KR102274678B1 - 신규한 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ｃｅｂ－ｋｃ－００７ 균주 및 이를 포함하는 항비만 효능을 가지는 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ｃｅｂ－ｋｃ－００７ 균주 및 이를 포함하는 항비만 효능을 가지는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치에서 분리한 항비만 효능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주(수탁번호: KCCM 12127P) 또는 이의 배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주(수탁번호: KCCM 12127P) 또는 이의 배양물을 트레할로스(Trehalose), 말토덱스트린(Maltodextrin), 아가베 이눌린(Agave inulin) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 동결보호제로 동결건조한 분말 제형의 조성물을 제공한다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ｃｅｂ－ｋｃ－００７ 균주 및 이를 포함하는 항비만 효능을 가지는 조성물{Novel Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ｃｅｂ－ｋｃ－００７ and compositions having anti-obesity activity comprising the same}
본 발명은 항비만 효능을 가지는 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 이의 균주를 포함하는 항비만 조성물, 보다 상세히는 동결건조된 항비만 조성물에 관한 것이다.
김치에는 일반적으로 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 바이셀라(Weissella) 속 유산균과 같이 크게 3개의 속(Genus)에 속하는 20여 종의 다양한 유산균들이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 김치 유산균은 체내 유해균의 증식을 억제하고, 정장작용, 장의 연동운동을 촉진하여 변비나 설사, 대장암 등 장질환을 예방하는 것으로 잘 알려져 있고, 이외에도 면역력 증강, 항염증, 다이어트 등 다양한 효과가 알려져 있어, 김치 유산균을 이용한 다양한 제품들이 판매되고 있다.
김치로부터 분리한 다양한 신규 유산균을 분리하여 건강식품 등으로 이용하고자 하는 많은 연구가 이루어지고 있다.
대한민국 특허등록 제10-1972236호 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY-08을 개시하고 있고, 이는 치매의 예방 또는 치료 효능이 있음을 개시하고 있다.
대한민국 특허공개 제10-2015-0098202호는 김치로부터 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) OK56, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) OK101, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) OK169과 같은 락토바실러스속 유산균을 개시하고 있고, 이러한 유산균들은 항비만 활성, 혈중 콜레스테롤 저하 활성, 혈중 중성지질 저하 활성 또는 항산화 활성을 가짐을 개시하고 있다.
락토바실러스 플란타룸이 항비만 효능을 가지는 것은 여러 문헌에서 이미 알려져 있다.
항비만 효과를 가지는 락토바실러스 플란타룸 균주와 관련하여 대한민국 특허공개 제10-2019-0090409호는 락토바실러스 플란타룸 KC3 균주, 대한민국 특허공개 제10-2019-0090407호는 락토바실러스 플 란타룸 K10 균주, 대한민국 특허공개 제10-2019-0068025호는 락토바실러스 플란타룸 BK-021 균주를 개시하고 있으나, 이러한 유산균은 생존환경에 따라 그 효능에 차이가 있는 만큼 보다 우수한 유산균의 지속적인 개발이 요구된다.
한편, 유산균 제품은 생균 또는 사균 형태로 이용될 수 있고, 주로 액상이나 분말 제형으로 이용될 수 있다. 유산균의 분말 제형은 제품의 유통기간, 복용 면에서 유리하다. 유산균의 분말 제형은 일반적으로 사균은 열 건조의 방법으로 제조되는 반면, 생균은 생존율을 높이기 위해 동결건조의 방법으로 제조된다. 동결건조에 있어, 동결보호제(동결 부형제)는 유산균의 생존에 있어 매우 중요한 요소이다. 동결보호제는 이미 다양한 성분들이 알려져 있으나, 구체적인 유산균의 종류에 따라 사용되는 동결보호제의 종류, 구성, 함량은 유산균의 생존율에 차이를 보인다. 따라서, 유산균의 동결건조 최적화에 대해 지속적인 연구가 필요하다.
대한민국 특허공개 제10-2015-0098202호 대한민국 특허등록 제10-1972236호 대한민국 특허공개 제10-2019-0090409호 대한민국 특허공개 제10-2019-0090407호 대한민국 특허공개 제10-2019-0068025호
본 발명의 목적은 항비만 효능이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 및 이의 균주를 포함하는 항비만 조성물을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 균주의 생존율 향상에 최적화된 동결건조 제형을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항비만 효능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주(수탁번호: KCCM 12127P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ceb-kc-007 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 효능을 가지는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 상기 조성물은 분말 제형, 건조 제형 또는 액상 제형일 수 있다.
한편, 일 양태에서 상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주를 동결보호제 존재하에서 동결건조시켜 제조된 조성물일 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 트레할로스(Trehalose), 말토덱스트린(Maltodextrin), 아가베 이눌린(Agave inulin) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 트레할로스 및 말토덱스트린 2종을 포함할 수 있고, 제한되지는 않으나 바람직하게는 전체 동결보호제 중에서 트레할로스 20~80 중량%, 말토덱스트린 20~80 중량%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 트레할로스 20~40 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 트레할로스 약 30 중량%, 말토덱스트린은 60 중량%일 수 있다.
한편, 일 양태에서 상기 동결보호제는 트레할로스, 말토덱스트린 및 아가베 이눌린 3종을 포함할 수 있고, 제한되지는 않으나 바람직하게는 전체 동결보호제 중에서 트레할로스 20~60 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%, 아가베 이눌린 5~15 중량%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 트레할로스 20~40 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%, 아가베 이눌린 5~15 중량%일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 트레할로스 약 30 중량%, 말토덱스트린 60 중량%, 아가베 이눌린 약 10 중량%일 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 항비만 효능을 가지는 조성물 전체 중량에 대하여 바람직하게는 0.1~1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량%일 수 있으나, 상기 함량으로 제한되는 것은 아니다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 항비만 효능을 가지는 조성물은 건강보조식품, 건강기능식품, 의약품, 식품첨가제 등으로 이용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주는 항비만 효능이 매우 우수하여 비만 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있으며, 본 발명에 따른 동결건조 제형은 유산균 생존율이 매우 우수하여 항비만 효능을 극대화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 16S rRNA 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 16S rRNA 염기서열 계통도이다.
도 4는 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007의 용혈 활성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007의 젤라틴 액화 반응 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007의 growth curve를 나타낸 그래프이다.
도 7(a)는 본 발명의 동물모델에 따라, 4주 동안 식이로 비만 유도된 C57BL/6 마우스 사진이다. (NFD: 정상식이군, HFD:고지방식이 대조군, P10, P20, P30: 유산균 식이군(유산균 미투여)
도 7(b)는 도 7(a)의 비만 유도 후 4주 동안 유산균 경구 투여에 따른 C57BL/6 마우스 사진이다. (NFD: 정상식이군, HFD:고지방식이 대조군, P10, P20, P30: 유산균 식이군(유산균 투여)
도 8은 본 발명의 유산균 경구투여 후 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 유산균 투여에 따른 조직무게 변화를 나타낸 그래프이다. (a) 간, (b) 부고환지방, (c) 후복막지방, (d) 갈색지방, (e) 신장, (f) 췌장.
도 10은 본 발명에 따른, 간 조직의 염색(H&E staining) 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른, 부고환 지방조직의 염색(H&E staining) 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른, 후복막 지방조직 염색(H&E staining) 결과이다.
도 13은 본 발명의 유산균 투여에 따른 AST와 ALT 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 유산균 투여에 따른 (a) 총 콜레스테롤, (b) triglyceride, (c) LDL-콜레스테롤, (d) HDL-콜레스테롤의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 유산균 투여에 따른 혈당 변화를 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 유산균 투여에 따른 부고환 지방조직에서 비만관련 단백질 발현을 나타내는 Western blot 결과이다.
도 17은 본 발명의 유산균 투여에 따른 후복막 지방조직에서 비만관련 단백질 발현을 나타내는 Western blot 결과이다.
도 18은 본 발명의 동물실험에서, 간 조직에서 비만 관련 유전자 발현 결과를 나타내는 그래프이다. (a) ACC1, (b) aP2, (c) FAS, (d) C/EBPα, (e) PPARγ, (f) SREBP1
도 19는 본 발명의 동물실험에서, 부고환 지방조직에서 비만관련 유전자 발현 결과를 나타내는 그래프이다. (a) ACC1, (b) aP2, (c) FAS, (d) C/EBPα, (e) PPARγ, (f) SREBP1
도 20은 본 발명의 동물실험에서, 후복막 지방조직에서 비만 관련 유전자 발현 결과를 나타내는 그래프이다. (a) ACC1, (b) aP2, (c) FAS, (d) C/EBPα, (e) PPARγ
도 21은 본 발명에 따른 Cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 분비량 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 있어서 용어“유산균”은 균주의 종류가 언급되지 않는 한, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007을 의미한다.
본 발명에 있어서 용어 “항비만”은 비만의 억제, 예방 또는 치료를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 성분 함량 설명에서 용어 “약”은 언급되는 함량 수치의 20% 범위 내에서 가감될 수 있다. 예를 들어, “약 20 중량%”는 20±4중량%의 의미일 수 있다.
본 발명자는 항비만 효능을 가지는 유산균 및 이의 제형을 개발하기 위하여, 한국 전통방식으로 담근 다양한 종류의 김치들로부터 유산균들을 분리 동정하고, 이중 항비만 효능이 가장 우수한 유산균을 선발하였다.
본 발명은 항비만 효능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주(수탁번호: KCCM 12127P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ceb-kc-007 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 효능을 가지는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 상기 조성물은 분말 제형, 건조 제형 또는 액상 제형일 수 있다.
한편, 일 양태에서 상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Ceb-kc-007 균주를 동결보호제 존재하에서 동결건조시켜 제조된 조성물일 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 트레할로스(Trehalose), 말토덱스트린(Maltodextrin), 아가베 이눌린(Agave inulin) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 트레할로스 및 말토덱스트린 2종을 포함할 수 있고, 제한되지는 않으나 바람직하게는 전체 동결보호제 중에서 트레할로스 20~80 중량%, 말토덱스트린 20~80 중량%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 트레할로스 20~40 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 트레할로스 약 30 중량%, 말토덱스트린은 60 중량%일 수 있다.
한편, 일 양태에서 상기 동결보호제는 트레할로스, 말토덱스트린 및 아가베 이눌린 3종을 포함할 수 있고, 제한되지는 않으나 바람직하게는 전체 동결보호제 중에서 트레할로스 20~60 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%, 아가베 이눌린 5~15 중량%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 트레할로스 20~40 중량%, 말토덱스트린 50~70 중량%, 아가베 이눌린 5~15 중량%일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 트레할로스 약 30 중량%, 말토덱스트린 60 중량%, 아가베 이눌린 약 10 중량%일 수 있다.
일 양태에서, 상기 동결보호제는 항비만 효능을 가지는 조성물 전체 중량에 대하여 바람직하게는 0.1~1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량%일 수 있으나, 상기 함량으로 제한되는 것은 아니다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 항비만 효능을 가지는 조성물은 건강보조식품, 건강기능식품, 의약품, 식품첨가제 등으로 이용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 기술적 사상을 최적화하여 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 기술적 사상이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균의 분리 및 동정
(1) 김치유래 유산균의 분리
한국 전통 김치에서 유산균의 분리를 위하여 원재료 및 제조방법이 다른 갓김치, 고들빼기김치, 배추김치, 부추김치, 열무김치 및 파김치 등 총 6종류의 한국 토종 김치를 사용하였다.
김치에서 유산균을 분리하기 위해 MRS 평판배지에 균질화된 김치 시료를 단계 희석 후 접종하여 35℃에서 24~72시간 배양하였다. 배양 후 colony의 형태, 색 및 크기에 따라 순수 분리 및 계대배양 하여, 내산성이 강한 균주를 선발하였다.
도 1은 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 현미경 사진이다.
(2) 김치유래 유산균의 동정(염기서열 분석, 계통도 분석)
상기 선발된 균주의 염기서열 분석은 16S rRNA의 27F (5’’1492R (5’’primer를 사용하였다. 증폭된 PCR products는 ㈜제노텍에 의뢰하여 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 것으로 나타났다.
도 2는 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 16S rRNA 염기서열이다.
상기 선발된 균주의 16S rRNA 염기서열 자료를 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST search 하여 ‘’가 높은 순으로 배열 후 상위 15개 종에 대한 계통도를 Neighbor joining 법으로 상동성을 분석한 결과 신규 Lactobacillus plantarum 아종으로 판명되어 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 로 명명하였고, 상기 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주는 한국미생물보존센터에 2017년 10월 16일자로 수탁되었다(수탁번호: KCCM12127P).
(3) Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb - kc -007의 생화학적 특성(API kit 분석)
분리 동정한 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 균주의 생화학적 특성을 확인하기 위하여 유산균은 API 50CHL kit를 사용하였으며, 배양 중 발현되는 효소의 종류를 확인하기 위하여 API ZYM kit를 사용하여 분석하였다. 실험방법 및 결과 분석은 API kit protocol 및 결과 기준표에 따라 실시하였다.
① API 50 CHL kit
API 50 CHL kit를 이용하여 본 발명에서 분리된 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 의 생화학적 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb - kc - 007 의 생화학적 분석 결과
Tube Active ingredient Result Tube Active ingredient Result
1 Glycerol - 26 Salicin +++
2 Etrythritol - 27 D-celiobiose +++
3 D-arabinose - 28 D-maltose +++
4 L-arabinose + 29 D-lactose +++
5 D-ribose + 30 D-melibiose +++
6 D-xylose - 31 D-saccharose(sucrose) +++
7 L-xylose - 32 D- trehalose +++
8 D-adonitol - 33 Inulin -
9 Methyl-β-D-xylopyranoside - 34 D- melezitose +++
10 D- galactose +++ 35 D-raffinose -
11 D-glucose +++ 36 Amidon(starch) -
12 D-fructose +++ 37 Glycogen -
13 D- mannose +++ 38 Xylitol -
14 L-sorbose - 39 Gentiobiose ++
15 L-rhamnose - 40 D-uranose -
16 Dulcitol - 41 D-lyxose -
17 Inositol - 42 D-tagatose -
18 D- manitol +++ 43 D-fucose -
19 D- sorbitol +++ 44 L-fucose -
20 Methyl-α-D-mannopyranoside - 45 D-arabitol -
21 Methyl-α-D-glucopyranoside - 46 L-arabitol -
22 N- acetylglucosamine +++ 47 Potassium gluconate +
23 Amygdalin +++ 48 Potassium 2-ketogluconate -
24 Arbutin +++ 49 Potassium 5-ketogluconate -
25 Esculin ferric citrate -
② API ZYM kit
API ZYM kit를 이용하여 본 발명에서 분리된 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 가 발현하는 효소에 대하여 분석하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb - kc - 007 가 발현하는 효소
No. Enzyme Assayed For Result No. Enzyme Assayed For Result
1 Control - 11 Acid phospatase ++
2 Alkaline phosphatase + 12 Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase ++
3 Esterase (C4) + 13 α-galactosidase -
4 Esterase Lipase (C8) ++ 14 β-glucuronidase -
5 Lipase(C14) - 15 β-glucosidase -
6 Leucine arylamidase +++ 16 α-glucosidase ++
7 Valine arylamidase ++ 17 β-glucosidase +++
8 Crystine arylamidase + 18 N-acetyl-β-glucosaminidase +++
9 Trypsin - 19 α-mannosidase -
10 α-chymotrypsin - 20 α-fucosidase -
표 2에 보이는 바와 같이 총 20종의 효소 중 13종이 확인되었고, 유해 효소의 발현은 확인되지 않았으며, 주로 당 이용에 관련된 효소의 활성이 큰 것으로 확인되었다.
실험예 1: Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb - kc -007 균주의 내산성 , 안전성 및 최적 배양조건
(1) 내산성
본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 의 내산성 시험을 위해 MRS broth를 pH 7 및 pH 2로 각각 제조하여 9mL test tube에 분주하였다. 유산균은 37℃/18h 배양하여 원심분리 후 phosphate buffer로 2회 세척하고 최종적으로 cell 농도를 OD600 1.0으로 조정하였다. 유산균 1mL를 pH 2.0 및 7.0 tube에 각각 접종 및 Vortex로 균질화하였다. 37℃/3h 배양 후 1mL를 분취하여 단계 희석 후 MRS agar plate에 접종 및 배양하여 생균수를 확인하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
pH 7 pH 2
CFU/mL 3.8×107 1.7×105
log CFU/mL 7.6 5.2
유산균의 내산성 시험결과 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007은 pH 2에서도 1.7×105 CFU/mL의 생균수를 유지하여 매우 강한 내산성을 나타냈으며, pH 7 대비 pH 2의 생존율은 약 0.45%로 확인되었다.
(2) 용혈활성
용혈 활성은 sheep blood agar plate에 유산균을 접종 및 37℃/48h 배양 후 콜로니 주변에 용혈현상으로 인해 생성된 환의 형태 관찰하여 용혈 활성을 확인하여 도 4에 나타내었다. 적혈구를 용해하는 용혈 활성을 시험한 결과 용혈 활성이 없는 것으로 확인되었다.
(3) 젤라틴 액화반응
젤라틴 액화반응은 MRS broth에 beef extract(0.3%), peptone(0.5%), gelatin(12%)를 첨가하여 제조하였다. 유산균을 MRS 배지에서 37℃/24h 배양 후 젤라틴이 첨가된 배지에 접종하였다. 유산균이 접종된 배지는 37℃의 온도에서 48시간 배양하여 성장을 확인하였고, 총 7일간 관찰하였다. 7일 후 4℃ 냉장 상태에서 사면으로 방치 및 응고 여부를 확인하였다.
도 5는 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007의 젤라틴 액화 반응 결과를 나타낸다.
도 5에 보이는 바와 같이 유해 효소 중의 하나인 gelatinase의 분비 여부를 확인하기 위하여 젤라틴 액화 반응을 시험한 결과 액화 반응이 관찰되지 않아 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007은 안전한 것으로 확인되었다.
(4) 최적 배양조건
김치에서 분리 및 선발된 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007의 최적배양 조건에서 배지는 Lactobacillus 속의 영양요구성이 잘 갖춰진 MRS를 사용하였다. 온도는 35℃±2℃로 설정하였으며, 호기 및 혐기 조건에서의 생장능을 생균수로 확인하였다. MRS broth에 실리스토퍼로 마개하여 호기적 배양조건으로 설정하였고, 멸균 유동파라핀을 MRS broth 상층으로부터 2cm 이상 채워 혐기 배양조건으로 설정하였다. 각각의 조건에서 18시간 배양 후 생균수를 측정하여 최적 배양조건을 확인하였다.
호기 및 혐기 조건
호기 혐기
CFU/mL 2.8×109 3.6×10 9
pH 4.25 4.22
유산균 배양 시 통기 여부에 따른 생장 활성
호기 혐기
Figure 112020073896942-pat00001
CFU/mL 2.8×109 3.6×10 9
pH 4.25 4.22
MRS 배지를 사용하여 호기 및 혐기 조건으로 실험하였다. 실험결과 호기 조건보다 혐기 조건에서 보다 높은 생균수를 나타내는 것으로 확인되었다.
(5) Growth curve
최적 배양조건으로 확인된 MRS 배지 및 혐기 조건에서 35℃의 온도로 총 26시간 동안 배양하면서 2시간 간격으로 시료를 채취하여 생균수 및 pH를 측정하여 유산균의 growth curve를 도 6에 나타내었다. 도 6에 보이는 바와 같이 접종 후 0~12시간의 유도기를 거쳐, 12~23시간까지 대수기를 유지하였으며, 23~24시간 후 정지기 및 25시간 이후 사멸하는 곡선을 나타냈다. pH 변화는 접종 직후 pH6.8에서 대수기까지 지속적으로 감소하였으며, 대수기부터 사멸기 이후에는 pH4.3 수준을 유지하였다.
실시예 2: Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb - kc -007의 분말 제형화 (동결건조)
(1) 동결보호제의 종류에 따른 고온에서의 생존율 시험 (40℃, 습도 70RH% )
본 발명에서 분리동정된 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007를 배양 후 원심분리하고, 수세한 다음 다시 원심분리하여 cell harvest를 수행하였다. 유산균 분말 제형화를 위해 동결보호제의 종류를 달리하여 처리 후 생균수 및 저장 기간에 따른 생존율을 분석하여 가장 적합한 동결보호제를 선정하고자 하였다. 동결보호제로는 trehalose, maltodextrin, Agave inulin 및 skim milk를 사용하였다. Cell harvest된 균주에 각각의 동결보호제 처리 후 동결건조를 실시하였으며, 마쇄 후 냉동보관하였다. 이후 비교적 높은 온도인 40℃, 습도 70RH%의 가혹한 조건에서 0일, 3일, 7일 후 생균수를 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
동결보호제 단독 처리에 따른 저장 안정성(n=5)
유기농 원료 0일 3일 7일
Skim milk(20%) CFU/mL 2×1011 4.8×106 0
생존율(%) 100 33.5 0
Saline buffer(0.85%) CFU/mL 2×1011 0 0
생존율(%) 100 0 0
Trehalose(20%) CFU/mL 2.0×1011 6.7×1010 2×1010
생존율(%) 100 33.5 10
Maltodextrin(20%) CFU/mL 2×1011 5×1010 8.7×109
생존율(%) 100 25 4.4
Agave inulin(20%) CFU/mL 2×1011 3.7×1010 5×109
생존율(%) 100 18.5 2.5
표 6에 보이는 바와 같이 동결보호제 처리 실험 결과 trehalose > maltodextrin > Agave inulin 순으로 높은 생존율을 나타냈으며, skim milk는 7일 차에 생균수가 확인되지 않아 보존제로서의 역할이 미미할 것으로 판단하여 추가 실험에서는 제외하였다.
(2) 복합 동결보호제 처리 후 실온에서의 생존율 시험 (20~25℃, 55~ 60RH% )
유산균에 trehalose, maltodextrin, Agave inulin 총 3가지 동결보호제의 비율을 달리하여 복합처리하고 상기와 같은 방법으로 동결건조한 다음, 20~25℃의 실온 및 55~60RH% 습도에서 0일, 3일, 7일 후 생균수를 측정하여 생균수 및 저장 기간에 따른 생존율을 분석하였다. 복합 동결보호제의 비율은 하기 표 7과 같으며, 0.85% saline buffer는 동결보호제를 처리하지 않은 대조구로 사용하였다.
복합 동결보호제의 비율에 따른 저장 안정성(n=5)
유기농 원료 0일 3일 7일
Trehalose(1%) CFU/mL 2.0×1011 9.0×1010 9.6×109
생존율(%) 100 45 4.8
복합(1%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=60:30:10		 CFU/mL 2.0×1011 9.2×1010 1.5×1010
생존율(%) 100 46 7.5
복합(1%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=50:40:10		 CFU/mL 2.0×1011 1.1×1011 5.5×1010
생존율(%) 100 55 27.5
복합(1%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=40:50:10		 CFU/mL 2.0×1011 1.2×1011 6.0×1010
생존율(%) 100 60 30
복합(1%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=30:60:10		 CFU/mL 2.0×1011 1.2×1011 9.8×1010
생존율(%) 100 60 49
Saline buffer(0.85%) CFU/mL 2.0×1011 4.0×106 2.0×103
생존율(%) 100 0.02 0
상기 표 7에 보이는 바와 같이 복합 동결보호제는 Trehalose 대비 Maltodextrin이 증가할수록 안정성이 우수한 것으로 나타났으며, Trehalose : Maltodextrin : Agave inulin = 30 : 60 : 10 비율의 동결보호제로 제형화했을 때 실온에서의 안정성이 총 7일 동안 가장 높게 나타났다.
(3) 유산균의 동결보호제의 농도에 따른 실온 생존율 시험 (20~25℃, 55~ 60RH% )
복합 동결보호제의 비율을 Trehalose : Maltodextrin : Agave inulin = 30 : 60 : 10으로 고정하고 사용 농도를 0.2%, 0.5% 및 1.0%로 달리하여 상기와 동일한 방법으로 동결건조하고, 20~25℃의 실온 및 55~60RH%의 습도에서 7일간 생존율 시험하여 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
복합 동결 보존제의 농도에 따른 저장 안정성(n=5)
유기농 원료 0일 3일 7일
복합(1%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=30:60:10		 CFU/mL 2.0×1011 1.2×1011 9.8×1010
생존율(%) 100 60 49
복합(0.5%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=30:60:10		 CFU/mL 2.0×1011 2.0×1011 1.9×1011
생존율(%) 100 100 95
복합(0.2%)
Trehalose:Maltodextrin:
Agave inulin=30:60:10		 CFU/mL 2.0×1011 1.0×1011 5.0×1010
생존율(%) 100 50 25.0
상기 표 8에 보이는 바와 같이 복합 동결보호제의 농도를 0.5% 사용 시 가장 높은 생존율을 나타내어 최적 동결보호제 비율 및 사용 농도로 설정하였다.
(4) 복합 동결보호제의 온도에 따른 저장 안정성(n=5)
유산균에 Trehalose : Maltodextrin : Agave inulin = 30 : 60 : 10 비율의 복합 동결 보존제 0.5%를 처리하여 상기와 같은 방법으로 동결건조 후 저온(4℃), 실온(20~25℃) 및 고온(40℃)에서 0일, 3일, 7일 후 생균수를 분석하여 하기 표 9에 나타내었다.
김치 유래 유산균의 최적 복합 동결보호제 처리 후 온도별 저장 안정성(n=5)
0일 3일 7일
4℃, 50RH% CFU/mL 2.0×1011 2.0×1011 2.0×1011
생존율(%) 100 100 100
20~25℃, 55~60RH% CFU/mL 2.0×1011 2.0×1011 1.9×1011
생존율(%) 100 100 95
실험 결과 저온 및 실온에서는 저장 7일까지 1000억 이상의 생균수를 유지하여 매우 높은 저장 안정성을 유지하였다.
(5) 최적 제형의 제조 및 저장
유산균을 37℃에서 배양 후 대수기에서 정지기로 이동되기 전인 약 18시간 전후로 cell harvest 하여 가장 활력이 있는 단계의 cell을 확보하였다. 배양 중간에 적정 pH 유지를 위해 5N NaOH로 조절하였으며, 배양 중 소모되는 당을 보충하기 위하여 5%의 포도당을 첨가하였다. 유산균 cell harvest 후 동결건조를 위해 Trehalose : Maltodextrin : Agave inulin = 30 : 60 : 10 비율의 복합 동결보호제 0.5%를 처리하였고, 4일 동안 동결건조하였으며 마쇄 후 -20℃에 냉동보관 하였다.
동결건조 제형 유산균의 제조 후 생균수를 분석한 결과 하기 표 10에 보이는 바와 같이 그람 당 약 3,900억으로 확인되었다. 원말 규격에 대해 3,000억 CFU/g으로 표준화 가능할 것으로 판단되었다.
김치 유래 유산균의 동결건조 제형 생균수 분석
시험 검사항목 시험 검사 결과
1 2 3 평균
생균수(CFU/g) 3.8×1011 4.0×1011 3.9×1011 3.9×1011
실험예 2: 유산균 투여에 따른 마우스의 체중, 식이섭취량 및 조직무게 변화 측정
김치에서 유래한 유산균인 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007을 MRS로 배지로 37℃의 온도에서 12시간 배양 후 cell harvest 및 동결보호제를 처리하여 동결건조하였다. 유산균의 사용 농도는 1.0×109, 3.0×109, 5.0×109 CFU/mouse로 선정하였다.
(1) 마우스의 비만 유도 실험
실험에 사용한 동물은 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 (주)오리엔트바이오로부터 구입하였으며, 1주일 적응 기간을 가진 후 몸무게를 측정하여 그룹화하였다. 정상 사료와 고지방 사료는 (주)두열바이오텍으로부터 구입하였다.
실험 그룹은 정상식이군(NFD), 고지방식이 대조군(HFD) 및 본 발명의 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ceb-kc-007 동결건조 식이군(유산균 식이군)으로 구성된 3개 군으로 설정하였다.
정상식이군에는 정상 사료(10% kcal/diet)를 4주 동안 공급하였고, 고지방식이 대조군과 유산균 식이군은 고지방 사료(45% kcal/diet)를 4주 동안 공급하여 비만을 유도시켰다(표 11).
마우스의 비만 유도 설계
실험군 NFD HFD 유산균 ( Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb-kc-007)
P10 P30 P50
식이
(kcal/diet)		 정상 사료
(10%)		 고지방사료
(45%)		 고지방사료
(45%)		 고지방사료
(45%)		 고지방사료
(45%)
실험 기간 4주 동안 고지방식이를 섭취한 C57BL/6 마우스에서 비만이 유도되었는지 살펴보기 위하여 호흡 마취제를 이용하여 관찰하였다.
도 7(a)는 본 발명의 동물모델에 따라, 4주 동안 식이로 비만 유도된 C57BL/6 마우스 사진이다. (NFD: 정상식이군, HFD:고지방식이 대조군, P10, P20, P30: 유산균 식이군(유산균 미투여).
마우스 관찰 결과, 정상식이군(NFD)보다 고지방식이 (HFD)를 섭취한 실험군에서 대체적으로 체중이 증가하는 것을 확인하였다.
(2) 비만 유도 후 유산균 식이 실험
4주간의 비만 유도 후, 정상식이군은 normal diet와 함께 100uL DPBS을 같이 경구투여하였고, 고지방식이 대조군에는 45% kcal/diet를 제공하면서 100uL DPBS을 같이 경구투여하였다. 유산균 이용 소재 식이군에게는 고지방식이를 급여하면서 100uL의 DPBS에 용해된 P10, P30, P50을 4주간 경구 투여하였다(표 12).
각 실험에 쓰이는 실험동물은 물과 실험식이(정상, 고지방 식이)를 자유로이 먹이면서 주 2회 동일한 시간대에 식이섭취량과 체중을 측정하였다. 식이효율 (Food efficiency ratio, FER)은 실험 기간에 성장한 체중 증가량을 같은 기간 동안 섭취한 식이의 양으로 나누어 계산하였다.
비만 유도 후 식이 설계
실험군 NFD HFD 유산균 ( Lactobacillus plantarum subsp . plantarum Ceb-kc-007)
P10 P30 P50
경구투여량
(100 uL/mouse)		 DPBS DPBS DPBS + 유산균
1.0×109
(CFU/mouse)		 3.0×109
(CFU/mouse)		 5.0×109
(CFU/mouse)
식이
(kcal/diet)		 정상 사료
(10%)		 고지방 사료
(45%)		 고지방 사료
(45%)		 고지방 사료
(45%)		 고지방 사료
(45%)
도 7(b)는 도 7(a)의 비만 유도 후 4주 동안 유산균 경구 투여에 따른 C57BL/6 마우스 사진이다. (NFD: 정상식이군, HFD:고지방식이 대조군, P10, P20, P30: 유산균 식이군(유산균 투여)
(3) 유산균 투여에 따른 마우스의 체중 변화 측정
4주 동안 정상식이와 고지방식이를 섭취한 C57BL/6 마우스에 유산균을 4주 동안 농도별로 경구투여를 진행하였다. 경구투여는 주 5일 같은 시간대에 투여하였으며 고지방식이 시작 후 29일부터 경구투여를 진행하였다. 그 결과, 부검 전(54일)에 마우스의 체중 비교 시 고지방식이만 섭취한 마우스와 유산균(P10~P50)이 함께 투여된 마우스의 체중에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나 유산균 투여량에 따라 농도 의존적으로 체중이 감소하는 경향은 확인할 수 있었다(표 13 및 도 28).
유산균 투여에 따른 마우스 체중 변화(g, 평균±표준편차)
Days Sample
NFD HFD P10 P30 P50
1 20.78±0.68 21.27±1.00 21.28±0.51 21.10±0.68 21.04±0.91
15 23.75±0.92 26.29±1.23 27.59±1.31 26.78±1.31 26.11±0.97
22 24.48±1.12 29.36±0.80 29.51±1.37 29.01±2.01 28.13±0.74
29 25.80±1.91 31.10±1.64 31.57±0.60 31.19±2.03 31.15±0.88
33 26.83±1.26 33.27±1.32 32.98±1.34 32.07±2.32 30.95±1.20
36 27.53±1.29 32.78±1.49 33.56±1.44 32.85±2.32 31.49±1.14
40 27.81±1.21 33.41±1.52 33.64±1.16 33.6±2.66 32.45±1.31
43 27.82±0.68 33.52±0.54 33.75±0.56 33.47±2.45 32.31±1.34
47 27.96±1.15 33.78±0.89 33.89±0.13 32.87±1.30 32.64±0.54
50 28.16±1.43 34.00±0.27 34.19±0.32 32.62±1.39 32.58±0.57
54 28.50±1.26 34.21±1.23 34.46±0.38 33.27±1.30 32.93±0.18
(4) 유산균 투여에 따른 마우스의 식이섭취량 및 식이효율 측정
비만 유도 기간 마지막 날인 29일에 마우스의 무게를 측정한 후 유산균을 경구투여하면서 식이섭취량을 주 2회 측정하였고(표 14), 체중 변화와 식이섭취량을 이용하여 식이효율(FER, %)을 계산하였다. 그 결과, 대조군인 고지방식이군에 비해 유산균(P10~P50)을 섭취한 식이군에서 식이 효율이 감소하는 것으로 나타났다(표 15).
비만유도기간 후 식이섭취량 측정(g/mouse)
Days Sample
NFD HFD P10 P30 P50
29 7.73 6.88 7.79 7.50 7.51
33 17.45 14.67 19.26 16.76 15.36
36 24.93 21.25 25.71 23.63 22.45
40 33.21 28.78 34.01 31.82 30.76
43 39.77 35.11 41.15 38.29 37.60
47 47.94 42.37 49.28 46.10 46.55
50 46.45 40.95 47.62 44.37 45.13
54 45.30 40.90 44.05 43.13 45.72
식이효율 변화(FER, % )
Days Groups
NFD HFD P10 P30 P50
29 17.0 25.3 26.5 29.1 40.2
33 13.4 26.1 18.0 18.3 18.4
36 12.2 16.1 15.8 16.2 15.0
40 10.0 14.1 12.2 14.4 14.1
43 8.4 11.8 10.3 11.6 11.1
47 7.2 10.4 8.9 8.4 9.7
50 7.9 11.3 9.8 8.1 9.9
54 8.9 11.9 11.2 9.9 10.5
(5) 유산균 투여에 따른 마우스 조직들의 무게 변화
유산균을 4주간 농도별로 경구 투여한 뒤 부검을 진행하여 간, 부고환지방, 후복막지방, 갈색지방, 신장, 췌장을 채취하여 무게를 측정하여 도 9에 나타내었다.
도 9에 보이는 바와 같이, 간과 췌장은 중간농도와 고농도(3.0×109, 5.0×109 CFU/mouse)에서 HFD군 대비 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고, 부고환지방과 갈색지방은 고농도(3.0×109, 5.0×109 CFU/mouse)에서 HFD군 대비 유의적으로 감소하였다. 후복막지방과 신장은 모든 유산균 투여군(P10~P50)에서 HFD군 대비 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고, 농도 의존적인 경향으로 나타났다.
실험예 3: 간 및 지방조직의 형태학적 관찰 (H&E staining)
실험이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 뒤 isoflurane 흡입마취제로 희생시킨 후 간과 부고환 주위 지방조직을 채취하여 중량을 측정하였으며, 10% formalin solution으로 세포를 고정하여 조직학적 분석 시까지 보관하였다. 포르말린 용액에 의하여 고정된 간 조직은 농도별 에탄올 용액 (70, 80, 90, 95, 100%)에 순차적으로 담가 탈수시킨다. 조직에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 xylene용액에 담근 다음, 꺼내어 굳힌다. 조직을 5 um으로 자른 뒤 슬라이드로 옮겼다. hematoxylin solution을 10분간 침지한 후, 증류수로 5분간 세척 하였다. 1% HCl-EtOH에 5번 담갔다가 증류수로 3분간 세척 하였다. 그 다음, Eosin solution을 2분 동안 침지한 뒤 염색된 조직을 농도별 에탄올 용액에 순차적으로 담가 탈수시켰다. Xylene에 침지시킨 뒤 슬라이드 위에 고정시켜 현미경으로 확인하였다.
간 조직, 부고환 지방조직 및 후복막 지방조직에서 체지방 감소를 확인하기 위하여 H&E staining을 진행하여 조직 내 지방축적, 지방세포의 크기를 관찰하여 그 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
(1) 간 조직의 형태학적 관찰 (H&E staining)
도 10은 본 발명에 따른, 간 조직의 염색(H&E staining) 결과이다. 도 10에 보이는 바와 같이, 간 조직에서 정상식이군(NFD)과 고지방식이군(HFD)을 비교했을 때 고지방식이군에서 지방구의 크기가 증가하여 비만이 유도되었음을 확인하였다. 유산균(P10~P50)을 농도별로 경구 투여 진행한 결과, 농도가 증가할수록 지방구의 크기가 작아지는 것을 확인하였다.
(2) 부고환 지방조직의 형태학적 관찰 (H&E staining)
도 11은 본 발명에 따른, 부고환 지방조직의 염색(H&E staining) 결과이다. 도 11에 보이는 바와 같이, 유산균(P10~P50)을 농도별로 경구 투여하여 부고환 지방조직의 지방구를 관찰한 결과, 농도변화에 따른 지방구의 크기의 변화는 관찰되지 않았으나, P50에서는 지방구가 HFD 대비 약간 줄어든 것으로 나타났다.
(3) 후복막 지방조직의 형태학적 관찰 (H&E staining)
도 12는 본 발명에 따른, 후복막 지방조직 염색(H&E staining) 결과이다. 도 12에 보이는 바와 같이, 후복막 지방조직의 지방구를 관찰한 결과, 유산균(P10~P50)의 투여 농도가 증가함에 따라서 지방구의 크기가 감소하는 것으로 나타났다.
실험예 4: 혈청 분석 및 혈당 조절 여부 확인
실험이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 뒤 isoflurane 흡입마취제로 희생시켜 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 4℃, 3,000rpm/15min 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.
원심 분리한 혈청으로 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), glucose, total cholesterol (T-CHO), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), 및 triglyceride (TG)을 분석하였다. 또한, 혈당 측정기를 이용하여 혈당조절 여부를 확인하여 도 13 내지 도 15에 나타내었다.
도 13은 본 발명의 유산균 투여에 따른 간 독성 (AST와 ALT) 변화를 나타내는 그래프이다. 도 13에 보이는 바와 같이, 간 독성(ALT, AST) 확인 결과, 본 발명의 유산균에서는 간 독성이 없는 것으로 확인되었다.
도 14는 본 발명의 유산균 투여에 따른 (a) 총 콜레스테롤, (b) triglyceride, (c) LDL-콜레스테롤, (d) HDL-콜레스테롤의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 14에 보이는 바와 같이, 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤은 control인 HFD군 대비해서 유산균 P30과 P50을 투여하였을 때 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고, Triglyceride의 경우에는 P50에서 HFD군 대비 유의적으로 감소하였으며, HDL-콜레스테롤은 P10~P50을 투여하였을 때 모두 HFD군 대비해서 유의적으로 상승한 것으로 나타났다.
도 15는 본 발명의 유산균 투여에 따른 혈당 변화를 나타내는 그래프이다. 도 15에 보이는 바와 같이, 혈당 (Glucose)의 경우 P50에서만 HFD군 대비 유의차가 있는 것으로 확인되었다.
실험예 5: 비만 관련 바이오마커의 단백질 분석
효모 발효 서목태 이용 소재에 의한 지방분해 관련 단백질 변화량을 Western blot 방법을 이용해서 확인하였다. 관찰하고자 하는 단백질은 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c이다. 지방조직을 lysis buffer+protease inhibitor cocktail+phosphatase inhibitor cocktail 혼합액으로 용해시킨 후 단백질 정량을 진행하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동을 진행하였다. 단백질 분리 후 0.2 uM PVDF membrane을 이용하여 단백질을 transfer하였다. 그 후, membrane을 5% BSA(Bovine serum albumin)으로 1시간 blocking 하였다. Blocking 과정 후 1차 항체 반응을 1:1000으로 overnight 처리한 후 TBST로 washing하였다. 다음으로 2차 항체 반응을 1:2000으로 2시간 처리하고 TBST로 세척 하였다. ECL solution을 이용해 X-ray film을 이용하여 단백질 발현을 측정하여 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 16은 본 발명의 유산균 투여에 따른 부고환 지방조직에서 비만관련 단백질 발현을 나타내는 Western blot 결과이다. 도 16에 보이는 바와 같이, 부고환 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 단백질 발현을 확인한 결과, C/EBPα, PPARγ, SREBP-1에서 유산균을 처리한 실험군이 농도 의존적으로 단백질 발현이 감소하지 않은 것이 확인되었다.
도 17은 본 발명의 유산균 투여에 따른 후복막 지방조직에서 비만관련 단백질 발현을 나타내는 Western blot 결과이다. 도 17에 보이는 바와 같이, 후복막 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 단백질 발현을 확인한 결과, C/EBPα, PPARγ, SREBP-1에서 유산균을 처리한 실험군이 농도 의존적으로 단백질 발현이 감소하는 것이 확인되었다.
실험예 6: 비만 관련 유전자 측정
지방조직에서 TRIzol reagent 용액을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA를 정량한 후 oligo dT primer와 reverse를 이용하여 1 ug의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 각각의 primer와 SYBR premix를 첨가하고, Real time PCR 기기를 이용하여 증폭시킨 후 정량 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. Real time PCR로 증폭된 산물은 comparative cycle threhold(Ct)법을 이용하여 정량하였다. PCR에 사용한 각 유전자의 primer는 표 16과 같다.
비만 관련 유전자의 primer set
Primer Sequence (5′→ 3′)
PPARγ Forward CAAAACACCAGTGTGAATTA
Reverse ACCATGGTAATTTCTTGTGA
FAS Forward AGGGGTCGACCTGGTCCTCA
Reverse GCCATGCCCAGAGGGTGGTT
SREBP-1c Forward CACTTCTGGAGACATCGCAAAC
Reverse ATGGTAGACAACAGCCGCATC
aP2 Forward GGATTTGGTCACCATCCGGT
Reverse TTCACCTTCCTGTCGTCTGC
C/EBPα Forward TGGACAAGAACAGCAACGAGTAC
Reverse TGGACAAGAACAGCAACGAGTAC
ACC1 Forward GGAGATGTACGCTGACCGAGAA
Reverse ACCCGACGCATGGTTTTCA
GAPDH Forward AGGTTGTCTCCTGCGACT
Reverse TGCTGTAGCCGTATTCATTCTCA
(1) 간 조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자 측정
간 조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자를 측정하기 위하여 각 조직을 분쇄한 뒤 real-time PCR을 진행하여 확인하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에 보이는 바와 같이 간 조직에서 비만 관련 유전자인 aP2, FAS, C/EBPα, PPARγ, 그리고 SREBP-1c가 P50에서만 유의적으로 HFD 대비 감소하였고, ACC1은 유의차가 없는 것으로 나타났다.
(2) 부고환 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자 측정
부고환 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자를 측정하기 위하여 각 조직을 분쇄한 뒤 real-time PCR을 진행하여 확인하여 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에 보이는 바와 같이 부고환 지방조직에서 비만 관련 유전자 발현을 확인한 결과, 유산균을 투여한 실험군에서 FAS는 HFD 대비 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타냈다. aP2와 C/EBPα 유전자는 고농도의 유산균인 P50에서만 유의적으로 HFD 대비 감소한 것으로 나타났다. 그리고 ACC1, PPARγ, 그리고 SREBP-1c는 HFD와 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
(3) 후복막 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자 측정
후복막 지방조직에서 비만 관련 바이오마커의 유전자를 측정하기 위하여 각 조직을 분쇄한 뒤 real-time PCR을 진행하여 확인하여 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 보이는 바와 같이 후복막 지방조직에서 비만 관련 유전자 발현을 확인한 결과, 유산균을 투여한 실험군은 모든 농도(1.0×109 ~ 5.0×109 CFU/mouse)에서 3개 유전자(ACC1, FAS, 그리고 C/EBPα) 모두 HFD 대비 유의적으로 감소하였고, 그 효과는 농도 의존적이었다. aP2와 PPARγ는 고농도의 유산균인 P50에서만 HFD 대비 유의적인 감소를 나타났다.
실험예 7: 혈액 내 염증성 cytokine 변화 분석
마우스의 혈액에서 정상군(NFD), 고지방식이 대조군(HFD), 효모+서목태 이용 소재 식이군(P10, P20, P30)의 염증성 cytokine 변화를 관찰하였다. 실험이 종료된 실험동물을 12시간 절식시킨 뒤 isoflurane 흡입마취제로 희생시켜 복대 정맥에서 혈액을 채취하고 지방조직을 분리하여 실험에 사용하였다.
혈액에서 cytokine 분비량을 측정하기 위하여 ELISA kit를 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6의 활성을 관찰하여 그 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에 보이는 바와 같이 TNF-α는 P30과 P50에 의해서 유의적으로 감소한 것으로 나타났으나, IL-1β와 IL-6의 경우에는 HFD와 유의적인 차이가 확인되지 않았다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12127 20171016
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  1. 삭제
  2. 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ceb-kc-007 균주(수탁번호: KCCM 12127P) 또는 이의 배양물이 동결보호제를 포함하여 동결건조된 분말 제형 또는 건조 제형으로서,
    상기 동결보호제는 전체 동결보호제를 기준으로 트레할로스 20~50 중량%, 말토덱스트린 40~70 중량% 및 아가베 이눌린 5~15 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항비만 효능을 가지는 조성물.
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  9. 제2항에 있어서,
    상기 동결보호제는 전체 동결보호제를 기준으로 트레할로스 30~50 중량%, 말토덱스트린 40~60 중량% 및 아가베 이눌린 5~15 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항비만 효능을 가지는 조성물.
  10. 제2항 또는 제9항에 있어서,
    상기 동결보호제는 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~1.0 %인 것을 특징으로 하는, 항비만 효능을 가지는 조성물.
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