KR102270771B1 - 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하는 방법에 관한 것으로, 상기 데이터 세트를 보정을 위한 표준화 계수는 기준값, 기준 사이클 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며, 상기 보정 데이터 세트는 상기 표준화 계수를 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 수득된다. 본 발명의 방법은 기기간 및 기기내 신호 편차를 제거하는데 매우 효과적이다. 또한 본 발명의 방법은 소프트웨어로 구현되므로, 제조사와 관계없이 다양한 분석 기기 (예를 들어 실시간 PCT 기기)에 보편적으로 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 진단 데이터 분석에 매우 유용하다.
Description
본 발명은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하는 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄반응(Polynucleotide chain reaction; 이하 "PCR"이라한다)으로 공지된 가장 많이 사용되는 핵산 증폭 반응은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형으로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
실시간 PCR(Real-time PCR)은 시료에서 표적 핵산을 실시간으로 검출하기 위한 PCR 기반 기술이다. 특정 표적물질을 검출하기 위하여, 실시간 PCR은 표적 분자의 양에 비례하여 검출 가능한 형광신호를 방출하는 신호발생수단을 이용한다. 검출 가능한 형광신호의 방출은, 예를 들어 이중 나선 DNA에 결합하여 형광신호를 방출하는 시약(intercalator)을 사용하거나, 형광신호체 및 이의 형광 방출을 억제하는 quencher 분자를 모두 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법이 있다. 표적 핵산의 양에 비례하는 형광신호가 실시간 PCR을 통하여 각 사이클 마다 검출되며, 형광신호를 측정하여, 사이클 대비 검출되는 형광신호의 세기를 표시한 증폭곡선(amplification curve) 또는 증폭 프로파일 곡선(amplification profile curve)을 얻게 된다.
형광 신호를 이용한 시료분석은 다음과 같이 이루어진다. LED 등의 광원을 통하여 발광체(luminant)에 에너지가 공급되면, 발광체의 전자는 더 높은 양자상태로 들뜨게 되고, 궤도전자가 바닥상태로 돌아오면서 발광체는 특정 파장의 빛을 발산한다. 분석기기가 광다이오드 또는 CCD등을 이용하여 이 특정 파장의 빛을 전기적 신호로 변환시켜 시료 분석에 필요한 정보를 제공한다.
이때 기기 간 LED 광량의 차이(uneven illumination) 및 각 기기에 있는 빛-전기 변환장치의 기능적 편차에 의하여, 동일한 양의 발광체가 시료에서 분석되어도, 각 분석기기는 기기마다 서로 상이한 수치를 산출하게 된다. 이러한 기기간 신호의 차이를 기기간 편차(inter-instrument variation)라 한다. 기기간 신호편차 뿐만 아니라, 기기에서 반응이 수행되는 반응웰의 위치 또는 반응혼합물의 농도, 조성의 미세한 차이와 같은 반응환경의 차이에 의하여, 동일한 하나의 분석기기에서 동종, 동량의 표적물질에 대하여 수행된 복수의 반응의 분석 결과도 신호 수준에 차이가 있을 수 있다. 이러한 동일한 기기에서의 반응들간의 신호차이를 기기내 편차(intra-instrument variation)라고 한다. 또한, 분석물질이 없는 기질인 블랭크를 대상으로 분석하는 경우에도 기기 자체에서 전기적 노이즈 신호가 발생하며, 이것이 정상적인 신호로 기록될 수 있다. 이러한 신호 편차를 발생시키는 전기적 노이즈 신호를 기기 블랭크 신호라고 한다. 이러한 기기 블랭크 신호는 특정한 신호값이 각 사이클마다 더해지거나, 차감된 형태로 나타난다.
정확하고 신뢰성 있는 분석을 위하여, 이러한 문제는 해결되어야 하며, 이를 위한 몇몇 방법이 제안되었다. 가장 기본적인 방법으로, 하드웨어 조정 방법이 사용된다. 예를 들어, 분석기기가 제조될 때, LED 광원과 같은 각 분석 기기의 일부를 보정하여 동일 시료에 대한 기기간 신호편차를 감소시켜 적정 수준으로 유지한다. 또 다른 방법으로는 기준 염색제가 사용될 수 있다. ROXTM 또는 fluorescein과 같은 일정양의 신호를 일정하게 발생시키는 기준 염색제를 반응 혼합물에 추가하여 시료에서 발생한 신호를 이 기준 염색제에서 발생한 신호 수준을 기초로 보정한다.
그러나, 이러한 선행 기술은 몇몇 한계를 가지고 있다. 하드웨어 보정 방법은 보정 정확도에 한계가 있으며, 분석 기기의 노후에 따라 발생하는 오차에 대응하기 위해서는 별도의 추가 보정이 필요하다. 더구나, 하드웨어 보정 방법은 단지 기기간 신호 편차만을 감소시킬 수 있을 뿐, 기기내 신호 편차를 감소시키지 못한다. 기준 염색제를 이용한 신호의 보정은 반응 단가를 증가시키며, 기준 염색제의 양적, 질적편차는 또다른 오류의 원인이 될 수 있다. 더구나, 기준 염색제의 사용은 반응 혼합물 내의 표적물질의 존재를 결정하는 염색제와 기준 염색제 간의 신호 간섭 현상의 가능성을 증가시킨다. 간섭 현상은 매우 중요한 문제이며, 특히 복수의 염색제가 사용되고, 검출되어야 하는 멀티플렉스 PCR에서 더욱 중요하다. 또한 하나의 염색제와 검출 채널을 신호 보정을 위하여 할당하는 것은 검출가능한 타겟 하나를 줄이는 것이 되므로, 제품 경쟁력 측면에서 심각한 단점이 된다.
따라서, 하드웨어의 조정이나, 기준 염색제의 사용 없이 기기간, 기기내 신호 편차를 감소시킬 수 있는 새로운 데이터 세트 보정 방법의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 실시간 PCR 시스템과 같은 데이터 세트를 수득하는 기기에서 발생하는 복수의 데이터 세트에서의 기기간, 기기내 신호 편차에 대한 보다 정확하고 신뢰도 있는 보정 결과를 얻기 위하여 노력하였다.
그 결과, 임의로 정한 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 데이터 세트를 이용하여 표준화 계수(normalization coefficient)를 구하고, 이를 복수의 데이터 지점의 신호값들에 적용하는 경우, 정확하고, 신뢰성 있는 보정된 데이터 세트를 얻을 수 있음을 밝혀 내었다. 또한 상기 표준화 계수가 적용되기 전, 기기 블랭크 신호를 제거한다면 더욱 정확하고, 신뢰성 있는 보정된 데이터 세트를 얻을 수 있음을 밝혀 내었다.
따라서, 본 발명의 목적은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하기 위한 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
I. 표적 분석물질에 대한 데이터 세트 보정 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정(calibration) 방법을 제공한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계.
본 발명자들은 데이터 세트를 보정하고 표적 핵산 분자와 같은 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 복수의 데이터 세트들 간의 기기간 및 기기내 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있는 새로운 방법을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 기준값, 기준 사이클 및 데이터 세트를 이용하여 표준화 계수를 얻고, 이를 복수의 데이터 지점들의 신호값들에 적용하는 경우, 정확하고, 신뢰성있는 보정 데이터 세트를 수득할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서는 배경신호 구역의 특정 사이클(기준 사이클)의 특정 배경신호를 보정에 이용하므로, 이러한 접근법은 "특정 배경 신호 기반 표준화 방법(Specific Background signal based Normalization: SBN)" 이라 명명된다.
본 명세서에서 용어 "표준화"(normalization)는 신호발생반응에서 수득한 데이터 세트의 신호 편차를 줄여주거나, 제거하는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "보정"(calibration) 또는 "조정"(adjustment)은 데이터 세트의 정정(correction), 특히 데이터 세트의 신호값을 분석 목적에 적합하게 정정하는 것을 의미한다. 상기 표준화는 상기 보정의 일 양태이다.
도 1은 본 발명의 SBN방법에 의한 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법의 일 구현예를 도시한 흐름도이다. 본 발명의 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다:
단계 (a):
데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수의 제공 (110)
본 발명에 따르면, 데이터 세트를 보정하기 위한 표준화 계수가 제공된다. 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며, 상기 데이터 세트는 신호발생반응의 사이클들 및 상기 시이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점들을 포함한다.
용어 표적 분석물질은 다양한 물질(예를 들어, 생물학적 물질 및 화합물과 같은 비생물학적 물질)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 표적 분석물질은 핵산 분자(예를들어, DNA 및 RNA), 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 아미노산, 생물학적 화합물, 호르몬, 항체, 항원, 대사물질 및 세포와 같은 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표적 분석물질은 표적 핵산 분자일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "시료"(sample)는 생물학적 시료(예를 들어, 생물학적 원료의 조직 및 체액) 및 비생물학적 시료(예를 들어, 음식물, 물, 토양)를 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 예컨대, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액(예를 들어, 전혈, 혈장 및 혈청), 림프, 골수액, 타액, 객담(sputum), 스왑(swab), 흡인액(aspiration), 젖, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 기관지 세척액, 복수 및 양막액일 수 있다. 표적 분석물질이 표적 핵산 분자인 경우, 상기 시료는 핵산 추출과정을 거칠 수 있다. 상기 추출되는 핵산이 RNA인 경우, 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사(reverse transcription) 과정을 추가로 거칠 수 있다(참조: Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)).
본 명세서에서 용어 "신호발생반응"은 시료 내 표적 분석물질의 특성에 의존적으로 신호를 발생시킬 수 있는 반응을 의미하며, 상기 특성은 예를 들어, 표적 분석물질의 활성, 양 또는 존재(또는 부존재)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 시료 내 표적 분석물질의 존재에 의존적으로 신호를 발생시킨다.
이러한 신호발생반응은 생물학적 또는 화학적 과정을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 과정은 PCR, 실시간 PCR, 마이크로어레이, 및 인베이더 분석과 같은 유전적 분석 과정, 면역학적 분석 과정 및 세균 성장 분석을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 유전적 분석 과정일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 PCR 또는 실시간PCR일 수 있다.
상기 신호발생반응은 신호 변화를 동반할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "신호"는 측정가능한 아웃풋을 의미한다. 상기 신호 변화는 표적 분석물질의 특성, 구체적으로 존재 또는 부존재를 정성적 또는 정량적으로 지시하는 지시자 역할을 한다. 이러한 지시자의 예는 형광 세기, 발광세기, 화학발광 세기, 생발광 세기, 인광세기, 전하 이동, 전압, 전류, 전력, 에너지, 온도, 점성도, 광 스캐터, 방사능 세기, 반사도, 투광도 및 흡광도를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 빈번히 사용되는 지시자는 형광 세기(fluorescence intensity)이다. 상기 신호 변화는 신호의 증가뿐만 아니라 감소도 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 신호값을 증폭하는 반응이다.
본 명세서에서 용어 "신호발생수단"은 분석하고자 하는 표적 분석물질의 특성, 구체적으로 존재 또는 부존재를 나타내는 신호를 발생하는데 사용되는 어떠한 수단을 의미한다.
다양한 신호발생수단이 알려져 있다. 신호발생수단의 예는 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함할 수 있다. 상기 신호발생수단은 표지 자체 및 표지가 결합된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함할 수 있다. 상기 인터컬레이팅 염료(intercalting dye)와 같이 표지 자체가 신호발생수단 역할을 할 수 있다. 또는 단일 표지 또는 공여분자 및 수용 분자를 포함하는 상호작용적인 이중 표지가 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형태로 신호발생수단으로 이용될 수 있다. 신호발생수단은 핵산 절단 효소(예를 들어, 5'-nucleases 및 3'-nucleases)와 같은 신호발생을 위한 추가 구성을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법이 표적 핵산 분자의 존재 또는 부존재의 결정에 적용되는 경우, 상기 신호발생반응은 공지의 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 방법은 TaqManTM 프로브 방법 (U.S. Pat. No. 5,210,015), Molecular Beacon 방법 (Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14 (3):303(1996)), 스콜피온 방법 (Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), 선라이즈(Sunrise or Amplifluor) 방법 (Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), and U.S. Pat. No. 6,117,635), Lux 방법 (U.S. Pat. No. 7,537,886), CPT (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법 (U.S. Pat. No. 6,977,295), 플렉서(Plexor) 방법 (Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), HybeaconsTM (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 and U.S. Pat. No. 7,348,141), 이중 표지된 자가-퀀칭 프로브 (US 5,876,930), 혼성화 프로브 (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE (PTO cleavage and extension) 방법 (WO 2012/096523), PCE-SH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법 (WO 2013/115442) and PCE-NH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법 (PCT/KR2013/012312) 및 CER 방법 (WO 2011/037306)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "증폭" 또는 "증폭반응"은 신호를 증가 또는 감소 시키는 반응을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 신호발생수단을 이용하여 표적 분석물질의 존재에 의존적으로 발생되는 신호의 증가(또는 증폭)를 의미한다. 상기 증폭 반응은 표적 분석물질(예를 들어, 핵산 분자)의 증폭을 동반하거나, 동반하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 표적 핵산 분자의 증폭을 포함하거나, 포함하지 않고 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 증폭 반응은 표적 분석물질의 증폭을 동반한 신호 증폭 반응을 의미한다.
증복반응을 통하여 수득하는 데이터 세트는 증폭 사이클을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "사이클"은 일정한 조건의 변화를 수반한 복수의 측정에 있어, 상기 조건의 변화 단위 또는 조건의 변화의 반복 단위를 말한다. 상기 일정한 조건의 변화 또는 조건의 변화의 반복은 예를 들어 온도, 반응시간, 반응횟수, 농도, pH, 측정 대상(예를 들어 표적 핵산 분자)의 복제 횟수의 변화 또는 변화의 반복을 포함한다. 따라서 사이클은 조건(예를 들어, 온도 또는 농도)의 변화 사이클, 시간 또는 과정(process) 사이클, 단위 운영(unit operation) 사이클 및 재생산(reproductive) 사이클 일 수 있다. 사이클 번호는 상기 사이클의 반복 횟수를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "사이클" 및 "사이클 번호" 는 혼용될 수 있다.
예를 들어, 효소 동역학이 조사되는 경우, 기질의 농도를 일정하게 증가시키면서 효소의 반응 속도를 수차례 측정한다. 이 경우, 기질 농도의 증가는 상기 조건의 변화에 해당하며, 기질 농도의 증가 단위가 하나의 사이클에 해당한다. 다른 일예로 핵산의 등온증폭 반응(isothermal amplification)의 경우, 하나의 시료의 신호를 일정 시간 간격으로 수 차례 측정 된다. 이 경우 반응시간이 조건의 변화이며, 반응시간 단위가 하나의 사이클로 설정된다. 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 핵산 증폭 반응을 통한 표적 분석물질의 검출 방법 중 하나로, 표적 분석물질에 혼성화된 프로브에 의해 발생하는 복수의 형광신호가 일정한 온도의 변화와 함께 측정된다. 이 경우, 온도의 변화가 상기 조건의 변화에 해당하며, 상기 온도가 사이클에 해당한다.
특히, 일련의 반응을 반복하거나, 일정 시간 간격으로 반응을 반복하는 경우, 용어 "사이클"은 상기 반복의 단위를 의미한다. 예를 들어, PCR에서, 사이클은 표적 핵산 분자의 변성, 표적 핵산 분자와 프라이머의 어닐링(혼성화) 및 프라이머의 연장을 포함하는 반응 단위를 의미한다. 이 경우 일정한 조건의 변화는 반응의 반복 횟수의 증가이며, 상기 일련의 단계를 포함하는 반응의 반복 단위가 하나의 사이클로 설정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 핵산 분자가 시료에 존재하는 경우, 측정되는 신호값(예를 들어, 신호 강도)은 증폭반응의 사이클의 증가에 따라 증가하거나, 감소한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 핵산 분자의 존재를 나타내는 신호를 증폭하는 상기 증폭반응은 표적 분석물질이 증폭되면서, 신호도 증폭되는 방법으로 실시될 수 있다(예를 들어, 실시간 PCR 방법). 또는 상기 증폭 반응은 표적 분석물질이 증폭되지 않고, 표적 분석물질의 존재를 나타내는 신호만이 증폭되는 방법으로 실시될 수 있다(예를 들어, CPT method (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148 (1990)), Invader assay (미국특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호)).
표적 분석물질은 다양한 방법으로 증폭될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 아니하나, 다음과 같이 표적 핵산 분자의 증폭을 위한 다양한 방법이 알려져 있다. PCR (중합효소연쇄반응), LCR (리가아제 연쇄반응, U.S. Pat. No. 4683195 and No. 4683202; A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990); Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64), GLCR (gap filling LCR, WO 90/01069, EP 439182 및 WO 93/00447), Q-beta (Q-beta 레플리카제 증폭, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), U.S. Pat. No. 5556751), SDA (가닥 치환 증폭, G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):1691-1696(1992), EP 497272), NASBA (염기순서기반증폭, Compton, J. Nature 350(6313):91-2(1991)), TMA (전사 매개 증폭, Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); U.S. Pat. No. 5888779).) or RCA (롤링서클 증폭, Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:17332-17336(2005)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생수단에 이용되는 표지는 형광(fluorescence)을 포함할 수 있으며, 구체적으로 형광 단일표지 또는 공여 분자(donor molecule) 및 수용 분자(acceptor molecule)를 포함하는 상호작용적인 이중 표지(예컨대, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자 포함)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭 반응은 표적 분석물질(구체적으로, 표적 핵산분자)의 증폭이 수반되면서 신호를 증폭할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 반응은 PCR, 구체적으로 실시간 PCR에 따라 실시된다.
신호발생반응에 의해 수득된 데이터 세트는 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값들을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "신호값" 또는 "신호의 값"은 신호발생반응의 사이클들에서 실제 측정되는 신호값(예를 들어, 증폭 반응에 의하여 나타나는 실제 형광 값)을 의미하며, 또는 이의 변형값을 의미한다. 상기 변형값은 측정된 신호값(예를 들어, 신호의 세기)의 수학적으로 가공된 값을 포함할 수 있다. 실제적으로 측정된 신호값의 수학적으로 가공된 신호값의 예는 로그값 또는 도함수값(derivatives)을 포함할 수 있다. 측정된 신호값의 상기 도함수값은 다중 도함수값을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "데이터 지점"은 사이클 및 상기 사이클에서의 신호값을 포함하는 하나의 좌표값(a coordinate value)을 의미한다. 용어 “데이터”는 데이터 세트를 구성하는 모든 정보를 의미한다. 예컨대, 증폭 반응의 사이클 및 신호값 각각은 데이터이다. 신호발생반응, 특히 증폭반응에 의해 얻어진 데이터 지점들은 2차원 직교 좌표계에 나타낼 수 있는 좌표값으로 표시될 수 있다. 상기 직교 좌표계에서 X-축은 증폭반응의 사이클을 나타내며, Y-축은 해당 사이클에서 측정 또는 가공된 신호값을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 "데이터 세트"는 상기 데이터 지점들의 집합을 의미한다. 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 신호발생반응(예를 들어, 증폭 반응)으로부터 직접 수득한 데이터 지점들의 집합일 수 있다. 또는 상기 데이터 세트는 신호발생반응으로부터 직접 수득한 데이터 지점들의 집합을 포함하는 데이터 세트의 변형에 의하여 수득되는 변형된 데이터 세트일 수 있다. 상기 데이터 세트는 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 지점들 또는 이의 변형된 데이터 지점들의 일부 또는 전체 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트가 수학적으로 가공된 데이터 세트일 수 있다. 구체적으로, 상기 데이터 세트는 원시 데이터 세트로부터 배경 신호값을 제거하기 위하여 베이스라인이 차감된 데이터 세트일 수 있다. 상기 베이스라인이 차감된 데이터 세트는 당업계에 공지된 다양한 방법(예컨대, 미국특허 제8,560,247호)을 통하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 용어 "원시 데이터 세트"는 증폭 반응으로부터 직접 수득한 데이터 지점들의 집합이다. 상기 원시 데이터 세트는 실시간 PCR을 수행하기 위한 장치 (예를 들어, thermocycler, PCR 기기 or DNA 증폭기)로부터 최초 수신한 미가공 데이터 지점들의 집합을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 당업계의 기술자들이 통상적으로 이해하고 있는 원시 데이터 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 본 명세서에 기재된 수학적으로 가공된 데이터 세트들의 기초가 되는 데이터 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원시 데이터 세트는 베이스라인이 차감되지 아니한 데이터 세트(no baseline subtraction data set) 일 수 있다.
본 발명의 방법은 시료 내 타겟 분석물질에 대한 하나의 데이터 세트를 보정하는 방법일 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 복수의 데이터 세트를 보정하는 방법일 수 있다. 본 발명의 일 구현에에 따르면, 본 발명의 데이터 세트는 복수의 데이터 세트를 포함할 수 있다. 특히, 상기 복수의 데이터 세트는 동종의 표적 분석물질에 대한 복수의 데이터 세트일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 데이터 세트는 기기 블랭크 신호가 제거된 데이터 세트일 수 있다. 또는 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 기기 블랭크 신호가 제거되지 아니한 데이터 세트일 수 있다.
용어 "1차 보정 데이터 세트"는 원시 데이터 세트로부터 기기 블랭크 신호가 제거된 변형된 데이터 세트를 나타내기 위하여 사용된다. 상기 1차 보정 데이터 세트는 변형된 데이터 세트로 기재될 수 있으며, 최종 보정 데이터 세트 또는 2차 보정 데이터 세트와 구분된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기기 블랭크 신호는 신호발생수단 없이 수득될 수 있다. 구체적으로, 상기 기기 블랭크 신호는 표지 자체 또는 표적 분석물질의 존재에 의해 신호를 발생시키는 표지된 올리고뉴클레오타이드와 같은 신호발생수단이 없이 수행된 반응으로부터 검출된 신호를 말한다. 이러한 기기 블랭크 신호는 신호발생수단이 없이 측정되므로, 기기 블랭크 신호에는 기기 대 기기 사이에서 표적 분석물질의 단위 농도 당 발생하는 신호의 비율적 차이에 의한 신호편차가 적용되지 않는다.
상기 기기 블랭크 신호는 다양한 방법으로 측정 및 적용될 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 기기는 이에 해당하는 각각의 기기 블랭크 신호가 결정될 수 있다. 하나의 기기 블랭크 신호는 하나의 기기에 의해 수득되는 여러 데이터 세트들에 적용되며, 서로 다른 기기에서 수득한 데이터 세트들에는 해당 기기에 대응하는 서로 다른 기기 블랭크 신호가 각각 적용될 수 있다. 또는 하나의 기기 내의 각 웰들에 대하여 서로 다른 기기 블랭크 신호가 결정될 수 있다. 하나의 기기 내의 각 웰은 고유의 기기 블랭크 신호를 가질 수 있으며, 하나의 기기 내의 각 웰에서 수득한 데이터 세트들에는 각 웰에 대응하는 상이한 기기 블랭크 신호가 적용될 수 있다.
상기 기기 블랭크 신호가 제거된 데이터 세트는 기기 블랭크 신호가 전부 또는 일부가 제거된 데이터 세트일 수 있다. 용어 "제거"는 데이터 세트에 신호값을 더하거나 차감하는 것을 의미한다. 바람직하게는 용어 "제거"는 데이터 세트로부터 신호값을 차감하는 것을 의미한다. 기기 블랭크 신호가 음수인 경우, 상기 블랭크 신호는 신호값을 더하여 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기기 블랭크 신호는 신호발생수단이 없이 수득될 수 있다. 구체적으로 상기 기기 블랭크 신호는 빈 웰(empty well), 빈 튜브, 증류수가 포함된 튜브 또는 형광분자가 결합된 올리고뉴클레오타이드와 같은 신호발생수단이 없는 실시간 PCR 반응혼합물을 포함하는 튜브를 이용하여 측정될 수 있다. 기기 블랭크 신호의 측정은 신호발생반응과 함께 수행될 수 있으며, 또는 신호발생반응과 별도로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기기 블랭크 신호의 측정이 신호발생반응과 함께 수행되며, 상기 신호발생반응에 의해 수득한 데이터 세트의 신호값에서 측정된 기기 블랭크 신호를 차감하는 방법으로 기기 블랭크 신호 전체가 제거될 수 있다.
택일적으로, 신호발생반응에 의해 수득된 데이터 세트의 신호값으로부터 일정한 신호값을 차감하는 방법으로 기기 블랭크 신호의 일부가 제거될 수 있다. 상기 일정한 신호값은 상기 일정한 신호값을 차감하여 기기 블랭크 신호에 해당하는 신호가 감소되는 범위에서 결정되는 한, 어떠한 값도 가능하다. 예를 들어, 상기 일정한 신호값은 하나의 기기 또는 복수의 기기에서 측정된 복수의 기기 블랭크 신호값들을 기초로 결정될 수 있다. 각각의 표적 분석물질 분석 실험마다 기기 블랭크 신호를 측정하는 것이 곤란한 경우, 하나의 기기 또는 복수의 기기에서 측정된 복수의 기기 블랭크 신호값들을 기초로 결정된 기기 블랭크 신호의 일부에 해당하는 일정한 신호값을 결정하고, 상기 결정된 일정한 신호값을 각 데이터 세트에서 일률적으로 차감하는 방법으로 기기 블랭크 신호가 데이터 세트들로부터 제거될 수 있다.
또는, 본 발명의 방법에 따라, 상기 일정한 신호값을 데이터 세트로부터 차감한 후 차감된 데이터 세트의 신호값들을 비율적으로 보정하였을 때, 동량의 표적분석 물질에 대한 신호값의 차이가 감소하는 범위에서 상기 일정 신호값이 결정될 수 있다. 이러한 경우, 기기 블랭크 신호의 측정 없이 기기 블랭크 신호의 일부를 제거하여 1차 보정 데이터 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (a) 이전에 상기 데이터 세트를 얻기 위한 신호발생반응을 실시하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 분석물질에 대한 상기 데이터 세트는 시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타낼 수 있다. 이 경우, 본 발명은 "시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터 세트의 보정 방법"으로 표현될 수 있다. 시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터 세트의 보정은 결국 시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 수행된다. 용어 "시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 결정"하는 것은 시료 내 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준화 계수는 기준값, 기준 사이클 및 데이터 세트를 이용하여 제공될 수 있다.
상기 기준 사이클은 데이터 세트의 사이클들에서 선택되고, 기준값은 임의로 정해진 값이며, 표준화 계수는 상기 기준 사이클에 해당되는 상기 데이터 세트의 사이클에서의 신호값과 상기 기준값 사이의 관계(relationship)를 정하여 제공된다.
상기 기준 사이클은 기준값과 함께 표준화 계수를 제공하기 위하여 사용되는 특정 신호값을 결정하기 위하여 선택되는 사이클이다. 표준화 계수의 제공에 이용되는 기준 사이클은 데이터 세트의 사이클들 중에서 임의로 선택될 수 있다.
상기 기준 사이클은 상기 사이클의 의미에 따라 기준 온도, 기준 농도 또는 기준 시간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사이클의 단위가 온도인 멜팅 데이터 세트에서는 기준 온도가 기준 사이클 일 수 있다. 멜팅 데이터 세트에 관한 기재에서 용어 "기준 사이클"과 "기준 온도"는 혼용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택되며, 상기 기준 사이클 그룹은 동일한 조건에 기초하여 생성된다. 상기 동일한 기준은 모든 데이터 세트들에서 기준 사이클을 결정하는데 동일하게 적용될 수 있다.
각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공된다. 상기 기준 사이클은 다양한 접근법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 수준이 유사하게 측정되는 사이클을 포함할 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 수준이 실질적으로 동일한 사이클을 포함할 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 신호값들의 변동계수가 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이내인 사이클을 포함할 수 있다.
데이터 세트가 시그모이드 반응 모양으로 플로팅 되는 경우, 상기 기준 사이클은 증폭 구간(예를 들어, 증폭기)의 이전 및/또는 이후의 사이클을 포함할 수 있다. 증폭 구간 이전은 베이스라인 구역 또는 초기 구역일 수 있으며, 증폭 구간 이후는 고원기 또는 말기 구역일 수 있다. 상기 기준 사이클 그룹은 하나의 사이클을 포함할 수 있으며, 이때 상기 하나의 사이클의 번호는 각 데이터 세트에서 동일할 수 있다.
기준 사이클의 수는 각 데이터 세트에 동일하게 결정될 수 있다. 또는 상기 기준 사이클의 수는 각 데이터 세트마다 상이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 데이터 세트는 각 데이터 세트에 동일한 방식(공통의 조건(rule) 또는 미리 결정된 기준)에 의하여 제공되는 기준 사이클 그룹에서 결정된 기준 사이클 또는 사이클들을 이용하여 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동일한 방식 (공통의 조건 또는 미리 결정된 기준)은 기준 사이클 그룹을 제공하며,
기준 사이클 그룹에서 선택된 기준 사이클 또는 사이클들과 데이터 세트에 의해 계산된 상기 표준화 계수들은 실질적으로 동일하거나, 좁은 범위(예를 들어, 15%, 10%, 8%, 5% 또는 4%)의 표준 편차 범위 내 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트가 복수의 데이터 세트를 포함하는 경우 동일한 기준 사이클이 복수의 데이터 세트에 적용이 되어 동일한 판단기준(criterion)으로 분석된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트들은 동일한 기준 사이클을 이용하여 보정될 수 있다.
내부 또는 상호 비교 분석에 사용되거나, 동일한 임계값과 같이 동일한 판단기준(criterion)에 의하여 분석되는 데이터 세트들의 신호 변화가 최소화 되어야 한다. 동일 판단기준으로 표준화 하는 데이터 세트의 범위는 분석 목적에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이에 제한되지 아니하나, 예를 들어 동일 표적 분석물질에 대한 복수의 데이터 세트, 동일 종류 시료에 대한 복수의 데이터 세트, 동일 반응 혼합물(예를 들어 동일 형광물질, 동일 프로브 등)을 사용하는 복수의 데이터 세트 들은 각각 동일 판단기준으로 표준화 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트를 포함하는 데이터 세트의 경우, 상이한 기준 사이클의 신호값이 실질적으로 동일하다면, 상기 복수의 데이터 세트 중 적어도 2 개의 데이터 세트는 서로 다른 기준 사이클이 적용될 수 있다.
기준 사이클은 기준값과 함께 표준화 계수를 제공하는데 사용되는 특정 신호값을 결정하는데 이용되므로, 상기 기준 사이클은 신호값을 제공할 수 있는 사이클들 중에서 선택되어야 한다.
기준 사이클은 미리 결정된 사이클이거나, 실험에 의하여 결정될 수 있다. 상기 기준 사이클은 데이터 세트의 사이클들 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 기준 사이클은 데이터 세트에서 증폭 신호가 거의 검출되지 않는 영역의 사이클들 중에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 데이터 세트가 핵산 증폭 반응에 의하여 수득되는 경우, 상기 기준 사이클은 배경신호 구역에서 결정되는 것이 바람직하다. 배경신호 구역은 신호발생반응의 초기에 증폭 신호가 충분히 검출되기 전의 구역을 말한다.
배경신호 구역은 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭 과정에 의해 수득한 데이터 세트의 1차 미분한 결과에서 특정 임계값을 초과하는 기울기를 가지는 첫번째 데이터 지점의 사이클이 배경신호 구역의 마지막 사이클로 결정될 수 있다. 또는 핵산 증폭 과정에 의해 수득한 데이터 세트의 1차 미분한 결과에서 첫 번째 피크의 시작 사이클을 배경 신호 구역의 마지막 사이클로 결정할 수 있다. 또는 곡률이 최대가 되는 데이터 지점을 배경 신호 구역의 마지막 사이클로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호값의 증폭 반응은 배경신호 구역 및 신호 증폭 구역의 신호값을 모두 제공하며, 상기 기준 사이클은 배경신호 구역에서 선택된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생반응은 PCR 또는 실시간 PCR이며, 기준 사이클은 PCR 또는 실시간 PCR의 신호 증폭 구간 이전의 배경신호 구역에서 선택될 수 있다. 동일한 표적에 대하여 동일한 조건에서 PCR 또는 실시간 PCR을 수행하여 수득한 데이터 세트의 초기 배경 구역의 신호값은 이론적으로 동일하거나 적어도 유사한 값을 가져야 한다. 그 이유는 초기 배경 구역의 신호값은 표적 분석물질의 농도와 무관하게 표적 분석물질에 대한 신호를 매우 낮은 수준으로 포함하기 때문이다. 따라서, 기준 사이클은 배경신호 구역에서 선택되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 기준 사이클은 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 또는 8 번째 사이클 이하일 수 있다. 본 발명의 기준 사이클은 PCR 초기 사이클에서 나타나는 노이즈를 피하여 설정될 수 있다. 본 발명의 기준 사이클은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 번째 사이클 이상일 수 있다. 구체적으로, 기준 사이클은 배경 신호 구역에 위치하는 1-30 사이클, 2-30 사이클, 2-20 사이클, 2-15 사이클, 2-10 사이클, 2-8 사이클, 3-30 사이클, 3-20 사이클, 3-15 사이클, 3-10 사이클, 3-9, 3-8, 4-8 또는 5-8 사이클 구역의 어떤 하나의 사이클로 정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클은 하나의 기준 사이클 일 수 있다. 하나의 사이클이 기준 사이클로 이용될 수 있으며, 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값이 표준화 계수를 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 택일적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준 사이클은 적어도 2개의 기준 사이클을 포함할 수 있다.
기준 사이클은 적어도 2개의 기준 사이클을 포함할 수 있으며, 데이터 세트에서 기준 사이클에 해당하는 신호값은 적어도 2개의 신호값들을 포함할 수 있다.
보정을 위한 표준화 계수는 데이터 세트의 사이클 중에서 상기 적어도 2 개의 기준 사이클에 대응하는 사이클들에서의 신호값들으로부터 계산된 신호값을 이용하여 제공될 수 있다. 택일적으로 데이터 세트의 사이클 중에서 상기 적어도 2 개의 기준 사이클에 대응하는 사이클들에서의 신호값들 각각을 이용하여 적어도 2 개의 표준화 계수가 제공되고, 보정을 위한 표준화 계수는 상기 적어도 2개의 표준화 계수에 의하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 기준 사이클을 4, 5 및 6 번째 사이클로 지정하고, 데이터 세트의 4, 5 및 6번째 사이클의 신호값의 평균을 표준화 계수의 제공에 이용할 수 있다. 또는, 기준 사이클을 4, 5 및 6 번째 사이클로 지정하고 각 기준 사이클에서의 신호값을 이용하여 각 기준 사이클에서의 표준화 계수를 결정하고, 이를 평균값을 데이터 세트에 적용할 최종 표준화 계수로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 사이클이 데이터 세트의 일정 범위의 사이클 내에서 결정되는 경우, 상기 기준 사이클은 동일 판단 기준으로 분석되는 데이터 세트들에서 그 신호값이 동일하거나, 적어도 유사한 값을 가지는 사이클들 중에서 선택될 수 있다.
데이터 세트의 보정을 위하여 복수의 데이터 지점에 적용될 표준화 계수의 제공에 이용되는 신호값은 기준 사이클 및 데이터 세트에 의해 결정된다. 구체적으로 표준화 계수는 기준 사이클에 해당되는 상기 데이터 세트의 사이클에서의 신호값과 기준값 사이의 관계를 정하여 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 기준사이클과 데이터 세트로부터 표준화 계수의 제공에 사용될 신호값을 결정하기 전 신호발생반응에 의해 얻어진 데이터 세트에서 스파이크(spike), 점프 오류(jump error) 등 여러 비정상적인 신호를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
기준값은 표준화 계수를 제공하는데 이용되는 값이다. 본 명세서에서 기준값은 데이터 세트의 신호값들을 보정하기 위하여 기준 사이클에 적용되는 임의의 값을 의미한다. 동일 기준으로 표준화 하려는 데이터 세트들에는 동일한 기준값이 적용된다. 보정하고자 하는 데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우, 상기 복수의 데이터 세트들은 동일한 기준값에 의하여 보정될 수 있으며, 이것은 본 발명의 중요한 특징 중 하나이다.
기준값은 임의로 정해진 값일 수 있다. 바람직하게는 기준값은 0이 아닌 실수 중에서 임의로 정해진 값이다. 기준값이 0인 경우 표준화 계수는 결정될 수 없다. 본 명세서에서 "기준값은 임의로 정해진 값일 수 있다"라는 것은 기준값은 시료 내 표적 분석물질의 존재가 상기 기준값을 이용한 보정 데이터 세트에 의하여 결정될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않고 결정될 수 있다는 의미이다. 기준값은 시료 내 표적 분석물질의 존재가 상기 기준값을 이용한 보정 데이터 세트에 의하여 결정될 수 있는 한, 실험자에 의하여 임의로 선택될 수 있다. 그러므로, 데이터 세트의 보정에 이용될 기준값은 상기 데이터 세트가 수득된 신호발생반응과 동일 종류의 신호발생반응에 의하여 기준 사이클에서 수득될 수 있는 신호값의 범위내에서 결정될 수 있다. 기준값은 보정될 데이터 세트와 별도로 수득될 수 있다. 구체적으로 기준값은 분석대상인 표적 분석물질과 동일 종류의 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득된 데이터 세트로부터 결정될 수 있다. 택일적으로, 상기 기준값은 보정될 데이터 세트를 포함하는 일군의 데이터 세트들로부터 수득될 수 있다.
바람직하게는 기준값은 보정대상인 데이터 세트의 신호값과 동일한 종류의 값일 수 있으며, 보정대상인 데이터 세트와 동일한 단위 또는 차원(dimension)일 수 있다. 그러나, 기준값과 데이터 세트의 신호값이 서로 다른 단위 또는 차원을 가지거나, 기준값이 단위나 차원을 가지지 않더라도, 각 반응에 대한 적절한 표준화 계수는 기준값과 보정대상 데이터 세트의 신호값으로부터 제공되고, 보정 데이터 세트가 각 반응에 대한 표준화 계수를 이용하여 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생반응은 동종의 표적 분석물질을 검출하기 위한 복수의 신호발생반응일 수 있으며, 상기 데이터 세트는 복수의 데이터 세트일 수 있으며, 각 데이터 세트에 적용된 기준값은 다른 기준값과는 독립적으로 결정될 수 있다. 기준값이 독립적으로 결정될 수 있다는 것은 복수의 데이터 세트 중 하나의 데이터 세트를 위한 기준값은 다른 데이터 세트의 기준값을 고려하지 않고 결정될 수 있다는 의미이다. 따라서, 본 발명의 데이터 세트가 복수의 데이터 세트를 포함하는 경우, 적어도 2 개의 데이터 세트는 서로 다른 기준값을 이용하여 보정이 되거나, 모든 데이터 세트가 동일한 기준값을 이용하여 보정이 될 수 있다.
상기 복수의 신호발생반응은 동종의 표적 분석물질의 검출을 위한 복수의 신호발생반응일 수 있다. 상기 동종의 표적 분석물질은 동일한 시료에서 분리된 복수의 표적 분석물질일 수 있다. 택일적으로 상기 동종의 표적 분석물질은 서로 상이한 시료에서 분리되었으나, 동일한 신호발생수단 (예를 들어, 동일 프로브 또는 동일 프라이머)에 의하여 검출 될 수 있는 표적 분석물질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 신호발생반응은 상이한 반응환경에서 수행되는 동종의 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응일 수 있다. 상이한 반응환경에서 수행되는 신호발생반응은 다양한 양태를 포함한다. 구체적으로, 상이한 반응환경에서 수행되는 신호발생반응은 기기가 서로 다른 반응, 반응 튜브 또는 웰이 서로 다른 반응, 시료가 서로 다른 반응, 표적 분석물질의 양이 서로 다른 반응, 프라이머 또는 프로브가 서로 다른 반응, 신호발생 염색제가 서로 다른 반응 또는 신호발생수단이 서로 다른 반응을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 서로 다른 반응용기에서 수행되는 복수의 신호발생반응을 포함할 수 있으며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트를 포함할 수 있다. 복수의 신호발생반응은 서로 다른 반응용기에서 수행될 수 있다. 용어 "반응용기"는 시료와 신호발생수단(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)이 혼합되어 반응이 일어나는 용기 또는 장치의 일부분을 의미한다. 복수의 신호발생반응이 서로 다른 반응용기에서 수행될 수 있다는 것은 또다른 신호발생반응을 위한 또다른 신호발생수단 및 또다른 시료와 분리된 신호발생수단 및 시료를 사용하여 신호발생반응이 수행된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 복수의 튜브에서 또는 플레이트의 복수의 웰에서 수행되는 신호발생반응들은 상기 복수의 신호발생반응에 해당한다. 신호발생반응들이 동일한 반응용기에서 수행되지만, 시간을 달리하여 수행되는 경우도 역시 상기 복수의 신호발생반응에 해당한다.
복수의 신호발생반응은 반응 환경(예를 들어, 사용된 기기)에 따라 수개의 그룹으로 분류될 수 있다. 구체적으로, 상이한 기기들에서 수행된 복수의 신호발생반응은 수행된 기기들에 따라 서로 다른 그룹으로 분류될 수 있다. 상기 복수의 상이한 기기들에서 수행된 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트들은 동일한 기준값을 사용하여 보정될 수 있으며, 또는 보다 정밀한 보정을 위하여 상이한 기준값을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 신호발생반응은 서로 다른 기기에서 수행될 수 있다. 기기가 한번 작동하여 하나의 시료를 분석하는 경우, 이와 같은 방식으로 복수의 신호발생반응을 통하여 얻어진 복수의 데이터 세트는 서로 다른 기준값을 이용하여 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트는 동일한 기준값을 이용하여 보정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트는 동일한 기준 사이클을 이용하여 보정될 수 있다.
복수의 데이터 세트가 복수의 데이터 세트에 공통적으로 적용되는 동일한 기준값(공통 기준값)을 이용하여 보정되는 경우, 모든 데이터 세트는 기준 사이클에서 동일한 신호값을 가지도록 보정되어, 데이터 세트들의 신호 편차가 감소한다. 그러므로, 서로 다른 반응 환경의 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 대한 표준화 계수는 동일한 기준값을 이용하여 구할 수 있으며, 이는 본 발명의 중요한 특징 중 하나이다. 구체적으로 반응 환경이 상이한 복수의 신호발생반응을 통하여 수득한 데이터 세트에 대한 각각의 표준화 계수는 동일한 기준 사이클 및 동일한 기준값을 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 서로 다른 기기에서 수득한 상기 복수의 데이터 세트는 동일한 기준값을 사용하여 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 복수의 데이터 세트에서 기준 사이클에 해당하는 사이클에서의 신호값의 평균±표준편차 범위 안에서 결정된다. 기준값이 상기 설명한 범위 내에서 결정되는 경우, 복수의 데이터 세트는 데이터 세트와 보정된 데이터 세트 간의 차이를 최소화 하면서 보정할 수 있다.
한편, 복수의 데이터 세트는 상이한 기준값을 이용하여 보정될 수 있다. 상이한 기준값은 동일한 판단기준에 의하여 분석되어야 할 복수의 데이터 세트에 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트 중 적어도 2개의 데이터 세트는 서로 다른 기준값을 이용하여 보정될 수 있다.
복수의 데이터 세트는 반응 환경(예를 들어, 사용된 기기)에 따라 수개의 그룹으로 분류될 수 있으며, 또한 반응 환경의 차이를 고려하여, 각 그룹에 적절한 기준값이 결정되고, 적용될 수 있다. 이러한 과정을 통하여, 복수의 데이터 세트들 간의 신호 편차는 더욱 정교하게 보정될 수 있다.
모든 복수의 데이터 세트들이 각각 서로 다른 그룹으로 분류되는 경우에는, 각각의 기준값이 모든 데이터 세트들 각각에 적용된다. 복수의 데이터 세트 중 적어도 2개의 데이터 세트가 동일 그룹에 분류되는 경우, 상기 적어도 2개의 데이터 세트에는 동일한 기준값이 적용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 기기의 서로 다른 웰에서 수득한 데이터 세트들은 동일 그룹으로 분류될 수 있으며, 다른 기기에서 수득한 데이터 세트들은 서로 다른 그룹으로 분류될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 서로 다른 기기에서 수득된 데이터 세트들에는 상이한 기준값들이 적용될 수 있으며, 동일한 기기의 서로 다른 웰에서 수득된 데이터 세트들에는 동일한 기준값이 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 복수의 데이터 세트 중 적어도 2개의 데이터 세트가 서로 다른 기준값을 이용하여 보정될 수 있으며, 상기 적어도 2개의 데이터 세트는 서로 다른 기기를 이용하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호발생반응은 동일 종류의 표적 분석물질에 대하여 서로 다른 반응용기에서 수행되는 복수의 신호발생반응이며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응으로부터 수득한 복수의 데이터 세트를 포함하며, 상기 복수의 데이터 세트들 중 적어도 2개의 데이터 세트는 서로 다른 기준값을 이용하여 보정될 수 있다. 예를 들어, 기기간 신호편차를 보다 정교하게 보정하기 위하여, 각 기기의 기기-특이적 표준 데이터 세트 및 이의 총 신호 변화값을 수득하고, 상기 총 신호 변화값을 이용하여 대응하는 기기를 이용하여 수득한 데이터 세트에 적용되는 기준값을 결정할 수 있다. 이는 본 발명의 또다른 특징이다.
기기간 편차는 각각 별도의 기기에서 수행된 동일한 표적 분석물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득한 별도의 데이터 세트들 간의 신호편차일 수 있다. 택일적으로 상기 기기간 편차는 동일한 기기에서 동일한 표적 분석물질에 대한 독립적인 신호발생반응에 의해 수득한 별도의 데이터 세트들 간의 신호편차일 수 있다. 예를 들어, 하나의 기기에서 하나의 표적 분석물질에 대한 신호발생반응들이 시간을 달리하여 독립적으로 수행될 수 있으며, 이 경우 상기 기기의 독립적인 수행들 각각이 하나의 기기로 취급될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비록 복수의 데이터 세트 중 적어도 2 개의 데이터 세트가 서로 다른 기준값을 이용하여 보정되는 경우에도, 상기 복수의 데이터 세트 중 상기 적어도 2개의 데이터 세트는 동일한 기준사이클을 사용하여 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 (i) 기준 총 신호 변화값에 대한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값의 비율 및 (ii) 표준 데이터 세트를 이용하여 결정된다. 상기 표준 데이터 세트는 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하기 위하여 사용되는 반응자리와 동일한 반응자리를 이용하여 수득될 수 있으며, 상기 기준 총 신호 변화값은 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하기 위하여 사용되는 데이터 세트를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트로부터 결정될 수 있다.
구체적으로, 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값이 기준 총 신호 변화값에 대한 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값의 비율을 이용하여 보정될 수 있으며, 상기 보정된 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값으로부터 기준값을 결정할 수 있다.
기준값은 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 및 기준 총 신호 변화값을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표준 데이터 세트는 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득할 때 사용한 것과 동일한 반응 자리를 이용하여 수득할 수 있다.
상기 반응자리(reaction site)는 시료에 대한 반응 또는 실험이 수행되는 물리적 공간을 말한다. 상기 반응자리는 기기(예를 들어, PCR기기) 및 기기의 일부(예를 들어, PCR 기기에 형성된 반응웰)를 포함할 수 있다. 상기 반응자리는 PCR 증폭과 같은 표적 분석물질 검출을 위하여 형성된다.
표준 데이터 세트는 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 신호발생반응에 의해 얻어지는 데이터 세트일 수 있다. 상기 표준 데이터 세트는 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 얻기 위하여 사용된 것과 동일한 웰 또는 기기를 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 데이터 세트는 보정대상인 표적 분석물질에 대한 데이터 세트와 별도로 얻어질 수 있다. 기기에 대한 보정 비율이 상기 기기를 이용한 표준 데이터 세트를 기반으로 계산되는 경우, 표준 데이터 세트를 위한 신호발생반응은 반드시 시료 내 표적 분석물질을 검출하고자 하는 신호발생반응과 동일한 조건의 반응에서 동시에 수행될 필요는 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표준 데이터 세트는 보정하려는 데이터 세트와 동시에 수득될 수 있다. 이 경우 표준 데이터 세트는 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 수득하는 것과 동일한 조건의 반응에서 얻어질 수 있다. 이로서 기기를 사용할 때마다 미세하게 변화하는 변화도 보정이 가능하다.
표준 데이터 세트는 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 데이터 세트이므로, 상기 표준 데이터 세트는 상기 알려진 농도와 동일한 농도의 표적 분석물질에 대한 다른 데이터 세트와 상기 표준 데이터 세트간의 공통되는 요소의 비교분석에 의한 기준값 결정에 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 알려진 농도의 표적 분석물질은 표준 농도의 표적 분석물질일 수 있다. 상기 공통되는 요소는 동일한 조건에서 동일한 신호발생반응이 수행되는 경우, 이론적으로 동일한 값을 가지는 요소이다. 상기 공통되는 요소는 예를 들어 총 신호 변화값, 임계값(threshold)이상의 신호값을 가지는 첫번째 데이터 지점의 사이클 수 또는 베이스라인 영역의 사이클에서의 신호값일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 데이터 세트는 상기 공통되는 요소 중 하나인 총 신호 변화값을 이용하여 보정될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "총 신호 변화값"은 데이터 세트의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)을 말한다. 총 신호 변화값은 전체 데이터 세트의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)일 수 있으며, 또는 데이터 세트의 일부 영역의 신호 변화량(증가량 또는 감소량)일 수 있다. 예를 들어, 상기 총 신호 변화값은 데이터 세트에서 신호의 변화가 가장 큰 사이클의 신호 변화값일 수 있다. 구체적으로, 총 신호 변화값은 데이터 세트의 베이스라인의 신호값과 최대 신호값의 차이일 수 있으며, 또는 데이터 세트의 베이스라인의 신호값과 마지막 사이클의 신호값의 차이일 수 있다.
한편, 총 신호 변화값이 데이터 세트의 일부 구간에서 결정되는 경우, 상기 총 신호 변화값은 상기 일부 구간의 첫번째 사이클과 마지막 사이클의 신호값의 차이일 수 있으며, 또는 상기 일부 구간에서 최대 신호값과 최소 신호값의 차이일 수 있다. 동일한 농도의 표적 분석물질을 이용하여 신호발생반응이 수행되는 경우, 이론적으로 동일한 기기 또는 상이한 기기에서 일정한 총 신호 변화값이 얻어져야 한다. 그러므로, 복수의 데이터 세트간의 신호 편차는 상기 총 신호 변화값에 기반한 보정에 의하여 감소될 수 있다.
표준 데이터 세트의 총 신호 변화값과 비교하여 보정계수를 결정하는데 사용되는 총 신호 변화 값을 기준 총 신호 변화값이라 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 총 신호 변화값은 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용된 것과 상이한 반응자리를 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트를 포함하는 1 또는 그 이상의 데이터 세트에 의해 결정될 수 있다.
구체적으로, 기준 총 신호 변화값은 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용된 것과 상이한 반응자리를 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트와 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용된 것과 동일한 반응자리를 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트를 함께 이용하여 결정될 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 기준 총 신호 변화값은 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 데이터 세트를 수득하는데 사용된 것과 상이한 반응자리를 이용한 신호발생반응으로부터 수득한 데이터 세트에 의하여 결정될 수 있다.
기준 총 신호 변화값은 표준 데이터 세트와 별개로 수득한 총 신호 변화값 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준 총 신호 변화값은 미리 결정된 총 신호 변화값 일 수 있다. 상기 기준 총 신호 변화값은 기준 (또는 표준) 반응용기 또는 기기 및 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 수득할 때 사용한 것과 실질적으로 동일한 물질을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 기준 총 신호 변화값은 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 신호발생반응에서 수득한 데이터 세트로부터 결정될 수 있다. 택일적으로, 본 발명의 기준 총 신호 변화값은 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응에서 수득한 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값으로부터 산출될 수 있다. 이 경우, 기준 총 신호 변화값은 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응에서 수득한 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값의 평균 또는 중간값일 수 있으며, 또는 알려진 농도의 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응의 결과를 기초로 실험자에 의하여 미리 결정될 수 있다.
택일적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 표준 데이터 세트가 복수의 표준 데이터 세트인 경우, 기준 총 신호 변화값은 상기 복수의 표준 데이터 세트로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 복수의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 중 하나가 기준 총 신호 변화값으로 결정될 수 있으며, 또는 복수의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값들의 평균 또는 중간값이 기준 총 신호 변화값으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 동일한 판단기준에 의하여 분석되는 복수의 데이터 세트의 기준 사이클에서의 복수의 신호값들의 범위에서 결정될 수 있다. 기준값이 동일한 판단기준에 의하여 분석되는 복수의 데이터 세트의 기준 사이클에서의 복수의 신호값들의 범위에서 결정되는 경우, 상기 복수의 데이터 세트는 데이터 세트와 보정된 데이터 세트 간의 차이를 최소화 하면서 보정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 데이터 세트의 표준화 계수는 기준값 및 기준사이클 및 데이터 세트를 이용하여 제공될 수 있다. 구체적으로, 보정하려는 데이터 세트에 있어서, 표준화 계수는 기준 사이클에 대응하는 사이클에서의 신호값과 기준값을 이용하여 제공될 수 있다. 상기 표준화 계수는 반응에 의하여 수득한 데이터 세트의 복수의 데이터 지점들에 적용이 되며, 이로 인해 데이터 세트를 보정한다.
데이터 세트가 복수의 데이터 세트인 경우 상기 복수의 데이터 세트는 서로 다른 반응용기에서 복수의 신호발생반응에 의하여 수득된 것 일 수 있다. 이 경우, 표준화 계수는 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트별로 제공되고, 상기 제공된 표준화 계수를 적용하여 복수의 데이터 세트가 보정될 수 있다. 동일한 판단기준에 의하여 분석되는 데이터 세트들 간에 나타나는 신호 편차를 줄이기 위하여, 본 발명의 방법은 각 데이터 세트에 적절한 표준화 계수를 제공한다. 표준화 계수는 데이터 세트의 복수의 데이터 지점들의 신호값들에 적용이 되며, 이로 인해 보정된 데이터 세트를 제공하기 위한 보정된 신호값을 얻을 수 있다.
표준화 계수는 기준값 및 기준사이클 및 데이터 세트를 이용하여 제공될 수 있다. 상기 표준화 계수는 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공될 수 있다. 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계는 다양한 방법으로 나타낼 수 있으며, 예를 들어 상기 관계는 수학적으로 정의될 수 있다. 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클(다시말해, "데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클")의 신호값은 변형되지 않은 신호값 그 자체이거나, 수학적으로 변형된 신호값일 수 있다. 구체적으로, 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값과 기준값 사이의 관계는 상기 두 값의 차이(difference)이다. 상기 두 값의 차이는, 구체적으로 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값과 기준값의 비율(ratio)이다.
데이터 세트에서 기준 사이클에 해당하는 사이클은 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값은 단일 신호값일 수 있다. 택일적으로 상기 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값은 복수의 신호값일 수 있다.
표준화 계수는 하나의 신호값과 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되거나, 복수의 신호값과 기준값 사이의 관계를 정하여 제공될 수 있다. 상기 복수의 신호값은 단일 기준 사이클 또는 복수의 기준 사이클에서 수득될 수 있다.
표준화 계수가 기준값과 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값에 의하여 제공되는 경우, 표준화 계수는 기준값에 대한 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값의 비율에 의해 결정될 수 있다.
표준화 계수가 기준값과 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 복수의 신호값에 의하여 제공되는 경우, 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 복수의 신호값은 복수의 기준 사이클 또는 단일 기준 사이클에 의하여 정해질 수 있다.
예를 들어, 3번째 사이클이 단일 기준 사이클로 지정되면, 기준사이클 대응 사이클에서의 복수의 신호값은 상기 3번째 사이클의 신호값 및 상기 3번 째 사이클의 앞 또는 뒤에 위치한 사이클들의 신호값을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 2, 3, 4번째 사이클이 복수의 기준 사이클로 지정되면, 기준사이클 대응 사이클에서의 복수의 신호값은 기준사이클 대응 사이클인 2, 3, 4번째 사이클들의 신호값을 포함할 수 있다.
기준 사이클에 의해 지정된 복수의 신호값들과 기준값의 관계는 다양한 방법으로 정의 될 수 있다. 예를 들어, 상기 복수의 신호값과 기준값의 관계는 지정된 복수의 신호값들의 평균값, 중간값, 최소값 또는 최대값, 또는 상기 복수의 신호값 중 임계값 이하의 신호값의 평균값과 기준값의 비율로 정의 될 수 있다. 바람직하게는 상기 기준사이클에 의해 지정된 복수의 신호값들과 기준값의 관계는 복수의 신호값의 평균의 기준값에 대한 비율로 정의될 수 있다. 복수의 신호값들이 표준화 계수를 제공하는데 이용되면, 하나의 비정상 신호값이 데이터 세트의 보정에 미치는 영향이 최소화 될 수 있다.
예를 들어, 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클에서의 신호값이 0인 경우, 데이터 세트의 모든 보정된 신호값들이 동일한 값을 가지게 된다. 이러한 잘못된 결과의 발생은 단일 신호값을 이용하여 표준화 계수를 제공할 때 보다, 복수의 신호값을 이용하여 표준화 계수를 제공할 때 월등히 감소하게 된다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준화 계수가 0인 경우, 표준화 계수 제공에 사용되는 모든 또는 일부 신호값들은 다른 신호값으로 변경될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준화 계수는 기준값 및 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클에서의 신호값을 이용하여 제공될 수 있다.
상기 표준화 계수는 다음의 수학식에 의하여 제공될 수 있다:
[표준화 계수 = 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 / 기준값]
예를 들어, 표적 분석물질의 검출을 위하여 실시간 PCR을 수행하여 수득한 데이터 세트가 다음의 조건에 의해 보정되는 경우 표준화 계수는 1.48로 산출된다.
(a) 5번째 사이클이 기준 사이클로 지정되고, (b) 기준값으로 9000이 지정되고, (c) 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값이 13,285이며, (d) 데이터 세트에서 상기 기준사이클 대응 사이클의 신호값과 기준값의 관계는 기준값에 대한 데이터 세트의 상기 기준사이클 대응 사이클의 신호값의 비율이다. 상기 표준화 계수 (1.48)을 복수의 데이터 지점의 신호값에 적용하여 보정된 데이터 세트가 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값의 기준값에 대한 비율을 정하여 제공될 수 있으며, 상기 표준화 계수는 다음의 수학식에 의하여 결정될 수 있다:
[표준화 계수 = α X (데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 / 기준값)]
상기 α (알파)는 0이 아닌 실수이며, 바람직하게는 1일 수 있다. 상기 α는 상기 기준값이 임의로(arbitrary) 정해지지 않고 다른 인자(factor)에 종속되어 결정되는 경우 데이터 세트가 분석에 적절한 범위로 보정되도록 표준화 계수를 조절하는 상수이다. 반응의 신호 수준은 상기 기준값 또는 상기 α 값의 조정을 동반한 신호값의 보정을 통하여 조절할 수 있으므로, 신호발생반응에 이용되는 반응 혼합물의 양에 대한 조절이 가능하다.
데이터 세트의 모든 데이터 지점들은 동일한 수학식에 따른 동일한 표준화 계수에 의해 보정될 수 있으며, 택일적으로, 데이터 세트의 모든 또는 일부 데이터 지점은 서로 상이한 표준화 계수가 적용되거나, 동일한 표준화 계수가 서로 상이한 수학식에 의하여 적용되어 보정될 수 있다.
단계 (b):
표준화 계수에 의한 보정된 데이터 세트의 제공 (S120)
보정된 데이터 세트는 표준화 계수를 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 제공된다. 구체적으로, 보정된 데이터 세트는 복수의 데이터 지점들의 신호값에 표준화 계수를 적용하여 보정된 신호값을 얻어 제공될 수 있다.
상기 표준화 계수는 다양한 방식에 의하여 데이터 세트의 신호값들에 적용될 수 있다.
표준화 계수가 기준값에 대한 상기 데이터 세트의 기준사이클 대응 사이클의 신호값의 비율에 의해 결정되는 경우, 보정된 데이터 세트는 보정된 신호값을 구하여 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 보정된 신호값은 다음의 수학식1에 의하여 제공될 수 있다:
수학식1
보정된 신호값 = 신호값 / 표준화 계수
상기 수학식 1의 신호값은 보정전 신호값이다. 보정전 신호값은 표준화 계수에 의하여 데이터 세트가 보정되기 전의 데이터 세트의 신호값을 말한다. 그러므로, 보정전 신호값은 측정된 신호값이거나, 상기 측정된 신호값의 가공된 신호값일 수 있다. 상기 가공은 표준화 계수를 이용한 보정과는 독립적으로 수행되는 절차이다. 예를 들어, 신호값의 가공은 신호값으로부터 특정 값을 더하거나 빼는 방법으로 수행될 수 있다. 특히, 상기 가공은 측정된 신호값에서 기기 블랭크 신호의 전부 또는 일부를 차감하는 것 일 수 있다.
보정된 신호값은 본 발명의 표준화 계수에 의하여 보정된 신호값을 말한다. 보정된 데이터 세트는 데이터 세트의 보정된 신호값을 추가 보정 없이 데이터 세트의 신호값으로 이용하여 제공될 수 있다.
또는 택일적으로, 상기 보정된 데이터 세트는 보정된 신호값을 추가 보정하여 데이터 세트의 신호값으로 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 표준화 계수에 의하여 보정된 신호값에 특정 값을 더하거나 차감하는 방법으로 추가 보정 될 수 있다. 구체적으로, 표준화 계수에 의하여 보정된 신호값은 베이스라인 신호값을 추가로 차감하는 것으로 추가 보정 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 보정된 데이터 세트는 시료 내 표적 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 데이터 세트는 기준 염색제(reference dye)의 사용 없이 표적 분석물질에 대한 신호발생반응에 의하여 수득될 수 있으며, 이는 본 발명의 특징 중 하나이다. 종래 기술에 따르면, 기준 염색제는 표준화를 위하여 반응 혼합물에 첨가된다(참조: WO2012/083235). 이러한 선행 기술은 다음과 같은 문제점이 있다.
기준 염색제를 반응 혼합물에 추가하는 것은 기준 염색제와 표적 분석물질의 존재를 검출하기 위한 다른 염색제 사이의 간섭 현상의 가능성을 증가시킬 수 있다. 반대로, 본 발명은 기준 염색제를 신호발생수단이 포함되는 반응 혼합물에 추가하지 않고 데이터 세트를 보정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 데이터 세트는 신호발생수단을 포함한 반응 혼합물에 기준 염색제의 투여 없이 표적 분석물질의 신호값을 사용하여 보정될 수 있으므로, 신호발생수단과 함께 기준 염색제를 사용하는 종래의 방법에 비하여 정확하고 효과적으로 데이터 세트를 보정할 수 있으며, 분석 결과의 편차와 관련한 다양한 문제를 극복할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 2개 그룹의 데이터 세트에 대한 기기간 및 기기내 변동계수(CV; coefficient of variation)가 계산되고 비교되었다. 데이터 세트 그룹 1은 하드웨어적으로 보정하지 않은 3개의 기기를 이용한 실시간 PCR을 통해 수득한 원시데이터 세트를 본 발명의 방법에 따라 보정하여 수득한 것이다. 데이터 세트 그룹 2는 하드웨어적으로 보정한 3개의 기기를 이용한 동일한 실시간 PCR을 통해 수득한 데이터 세트이다.
또한 실시예에서 2개 그룹의 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 신호 변화에 대한 변동계수가 계산되고 비교되었다. 멜팅 데이터 세트 그룹 1은 하드웨어적으로 보정하지 않은 3개의 기기를 이용한 실시간 PCR의 결과물을 멜팅 분석하여 수득한 원시 멜팅데이터 세트를 본 발명의 방법에 따라 보정하여 수득한 것이다. 데이터 세트 그룹 2는 하드웨어적으로 보정한 3개의 기기를 이용한 동일한 실시간 PCR의 결과물을 멜팅 분석하여 수득한 멜팅 데이터 세트이다.
실험 결과, 그룹 1의 데이터 세트 또는 멜팅 데이터 세트의 기기간 및 기기내 신호 변화에 대한 변동계수가 그룹2의 데이터 세트 또는 멜팅 데이터 세트의 것보다 월등히 작은 것을 확인하였다. 이로서, 본 발명의 방법이 증폭 데이터 세트 뿐만 아니라, 멜팅 데이터 세트에 대한 하드웨어적인 조정의 대안이 될 수 있음을 알 수 있다.
한편, 본 발명의 방법에 따르면, 기준값의 조절을 통하여 데이터 세트의 신호값 수준이 조정될 수 있다. 그 결과, 적은 양의 신호발생수단(예를 들어 프라이머 및 프로브)을 사용하는 경우에도 통계적으로 유의미한 표준화 된 데이터 세트를 얻을 수 있으며, 시료내 표적 분석물질의 존재, 부존재를 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 데이터 세트의 베이스라인의 최대 신호값보다 높은 값으로 선택될 수 있으며, 신호발생반응은 상이한 반응 환경에서 수행된 동종의 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응이며, 데이터 세트는 복수의 데이터 세트이며, 상기 복수의 데이터 세트는 동일한 기준값 및 동일한 기준 사이클을 이용하여 보정될 수 있다.
상기 기준값은 데이터 세트의 베이스라인의 최대 신호값보다 높게 설정되며, 데이터 세트의 베이스라인의 최대 신호값에 대한 상기 기준값의 비율은 특별히 한정되지 아니하나, 예를 들어 베이스라인의 최대 신호값의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 및 500배의 신호값으로 설정될 수 있다.
흥미롭게도, 본 발명의 방법에 의하여 복수의 데이터 세트의 신호 수준을 의도한 수준으로 증가시키면서, 동시에 복수의 데이터 세트간의 신호 편차를 최소화 할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는 2개 그룹의 데이터 세트가 비교되었다. 데이터 세트 그룹 1은 다양한 농도의 신호발생수단을 이용하여 수득한 데이터 세트이며, 따라서 다양한 수준의 신호값을 가진다. 데이터 세트 그룹 2는 낮은 농도의 신호발생수단을 이용하여 원시 데이터 세트를 얻고, 원시 데이터 세트의 신호값의 수준이 데이터 세트 그룹 1의 신호값의 수준이 되도록 조절된 복수의 기준값들을 이용하여 원시 데이터 세트를 각각 보정하여 수득하였다. 그 결과, 데이터 세트 그룹 1 및 2는 유사한 증폭 곡선 패턴과 유사한 Ct 값을 가지는 것을 확인하였다.
또한 낮은 농도의 신호발생수단을 이용하여 수득한 원시 데이터 세트를 보정한 데이터 세트와 보정전 원시 데이터 세트의 CV는 실질적으로 동일한 것을 확인하였다.
II. 기록 매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독 가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계.
프로그램 지시들은 프로세서에 의하여 실행될 때, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하도록 한다. 상기 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법에 대한 프로그램 지시들은 기준값, 기준 사이클 및 상기 데이터 세트를 이용하여 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수를 제공하는 지시 및 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 지시를 포함할 수 있다.
상기 기술한 본 발명의 방법은 독립 실행형 컴퓨터, 네트워크 부착 컴퓨터 또는 실시간 PCR 장치와 같은 데이터 수집 장치에 있는 프로세서와 같은 프로세서에 내장될 수 있다.
컴퓨터 해독가능한 기록매체는 당업계에 공지된 다양한 저장 매체, 예를 들어, CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 저장매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
데이터 세트는 다양한 방식으로 수집될 수 있다. 예를 들어, 데이터 세트는 PCR 데이터 수집 장치에 있는 프로세서에 의해 수집될 수 있다. 데이터 세트는 실시간으로 프로세서에 제공될 수 있고 또는 메모리 유닛 또는 버퍼에 저장되고 실험 완료 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게는, 데이터 세트는, 상기 수집 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크 및 포터블 HDD와 같은 포터블 매체 상에 제공될 수 있다. 유사하게, 데이터 세트는, 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다.
본 발명을 실행하는 프로세서에 구현된 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 소프트웨어 기록 매체(예컨대, 포터블 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD)로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM 또는 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하는 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전달에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 본 발명의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 장치(device)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 시료 및 신호-발생 수단을 수용할 수 있는 반응용기, 상기 반응용기의 온도를 조절하는 온도조절 수단 및/또는 증폭 사이클에서의 신호를 검출하는 검출기를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로세서는 사이클에서의 신호값을 수신할 뿐만 아니라, 시료 또는 데이터 세트를 분석하거나, 시료내 표적 분석물질에 대한 보정된 데이터 세트를 수득할 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 하나의 프로세서가 상술한 퍼포먼스를 모두 하도록 구축될 수 있다. 택일적으로, 프로세서 유닛은 여러 개의 프로세서가 각각의 퍼포먼스를 실행하도록 구축할 수 있다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 프로세서는 표적 분석물질(예컨대, 표적 핵산분자)의 검출에 이용되는 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치)에 소프트웨어를 인스톨 하여 구현시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 수득하고, 임의로 정해진 기준값, 기준 사이클 및 데이터 세트를 이용하여 표준화 계수를 제공한 후, 상기 표준화 계수를 데이터 세트의 신호값에 적용하여 보정된 신호값을 얻는 방법으로 보정된 데이터 세트는 제공된다.
기준값 및 기준 사이클은 제품 공급자 또는 사용자가 임의로 정한 값을 사용할 수 있다. 택일적으로, 기준값 및 기준 사이클은 본 발명의 장치가 결정 할 수 있다. 예를 들어, 복수의 데이터 세트를 수집한 본 발명의 장치는 누적된 복수의 데이터 세트의 신호값들을 고려하여 배경신호 영역의 사이클로부터 기준 사이클을 결정할 수 있다. 또한 본 발명의 장치는 누적된 복수의 데이터 세트의 신호값을 고려하여 복수의 데이터 세트들에서 기준 사이클에 대응하는 사이클의 신호값들의 평균±표준편차의 범위에서 기준값을 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 표준 데이터 세트와 기준 표준 데이터 세트의 비율 및 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값을 고려하여 기준값을 결정할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 의하면, 데이터 세트에 표준화 계수를 적용하는 간단한 방식으로 데이터 세트를 보정 할 수 있으며, 이로서 기기간 및 기기내 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 특히, 기기간 신호 편차 뿐만 아니라, 기기내 서로 다른 위치(예를 들어, 서로 다른 반응 튜브 또는 웰)에서 수행된 신호발생반응들 사이의 기기내 신호 편차를 감소시킬 수 있어, 정확도 및 재현성이 우수한 분석이 가능하다.
(b) 본 발명은 기준 염색제를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 방법은 기준 염색제를 사용하는 기존의 신호 보정 방법에 비하여 더욱 정확하고, 경제적으로 데이터 세트를 보정할 수 있다. 기기간 신호 편차를 감소시키기 위하여, 기준 염색제를 사용하는 기존의 보정 방법은 기준 염색제를 검출하는 광학 채널과 표적 분석물질을 검출하는 광학 채널의 기기간 신호 편차가 동일하여야 한다. 그러므로, 기존의 보정 방법은 단지 기준 염색제를 사용하는 것으로 기기간 신호 편차와 관련된 문제를 성공적으로 해결할 수 없으며, 하드웨어적인 보정을 통한 추가 보정이 필요하다. 더구나, 기존의 방법은 기기내 신호 편차를 감소시키기 위해서는 반응 혼합물에 기준 염색제를 사용하는 조건(예를 들어, 기준 염색제의 품질 또는 양)이 모든 반응 혼합물에 있어서 동일하여야 하는 문제가 있다.
(c) 본 발명의 방법에 의하면, 데이터 세트가 기준 염색제를 반응 혼합물에 첨가하지 않고도 보정될 수 있으므로, 보정을 위한 파장영역을 할당할 필요가 없다. 따라서, 기준 염색제에 의한 형광 간섭의 문제가 발생하지 않으며, 이러한 점은 high multiplex 실시간 PCR에서 특히 큰 장점이 된다.
(d) 본 발명의 보정 방법은 소프트웨어로 구현이 될 수 있으므로, 제조사에 관계 없이 다양한 분석기기(예를 들어, 실시간 PCR 기기)에 범용적으로 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 전통적인 하드웨어적 보정 방법에 비하여 매우 간편하고, 범용성이 우수하다.
(e) 축퇴성(degenerate) 프라이머 및/또는 프로브를 사용하는 RNA 바이러스의 검출에서는 신호 편차가 매우 중요한 문제이다. 본 발명의 방법에 의하면, 신호 편차를 획기적으로 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 RNA 바이러스를 검출하기 위한 축퇴성 프라이머 및/또는 프로브 사용에 따른 신호 편차의 문제에 대하여 탁월한 해결방법이 될 수 있다.
(f) 본 발명에 의하면, 데이터 세트의 신호 수준은 기준값의 조절에 의하여 조정이 가능하다. 그 결과, 적은 양의 신호발생수단(예를 들어, dNTP, 효소, 프라이머 및 프로브)을 사용하는 경우에도 통계적으로 유의미한 표준화 된 데이터 세트를 얻을 수 있다.
도 1은 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 보정하기 위한 방법의 일구현예를 도시한 흐름도이다.
도 2a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호 편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 2b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 나타낸 것이다.
도 3a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 3b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 4b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 5b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 6b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 7b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법(the instrument blank signal subtraction and specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 8b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 9b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 10b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 11b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 12b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 13b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 14b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 85℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 15b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 16b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 17b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 다양한 농도의 프로브를 이용하여 수득한 데이터 세트와 다양한 기준값을 이용하여 본 발명의 IBS-SBN방법에 의해 수득한 보정 데이터 세트의 비교 결과이다.
도 2a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호 편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 2b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 나타낸 것이다.
도 3a는 배경신호에 대한 기기간 신호 편차 및 기기내 신호편차를 확인하기 위하여, 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 3b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 4b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 5b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 6b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법(specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 7b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법(the instrument blank signal subtraction and specific background signal based normalization method)에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 8b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 9b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 공통 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 10b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 11b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 데이터 세트의 베이스라인이 차감된 증폭곡선 및 상기 보정 데이터 세트들의 기기간 및 기기내 변동계수(coefficient of variation)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 12b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 13b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 14b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14c는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 85℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 15b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 공통 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 16b는 하드웨어적으로 미보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 커브를 나타낸 것이다.
도 17b는 하드웨어적으로 보정된 3개의 기기로부터 각각 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값 및 기준 온도 55℃를 기준 사이클로서 이용한 본 발명의 IBS-SBN방법에 따라 보정하여 수득한 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값을 플로팅하여 수득한 멜팅 피크 및 상기 멜팅 데이터 세트들의 최대 변화값들의 기기간 및 기기내 변동계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 다양한 농도의 프로브를 이용하여 수득한 데이터 세트와 다양한 기준값을 이용하여 본 발명의 IBS-SBN방법에 의해 수득한 보정 데이터 세트의 비교 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 특정 배경신호 기반 표준화 방법(SBN)에 의한 데이터 세트 보정 및 보정 데이터 세트의 분석
실시간 PCR 기기의 기기 간 신호 편차를 최소화하기 위해 하드웨어적으로 입출력 신호 세기를 조절하는 방법이 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 광원(예를 들어 LED 및 할로겐 램프(Halogen lamp))의 출력 세기를 조정하거나, 또는 검출기(Detector)의 필터(Filter)에서 입력 세기의 조정을 통하여 신호를 보정한다.
실시예에서는 데이터 세트의 증폭 신호의 편차를 보정하기 위하여 본 발명의 특정 배경신호 기반 표준화 방법(Specific Background signal-based Normalization; SBN)을 사용하였다.
다음 3개 그룹의 데이터 세트에 대한 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹, (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트 그룹 및 (iii) SBN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트.
<1-1> 데이터 세트 준비
표적 핵산 분자에 대한 실시간 PCR은 표 1에 기재된 3대의 CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad)에서 TaqMan 프로브를 신호발생수단으로 사용하여 증폭 사이클 50회로 수행되었다. 표적 핵산 분자는 Ureaplasma urealyticum의 지놈 DNA를 사용하였다. 상호작용적 이중 표지는 TaqMan 프로브에 리포터 분자(FAM) 및 퀀처 분자(BHQ-1)를 결합하여 사용하였다. 반응은 표적 핵산 분자, 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, TaqMan 프로브 및 MgCl2, dNTPs 및 Taq DNA polymerase를 포함하는 마스터 믹스가 포함된 튜브에서 수행되었다. 반응 혼합물이 포함된 튜브를 실시간 thermocycler (CFX96, Bio-Rad)에 장착하고, 15분간 95℃에서 변성 후, 95℃ 10초, 60℃ 60초 및 72℃ 10초를 1 사이클로 하여 50 사이클을 진행하였다. 각 사이클마다 60℃에서 신호를 측정하였다.
동일한 표적 핵산서열이 동일한 농도로 포함된 시료를 이용하여 각 기기별로 96개 웰에서 96개 반응을 동일한 조건에서 수행하였으며, 이로부터 얻어진 데이터 세트를 분석하여 데이터 세트들의 기기간, 기기내 신호 편차 및 본 발명의 SBN 방법에 따른 편차 수준의 감소 여부를 확인하였다.
3개의 기기를 하드웨어적인 보정을 하지 아니한 미보정 상태로 반응을 진행하여 3개 그룹의 데이터 세트를 수득하고, 하드웨어적인 보정을 하고 반응을 진행하여 3개 그룹의 데이터 세트를 수득하여, 총 6개 그룹의 원시 데이터 세트들을 준비하였다. 각 그룹은 96개의 반응을 통하여 수득한 96개의 데이터 세트로 형성된다.
상기 원시 데이터 세트들로부터 베이스라인 차감된 데이터 세트들을 구하였다. 베이스라인 차감된 데이터 세트는 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 실시간 PCR 반응을 통해 얻어진 원시 데이터 세트에서 3번째 사이클로부터 증폭이 시작되기 전 사이클까지를 베이스라인으로 설정하고, 상기 구간의 사이클에 대한 신호값의 회귀직선 방정식을 구한다. 각 사이클마다 측정된 신호값에서 해당 사이클에서 상기 회귀직선 방정식을 통해 계산된 신호값을 차감하여 베이스라인 차감된 데이터 세트를 구한다.
| 명칭 | 실시간PCR 기기 |
| 기기 1 | CFX96 Real-time Cycler (Bio-Rad) |
| 기기 2 | |
| 기기 3 |
<1-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 분석상기 실시예 <1-1>에서 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트와 이로부터 얻어진 3개 그룹의 베이스라인 차감된 데이터 세트의 신호 편차를 분석하였다.
3개 기기의 배경신호 세기를 비교하기 위하여, 베이스라인이 차감되지 않은 원시 데이터 세트들을 플로팅하여 베이스라인 차감이 없는 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)을 수득하였다(도 2A 참조).
도 2A에서 보는 바와 같이, 동일한 조건의 증폭반응이므로 이론상 동일한 세기의 배경 신호가 플로팅 되어야 하지만 기기간 배경 신호가 구분되어 나누어지는 것을 확인하였다. 또한 동일 기기에서 서로 다른 웰에서 이루어진 서로 다른 반응 간에도 배경 신호의 세기에 차이가 있는 것을 확인하였다.
증폭구간의 신호 편차를 비교하기 위하여, 각 기기들로부터 수득한 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅 하여 베이스라인이 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)을 준비하였다.
베이스라인이 차감된 데이터 세트들의 마지막 사이클(50 번째 사이클)을 분석 사이클(analytical cycle)로 정하고, 상기 50 번째 사이클에서 증폭 신호의 변동계수(Coefficient of variation, CV)를 수득하였다(도 2B 참조).
변동 계수는 데이터의 표준편차를 산술 평균으로 나눈 것이다.
기기내 변동계수는 하나의 기기에서 측정된 복수개의 반응에 대한 결과들 중에서 특정 사이클에 대응하는 신호값들의 표준편차와 산술평균으로 산출하였다. 기기간 변동계수는 실험에 사용된 3대의 기기에서 측정된 모든 반응에 대한 결과 데이터 세트들에서 특정 사이클에 대응하는 신호값들의 표준편차와 산술평균으로 산출하였다.
도 2B에서와 같이, 베이스라인 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)의 마지막 사이클에서 증폭 신호의 변동계수를 확인한 결과, 기기내 증폭 신호 변동계수는 5.2%, 9.1%, 그리고 4.5%로 확인되었고, 기기간 증폭 신호 변동계수는 49.3%로 확인되었다.
<1-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 분석
실시예 <1-1>에서 수득한 원시 데이터 세트들 및 이들의 베이스라인 차감된 데이터 세트를 사용하였다. 신호 편차는 하드웨어적으로 보정된 기기들로부터 수득한 3개 그룹의 원시 데이터 세트 및 이로부터 수득한 베이스라인 차감된 3개 그룹의 데이터 세트의 신호 편차를 분석하였다.
실시예 <1-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 베이스라인 차감 없는 증폭 곡선(No Baseline Subtracted Curve)을 분석하였다. 도 3A에 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트에 비하여 기기간 배경 신호의 편차는 감소하였으나, 여전히 기기간, 반응간 넓게 분산된 배경 신호 편차 분포를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 베이스라인 차감된 증폭 곡선(Baseline Subtracted Curve)의 마지막 사이클에서 증폭 신호의 변동계수를 확인하였다. 도 3B에서 보는 바와 같이, 기기 1, 2 및 3의 증폭신호들의 기기내 증폭 신호 변동계수는 5.3%, 7.8%, 그리고 5.5%로 각각 확인되었고, 기기 1, 2 및 3의 증폭신호들의 기기간 변동계수는 17.7%로 확인되었다.
실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 결과와 상기 결과를 비교하면, 증폭신호의 기기내 변동계수는 큰 변화가 없는 것으로 확인되었으며, 증폭신호의 기기간 변동계수는 31.6p%(퍼센트 포인트) 감소한 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과로부터, 하드웨어 조정에 의한 보정은 기기의 증폭신호의 기기간 변동계수를 일부 감소시킬 수 있지만, 여전히 기기간 상당 수준의 신호 편차가 존재하며, 단일 기기내 웰간 증폭신호의 변동계수는 하드웨어 조정에 의하여 감소시킬 수 없음을 확인하였다.
<1-4> SBN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 데이터 세트의 분석
특정 배경신호 기반 표준화 방법(SBN)은 기준값과 기준 사이클에서의 신호값을 이용하여 데이터 세트를 비율적으로 표준화 하는 방법이며, 보정대상 데이터 세트의 배경신호 영역(베이스라인 영역)의 특정 사이클이 기준 사이클로 지정된다. 복수의 데이터 세트를 동일 기준에 의해 표준화 하기 위하여 기준값 및 기준 사이클은 표준화 하려는 데이터 세트들에 동일하게 적용된다. 반응 환경(예를 들어, 증폭에 사용된 기기)에 따라 복수의 데이터 세트가 몇몇 그룹으로 분류되는 경우, 기준값은 그룹들 간의 상이한 반응 조건을 고려하여 산출될 수 있으며, 산출된 기준값은 각 그룹에 적용될 수 있다.
<1-4-1>
공통 기준값을 적용한 SBN을 이용한 데이터 세트의 보정
본 실시예에서는 모든 기기들에서 수득한 데이터 세트에 하나의 공통 기준값을 적용하여 데이터 세트를 보정하였다. 실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 다음의 단계들에 따라 SBN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
원시 데이터 세트의 배경지역(baseline region)의 특정 사이클을 기준 사이클로 지정하였다. 본 실시예에서는 5번째 사이클을 기준 사이클로 지정하였다.
<단계 2>
특정 배경 신호로 표준화 하기 위하여 기준값을 지정하였다. 본 실시예에서는 RFU 8,400을 기준값으로 지정하였다.
<단계 3>
상기 단계 2에서 지정된 기준값 및 기준 사이클에 대응하는 원시 데이터 세트의 사이클에서의 신호값으로부터 표준화 계수(normalization coefficient)를 계산하였다.
표준화 계수 = 기준 사이클에서의 신호값 
기준값
<단계 4>
모든 사이클에서의 신호값을 상기 표준화 계수를 이용하여 보정하였다.
보정된 신호값(RFU) = 원시 데이터 세트의 신호값(RFU) 
표준화 계수.
실시예 <1-1>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 1 내지 4 단계에 따라 보정하여 보정된 6개 그룹의 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 4A 및 도 4B는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 4A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 4B)를 각각 나타낸다.
보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 4A는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 도 4A에서 나타난 바와 같이, 기기간 배경신호 편차의 분포가 SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 5번째 사이클(기준 사이클)에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 배경신호의 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 보정된 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 4B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 2.3%, 3.0% 및 1.0%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 12.1%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 2 에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 37.2p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 5.6p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 SBN에 의한 신호 보정 방법이 기기간 신호 편차 뿐만 아니라 단일 기기내 웰간 신호 편차도 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 SBN 방법이 기기를 하드웨어적으로 보정하는 방법보다 현저히 우수한 보정 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 기기에 대한 하드웨어상의 신호 보정 없이 SBN에 의한 보정 만으로도 하드웨어적인 보정보다 우수한 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | 특정 배경신호 기반 표준화(SBN) | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV, %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 3.0 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.0 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 12.1 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 SBN방법에 의해 추가 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 5A 및 도 5B는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 5A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 5B)를 각각 나타낸다.
보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 5A는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 도 5A에서 나타난 바와 같이, 기기간 배경신호 편차의 분포가 SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 5번째 사이클(기준 사이클)에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 배경신호의 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 보정된 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 5B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 2.3%, 2.3% 및 1.9%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 4.2%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 3 에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 45.1p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 13.5p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 SBN에 의한 신호 보정 방법이 기기간 신호 편차 뿐만 아니라 단일 기기내 웰간 신호 편차도 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 추가적인 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 특정 배경신호 기반 표준화(SBN) |
- | - | + |
| 하드웨이 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV, %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 2.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.9 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 4.2 |
<1-4-2> 총 신호 변화값에 따라 결정된 기기별 기준값을 적용한 SBN에 의한 데이터 세트 보정
본 실시예에서는 기기간 편차를 고려하여 결정된 기기별 기준값을 적용하여 데이터 세트를 보정하였다. 기기별 기준값은 기준 총 신호 변화값(R-TSC; reference total signal change value) 및 각 기기의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC; total signal change value)의 비율을 이용하여 결정하였다.
기준 총 신호 변화값(R-TSC)은 표준 기기에서 수득한 데이터 세트의 총 신호 변화값 또는 복수의 데이터 세트의 총 신호 변화값으로부터 결정될 수 있다. 또한 기준 총 신호 변화값은 해당 표적 분석물질에 대한 복수의 신호발생반응의 결과를 기초로 실험자에 의하여 결정될 수 있다.
표준 데이터 세트는 알려진 농도(표준 농도)의 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득된 데이터 세트를 의미한다. 각 기기의 표준 데이터 세트는 알려진 농도의 표적 분석물질을 이용하여 각 기기에서 신호발생반응을 수행하여 수득하였다.
총 신호 변화값(The total signal change value; TSC)은 해당 데이터 세트에서의 증가 또는 감소된 신호 변화량을 의미한다. 기기별 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값은 각 기기에서 수득한 표준 데이터 세트로부터 산출한다.
기기별 기준값을 결정하기 위하여, 표준 농도의 표적 분석물질을 이용하여 각 기기의 표준 데이터 세트를 수득하고, 이로부터 표준 데이터 세트에 대한 기기별 총 신호 변화값을 결정하였다. 미리 결정된 기준 총 신호 변화값(R-TSC)에 대한 기기별 총 신호 변화값(TSC)의 비율을 산출하였다. 상기 산출된 비율을 이용하여 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값을 보정하고, 그 결과 보정된 기준 사이클에서의 신호값을 해당 기기에서 수득한 데이터 세트에 적용할 기기별 기준값으로 결정하였다.
상기 결정된 기기별 기준값을 이용하여 해당 기기로부터 수득한 데이터 세트를 보정하여 기기간 편차를 추가적으로 감소시켰다.
아래 단계 1 내지 3에서 기기별 표준 데이터 세트로부터 기기별 기준값을 결정하고, 결정된 기기별 기준값을 이용하여 단계 4에서 실시예 <1-1>에서 수득한 각 원시 데이터 세트를 보정하였다.
<단계 1>
실제 실험 시료로부터 데이터 세트를 수득하기 위하여 실시하는 신호발생반응의 조건과 동일한 반응 조건에서 표준 농도의 표적 분석물질을 이용하여 표준 신호발생반응을 수행하여 기기별 표준 데이터 세트를 수득하였다. 기준값을 결정하기 위한 신호값 및 총 신호 변화값을 기기별 표준 데이터 세트로부터 수득하였다.
본 실시예에서 5번째 사이클이 기준 사이클로 지정되었으므로, 표준 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값을 기준값 결정에 사용될 신호값으로 지정하였다.
표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 산출하기 위하여, 실시예 <1-1>에서와 동일하게 수득한 표준 데이터 세트로부터 베이스라인을 차감하여 베이스라인 차감된 데이터 세트를 수득하였다. 얻어진 베이스라인 차감된 데이터 세트로부터 총 신호 변화값이 산출되었다. 베이스라인 차감된 데이터 세트의 마지막 50번째 사이클에서의 RFU를 상기 총 신호 변화값으로 하였다.
본 실시예에서는 각 기기로부터 3개의 표준 데이터 세트를 수득하고, 각 데이터 세트의 총 신호 변화값 및 기준값 결정에 사용된 신호값을 산출하였다. 구체적으로, 3개의 기기별 표준 데이터 세트로부터 산출된 3개의 총 신호 변화값의 평균을 해당 기기의 총 신호 변화값으로 지정하였다. 또한 3개의 기기별 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값들의 평균을 해당 기기의 기준값 결정에 사용되는 신호값으로 지정하였다.
하드웨어적으로 보정되거나 미보정된 기기 1, 2, 3의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)들 및 기준값 결정에 사용되는 신호값들은 [표 4]와 같이 측정되었다.
| 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC) (RFU) | 표준 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값(기준값 결정에 사용될 신호값) (RFU) |
|||
| 하드웨어 조정 | - | + | - | + |
| 기기 1 | 2538 | 3513 | 5489 | 7011 |
| 기기 2 | 4808 | 5470 | 8858 | 9898 |
| 기기 3 | 8414 | 4601 | 13623 | 8390 |
<단계 2>
상기 산출된 총 신호 변화값과 함께 기기별 기준값 결정에 사용될 기준 총 신호 변화값(R-TSC)이 지정되었다. 본 실시예에서는 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 하드웨어적으로 보정된 3개 기기에서 수득한 데이터 세트들의 평균 총 신호 변화값과 유사한 RFU 4560을 기준 총 신호 변화값으로 지정하였다(도 3B 참조).
<단계 3>
(i) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(단계 1), (ii) 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값(단계 1) 및 (iii) 기준 총 신호 변화값(단계 2)을 이용하여 다음의 수식에 따라 각 기기에 적용될 기준값을 산출하였다.
기준값 = 표준데이터 세트의 기준사이클에서의 신호값 
(표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 / 기준 총 신호 변화값)
기준값 산출 결과, 하드웨어적으로 보정되거나 미보정된 기기 1, 2, 3에서 수득한 데이터 세트의 보정에 사용될 기준값은 [표 5]에서 보는 바와 같이 결정되었다.
| 하드웨어 보정 | 기기 번호 | A) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 (TSC) |
B) 기준 총 신호 변화값 (R-TSC) |
C) TSC와 R-TSC의 비율 [A/B] |
D) 표준 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값 |
E) 결정된 기준값 [D/C] |
| - | 1 | 2538 | 4560 | 0.5566 | 5489 | 9862 |
| 2 | 4808 | 4560 | 1.0545 | 8858 | 8400 | |
| 3 | 8414 | 4560 | 1.8453 | 13623 | 7383 | |
| + | 1 | 3513 | 4560 | 0.7705 | 7011 | 9099 |
| 2 | 5470 | 4560 | 1.1995 | 9898 | 8251 | |
| 3 | 4601 | 4560 | 1.0090 | 8390 | 8316 |
<단계 4>
실시예 <1-1>에서 수득한 6개 그룹의 원시 데이터 세트들을 상기 단계 3에서 결정된 기준값들을 이용하여 실시예 <1-4-1>에서와 동일한 방법으로 보정하여, 6개 그룹의 보정된 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기별 기준값을 적용한 SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 6A 및 도 6B는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 6A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 6B)를 각각 나타낸다.
보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 6A는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 3개 기기로부터 수득한 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 9862, 8400 및 7383으로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 증폭구간도 서로 유사한 신호값을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 보정된 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 6B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 2.3%, 3.0% 및 1.0%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 3.0%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 6 에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 46.3p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 5.6p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
이로서, 본 발명의 신호 보정 방법에 의하면, 기기별 표준 데이터 세트를 이용하여 기기별로 적용되는 기준값을 조정하여도 기기간 신호 편차 및 단일 기기내 웰간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 SBN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 3.0 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.0 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 3.0 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 7A 및 도 7B는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 7A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 7B)를 각각 나타낸다.
보정된 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 7A는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 3개 기기로부터 수득한 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 9099, 8251 및 8316으로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 증폭구간도 서로 유사한 신호값을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 보정된 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 7B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 2.3%, 2.3% 및 1.9%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 2.3%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 본 실시예의 기기별 기준값을 이용한 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 7에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 47p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 15.4p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
이로서, 본 발명의 신호 보정 방법에 의하면, 기기별 표준 데이터 세트를 이용하여 기기별로 적용되는 기준값을 조정하여도 기기간 신호 편차 및 단일 기기내 웰간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 추가적인 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 SBN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 2.3 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 2.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.9 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 2.3 |
본 발명의 SBN을 이용한 실시간PCR 기기로부터 수득한 신호의 보정 방법은 기기내 신호 편차 및 기기간 신호 편차를 쉽고 소프트웨어적 접근으로 감소시킬 수 있다. 더구나, 본 발명의 보정 방법은 하드웨어적 방식이 아니라, 소프트웨어적 방식이므로, 다양한 실시간PCR 기기에 범용적으로 적용이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법은 이미 하드웨어적으로 보정되어 있는 기기에서 나온 신호도 추가적으로 보정할 수 있다. 실시간 PCR 장치와 같은 기기들은 시장에 나오기 전 하드웨어적인 보정을 거친다. 이러한 하드웨어적으로 보정된 기기에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 더욱 정확하게 보정된 기기를 제공할 수 있다.
실시예 2: 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 방법(IBS-SBN)에 의한 데이터 세트의 보정 및 보정 데이터 세트의 분석
SBN을 이용한 데이터 세트의 보정은 기기 블랭크 신호와 유사한 신호값을 차감하는 경우 더욱 정확하게 된다. 본 실시예에서는 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 방법(IBS-SBN)이 증폭된 신호를 보정하는데 사용되었다.
다음 3개 그룹의 데이터 세트가 비교 분석 되었다; (i) 실시예 <1-1>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 그룹; (ii) 실시예 <1-1>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트 그룹; 및 (iii) 실시예 <1-1>의 데이터 세트를 IBS-SBN방법에 의하여 소프트웨어적으로 보정하여 수득한 데이터 세트 그룹.
<2-1> 기기 블랭크 신호의 측정
원시 데이터 세트는 일반적으로 형광 분자에 의하여 발생하는 신호 및 형광 분자가 없어도 기기에서 기본적으로 발생하는 기기 블랭크 신호(instrument blank signal)를 모두 포함하고 있다. 따라서, 형광 분자에 의하여 발생하는 신호만을 이용하여 더욱 정확한 결과를 얻기 위해서는 기기 블랭크 신호를 측정하고, 이를 원시 데이터 세트에서 차감하는 것이 필요하다.
본 실시예에서는 빈 튜브를 측정하여 수득한 신호를 기기 블랭크 신호로 이용하였다.
기기 블랭크 신호의 측정은 실시간PCR에서 신호를 검출하는 온도 부근에서 이루어질 수 있으며, 증폭 사이클 반복의 유무에 따라 측정될 수 있다. 본 실시예에서는 실시예 <1-1>에 기술된 것과 동일 조건에서 10개 사이클의 증폭이 수행되었으며, 10번째 사이클에서 측정된 신호값을 기기 블랭크 신호로 사용하였다. 각 조건별로 기기 블랭크 신호는 표 9와 같이 측정되었다.
| 명칭 | 하드웨어적으로 미보정된 기기의 기기 블랭크 신호 | 하드웨어적으로 보정된 기기의 기기 블랭크 신호 |
| 기기 1 | RFU 2525 | RFU 2977 |
| 기기 2 | RFU 3152 | RFU 3638 |
| 기기 3 | RFU 3629 | RFU 3010 |
<2-2> 기기 블랭크 신호 제거(IBS)에 의하여 1차 보정 데이터 세트 수득
실시예 <1-1>의 원시 데이터 세트로부터 실시예 <2-1>의 기기 블랭크 신호를 다음의 식에 따라 차감하여 1차 보정 데이터 세트를 수득하였다.
1차 보정 데이터 세트 = 원시 데이터 세트 - 기기 블랭크 신호
상기 식을 이용한 계산에 의해, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 원시 데이터 세트를 이용하여 3개 그룹의 1차 보정 데이터 세트를 수득하고, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 원시 데이터 세트를 이용하여 3개 그룹의 1차 보정 데이터 세트를 수득하여, 총 6개 그룹의 1차 보정 데이터 세트를 준비하였다.
<2-3> SBN에 의한 데이터 세트 보정 및 보정 데이터 세트의 분석
상기 1차 보정 데이터 세트에 실시예 <1-4>와 동일한 방법으로 SBN을 적용하여 2차 보정 데이터 세트를 수득하였으며, 이를 분석하였다.
<2-3-1> 공통 기준값 이용한 IBS-SBN에 의한 데이터 세트의 보정
본 실시예에서는 실시예 <2-2>의 IBS 방법에 따라 수득한 6개 그룹의 1차 보정 데이터 세트를 다음의 단계에 따라 SBN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다.
<단계 1>
데이터 세트의 배경지역(baseline region)의 특정 사이클을 기준 사이클로 지정하였다. 본 실시예에서는 5번째 사이클을 기준 사이클로 지정하였다.
<단계 2>
특정 배경 신호로 표준화 하기 위하여 기준값을 지정하였다. 본 실시예에서는 RFU 5,350을 기준값으로 지정하였다.
<단계 3>
상기 단계 2에서 지정된 기준값 및 기준 사이클에 대응하는 1차 보정 데이터 세트의 사이클에서의 신호값으로부터 표준화 계수(normalization coefficient)를 계산하였다.
표준화 계수 = 기준 사이클에서의 신호값 ÷ 기준값
<단계 4>
모든 사이클에서의 신호값을 상기 표준화 계수를 이용하여 보정하였다.
2차 보정 신호값 (RFU) = 1차 보정 데이터 세트의 신호값 (RFU) 
표준화 계수
실시예 <2-2>에서 제공된 6개 그룹의 원시 데이터 세트를 상기 1 내지 4 단계에 따라 보정하여 보정된 6개 그룹의 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 IBS-SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 8A 및 도 8B는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기 블랭크 신호를 차감하고, 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 8A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 8B)를 각각 나타낸다.
보정된 2차 보정 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 8A는 2차 보정 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 도 8A에서 나타난 바와 같이, 기기간 배경신호 편차의 분포가 SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 5번째 사이클(기준 사이클)에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 배경신호의 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 2차 보정 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 8B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 1.1%, 1.3% 및 0.8%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 1.3%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 10에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 48.0p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 16.4p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-SBN에 의한 신호 보정 방법이 기기간 신호 편차 뿐만 아니라 단일 기기내 웰간 신호 편차도 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 IBS-SBN 방법이 기기를 하드웨어적으로 보정하는 방법보다 현저히 우수한 보정 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 기기에 대한 하드웨어상의 신호 보정 없이 IBS-SBN에 의한 보정 만으로도 하드웨어적인 보정보다 우수한 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 (IBS-SBN) | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.1 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 0.8 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.3 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 IBS-SBN방법에 의해 추가 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 9A 및 도 9B는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기 블랭크 신호를 차감하고, 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트의 증폭곡선(도 9A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 9B)를 각각 나타낸다.
보정된 2차 보정 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 9A는 2차 보정 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 도 9A에서 나타난 바와 같이, 기기간 배경신호 편차의 분포가 IBS-SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 5번째 사이클(기준 사이클)에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 배경신호의 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 2차 보정 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 9B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 1.2%, 1.7% 및 1.0%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 1.6%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 11에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기와 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 47.3p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 16.1p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-SBN에 의한 신호 보정 방법이 기기간 신호 편차 뿐만 아니라 단일 기기내 웰간 신호 편차도 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 IBS-SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 추가적인 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 (IBS-SBN) | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변공계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.2 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.7 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.0 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.6 |
<2-3-2> 총 신호 변화값에 따라 결정된 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN에 의한 데이터 세트 보정
본 실시예에서는 기기간 편차를 고려하여 결정된 기기별 기준값을 적용하여 데이터 세트를 보정하였다.
아래 단계 1 내지 3에서 기기별 표준 데이터 세트로부터 기기별 기준값을 결정하고, 결정된 기기별 기준값을 이용하여 단계 4에서 실시예 <2-2>에서 수득한 각 1차 보정 데이터 세트를 보정하였다.
<단계 1>
실험 시료로부터 데이터 세트를 수득하기 위하여 실시하는 실제 신호발생반응의 조건과 동일한 반응 조건에서 표준 농도의 표적 분석물질을 이용한 표준 신호발생반응을 수행하여 기기별 표준 데이터 세트를 수득하였다. 기준값을 결정하기 위한 신호값 및 총 신호 변화값을 기기별 표준 데이터 세트로부터 수득하였다.
본 실시예에서 5번째 사이클이 기준 사이클로 지정되었으므로, 표준 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값을 기준값 결정에 사용될 신호값으로 지정하였다.
표준 데이터 세트의 총 신호 변화값을 산출하기 위하여, 실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 얻어진 표준 데이터 세트에 대한 1차 보정 데이터 세트를 수득하고, 실시예 <1-1>에서와 동일한 방법으로 얻어진 표준 데이터 세트로부터 베이스라인을 차감하여 베이스라인 차감된 데이터 세트를 수득하였다. 얻어진 베이스라인 차감된 데이터 세트로부터 총 신호 변화값이 산출되었다. 베이스라인 차감된 데이터 세트의 마지막 50번째 사이클에서의 RFU를 상기 총 신호 변화값으로 하였다.
본 실시예에서는 각 기기로부터 3개의 표준 데이터 세트를 수득하고, 각 데이터 세트의 총 신호 변화값 및 기준값 결정에 사용된 신호값을 산출하였다. 구체적으로, 3개의 기기별 표준 데이터 세트로부터 산출된 3개의 총 신호 변화값의 평균을 해당 기기의 총 신호 변화값으로 지정하였다. 또한 3개의 기기별 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값들의 평균을 해당 기기의 기준값 결정에 사용되는 신호값으로 지정하였다.
하드웨어적으로 보정되거나 미보정된 기기 1, 2, 3의 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)들 및 기준값 결정에 사용되는 신호값들은 표 12와 같이 측정되었다.
| 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 (TSC) (RFU) |
표준 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값 (기준값 결정에 사용될 신호값) (RFU) | |||
| 하드웨어 조정 | - | + | - | + |
| 기기 1 | 2538 | 3513 | 2964 | 4034 |
| 기기 2 | 4808 | 5470 | 5706 | 6260 |
| 기기 3 | 8414 | 4601 | 9994 | 5380 |
<단계 2>
상기 산출된 총 신호 변화값과 함께 기기별 기준값 결정에 사용될 기준 총 신호 변화값(R-TSC)이 지정되었다. 본 실시예에서는 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 하드웨어적으로 보정된 3개 기기에서 수득한 데이터 세트들의 평균 총 신호 변화값과 유사한 RFU 4560을 기준 총 신호 변화값으로 지정하였다(도 3B 참조).
<단계 3>
(i) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값(단계 1), (ii) 표준 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값(단계 1) 및 (iii) 기준 총 신호 변화값(단계 2)을 이용하여 각 기기에 적용될 기준값을 산출하였으며, 산출된 기준값을 표 13에 나타내었다.
| 하드웨어 보정 | 기기 번호 | A) 표준 데이터 세트의 총 신호 변화값 (TSC) |
B) 기준 총 신호 변화값 (R-TSC) |
C) TSC와 R-TSC의 비율 [A/B] |
D) 표준 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값 |
E) 결정된 기준값 [D/C] |
| - | 1 | 2538 | 4560 | 0.5566 | 2964 | 5325 |
| 2 | 4808 | 4560 | 1.0545 | 5706 | 5411 | |
| 3 | 8414 | 4560 | 1.8453 | 9994 | 5416 | |
| + | 1 | 3513 | 4560 | 0.7705 | 4034 | 5236 |
| 2 | 5470 | 4560 | 1.1995 | 6260 | 5218 | |
| 3 | 4601 | 4560 | 1.0090 | 5380 | 5332 |
<단계 4>
실시예 <2-2>에서 기기 블랭크 신호 제거(IBS) 방법에 의해 수득한 6개 그룹의 1차 보정 데이터 세트들을 상기 단계 3에서 결정된 기준값들을 이용하여 실시예 <2-3-1>에서와 동일한 방법으로 보정하여, 6개 그룹의 2차 보정 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 10A 및 도 10B는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기 블랭크 신호를 차감한 후, 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트의 증폭곡선(도 10A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 10B)를 각각 나타낸다.
보정된 2차 보정 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 10A는 2차 보정 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호들의 세기를 비교할 수 있다. 분석 결과, 3개 기기로부터 수득한 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 5325, 5411 및 5416으로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 증폭구간도 서로 유사한 신호값을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 2차 보정 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 10B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 1.1%, 1.3% 및 0.8%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 1.1%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 14에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 48.2p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 16.6p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
이로서, IBS-SBN을 이용한 본 발명의 신호 보정 방법에 의하면, 기기별 표준 데이터 세트를 이용하여 기기별로 적용되는 기준값을 조정하여도 기기간 신호 편차 및 단일 기기내 웰간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 <1-4>의 SBN을 이용한 보정 방법과 비교하면, 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN 방법이 기기간 신호 편차 및 단일 기기내 웰간 신호 편차 감소 효과가 더 우수한 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN |
- | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.1 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.3 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 0.8 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.1 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN방법에 의해 추가 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 데이터 세트를 분석하였다. 도 11A 및 도 11B는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트를 기기 블랭크 신호를 차감한 후, 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 보정된 데이터 세트의 증폭곡선(도 11A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 11B)를 각각 나타낸다.
보정된 2차 보정 데이터 세트들을 플로팅하여 증폭곡선을 수득하였다. 도 11A는 보정된 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 증폭곡선(No Baseline Subtraction Curve)이며, 배경신호 영역 및 증폭구간의 신호 세기를 비교할 수 있다. 분석 결과, 3개 기기로부터 수득한 데이터 세트의 5번째 사이클에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 5236, 5218 및 5332로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 증폭구간도 서로 유사한 신호값을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 2차 보정 데이터 세트에서 베이스라인을 차감하고, 베이스라인이 차감된 데이터 세트를 플로팅하여 베이스라인이 차감된 증폭곡선(Baseline Bubtracted Curve)을 수득하고, 50번째 사이클에서의 변동계수를 계산하였다. 도 11B는 베이스라인이 차감된 곡선이며, 증폭 영역의 신호 편차를 비교할 수 있다. 마지막 사이클에서의 증폭 신호의 변동계수를 분석하였다. 기기내 증폭신호의 변동계수는 각각 1.2%, 1.7% 및 1.0%인 것으로 확인되었으며, 증폭 신호의 기기간 변동계수는 1.3%로 확인 되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <1-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수, (ii) 실시예 <1-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들의 신호의 변동계수 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 본 실시예의 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트들의 신호의 변동계수.
표 15에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 데이터 세트들을 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 48p%(percentage points)만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 증폭신호의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 증폭신호의 변동계수는 16.4p%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
이로서, 본 발명의 IBS-SBN방법에 의한 데이터 세트 보정 방법에 의하면, 기기별 표준 데이터 세트를 이용하여 기기별로 적용되는 기준값을 조정하여도 기기간 신호 편차 및 단일 기기내 웰간 신호 편차를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트를 IBS-SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 추가적인 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
실시예 <1-4>의 SBN을 이용한 보정 방법과 비교하면(표 7 참조), 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN 방법이 기기별 기준값을 이용한 SBN방법에 비하여 하드웨어적으로 보정된 기기에 대한 추가 보정 측면에서 월등하게 효과가 더 우수한 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN |
- | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | + | |
| 증폭신호 분석결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 5.2 | 5.3 | 1.2 |
| 기기 2 | 9.1 | 7.8 | 1.7 | |
| 기기 3 | 4.5 | 5.5 | 1.0 | |
| Total | 49.3 | 17.7 | 1.3 |
본 발명의 IBS-SBN을 이용한 실시간PCR 기기로부터 수득한 신호의 보정 방법은 기기내 신호 편차 및 기기간 신호 편차를 쉽고 소프트웨어적 접근으로 감소시킬 수 있으며, SBN을 이용한 방법보다 월등히 우수한 보정 효과를 나타낸다.SBN 또는 IBS-SBN 방법을 이용하면, 표준화 하려는 사이클(다시말해 기준 사이클)은 적절한 신호가 발생하지 않는 배경지역뿐만 아니라, 신호발생영역에서도 지정이 가능하다. 이는 표준화 방법 자체가 신호 보정 효과를 가지고 있으며, 기준 사이클의 위치에 따라 보정 수준의 차이가 있을 뿐이라는 것을 의미한다.
다음 실시예 3에서는 상기와 같은 본 발명 방법의 특징을 이용하여 멜팅 커브 분석에서 멜팅 신호 편차도 보정이 되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경 신호 기반 표준화 방법(IBS-SBN)을 이용한 멜팅 데이터 세트의 보정 및 분석
상기 실시예 1 및 2에서는 SBN 또는 IBS-SBN을 이용하여 핵산 증폭 데이터 세트들을 보정하였다. 실시예 3에서는 멜팅 데이터 세트도 본 발명의 방법에 의하여 소프트웨어적으로 보정되는지 확인하였다.
다음 3개 그룹의 멜팅 신호 편차가 비교 분석 되었다: (i) 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트 그룹; (ii) 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트 그룹 및 (iii) IBS-SBN에 의하여 소프트웨어적으로 보정된 멜팅 데이터 세트.
<3-1> 멜팅 데이터 세트 준비
표적 핵산분자에 대한 멜팅 분석은 [표 16]에 기재된 6대의 CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad)에서 PTOCE 어세이를 신호발생수단으로 사용하여 증폭 사이클 50회로 수행되었다. 표적 핵산분자는 Human beta-globin의 DNA를 사용하였다. 상호작용적 이중 표지는 리포터 분자(Quasar 670) 및 퀀처 분자(BHQ-1)가 표지된 CTO를 사용하였다.
반응은 표적 핵산 분자, 다운스트림 프라이머, 업스트림 프라이머, 이중 표지된 CTO, PTO 및 MgCl2, dNTPs 및 Taq DNA polymerase를 포함하는 마스터 믹스가 포함된 튜브에서 수행되었다. 반응 혼합물이 포함된 튜브를 실시간 thermocycler (CFX96, Bio-Rad)에 장착하고, 15분간 95℃에서 변성 후, 95℃ 30초, 60℃ 60초 및 72℃ 30초를 1 사이클로 하여 50 사이클을 진행하였다. 멜팅 데이터 세트는 실시간 PCR 결과물을 55℃에서 85℃까지 가온하면서 0.5℃ 단위로 온도별 형광신호를 측정하여 수득하였다.
각 기기별로 96개 웰에서 동일한 표적 핵산서열이 동일한 농도로 포함된 시료를 이용하여 96개 반응을 동일한 조건에서 수행하였으며, 이로부터 얻어진 멜팅 데이터 세트들을 분석하여 기기간, 기기내 신호 편차 및 본 발명의 방법에 따른 편차 수준의 감소 여부를 확인하였다.
하드웨어적인 보정을 하지 아니한 3대의 기기와 하드웨어적인 보정을 한 3대의 기기로 구성된 총 6대의 PCR 기기들을 사용하여 온도에 따른 형광값으로 구성된 총 6개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트들을 수득하였다. 각 그룹은 96개의 반응을 통하여 수득한 96개의 데이터 세트로 형성된다.
수득한 원시 멜팅 데이터 세트의 음수 변화값을 계산하여 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값을 구하였다. 상기 변화값 계산을 위하여, 아래 식에 따라 최소자승법(Least Square Method)을 원시 멜팅 데이터 세트에 적용하였으며, 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값이 음수 변화값 형태로 수득되었다.
I: 데이터 세트에서 변화값을 구하려는 사이클 번호
xi: i번째 사이클의 사이클 번호
yi: i번째 사이클에서 측정된 신호세기
si : i번째 사이클에서 데이터의 변화량
"a" 및 "b" : 0이상 10이하의 정수
n: a + b + 1, 변화값 산출에 사용되는 데이터의 갯수
본 실시예에서는, 상기 a 및 b는 1을 사용하였다. I-a가 1보다 작아지는 데이터 지점은 I-a를 1로 될 수 있도록 a를 변화시켰다. I+b가 모든 데이터 지점의 개수보다 커지는 데이터 지점에서는 I+b가 모든 데이터 지점의 개수와 동일하게 되도록 b를 변화시켰다.
원시 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 멜팅 커브를 얻었으며, 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)은 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 얻었다.
| 기기 명칭 | 하드웨어 보정 | 실시간 PCR 기기 |
| 기기 1 | 보정 없음 | CFX96 Real-time Cycler (Bio-Rad) |
| 기기 2 | ||
| 기기 3 | ||
| 기기 4 | 보정함 | |
| 기기 5 | ||
| 기기 6 |
<3-2> 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 분석
상기 실시예 <3-1>에서 수득한 원시 멜팅 데이터 세트 및 이의 변화값을 이용하였다. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트 및 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 신호 편차를 분석하였다.
3개 기기의 전체적인 멜팅 신호 패턴을 확인하기 위하여 원시 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 멜팅 커브(melting curve)를 수득하였다(도 12A 참조).
멜팅 커브 분석 결과, 도 12A에서 보는 바와 같이, 동일한 조건의 증폭반응이므로 이론상 동일한 멜팅 시작 온도에서의 신호 및 온도 증가에 따라 동일한 세기의 신호 변화가 플로팅 되어야 하지만 기기간 신호가 구분되어 나누어지는 것을 확인하였다. 또한 동일 기기에서 서로 다른 웰에서 이루어진 서로 다른 반응 간에도 신호에 차이가 있는 것을 확인하였다.
멜팅 커브 분석에서 신호를 비교하기 위하여, 3개의 기기 각각에서 수득한 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 멜팅 변화값 커브(멜팅 피크)를 수득하였다. 멜팅 피크의 편차가 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 편차이다.
멜팅 피크의 값이 최고가 되는 지점을 분석 온도(analytical temperature)로 지정하고, 상기 분석 온도에서의 멜팅 피크의 값의 변동계수를 계산하였다. 멜팅 피크의 변동계수, 다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수는 분석 온도에서의 멜팅 피크의 값의 변동계수이다. 변동계수의 계산 방법은 실시예 <1-2>에 기재되어 있다.
도 12B에서와 같이, 멜팅 피크의 변동계수를 확인한 결과, 기기내 멜팅 피크의 신호 변동계수는 4.9%, 5.9%, 그리고 7.5%로 확인되었고, 기기간 멜팅 피크의 신호 변동계수는 37.8%로 확인되었다.
<3-3> 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 분석
실시예 <3-1>에서 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 3개 그룹의 원시 멜팅 데이터 세트와 3개 그룹의 상기 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 신호 편차를 실시예 <3-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 분석하였다.
실시예 <3-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 멜팅 커브를 분석한 결과, 도 13A에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트에 비하여 기기간 신호의 편차는 감소하였다. 그러나, 여전히 기기간, 반응간 넓게 분산된 신호 편차 분포를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 <3-2>에서와 동일한 방법으로 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)의 최대 변화값의 변동계수를 확인한 결과, 도 13B에서와 같이, 기기 내 변화값 변동계수는 5.8%, 8.3%, 그리고 7.9%로 확인되었고, 기기간 변화값 변동계수는 7.5%로 확인되었다.
상기 결과를 실시예 <3-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 결과와 비교하면, 멜팅피크의 기기내 변동계수는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었고, 멜팅피크의 기기간 변동계수는 30.3p%(percentage points) 만큼 감소하는 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과로부터, 하드웨어 조정에 의한 보정 방법이 멜팅 피크의 기기간 변동계수를 일부 감소시킬 수 있지만, 여전히 기기간 상당한 신호 편차가 존재하며, 단일 기기내 웰간 멜팅피크의 변동계수는 하드웨어 조정에 의하여 감소시킬 수 없음을 확인하였다.
<3-4> IBS-SBN을 이용하여 소프트웨어적으로 보정된 멜팅 데이터 세트 분석
<3-4-1> 기기 블랭크 신호 측정
상기 실시예 <2-1>에서와 동일한 방법으로, 기기 블랭크 신호를 측정할 수 있다.
멜팅 분석에서는 다양한 온도에서 신호를 검출하므로, 다양한 온도에서 기기 블랭크 신호를 측정할 수 있으며, 각 온도별로 측정된 각 기기 블랭크 신호를 적용할 수 있다.
본 실시예에서는 1개 온도에서 기기 블랭크 신호를 측정하였고, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 실시간PCR 조건에서 빈 튜브를 이용하여 증폭 사이클 10회로 수행하여 수득한 데이터 세트의 10번째 사이클의 신호값을 기기 블랭크 신호로 사용하였다. 각 기기별로 기기 블랭크 신호는 [표 17]과 같이 측정되었다.
| 명칭 | 하드웨어적으로 미보정된 기기의 기기 블랭크 신호 | 명칭 | 하드웨어적으로 보정된 기기의 기기 블랭크 신호 |
| 기기 1 | RFU 1480 | 기기 4 | RFU 1517 |
| 기기 2 | RFU 1847 | 기기 5 | RFU 1680 |
| 기기 3 | RFU 1700 | 기기 6 | RFU 1418 |
<3-4-2> 기기 블랭크 신호 제거(IBS)에 의한 1차 보정 멜팅 데이터 세트 수득
실시예 <3-1>의 원시 멜팅 데이터 세트로부터 실시예 <3-4-1>의 기기 블랭크 신호를 다음의 식에 따라 차감하여 1차 보정 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
1차 보정 멜팅 데이터 세트 = 원시 데이터 세트 - 기기 블랭크 신호
상기 식을 이용한 계산에 의하여, 총 6개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트가 준비되었다. 여기에는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 원시 멜팅 데이터 세트를 이용하여 수득한 3개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트와 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 원시 멜팅 데이터 세트를 이용하여 수득한 또다른 3개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트가 포함된다.
<3-4-3> SBN에 의한 1차 보정 멜팅 데이터 세트의 보정 및 보정된 멜팅 데이터 세트의 분석
상기 1차 보정 멜팅 데이터 세트에 실시예 <2-3>에서와 동일한 방법으로 SBN을 적용하여 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 수득하였으며, 이를 분석하였다.
<3-4-3-1> 공통 기준값을 이용한 SBN에 의한 1차 보정 멜팅 데이터 세트의 보정
본 실시예에서는 실시예 <3-4-2>에서 수득한 6개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트를 다음의 단계에 따라 SBN 방법으로 소프트웨어적으로 보정하였다. 모든 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트에 단일 기준값이 적용 되었다.
<단계 1>
SBN 방법을 사이클의 단위가 온도인 멜팅 커브 분석에 적용하기 위하여, 표준화 하려는 지점, 다시말해, 멜팅 데이터 세트에서 특정 온도가 기준 사이클에 해당하는 기준 온도로 지정된다. 본 실시예에서는 55℃ 및 85℃를 기준 온도로 지정하여 멜팅 데이터 세트를 보정하였으며, 그 결과를 비교분석 하였다.
<단계 2>
특정 신호로 표준화하기 위한 기준값을 지정한다. 본 실시예에서는 기준 온도가 55℃인 경우 RFU 4,900을 기준값으로 지정하였으며, 기준 온도가 85℃인 경우 RFU 2,700을 기준값으로 지정하였다.
<단계 3>
1차 보정 멜팅 데이터 세트에서 기준 온도에 대응하는 신호값과 상기 단계 2에서 제공된 기준값으로부터 표준화 계수를 계산한다.
표준화 계수 = 기준 온도에서의 신호값 
기준값
<단계 4>
상기 표준화 계수를 이용하여 모든 온도에서의 신호값을 보정하였다.
2차 보정 신호값 (RFU) = 1차 보정 멜팅 데이터 세트의 신호값 (RFU) 
표준화 계수
실시예 <3-4-2>에서 수득한 6개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트들을 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 6개 그룹의 2차 보정 멜팅 데이터 세트들을 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 데이터 세트를 분석하였다.
도 14A, 도 14B 및 도 14C는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기 블랭크 신호를 차감하고, 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 증폭곡선(도 14A) 및 기기간 및 기기내 변동계수(CVs) (도 14B 및 14C)를 각각 나타낸다.
2차 보정 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 멜팅 커브를 수득하였다. 도 14A는 2차 보정 멜팅 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 멜팅 커브이며, 멜팅 신호들의 세기를 비교할 수 있다. 분석 결과, 기기간 신호 편차는 기준온도 55℃에서 IBS-SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히 기준온도 55℃에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 신호 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트로부터 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 얻고, 상기 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)을 수득한 후, 기준온도 55℃ 또는 85℃에서 변동계수를 계산하였다.
도 14B는 기준온도 55℃로 보정한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크를 보여준다. 상기 멜팅 피크의 변동계수(다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수)를 분석한 결과, 멜팅 피크의 기기내 변동계수는 각각 1.8%, 1.1%, 및 1.8%인 것으로 확인되었으며, 멜팅 피크의 기기간 변동계수는 1.8%로 확인되었다.
도 14C는 기준온도 85℃로 보정한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크를 보여준다. 상기 멜팅 피크의 변동계수를 분석한 결과, 멜팅 피크의 기기내 변동계수는 각각 1.5%, 1.9%, 및 2.5%인 것으로 확인되었으며, 멜팅 피크의 기기간 변동계수는 2.3%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <3-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (ii) 실시예 <3-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값에서 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 18에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기준온도 55℃ 및 85℃의 멜팅피크의 기기간 변동계수는 각각 36.0p%(percentage points) 및 35.5p% 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기준온도 55℃ 및 85℃의 멜팅피크의 기기간 변동계수는 각각 5.7p% 및 5.2p% 만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-SBN에 의한 신호보정 방법이 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 기기간, 기기내 편차를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 특히 IBS-SBN방법이 기기를 하드웨어적으로 보정하는 방법보다 현저히 우수한 보정 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 기기에 대한 하드웨어상의 보정 없이 IBS-SBN에 의한 보정 만으로도 하드웨어적인 보정보다 우수한 멜팅 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
기준온도(기준 사이클)에 다른 결과를 비교한 결과, 기준 온도에 따른 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 편차의 감소비율은 거의 차이가 없으며, 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 변동계수는 기준 온도와 무관하게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 이하 실험은 기준온도 55℃에서 진행되었다.
| 보정 방법 | 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 (IBS-SBN) | - | - |
+
(55℃) |
+
(85℃) |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | - | |
| 멜팅 신호 분석 결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 4.9 | 5.8 | 1.8 | 1.5 |
| 기기 2 | 5.9 | 8.3 | 1.1 | 1.9 | |
| 기기 3 | 7.5 | 7.9 | 1.8 | 2.5 | |
| Total | 37.8 | 7.5 | 1.8 | 2.3 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN 방법에 의해 단계 1 내지 4에 따라 추가 보정 하여 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 얻었으며, 이를 분석하였다.
도 15A는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트에서 기기 블랭크 신호를 차감한 후, 상기 기기 블랭크 신호가 차감된 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라서 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트에 대한 멜팅 커브를 나타낸다.
도 15B는 상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트에 대한 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 멜팅 피크로부터 수득한 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸다.
멜팅 커브는 상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 플로팅하여 수득하였다. 도 15A는 2차 보정 멜팅 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 멜팅 커브이며, 멜팅 신호들의 세기를 비교할 수 있다. 도 15A에 나타난 바와 같이, 기기간 신호 편차는 기준온도 55℃에서 IBS-SBN을 이용한 보정에 의하여 확연하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히 기준온도 55℃에서의 모든 RFU 값이 지정된 기준값과 동일하게 되었으며, 신호 편차가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트로부터 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 얻고, 상기 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 플로팅하여 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)을 수득한 후, 기준온도 55℃에서 변동계수를 계산하였다. 도 15B는 기준온도 55℃에서 보정한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크를 보여준다. 상기 멜팅 피크의 변동계수(다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수)를 분석한 결과, 멜팅 피크의 기기내 변동계수는 각각 1.6%, 1.5%, 및 2.3%인 것으로 확인되었으며, 멜팅 피크의 기기간 변동계수는 2.0%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <3-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (ii) 실시예 <3-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값에서 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 19에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기준온도 55℃의 멜팅피크의 기기간 변동계수는 35.8p%(percentage points) 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기준온도 55℃의 멜팅피크의 기기간 변동계수는 각각 5.5p% 만큼 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 IBS-SBN에 의한 신호보정 방법이 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들의 기기간, 기기내 편차를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 특히 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트를 본 발명의 IBS-SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 멜팅 데이터 세트에 대한 추가적인 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 (IBS-SBN) | - | - |
+
(55℃) |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 멜팅 신호 분석 결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 4.9 | 5.8 | 1.6 |
| 기기 2 | 5.9 | 8.3 | 1.5 | |
| 기기 3 | 7.5 | 7.9 | 2.3 | |
| Total | 37.8 | 7.5 | 2.0 |
<3-4-3-2> 총 신호 변화값에 따라 결정된 기기별 기준값을 적용한 SBN에 의한 1차 보정 멜팅 데이터 세트의 보정
기기별 기준값은 기기간 편차를 고려하여 결정되었으며, 상기 기기별 기준값을 이용하여 멜팅 데이터 세트가 보정되었다. 실시예 <2-3-2>에 기재된 바와 같이, 표준 농도의 표적 분석물질을 이용하여 표준 데이터 세트를 수득하였으며, 이를 이용하여 기기별 기준값을 이용한 본 발명의 방법이 멜팅 커브 분석에도 적용되는지 확인하였다.
<단계 1>
실험 시료로부터 멜팅 데이터 세트를 수득하기 위하여 실시하는 실제 신호발생반응의 조건과 동일한 반응 조건에서 표준 농도의 표적 분석물질을 이용하여 표준 신호발생반응을 수행하여 기기별 표준 멜팅 데이터 세트를 수득하였다. 기준값을 결정하기 위한 신호값 및 총 신호 변화값을 기기별 표준 데이터 세트로부터 수득하였다.
본 실시예에서 55℃가 기준 온도(기준 사이클)로 지정되었으므로, 표준 멜팅 데이터 세트의 55℃에서의 멜팅 신호값을 기준값 결정에 사용될 신호값으로 지정하였다.
표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값을 산출하기 위하여, 실시예 <3-4-2>에서와 동일한 방법으로 얻어진 표준 멜팅 데이터 세트에 대한 1차 보정 데이터 세트를 수득하고, 수득한 보정된 표준 멜팅 데이터 세트로부터 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 멜팅 데이터 세트의 변화값을 수득하였다. 얻어진 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 총 신호 변화값이 산출되었다. 멜팅 데이터 세트의 변화값의 최대값(멜팅 피크의 최대값)을 상기 총 신호 변화값으로 하였다.
본 실시예에서는 각 기기로부터 3개의 표준 멜팅 데이터 세트를 수득하고, 각 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값 및 기준값 결정에 사용된 신호값을 산출하였다. 구체적으로, 3개의 기기별 표준 멜팅 데이터 세트로부터 산출된 3개의 총 신호 변화값의 평균을 해당 기기의 총 신호 변화값으로 지정하였다. 또한 3개의 기기별 표준 멜팅 데이터 세트의 기준 사이클(기준 온도)에서의 신호값들의 평균을 해당 기기의 기준값 결정에 사용되는 신호값으로 지정하였다.
하드웨어적으로 보정되거나 미보정된 기기 1, 2, 3의 표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC)들 및 기준값 결정에 사용되는 신호값들은 [표 20]과 같이 측정되었다.
| 기기 번호 | 하드웨어 조정 | 표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC) (Slope) | 표준 멜팅 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값(기준값 결정에 사용될 신호값) (RFU) |
| 기기 1 | - | 234 | 3786 |
| 기기 2 | - | 467 | 7787 |
| 기기 3 | - | 572 | 9431 |
| 기기 4 | + | 305 | 4961 |
| 기기 5 | + | 257 | 4246 |
| 기기 6 | + | 274 | 4539 |
<단계 2>
상기 산출된 총 신호 변화값과 함께 기기별 기준값 결정에 사용될 기준 총 신호 변화값(R-TSC)이 지정되었다. 본 실시예에서는 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 하드웨어적으로 보정된 3개 기기에서 수득한 데이터 세트들의 평균 총 신호 변화값과 유사한 slope 300을 기준 총 신호 변화값으로 지정하였다(도 13B 참조).
<단계 3>
(i) 표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값(단계 1), (ii) 표준 데이터 세트의 기준 온도(기준 사이클)에서의 신호값(단계 1) 및 (iii) 기준 총 신호 변화값(단계 2)을 이용하여 각 기기에 적용될 기준값을 산출하였다.
기준값 = 표준 멜팅 데이터 세트의 기준 사이클에서의 신호값 
(표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값 / 기준 총 신호 변화값)
각 기기로부터 수득한 표준 멜팅 데이터 세트를 분석하여, 하드웨어적으로 미보정된 기기 및 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 데이터 세트의 보정에 사용될 기준값을 표 21과 같이 결정하였다.
| 하드웨어 보정 | 기기번호 | A) 표준 멜팅 데이터 세트의 총 신호 변화값(TSC) (Unit:Slope) |
B) 기준 총 신호 변화값 (R-TSC) |
C) TSC와 R-TSC의 비율 [A/B] |
D) 표준 데이터 세트의 기준 사이클의 신호값 (Unit : RFU) |
E) 결정된 기준값 [D/C] |
| - | 1 | 234 | 300 | 0.7800 | 3786 | 4854 |
| 2 | 467 | 300 | 1.5556 | 7787 | 5006 | |
| 3 | 572 | 300 | 1.9078 | 9431 | 4943 | |
| + | 4 | 305 | 300 | 1.0178 | 4961 | 4875 |
| 5 | 257 | 300 | 0.8556 | 4246 | 4963 | |
| 6 | 274 | 300 | 0.9144 | 4539 | 4963 |
<단계 4>
실시예 <3-4-2>에서 수득한 6개 그룹의 1차 보정 멜팅 데이터 세트들을 상기 단계 3에서 결정된 기기별 기준값을 이용하여 실시예 <3-4-3-1>에서와 동일한 방법으로 보정하여, 6개 그룹의 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 수득하였다.
A. 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 보정 결과 분석
하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN방법에 의해 보정하였으며, 그 결과인 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 분석하였다. 도 16A는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정한 결과의 멜팅 커브다. 도 16B는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정한 결과의 멜팅 피크로부터 얻은 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸다. 상기 멜팅 커브는 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 원시 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN 방법에 의해 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 플로팅 하여 수득하였다.
도 16A는 2차 보정 멜팅 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 멜팅 커브이며, 멜팅 신호들의 세기를 비교할 수 있다. 분석 결과, 3개 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 55℃에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 4854, 5006 및 4943으로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 멜팅 신호들도 서로 유사하게 된 것을 확인하였다.
상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트들로부터 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 수득하고, 이를 플로팅하여 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)를 수득하고, 상기 멜팅 변화값 곡선으로부터 기준 온도 55℃에서 변동계수를 계산하였다.
도 16B는 상기 기준온도 55℃로 보정한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크를 보여준다. 상기 멜팅 피크의 변동계수(다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수)를 분석한 결과, 멜팅 피크의 기기내 변동계수는 각각 1.8%, 1.1%, 및 1.8%인 것으로 확인되었으며, 멜팅 피크의 기기간 변동계수는 1.7%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <3-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (ii) 실시예 <3-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (iii) 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값에서 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 22에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 변화값 편차의 변동계수는 36.1p%(percentage points) 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 변화값 편차의 변동계수는 5.8p% 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다.
기기별 표준 멜팅 데이터 세트를 이용하여 기기별 기준값을 조정하는 본 발명의 방법은 온도를 사이클로 하는 멜팅 데이터 세트의 기기내 및 기기간 신호편차를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였으며, 기기에 대한 하드웨어상의 보정 없이 총 신호 변화값에 의하여 결정된 기준값을 이용한 IBS-SBN방법에 의한 보정 만으로도 하드웨어적인 보정보다 우수한 멜팅 신호 보정 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 멜팅 신호 분석 결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 4.9 | 5.8 | 1.8 |
| 기기 2 | 5.9 | 8.3 | 1.1 | |
| 기기 3 | 7.5 | 7.9 | 1.8 | |
| Total | 37.8 | 7.5 | 1.7 |
B. 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트 보정 결과 분석
하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN 방법에 의해 추가 보정 하여 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 얻었으며, 이를 분석하였다. 도 17A는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정한 결과에 대한 멜팅 커브를 나타낸다. 도 17B는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 상기 단계 1 내지 4에 따라 보정한 결과의 멜팅 피크로부터 얻은 기기내 및 기기간 변동계수를 나타낸다. 상기 멜팅 커브는 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 원시 멜팅 데이터 세트를 IBS-SBN 방법에 의해 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트를 플로팅 하여 수득하였다.
도 17A는 2차 보정 멜팅 데이터 세트들을 베이스라인 차감 없이 플로팅하여 얻은 멜팅 커브이며, 멜팅 신호들의 세기를 비교할 수 있다. 분석 결과, 3개 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 55℃에서의 신호값들은 기기별 기준값인 RFU 4875, 4963 및 4963으로 각각 보정되어 배경신호 영역이 유사하게 되었으며, 멜팅 신호들도 서로 유사하게 된 것을 확인하였다.
상기 2차 보정 멜팅 데이터 세트들로부터 원시 멜팅 데이터 세트의 변화값들을 수득하고, 이를 플로팅하여 멜팅 변화값 곡선(멜팅 피크)를 수득하고, 상기 멜팅 변화값 곡선으로부터 기준 온도 55℃에서 변동계수를 계산하였다.
도 17B는 상기 기준온도 55℃로 보정한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 멜팅 피크를 보여준다. 상기 멜팅 피크의 변동계수(다시말해, 멜팅 데이터 세트의 변화값의 변동계수)를 분석한 결과, 멜팅 피크의 기기내 변동계수는 각각 1.6%, 1.5%, 및 2.3%인 것으로 확인되었으며, 멜팅 피크의 기기간 변동계수는 1.9%로 확인되었다.
다음의 3개의 변동계수를 비교분석 하였다: (i) 실시예 <3-2>의 하드웨어적으로 미보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; (ii) 실시예 <3-3>의 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트의 변화값으로부터 산출한 멜팅 피크의 변동계수; 및 (iii) 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트의 변화값에서 산출한 멜팅 피크의 변동계수.
표 23에서 보는 바와 같이, 하드웨어적으로 보정된 기기로부터 수득한 멜팅 데이터 세트를 기기별 기준값을 이용한 IBS-SBN으로 보정하여 수득한 2차 보정 멜팅 데이터 세트는 다음과 같은 특징을 가진다: 하드웨어적으로 미보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 멜팅피크의 변동계수는 35.9p%(percentage points) 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이를 하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트들과 비교하였을 때, (i) 기기내 멜팅피크의 변동계수가 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였으며, (ii) 기기간 멜팅피크의 변동계수는 5.6p% 만큼 대폭 감소하는 것을 확인하였다.
하드웨어적으로 보정된 기기에서 수득한 멜팅 데이터 세트를 본 발명의 IBS-SBN 방법으로 추가 표준화 하는 경우, 멜팅 데이터 세트에 대한 더 정확한 보정 효과가 달성되는 것을 확인하였다.
| 보정 방법 | 기기별 기준값을 적용한 IBS-SBN | - | - | + |
| 하드웨어 조정 | - | + | - | |
| 멜팅 신호 분석 결과 (변동계수, CV %) |
기기 1 | 4.9 | 5.8 | 1.6 |
| 기기 2 | 5.9 | 8.3 | 1.5 | |
| 기기 3 | 7.5 | 7.9 | 2.3 | |
| Total | 37.8 | 7.5 | 1.9 |
이상과 같이, 본 발명의 IBS-SBN을 이용한 신호 보정 방법은 증폭 신호 뿐만 아니라 멜팅 신호에도 적용이 가능하며, 동일한 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 멜팅 커브 분석은 신호 검출 온도에 대한 미세한 조절이 필요한 방법이므로, 증폭 곡선 분석보다 기기간 신호 편차가 발생할 가능성이 높다. 그러므로, 본 발명의 신호 보정 방법은 멜팅 커브 분석에 더 유용할 것으로 기대된다.
실시예 4: 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 방법(IBS-SBN)에 의한 데이터 세트의 신호 세기 조절
실시예 4에서는 기기 블랭크 신호 제거 및 특정 배경신호 기반 표준화 방법(IBS-SBN)에 의하여 데이터 세트의 신호 보정뿐만 아니라 신호 세기의 조절이 가능한지 시험하였으며, 이러한 데이터 세트의 신호 세기 조절에 의해 신호발생수단으로 사용되는 물질(예를 들어 TaqMan 프로브)의 농도를 감소시킬 수 있는지 확인하였다.
먼저, 저농도의 TaqMan 프로브를 사용하여 표적핵산 서열에 대한 실시간 PCR을 통해 데이터 세트 수득하고, 이를 다양한 기준값을 적용한 IBS-SBN 방법으로 보정하여 수득한 2차 보정 데이터 세트들을 수득하였다. 상기 2차 보정 데이터 세트들을 실제 다양한 농도의 TaqMan 프로브를 사용하여 표적핵산 물질에 대한 실시간 PCR을 통해 수득한 데이터 세트과 비교 분석 하였다.
또한 다양한 기준값을 적용한 IBS-SBN 방법으로 데이터 세트를 보정하는 경우의 데이터 세트의 기기간 신호편차가 변하는지 여부도 조사하였다.
<4-1> IBS-SBN에 의해 보정된 데이터 세트와 농도별 데이터 세트의 비교
표적핵산 분자에 대한 실시간 PCR은 Bio-Rad 사의 CFX96™ Real-Time PCR Detection System을 이용하여, TaqMan 프로브를 신호발생수단으로 사용하여 증폭 사이클 50회로 수행되었다.
1개의 기기를 이용하여 TaqMan 프로브 농도를 반응 당 1 pmole, 2 pmole, 3 pmole 및 5 pmole로 설정하여 4개의 원시 데이터 세트를 수득하였다.
상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 원시 데이터 세트들로부터 농도별 베이스라인 차감된 데이터 세트들(그룹 A)을 구하였다.
1 pmole의 TaqMan 프로브를 사용하여 수득한 데이터 세트를 실시예 2의 방법에 따라 보정하여, 2 pmole, 3 pmole, 5 pmole의 TaqMan 프로브를 사용하여 수득한 각각의 데이터 세트와 유사한 신호값을 가지는 3개의 2차 보정 데이터 세트를 수득하였다.
구체적으로, 우선 사용된 기기의 기기 블랭크 신호를 실시예 <2-1>과 같이 측정하였다. 기기 블랭크 신호는 RFU 3466으로 측정되었다. 1 pmole의 TaqMan 프로브를 사용하여 수득한 데이터 세트에서 기기 블랭크 신호인 RFU 3466을 차감하여 1차 보정 데이터 세트를 수득하였다.
상기 1차 보정 데이터 세트로부터 기준 사이클을 5번째 사이클로 설정하고, TaqMan 프로브 농도 별 데이터 세트의 신호 세기와 유사한 신호 세기가 검출되도록 기준값을 RFU 2,700, 4,100, 그리고 5,900으로 설정하여 3개의 보정된 2차 보정 데이터 세트를 수득하였다. 상기 농도별 2차 보정 데이터 세트들로부터 실시예 <1-1>의 방법에 따라 베이스라인 차감된 데이터 세트들(그룹 B)을 각각 구하였다.
상기 그룹 A와 그룹 B의 데이터 세트를 플로팅하여 비교 분석 하였다.
첫 번째로 데이터 세트의 신호 세기를 비교하기 위해 상기 그룹 A 및 그룹 B 데이터 세트의 마지막 사이클(50번째 사이클)에서 신호값을 비교하였다.
그 결과, 도 18에서와 같이, 그룹 A의 TaqMan 프로브 농도 증가에 따라 데이터 세트의 신호 세기가 증가하는 패턴과 그룹 B의 IBS-SBN을 이용하여 기준값 변화에 의해 데이터 세트의 신호 세기가 증가하는 패턴이 유사함을 확인할 수 있었다.
두 번째로 그룹 A와 그룹 B 데이터 세트간 타겟 검출 시점 차이 비교를 위해 그룹 A와 그룹 B의 각 데이터 세트의 Ct (Threshold Cycle) 값을 분석하였다. Ct 값은 임계값을 RFU 500으로 설정하여, 상기 임계값에 해당하는 사이클 값으로 결정하였다.
그 결과, 도 18에서 보는 바와 같이 그룹 A의 각 농도별 데이터 세트의 Ct값과 그룹 B의 적용된 각 기준값 별 데이터 세트의 Ct값이 서로 유사한 것을 확인하였다.
상기 결과와 같이, IBS-SBN을 이용하여 기준값 변화에 의해 데이터 세트의 신호 세기를 원하는 대로 조절할 수 있음을 확인하였고, 이는 데이터 세트의 신호 세기 증가를 위해 측정기기를 하드웨어적으로 조절하거나, 신호발생수단으로 사용하는 물질(예를 들어, TaqMan 프로브)의 농도를 증가시킬 필요 없이 소프트웨어 상에서 데이터 세트의 신호 세기 조절 가능함을 알 수 있었다.
상기와 같이 IBS-SBN을 이용하여 기준값 변화에 의해 데이터 세트의 신호 세기를 조절하는 경우, 기준값 변화에 따라 IBS-SBN의 효과인 신호 편차 보정효과에 차이가 있는지 하기 실시예 <4-2>에서 확인하였다.
<4-2> IBS-SBN에 의한 신호 세기의 조절에 따른 보정된 데이터 세트의 변동 계수 확인
IBS-SBN 방법에 의하여 신호 세기가 조절된 2차 보정 데이터 세트를 수득하는 경우 기준값 조절에 의하여 데이터 세트의 신호 편차(변동계수)에 변화가 발생하는지 확인하였다.
실시예 <2-2>에서 하드웨어적으로 미보정된 기기 3대를 이용하여 수득한 1차 보정 데이터 세트들을 RFU 5,000, 10,000, 및 15,000을 기준값으로 하여 실시예 <2-3>의 방법과 같이 각각 SBN으로 보정하여 2차 보정 데이터 세트를 수득하고, 실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 증폭곡선 및 변동계수를 수득하였다. 기준 사이클을 5번째 사이클로 설정하였다. 그 결과는 하기 표 24와 같다.
| 기준값 | 5000 | 10000 | 15000 | ||||||
| 기기번호 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| 기기내(Intra-Instrument) | |||||||||
| Min. | 4176 | 4124 | 4158 | 8352 | 8248 | 8317 | 12527 | 12372 | 12475 |
| Max. | 4418 | 4364 | 4328 | 8836 | 8728 | 8655 | 13254 | 13093 | 12983 |
| Range | 242 | 240 | 169 | 484 | 481 | 338 | 726 | 721 | 508 |
| Mean | 4299 | 4233 | 4242 | 8599 | 8467 | 8484 | 12898 | 12700 | 12726 |
| SD | 49 | 54 | 36 | 98 | 108 | 71 | 147 | 162 | 107 |
| CV (%) | 1.10% | 1.30% | 0.80% | 1.10% | 1.30% | 0.80% | 1.10% | 1.30% | 0.80% |
| 기기간(Inter-Instrument) | |||||||||
| Min. | 4124 | 8248 | 12372 | ||||||
| Max. | 4418 | 8836 | 13254 | ||||||
| Range | 294 | 588 | 882 | ||||||
| Mean | 4258 | 8517 | 12775 | ||||||
| SD | 55 | 110 | 166 | ||||||
| CV (%) | 1.30% | 1.30% | 1.30% | ||||||
Min.: 최소값; Max.: 최대값; Range : Max-Min; SD: 표준편차(Standard Deviation);
CV: 변동계수(Coefficient of variation)
상기 표 24에서 보는 바와 같이, 기준값 변화에 따라 각 기기마다 신호의 최대값, 최소값, 범위, 평균값, 그리고 표준편차는 변화하는 것을 볼 수 있지만, 기기내(Intra-Instrument), 기기간(Inter-Instrument) 신호 편차에 해당하는 변동계수(CV)는 기준값의 변화에 무관하게 동일한 값인 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과와 같이, IBS-SBN을 이용하여 기준값 변화에 의해 소프트웨어 상에서 데이터 세트의 신호 세기를 원하는 대로 조절할 수 있으므로, 신호 세기를 증가시키기 위하여 측정기기를 하드웨어적으로 조절하거나 신호발생수단으로 사용하는 물질(예를 들어, TaqMan 프로브)의 농도를 조절할 필요가 없다. 따라서 본 발명의 방법에 의하여 보정용 물질의 생산비, 보정시간 및 신호발생물질 생산비의 감소 효과가 나타날 것으로 기대된다. 이와 동시에 소프트웨어 상에서 데이터 세트의 신호 편차의 보정도 동시에 가능하기 때문에 보다 유용한 보정 방법으로 사용할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (28)
- 다음 단계를 포함하는 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 상기 신호발생반응은 별도의 반응용기들에서 수행되는 복수의 신호발생반응을 포함하며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득된 복수의 데이터 세트이며; 상기 표준화 계수는 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트별로 제공되며; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트에 대한 표준화 계수는 동일한 기준 사이클 및 동일한 기준값을 이용하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트는 각 데이터 세트별로 제공된 표준화 계수를 적용하여 보정된다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 표적 분석물질에 대한 데이터 세트는 상기 시료 내 상기 표적 분석물질의 존재 또는 부존재를 나타내는 정보를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 신호발생반응은 시료 내 상기 표적 분석물질의 존재에 의존적으로 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 신호발생반응은 상기 신호값의 증폭 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 표적 분석물질은 표적 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 신호발생반응은 표적 핵산 분자의 증폭이 동반되거나, 동반되지 않고 수행되는 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 신호발생반응은 PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 데이터 세트는 기기 블랭크 신호가 제거된 데이터 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기준 사이클은 신호 기준 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기준 사이클은 적어도 2개의 기준 사이클들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 신호발생반응은 PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 PCR이며, 상기 기준 사이클은 상기 PCR 또는 실시간 PCR의 신호 증폭 구역 이전의 배경 신호 구역에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 기준 사이클은 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹에서 선택되며, 상기 각 데이터 세트의 기준 사이클 그룹은 서로 동일한 방식으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 복수의 신호발생반응은 서로 다른 기기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기준값은 상기 기준 사이클에 해당하는 상기 복수의 데이터 세트의 사이클에서의 신호값들의 평균값 ± 표준편차 범위 내에서 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값의 차이(difference)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값의 차이는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 상기 기준값의 비율(ratio)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 보정 데이터 세트는 시료 내 표적 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 보정된 신호값은 다음과 같은 수학식1을 이용하여 수득한 것을 특징으로 하는 방법:
수학식 1
보정된 신호값 = 신호값 / 표준화 계수
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 단계 (a) 이전에 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트를 수득하기 위하여 신호발생반응을 수행하는 단계.
- 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독 가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 상기 신호발생반응은 별도의 반응용기들에서 수행되는 복수의 신호발생반응을 포함하며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득된 복수의 데이터 세트이며; 상기 표준화 계수는 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트별로 제공되며; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트에 대한 표준화 계수는 동일한 기준 사이클 및 동일한 기준값을 이용하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트는 각 데이터 세트별로 제공된 표준화 계수를 적용하여 보정된다.
- (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 제26항의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 장치.
- 시료 내 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 데이터 세트 보정을 위한 표준화 계수(normalization coefficient)를 제공하는 단계; 상기 데이터 세트는 신호발생수단을 이용한 상기 표적 분석물질에 대한 신호발생반응으로부터 수득되며; 상기 데이터 세트는 상기 신호발생반응의 사이클들 및 상기 사이클들에서의 신호값을 포함하는 복수의 데이터 지점을 포함하며; 상기 표준화 계수는 기준값(reference value), 기준 사이클(reference cycle) 및 상기 데이터 세트를 이용하여 제공되며; 상기 기준 사이클은 상기 데이터 세트의 사이클들에서 선택되며; 상기 기준값은 임의로 정해진 값이며; 상기 표준화 계수는 상기 데이터 세트에서 상기 기준 사이클에 해당하는 사이클의 신호값 및 상기 기준값 사이의 관계를 정하여 제공되며; 상기 신호발생반응은 별도의 반응용기들에서 수행되는 복수의 신호발생반응을 포함하며, 상기 데이터 세트는 상기 복수의 신호발생반응에서 수득된 복수의 데이터 세트이며; 상기 표준화 계수는 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트별로 제공되며; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트에 대한 표준화 계수는 동일한 기준 사이클 및 동일한 기준값을 이용하여 제공되며; 그리고
(b) 상기 표준화 계수를 상기 데이터 세트의 신호값들에 적용하여 보정된 신호값들을 얻어 보정 데이터 세트를 제공하는 단계; 상기 복수의 데이터 세트의 각 데이터 세트는 각 데이터 세트별로 제공된 표준화 계수를 적용하여 보정된다.
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