CN107365782A - 一种基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基因工程菌及其应用。本发明所述基因工程菌能够在同一株菌中同时表达MTSase和MTHase，并且在翻译水平调控两种酶的表达，实现了两种酶的不同水平的高效表达。本发明所述基因工程菌可以同时发酵制备MTSase和MTHase两种酶，只需要一套设备就能满足生产要求。并且MTSase和MTHase两种酶表达量配比固定，生产更稳定。本发明通过分子生物学手段调节所述基因工程菌的MTSase和MTHase酶的表达水平，使得两种酶获得最佳配比，协同作用强，在最短的时间获得最高的转化率。实验表明利用本发明所述基因工程菌表达获得的产物生产海藻糖，海藻糖的转化率最高达到87％。

Description

一种基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其应用，尤其是涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶共表达的基因工程菌及其在海藻糖生产中的应用。
背景技术
海藻糖是由两个吡喃环葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键缩合而成的非还原性双糖，具有在极端条件下保护生物活性特征，在科学界素有“生命之糖”的美誉，并被广泛应用于食品、医药及化妆品行业中。目前海藻糖的生产方法主要包括微生物抽提法、发酵法、酶转化法以及基因重组法。酶转化法由于工艺简单、转化率高、成本低廉等优点，是适合工业化生产的理想途径。
酶法合成海藻糖的生物合成途径有多种，其中海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸酯酶转化法、海藻糖磷酸化酶转化法均需要高能化合物为原料，成本较高且磷酸化酶不稳定，不适合工业化生产。海藻糖合酶转化法是以麦芽糖为底物通过分子内转糖苷作用直接生产海藻糖，该酶能够作用麦芽糖生成海藻糖及其逆反应海藻糖生成麦芽糖，从脂肪杆菌(Pimelobacter species.R48)、恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida H626)和水生嗜热菌(The rmus aquaticus)中提取的海藻糖合酶(Trehalose synthase，EC5.4.99.16)，可催化麦芽糖分子内转苷作用，将α-1,4糖苷键连接的麦芽糖转化为α-1,1糖苷键，麦芽糖即转变成海藻糖。海藻糖合酶转化法以麦芽糖为直接底物，工艺简单，但反应温度低(一般为20-30℃)，反应时间较长，而且海藻糖合酶催化的是一个可逆反应，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率最高只能达到60％左右。而麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)转化法，能够以直链淀粉为底物，经过转化后最后产物为海藻糖和少量的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖，该双酶***不需要磷酸盐共存，而且对淀粉转化率可达到80％以上，是理想的工业化生产途径。
日本林原生化研究所和日本麒麟公司的研究者从节杆菌(Arthrabactersp.Q36)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolbus acidocaldarius)和硫矿硫化叶菌中纯化出和该转化相关的酶，并阐明了这种海藻糖合成途径的酶***及海藻糖合成机理。该酶***包括麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyl trehalose synthase，MTSase，EC5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyl trehalose trehalohyrolase，MTHase，EC3.2.1.141)。MTSase和MTHase联合作用于不同DP值(DP≥3)的麦芽寡糖或直链淀粉合成出海藻糖，该过程对磷酸盐并无依赖性。其中MTSase作用于底物还原性末端的C1-OH，产生α-1，4糖苷键到α-1，1糖苷键的分子内转糖基作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；MTHase则专一地内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α-1，4糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复交替进行2种酶反应就可以将麦芽寡糖或直链淀粉转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。如配合其他的淀粉水解酶，如α-淀粉酶、异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等，可使淀粉转化为海藻糖的转化率达80％以上。双酶法是目前海藻糖工业化生产的主要方法。
由于MTHase的作用底物是MTSase的反应产物，因此两种酶的配比对海藻糖转化有显著影响，当MTSase一定时，MTHase不足时，转糖基作用快，MTHase水解慢，导致中间产物麦芽寡糖基海藻糖积累；当MTHase过量时，转糖基作用速率慢，中间产物麦芽寡糖基海藻糖不足，海藻糖转化缓慢，反应周期长。因此需要找到两种酶合适的配比，从而获得最高的海藻糖转化率。
日本林原在中国专利CN100352920C中公开了一种新的非还原糖类生成酶及其制备和应用，即MTSase，这种酶可从Rhizobium sp.M-11(FERMBP4130)和Arthrobactersp.Q36(FERMBP4316)等微生物的培养物中获取，当其作用于还原性淀粉部分水解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。当葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于这种非还原性糖类时，易于产生海藻糖。日本林原同时在中国专利CN1204249C中公开了一种海藻糖释放酶，即MTHase，这种酶也是从Rhizobium sp.M-11(FERMBP4130)和Arthrobacter sp.Q36(FERMBP4316)等微生物的培养物中获取，它能特异性水解具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，然后通过柱层析分离纯化海藻糖，最后浓缩结晶干燥获得成品海藻糖。
江南大学研究人员在中国专利CN106190880A中公开了一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌及其应用，以pPIC3.5k为载体，以Pichia pastoris KM71为表达宿主，表达Sulfolobus acidocaldarius来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。发酵产麦芽寡糖基海藻糖合成酶活可达3128.7U/mL。同时在中国专利CN105969713A中公开了一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用，以pET-32a(+)为载体，以E.coli Origami(DE3)为表达宿主，构建了高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，以该菌株为生产菌株在发酵罐进行发酵产酶，酶活可达到204U/mL。
中国专利CN103194432A和CN103194434A中分别公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶、酶的基因、含有该基因的重组表达载体及重组工程菌及酶的制备方法，采用pET-24a(+)为载体，以E.coli BL21为表达宿主，发酵表达的MTSase和MTHase酶具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有较低的最适pH，降低了染菌风险，提高了生产的稳定性，显著提高了其和普鲁兰酶联合作用还原性淀粉水解物生产海藻糖的效率，显著提高了海藻糖生产效率。
然而目前采用双酶法转化生产海藻糖大都是构建两株菌，分别表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，分别通过两个发酵罐进行发酵产酶，然后破碎、离心制备两种酶液，测定酶活后根据酶活按照一定比例加入底物中进行酶解转化，采用两株菌分别发酵制酶，需要两套设备，设备投资大，需要每批测定酶活，两种酶添加比例每批都需要调整，酶加配比不合适会导致酶解转化率降低，最终影响生产稳定。即使有在同一株菌中表达两种酶，但未对酶的表达水平进行调控，导致两种酶的表达比例不合适，影响最终酶解转化率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，构建一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase酶)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase酶)共表达的基因工程菌，实现了两种酶不同水平的高效表达，并应用于海藻糖生产。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种基因，由编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子、核糖体结合位点序列(RBS序列)、编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子依次连接而成。所述基因可以共表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)。
在一些实施方案中，所述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子为来源于Arthrobacter sp.Q36的treY基因。所述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子来源于Arthrobacter sp.Q36的treZ基因。
进一步的，所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；所述核糖体结合位点序列其核苷酸序列如SEQ IDNO:5-9任意一个所示。
本发明还提供了一种重组载体为包含上述基因的载体。其中，所述重组载体中所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子位于编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子的上游。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体，是所述基因连接到pET-28a(+)表达载体上得到的。
本发明还提供了一种基因工程菌，包含上述重组载体。将所述重组载体转化到宿主菌中得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)共表达的基因工程菌。
进一步的，在一些实施方案中，所述基因工程菌的所述重组载体中的核糖体结合位点序列的如SEQ IDNO:7所示。
进一步的，在一些实施方案中，所述基因工程菌所述重组载体中的核糖体结合位点序列的如SEQ IDNO:7所示，载体为pET-28a(+)，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)菌株，命名为大肠杆菌SH003。
本发明还提供了所述基因工程菌的制备方法，包括：
步骤A、获得编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因序列，以及连接核糖体结合位点序列；
步骤B、构建重组载体转化宿主菌，其中所述重组载体包含由编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子、核糖体结合位点序列、编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子依次连接而成基因，所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子位于编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子的上游；
本发明通过分子生物学手段从转录和翻译水平调节双酶表达来构建MTSase和MTHase的共表达菌株，实现两种酶不同表达量的要求，从而控制两种酶在合适的配比，以达到该转化体系下海藻糖的高效生产。其中，所述转录水平调控双酶表达是通过单启动子双酶双联表达来构建共表达质粒。翻译水平调控双酶表达是通过改变核糖体结合位点序列(RBS序列)与起始密码子之间的间隔，进而影响翻译起始速率，在翻译水平上调节蛋白质表达量。
本发明所述单启动子双酶双联表达方式，采用pET***中自带的T7启动子，麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因(treY)的RBS序列采用pET***中自带的RBS序列，通过优化麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因(treZ)前端的RBS序列与起始密码子之间的间隔调控该酶不同的表达量，间隔设定在4bp～12bp。通过RBS Calculatorv1.1(https://www.denovodna.com/software/)预测不同RBS强度及翻译起始速率TIR，从而设计不同的RBS序列，构建双酶串联表达质粒，获得符合要求的酶配比。
本发明所述制备方法步骤B所述载体包括但不限于pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一些实施方案中，所述载体为pET系列载体。在一个具体实施例中，所述载体为pET-28a(+)。
本发明所述制备方法步骤B所述宿主菌为大肠杆菌表达菌株，可以为Rosetta系列或BL21系列菌株。在一些实施方案中，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)菌株。
进一步，本发明还提供了所述的基因工程菌经诱导表达获得的产物。本发明所述基因工程菌经诱导后共表达MTSase和MTHase，获得特定配比的MTSase和MTHase的双酶混合产物。
本发明还提供了所述产物的制备方法，将所述基因工程菌活化后接种于培养基中诱导表达。
其中，在一些实施方案中，所述活化为所述基因工程菌加入TB培养基中37℃振荡培养过夜。
在一些实施方案中，所述接种为按10％的接种量接种于培养基中，培养至OD600为6～10。
在一些实施方案中，所述诱导为加入诱导剂诱导表达。
优选的，所述诱导剂为0.3～0.5mmol/L IPTG或3～7g/L乳糖。
优选的，所述诱导温度为25-30℃，诱导时间为12-16h。
本发明所述产物的制备方法诱导表达后离心收集菌体，超声破碎后，再次离心去掉菌体碎片，即得特定配比的MTSase和MTHase的双酶混合产物。
上述制备方法中，本领域技术人员可以根据现有的大肠杆菌培养基，选择适合产酶的培养基或者是进一步对培养基进行优化。
本发明所述的基因工程菌经诱导后共表达MTSase和MTHase，获得的特定配比的MTSase和MTHase的双酶混合产物，按照一定比例加入底物中可进行酶解转化用于海藻糖生产。因此本发明还提供了所述基因工程菌或所述的基因工程菌经诱导表达获得的产物在生产海藻糖中的应用。
本发明还提供了一种海藻糖的生产方法，以直链糊精或直链淀粉为底物，加入所述的基因工程菌经诱导表达获得的产物转化。
以直链糊精或直链淀粉为底物，底物浓度10％～30％，在pH5.0-7.0、温度40-60℃下，加入所述基因工程菌经诱导表达获得的产物，转化24-72h。
在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为10％～30％。
在本发明的一种实施方式中，所述转化pH5.0-7.0，转化温度为40-60℃，转化时间为24-72h。
在本发明的一种实施方式中，所述产物加入量为10～20mL/Kg干物或10～20g/Kg干物。即每Kg直链糊精或直链淀粉加入10～20mL基因工程菌经诱导表达酶液或每Kg直链糊精或直链淀粉加入10～20g基因工程菌经诱导表达酶干物。
在一些具体实施例中，所述转化为10％直链淀粉，加入2～2.5mL基因工程菌经诱导表达酶液或2～2.5g基因工程菌经诱导表达酶干物，在pH6.0的磷酸缓冲液体系中，40～60℃，200rpm条件下转化24h。
与现有技术相比，本发明至少具有以下一个优点：
1、本发明所述基因工程菌能够在同一株菌中同时表达MTSase和MTHase，并且在翻译水平调控两种酶的表达，实现了两种酶的不同水平的高效表达；
2、本发明所述基因工程菌可以同时发酵制备MTSase和MTHase两种酶，工艺简单，设备投资低，只需要一套设备就能满足生产要求。并且MTSase和MTHase两种酶表达量配比固定，生产更稳定。
3、本发明通过分子生物学手段调节所述基因工程菌的MTSase和MTHase酶的表达水平，使得两种酶获得最佳配比，协同作用最强，在最短的时间获得最高的转化率。实验表明利用本发明所述基因工程菌表达获得的产物生产海藻糖，海藻糖的转化率最高达到87％。
具体实施方式
本发明公开了一种基因工程菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所涉及的TB培养基(W/V)的配方为：1.2％蛋白胨，2.4％酵母粉，0.213％KH2PO4，1.643％K2HPO4·3H2O，0.5％甘油，pH7.0。
本发明所用到的技术，例如PCR扩增技术、引物设计技术、载体构建技术、工程菌构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中比较成熟的技术，本领域人员可以根据现有技术实现。在操作过程中所用的设备或者试剂、载体、酶等，如无特别说明，均能在市场中得到。在本发明中所有基因工程菌的性能评价均在同一条件下诱导测定产酶效果，随后利用酶液转化直链糊精或直链淀粉生产海藻糖。
实施例1：获得目的基因
从NCBI中查找节杆菌Arthrobacter sp.Q36，获得编码MTSase和MTHase基因序列treY和treZ，MTSase的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。MTHase的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2：连接RBS序列设计
分别设计5组RBS序列，5种RBS序列的区别为与ATG的间隔区不同，分别命名为rbs-1(序列如SEQ ID NO:5)、rbs-2(序列如SEQ ID NO:6)、rbs-3(序列如SEQ ID NO:7)、rbs-4(序列如SEQ ID NO:8)和rbs-5(序列如SEQ ID NO:9)，其序列及对应的T.I.R值见表1。另外，rbs-1与表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因所采用的RBS序列相同，其序列如SEQ IDNO:5，对应的T.I.R值见表1。所述RBS序列强度是通过RBS Calculator v1.1(https:// www.denovodna.com/software/)进行计算而得。
表1：不同RBS及其翻译起始速率
RBS序列 序列号 mRNA序列 T.I.R[au]
rbs-1 SEQ ID NO:5 aataattttgtttaactttaagaaggagatatacc 1055.70
rbs-2 SEQ ID NO:6 aataattttgtttaactttaagaaggagatat 429.70
rbs-3 SEQ ID NO:7 aataattttgtttaactttaagaaggagatataccat 912.40
rbs-4 SEQ ID NO:8 aataattttgtttaactttaagaaggagatataccata 704.10
rbs-5 SEQ ID NO:9 aataattttgtttaactttaagaaggagatataccatacc 366.70
实施例3：重组表达菌株的构建
采用pET-28a(+)载体同时表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，表达方式为单启动子双酶串联表达，麦芽寡糖基海藻糖合成酶位于麦芽寡糖基海藻糖水解酶的上游，两个酶编码基因的间隔区为RBS序列，启动子为T7启动子。麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的RBS序列固定为rbs-1，rbs-1为pET载体自身的RBS序列。麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的RBS序列分别取rbs-1、rbs-2、rbs-3、rbs-4和rbs-5，5种不同的RBS序列通过设计引物由PCR扩增引入。
麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因通过引物引入合适的酶切位点，与表达载体pET-28a(+)进行连接，从而得到目的表达质粒。引物及酶切位点见表2。通过此操作，得到5种组合的双酶表达***，并将对应的表达载体命名为pET-treYZ1、pET-treYZ2、pET-treYZ3、pET-treYZ4和pET-treYZ5，然后将5种表达载体分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中，涂布卡那霉素抗性平板，筛选获得同时表达MTSase和MTHase的基因工程菌，对应的菌株名称为SH001(即MTSase和MTHase通过SEQ ID NO:5的连接序列进行连接)、SH002(即MTSase和MTHase通过SEQ ID NO:6的连接序列进行连接)、SH003(即MTSase和MTHase通过SEQ ID NO:7的连接序列进行连接)、SH004(即MTSase和MTHase通过SEQ ID NO:8的连接序列进行连接)和SH005(即MTSase和MTHase通过SEQ ID NO:9的连接序列进行连接)。
表2引物序列
引物名称 引物序列 酶切位点
PtreY-f ggaattccatatgccggcatccacctaccgcc NdeI
PtreY-r cgggatccaaacaaaattattttaggtttcgaccagcagtgcg BamHI
PtreZ-rbs1 cgggatccaagaaggagatataccatgaatcgccgttttccggt BamHI
PtreZ-rbs2 cgggatccaagaaggagatatatgaatcgccgttttccggt BamHI
PtreZ-rbs3 cgggatccaagaaggagatataccatatgaatcgccgttttccggt BamHI
PtreZ-rbs4 cgggatccaagaaggagatataccataatgaatcgccgttttccggt BamHI
PtreZ-rbs5 cgggatcc aagaaggagatataccataccatgaatcgccgttttccggt BamHI
PtreZ-A cccaagcttttattccagacgcacaatcgcc HindIII
实施例4：不同配比粗酶液制备
将构建好的重组基因工程菌SH001～005分别在TB培养基中培养，于37℃水浴振荡培养过夜，按10％的接种量转接于装有50mLTB培养基的500mL三角瓶中，继续培养至OD600为8时，加入IPTG终浓度为0.3mmol·L-1，30℃诱导表达12-16h。将重组菌分别经离心收集，并超声破碎，再次离心取上清即得到不同配比的MTSase和MTHase共表达的粗酶液。根据蛋白电泳条带强度计算蛋白含量，获得不同菌株发酵产酶比例。
表3不同菌株发酵产酶比例
菌株名称 MTSase和MTHase表达量比例
SH001 1：1
SH002 1：0.41
SH003 1：0.86
SH004 1：0.67
SH005 1：0.35
实施例5：海藻糖转化
以直链糊精或直链淀粉为底物，底物浓度30％，在pH5.0-6.0，温度45℃下，分别加入由菌株SH001～SH005发酵制备的MTSase和MTHase粗酶液，转化60-72h，之后加入糖化酶转化剩余未反应的底物为葡萄糖，然后采用高效液相色谱检测海藻糖含量，计算不同配比酶液的海藻糖转化率。结果如下表5。
表5不同配比酶液的海藻糖转化率
菌株名称 转化率
SH001 63％
SH002 55％
SH003 87％
SH004 75％
SH005 50％
结果显示，分别加入菌株SH001～SH005发酵制备的MTSase和MTHase粗酶液，转化60-72h，之后加入糖化酶转化剩余未反应底物为葡萄糖，海藻糖转化率50～87％。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种基因工程菌及其应用
<130> MP1709817
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2274
<212> DNA
<213> Arthrobacter sp. Q36
<400> 1
atgccggcat ccacctaccg cctgcaaatc tcagccgaat tcaccctgtt tgacgccgcc 60
cgtatcgttc cgtatctgca ccgcctgggc gcggattggc tgtatctgag cccgctgctg 120
gaaagtgaat ccggcagctc tcatggttac gatgtggttg accactcacg tgttgacgca 180
gcacgcggcg gtccggaagg tctggcggaa ctgtcgcgtg cagctcatga acgcggcatg 240
ggtgtcgtgg ttgatattgt tccgaaccac gtgggcgttg cgaccccgaa agccaatcgt 300
tggtggtggg acgtgctggc acgtggtcag cgtagtgaat atgccgatta ctttgatatc 360
gactgggaat tcggcggtgg ccgtctgcgc ctgccggttc tgggtgatgg tccggacgaa 420
ctggatgcgc tgcgtgttga tggcgacgaa ctggtctatt acgaacatcg ctttccgatt 480
gcagaaggta ccggtggcgg tacgccgcgt gaagtgcatg atcgccagca ctatgaactg 540
atgtcttggc gtcgcgcaga tcacgacctg aactaccgtc gctttttcgc ggttaatacc 600
ctggcagcag tccgtgtgga agatccgcgc gtcttcgatg acacgcatcg tgaaattggc 660
cgctggatcg cagaaggcct ggtcgacggt ctgcgtgtgg accacccgga tggtctgcgt 720
gcaccgggtg attatctgcg tcgcctggca gaactggcac agggtcgtcc gatttgggtg 780
gaaaaaatta tcgaaggtga cgaacgcatg ccgccgcaat ggccgattgc aggcaccacg 840
ggttacgatg cactggctgg catcgaccgt gttctggtcg atccggcggg tgaacatccg 900
ctgacccaga tcgttgatga agcagctggc tcaccgcgtc gctgggcaga actggtcccg 960
gaacgtaaac gtgcagtggc acgtggtatt ctgaactcgg aaatccgtcg cgtggcacgt 1020
gaactgggcg aagtggcagg tgacgttgaa gatgctctgg ttgaaattgc ggccgcactg 1080
tcagtctatc gttcgtacct gccgtttggt cgcgaacacc tggatgaagc agtggctgca 1140
gcacaggcag ctgcaccgca actggaagca gacctggcag cagttggtgc tgcactggcc 1200
gatccgggta acccggccgc actgcgcttt cagcaaacca gcggcatgat tatggcaaaa 1260
ggtgtcgaag ataatgcttt ctatcgttac ccgcgcctga ccagcctgac ggaagtgggc 1320
ggtgacccgt ctctgtttgc catcgatgct gcggccttcc atgcagctca gcgtgatcgt 1380
gcagcacgtc tgccggaaag tatgaccacg ctgaccacgc acgacaccaa acgctccgaa 1440
gatacccgtg cgcgcattac ggcactggct gaagcgccgg aacgttggcg tcgctttctg 1500
accgaagttg gcggtctgat cggcacgggt gatcgcgtcc tggaaaatct gatttggcaa 1560
gccatcgtgg gcgcatggcc ggctagtcgt gaacgcctgg aagcctatgc actgaaagca 1620
gctcgtgaag ccggcgaatc caccgattgg atcgatggtg acccggcatt cgaagaacgt 1680
ctgacccgcc tggtgacggt tgcggtcgaa gaaccgctgg tgcatgaact gctggaacgc 1740
ctggttgatg aactgaccgc ggccggctat tccaacggtc tggcagctaa actgctgcag 1800
ctgctggcac cgggtacccc ggacgtgtac cagggtacgg aacgttggga tcgcagcctg 1860
gtcgatccgg acaatcgtcg cccggtggat tttgcggccg catctgaact gctggaccgt 1920
ctggatggcg gttggcgtcc gccggtggac gaaaccggtg cagttaaaac gctggtcgtg 1980
agccgtgctc tgcgtctgcg tcgcgatcgt ccggaactgt ttaccgcata tcatccggtt 2040
acggcacgtg gtgctcaggc agaacacctg attggtttcg atcgtggcgg tgcaatcgca 2100
ctggctaccc gtctgccgct gggtctggct gcagccggcg gttggggcga caccgttgtc 2160
gatgtgggtg aacgttctct gcgcgatgaa ctgacgggcc gtgaagcgcg cggtgccgct 2220
cgtgtcgctg aactgtttgc tgactatccg gtcgcactgc tggtcgaaac ctaa 2274
<210> 2
<211> 775
<212> PRT
<213> Arthrobacter sp. Q36
<400> 2
Met Arg Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Lys Gly Phe
1 5 10 15
Thr Leu Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Pro Tyr Leu His Ser Leu Gly
20 25 30
Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser
35 40 45
Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg
50 55 60
Gly Gly Pro Glu Gly Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ala Arg Ala Ala
65 70 75 80
Gly Met Gly Val Leu Ile Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala
85 90 95
Thr Pro Ala Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Arg
100 105 110
Gln Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala Gly
115 120 125
Gly Arg Ile Arg Leu Pro Val Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp Gln
130 135 140
Leu Glu Ile Arg Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro
145 150 155 160
Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asp Ala Pro Arg Asp Val His
165 170 175
Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Ile Gly Trp Arg Arg Ala Asp Asn Glu
180 185 190
Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Gly Val Arg
195 200 205
Val Glu Ile Pro Ala Val Phe Asp Glu Ala His Gln Glu Val Val Arg
210 215 220
Trp Phe Arg Glu Asp Leu Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Pro Asp
225 230 235 240
Gly Leu Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Val Thr
245 250 255
Gly Gly Ala Tyr Leu Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Gln
260 265 270
Leu Pro Ala Ser Phe Glu Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu
275 280 285
Ala Asp Val Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Arg Gly Gln Glu Pro Leu
290 295 300
Asp Arg Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr Gln
305 310 315 320
Asp Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Arg Ile Thr Asp Gly Ile Leu His
325 330 335
Ser Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Gly Asp Ala Asn Val
340 345 350
Ser Ile Asp Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Glu Ile Ile Ala Ala Phe
355 360 365
Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Glu Val Leu Lys Glu
370 375 380
Ala Cys Glu Leu Ala Ala Arg Arg Arg Pro Glu Leu Asp Gln Ala Ile
385 390 395 400
Gln Ala Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Glu Leu Ala Arg
405 410 415
Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp
420 425 430
Thr Ala Phe Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val Gly
435 440 445
Ala Asp Pro Thr Glu Phe Ala Val Glu Pro Asp Glu Phe His Ala Arg
450 455 460
Leu Ala Arg Arg Gln Ala Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu Ser
465 470 475 480
Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ser Val
485 490 495
Ile Ser Glu Val Ala Gly Asp Trp Glu Lys Ala Leu Asn Arg Leu Arg
500 505 510
Asp Leu Ala Pro Leu Pro Asp Gly Pro Leu Ser Ala Leu Leu Trp Gln
515 520 525
Ala Ile Ala Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Tyr Tyr
530 535 540
Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Asn Trp Thr Asp
545 550 555 560
Pro Ala Pro Ala Phe Glu Glu Lys Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala Val
565 570 575
Phe Asp Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Val Glu Ala Leu Val Glu Leu
580 585 590
Leu Glu Pro Tyr Gly Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val Gln
595 600 605
Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Trp
610 615 620
Asp Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Phe Ser Phe Asp
625 630 635 640
Asp Arg Arg Ala Ala Leu Glu Gln Leu Asp Ala Gly Asp Leu Pro Ala
645 650 655
Ser Phe Thr Asp Glu Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala Leu
660 665 670
Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Thr Gly Tyr Arg Pro Val
675 680 685
Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ala Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Arg Gly
690 695 700
Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro Tyr
705 710 715 720
Gly Leu Glu Gln Ser Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu Asn
725 730 735
Thr Ala Met Lys Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Pro Gly Ala
740 745 750
Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Ser Phe Pro Val Ala Leu Leu Val
755 760 765
Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser
770 775
<210> 3
<211> 1728
<212> DNA
<213> Arthrobacter sp. Q36
<400> 3
atgaatcgcc gttttccggt ctgggctccg caagccgctc aagtgacgct ggtcgtgggc 60
caaggtcgtg ccgaactgcc gctgacgcgc gatgaaaacg gttggtgggc actgcagcaa 120
ccgtgggacg gcggtccgga cctggtggat tatggctacc tggttgatgg caaaggtccg 180
tttgcagacc cgcgttcact gcgtcagccg cgtggtgttc atgaactggg ccgcgaattt 240
gatccggctc gttatgcatg gggtgatgac ggttggcgtg gtcgtgacct gaccggtgcc 300
gtcatttacg aactgcatgt gggtaccttt acgccggaag gcacgctgga ttcggcaatc 360
cgtcgcctgg accacctggt tcgtctgggc gtggatgctg ttgaactgct gccggtcaac 420
gcgtttaatg gtacccatgg ctggggttat gatggcgtcc tgtggtacgc tgtgcacgaa 480
ccgtatggcg gtccggaagc gtaccagcgc ttcgtggatg cctgccatgc acgtggtctg 540
gcagtggttc aagacgtcgt gtataaccat ctgggtccga gtggcaatca cctgccggat 600
tttggtccgt acctgggttc cggtgcagca aacacgtggg gtgacgcgct gaatctggat 660
ggcccgctgt cagacgaagt ccgtcgctat attatcgata acgccgtgta ctggctgcgc 720
gacatgcacg cagatggtct gcgtctggat gctgttcatg cactgcgtga cgctcgtgca 780
ctgcacctgc tggaagaact ggcagctcgc gtggatgaac tggcaggtga actgggtcgt 840
ccgctgaccc tgattgcaga aagcgacctg aacgatccga aactgatccg ttctcgcgcg 900
gcccatggct atggtctgga tgcgcagtgg gatgacgatg tccatcacgc cgtgcacgca 960
aatgttaccg gtgaaacggt tggctattac gctgattttg gcggtctggg tgcgctggtg 1020
aaagtttttc aacgcggttg gttccatgat ggcacctgga gctctttccg tgaacgtcat 1080
cacggtcgtc cgctggaccc ggatattccg tttcgtcgcc tggtggcctt cgcacaggac 1140
cacgatcaag ttggtaatcg cgccgtcggc gatcgtatgt cagcacaggt tggtgaaggt 1200
tcgctggcag ctgcagcagc actggtgctg ctgggtccgt ttaccccgat gctgttcatg 1260
ggtgaagaat ggggcgcacg taccccgtgg caatttttca cgagccatcc ggaaccggaa 1320
ctgggtgaag ctacggcgcg tggccgcatt gctgaatttg cgcgtatggg ttgggatccg 1380
gcagttgtcc cggacccgca ggatccggca accttcgcac gtagtcatct ggattggtcc 1440
gaaccggaac gtgaaccgca cgcaggtctg ctggcatttt atacggatct gatcgccctg 1500
cgtcgcgaac tgccggtgga cgcaccggca cgcgaagttg acgctgatga agcgcgtggt 1560
gtgtttgctt tctctcgcgg cccgctgcgt gtcaccgtgg cactgcgtcc gggtccggtt 1620
ggcgtcccgg aacatggcgg tctggttctg gcgtatggcg aagtccgtgc tggtgcggct 1680
ggtctgcatc tggatggtcc gggtgcggcg attgtgcgtc tggaataa 1728
<210> 4
<211> 598
<212> PRT
<213> Arthrobacter sp. Q36
<400> 4
Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro
1 5 10 15
Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro
35 40 45
Glu Asp Ala Gly Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn
50 55 60
Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp
65 70 75 80
Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr
85 90 95
Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg
100 105 110
Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr
115 120 125
Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala
130 135 140
Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn
145 150 155 160
Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His
165 170 175
Glu Ala Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala
180 185 190
His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu
195 200 205
Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln
210 215 220
Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly
225 230 235 240
Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu
245 250 255
Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu
260 265 270
Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala
275 280 285
Asp Gln Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu
290 295 300
Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Glu Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His
325 330 335
Val Asn Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser
340 345 350
Leu Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly
355 360 365
Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe
370 375 380
Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp
385 390 395 400
Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro
405 410 415
Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe
420 425 430
Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Trp
435 440 445
Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala
450 455 460
Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val
465 470 475 480
Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp
485 490 495
Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr
500 505 510
Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu
515 520 525
Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu
530 535 540
Arg Phe Arg Arg Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln
545 550 555 560
Pro Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp
565 570 575
Asp Ala Val Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser
580 585 590
Ala Ala Val Val Ser Asp
595
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aataattttg tttaacttta agaaggagat atacc 35
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aataattttg tttaacttta agaaggagat at 32
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccat 37
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccata 38
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatacc 40

Claims (10)

1.一种基因，其特征在于，由编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子、核糖体结合位点序列、编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子依次连接而成。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；所述核糖体结合位点序列其核苷酸序列如SEQ IDNO:5-9任意一个所示。
3.一种重组载体，包含权利要求1或2所述基因的载体，所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子位于编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子的上游。
4.一种基因工程菌，其特征在于，包含权利要求3所述重组载体。
5.权利要求4所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括：
步骤A、获得编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因序列，以及连接核糖体结合位点序列；
步骤B、构建重组载体转化宿主菌；其中所述重组载体包含由编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子、核糖体结合位点序列、编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子依次连接而成基因，所述编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子位于编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA分子的上游。
6.权利要求4所述的基因工程菌经诱导表达获得的产物。
7.权利要求6所述产物的制备方法，其特征在于，将所述基因工程菌活化后接种于培养基中诱导表达。
8.权利要求4所述基因工程菌或权利要求6所述产物在生产海藻糖中的应用。
9.一种海藻糖的生产方法，其特征在于，以直链糊精或直链淀粉为底物，加入权利要求6所述产物转化。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述底物浓度为10％～30％；所述转化pH5.0-7.0；转化温度为40-60℃；转化时间为24-72h；所述权利要求6所述产物加入量为10～20mL/Kg干物或10～20g/Kg干物。
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