CN102138889A

CN102138889A - 靶向载药超声微泡及其制备方法

Info

Publication number: CN102138889A
Application number: CN2011100744041A
Authority: CN
Inventors: 严飞; 郑海荣; 李翔; 靳巧锋
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明涉及一种靶向载药超声微泡，包括脂质双分子层外壳、固定在脂质双分子层外壳外侧的靶向多肽、包裹在脂质双分子层外壳内部的生物惰性气体、以及分散于脂质双分子层外壳中的药物颗粒，靶向多肽为包含氨基酸序列CGNKRTRGC的多肽或蛋白衍生物。通过在脂质双分子层外壳外连接含有肿瘤靶向肽序列的多肽或蛋白衍生物，得到的靶向载药超声微泡可以靶向肿瘤的***及其肿瘤细胞，再通过高频超声成像可以对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过低频超声击碎微泡释放药物颗粒，达到可控地靶向释放药物的目的，从而对肿瘤的预防、诊断及治疗均有着极其重要的意义。此外，本发明还涉及一种靶向载药超声微泡的制备方法。

Description

靶向载药超声微泡及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及超声微泡显影技术领域，尤其涉及一种靶向载药超声微泡及其制备方法。

【背景技术】

1968年Gramiak首次报道了可增强显影的小气泡，即超声微泡造影剂(UCA)。UCA的出现开创了无创超声诊断和治疗的新领域。随着对其研究的不断深入，人们发现超声微泡造影剂不仅是一种良好的超声显像对比剂，而且是一种重要的药物递送载体。对超声微泡造影剂携带基因或药物靶向治疗在医学领域的研究日益广泛。超声微泡造影剂靶向治疗包括超声介导载药微泡的治疗及超声介导靶向载药微泡的治疗。

微泡与药物的结合方法有：(1)直接黏附在微泡外壳，如带负电基团的药物容易黏附在带正电的脂质微泡表面；(2)包裹入微泡外壳中，构成超声微泡造影剂外壳的成分白蛋白、磷脂多糖等均是药物的良好载体，可将药物吸附、整合或包裹其中；(3)包裹入微泡内部，这是一种比较稳定的结合方式，药物包载率高且在超声作用下能完整释放，可增加靶组织的药物浓度，通过将具有较大副作用的药物置于微泡内，在靶器官局部释放可达到保护药物、延缓药物的释放、减少给药次数、减小剂量和增加疗效的目的。

尽管超声介导靶向载药微泡兼具安全、高效、可控性强等优点，初步显示了广阔的应用前景，但传统的超声介导靶向载药微泡靶向性不强，为增强其靶向性，需要对其进行进一步的改造。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种靶向性较好的靶向载药超声微泡。

一种靶向载药超声微泡，包括脂质双分子层外壳、固定在脂质双分子层外壳外侧的靶向多肽、包裹在脂质双分子层外壳内部的生物惰性气体、以及分散于脂质双分子层外壳中的药物颗粒，靶向多肽为包含氨基酸序列CGNKRTRGC的多肽或蛋白衍生物。

优选的，脂质双分子层外壳包括如下质量份数的各组分：

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱 7份，

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 0.5份，

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素 0.5份；

药物颗粒为紫杉醇，且1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱与紫杉醇的质量比为7-8∶2-3。

优选的，还包括亲和素，所述靶向多肽连有生物素，靶向多肽通过生物素-亲和素-生物素桥与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。

优选的，还包括链霉亲和素，所述靶向多肽连有生物素，靶向多肽通过生物素-链霉亲和素-生物素桥与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。

优选的，靶向载药超声微泡的粒径为0.5～8μm。

优选的，生物惰性气体为全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫中的至少一种。

优选的，脂质双分子层外壳为磷脂或磷脂类衍生物。

优选的，磷脂或磷脂类衍生物为1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱中的至少一种。

优选的，药物颗粒为多烯紫杉醇、阿霉素、喜树碱、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、消炎痛、普洛比普洛芬、酮基布洛芬、炎痛喜康及双氯酚酸中的至少一种，或者药物颗粒为用于治疗乳腺癌的活性蛋白、多肽、疫苗或基因。

为了增加载药超声微泡的靶向性，在脂质双分子层外壳外连接含有肿瘤靶向肽序列的多肽或蛋白衍生物，得到的靶向载药超声微泡可以靶向肿瘤的***及其肿瘤细胞，再通过高频超声成像可以对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过低频超声击碎微泡释放药物颗粒，达到可控地靶向释放药物的目的，从而对肿瘤的预防、诊断及治疗均有着极其重要的意义。

此外，还有必要提供一种靶向性较好的靶向载药超声微泡的制备方法。

一种靶向载药超声微泡的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：按质量份数配比紫杉醇7/4～3份、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱7份，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 0.5份，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素0.5份，溶于溶剂中制备药物磷脂混悬液；

步骤二：将药物磷脂混悬液混匀，在干燥的N₂流作用下除去溶剂使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥1～3小时；

步骤三：在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的pH＝7.4的Tris缓冲溶液，得制备载药磷脂溶液，Tris缓冲溶液中包括10％体积的甘油和10％体积的丙二醇；

步骤四：加热载药磷脂溶液到相转变温度以上，水浴超声震荡使磷脂溶液分散彻底直至透明；

步骤五：将透明的载药磷脂溶液分装置西林瓶中，并将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡30～60秒制备载药超声微泡；

步骤六：离心漂浮法清洗载药超声微泡3～4次，以除去未形成微泡的磷脂；

步骤七：在清洗过的载药超声微泡中加入亲和素，轻轻摇动室温下孵育15分钟后用离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的亲和素；

步骤八：向步骤七得到的载药超声微泡中加入生物素化的靶向多肽，轻轻摇动并室温下孵育10分钟以上，用离心漂浮法清洗3～4次除去未结合的生物素化的靶向多肽，得到靶向载药超声微泡。

优选的，步骤四中，震荡频率为4000～5000次/分钟，震荡幅度为10～40毫米，震荡时间为30～90秒。

该制备方法原理简单，操作简便，对设备要求低，可以广泛推广应用。

【附图说明】

图1为一实施例的靶向载药超声微泡模式图；

图2为结合了靶向多肽的靶向载药超声微泡荧光图；

图3A为非靶向载药超声微泡与乳腺癌MDA-MB-231细胞结合示意图；

图3B为靶向载药超声微泡与乳腺MDA-MB-231细胞特异性结合的电镜图；

图4为加有靶向载药超声微泡和非靶向载药超声微泡的乳腺癌MDA-MB-231细胞显像对比图；

图5为靶向载药超声微泡在超声条件下对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤活性示意图。

【具体实施方式】

下面主要结合附图及具体实施例对靶向载药超声微泡及其制备方法作进一步详细的说明。

一实施方式的靶向载药超声微泡包括：脂质双分子层外壳、固定在脂质双分子层外壳外侧的靶向多肽、包裹在脂质双分子层外壳内部的生物惰性气体、以及分散于脂质双分子层外壳中的药物颗粒。

靶向多肽为包含氨基酸序列CGNKRTRGC(LyP-1多肽)的多肽或蛋白衍生物。靶向多肽上连有生物素，从而靶向多肽与脂质双分子层外壳之间可以通过生物素-亲和素-生物素桥或者生物素-链霉亲和素-生物素桥连接。

本实施方式的脂质双分子层外壳为磷脂或磷脂衍生物，如1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)等。相应的，磷脂或磷脂类衍生物上可以在连接聚乙二醇(PEG)、生物素等分子，以便于与其他多肽、蛋白等进一步连接。

为增强靶向载药超声微泡的稳定性，本实施方式的脂质双分子层外壳包裹有生物惰性气体，可以为全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫中的至少一种。

本实施方式的药物颗粒可以为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、喜树碱、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、消炎阿诺迪宁如消炎痛、普洛比普洛芬、酮基布洛芬、炎痛喜康、双氯酚酸等，以及可用于治疗乳腺癌的可溶性药物，如：活性蛋白、多肽、疫苗以及基因。

以下为具体实施例部分：

如图1所示，本实施例的靶向载药超声微泡由类脂双分子层薄膜包裹生物惰性气体构成，紫杉醇包封于双分子层中，LyP-1多肽连接固定在双分子层外侧。类脂双分子层薄膜及紫杉醇按以下质量份数配比制得：

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)：7份

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000(DSPC-PEG)：0.5份

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素(DSPC-PEG-Biotin)：0.5份

紫杉醇：7/4～3份。

靶向多肽LyP-1通过生物素-亲和素-生物素桥与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。

本实施例的靶向载药超声微泡的粒径可以控制在0.5～8μm之间。

该靶向载药超声微泡的制备过程，可按如下步骤进行：

步骤S1：按质量份数配比紫杉醇7/4～3份、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱7份，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 0.5份，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素0.5份，溶于5mL三氯甲烷中，制备药物磷脂混悬液；

步骤S2：在涡旋混合器上将药物磷脂混悬液混匀，在干燥的N₂流作用下除去三氯甲烷使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥1～3小时；

步骤S3：在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的pH＝7.4的Tris缓冲溶液，得制备载药磷脂溶液，Tris缓冲溶液中包括10％体积的甘油和10％体积的丙二醇；

步骤S4：加热载药磷脂溶液到相转变温度(55～60℃)以上，水浴超声震荡使牛奶状的磷脂溶液分散彻底直至透明，其中震荡频率为4000～5000次/分钟，震荡幅度为10～40毫米，震荡时间为30～90秒；

步骤S5：将透明的载药磷脂溶液每毫升一装入2mL西林瓶中，并将西林瓶中的空气置换成全氟丙烷，机械震荡30～60秒制备载药超声微泡；

步骤S6：用PBS缓冲液离心漂浮法清洗载药超声微泡3～4次，以除去未形成微泡的磷脂；

步骤S7：在清洗过的载药超声微泡中加入亲和素，轻轻摇动室温下孵育15分钟后用离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的亲和素；

步骤S8：向步骤S7得到的载药超声微泡中加入生物素化的靶向多肽(生物素-LyP-1)，轻轻摇动并室温下孵育10分钟以上，用离心漂浮法清洗3～4次除去未结合的生物素化的靶向多肽，得到靶向载药超声微泡。

以下为对制得的靶向载药超声微泡性能的检测、研究部分：

(1)验证LyP-1多肽与载药超声微泡的成功藕连：

用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)对生物素-LyP-1多肽进行荧光标记，并将标记后的生物素-LyP-1多肽与连接有亲和素的载药超声微泡孵育，PBS离心漂浮法洗涤3次后，置于荧光显微镜下观察，结果如图2所示，图中能够成功检测到绿色荧光，证明LyP-1多肽与载药超声微泡成功藕连，制得LyP-1靶向载药超声微泡。

(2)优化靶向载药超声微泡的药物包封率：

分别加入0.75，1.5，3，4.5mg的紫杉醇药物，制备获得携载不同浓度紫杉醇的LyP-1靶向超声微泡，通过粒径/浓度分析仪测定各组微泡的粒径分布和形成微泡的浓度，再通过三氯甲烷裂解等量的载药超声微泡，用紫外分光光度计分析测定各组所含紫杉醇的药物含量，得出最佳的载药超声微泡参数。结果如表1所示：

表1

药物加入量(mg)	微泡浓度(10⁸MBs/ml)	包封率(％)
			0.75	5.95+0.79	62.92+2.38
1.5	4.99+0.43	54.52+2.19
			3.0	4.14+0.29	50.39+1.68
4.5	3.51+0.36	42.98+1.47

表1结果表明随着药物颗粒添加量的增加，载药超声微泡的载药量也随之增加，但药物颗粒与脂质体的成泡率有所下降。

(3)靶向载药超声微泡对肿瘤细胞的特异性：采用载药的LyP-1靶向超声微泡验证其对乳腺癌细胞的黏附性及特异结合能力。

首先，按照上述方法制备获得LyP-1靶向载药超声微泡，使用1×10⁸微泡/毫升浓度加入至贴壁培养过夜的MDA-MB-231乳腺癌细胞，同时采用非靶向载药超声微泡作为对照，将靶向载药超声微泡与非靶向载药超声微泡分别与乳腺癌MDA-MB-231细胞孵育5分钟后，用PBS离心漂浮洗涤3-4次，在显微镜下观察LyP-1靶向载药超声微泡对乳腺癌细胞的粘附性和细胞特异性。结果如图3A和图3B所示，结果表明，靶向载药超声微泡能够与乳腺癌MDA-MB-231细胞结合并黏附在其细胞表面，而非靶向载药超声微泡则不能与乳腺癌MDA-MB-231细胞结合。

(4)研究载药靶向微泡对乳腺癌的超声成像特性：

将MDA-MB-231细胞贴壁生长于盖玻片上，采用LyP-1靶向载药超声微泡与细胞孵育，将LyP-1靶向载药超声微泡结合至细胞表面，以不带LyP-1多肽的非靶向载药超声微泡为对照，两组用超声探头进行B-mode超声成像分析，比较靶向载药超声微泡与非靶向载药超声微泡的超声成像特性，结果如图4所示，结果表明结合于乳腺癌MDA-MB-231细胞的LyP-1靶向载药超声微泡在B-mode条件下能够检测到明显的超声信号。

(5)研究靶向载药超声微泡对乳腺癌的杀伤活性：

将1×10⁸微泡/毫升浓度的载药超声微泡加入至贴壁培养过夜的乳腺癌MDA-MB-231细胞，实验分组：完全未处理组，未载药超声微泡处理组，非靶向载药超声微泡处理组，靶向载药超声微泡处理组，对以上四个处理组分别进行超声和不超声处理。分析靶向载药微泡在超声条件下对乳腺癌细胞特异杀伤活性。结果如图5所示，结果表明靶向载药超声微泡较非靶向载药超声微泡具有更强的杀伤活性，体现出更佳的乳腺癌治疗效果。

本实施例采用针对乳腺癌肿瘤细胞特异性结合的LyP-1多肽作靶向多肽，该多肽具有高特异性、高选择性和分子量小等特点，能够特异性地结合肿瘤。本实施例制得的靶向载药超声微泡是一种兼具肿瘤诊断和治疗双功能超声造影剂，通过超声成像可确定肿瘤在体内的具***置并对肿瘤的发生、发展状况做出诊断；利用超声空化效应可使微泡破裂、释放药物，利用声孔效应增强局部毛细血管和细胞膜通透性，从而达到增加靶向部位血药浓度，减少用药剂量并增强靶向给药的效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种靶向载药超声微泡，其特征在于，包括脂质双分子层外壳、固定在所述脂质双分子层外壳外侧的靶向多肽、包裹在所述脂质双分子层外壳内部的生物惰性气体、以及分散于所述脂质双分子层外壳中的药物颗粒，所述靶向多肽为包含氨基酸序列CGNKRTRGC的多肽或蛋白衍生物。

2.如权利要求1所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述脂质双分子层外壳包括如下质量份数的各组分：

1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱 7份，

所述药物颗粒为紫杉醇，且所述1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱与所述紫杉醇的质量比为7～8∶2～3。

3.如权利要求2所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，还包括亲和素，所述靶向多肽连有生物素，所述靶向多肽通过生物素-亲和素-生物素桥与所述1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。

4.如权利要求2所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，还包括链霉亲和素，所述靶向多肽连有生物素，所述靶向多肽通过生物素-链霉亲和素-生物素桥与所述1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。

5.如权利要求1或2所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述靶向载药超声微泡的粒径为0.5～8μm。

6.如权利要求1或2所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述生物惰性气体为全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫中的至少一种。

7.如权利要求1所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述脂质双分子层外壳为磷脂或磷脂类衍生物。

8.如权利要求7所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述磷脂或磷脂类衍生物为1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱中的至少一种。

9.如权利要求1所述的靶向载药超声微泡，其特征在于，所述药物颗粒为多烯紫杉醇、阿霉素、喜树碱、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、消炎痛、普洛比普洛芬、酮基布洛芬、炎痛喜康及双氯酚酸中的至少一种，或者所述药物颗粒为用于治疗乳腺癌的活性蛋白、多肽、疫苗或基因。

10.一种如权利要求3所述的靶向载药超声微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二：将所述药物磷脂混悬液混匀，在干燥的N2流作用下除去溶剂使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥1～3小时；

步骤三：在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的pH＝7.4的Tris缓冲溶液，得制备载药磷脂溶液，所述Tris缓冲溶液中包括10％体积的甘油和10％体积的丙二醇；

步骤四：加热所述载药磷脂溶液到相转变温度以上，水浴超声震荡使磷脂溶液分散彻底直至透明；

步骤八：向步骤七得到的载药超声微泡中加入生物素化的靶向多肽，轻轻摇动并室温下孵育10分钟以上，用离心漂浮法清洗3～4次除去未结合的生物素化的靶向多肽，得到所述靶向载药超声微泡。

11.如权利要求10所述的靶向载药微泡的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，震荡频率为4000～5000次/分钟，震荡幅度为10～40毫米，震荡时间为30～90秒。