KR102289921B1 - 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀 제조 방법 및 이를 이용한 리포좀 - Google Patents

약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀 제조 방법 및 이를 이용한 리포좀 Download PDF

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Abstract

약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀의 제조 방법에 있어서, (a) 내부에 불활성 가스를 포함하며 외면에 제1쉘이 형성된 초음파 반응형 미소기포를 생성한 이후 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계; 및 (b) 내부에 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 초음파 반응형 미소기포와 약물을 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀을 생성한 이후 압출기를 통해 상기 리포좀의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계;를 포함하는 방법 및 이를 이용한 리포좀을 제공한다.

Description

약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀 제조 방법 및 이를 이용한 리포좀{METHOD FOR PREPARING LIPOSOME SYNTHESIS CONTAINING ULTRASOUND RESPONSIVE MICROBUBBLE FOR DRUG DELIVERY AND LIPOSOME USING THE SAME}
본 발명은 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포와 약물을 포함하는 리포좀의 제조 방법 및 이를 이용한 리포좀에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀의 제조 방법에 있어서, (a) 내부에 불활성 가스를 포함하며 외면에 제1쉘이 형성된 초음파 반응형 미소기포를 생성한 이후 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계; 및 (b) 내부에 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 초음파 반응형 미소기포와 약물을 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀을 생성한 이후 압출기를 통해 상기 리포좀의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계;를 포함하는 방법 및 이를 이용한 리포좀에 관한 것이다.
약물전달시스템(DDS: Drug Delivery System)은 기존의 약물을 부작용을 최소화하고 약물이 가지고 있는 효능 및 효과를 최적화하여 질병치료를 위하여 필요한 양을 약물을 효율적으로 전달하기 위한 제형(dosage formulation)이라 할 수 있다.
이러한 약물전달시스템은 약물전달경로에 따라서 경피, 경구 또는 혈관을 통한 방법 등이 있다. 또한 마이크로 크기의 캡슐을 혈관에 도입하여 환부를 치료하는 약물전달시스템이 앞으로 꿈의 치료기술로써 각광을 받고 있다.
그리고 약물전달시스템의 기술 중에서 요소기술은 약물을 목적하는 환부에 정확히 타겟팅하는 기술과 환부에서의 약물방출을 제어하는 기술이라고 할 수 있다. 따라서 초음파와 초음파 반응형 미소기포에 의한 표적약물전달 시스템은 이러한 문제점들을 해결할 수 있는 기술로써, 최근에 더욱 관심을 모으고 있다.
특히, 초음파 조영제로 사용되는 미소기포는 초음파 에너지에 의해 공동화 현상(cavitation)이 발생하고 이 현상은 피부나 세포 내부로의 약물전달 효과를 증가시킨다는 연구 결과에 따라 미소기포의 막에 원하는 약물이나 수용체(receptor)를 리간드 결합(ligand binding)하여 약물을 인체에 전달하고자 하였다.
그러나, 이러한 방법은 막 표면에 약물을 결합시키므로, 미소기포가 타겟 위치까지 이동하는 중에 약물의 유실이 발생할 수 있어 약물 전달체의 역할을 완벽하게 수행할 수 없다는 한계가 있다. 또한, 많은 양의 약물을 탑재할 수 없다는 점에서 한계가 있다.
이를 개선하기 위하여, 최근에는 초음파 에너지와 반응성을 높이기 위한 미소기포와 약물을 동시에 탑재한 리포좀 제조 기술이 대두되고 있다.
하지만, 불활성 가스를 함유한 미소기포와 약물을 리포좀 막(shell) 사이 공간에 동시에 탑재하는 방식의 제조법은 다층 구조를 형성하기 어려우며 또한 효과적으로 약물을 탑재하지 못한다는 단점이 있다.
즉, 리포좀의 내부에 포집되는 미소기포의 크기 및 약물의 특성에 따라 탑재되는 약물의 양이 서로 다르게 되며, 심한 경우 리포좀에 약물이 탑재되지 못하거나 미소기포가 탑재되지 못하는 경우가 발생한다.
본 발명은 상술한 문제점들을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 약물을 리포좀 내부로 캡슐화하여 외부 환경으로부터 약물을 보호할 수 있도록 하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 정상 조직에서의 약효 발생을 차단하며 초음파 에너지에 높은 반응성을 나타내어 초음파 에너지가 조사되고 있는 표적 영역에서만 상호 반응하여 약물을 전달할 수 있도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 미소기포 및 리포좀의 크기를 일정하게 형성함으로써 리포좀 내부에 탑재되는 약물의 양을 정량화할 수 있도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 유의한 약물 효과를 나타내기 위한 일정량 이상의 약물을 탑재할 수 있도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀의 제조 방법에 있어서, (a) 내부에 불활성 가스를 포함하며 외면에 제1쉘이 형성된 초음파 반응형 미소기포를 생성한 이후 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계; 및 (b) 내부에 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 초음파 반응형 미소기포와 약물을 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀을 생성한 이후 압출기를 통해 상기 리포좀의 크기 분포를 균일하게 형성하는 단계;를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀의 제조 방법에 있어서, 내부에 불활성 가스를 포함하며 외면에 제1쉘이 형성된 초음파 반응형 미소기포가 생성된 이후 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 초음파 반응형 미소기포; 및 내부에 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 초음파 반응형 미소기포와 약물을 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀이 생성된 이후 압출기를 통해 상기 리포좀의 크기 분포가 균일하게 형성된 상기 리포좀;을 포함하는 약물 전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀을 제공한다.
본 발명에 의하면, 다음과 같은 효과가 있다.
본 발명은 약물을 리포좀 내부로 캡슐화 하여 외부 환경으로부터 약물을 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 정상 조직에서의 약효 발생을 차단하며 초음파 에너지에 높은 반응성을 나타내어 초음파 에너지가 조사되고 있는 표적 영역에서만 상호 반응하여 약물을 전달할 수 있다.
또한, 본 발명은 미소기포 및 리포좀의 크기를 일정하게 형성함으로써 리포좀 내부에 탑재되는 약물의 양을 정량화할 수 있다.
또한, 본 발명은 유의한 약물 효과를 나타내기 위한 일정량 이상의 약물을 탑재할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포와 약물을 함유한 리포좀을 개략적으로 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미소기포의 사이즈를 조절하는 상태를 개략적으로 도시한 것이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미소기포의 공초점 현미경 영상을 개략적으로 도시한 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미소기포의 입도를 강도(intensity), 용적(volume), 개수(number) 분포로 분석한 결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀의 사이즈를 조절하는 상태를 개략적으로 도시한 것이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀에 대한 공초점 현미경 분석 이미지를 도시한 것이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀과 종래 방법에 의해 제작된 리포좀에 대한 공초점 현미경 분석 이미지를 각각 비교하여 도시한 것이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀을 이용하여 골드 나노 파티클 포집 실험을 수행한 상태를 개략적으로 도시한 것이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포(11)를 포함하는 리포좀을 개략적으로 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 리포좀은 내부에 미소기포(11)가 형성되며 외면에 제2쉘(22)이 형성될 수 있다. 그리고, 미소기포(11)와 제2쉘(22)의 사이 영역(21)에는 약물이 탑재될 수 있다. 또한, 미소기포(11)의 외면에는 제1쉘(12)이 형성될 수 있다.
이와 같은 구조의 리포좀은 본 발명의 일 실시예에 의해 크기 분포가 균일하게 형성된 미소기포(11)를 먼저 생성한 다음, 내부에 미소기포와 약물을 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀을 생성하고, 압출기를 통해 리포좀의 크기 분포를 균일하게 형성하는 과정을 거쳐 만들어지게 된다.
아래에서는 초음파 반응형 미소기포(11)를 생성하는 과정에 대해서 구체적으로 설명한다.
먼저, 미소기포(11)를 제조하기 위한 제1쉘 물질의 솔루션을 준비한다.
이를 위해 제1 리피드를 포함하는 제1 혼합물 파우더를 제1 용매에 용해하여 제1쉘 물질의 솔루션을 생성할 수 있다. 여기서, 제1 리피드가 포함된 제1 혼합물 파우더에는 알부민, 폴리머, PEG, 계면활성제, 단백질, 생분해성 고분자 등이 더 포함될 수 있으며, 초음파 반응형 미소기포의 내구성을 높여주기 위해 콜레스테롤(cholesterol)이 첨가될 수 있다.
또한, 제1 리피드는 DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), HSPC(phosphatidylcholine), DDPC(1,2-didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Di(cis-13-docosenoyl)-sn-glycerol-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DEPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MPPC(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MSPC(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), egg PC(phosphocholine), DPPA(Diphenylphosphoryl azide), DMPA-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DPPA-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DOPA-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DSPE(Distearoylphosphatidylethanolamine), DMPE(Dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(Dioleoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), DOPE-Glutaryl-(Na)2(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), egg PE(phosphatidylethanolamine), DSPG(Distearoyl phosphatidylglycerol), DMPG-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DPPG-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPG-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPS(ioleoyl phosphatidylserine), DMPS(Dimyristoyl phosphatidylserine), DMPS- Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DPPS-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DOPS-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DSPS(Distearoylphosphatidylserine), DSPE-mPEG(1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]), DSPE-mPEG-2000-Na(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE-Maleimide PEG-2000-Na, Surfactant: Tween 80, Span 80, dipotassium glycyrrhizinate 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 알부민은 세럼 알부민 (serum albumin), 오발부민 (ovalbumin) 등을 포함할 수 있다.
또한, 폴리머는 Poly(β-benzyl-L-asparate), PBLA(poly-DL-lactic acid) 등을 포함할 수 있다.
또한, 계면활성제는 지방산 나트륨, 모노알킬 황산염, 알킬폴리옥시에틸렌 황산염, 알킬벤젠술폰산염, 모노알킬인산염, 디알킬디메틸암모늄염, 알킬벤질메틸암모늄염, 알킬설포베타인, 알킬카르복시베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 지방산 솔비탄에스테르, 지방산 디에탄올아민, 알킬모노글리세릴에테르, 벤잘코늄 염화물 (benzalkonium chloride), 벤제토늄 염화물 (benzethonium chloride) 등을 포함할 수 있다.
또한, 단백질은 알부민, 글로불린, 콜라겐 등을 포함할 수 있다.
또한, 생분해성 고분자는 PHB계 플라스틱, 다당류계 플라스틱,　폴리카프로락톤(PCL),　폴리유산(PLA),　폴리필렌 글리콜산(PG), 폴리리드록시부티레이트-코-발레레이트(PHBV), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS), Chitin계 플라스틱, Oil계 플라스틱 등을 포함할 수 있다.
또한, 제1 용매에는 Saline 및/또는 3차 증류수, glycerin 및 propylene glycol 중 적어도 하나 이상이 포함될 수 있다.
일 예로, 파우더 상태의 쉘을 구성하는 리피드(lipid), 알부민(albumin), 폴리머(polymer), 콜레스테롤(cholesterol) 및 PEG(polyethylene glycol) 등의 물질을 Saline 및/또는 3차 증류수(40~60%), glycerin(2~10%), propylene glycol(40~60%) 중 하나 이상을 포함하는 용매와 혼합한 뒤 60°C~100°C 사이의 온도에서 1~6시간 동안 녹여줌으로써 제1쉘 물질의 솔루션을 생성할 수 있다 .
일 예로, 약물 전달을 위한 초음파에 특화된 미셀(micelle)은 불활성 가스를 포집하고 기포의 안정성을 높이기 위해 쉘 물질로 DPPC (Dipalmitoyl -Phos Phatidyl - Choline) 및 DPPA(Diphenyl-phosphoryl-Azide)를 주요 구성물로 하고 Normal saline, Glycerol, Propylene glycol이 함께 첨가될 수 있다.
그리고, 주요 구성물인 DPPC와 DPPA가 쉘을 구성할 때 미셀의 내구성을 높여주기 위해 콜레스테롤(cholesterol)이 첨가될 수 있다.
다음으로, 초음파 에너지에 반응성을 높이기 위해 제1쉘 물질의 솔루션과 불활성 가스를 혼합할 수 있다.
이때, 불활성 가스는 퍼플루오로카본 계열의 가스일 수 있으며, 퍼플루오로카본 계열의 불활성 가스로서 Perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoro-n-pentane, perfluoro-n-hexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluoro-1,3-dimethylcyclohexane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin, perfluoroperhydrobenzyltetralin 등을 사용할 수 있다.
일 예로, 제1쉘 물질의 솔루션과 불활성 가스의 혼합비율(v/v)을 1:1 내지 20:1의 비율로 바이얼에 분주하여 밀봉 후, 바이얼믹서를 통해 쉘 물질과 불활성 가스를 기계적 믹싱할 수 있다.
이때, 기계적 믹싱 속도는 1000 ~ 5000 rpm으로 조절하여 초음파 반응형 미소기포(11)의 크기 및 입도 분포를 적절하게 조절할 수 있다.
그러면, 기계적 믹싱을 통해 퍼플루오로카본 계열의 불활성 가스가 nano 내지 micro 사이즈의 oil/water 에멀젼 형태로 잘게 부수어지며, 불활성 가스는 자기 정합(self-assembling)에 의해 자연스럽게 양친매성 인지질의 소수성 꼬리 부분과 결합되어 안정된 상태를 유지할 수 있게 되어 도 1에서와 같이 내부에 코어로서의 불활성 가스를 가지는 미소기포(11)를 형성하게 된다. 구체적으로는, 인지질 중 꼬리 부분에 해당하는 지방산 사슬은 소수성이고, 헤더 부분인 인산과 염기 부분은 친수성인 양친매성 특성을 가진다. 이런 친수성 특성과 소수성 특성을 동시에 지니는 양친매성(amphipathic) 인지질은 쉘을 구성하는데 있어 중요한 역할을 한다. 그리고, 미소기포(11)는 초음파 반응성 기포일 수 있다.
다음으로, 도 2에서와 같이, 다양한 크기로 제작된 초음파 반응형 미소기포(11)를 일정한 공극 사이즈, 일 예로 30nm 내지 1um 중 어느 하나의 공극 사이즈를 갖는 필터와 압출기를 사용하여 필터링함으로써 초음파 반응형 미소기포(11)의 크기 분포를 균일하게 할 수 있다. 이때, 필터는 멤브레인 필터일 수 있으며, 멤브레인 필터는 폴리 카보나이트로 형성될 수 있다.
또한, 초음파 반응형 미소기포(11)의 필터링을 위한 온도는 상온에서 각 물질의 상전이 온도 범위까지 다양하게 조절할 수 있으며, 필터링의 횟수는 최소 5회에서 그 이상으로 수행할 수 있다.
이후, 필터링에 의해 크기 분포가 균일하게 형성된 초음파 반응형 미소기포(11)를 포함하는 혼합물을 원심분리기를 통해 원심분리로 잘 구성된 미셀을 가라앉힌 다음 상층에 존재하는 상층액을 제거하고 DW(deionized water)를 이용하여 워싱함으로써 원하는 크기로 조정된 초음파 반응형 미소기포(11)를 획득할 수 있다.
실시예1. 초음파 반응형 미소기포 제작
1. 리피드 쉘 물질 준비
Normal saline + Glycerol + Propylene glycol이 혼합된 용매에 DPPC + DPPA 파우더를 넣고 핫 플레이트(hot plate)를 이용하여 용액이 끓어서 넘치지 않도록 주의하여 3시간 동안 가열한다. 이때, Lipid를 용해할 용매는 Saline, glycerol, propylene glycol을 20:1:21의 비율로 혼합하여 total 100ml의 혼합물에 DPPC(0.1g), DPPA(0.01g)의 비율로 Lipid 파우더를 넣어준다. 이때, DSPE-mPEG(0.127g)를 더 혼합할 수 있다. 그리고, 가열은 microwave를 이용할 수도 있다.
2. 콜레스테롤 쉘 물질 준비
Normal saline + Propylene glycol (+ Glycerol, 생략가능)을 유리 비커에 넣고 전체 100ml의 혼합물에 콜레스테롤(0.127g)을 넣은 뒤 핫 플레이트를 이용하여 용액의 온도를 80°C로 유지하며 3시간 동안 가열한다.
3. 초음파 반응형 미소기포 제작
준비된 DPPC+DPPA 혼합액(1.5ml)과 Cholesterol 혼합액(0.5ml)을 더해준 뒤, perfluorobutane(0.1ml)을 쉘 물질의 솔루션과 코어 가스의 혼합비율(v/v)을 20:1 비율로 혼합하여 2ml 바이얼에 분주하여 밀봉 후 45초 동안 기계적 믹싱한다. 이때, 믹싱은 1분에 4530±100번 진동이 이루어지도록 주파수를 설정한다.
즉, 실시예1에서는 초음파 반응형 미소기포(11) 제조의 일례로 DPPC(0.1g) + DPPA(0.01g) + Cholesterol(0.127g)를 각각 용매에 녹여 혼합하였으며, 주입된 가스의 양은 perfluorobutane의 경우 액화상태(-80℃~-20℃)에서 10~100ul (질량으로 환산 시 17.5~175 mg) 이다.
4. 초음파 반응형 미소기포의 사이즈 조절 및 분리
다양한 크기로 제작된 초음파 반응형 미소기포(11)를 폴리카보나이트 멤브레인 필터와 압출기를 사용하여 필터링하고, 원심분리기를 통해 원심분리로 잘 구성된 미셀을 가라앉힌 다음 상층에 존재하는 상층액을 제거하고 DW(deionized water)로 워싱하여 초음파 반응형 미소기포(11)를 완성한다.
5. 공초점 현미경 분석
상기 실시예1에서와 같은 방법에 의해 NBD PC로 제작된 미셀을 이용하여 미셀의 형성 여부와 형태 분석 및 형광 지질의 위치와 물리적 기포의 상관관계를 확인하기 위하여 도 3에서와 같은 공초점 현미경 영상을 획득하였다.
도 3에서 (a)는 형광 현미경 이미지이며, (b)는 광학 현미경 이미지이며, (c)는 형광 현미경 이미지와 광학 현미경 이미지를 합한(merging) 이미지이다.
도 3의 (a)와 (b)를 통해 알 수 있는 바와 같이, 형광 신호를 띄는 지질이 쉘 형태로 미셀 테두리를 형성하고 있는 것을 확인할 수 있으며, 가운데 코어 부분은 지질이 아닌 빈 공간 혹은 가스로 이루어져 있는 것을 확인할 수 있다.
그리고, 도 3의 (c)를 통해 알 수 있는 바와 같이, 일반 공기방울과 미셀의 구분은 형광지질로 이루어져 있지 않은 기포와 형광 지질로 구성된 기포로 구분할 수 있으며, 대부분의 경우 형광 지질로 쉘이 구성되어 있음을 알 수 있다.
6. 입도분석
입도분석의 원리는 레이저가 샘플을 통과할 때 발생하는 회절, 산란광을 이용하여 입자의 크기를 측정하는 것으로, 미셀의 입도분석에 사용된 장비 스펙은 다음과 같다.
가. 모델명: ELS-2000ZS
나. 입도분석: DLS (Dynamic Light Scattering)
다. 제타전위: ELS (Electrophoretic Light Scattering)
라. 모든 용매에 분산된　Particle의 입도분포 및　Zeta Potential　측정
마. Flat Sample의 표면　Zeta Potential　측정 가능
바. 온도　Control &　경시변화 측정 가능
사. 미량　Sample　측정 가능
아. Size: 0.1nm~10000nm / Zeta Potential:　1nm~50000nm　대응 가능
자. 시료 농도: 0.001~40% 대응 가능
도 4의 (a)는 미셀에 대한 입도분석 결과를 Intensity distribution, Volume distribution, Number distribution으로 나타낸 것이다.
그 결과 Intensity distribution: 308 nm, Volume distribution: 184 nm, Number Distribution: 139nm로 최종 결과치가 나타난다.
그리고, 도 4의 (b)는 실시예1에 따라 제작된 미셀의 직경과 분산도 및 확산 상수, 측정환경 등에 대한 경과를 나타낸 것이다. 이때, 기포의 크기 분포 측정 환경은 25℃의 물에서 측정을 하였으며 점도 0.8878(cP), 분산 강도 25762(cps), 감쇠기 0.72(%)로 설정하였다.
측정 결과, 실시예1에 의해 제작된 미셀의 평균 직경은 257.1 nm이며, 확산상수는 1.913 e-8(cm2/sec)로 나타났다.
다음으로는, 상기에서와 같은 방법에 의해 만들어진 크기 분포가 균일하게 형성된 초음파 반응형 미소기포(11)를 이용하여 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 포함하는 리포좀을 제조하는 방법을 설명하면 다음과 같다.
먼저, 리포좀을 제조하기 위한 제2쉘 물질의 솔루션을 준비한다.
이를 위해 제2 리피드를 포함하는 제2 혼합물 파우더를 유기 용매에 용해한 후 유기 용매를 제거하여 리피드 필름을 획득하는 과정을 수행할 수 있다. 여기서 제2 리피드가 포함된 제2 혼합물 파우더에는 알부민(albumin), 폴리머(polymer) 및 PEG(polyethylene glycol) 중 적어도 하나 이상이 더 포함될 수 있으며, 리포좀의 내구성을 높여주기 위해 콜레스테롤이 첨가될 수 있다.
또한, 제2 리피드는 DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), HSPC(phosphatidylcholine), DDPC(1,2-didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Di(cis-13-docosenoyl)-sn-glycerol-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DEPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MPPC(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MSPC(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), egg PC(phosphocholine), DPPA(Diphenylphosphoryl azide), DMPA-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DPPA-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DOPA-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DSPE(Distearoylphosphatidylethanolamine), DMPE(Dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(Dioleoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), DOPE-Glutaryl-(Na)2(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), egg PE(phosphatidylethanolamine), DSPG(Distearoyl phosphatidylglycerol), DMPG-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DPPG-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPG-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPS(ioleoyl phosphatidylserine), DMPS(Dimyristoyl phosphatidylserine), DMPS- Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DPPS-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DOPS-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DSPS(Distearoylphosphatidylserine), DSPE-mPEG(1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]), DSPE-mPEG-2000-Na(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE-Maleimide PEG-2000-Na, Surfactant: Tween 80, Span 80, dipotassium glycyrrhizinate 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 예로, 약물이나 유전자를 포집하기 위한 미셀은 약물이나 유전자를 채집하고 미셀의 안정성을 높이기 위해 쉘 물질로 DPPC (Dipalmitoyl -Phos Phatidyl - Choline), DPPA(Diphenyl-phosphoryl-Azide)를 주요 구성물로 할 수 있다. 이때, DPPC, DPPA, 및 콜레스테롤은 60%~85%:2%~10%:10%~30%의 비율로 혼합될 수 있다. 그리고, 쉘 물질로 DSPE-mPEG가 추가될 수 있다.
특히, DPPA, DMPA-Na, DPPA-Na, DSPG, DSPS 등은 음전하 또는 양전하를 가지는 인지질로 리포좀이 전하를 띄게 하기 위하여 사용되어질 수 있다.
또한, 알부민은 세럼 알부민 (serum albumin), 오발부민 (ovalbumin) 등을 포함할 수 있다.
또한, 폴리머는 Poly(β-benzyl-L-asparate), PBLA(poly-DL-lactic acid) 등을 포함할 수 있다.
여기서, 유기용매는 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매를 포함할 수 있으며, 클로로포름과 메탈올은 1:1 내지 3:1의 혼합비로 혼합될 수 있다.
또한, 제2 혼합물 파우더를 유기 용매에 녹이기 위하여 자석 교반기(magnetic stirrer)를 사용하여 교반할 수 있으며, 교반기의 온도는 약 40°C~60°C로 하여 10분 내지 30분간 교반을 진행할 수 있다.
또한, 회전 증발 방식에 의해 쉘 물질이 녹아있는 유기 용매를 제거할 수 있다.
일 예로, 회전증발기(rotary evaporator)를 이용하여 20°C 내지 40°C의 온도에서 10분 내지 30분간 유기 용매를 증발시키며, 잔류된 유기 용매를 완전히 제거하기 위하여 진공 챔버에 넣은 후 감압 건조하여 준다. 이때 진공 챔버에서의 감압 건조는 적어도 6시간 이상 진행하는 것이 바람직하며, 보다 상세하게는 24시간 진행하는 것이 바람직하다.
그러면, 유기 용매의 클로로포름과 메탄올 등이 증발된 뒤 플라스크 바닥에는 리피드 필름이 다층으로 형성될 수 있으며, 플라스크 바닥에는 뿌옇게 리피드 물질이 회전이 적용된 형태로 필름 케이크(film cake)를 형성하게 된다.
다음으로, 리피드 필름에 적절한 용량의 제2 용매, 일 예로, PBS(Phosphate-buffered saline)를 넣어 수화함으로써 제2쉘 물질의 솔루션을 생성한 다음, 초음파발생장치를 이용하여 분쇄하여 준다. 이때, 약물의 조건 및 미셀의 특성에 따라 크기 분포가 균일하게 형성된 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물 및/또는 유전자를 함께 넣고 초음파 분해를 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 리피드 필름을 분쇄한 이후에 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물 및/또는 유전자를 넣을 수 있다.
그러면, 초음파발생장치에 의해 분쇄된 리피드 필름과 크기 분포가 균일하게 형성된 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물 및/또는 유전자는 자기정합(self-assembling) 기전에 의해 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물 및/또는 유전자를 포함하는 리포좀의 형태로 제작된다.
다음으로, 도 5에서와 같이, 다양한 크기로 제작된 리포좀을 필터와 압출기를 사용하여 필터링하여 사이즈를 조절한다. 즉, 필터의 공극보다 큰 직경을 가지는 리포좀은 공극을 통과하지 못하고 파괴되며, 파괴된 리포좀 내부에 위치하는 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물, 리피드 필름은 재결합하게 된다.
이후, 필터링에 의해 크기 분포가 균일하게 형성된 리포좀을 포함하는 혼합물을 원심분리기를 통해 원심분리로 잘 구성된 미셀을 가라앉힌 다음 상층에 존재하는 상층액을 제거하고 DW(deionized water)를 이용하여 워싱함으로써 원하는 크기로 조정된 리포좀을 획득할 수 있다.
실시예2. 리포좀 제작
1. 쉘 물질 준비
DPPC + DPPA + Cholesterol을 각각 75:5:20 비율로 혼합하여 리피드 물질을 생성하고, 생성된 리피드 물질을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)의 유기 용매에 녹인다.
그리고, 회전교반기를 이용하여 30℃에서 20분간 유기 용매를 증발시킨다.
이후, 진공 챔버에 넣은 뒤 감압하여 24시간 감압 건조하여 리피드 필름을 제작한다.
2. 리포좀 제작
리피드 필름에 2ml의 PBS를 넣어 수화한 다음, 상온에서 1분 동안 100W의 에너지로 초음파 분해를 진행한다. 이때, 실시예1에서 제작된 사이즈가 조절된 미소기포(11)와 약물 및/또는 유전자를 함께 넣고 초음파 분해를 진행하여 다양한 크기를 가지는 리포좀을 제작할 수 있다.
3. 리포좀의 사이즈 조절 및 재결합
다양한 크기로 제작된 초음파 반응형 미소기포(11)를 폴리카보나이트 멤브레인 필터와 압출기를 사용하여 필터링하고, 원심분리기를 통해 잘 구성된 리포좀을 가라앉힌 다음 상층에 존재하는 상층액을 제거하고 DW(deionized water)로 워싱하여 약물전달을 위한 리포좀을 완성한다
4. 공초점 현미경 분석
상기 실시예2에서와 같은 방법에 의해 약물을 포집하는 리포좀을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 내부에 가스 공간이 존재하는 미소기포(11)의 포집 및 미셀 외부에 친수성 형광 물질(MW: 4k의 Dextran)이 포집된 리포좀이 확인됨을 알 수 있다.
또한, 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 초음파 반응형 미소기포(11)와 리포좀의 사이즈를 조절하지 않은 상태인 (a)에 비하여, 본 발명에서의 실시예에 따라 제작된 상태인 (b)에서 각각의 리포좀들이 효율적으로 약물을 포집하고 있음을 확인할 수 있다.
5. 골드 나노 파티클 포집 실험
TEM 영상을 이용하여 초음파 반응형 미소기포(11)와 친수성 약물을 함유한 리포좀을 분석하기 위한 것으로, 도 8의 (a)와 같이 골드 나노 파티클이 위치하는 영역에 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 함유한 리포좀을 위치시켰다.
그리고, TEM 영상을 통해 상태를 확인한 결과, 도 8의 (b)에서와 같이 골드 나노 파티클이 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 함유한 리포좀에 포획되는 것을 알 수 있으며, 이를 통해 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 함유한 리포좀에 유의한 약물 효과를 나타내기 위한 일정량 이상의 약물이 탑재 되었음을 확인할 수 있다.
상기에서 제작된 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 함유한 리포좀은 특정 영역에서 초음파 에너지를 받게 되면 캐비테이션 효과를 발생시켜 리포좀에 함유된 약물이 해당 위치에서 방출될 수 있도록 할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포(11)와 약물을 함유한 리포좀은 표적 전달 효율을 높이기 위해 암세포와 같은 특정 세포 표면에서 발현하는 단백질 등의 표적 분자에 반응하도록 만들어진 항체나 펩타이드와 같은 타게팅 리간드(targeting ligand)를 리포좀 표면에 결합할 수도 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀은 포집된 약물을 이용하는 집속형 초음파에 의한 수동형 표적 지향과 특정 리간드에 의한 능동적 표적 지향의 표적 효과를 동시에 가져올 수 있다.
이때, 표적하는 병원체에 대한 리간드 라이브러리 스크리닝을 통해 항체, 단백질, 펩타이드, 수용체 등의 표적 대상을 확인하고, 확인된 표적 대상을 리포좀 표면에 결합한다. 그러면, 리포좀 표면에 결합된 표적 대상이 병원체에 유도될 수 있게 된다.
또한, 리포좀 표면에 표적 대상을 결합하는 방법은, 예를 들어, 상기 실시예1 및 실시예2에 의해 PEG-COOH가 결합되어있는 리포좀을 만든다(DNase, RNase free water).
그리고, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), N-hydroxysuccinimide를 첨가하여 15분간 실온에 교반시켜 카르복실기(COOH)가 활성화되도록 해준다.
다음으로 N-hydroxysuccinimide가 활성화된 리포좀에 아미노기(NH2)가 결합되어있는 표적 대상을 넣어 카르복실과 아민이 반응하여 아마이드가 형성되어 결합되도록 해준다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (25)

  1. 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀의 제조 방법에 있어서,
    (a) 내부에 불활성 가스를 포함하며 외면에 제1쉘이 형성된 초음파 반응형 미소기포를 생성한 이후 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포가 제1 균일 크기 분포가 되도록 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기를 조절하는 단계; 및
    (b) 상기 제1 균일 크기 분포를 가지는 상기 초음파 반응형 미소기포와 약물을 내부에 포함하며 외면에 제2쉘이 형성된 리포좀을 생성한 이후 상기 압출기를 통해 상기 리포좀의 크기 분포가 제2 균일 크기 분포가 되도록 상기 리포좀의 크기를 조절하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 상기 약물을 전달하고자 하는 병원체에 반응하는 타게팅 리간드(targeting ligand)를 상기 제2쉘에 결합하는 단계;
    를 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (c) 단계는,
    상기 병원체에 대한 리간드 라이브러리 스크리닝을 통해 상기 병원체에 반응하는 항체, 단백질, 펩타이드 및 수용체 중 적어도 하나를 상기 타게팅 리간드로서 확인하고, 확인된 상기 타게팅 리간드를 상기 제2쉘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2쉘에 카르복실기(COOH)를 도입시킨 후, 상기 카르복실기를 활성화시킨 다음 아미노기(NH2)가 결합된 상기 타게팅 리간드를 혼합하고 상기 카르복실기와 상기 아미노기가 반응하도록 하여 아마이드를 형성함으로써 상기 타게팅 리간드를 상기 제2쉘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제2쉘에 상기 카르복실기를 도입시킨 후, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 및 N-hydroxysuccinimide를 첨가하여 (i) 상기 카르복실기를 활성화시키고, (ii) 상기 아미노기가 결합된 상기 타게팅 리간드를 혼합하여 상기 카르복실기와 상기 아미노기가 반응하도록 하여 아마이드를 형성함으로써 상기 타게팅 리간드를 상기 제2쉘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서,
    제1 리피드를 포함하는 제1 혼합물 파우더를 제1 용매에 용해하여 제1쉘 물질의 솔루션을 생성하고, 상기 제1쉘 물질의 솔루션과 상기 불활성 가스를 혼합한 다음 기계적 믹싱을 하여 상기 초음파 반응형 미소기포를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제1 리피드는 DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), HSPC(phosphatidylcholine), DDPC(1,2-didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Di(cis-13-docosenoyl)-sn-glycerol-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DEPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MPPC(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MSPC(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), egg PC(phosphocholine), DPPA(Diphenylphosphoryl azide), DMPA-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DPPA-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DOPA-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DSPE(Distearoylphosphatidylethanolamine), DMPE(Dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(Dioleoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), DOPE-Glutaryl-(Na)2(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), egg PE(phosphatidylethanolamine), DSPG(Distearoyl phosphatidylglycerol), DMPG-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DPPG-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPG-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPS(ioleoyl phosphatidylserine), DMPS(Dimyristoyl phosphatidylserine), DMPS- Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DPPS-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DOPS-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DSPS(Distearoylphosphatidylserine), DSPE-mPEG(1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]), DSPE-mPEG-2000-Na(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE-Maleimide PEG-2000-Na, Surfactant: Tween 80, Span 80, dipotassium glycyrrhizinate 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 리피드는 상기 DPPC 및 상기 DPPA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 제1 혼합물 파우더는 알부민(albumin), 폴리머(polymer), 콜레스테롤(cholesterol), PEG(polyethylene glycol), 계면활성제, 단백질 및 생분해성 고분자 중 적어도 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 제1 용매는 Saline 또는 3차 증류수, glycerin 및 propylene glycol 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 제1쉘 물질의 솔루션과 상기 불활성 가스를 1:1 내지 20:1의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서,
    30nm 내지 1um 중 어느 하나의 공극 사이즈를 갖는 필터와 상기 압출기를 통해 상기 초음파 반응형 미소기포를 필터링함으로써, 상기 초음파 반응형 미소기포의 크기 분포를 균일하게 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 불활성 가스는 퍼플루오로카본(perfluorocarbon) 계열의 가스인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 퍼플루오로카본 계열의 가스로서, Perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoro-n-pentane, perfluoro-n-hexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluoro-1,3-dimethylcyclohexane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin 및 perfluoroperhydrobenzyltetralin 중 적어도 하나가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서,
    제2 리피드를 포함하는 제2 혼합물 파우더를 유기 용매에 용해한 후 상기 유기 용매를 제거하여 리피드 필름을 획득하고, 상기 리피드 필름을 제2 용매에 용해하여 제2쉘 물질의 솔루션을 생성하고, 상기 제2쉘 물질의 솔루션과 상기 초음파 반응형 미소기포 및 상기 약물을 혼합한 다음 초음파를 조사하여 상기 리포좀을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제2 리피드는 DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), HSPC(phosphatidylcholine), DDPC(1,2-didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Di(cis-13-docosenoyl)-sn-glycerol-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine), DEPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MPPC(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), MSPC(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), egg PC(phosphocholine), DPPA(Diphenylphosphoryl azide), DMPA-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DPPA-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DOPA-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DSPE(Distearoylphosphatidylethanolamine), DMPE(Dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(Dioleoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), DOPE-Glutaryl-(Na)2(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), egg PE(phosphatidylethanolamine), DSPG(Distearoyl phosphatidylglycerol), DMPG-Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DPPG-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPG-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-Phosphoglycerol), DOPS(ioleoyl phosphatidylserine), DMPS(Dimyristoyl phosphatidylserine), DMPS- Na(1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DPPS-Na(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DOPS-Na(1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoserine), DSPS(Distearoylphosphatidylserine), DSPE-mPEG(1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]), DSPE-mPEG-2000-Na(1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine), DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE-Maleimide PEG-2000-Na, Surfactant: Tween 80, Span 80, dipotassium glycyrrhizinate 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제2 리피드는 상기 DPPC 및 DPPA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 제2 리피드는 상기 DPPA, 상기 DMPA-Na, 상기 DPPA-Na, 상기 DSPG 및 상기 DSPS 중 적어도 하나 이상을 포함함으로써, 상기 리포좀이 전하를 띄도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 제2 혼합물 파우더는 알부민(albumin), 폴리머(polymer), 콜레스테롤(cholesterol) 및 PEG(polyethylene glycol) 중 적어도 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 제2 용매는 PBS(Phosphate-buffered saline)인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 유기 용매는 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서,
    필터와 상기 압출기를 통해 상기 리포좀을 필터링함으로써, 상기 리포좀의 크기 분포를 균일하게 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제15항에 있어서,
    상기 제2쉘 물질의 솔루션에 초음파를 조사한 다음, 상기 미소기포와 상기 약물을 혼합하여 상기 리포좀을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 리포좀은 내부에 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 삭제
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