四重突变(Y444+500+730F+T491V)载体时，这种载体在体外和体内鼠肝细胞中的转导效率为酪氨酸三重突变载体的～2-3倍。但是，最有效的S突变(S662V)(Aslanidi等，2012)与酪氨酸三重突变的组合不利地影响Y-S四重突变(Y444+500+730F+S662V)载体和Y-S-T五重突变(Y444+500+730F+S662V+T491V)载体的转导效率。虽然多种其他组合表现出比WTAAV2载体更高的转导效率，但是没有类似组合(四重、五重或六重酪氨酸；以及三重和四重苏氨酸突变体)或最佳性能YST突变的组合达到三重酪氨酸突变载体的表达水平。鉴于测试了大量突变的组合，本文仅详细表征了与三重酪氨酸突变载体相比显著提高转导效率的突变。
17个AAV2表面暴露苏氨酸残基分散在整个衣壳上。四个突变(T329V、T330V、T713V和T716V)导致组装和载体产生中的显著缺陷，而且不能对其进一步表征。残基329和330位于AAV2 VP3结构的核心β-桶状结构的βD和βE链之间的α-表面环(DE环)中(Xie等，2002)。来自二十面体五倍对称性相关VP3的这些环中的5个在该轴处组装通道，其连接衣壳的内表面和外表面(图32A)。如在之前的研究(Bleker等，2006)中观察到的，这些突变体的效价显著降低，符合通道在基因组包装中的作用。残基713和716分别位于二十面体二倍和五倍轴处和其周围的凹陷之间的壁/凸起的衣壳区上(图32A和图32B)。其侧链参与与对称性相关VP3单体的极性相互作用，且突变可能导致衣壳组装的缺陷。位于二十面体二倍轴处的残基在衣壳组装中的作用符合最近的报道：他们观察到介导与组装激活蛋白(assembly-activating protein，AAP)相互作用的AAV2残基位于该衣壳区(Naumer等，2012)。
在突变成缬氨酸或丙氨酸时表现出提高的转导表型的残基T455、T491、T550和T659位于围绕二十面体三倍轴的突出上(T455、T491和T550)或者位于处在AAV2衣壳的二十面体五倍轴通道周围之凹陷上的HI环(核心β-桶状结构的βH和βI之间)(T659)上。突出(由两个VP3单体组装的衣壳上的显著特征)上的残基分别定位于突出的接近于顶部(455)，侧朝向二倍凹陷(491)，以及侧朝向五倍周围的凹陷(550)。该AAV区包含序列和结构中的大部分变化性，并且除了残基659，其余三个苏氨酸残基定位于限定VP3可变区(VR)(Govindasamy等，2006)。与T659一起，这些残基在衣壳表面上形成了从突出的顶部向二十面体五倍轴周围的凹陷延伸的足迹(footprint)(图32A和图32B)。其表面暴露与和宿主分子(其可能包括激酶)相互作用的潜力一致。有趣的是，这种足迹侧翼是三重酪氨酸突变体中的残基Y444、Y500和Y730，T491位置接近于衣壳表面氨基酸的描述中的酪氨酸残基Y730(图32B)。当7个表面暴露酪氨酸突变成苯丙氨酸残基时，存在于衣壳二十面体轴之凹陷中的该残基表现出与WT AAV2相比最高的转导提高(Zhong等，2008)。明显地，当在内吞途径中运输期间遇到的条件下检查同源AAV8时，观察到二倍衣壳区经历pH介导的结构转变(Nam等，2011)。可能的是，AAV2的突变通过改变受体结合机制来提高转导效率。调节AAV2和AAV6与硫酸乙酰肝素受体相互作用的残基R585和R588以及K531(结构上等同于AAV2中的E530)分别接近于该足迹(图26B)，VRV中的残基491和500位于AAV2衣壳表面上的两个大区域的一个中，已表明其与AAV8中的LamR受体结合(Akache等，2006)。VRV中的氨基酸还在AAV9衣壳与其聚糖受体半乳糖的结合中具有作用。
考虑到该残基位于由突变时消除潜在的磷酸化增强转导的残基所描绘的足迹内，包含S662V突变的突变体转导效率降低的表型难以解释(图32A和图32B)。此外，已经示出该残基突变为缬氨酸改进了相对于WT AAV2的转导(Aslanidi等，2012)。与残基T659一样，残基S662位于由相邻五倍对称性相关VP3单体延伸的HI环中，并且可能在稳定五聚体亚基中具有作用。但是，丝氨酸侧链不参与任何亚基间或亚基内相互作用，并且虽然HI环已被报道是衣壳组装和基因组包装的决定因素(DiPrimio等，2008)，然而其耐受单氨基酸替换(Aslanidi等，2012)。因此，其效果可能是由于利用含三重酪氨酸突变残基和T491的足迹消除了衣壳相互作用。明显地，构成HI环的附近氨基酸突变的表型，例如氨基酸残基664替换丝氨酸(mut45subSer14)或FLAG表位(mut45SubFLAG10)是非感染性的并且不能组装到病毒衣壳中(Wu等，2000)。但是，相同位置HA的***产生了部分缺陷但依然结合肝素的衣壳(Wu等，2000)。
虽然在感染后48小时仅有～45％的由WT AAV2载体递送的载体基因组存在于细胞核中，但是在相同时间点，存在＞90％的由Y-T四重突变载体递送的载体基因组。这表明了突变体改进的运输动力学，其符合对于蛋白酶体的重定向减少。与酪氨酸三重突变载体相比，这些载体转导效率的适度(～2-3倍)提高还符合细胞核载体基因组递送～10％的提高，即，～90％相比于～80％。
表面酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸修饰的多种组合清楚表明，有实现最大增加的最佳组合。这些研究还突出了感染期间AAV相互作用中特定残基类型和增强转导的需要。可能的是，在作为单个变化不表现出显著转导效率提高的个别突变在单个衣壳中组合可能形成优异的载体。
表6
AAV血清型中酪氨酸残基的比较
(在其氨基酸位置后以“＊”表示表面暴露残基)
Figure BSA0000211436760000841
Figure BSA0000211436760000851
表7
AAV血清型中赖氨酸残基的比较
(在其氨基酸位置后以“＊”表示表面暴露残基)
Figure BSA0000211436760000861
Figure BSA0000211436760000871
Figure BSA0000211436760000881
粗体的残基是表面相关的赖氨酸＝＊
位于衣壳内部的残基＝I
该血清型在该位置没有同源性赖氨酸＝NA
在AAV的晶体结构中不可见的残基为灰色阴影；但是，生物化学数据表明这些氨基酸位于AAV衣壳内部，直到病毒生命周期中的一些点，然后其被外在化。
实施例6-AAV3载体抑制人肝肿瘤发生
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在实体癌中位列第五，全世界每年有～695,900例死亡(Thomas和Zhu，2005；Jemal等，2011)。在过去的二十多年中，HCC在USA的发病率增加三倍，而五年存活率保持低于12％(EI-Serag，2011)。在亚洲和非洲甚至更糟，在中国每年发病率为每3,000人中1人(Chen等，2013)。当前，HCC的分期被认为是计划最佳治疗的关键(Bruix等，2005)。患有早期HCC的患者可以从根治(治愈)治疗受益，并且具有中间阶段的那些患者可以从姑息治疗受益。但是，复发是频发的并发症，并且治疗失败率高。对于具有晚期HCC的那些患者，遗憾的是，最佳维持护理是唯一的选择(Verslype等，2009)。美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准了一种药物索拉菲尼(sorafenib)用于晚期HCC，但是在III期临床试验中，中值存活率仅从7.9个月提高到10.7个月(Llovet等，2008)。
AAV载体在治疗Leber先天性黑矇(Bainbridge等，2008；Maguire等，2008；Cideciyan等，2008；Cideciyan，2010)、血友病B(Nathwani等，2011)和芳香族L氨基酸羧化酶缺陷(Hwu等，2012)中表现出了明显的效力。一种治疗脂蛋白脂肪酶缺陷的rAAV1载体Glybera是西方世界的第一个基因治疗产品(Melchiorri等，2013)。在21世纪初期，研究者使用常规单链(ss)rAAV2载体来体内靶向HCC(Su等，2000)。遗憾的是，由于ssAAV2载体的转导效力低，因此经由全身性施用未在大于2-mm的肿瘤中观察到转导(Peng等，2000)。最近，发现在小鼠内源HCC模型中使用rAAV8载体递送特异性miRNA来导致癌细胞增殖的抑制(Kota等，2009；Hsu等，2012)。但是，在鼠模型(Zincarelli等，2008；Gao等，2002；Wang等，2005)和非人灵长类动物(Nathwani等，2006；Nathwani等，2007)中，rAAV8载体对除肝脏外的正常组织具有宽的向性。
有趣的是，本发明人已经证明，未能有效体内转导任何正常鼠组织的rAAV3载体(Zincarelli等，2008；Palomeque等，2007；Markakis等，2010；Ling等，2010)表现出高效转导体外(Ling等，2010；Glushakova等，2009)和体内(Cheng等，2012)的人HCC细胞。虽然rAAV3载体还转导原代人肝细胞，但是可以通过使用HCC特异性启动子α-甲胎蛋白启动子(AFPp)来使转基因表达局限于恶性细胞。在随后的研究中，本发明人观察到，rAAV3载体利用人肝细胞生长因子受体(hHGFR，也称为c-Met)作为细胞共受体(Ling等，2010)，其表明了探究基于rAAV3的载体靶向人肝癌的机会，因为hHGFR在大部分HCC细胞中过表达(You等，2011)。此外，由于AAV3载体与其他常用AAV血清型相比在人中具有更低的预先存在中和抗体的可能性(van der Marel等，2011)，因此其具有开发为用于人肝癌基因治疗之选择性病毒载体的潜力。本实施例证明，可以通过消除病毒衣壳上的特定表面暴露酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基来实现在人肝癌细胞中rAAV3介导的转导效率的进一步增强。未观察到与这些修饰有关的体外细胞受体相互作用和体内病毒向性的显著改变。此外，通过全身性施用携带有来自传统中医药天花粉蛋白(Trichosanthin)之新治疗性基因的经优化rAAV3载体，实现了人肝癌异种移植模型中肿瘤发生的显著抑制。
材料和方法
化学物质、质粒和引物。I-A级肝素钠盐购自Sigma-Aldrich。重组hHGF购自LifeTechnologies。质粒pHelper购自Agilent Technologies。质粒pdsAAV-CBAp-EGFP和pAAV-CBAp-FLuc由教堂山北卡罗莱纳大学的Xiao Xiao博士处获得。之间已经描述了质粒pdsAAV-AFPp-EGFP(Glushakova等，2009)。TCS基因(Shaw等，1994)由Life Technologies基于公开的序列(栝楼(T.kirilowii)天花粉蛋白(TCS)mRNA，complete cds；GenBank：M34858.1)合成，并且使用AgeI和HindIII限制性位点亚克隆到质粒pdsAAV-AFPp-EGFP中。在使用前对所有突变质粒进行测序。
经优化rAAV3衣壳质粒的构建.如之前描述(Zhong等，2008；Markusic等，2010；Aslanidi等，2013)使用Turbo Pfu聚合酶(Stratagene)进行两阶段PCR程序以在rAAV3衣壳中引入位点特异性突变。简单地说，在阶段一中，在每种突变体的不同管中进行两个PCR延伸反应。一个管包含正向PCR引物，而另一个包含反向引物。在阶段二中，将两个反应混合并且根据制造商的说明进行标准PCR诱变测定。在使用前对所有突变质粒进行测序。
细胞系和培养物。人肝细胞癌(Huh7)细胞在之前有描述(Ling等，2010；Cheng等，2012)，并且保持在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich)、1％青霉素和链霉素(Lonza)的完全Dulbecco改良Eagle培养基(C-DMEM，Mediatech，Inc.)中。新建立的人肝母细胞瘤(Hep293TT)细胞系获自Gail E.Tomlinson博士(University of Texas HealthScience Center at San Antonio)并且保持在补充有15％热灭活的FBS(Sigma-Aldrich)和1％P/S(Lonza)的完全RPMI培养基1640(Life Technologies)中。细胞在37℃、5％CO2的潮湿气氛中贴壁培养生长，并且在室温下用胰蛋白酶-versene混合物(Lonza)处理2-5分钟、洗涤并且重悬在完全培养基后进行传代。
rAAV载体产生。通过三重质粒转染方案产生高度纯化的rAAV载体储液。简单地说，使用聚氮丙啶(线性，MW 25,000，Polysciences，Inc.)用三种质粒共转染HEK293细胞，并且在转染后6小时更换培养基。转染后72小时收获细胞并且进行三个冻融循环，然后用Benzonase(Life Technology)消化。通过碘克沙醇(Sigma-Aldrich)梯度超速离心接着使用HiTrap SP/Q HP(GE Healthcare)通过离子交换色谱法纯化病毒载体，用磷酸缓冲盐水(PBS，Mediatech，Inc.)洗涤，并且通过具有150Kda分子量截断(MWCO)的离心旋转浓缩机浓缩。通过定量DNA狭缝印迹和Southern印迹分析来确定重组载体储液的物理基因组效价。
rAAV载体体外转导。将细胞以5,000或10,000细胞/孔接种到96孔板的C-DMEM中。二十四小时后，将细胞模拟处理或者用指定的化学物质处理2小时。然后在具有或不具有指定化学物质的情况下，在无血清且无抗生素的DMEM培养基中进行rAAV感染(MOI：5×103)2小时，然后用PBS彻底洗涤以除去载体接种物。在转导后72小时通过荧光显微术或流式细胞术分析转基因表达。
hHGF竞争测定。用scAAV3-CBAp-EGFP载体以5×103vgs/细胞的MOI转导Huh7细胞。载体与逐渐提高浓度的重组hHGF预混合。在转导后72小时分析细胞的EGFP表达水平。
动物操作。所有动物实验均经适当的监管机构批准，并且根据用于动物管理的特定指南进行。六至十周大的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷的IL2-γ-缺陷(NSG)雄性小鼠购自Jackson Laboratory。
人肝癌异种移植模型。六至十周大的雄性NSG小鼠在肩胛骨之间颈部的腹侧上接受5×106Huh7或Hep293TT细胞的皮下注射。将动物在实验结束之前一直保持在无菌笼中。
体内FLuc测定。将rAAV载体通过尾静脉静脉内注射或者直接注射到NSG小鼠的肿瘤中。对于体内FLuc成像，将小鼠称重以根据4mg/kg体重的剂量来计算底物D-荧光素-K+盐(Caliper Life Sciences)的体积，并且麻醉。将计算的5mg/mL体积的底物储液与100μLPBS混合并且腹膜内注射。使用装备有冷却电耦合装置相机(cooled couple-chargeddevice camera)的Xenogen机器(Xenogen)在5分钟时段内立即采集体内生物发光图像。使用相机控制程序Living Image软件定量信号强度，并且表示为光子/秒/cm2/steridian(p/s/cm2/sr)。
统计学分析。结果表示为平均值±标准差(SD)。使用单因素ANOVA和Sidak多重比较检验在GraphPad Prism 6软件中鉴定组之间的差异。
结果
rAAV3载体选择性体内转导人肝肿瘤。在第一组研究中，将rAAV3和rAAV8载体在人HCC肿瘤中的转导效率与在小鼠异种移植模型中的体内转导效率相比较。非肥胖糖尿病(NOD)、严重联合免疫缺陷(scid)、白介素2缺陷(IL2-)(NSG)的雄性和雌性两种小鼠(n＝4)在肩胛骨之间的腹侧上皮下注射5×106人Huh7细胞，其形成肿瘤。四周后，将小鼠模拟注射或者通过尾静脉以1×1011病毒基因组(vgs)/小鼠注射rAAV3或rAAV8载体，所述载体携带有处于巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡β-肌动蛋白杂合启动子(CBAp)控制之下的萤火虫荧光素酶基因(FLuc)(图40A)。施用载体后3天进行全身生物发光成像。这些结果示出在图36A中。可以看出，在用rAAV3载体注射的雄性和雌性小鼠二者中，FLuc表达限于肿瘤，而在用rAAV8载体注射的小鼠中，FLuc表达相对更普遍，但是主要位于肝脏，并且rAAV8载体的转导效率在雄性小鼠中显著更高，观察结果符合之前公开的研究(Davidoff等，2003)。定量数据进一步证明，rAAV3载体介导的转基因表达限于肿瘤，而在肝脏中检测到很少的转基因表达。相比之下，在rAAV8载体注射的小鼠中，肿瘤中仅发生低水平的转基因表达，而肝脏中的表达显著更高。为了进一步证实这些结果，在第二组实验中，将rAAV3和rAAV8载体用于以1×1011vgs/小鼠直接瘤内注射到具有人Huh7肿瘤的雄性NSG小鼠中(n＝4)，并且在载体注射后3天获得全身生物发光图像。从图36C中可以看出，在用rAAV3载体注射的小鼠中，高水平的转基因表达位于肿瘤中，而在用rAAV8载体注射的小鼠中，除了肿瘤外，在肝脏中也检测到了显著的转基因表达。因此，与rAAV8载体相比，rAAV3载体在该实验模型具有体内人肝肿瘤向性。
在初步实验中，还注意到了在载体施用后5天肿瘤中转基因表达的降低，这是由于HCC肿瘤的迅速生长。因此，为了进一步证实这些结果，在接下来的一组实验中，在低(L＝1×1011vgs/小鼠)和高(H＝1×1012vgs/小鼠)剂量下对rAAV3和rAAV8载体进行直接瘤内注射。在第3天和第7天时获得的全身生物发光成像数据示出在图36D中。很明显，即使在高剂量下，rAAV3载体注射的小鼠中肝脏的异位表达也最小，而瘤内注射的rAAV8载体导致肝脏中剂量和时间依赖方式的强转基因表达。在载体注射后第7天，处死小鼠并且比较存在于肝组织样品中的病毒基因组拷贝数。示出在图36E中的这些结果表明，肝脏中存在大量rAAV8载体基因组，而rAAV3载体基因组的数目最小，证实了较早的结果。这些结果与较早结果(Ling等，2010；Glushakova等，2009；Cheng等，2012；Ling等，2011)一起提供了使用rAAV3载体介导的基因治疗用于HCC的清楚理论。
可以通过病毒衣壳的修饰来实现体外人肝癌细胞中rAAV3载体介导的转基因表达的进一步增强。为了进一步增强rAAV3载体的转导效率，进行rAAV3衣壳的位点定向诱变。除了将表面暴露酪氨酸(Y)诱变成苯丙氨酸(F)残基(Cheng等，2012)外，还将表面暴露丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)残基分别诱变成缬氨酸(V)和谷氨酸(E)或精氨酸(R)残基。优先考虑在不同AAV血清型之间保守的位置，并且之前已经发现使rAAV2载体的转导效率增强(Zhong等，2008；Markusic等，2010；Aslanidi等，2013；Aslanidi等，2012)。在相同的条件下，使用携带CBAp驱动的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因的野生型(WT)和所有突变rAAV3载体(图40A)来评估其在人HCC细胞系Huh7中的转导效率。对这些数据的概括在图41中提供。两种K突变体(K528E；K533E)的转导效率降低＞10倍，而多种Y和T突变体(Y272F；Y444F；T251V；Y705+731F+T492V)的转导效率降低＞2倍。其余突变体的转导效率提高＜2倍至＞10倍。然后在相同的条件下，使用携带CBAp-驱动的FLuc报道基因的七种最佳突变体和WT rAAV3载体转导Huh7细胞。这些结果(示出在图37A中)表明，与WT rAAV3载体相比，Y705+731F和S663V+T492V+K533R突变体的转导效率提高了～10倍，而S663V+T492V突变体的转导效率提高了～15倍。为了进一步证实观察的这些突变体转导效率的提高，在相同条件下使用携带CBAp启动子驱动的EGFP报道基因的三种最佳突变rAAV3载体转导一种不同的人HCC细胞系HepG2。结果(示出在图37B中)证明，与WT rAAV3载体相比，S663V+T492V+K533R和Y705+731F突变体的转导效率分别提高～2和～3倍，而S663V+T492V突变体的转导效率提高～5倍。还在最近建立的人肝母细胞瘤(HB)细胞系Hep293TT(Cheng等，2012)中评估了最佳突变体(S633V+T492V)的转导效率(图37C)。因此，可以证明经优化rAAV3载体可用于人肝癌的潜在基因治疗。
rAAV3衣壳上特定氨基酸的修饰不改变病毒-细胞受体相互作用。由于负责病毒-受体相互作用的病毒衣壳氨基酸的不确定性，本发明人还检查了之前鉴定为WT rAAV3载体的受体(Rabinowitz等，2004)和共受体(Ling等，2010)的细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和人肝细胞生长因子受体(hHGFR)是否参与我们的经优化rAAV3载体的转导。进行了以下三组研究。首先，在低(100ng/mL)或高(100μg/mL)剂量可溶性肝素的存在下，用rAAV3-CBAp-EGFP载体或两种最佳突变载体对Huh7细胞进行转导。这些结果(示出在图37D中)表明，Y705+731F和S663V+T492V突变体二者以与WT rAAV3载体类似的方式执行，其中低剂量肝素增强病毒载体介导的转导效率，而高剂量大幅降低转导效率。第二，在5μg/mL人肝细胞生长因子(hHGF)的存在下进行转导测定，之前发现其显著抑制WT rAAV3载体的转导效率(Ling等，2010)。示出在图37E中的这些结果证明，WT和突变病毒载体二者的转导效率均显著受影响。以及第三，使用WT和两种突变rAAV3载体转导表达不可检测水平内源hHGFR的人乳腺癌细胞系T47D以及稳定转染有hHGFR表达质粒的T47D细胞(T47D+hHGFR)。示出在图37F中的这些数据表明，与亲本T47D细胞相比，WT和突变rAAV3载体二者均更有效(＞5倍)地转导T47D+hHGFR。总之，这些数据证实，经优化rAAV3载体也利用细胞HSPG和hHGFR作为用于其转导的受体/共受体。
rAAV3衣壳上特定氨基酸的修饰进一步增强全身性施用后病毒的体内转导效率。本发明人接下来评估了两种经优化rAAV3载体在鼠异种移植模型中的体内转导效率。为此，使用具有人Huh7或Hep293TT肿瘤的NSG小鼠(n＝4)，并且通过尾静脉递送相对低剂量(5×1010vgs/小鼠)的rAAV3-Y705+731F-CBAp-FLuc或rAAV3-S663V+T492V-CBAp-FLuc载体。在载体注射后3天进行全身生物发光成像。从图38A中示出的结果，清楚的是，Huh7和Hep293TT肿瘤二者均被经优化rAAV3载体有效靶向，并且与rAAV3-Y705+731F载体相比，这两种肿瘤类型中转基因表达均被rAAV3-S663V+T492V载体显著增强(图38B)，之前发现所述rAAV3-Y705+731F载体与WT rAAV3载体相比在体内显著更有效(Cheng等，2012)。载体注射后三天，处死小鼠并且收获肝脏和肿瘤组织。从肝脏和肿瘤组织二者分离总DNA样品，并进行qPCR分析以确定载体基因组拷贝数。从图38C和图38D中示出的数据，明显的是，肿瘤中存在的rAAV3-S663V+T492V突变体的载体基因组显著高于rAAV3-Y705+731F突变体的载体基因组(图38C)，推测是由于更有效的细胞内运输和核进入(Aslanidi等，2013)，这也与FLuc转基因表达很好地相关(图38A和图38B)。未观察到肝脏中存在的这两种载体的载体基因组的显著差异，这也与之前的报道类似(Zincarelli等，2008)。但是，值得注意的是，尽管与肿瘤相比，在肝脏中存在约5倍的载体基因组拷贝数，但是在两种经优化rAAV3载体的任一种中都检测到很少的转基因表达。
在全身性施用表达新治疗性基因的经优化rAAV3载体后，体内抑制人肝癌异种移植模型的肿瘤发生。迄今描述的所有研究是利用没有治疗价值的报道基因进行的。因此，虽然预期了许多良好建立的促凋亡和“***”基因的使用，但是努力集中在新鉴定的治疗性基因，其编码从传统中草药栝楼(Trichosanthes kirilowii)分离的核糖体失活蛋白天花粉蛋白(TCS)(Sha等，2013)。虽然TCS基因的核苷酸序列在20多年前就已经确定(Shaw等，1994)，但是从未探求将编码TCS的基因递送到细胞中。合成处于AFPp控制之下的TCS基因表达盒(详请在图40A中)，其细胞内表达在体外显著抑制人HCC细胞系的生长。
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然后，产生携带这种新治疗性基因的rAAV3-S663V+T492突变载体。此外，为了允许在早期时间点起始治疗，在肿瘤可触知之前，还产生了遗传修饰的人HCC细胞系Huh7-FLuc，其中CBAp启动子控制之下的FLuc基因被稳定转染，其还允许通过全身生物发光成像来监测肿瘤生长。在肩胛骨之间腹侧上向NSG小鼠(n＝10)皮下注射5×106Huh7-FLuc细胞。异种移植后四周，将小鼠分成两组，第一组通过尾静脉注射5×1010vgs的rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS载体(第0天)。第二组小鼠注射5×1010vgs的rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP载体以充当适当的对照。在载体施用后第0天、第3天、第8天和第11天进行小鼠的全身生物发光成像。示出在图39A中的这些结果证明，虽然用rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP载体注射的小鼠中Huh7-FLuc肿瘤逐渐生长，但是用rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS载体注射的小鼠中的肿瘤生长在第11天前被显著抑制(p＜0.05)，最大生长抑制在第8天(p＜0.01)。在载体施用后第8天进行的小鼠全身生物发光图像示出在图39B中。此外，在第11天，处死所有小鼠，并且确定天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的血清水平。未在TCS处理组和对照组之间观察到显著差异，表明小鼠中的肝损伤很少(图39C)。
讨论
如上所述，HCC在人的实体肿瘤中位列第五，导致全世界每年有～695,900例死亡。虽然具有早期诊断的HCC的患者可以从手术和/或化学治疗干预受益，但是疾病的复发频繁发生，并且治疗失败率高。对于诊断为具有晚期HCC的患者，选择很大程度上限于维持护理。尽管美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准了在具有晚期HCC的患者中使用索拉菲尼，但是中值存活率仅提高～3个月。因此，容易看出明显的是，迫切需要开发用于HCC的新治疗选择，而基因治疗与传统中医(TCM)的组合是有前景的选择。TCM药物作为医学治疗的一种主要补充和替代，已经成为中国用于HCC的常用治疗(Zhai等，2013)。最近，已报到从TCM草药中提取的生物活性单体化合物具有显著增强由rAAV载体介导的治疗效力的能力(Zhang等，2010；Mitchell等，2013；Wang等，2014；Ling等，2014)。本文已经开发组合基因治疗和TCM施用的新策略，其中将从草药中分离的治疗性***基因通过rAAV载体体内全身性递送到恶性细胞中。
过去已经对重组AAV载体介导的HCC基因治疗进行了尝试。例如，已经报道了使用常规单链(ss)rAAV2载体来体内靶向HCC(Su等，2000)，但是这些载体的转导效率低。在随后的研究中(Peng等，2000)，在全身性施用后未在大于2mm的肿瘤中观察到转导。在最近的研究中，在小鼠内源HCC肿瘤模型中使用rAAV8载体来介导特异性miRNA-26A和miRNA-122的递送，表明导致肿瘤生长抑制(Kota等，2009；Hsu等，2012)。但是，在鼠模型(Zincarelli等，2008；Gao等，2002；Wang等，2005)和非人灵长类动物(Nathwani等，2006；Nathwani等，2007)中，rAAV8载体对除肝脏外的正常组织具有宽的向性。本实施例证明，rAAV3载体对于体外人肝癌细胞的明显向性也可用于实现这些载体向异种移植小鼠模型中的人肝肿瘤的体内靶向递送。此外，rAAV3衣壳上特定氨基酸残基的位点定向诱变可进一步增强rAAV3载体的转导效率。另外，表达新治疗性基因的经优化rAAV3载体也可用于在鼠异种移植模型中抑制人肝肿瘤发生。需要强调的是，这些研究利用良好建立的肿瘤进行，并且故意使用低载体剂量以建立肿瘤靶向。因此，极有可能的是，在肿瘤良好建立之前使用高载体剂量和/或早期干预可能实现更理想的治疗终点。同样诱人的是推测，在利用原代人肝肿瘤异种移植(尤其是在肝微环境中)的另外研究成功完成以及大动物模型中的安全性和效力未决的情况下，可以证明rAAV3-S663V+T492V载体可用于人肝癌的潜在基因治疗。
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以为本文给出的那些提供示例程序或其他细节补充的程度，以下参考文献被明确地通过引用并入本文：
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应理解的是本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且在其基础上，多种修改或改变已向本领域技术人员暗示并且包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均明确地通过引用以其整体并入本文，程度如同每个参考文献均被单独地并且明确地指出通过引用并入并且其整体由本文给出。
除非本文另有说明，否则本文记载的值的范围仅旨在作为单独地引用落入范围内的每个独立值的速记方法，并且每个独立值均被并入说明书中，如同其在本文中单独记载。
本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明，或者与上下文明显矛盾。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不是限制本发明的范围，除非另有说明。说明书中没有语言应该被解释为指示任何要素均是实施本发明必要的，除非同样地明确说明。
本文在描述本发明的任何方面或实施方案时关于要素所使用的术语如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”旨在为由该特定要素“组成”、“基本上组成”或“基本上包含”该特定要素的本发明类似方面或实施方案提供支持，除非另有说明或者与上下文明显矛盾(例如，本文描述为包含特定要素的组合物应被理解为还描述了由该要素组成的组合物，除非另有说明或者与上下文明显矛盾)。
在本公开的基础上，本文公开和要求保护的所有组合物和方法无需多度实验就能够制备和实施。虽然根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以对本文所述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行变化而不脱离本发明的理念、精神和范围。更具体地，明显的是，可以利用某些化学上和/或生理学上相关的试剂替换本文描述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替换和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和理念内。
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Claims (33)

1.rAAV 3载体，其包含经修饰衣壳蛋白，所述经修饰衣壳蛋白包含：
(a)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的Y252、Y272、Y444、Y701、Y705和Y731的一个或更多个位置处的非酪氨酸残基；
(b)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的S459或S663的一个或更多个位置的每个位置处的非丝氨酸残基；
(c)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的T251或T492的一个或更多个位置的每个位置处的非苏氨酸残基；
(d)在对应于SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的K528、K533或K545的一个或更多个位置的每个位置处的非赖氨酸残基；
(e)在SEQ ID NO：3示出的野生型AAV3衣壳蛋白的(i)Y701或Y705位处的非酪氨酸残基；和(ii)Y705或Y731位处的非酪氨酸残基，或S663位处的非丝氨酸残基；
(f)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的三个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换；
(g)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的四个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换；或者
(h)(a)、(b)、(c)和(d)中所列的五个或更多个氨基酸替换的组合；其各自被非天然氨基酸替换；或者，其中每个氨基酸替换位于任意一种其他野生型载体血清型中对应的等同氨基酸位置处，所述其他野生型载体血清型选自：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10，其分别在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中示出。
2.根据权利要求1所述的rAAV 3载体，其中所述非丝氨酸残基选自：苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)和异亮氨酸(I)；或者所述非酪氨酸、非赖氨酸或非苏氨酸残基选自：丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)和异亮氨酸(I)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的rAAV 3载体，其中所述三个或更多个氨基酸替换的组合包括在一种或更多种以下氨基酸残基组合处的非天然氨基酸替换：在SEQ ID NO：3中示出的野生型AAV3衣壳蛋白的以下位置：
(a)Y701F、Y705F和Y731F；
(b)Y705F、Y731F和S663V；
(c)Y705F、Y731F和T492V；
(d)Y705F、Y731F、K533R；
(e)S663V、T492V和K533R；
(f)Y705F、Y731F、S663V和T492V；或
(g)Y705F、Y731F、S663V、T492V和K533R，
或者在分别于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中示出的任一种对应野生型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10衣壳蛋白的任一种的等同表面暴露氨基酸残基处，或者其任意组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中包含所述载体的病毒体在选定的哺乳动物宿主细胞中的转导效率是包含对应未经修饰rAAV3载体之病毒体的转导效率的约2倍至约50倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中包含所述载体的病毒体在选定的哺乳动物宿主细胞中的转导效率是包含对应未经修饰rAAV3载体之病毒体转导效率的约6倍至约40倍。
6.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中包含所述载体的病毒体在选定的哺乳动物宿主细胞中的转导效率是包含对应未经修饰rAAV3载体之病毒体的转导效率的约8倍至约30倍。
7.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中与包含对应未经修饰rAAV3载体的病毒体相比，包含所述载体的病毒体在引入到哺乳动物细胞中时对泛素化更不易感。
8.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中所述载体还包含编码诊断剂、治疗剂或化学治疗剂的核酸区段，所述核酸区段与能够在包含所述载体的合适宿主细胞中表达所述核酸区段的启动子有效连接。
9.根据权利要求8所述的rAAV 3载体，其中所述核酸区段还包含与所述核酸区段有效连接的增强子、转录后调控序列、多腺苷酸化信号或其任意组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其还包含与所述核酸区段有效连接的至少第一哺乳动物内含子序列。
11.根据权利要求8所述的rAAV 3载体，其中所述启动子是异源启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子或其任意组合。
12.根据权利要求10所述的rAAV 3载体，其中所述启动子是肝特异性启动子、肿瘤细胞特异性启动子或其组合。
13.根据权利要求8所述的rAAV 3载体，其中所述核酸区段表达或编码多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任意组合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其中所述至少第一核酸区段编码化学治疗剂。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的rAAV 3载体，其中所述诊断剂、治疗剂或化学治疗剂是激动剂、拮抗剂、抗凋亡因子、抑制剂、受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、神经生长因子、神经活性肽、神经活性肽受体、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、酶、受体结合蛋白、转运蛋白或其抑制剂、血清素受体或其摄取抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂受体、肿瘤抑制剂、细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗炎剂或者其任意组合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体，其包含在腺相关病毒颗粒或感染性rAAV3病毒体内。
17.分离的核酸区段，其编码根据前述权利要求中任一项所述的rAAV 3载体。
18.病毒体或病毒颗粒，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体。
19.多个感染性病毒颗粒，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体。
20.分离的哺乳动物宿主细胞，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体。
21.根据权利要求20所述的分离的哺乳动物宿主细胞，其中所述宿主细胞是干细胞、造血细胞、血细胞、神经细胞、视网膜细胞、上皮细胞、内皮细胞、胰细胞、癌细胞、肌细胞、血管细胞、膈细胞、胃细胞、肝细胞、肿瘤细胞或CD34+细胞。
22.组合物，其包含：
(I)(a)根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体；
(b)编码(a)之载体的核酸区段；或者
(c)包含(b)之核酸区段的多个病毒体或感染性病毒颗粒；以及
(II)可药用缓冲剂、稀释剂或赋形剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其包含在药盒内，所述药盒用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾病、损伤、紊乱、创伤或功能障碍的一种或更多种症状，所述疾病、损伤、紊乱、创伤或功能障碍包括但不限于肝癌，例如HCC。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的组合物，其还包含脂质、脂质体、脂质复合物、醇质体、泡囊、纳米颗粒、微颗粒、脂质球、纳米胶囊或其任意组合。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防人癌症。
27.药盒，其包含：
(1)选自以下的组分：
(a)根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV载体；或者
(b)根据权利要求18或权利要求19所述的病毒体或多个感染性病毒颗粒；以及
(2)在诊断、预防、治疗或改善人肝癌的一种或更多种症状中使用所述组分的说明。
28.根据权利要求22所述的组合物在制备用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物癌症的一种或更多种症状之药物中的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其制备用于治疗或改善人肝癌的一种或更多种症状的药物。
30.用于向有此需要的哺乳动物提供诊断或治疗有效量的选定生物分子的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物的细胞、组织或器官提供根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体，其量和持续时间有效地向所述哺乳动物提供诊断或治疗有效量的所述选定生物分子。
31.用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物中的肝癌包括HCC的至少一种或更多种症状的方法，所述方法包括以足以诊断、预防、治疗或改善所述哺乳动物中肝癌的一种或更多种症状的量和时间，向有此需要的哺乳动物施用根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV 3载体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
33.在经诊断具有、患有或怀疑患有HCC的人中转导肝细胞群或肝肿瘤细胞群的方法，所述方法包括以有效转导所述肝细胞群或肝肿瘤细胞群的持续时间向所述人施用包含有效量的根据权利要求1至16中任一项所述之rAAV 3载体的组合物。
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