ES2899242T3

ES2899242T3 - Método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana

Info

Publication number: ES2899242T3
Application number: ES16866714T
Authority: ES
Inventors: Jong Yoon Chun; Young Jo Lee; Han Bit Lee
Original assignee: Seegene Inc
Current assignee: Seegene Inc
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2022-03-10
Anticipated expiration: 2036-11-21
Also published as: IL259466A; AU2020256417A1; EP3378000A1; CA3005600A1; KR102270771B1; US20240194300A1; IL259466B; US20180336315A1; WO2017086762A1; CN108351918A; AU2020256417B2; CN108351918B; US11915796B2; EP3378000B1; AU2016356474A1; JP6685396B2; KR20180074800A; JP2019503658A; EP3378000A4; CA3005600C

Abstract

Método implementado por ordenador para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra que comprende: (a) proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos; en el que el conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para el analito diana usando unos medios de generación de señal; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos; en el que el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; en el que el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos; en el que el valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real excepto cero; en el que el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia; en el que el proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal; en el que el coeficiente de normalización se proporciona para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos; en el que el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se proporciona usando el ciclo de referencia idéntico y el valor de referencia idéntico; y (b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, un medio de almacenamiento legible por ordenador, un dispositivo para analizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, y un programa informático para almacenarse en un medio de almacenamiento legible por ordenador.

Antecedentes de la invención

Una reacción en cadena de polimerasa (en adelante en el presente documento denominada “PCR”) que se usa más ampliamente para la amplificación de ácido nucleico incluye ciclos repetidos de desnaturalización de ADN bicatenario, seguido de hibridación de cebador oligonucleotídico con el molde de ADN, y la extensión de cebador por una polimerasa de ADN (Mullis et al., patente estadounidense n.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

Una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real es una de las tecnologías basadas en PCR para detectar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra en tiempo real. Para detectar un analito diana específico, la PCR en tiempo real usa unos medios de generación de señal para generar una señal de fluorescencia que es detectable de manera proporcional con la cantidad de la molécula diana. La generación de señales de fluorescencia puede lograrse usando o bien intercaladores que generan señales cuando se intercalan entre ADN bicatenario o bien oligonucleótidos que portan moléculas inactivadoras e indicadoras fluorescentes. Las señales de fluorescencia cuyas intensidades son proporcionales a la cantidad de la molécula diana se detectan en cada ciclo de amplificación y se representan gráficamente frente a ciclos de amplificación, obteniendo de ese modo una curva de amplificación o curva de perfil de amplificación.

Un análisis de muestra usando señales de fluorescencia se realiza de la siguiente manera. Cuando se suministra energía a una fuente luminosa a través de una fuente de luz tal como LED, el electrón de la fuente luminosa se excita a un estado cuántico más alto, entonces la fuente luminosa emite una luz de longitud de onda específica por relajación del electrón orbital a su estado fundamental. El instrumento analítico convierte la luz de longitud de onda específica en una señal eléctrica usando fotodiodo o CCD y proporciona información necesaria para el análisis de muestras. Aunque se analiza la misma cantidad de una fuente luminosa en una muestra, cada instrumento analítico proporciona diferentes valores de señal debido a las iluminaciones desiguales de la fuente de luz (por ejemplo, LED) y las variaciones de rendimiento del dispositivo de conversión de luz-electricidad en los instrumentos respectivos. Una diferencia de señal de este tipo entre instrumentos se denomina variación interinstrumento. Además de la variación interinstrumento, los resultados del análisis de una pluralidad de reacciones realizadas para el mismo tipo y la misma cantidad del analito diana mediante un solo instrumento analítico idéntico pueden tener variaciones en el nivel de señal debido a la diferencia en los entornos de reacción, tales como la posición del pocillo de reacción donde la reacción se realiza en el instrumento o diferencias delicadas en la composición o concentración de la mezcla de reacción. Una diferencia de señal de este tipo entre las reacciones en un solo instrumento se conoce como una variación intrainstrumento. Además, un instrumento analítico en sí mismo genera una señal de ruido eléctrico incluso cuando se analiza un blanco (matriz sin analito) y puede identificarse como una señal normal. Sin embargo, una señal de ruido eléctrico de este tipo también crea una variación de señal y se denomina señal de blanco de instrumento. La señal de blanco de instrumento se genera de manera que se suma o se resta una cantidad específica de valor de señal del valor de señal original para cada ciclo.

Para el análisis preciso y fiable, tales problemas deben resolverse y se usan varios métodos para resolver los problemas. Como solución más básica, se usa un método de ajuste de hardware. Por ejemplo, cuando se fabrica el instrumento analítico, la propiedad de algunas partes de cada instrumento analítico, tal como la intensidad de la fuente de luz LED, se calibra o ajusta de manera que el nivel de una variación interinstrumento para la misma muestra se reduzca y mantenga dentro de un intervalo apropiado. Alternativamente, puede usarse un método de colorante de referencia. El colorante de referencia tal como ROXTM o fluoresceína que genera constantemente una cantidad conocida de una señal se añade en una mezcla de reacción de tal manera que la señal generada a partir de una muestra se calibra basándose en el nivel de señal generada a partir del colorante de referencia.

Sin embargo, estas técnicas anteriores pueden tener algunas limitaciones o deficiencias. El método de ajuste de hardware muestra una precisión limitada en la calibración y se necesita una calibración adicional para eliminar una variación producida por el deterioro del instrumento analítico. Además, el método de ajuste de hardware puede reducir solo la variación interinstrumento, pero no puede reducir la variación intrainstrumento. La calibración de señal usando el colorante de referencia aumenta el coste por reacción y las variaciones cuantitativas y cualitativas en los colorantes de referencia usados en cada reacción pueden causar otro error. Además, el uso del colorante de referencia puede aumentar la posibilidad de fenómeno de interferencia entre el colorante de referencia y otros colorantes usados para determinar la presencia de analito diana en la mezcla de reacción. El fenómeno de interferencia es un problema muy importante, particularmente en la PCR múltiple donde se usan múltiples colorantes y su fluorescencia debe detectarse. Además, asignar un colorante y un canal de detección para la calibración de señal provoca una desventaja considerable en vista de la competencia de producto porque da como resultado una diana simultáneamente menos detectable.

Por consiguiente, existen fuertes necesidades en la técnica para desarrollar enfoques novedosos para calibrar el conjunto de datos y reducir las variaciones inter- e intrainstrumento sin ajuste directo de hardware o usando el colorante de referencia.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas patentes y publicaciones y se proporcionan citas entre paréntesis.

El documento US 2013/115611 A1 da a conocer sistemas y métodos para calibrar un conjunto de datos de analito diana obtenido en un proceso de generación de señal, en los que se usa un coeficiente de normalización, que se proporciona basándose en un valor de señal de línea de referencia, y un valor de referencia. También se da a conocer un programa informático, un dispositivo informático y un medio legible por ordenador que almacena o ejecuta el método de calibración mencionado anteriormente.

El documento EP 2719770 A1 da a conocer un método y sistema para calibrar un conjunto de datos de una diana de ácido nucleico obtenida en PCR en tiempo real, en el que se usa un coeficiente de normalización, que se proporciona basándose en un valor de señal de línea de referencia, y un valor de referencia.

El documento US 2013/085078 A1 da a conocer un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana obtenido en un proceso de generación de señal, en el que se usa un coeficiente de normalización, que se proporciona basándose en un valor de señal de línea de referencia, y un valor de referencia.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los presentes inventores han realizado investigaciones intensivas para desarrollar enfoques novedosos para obtener resultados de calibración más precisos y fiables de variaciones de señal en una pluralidad de conjuntos de datos en los que las variaciones son las variaciones interinstrumento y las variaciones intrainstrumento de señales obtenidas de los instrumentos para adquirir conjuntos de datos (por ejemplo, sistema de PCR en tiempo real).

Como resultado, hemos encontrado que puede obtenerse un conjunto de datos calibrados con precisión y fiabilidad cuando se proporciona un coeficiente de normalización usando un valor de referencia determinado arbitrariamente, un ciclo de referencia y el conjunto de datos y se aplica a los valores de señal de la pluralidad de puntos de datos. Además, también hemos encontrado que el conjunto de datos calibrados puede obtenerse con mayor precisión y fiabilidad cuando se elimina un valor de señal de blanco de instrumento del valor de señal del conjunto de datos antes de que se proporcione el coeficiente de normalización. Además, hemos encontrado que el conjunto de datos calibrados puede obtenerse con mayor precisión y fiabilidad cuando el valor de referencia se determina al considerar una variación interinstrumento.

Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra.

Es otro objeto de esta invención proporcionar un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra.

Otro objeto más de esta invención es proporcionar un dispositivo para analizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra.

Es objeto adicional de esta invención proporcionar un programa informático para almacenarse en un medio de almacenamiento legible por ordenador para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra.

Otros objetos y ventajas de la presente invención se volverán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue tomada conjuntamente con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un diagrama de flujo que ilustra una realización del presente método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra.

La figura 2a representa curvas de amplificación de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware para mostrar la variación interinstrumento y la variación intrainstrumento de las señales de fondo.

La figura 2b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos.

La figura 3a representa curvas de amplificación de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware para mostrar la variación interinstrumento e intrainstrumento de las señales de fondo.

La figura 3b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos.

La figura 4a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por un método de normalización basado en señal de fondo específico (SBN) de la presente invención usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 4b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 5a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 5b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 6a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 6b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 7a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 7b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 8a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar mediante la resta de señal de blanco de instrumento y normalización basada en señal de fondo específica del método IBS-SBN de la presente invención usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 8b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 9a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 9b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 10a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBn usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 10b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 11a representa curvas de amplificación de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBn usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 11b representa curvas de amplificación con resta de línea de referencia de conjuntos de datos calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos calibrados.

La figura 12a representa curvas de fusión de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 12b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 13a representa curvas de fusión de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 13b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 14a representa curvas de fusión de conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en donde los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 14b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en los que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 14c representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común y una temperatura de referencia de 85°C como ciclo de referencia, en los que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 15a representa curvas de fusión de conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en las que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 15b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia común y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en los que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 16a representa curvas de fusión de conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en las que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware.

La figura 16b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en los que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos sin un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 17a representa curvas de fusión de conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en las que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware.

La figura 17b representa picos de fusión obtenidos representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos por calibración de tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar por la IBS-SBN usando un valor de referencia específico de instrumento y una temperatura de referencia de 55°C como ciclo de referencia, en los que conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtienen respectivamente de tres instrumentos con un ajuste de hardware y resultados analíticos del coeficiente de variación inter- e intrainstrumento de las derivadas máximas de los conjuntos de datos.

La figura 18 representa un resultado comparativo de conjuntos de datos obtenidos usando sondas de diversas concentraciones y conjuntos de datos calibrados obtenidos por la IBS-SBN usando diversos valores de referencia.

Descripción detallada de esta invención

I. Método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana

En un aspecto de esta invención, se proporciona un método implementado por ordenador para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos; en el que el conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para el analito diana usando unos medios de generación de señal; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos; en el que el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; en el que el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos; en el que el valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real excepto cero; en el que el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia; en el que el proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal; en el que el coeficiente de normalización se proporciona para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos; en el que el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se proporciona usando el ciclo de referencia idéntico y el valor de referencia idéntico; y

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de setarbit de datos.

Los presentes inventores han realizado investigaciones intensivas para desarrollar enfoques novedosos para calibrar un conjunto de datos y reducir más eficazmente la variación interinstrumento e intrainstrumento entre una pluralidad de conjuntos de datos que representan la presencia o ausencia de analito diana, por ejemplo, molécula de ácido nucleico diana. Como resultados, hemos encontrado que el conjunto de datos calibrados puede obtenerse con precisión y fiabilidad proporcionando un coeficiente de normalización usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y un conjunto de datos y aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal de la pluralidad de puntos de datos.

Según una realización, este enfoque se denomina en el presente documento método de “normalización específica basada en señal de fondo (SBN)”, debido a una señal de fondo específica de un ciclo específico, es decir, se usa un ciclo de referencia en la región de fondo para una calibración.

El término usado en el presente documento “normalización” se refiere a un proceso de reducción o eliminación de una variación de señal de un conjunto de datos obtenido de un proceso de generación de señal. El término usado en el presente documento “calibración” o “ajuste” se refiere a una corrección de un conjunto de datos, particularmente una corrección de un valor de señal de un conjunto de datos, adecuado para el objetivo de análisis. La normalización es un aspecto de la calibración.

La figura 1 representa un diagrama de flujo que ilustra una realización del presente método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra según el método SBN. La presente invención se describirá con más detalle de la siguiente manera:

Etapa (a): Proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar un conjunto de datos (110)

Según el presente método, se proporciona un coeficiente de normalización para calibrar un conjunto de datos. El conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para un analito diana usando unos medios de generación de señal, y el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos.

Los términos usados en el presente documento un analito diana pueden incluir diversos materiales (por ejemplo, materiales biológicos y materiales no biológicos tales como productos químicos). Particularmente, el analito diana puede incluir materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN y ARN), proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos, aminoácidos, productos químicos biológicos, hormonas, anticuerpos, antígenos, metabolitos y células. Más particularmente, el analito diana puede incluir moléculas de ácido nucleico. Según una realización, el analito diana puede ser una molécula de ácido nucleico diana.

El término usado en el presente documento “muestra” puede incluir muestras biológicas (por ejemplo, célula, tejido y fluido de una fuente biológica) y muestras no biológicas (por ejemplo, alimentos, agua y suelo). Las muestras biológicas pueden incluir virus, bacterias, tejido, célula, sangre (por ejemplo, sangre completa, plasma y suero), linfa, aspirado de médula ósea, saliva, esputo, hisopo, aspiración, leche, orina, heces, humor vítreo, esperma, líquido cerebral, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, fluido de la glándula del timo, lavado broncoalveolar, ascitis y líquido amniótico. Cuando un analito diana es una molécula de ácido nucleico diana, la muestra se somete a un proceso de extracción de ácido nucleico. Cuando el ácido nucleico extraído es ARN, el proceso de transcripción inversa se realiza adicionalmente para sintetizar ADNc a partir del ARN extraído (Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).

El término usado en el presente documento “proceso de generación de señales” se refiere a cualquier proceso capaz de generar señales de manera dependiente de una propiedad de un analito diana en una muestra, en el que la propiedad puede ser, por ejemplo, actividad, cantidad o presencia (o ausencia) del analito diana, en particular la presencia de (o ausencia de) un analito en una muestra. Según una realización, el proceso de generación de señal genera señales de manera dependiente de la presencia del analito diana en la muestra.

Dicho proceso de generación de señales puede incluir procesos biológicos y químicos. Los procesos biológicos pueden incluir procesos de análisis genético tales como PCR, PCR en tiempo real, ensayo de micromatrices e invasores, procesos de inmunoensayo y análisis de crecimiento de bacterias. Según una realización, el proceso de generación de señal incluye procesos de análisis genético. Los procesos químicos pueden incluir un análisis químico que comprende producción, cambio o descomposición de materiales químicos. Según una realización, el proceso de generación de señal puede ser una PCR o una PCR en tiempo real.

El proceso de generación de señal puede ir acompañado de un cambio de señal. El término “señal”, como se usa en el presente documento, se refiere a una salida medible. El cambio de señal puede servir como un indicador que indica cualitativa o cuantitativamente la propiedad, en particular la presencia o ausencia, de un analito diana. Ejemplos de indicadores útiles incluyen intensidad de fluorescencia, intensidad de luminiscencia, intensidad de quimioluminiscencia, intensidad de bioluminiscencia, intensidad de fosforescencia, transferencia de carga, voltaje, corriente, potencia, energía, temperatura, viscosidad, dispersión de luz, intensidad radiactiva, reflectividad, transmitancia y absorbancia. El indicador más ampliamente usado es la intensidad de fluorescencia. El cambio de señal puede incluir una disminución de señal, así como un aumento de señal. Según una realización, el proceso de generación de señal es un proceso que amplifica los valores de señal.

El término usado en el presente documento “medios de generación de señal” se refiere a cualquier material usado en la generación de una señal que indica una propiedad, más específicamente la presencia o ausencia del analito diana que pretende analizarse.

Una amplia variedad de los medios de generación de señal se conoce por un experto en la técnica. Los ejemplos de los medios de generación de señal pueden incluir oligonucleótidos, marcadores y enzimas. Los medios de generación de señal incluyen tanto marcadores per se como oligonucleótidos con marcadores. Los marcadores pueden incluir un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador quimioluminiscente, un marcador electroquímico y un marcador metálico. El marcador per se, como un colorante intercalante, puede servir como medios de generación de señal. Alternativamente, puede usarse un único marcador o un marcador dual interactivo que contiene una molécula donante y una molécula aceptadora como medios de generación de señal en forma de enlace con al menos un oligonucleótido. Los medios de generación de señal pueden comprender componentes adicionales para generar señales tales como enzimas nucleolíticas (por ejemplo, 5'-nucleasas y 3'-nucleasas).

Cuando el presente método se aplica a la determinación de la presencia o ausencia de una molécula de ácido nucleico diana, el proceso de generación de señal puede realizarse según una multitud de métodos conocidos por un experto en la técnica. Los métodos incluyen el método de sonda TaqMan™ (patente estadounidense n.° 5.210.015), método de baliza molecular (Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14 (3):303 (1996)), Método Scorpion (Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), método Sunrise o Amplifluor (Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), y patente estadounidense n.° 6.117.635), método Lux (patente estadounidense n.° 7.537.886), CPT (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148(1990)), método de LNA (patente estadounidense n.° 6.977.295), método Plexor (Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), Hybeacons™ (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 y patente estadounidense n.° 7.348.141), sonda autoinactivada de marcaje dual (US 5.876.930), sonda de hibridación (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), método PTOCE (escisión y extensión de PTO) (WO 2012/096523), método de PCE-SH (hibridación de oligonucleótidos de señalización dependiente de escisión y extensión de PTO) (WO 2013/115442) y método de PCE-NH (sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO) (PCT/KR2013/012312) y método CER (WO 2011/037306).

El término usado en el presente documento “amplificación” o “reacción de amplificación” se refiere a una reacción para aumentar o disminuir las señales. Según una realización de esta invención, la reacción de amplificación se refiere a un aumento (o amplificación) de una señal generada dependiendo de la presencia del analito diana usando los medios de generación de señal. La reacción de amplificación se acompaña de o sin una amplificación del analito diana (por ejemplo, molécula de ácido nucleico). Por lo tanto, según una realización de esta invención, el proceso de generación de señal se realiza con o sin una amplificación de la molécula de ácido nucleico diana. Más particularmente, la reacción de amplificación de la presente invención se refiere a una reacción de amplificación de señal realizada con una amplificación del analito diana.

El conjunto de datos obtenido de una reacción de amplificación comprende un ciclo de amplificación.

El término usado en el presente documento “ciclo” se refiere a una unidad de cambios de condiciones o una unidad de una repetición de los cambios de condiciones en una pluralidad de mediciones acompañadas de cambios de condiciones. Por ejemplo, los cambios de condiciones o la repetición de los cambios de condiciones incluyen cambios o repetición de cambios en temperatura, tiempo de reacción, número de reacción, concentración, pH y/o número de replicación de un sujeto medido (por ejemplo, molécula de ácido nucleico diana). Por lo tanto, el ciclo puede incluir un ciclo de cambio de condición (por ejemplo, temperatura o concentración), un tiempo o un ciclo de proceso, un ciclo de operación unitaria y un ciclo reproductor. Un número de ciclo representa el número de repetición del ciclo. En este documento, los términos “ciclo” y “número de ciclo” se usan indistintamente.

Por ejemplo, cuando se investiga la cinética enzimática, la velocidad de reacción de una enzima se mide varias veces a medida que aumenta regularmente la concentración de un sustrato. En esta reacción, el aumento en la concentración de sustrato puede corresponder a los cambios de las condiciones y la unidad creciente de la concentración de sustrato puede corresponder a un ciclo. Como otro ejemplo, cuando se realiza una amplificación isotérmica del ácido nucleico, las señales de una sola muestra se miden varias veces con un intervalo regular de veces en condiciones isotérmicas. En esta reacción, el tiempo de reacción puede corresponder a los cambios de condiciones y una unidad del tiempo de reacción puede corresponder a un ciclo. Según otra realización, como uno de los métodos para detectar un analito diana a través de una reacción de amplificación de ácido nucleico, una pluralidad de señales de fluorescencia generadas a partir de las sondas hibridadas con el analito diana se miden con un cambio regular de la temperatura en la reacción. En esta reacción, el cambio de la temperatura puede corresponder a los cambios de condiciones y la temperatura puede corresponder a un ciclo.

Particularmente, cuando se repite una serie de reacciones o se repite una reacción con un intervalo de tiempo, el término “ciclo” se refiere a una unidad de la repetición. Por ejemplo, en una reacción en cadena de polimerasa (PCR), un ciclo se refiere a una unidad de reacción que comprende la desnaturalización de una molécula de ácido nucleico diana, hibridación entre la molécula de ácido nucleico diana y cebadores y extensión de cebador. Los aumentos en la repetición de las reacciones pueden corresponder a los cambios de condiciones y una unidad de la repetición puede corresponder a un ciclo.

Según una realización, donde la molécula de ácido nucleico diana está presente en una muestra, valores (por ejemplo, intensidades) de las señales medidas aumentan o disminuyen al aumentar los ciclos de una reacción de amplificación. Según una realización, la reacción de amplificación para amplificar señales indicativas de la presencia de la molécula de ácido nucleico diana puede realizarse de tal manera que las señales se amplifiquen simultáneamente con la amplificación de la molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, PCR en tiempo real). Alternativamente, la reacción de amplificación puede realizarse de tal manera que las señales se amplifiquen sin amplificación de la molécula de ácido nucleico diana [por ejemplo, método CPT (Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148(1990)), ensayo de Invader (patentes estadounidenses n.os 6.358.691 y 6.194.149)].

El analito diana puede amplificarse mediante diversos métodos. Por ejemplo, se conoce una multitud de métodos para la amplificación de una molécula de ácido nucleico diana, incluyendo, pero no limitado a, PCR (reacción en cadena de polimerasa), LCR (reacción en cadena de ligasa, véase la patente estadounidense n.° 4683195 y n.° 4683202; A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990); Wiedmann M, et al., “Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications.” PCR Methods and Applications, febrero de 1994; 3(4):S51-64), GLCR (LCR de relleno de huecos, véanse los documentos WO 90/01069, EP 439182 y WO 93/00447), Q-beta (amplificación de replicasa Q-beta, véase Cahill P, et al., Clin Chem. 37(9):1482-5(1991), patente estadounidense n.° 5556751), s Da (amplificación por desplazamiento de cadena, véanse G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):1691-1696(1992), EP 497272), NASBA (amplificación basada en secuencias de ácido nucleico, véase Compton, J. Nature 350(6313):91-2(1991)), TMA (amplificación mediada por transcripción, véase Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); patente estadounidense n.° 5888779).) o RCA (amplificación del círculo rodante, véase Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE. UU. 102:17332-17336(2005)).

Según una realización, el marcador usado para los medios de generación de señal puede comprender una fluorescencia, más particularmente, un marcador único fluorescente o un marcador dual interactivo que comprende una molécula donante y una molécula aceptadora (por ejemplo, un marcador dual interactivo que contiene una molécula indicadora fluorescente y una molécula inactivadora).

Según una realización, la reacción de amplificación usada en la presente invención puede amplificar señales simultáneamente con la amplificación del analito diana, particularmente la molécula de ácido nucleico diana. Según una realización, la reacción de amplificación se realiza según una PCR o una PCR en tiempo real.

El conjunto de datos obtenido de un proceso de generación de señal comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos.

El término usado en el presente documento “valores de señales” o “valores de señal” significa cualquiera de los valores de señales medidos realmente en los ciclos del proceso de generación de señal (por ejemplo, valor real de la intensidad de fluorescencia procesada por reacción de amplificación) o sus modificaciones. Las modificaciones pueden incluir valores procesados matemáticamente de valores de señal medidos (por ejemplo, intensidades). Los ejemplos de valores procesados matemáticamente de valores de señal medidos pueden incluir valores logarítmicos y derivadas de valores de señal medidos. Las derivadas de valores de señal medidos pueden incluir múltiples derivadas.

El término usado en el presente documento “punto de datos” significa un valor de coordenadas que comprende un ciclo y un valor de una señal en el ciclo. El término usado en el presente documento “datos” significa cualquier información comprendida en el conjunto de datos. Por ejemplo, cada uno de los ciclos y valores de señal de una reacción de amplificación pueden ser datos. Los puntos de datos obtenidos de un proceso de generación de señal, particularmente de una reacción de amplificación puede representarse gráficamente con valores de coordenadas en un sistema de coordenadas rectangular. En el sistema de coordenadas rectangulares, el eje X representa ciclos de la reacción de amplificación y el eje Y representa valores de señal medidos en cada ciclo o modificaciones de los valores de señal.

El término usado en el presente documento “conjunto de datos” se refiere a un conjunto de puntos de datos. El conjunto de datos puede incluir un conjunto de datos sin procesar que es un conjunto de puntos de datos obtenidos directamente del proceso de generación de señal (por ejemplo, una reacción de amplificación) usando unos medios de generación de señal. Alternativamente, el conjunto de datos puede ser un conjunto de datos modificado que se obtiene mediante una modificación del conjunto de datos que incluye un conjunto de puntos de datos obtenidos directamente del proceso de generación de señal. El conjunto de datos puede incluir un conjunto completo o parcial de puntos de datos obtenidos del proceso de generación de señal o puntos de datos modificados del mismo.

Según una realización de esta invención, el conjunto de datos puede ser un conjunto de datos procesados matemáticamente del conjunto de datos sin procesar. En particular, el conjunto de datos puede ser un conjunto de datos restados de línea de referencia para eliminar un valor de señal de fondo del conjunto de datos sin procesar. El conjunto de datos con resta de línea de referencia puede obtenerse mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, US 8.560.240).

El término “conjunto de datos sin procesar” como se usa en el presente documento se refiere a un conjunto de puntos de datos (incluidos números de ciclo y valores de señal) obtenidos directamente de una reacción de amplificación. El conjunto de datos sin procesar significa un conjunto de puntos de datos no procesados que se reciben inicialmente de un dispositivo para realizar una PCR en tiempo real (por ejemplo, termociclador, máquina de PCR o amplificador de ADN). En una realización de la presente invención, el conjunto de datos sin procesar puede incluir un conjunto de datos sin procesar entendido convencionalmente por un experto en la técnica. En una realización de la presente invención, el conjunto de datos sin procesar puede incluir un conjunto de datos antes del procesamiento. En una realización de la presente invención, el conjunto de datos sin procesar puede incluir un conjunto de datos que es la base para los conjuntos de datos procesados matemáticamente como se describe en el presente documento. En una realización de la presente invención, el conjunto de datos sin procesar puede incluir un conjunto de datos no restado por una línea de referencia (conjunto de datos sin resta de línea de referencia).

El método de la presente invención puede ser un método para calibrar un único conjunto de datos de un analito diana en una muestra. Alternativamente, el método para la presente invención puede ser un método para calibrar una pluralidad de conjuntos de datos. Según una realización, un conjunto de datos de la presente invención puede comprender una pluralidad de conjuntos de datos. Particularmente, la pluralidad de conjuntos de datos es una pluralidad de conjuntos de datos de analitos diana del mismo tipo.

Según una realización, el conjunto de datos de la etapa (a) puede ser un conjunto de datos que se elimina de una señal de blanco de instrumento. Alternativamente, el conjunto de datos de la etapa (a) puede ser el conjunto de datos que no se elimina de una señal de blanco de instrumento.

El término “1er conjunto de datos calibrados” puede usarse en el presente documento para referirse al conjunto de datos modificado en el que se elimina una señal de blanco de instrumento del conjunto de datos sin procesar. El 1er conjunto de datos calibrados puede interpretarse como un conjunto de datos modificado y se distingue del conjunto de datos finalmente calibrado o el 2° conjunto de datos calibrados.

Según una realización, la señal de blanco de instrumento puede obtenerse sin el uso de los medios de generación de señal. Particularmente, la señal de blanco de instrumento es una señal detectada a partir de una reacción realizada sin medios de generación de señal tales como marcadores per se, u oligonucleótidos marcados que generan una señal por la presencia del analito diana. Debido a que dicha señal de blanco de instrumento se mide en ausencia de los medios de generación de señal, una variación de señal debido a una diferencia de instrumento a instrumento en las proporciones de señales generadas por unidad de concentración de analitos diana no se aplica a la señal de blanco de instrumento.

La señal de blanco de instrumento puede determinarse y aplicarse en diversos enfoques. Por ejemplo, las señales de blanco de instrumento independientes pueden determinarse para aplicar a sus instrumentos correspondientes. Puede aplicarse una única señal de blanco de instrumento a los conjuntos de datos obtenidos por un solo instrumento y pueden aplicarse diferentes señales de blanco de instrumento cada una a los conjuntos de datos obtenidos por cada uno de sus instrumentos correspondientes. Alternativamente, pueden determinarse diferentes señales de blanco de instrumento para aplicar a cada uno de los pocillos dentro de un solo instrumento. Cada pocillo dentro de un solo instrumento puede tener su propia señal de blanco de instrumento y diferentes señales de blanco de instrumento pueden aplicarse cada una a conjuntos de datos obtenidos por cada uno de sus pocillos correspondientes dentro de un solo instrumento.

El conjunto de datos que se elimina de una señal de blanco de instrumento puede ser el conjunto de datos en el que se elimina una señal de blanco de instrumento en su totalidad o en parte. El término “eliminación” significa restar o sumar un valor de señal de/a un conjunto de datos. Particularmente, el término “eliminación” se refiere a la resta de un valor de señal de un conjunto de datos. Cuando una señal de blanco de instrumento tiene un valor negativo, puede eliminarse sumando un valor de señal.

Según una realización, la señal de blanco de instrumento puede obtenerse sin el uso de los medios de generación de señal. Particularmente, la señal del blanco del instrumento puede medirse usando un pocillo vacío, un tubo vacío, un tubo que contenga agua o un tubo que contenga una mezcla de reacción de PCR en tiempo real sin medios de generación de señal tales como oligonucleótido conjugado con molécula de fluorescencia. Puede realizarse una medición de una señal de blanco de instrumento junto con un proceso de generación de señal o puede realizarse independientemente de un proceso de generación de señal.

Según una realización, una señal de blanco de instrumento puede eliminarse en su totalidad de tal manera que la medición de la señal de blanco de instrumento se realiza junto con un proceso de generación de señal y la señal de blanco de instrumento medida se resta de los valores de señal de un conjunto de datos obtenido por el proceso de generación de señal.

Alternativamente, una señal de blanco de instrumento puede eliminarse en parte de tal manera que un valor determinado de una señal se resta de los valores de señal de un conjunto de datos obtenido por un proceso de generación de señal. El valor determinado de una señal puede ser cualquier valor siempre que una señal correspondiente a una señal de blanco de instrumento en un conjunto de datos se reduzca por la resta del valor determinado de la señal. Por ejemplo, el valor determinado de una señal puede determinarse basándose en una pluralidad de señales de blanco de instrumento medidas a partir de un instrumento o una pluralidad de instrumentos. Cuando es problemático medir una señal de blanco de instrumento para cada experimento de análisis de analito diana, una señal de blanco de instrumento puede eliminarse de conjuntos de datos de tal manera que un valor determinado de la señal correspondiente a una parte de la señal de blanco de instrumento se determina basándose en una pluralidad de señales de blanco de instrumento medidas de un instrumento o de una pluralidad de instrumentos y luego el valor determinado de señal determinado se resta de cada uno de los conjuntos de datos.

Alternativamente, el valor determinado de la señal puede determinarse en un intervalo tal que una variación de señal de un conjunto de datos se reduce cuando el valor determinado de la señal se resta del conjunto de datos y los valores de señal del conjunto de datos restados se calibran con una razón según el presente método. Como tal, el conjunto de datos reducido de una señal de blanco de instrumento puede proporcionarse restando el valor determinado de señal que es una parte de la señal de blanco de instrumento sin medición de una señal de blanco de instrumento para cada reacción.

Según una realización, el método comprende además la etapa de realizar el proceso de generación de señal para obtener un conjunto de datos del analito diana en la muestra antes de la etapa (a).

Según una realización, el conjunto de datos del analito diana puede indicar la presencia o ausencia del analito diana en la muestra. En este caso, el método proporcionado por la presente invención se describe como “un método para calibrar el conjunto de datos que representa la presencia o ausencia de un analito diana en una muestra”. La calibración de un conjunto de datos que representa la presencia o ausencia de un analito diana en una muestra se realiza eventualmente para determinar la presencia o ausencia de un analito diana en una muestra. El término usado “determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra” significa determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia o ausencia de un analito en una muestra.

El coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos.

El ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos. El valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente. El coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia.

El ciclo de referencia es un ciclo seleccionado para determinar un valor de señal específico usado para proporcionar un coeficiente de normalización con un valor de referencia. El ciclo de referencia usado para proporcionar un coeficiente de normalización puede seleccionarse arbitrariamente de ciclos del conjunto de datos.

El ciclo de referencia puede abarcar una temperatura de referencia, una concentración de referencia o un tiempo de referencia dependiendo del significado del ciclo. Por ejemplo, una temperatura de referencia puede ser un ciclo de referencia de conjunto de datos de fusión, en el que la unidad de ciclo es la temperatura. En la descripción con respecto al conjunto de datos de fusión, los términos “ciclo de referencia” y “temperatura de referencia” pueden usarse indistintamente.

Según una realización, el ciclo de referencia se selecciona de un grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos, en el que el grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos se proporciona de la misma manera entre sí.

Según una realización, el ciclo de referencia se selecciona de un grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos, en el que el grupo de ciclos de referencia se genera basándose en una regla idéntica. La regla idéntica puede aplicarse igualmente a la determinación del ciclo de referencia en todos los conjuntos de datos.

El grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos se proporciona de la misma manera entre sí. El grupo de ciclos de referencia puede determinarse mediante diversos enfoques. Por ejemplo, el grupo de ciclos de referencia puede comprender los ciclos en los que se mide un nivel similar de valores de señal. El grupo de ciclos de referencia puede comprender los ciclos en los que se mide un nivel sustancialmente idéntico de valores de señal. El grupo de ciclos de referencia puede comprender los ciclos donde el coeficiente de variación de los valores de señal está dentro del 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %.

Cuando el conjunto de datos se representa gráficamente como una forma de respuesta sigmoidal, el grupo de ciclo de referencia puede comprender los ciclos antes y/o después de la región de amplificación (es decir, fase de crecimiento). La región antes de la región de amplificación puede ser la región de línea de referencia o la región de estadio temprano. La región después de la región de amplificación puede ser la región de meseta o la región de etapa tardía. El grupo de ciclos de referencia puede comprender un solo ciclo en el que el número del ciclo único de cada conjunto de datos es idéntico entre sí.

El número de los ciclos de referencia determinados en cada conjunto de datos pueden ser idénticos entre sí. Alternativamente, el número de los ciclos de referencia determinados en cada conjunto de datos pueden ser diferentes entre sí.

Según una realización, la pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un ciclo o ciclos de referencia seleccionados de un grupo de ciclos de referencia que se proporcionan de la misma manera (una regla común o un criterio predeterminado) entre sí.

Según una realización, la misma manera (una regla común o un criterio predeterminado) proporciona un grupo de referencia, en el que los coeficientes de normalización calculados a partir de un conjunto de datos con el ciclo o ciclos de referencia seleccionados del grupo de referencia pueden ser sustancialmente idénticos o estar en un intervalo de desviación estándar estrecho (por ejemplo, un 15 %, 10 %, 8 %, 5 % o 4 %).

Según una realización, cuando el conjunto de datos comprende la pluralidad de conjuntos de datos, se aplica un ciclo de referencia idéntico a una pluralidad de conjuntos de datos a analizar con respecto a un criterio idéntico. La pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un ciclo de referencia idéntico.

La variación de señal de los conjuntos de datos usados para el análisis de intra- o intercomparación o analizados por el criterio idéntico, tal como el mismo umbral, debe minimizarse. Un intervalo de conjuntos de datos que van a analizarse con respecto a un criterio idéntico puede determinarse por un propósito de análisis, tal como, pero no limitado al mismo, una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de un analito diana, obtenido del mismo tipo de muestra, u obtenido por la misma mezcla de reacción (por ejemplo, las mismas moléculas fluorescentes o la misma sonda) con respecto a un criterio idéntico.

Debido a que se usa un ciclo de referencia para determinar un valor de señal específico que se usa para proporcionar un coeficiente de normalización junto con un valor de referencia, el ciclo de referencia se seleccionará de ciclos de conjuntos de datos donde los ciclos son capaces de proporcionar un valor de señal.

El ciclo de referencia puede ser un ciclo predeterminado o puede determinarse mediante un experimento. El ciclo de referencia puede seleccionarse de ciclos de un conjunto de datos. Específicamente, el ciclo de referencia se selecciona de ciclos en una región de un conjunto de datos donde la amplificación de la señal no se detecta suficientemente.

Por ejemplo, cuando el conjunto de datos se obtiene mediante un proceso de amplificación de ácido nucleico, es preferible que el ciclo de referencia se seleccione dentro de una región de señal de fondo. La región de fondo se refiere a una etapa temprana de un proceso de generación de señal antes de que se detecte suficientemente la amplificación de la señal.

La región de fondo puede determinarse mediante diversos enfoques. Por ejemplo, el ciclo de punto final de la región de fondo puede determinarse con un ciclo del primer punto de datos que tiene una pendiente mayor que un umbral determinado en las primeras derivadas del conjunto de datos obtenido por un proceso de amplificación de ácido nucleico. Alternativamente, el ciclo de punto de inicio de la región de fondo puede determinarse con un ciclo de inicio del primer pico en las primeras derivadas del conjunto de datos obtenido por un proceso de amplificación de ácido nucleico. De lo contrario, el ciclo de punto final de la región de fondo puede determinarse con un ciclo de un punto de datos que tiene una curvatura máxima.

Según una realización, el proceso de amplificación del valor de señal puede ser un proceso que proporciona valores de señal de una región de señal de fondo y una región de amplificación de señal y el ciclo de referencia puede seleccionarse dentro de la región de señal de fondo. Más específicamente, según una realización, el proceso de generación de señal puede ser una reacción en cadena de polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real) y el ciclo de referencia puede seleccionarse dentro de la región de señal de fondo antes de una región de amplificación de señal de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). Los valores de señal de la región de fondo inicial de los conjuntos de datos obtenidos por una pluralidad de PCR o PCR en tiempo real usando el mismo analito diana en la misma condición de reacción tendrían teóricamente el mismo o al menos un valor similar, debido a que los valores de señal de la región de fondo inicial pueden comprender un nivel muy bajo del valor de señal generado por el analito diana independientemente de la concentración del analito diana. Por lo tanto, es preferible que el ciclo de referencia se seleccione dentro de la región de señal de fondo.

Por lo tanto, el número de los ciclos de referencia puede ser de no más de 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 u 8. El ciclo de referencia de la presente invención puede seleccionarse evitando una señal de ruido inicial. El número de los ciclos de referencia puede no ser inferior a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. Particularmente, el ciclo de referencia de la presente invención puede determinarse a partir de los ciclos 1-30, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 3-30, 3 20, 3-15, 3-10, 3-9, 3-8, 4-8, o 5-8 en la región de fondo.

Según una realización, el ciclo de referencia puede ser un único ciclo de referencia. Puede usarse un solo ciclo como ciclo de referencia, y puede usarse un valor de señal en el ciclo de referencia de un conjunto de datos para proporcionar un coeficiente de normalización. Alternativamente, según una realización, el ciclo de referencia puede comprender al menos dos ciclos de referencia.

El ciclo de referencia puede comprender al menos dos ciclos de referencia y los valores de señal en los ciclos del conjunto de datos correspondientes a los ciclos de referencia pueden comprender al menos dos valores de señal.

Puede proporcionarse un coeficiente de normalización para la calibración usando un valor de señal que se calcula a partir de los valores de señal respectivos en los ciclos del conjunto de datos correspondientes a los al menos dos ciclos de referencia. Alternativamente, pueden proporcionarse al menos dos coeficientes de normalización usando los valores de señal respectivos en los ciclos del conjunto de datos correspondientes a los al menos dos ciclos de referencia, y puede proporcionarse un coeficiente de normalización para la calibración a partir de los al menos dos coeficientes de normalización. Por ejemplo, los ciclos 4°, 5° y 6° pueden designarse como ciclos de referencia, y el promedio de los valores de señal de los ciclos 4°, 5° y 6° de un conjunto de datos pueden usarse para proporcionar un coeficiente de normalización. Como otro ejemplo, los ciclos 4°, 5° y 6° pueden designarse como los ciclos de referencia y los coeficientes de normalización para cada ciclo de referencia pueden proporcionarse usando los valores de señal respectivos en los ciclos del conjunto de datos correspondientes a los ciclos de referencia, y luego el promedio de los coeficientes de normalización proporcionados puede determinarse como el coeficiente de normalización final que se aplicará al conjunto de datos.

Según una realización, cuando se selecciona un ciclo de referencia dentro de un intervalo de ciclos de un conjunto de datos, el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos en los que los valores de señal de los conjuntos de datos que van a analizarse con respecto a un criterio idéntico tendrían el mismo valor o al menos un valor similar en el ciclo de referencia.

Un valor de señal usado para proporcionar un coeficiente de normalización que se aplicará a una pluralidad de puntos de datos para la calibración de un conjunto de datos se determina mediante un ciclo de referencia y el conjunto de datos. Particularmente, el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia.

Según una realización, el método de la presente invención puede comprender además la etapa de eliminar señales anómalas (por ejemplo, señal de pico o error de salto) de un conjunto de datos obtenido por proceso de generación de señal antes de la determinación del valor de señal usado para proporcionar un coeficiente de normalización a partir del ciclo de referencia y el conjunto de datos.

Un valor de referencia es un valor usado para proporcionar un coeficiente de normalización. Un valor de referencia de la presente invención se refiere a un valor arbitrario que se aplica a un ciclo de referencia para las calibraciones de valores de señal de un conjunto de datos. Los conjuntos de datos que van a analizarse por un criterio idéntico pueden aplicarse con el mismo valor de referencia. Cuando el conjunto de datos que va a calibrarse es una pluralidad de conjuntos de datos, la pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un valor de referencia idéntico y esta es una de las características importantes de la presente invención.

Un valor de referencia puede ser un valor determinado arbitrariamente. El valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real, excepto cero. Cuando el valor de referencia es cero, no puede determinarse el coeficiente de normalización. Como se usa en el presente documento, “un valor de referencia puede ser un valor determinado arbitrariamente” significa que un valor de referencia puede determinarse de manera no limitada siempre que la presencia de un analito diana en una muestra esté determinada por el conjunto de datos calibrados usando el valor de referencia. El valor de referencia puede seleccionarse arbitrariamente por un experimentador siempre que la presencia de un analito diana en una muestra se determine mediante el conjunto de datos calibrados usando el valor de referencia. Por lo tanto, el valor de referencia que va a usarse para calibrar un conjunto de datos puede determinarse dentro de un intervalo de valores de señal que va a obtenerse en el ciclo de referencia de los procesos de generación de señal del mismo tipo que un proceso de generación de señal mediante el cual se obtiene el conjunto de datos. El valor de referencia puede obtenerse independientemente de un conjunto de datos que va a calibrarse. Específicamente, el valor de referencia puede determinarse mediante un conjunto de datos que se obtiene de un proceso de generación de señal del mismo tipo de analito diana a un analito diana que va a analizarse. Alternativamente, el valor de referencia puede obtenerse de un grupo de conjuntos de datos que comprende un conjunto de datos que va a calibrarse.

Preferiblemente, un valor de referencia puede ser el mismo valor de tipo que los valores de un conjunto de datos que va a calibrarse y puede tener la misma unidad o dimensión que el conjunto de datos que va a calibrarse. Sin embargo, aunque el valor de referencia y el valor de señal del conjunto de datos pueden tener diferentes unidades o dimensiones entre sí o el valor de referencia no tiene unidad o dimensión, puede proporcionarse un coeficiente de normalización adecuado para cada reacción usando una razón del valor de referencia con respecto al valor de señal del conjunto de datos que va a calibrarse, de modo que pueda obtenerse un conjunto de datos calibrados usando el coeficiente de normalización para cada reacción.

Según una realización, el proceso de generación de señal puede ser una pluralidad de procesos de generación de señal para la detección del mismo tipo de analitos diana, el conjunto de datos puede ser una pluralidad de conjuntos de datos y unos valores de referencia aplicados a cada conjunto de datos pueden determinarse independientemente de otro valor de referencia. La expresión usada en el presente documento “ los valores de referencia pueden determinarse independientemente” significa que un valor de referencia para un conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos puede determinarse sin tener en cuenta un valor de referencia para otro conjunto de datos.

La pluralidad de procesos de generación de señal puede ser una pluralidad de procesos de generación de señal para la detección del mismo tipo de analitos diana (es decir, los analitos diana del mismo tipo). El mismo tipo de analitos diana puede ser una pluralidad de analitos diana aislados de la misma muestra. Alternativamente, el mismo tipo de analitos diana puede ser una pluralidad de analitos diana que se aísla de las diferentes muestras pero se detecta por los mismos medios de generación de señal (por ejemplo, las mismas sondas o los mismos cebadores).

Según una realización, la pluralidad de procesos de generación de señal puede ser una pluralidad de procesos de generación de señal para el analito diana del mismo tipo realizado en diferentes entornos de reacción. Los procesos de generación de señal en diferentes entornos de reacción comprenden diversas realizaciones. Particularmente, los procesos de generación de señal en diferentes entornos de reacción pueden ser procesos de generación de señal realizados en diferentes instrumentos, realizado en diferentes pocillos o tubos de reacción, realizado para diferentes muestras, realizado con analitos diana de diferentes concentraciones, realizado con diferentes cebadores o sondas, realizado con diferentes colorantes de generación de señal o realizado por diferentes medios de generación de señal.

El proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción, y el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal. La pluralidad de procesos de generación de señal se realiza en diferentes recipientes de reacción. El término usado en el presente documento “recipiente de reacción” se refiere a un recipiente o una parte de un dispositivo en el que una reacción se procesa mezclando una muestra y medios de generación de señal (por ejemplo, cebadores o sondas). La expresión usada en el presente documento “ la pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción” significa que un proceso de generación de señal se realiza usando un medio de generación de señal y una muestra que son independientes de otro medio de generación de señal y muestra para otro proceso de generación de señal. Por ejemplo, los procesos de generación de señal realizados en una pluralidad de tubos o en una pluralidad de pocillos de una placa pueden corresponder a la pluralidad de procesos de generación de señal. Los procesos de generación de señal que se realizan en el mismo recipiente de reacción pero en diferentes momentos también pueden corresponder a la pluralidad de procesos de generación de señal.

La pluralidad de procesos de generación de señal puede clasificarse en varios grupos con respecto a los entornos de reacción (por ejemplo, un instrumento usado). Particularmente, la pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes instrumentos puede clasificarse en diferentes grupos dependiendo de los instrumentos realizados. La pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de los procesos de generación de señal que se realizaron en diferentes instrumentos se calibran usando un valor de referencia idéntico.

Según una realización, la pluralidad de procesos de generación de señal puede realizarse en instrumentos diferentes entre sí. Cuando el instrumento analiza una sola muestra en una operación, la pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de este tipo de la pluralidad de procesos de generación de señal puede calibrarse usando diferentes valores de referencia entre sí.

La pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un valor de referencia idéntico. La pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un ciclo de referencia idéntico.

Cuando se calibra una pluralidad de conjuntos de datos usando un valor de referencia idéntico (valor de referencia común) que se aplica a la pluralidad de conjuntos de datos en común, todos los conjuntos de datos están calibrados para tener un valor de señal idéntico en un ciclo de referencia, reduciendo de ese modo la variación de señal de los conjuntos de datos. Por lo tanto, los coeficientes de normalización para conjuntos de datos obtenidos de una pluralidad de procesos de generación de señal que son diferentes en entornos de reacción se obtienen usando un valor de referencia idéntico, que es una de las características importantes de la presente invención. Particularmente, cada coeficiente de normalización para los conjuntos de datos obtenidos de una pluralidad de procesos de generación de señal que es diferente en entornos de reacción se obtiene usando un ciclo de reacción idéntico y un valor de referencia idéntico. La pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de diferentes instrumentos se calibra usando un valor de referencia idéntico.

Según una realización, el valor de referencia se determina dentro del promedio ± desviación estándar (SD) de los valores de señal en los ciclos de la pluralidad de conjuntos de datos correspondientes al ciclo de referencia. Cuando el valor de referencia se determina dentro del intervalo descrito anteriormente, puede normalizarse una pluralidad de conjuntos de datos minimizando la diferencia entre el conjunto de datos y el conjunto de datos calibrado.

Sin embargo, la pluralidad de conjuntos de datos puede calibrarse usando diferentes valores de referencia. Pueden aplicarse diferentes valores de referencia a una pluralidad de conjuntos de datos que van a analizarse mediante un criterio idéntico.

La pluralidad de conjuntos de datos puede clasificarse en varios grupos con respecto a los entornos de reacción (por ejemplo, un instrumento usado), y considerando las diferencias de los entornos de reacción, puede determinarse y aplicarse un valor de referencia apropiado para cada grupo. A través de este proceso, la variación de señal entre la pluralidad de conjuntos de datos puede calibrarse con mayor precisión.

Según una realización, el proceso de generación de señal es una pluralidad de procesos de generación de señal para el mismo tipo de analito diana realizado en diferentes recipientes de reacción, el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal. La variación interinstrumento puede ser una variación de señal entre los conjuntos de datos independientes que se obtienen mediante los procesos de generación de señal para el analito diana idéntico realizado en los respectivos instrumentos diferentes. Alternativamente, la variación interinstrumento puede ser una variación de señal entre los conjuntos de datos independientes que se obtienen mediante operaciones independientes de los procesos de generación de señal para el analito diana idéntico en el instrumento idéntico. Por ejemplo, las operaciones independientes de los procesos de generación de señal para el analito diana idéntico pueden realizarse en el instrumento idéntico con un intervalo de tiempo de operación. En este caso, el funcionamiento independiente de un instrumento puede considerarse como un instrumento.

Según una realización, el valor de referencia puede determinarse dentro de un intervalo de una pluralidad de valores de señal en ciclos de referencia de una pluralidad de conjuntos de datos que van a analizarse con respecto a un criterio idéntico. Cuando el valor de referencia se determina dentro de un intervalo de una pluralidad de valores de señal en ciclos de referencia de una pluralidad de conjuntos de datos que van a analizarse con respecto a un criterio idéntico, la pluralidad de conjuntos de datos puede calibrarse minimizando la diferencia entre el conjunto de datos y el conjunto de datos calibrado.

Según una realización, el coeficiente de normalización para un conjunto de datos puede proporcionarse usando un valor de referencia y un ciclo de referencia y el conjunto de datos. Más particularmente, el coeficiente de normalización puede proporcionarse usando un valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos que va a calibrarse en el que el ciclo corresponde al ciclo de referencia. El coeficiente de normalización puede ser un valor aplicado a una pluralidad de puntos de datos de un conjunto de datos obtenido de una reacción, calibrar así el conjunto de datos.

Cuando el conjunto de datos comprende la pluralidad de conjuntos de datos, la pluralidad de conjuntos de datos se obtiene a partir de la pluralidad de procesos de generación de señal en diferentes recipientes de reacción. El coeficiente de normalización puede proporcionarse para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos. La pluralidad de conjuntos de datos puede calibrarse aplicando los coeficientes de normalización. Para reducir la variación de señal mostrada entre conjuntos de datos que van a analizarse mediante un criterio idéntico, el coeficiente de normalización apropiado para el conjunto de datos se proporciona mediante el presente método. El coeficiente de normalización se aplica a valores de señal en una pluralidad de puntos de datos del conjunto de datos, obteniendo de ese modo valores de señal calibrados para proporcionar un conjunto de datos calibrados.

El coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos. El coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia. La relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia puede definirse de varias maneras, por ejemplo, la relación puede definirse matemáticamente. El valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia (es decir, en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos) puede ser un valor de señal sin modificación o puede ser un valor de señal modificado matemáticamente. Particularmente, la relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia puede ser una diferencia entre el valor de referencia y un valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia. Más particularmente, la diferencia entre el valor de referencia y un valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia puede ser una razón del valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia con respecto al valor de referencia.

El ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia es un ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos. Según una realización, el valor de señal de un ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos puede ser un único valor de señal. Alternativamente, según una realización, el valor de señal de un ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos puede ser una pluralidad de valores de señal.

El coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal o definiendo una relación entre el valor de referencia y una pluralidad de valores de señal. La pluralidad de valores de señal puede obtenerse en un ciclo de referencia o una pluralidad de ciclos de referencia.

Cuando el coeficiente de normalización se proporciona por un valor de referencia y un valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos, el coeficiente de normalización puede proporcionarse mediante una razón del valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos con respecto al valor de referencia.

Cuando el coeficiente de normalización se proporciona por un valor de referencia y una pluralidad de valores de señal en los ciclos correspondientes al ciclo de referencia del conjunto de datos, la pluralidad de valores de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos puede designarse mediante una pluralidad de ciclos de referencia o un ciclo de referencia.

Por ejemplo, cuando el 3er ciclo se designa como un ciclo de referencia, la pluralidad de valores de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia puede comprender un valor de señal en el 3er ciclo y valores de señal en los ciclos que se posicionan un ciclo antes/después del 3er ciclo. Como otro ejemplo, cuando los ciclos 2°, 3° y 4° se designan como ciclos de referencia, la pluralidad de valores de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia puede comprender valores de señal en el 2°, 3er y 4° ciclo que son los ciclos correspondientes al ciclo de referencia.

La relación entre la pluralidad de valores de señal designados por el/los ciclo(s) de referencia y un valor de referencia puede definirse de varias maneras. Por ejemplo, la relación entre la pluralidad de valores de señal y un valor de referencia puede definirse por una razón de un promedio, mediana, valor mínimo o máximo de la pluralidad de valores de señal o un valor promedio de valores de señal por debajo del umbral de la pluralidad de valores de señal con respecto al valor de referencia. Preferiblemente, la relación entre la pluralidad de valores de señal designados por el/los ciclo(s) de referencia y un valor de referencia puede definirse por una razón de un valor promedio de la pluralidad de valores de señal con respecto al valor de referencia. Cuando la pluralidad de valores de señal se usa para proporcionar el coeficiente de normalización, la influencia de un valor de señal anómala en la calibración de un conjunto de datos se vuelve insignificante.

Por ejemplo, cuando un valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos es 0 (cero), todos los valores de señal calibrados del conjunto de datos pueden tener el mismo valor. La aparición de dicho resultado erróneo puede reducirse mucho más mediante el uso de una pluralidad de valores de señal para proporcionar el coeficiente de normalización que mediante el uso de un único valor de señal. Según una realización, cuando un coeficiente de normalización es 0 (cero), todos o algunos de los valores de señal para proporcionar el coeficiente de normalización pueden cambiarse a otros valores de señal.

Según una realización, el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia y un valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos.

El coeficiente de normalización puede calcularse mediante la siguiente ecuación matemática:

[Coeficiente de normalización = un valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia / valor de referencia]

Por ejemplo, el coeficiente de normalización puede calcularse como 1,48, cuando un conjunto de datos obtenido realizando una PCR en tiempo real para la detección de un analito diana se calibra en condiciones en las que (a) el 5° ciclo se designa como un ciclo de referencia; (b) el valor de 9000 se designa como un valor de referencia; (c) el valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia es el valor de 13.285 y (d) la relación entre el valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos y el valor de referencia es una razón del valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos con respecto al valor de referencia. Puede proporcionarse un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización (1,48) a los valores de señal de la pluralidad de puntos de datos.

Según una realización, el coeficiente de normalización puede proporcionarse definiendo una razón de un valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos al valor de referencia. El coeficiente de normalización puede calcularse mediante la siguiente ecuación matemática:

[Coeficiente de normalización = a x un valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia / valor de referencia)].

El a puede ser un número real excepto 0 (cero), preferiblemente, puede ser el número 1. El a es una constante para ajustar adecuadamente un coeficiente de normalización cuando el valor de referencia se determina dependiendo de otros factores. Un nivel de señal de una reacción puede ser controlable a través de la calibración de valores de señal de un conjunto de datos ajustando el valor de referencia o el valor de a, controlando de ese modo una cantidad de una mezcla de reacción usada para el proceso de generación de señal.

Todos los puntos de datos de un conjunto de datos pueden calibrarse usando un coeficiente de normalización idéntico según una ecuación matemática idéntica. Alternativamente, todos o una parte de los puntos de datos de un conjunto de datos pueden calibrarse usando diferentes coeficientes de normalización respectivamente o usando un coeficiente de normalización idéntico según diferentes ecuaciones matemáticas.

Etapa (b): Proporcionar un conjunto de datos calibrados aplicando un coeficiente de normalización (S120)

Puede proporcionarse un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos. Particularmente, puede proporcionarse un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal de la pluralidad de puntos de datos.

El coeficiente de normalización puede aplicarse a los valores de señal del conjunto de datos mediante diversos enfoques.

Cuando el coeficiente de normalización se proporciona por la razón del valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia del conjunto de datos al valor de referencia, puede proporcionarse un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados.

Según una realización, el valor de señal calibrado se obtiene utilizando la siguiente ecuación matemática 1:

Ecuación 1

Valor de señal calibrado = valor de señal / coeficiente de normalización

El valor de señal de la ecuación 1 es el valor de señal no calibrado. El valor de señal no calibrado se refiere a un valor de señal de un conjunto de datos antes de que el conjunto de datos se calibre por el coeficiente de normalización. Por lo tanto, el valor de señal no calibrado puede ser un valor de señal medido o un valor de señal procesado del valor de señal medido. El proceso puede ser un proceso realizado independientemente de un proceso de calibración usando el coeficiente de normalización. Por ejemplo, el procesamiento de valor de señal puede realizarse sumando o restando una cantidad determinada de valor a o del valor de señal. Particularmente, el proceso puede ser eliminar una señal de blanco de instrumento en su totalidad o en parte del valor de señal medido.

El valor de señal calibrado se refiere a un valor de señal calibrado por el coeficiente de normalización. El conjunto de datos calibrados puede proporcionarse usando el valor de señal calibrado para el valor de señal del conjunto de datos sin calibración adicional.

Alternativamente, el conjunto de datos calibrados puede proporcionarse usando el valor de señal calibrado para el valor de señal del conjunto de datos con modificación adicional. Por ejemplo, el valor de señal calibrado por el coeficiente de normalización puede calibrarse adicionalmente sumando o restando una cantidad determinada de valor a o del valor de señal calibrado. Particularmente, el valor de señal calibrado por el coeficiente de normalización puede calibrarse adicionalmente restando el valor de señal de línea de referencia.

Según una realización, el conjunto de datos calibrados se usa para la detección cualitativa o cuantitativa del analito diana en la muestra.

Según una realización, el conjunto de datos de la presente invención puede obtenerse a partir de un proceso de generación de señal para el analito diana usando un medio de generación de señal sin un colorante de referencia, que es una de las características de la realización de la presente invención. Según una tecnología convencional, un colorante de referencia se contiene en una mezcla de reacción para calibración (véase el documento WO2012/083235). Esta técnica anterior puede tener algunas limitaciones o deficiencias.

La introducción del colorante de referencia en una mezcla de reacción puede aumentar la posibilidad de un fenómeno de interferencia entre el colorante de referencia y otros colorantes usados para determinar la presencia de analito diana. Por el contrario, la presente invención puede calibrar un conjunto de datos sin introducir el colorante de referencia en una mezcla de reacción que comprende medios de generación de señal.

En el método de la presente invención, el conjunto de datos es capaz de calibrarse usando el valor de señal de un analito diana sin introducir el colorante de referencia en una mezcla de reacción que comprende medios de generación de señal, por lo que es posible calibrar el conjunto de datos de manera más precisa y efectiva que el método convencional usando el colorante de referencia junto con medios de generación de señal y superar diversos problemas asociados con variaciones en resultados analíticos.

En el ejemplo descrito a continuación, se calcularon y compararon los CV (coeficiente de variación) de las variaciones inter- e intrainstrumento de dos grupos de conjuntos de datos. Los conjuntos de datos del grupo 1 se obtuvieron calibrando conjuntos de datos sin procesar según el método de la presente invención en el que los conjuntos de datos sin procesar se obtuvieron mediante una PCR en tiempo real usando tres instrumentos sin un ajuste de hardware. Los conjuntos de datos del grupo 2 se obtuvieron mediante la misma PCR en tiempo real usando tres instrumentos con un ajuste de hardware.

Además, se calcularon y compararon los CV de las variaciones inter- e intrainstrumento de dos grupos de conjuntos de datos de fusión. Los conjuntos de datos de fusión del grupo 1 se obtuvieron calibrando conjuntos de datos de fusión sin procesar según el método de la presente invención en el que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron realizando un análisis de fusión usando productos de una PCR en tiempo real usando tres instrumentos sin un ajuste de hardware. Los conjuntos de datos de fusión del grupo 2 se obtuvieron realizando un análisis de fusión usando productos de una PCR en tiempo real usando tres instrumentos con un ajuste de hardware.

Como resultado, se verificó que los CV (coeficiente de variación) de las variaciones inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos o los conjuntos de datos de fusión del grupo 1 son mucho más pequeños que los de los conjuntos de datos o los conjuntos de datos de fusión del grupo 2. Como tal, se entenderá que el método de la presente invención puede ser una solución alternativa de un ajuste de hardware no solo para un conjunto de datos de amplificación sino también para un conjunto de datos de fusión.

Mientras tanto, según el método de la presente invención, un nivel de valores de señal de un conjunto de datos puede controlarse modulando el valor de referencia. Como resultado, un conjunto de datos normalizados con significación estadística y puede obtenerse incluso cuando se usa una pequeña cantidad de medios de generación de señal (por ejemplo, cebadores y sondas), determinando finalmente la presencia o ausencia de un analito diana en una muestra.

Según una realización, el valor de referencia puede seleccionarse para que sea más alto que un valor de señal máximo de una línea de referencia del conjunto de datos; en el que el proceso de generación de señal puede ser una pluralidad de procesos de generación de señal para el analito diana del mismo tipo realizado en diferentes entornos de reacción; en el que el conjunto de datos es una pluralidad de conjuntos de datos; en el que la pluralidad de conjuntos de datos se calibra usando un ciclo de referencia idéntico y un valor de referencia idéntico.

El valor de referencia puede seleccionarse para que sea más alto que un valor de señal máximo de una línea de referencia del conjunto de datos de tal manera que pueda llegar a ser la razón del valor de referencia con respecto a un valor de señal máximo de una línea de referencia del conjunto de datos, no limitado a, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, I , 7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 y 500.

Curiosamente, hemos encontrado que la presente invención puede minimizar una variación de señal de una pluralidad de conjuntos de datos junto con el aumento del nivel de valores de señal de una pluralidad de conjuntos de datos a un nivel deseable.

En el ejemplo descrito a continuación, se compararon dos grupos de conjuntos de datos. Los conjuntos de datos del grupo 1 se obtuvieron usando diversas concentraciones de medios de generación de señal de modo que los conjuntos de datos del grupo 1 comprenden conjuntos de datos que tienen diversos niveles de valores de señal. Los conjuntos de datos del grupo 2 se obtuvieron de tal manera que se obtuvo un conjunto de datos sin procesar usando baja concentración de medios de generación de señal, seguido de la calibración del conjunto de datos sin procesar usando una pluralidad de valores de referencia ajustados para calibrar el nivel de valores de señal del conjunto de datos sin procesar para alcanzar los diversos niveles de valores de señal de conjuntos de datos del grupo 1. Como resultado, se verificó que los conjuntos de datos de los grupos 1 y 2 exhibieron patrones similares de una curva de amplificación y valores de Ct similares.

Además, se verificó que el CV del conjunto de datos sin procesar calibrados obtenido usando baja concentración de medios de generación de señal era sustancialmente idéntico al de los datos sin procesar precalibrados.

II. Medio de almacenamiento, d ispositivo y programa informático

En otro aspecto de esta invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, comprendiendo el método:

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada dato.

En otro aspecto de esta invención, se proporciona un programa informático para almacenarse en un medio de almacenamiento legible por ordenador para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, comprendiendo el método:

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos.

Las instrucciones de programa son operativas, cuando se realizan por el procesador, para hacer que el procesador realice el presente método descrito anteriormente. Las instrucciones de programa para realizar el método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra pueden comprender una instrucción para proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; y una instrucción para proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos.

El presente método descrito anteriormente se implementa en un procesador, tal como un procesador en un ordenador independiente, un ordenador conectado a la red o un dispositivo de adquisición de datos tal como una máquina de PCR en tiempo real.

Los tipos de medio de almacenamiento legible por ordenador incluyen diversos medios de almacenamiento tales como CD-R, CD-ROM, DVD, memoria flash, disco flexible, disco duro, HDD portátil, USB, cinta magnética, MINIDISC, tarjeta de memoria no volátil, EEPROM, disco óptico, medio de almacenamiento óptico, RAM, ROM, memoria de sistema y servidor web.

El conjunto de datos puede recibirse a través de varios mecanismos. Por ejemplo, el conjunto de datos puede adquirirse por un procesador residente en un dispositivo de adquisición de datos de PCR. El conjunto de datos puede proporcionarse al procesador en tiempo real a medida que se recopila el conjunto de datos, o puede almacenarse en una unidad de memoria o memoria intermedia y proporcionarse al procesador después de que se haya completado el experimento. De manera similar, el conjunto de datos puede proporcionarse a un sistema independiente tal como un sistema informático de escritorio a través de una conexión de red (por ejemplo, LAN, VPN, intranet e Internet) o conexión directa (por ejemplo, USB u otra conexión directa por cable o inalámbrica) al dispositivo de adquisición, o proporcionarse en un medio portátil tal como un CD, DVD, disco flexible, HDD portátil o similar a un sistema informático autónomo. De manera similar, el conjunto de datos puede proporcionarse a un sistema servidor a través de una conexión de red (por ejemplo, LAN, VPN, intranet, Internet y red de comunicación inalámbrica) a un cliente tal como un ordenador portátil o un sistema informático de escritorio.

Las instrucciones para configurar el procesador para realizar la presente invención pueden incluirse en un sistema lógico. Las instrucciones pueden descargarse y almacenarse en un módulo de memoria (por ejemplo, disco duro u otra memoria tal como una RAM o ROM local o conectada), aunque las instrucciones pueden proporcionarse en cualquier medio de almacenamiento de software tal como un HDD portátil, USB, disco flexible, CD y DVD. Un código informático para implementar la presente invención puede implementarse en una variedad de lenguajes de codificación tales como C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl y XML. Además, puede usarse una variedad de idiomas y protocolos en almacenamiento externo e interno y transmisión de datos y comandos según la presente invención.

En otro aspecto adicional de esta invención, se proporciona un dispositivo para calibrar el conjunto de datos de un analito diana en una muestra, que comprende (a) un procesador informático y (b) el medio de almacenamiento legible por ordenador descrito anteriormente acoplado al procesador informático.

Según una realización, el dispositivo comprende además un recipiente de reacción para albergar la muestra y los medios de generación de señal, un medio de control de temperatura para controlar las temperaturas del recipiente de reacción y/o un detector para detectar señales en ciclos de amplificación.

Según una realización, el procesador informático permite no solo recibir valores de señales en ciclos, sino también analizar una muestra o conjunto de datos u obtener un conjunto de datos calibrados de un analito diana en una muestra. El procesador puede prepararse de tal manera que un único procesador pueda realizar todas las funciones descritas anteriormente. Alternativamente, la unidad de procesador puede prepararse de tal manera que múltiples procesadores hagan múltiples rendimientos, respectivamente.

Según una realización, el procesador puede realizarse instalando software en dispositivos convencionales para la detección de moléculas de ácido nucleico diana (por ejemplo, dispositivo de PCR en tiempo real).

Según una realización, se proporciona un conjunto de datos calibrados de tal manera que se obtiene el conjunto de datos de un analito diana y el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia determinado arbitrariamente, un ciclo de referencia y el conjunto de datos, seguido de la obtención de valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos.

Un valor de referencia y un ciclo de referencia pueden determinarse arbitrariamente por usuarios o proveedores de sistemas. Alternativamente, un valor de referencia y un ciclo de referencia pueden determinarse por un dispositivo de la presente invención. Por ejemplo, el dispositivo de la presente invención que recopila una pluralidad de conjuntos de datos puede ser capaz de determinar un ciclo de referencia a partir de ciclos en una región de fondo con respecto a valores de señal de la pluralidad acumulada de conjuntos de datos. Además, el dispositivo de la presente invención puede ser capaz de determinar un valor de referencia dentro del promedio ± desviación estándar (SD) de los valores de señal en los ciclos de la pluralidad de conjuntos de datos correspondientes al ciclo de referencia con respecto a los valores de señal de la pluralidad acumulada de conjuntos de datos. Además, el dispositivo de la presente invención puede ser capaz de determinar un valor de referencia con respecto a una razón de un conjunto de datos estándar con respecto a un conjunto de datos estándar de referencia y un valor de señal del ciclo de referencia del conjunto de datos estándar.

Las características y ventajas de esta invención se resumirán de la siguiente manera:

(a) Según la presente invención, un conjunto de datos se calibra convenientemente aplicando un coeficiente de normalización al conjunto de datos que va a calibrarse de tal manera que las variaciones de señal inter- e intrainstrumento de los conjuntos de datos se reducen eficazmente. Particularmente, no solo las variaciones de señal interinstrumento sino también las variaciones de señal intrainstrumento entre procesos de generación de señal provocados por la realización de procesos de generación de señal en diferentes posiciones (por ejemplo, diferentes recipientes de reacción o diferentes pocillos) dentro de un instrumento se reducen, por lo tanto, el conjunto de datos puede analizarse con una alta precisión y de manera reproductiva.

(b) La presente invención no necesita un colorante de referencia. De manera más interesante, el presente método puede calibrar un conjunto de datos de manera más precisa y más económica que los métodos de calibración de señal convencionales usando un colorante de referencia. Para reducir la variación interinstrumento, los métodos de calibración convencionales que usan el colorante de referencia demandan que la variación interinstrumento de un canal óptico para detectar el colorante de referencia y la variación interinstrumento de un canal óptico para detectar un analito diana tengan que ser iguales. Por lo tanto, los métodos de calibración convencionales pueden no resolver con éxito los problemas asociados con la variación interinstrumento usando solo el colorante de referencia y, por lo tanto, necesitan una calibración adicional a través de un ajuste de hardware. Además, para reducir la variación de la señal intrainstrumento, los métodos convencionales requieren que las condiciones (por ejemplo, cantidad o calidad de un colorante de referencia) para usar un colorante de referencia en mezclas de reacción tienen que ser las mismas en todas las mezclas de reacción, lo que también puede considerarse como una deficiencia de los métodos convencionales.

(c) Según la presente invención, un conjunto de datos puede calibrarse sin introducir el colorante de referencia en una mezcla de reacción de modo que no sea necesaria una asignación de banda de longitud de onda para la calibración. Por lo tanto, no hay interferencia de fluorescencia provocada por el colorante de referencia, lo que es una gran ventaja especialmente en la PCR en tiempo real multiplexada alta.

(d) El método de calibración de la presente invención puede configurarse en software de modo que el método de la presente invención sea capaz de aplicarse universalmente a diversos instrumentos analíticos (por ejemplo, instrumentos de PCR en tiempo real) independientemente de los fabricantes. Por lo tanto, el método de la presente invención es mucho más conveniente y versátil que los métodos de calibración de hardware convencionales.

(e) La variación de la señal es un problema grave en la detección de virus de ARN usando cebadores y/o sondas deteriorados. La variación de señal entre conjuntos de datos puede reducirse drásticamente a través de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención puede ser una solución excelente para la variación de señal provocada por el uso de cebadores y/o sondas deteriorados para detectar virus de ARN.

(f) Según la presente invención, el nivel de valores de señal de un conjunto de datos puede controlarse ajustando el valor de referencia. Como resultado, puede obtenerse un conjunto de datos normalizados con significación estadística incluso cuando se usan cantidades más pequeñas de medios de generación de señal (por ejemplo, dNTP o sondas y cebadores enzimáticos).

La presente invención se describirá ahora con más detalle mediante ejemplos. Sería obvio para los expertos en la técnica que estos ejemplos pretenden ser más concretamente ilustrativos y el alcance de la presente invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas no está limitado a o por los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Calibración de conjunto de datos mediante el uso de normalización basada en señal de fondo específica (SBN) y análisis de conjunto de datos calibrado

El método de control de la intensidad de la señal de entrada o salida en hardware se usa ampliamente para minimizar las variaciones de la señal intrainstrumento en una PCR en tiempo real. Por ejemplo, la intensidad de salida de la fuente de luz (por ejemplo, LED y lámpara halógena) o la intensidad de entrada de la señal se controla en el filtro de un detector para la calibración de señales.

En los ejemplos, el método de normalización basada en señal de fondo específica (SBN) de la presente invención se usó para calibrar variaciones en las señales amplificadas de conjuntos de datos.

Se compararon y analizaron las variaciones de señal en los siguientes tres grupos de conjuntos de datos: (i) un grupo de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware; (ii) un grupo de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware; y (iii) un grupo de conjuntos de datos calibrados a nivel de software por la SBN.

<1-1> Preparación de conjunto de datos

Se realizó una PCR en tiempo real para una molécula de ácido nucleico diana usando una sonda TaqMan como medios de generación de señal con 50 ciclos de amplificación en tres sistemas de detección de PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad) enumerados en la tabla 1. La molécula de ácido nucleico diana era un ADN genómico de Ureaplasma urealyticum. El marcador dual interactivo se proporcionó por la sonda TaqMan marcada con una molécula indicadora (FAM) y una molécula inactivadora (BHQ-1).

La reacción se realizó en el tubo que contenía una molécula de ácido nucleico diana, un cebador en dirección 3', un cebador en dirección 5', sonda TaqMan, y mezcla maestra que contiene MgCh, dNTP y ADN polimerasa Taq. El tubo que contenía la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 15 min a 95°C y se sometió a 50 ciclos de 10 s a 95°C, 60 s a 60°C, 10 s a 72°C. La detección de la señal se realizó a 60°C de cada ciclo.

Las 96 reacciones en los respectivos 96 pocillos se llevaron a cabo en la misma condición en los respectivos instrumentos usando las muestras que contenían el mismo ácido nucleico diana de la misma concentración. Al analizar los conjuntos de datos obtenidos de las reacciones anteriores, se analizaron el nivel de una variación de señal interinstrumento o intrainstrumento y el nivel de reducción en las variaciones de señal por el método SBN.

Se preparó un total de seis grupos de conjuntos de datos sin procesar, incluyendo tres grupos de conjuntos de datos obtenidos de las reacciones en el instrumento sin un ajuste de hardware y los otros tres grupos de conjuntos de datos obtenidos de las reacciones en el instrumento con un ajuste de hardware. Cada grupo incluye 96 conjuntos de datos obtenidos de las reacciones de 96 pocillos.

Los conjuntos de datos con resta de línea de referencia se obtuvieron de los conjuntos de datos sin procesar. Los conjuntos de datos con resta de línea de referencia se prepararon de la siguiente manera. La línea de referencia se estableció desde el tercer ciclo hasta el ciclo justo antes de que se produjera la amplificación de la señal y luego se calculó una ecuación de regresión en línea recta para los ciclos en la región de línea de referencia establecida. Los conjuntos de datos con resta de línea de referencia se prepararon restando los valores de la señal calculados con la ecuación de regresión en línea recta en el ciclo correspondiente de los valores de la señal medidos en los ciclos respectivos.

Tabla 1

<1-2> Análisis de conjunto de datos obtenido de instrumento sin ajuste de hardware

Se usaron los conjuntos de datos sin procesar y sus conjuntos de datos con resta de línea de referencia obtenidos en el ejemplo <1-1>. Las variaciones de señal se analizaron en tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos de los instrumentos sin un ajuste de hardware y en tres grupos de conjuntos de datos con resta de línea de referencia.

Para comparar las intensidades de señal de fondo de tres instrumentos, se obtuvieron curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) representando gráficamente los conjuntos de datos sin procesar sin resta de línea de referencia (figura 2A).

Como se muestra en la figura 2A, se mostraron las señales de fondo de los instrumentos respectivos que son independientes entre sí, que es diferente de la expectativa teórica de que las señales de fondo que tienen las mismas intensidades se representarán gráficamente para las reacciones de amplificación en la misma condición. Además, se observó que había una diferencia clara en la intensidad de la señal de fondo entre las reacciones realizadas en los pocillos ubicados de manera diferente dentro del mismo instrumento.

Para comparar las variaciones de señal en la región de amplificación, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se prepararon representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia obtenidos de los tres instrumentos respectivos.

El último ciclo (es decir, 50° ciclo) de los conjuntos de datos con resta de línea de referencia se designó como un ciclo analítico y se calculó el coeficiente de variación (CV) de las señales de amplificación en el 50° ciclo (figura 2B).

El coeficiente de variación (CV) se define como la razón de la desviación estándar a la media aritmética para los datos.

El coeficiente de variación intrainstrumento se calculó a partir de la desviación estándar y la media aritmética de los valores de señal en un ciclo específico entre los resultados de múltiples reacciones medidas en un solo instrumento.

El coeficiente de variación interinstrumento (CV) se calculó a partir de la desviación estándar y la media aritmética de los valores de señal en un ciclo específico en los conjuntos de datos resultantes de todas las reacciones medidas en tres instrumentos usados en los experimentos.

Los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación en el último ciclo de curvas de amplificación con resta de línea de referencia se representaron en la figura 2B. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación de los instrumentos 1, 2, y 3 se analizaron como 5,2%, 9,1 %, y 4,5%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación de los instrumentos 1, 2, y 3 se analizó como 49,3 %.

<1-3> Análisis de conjunto de datos obtenido de instrumento con ajuste de hardware

Se usaron los conjuntos de datos sin procesar y sus conjuntos de datos con resta de línea de referencia obtenidos en el ejemplo <1-1>. Las variaciones de señal se analizaron en tres grupos de conjuntos de datos sin procesar obtenidos de los instrumentos con un ajuste de hardware y en tres grupos de conjuntos de datos con resta de línea de referencia.

Las curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) se analizaron según el mismo método que se describe en el ejemplo <1-2>. Como se muestra en la figura 3A, a pesar de que las variaciones de la señal de fondo interinstrumento se redujeron en comparación con los instrumentos sin un ajuste de hardware, se verificó que todavía había variaciones de señal de fondo ampliamente distribuidas entre los instrumentos y entre las reacciones.

Los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación en el último ciclo de las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se analizaron de la misma manera que se describe en el ejemplo <1-2>. Como se muestra en la figura 3B, los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación de los instrumentos 1, 2, y 3 se analizaron como 5,3%, 7,8%, y 5,5%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación de los instrumentos 1,2, y 3 se analizó como 17,7 %.

Cuando los resultados anteriores se compararon con los resultados de los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>, se demostró que el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo en 31,6 % P (puntos porcentuales) mientras que hubo una diferencia insignificante en el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación.

A partir de los resultados anteriores, puede concluirse que, aunque la calibración mediante el ajuste de hardware puede reducir parcialmente el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación de los instrumentos, todavía existe un nivel considerable de variaciones de señal entre los instrumentos y el ajuste de hardware no puede reducir el coeficiente de variación de las señales de amplificación entre los pocillos dentro de un solo instrumento.

<1-4> Análisis de conjunto de datos calibrados a nivel de software usando SBN

La normalización basada en señal de fondo específica (SBN) es un método para normalizar proporcionalmente los conjuntos de datos usando el valor de señal en un ciclo de referencia y el valor de referencia, en el que un ciclo específico en una región de señal de fondo (región de línea de referencia) de los conjuntos de datos que van a calibrarse se designa como el ciclo de referencia. Para normalizar una pluralidad de conjuntos de datos con respecto a la misma referencia, tanto el valor de referencia como el ciclo de referencia pueden aplicarse igualmente a los conjuntos de datos que van a normalizarse. En caso de que una pluralidad de conjuntos de datos se divida en varios grupos según los entornos de reacción (por ejemplo, un instrumento usado para amplificación), los valores de referencia pueden calcularse al considerar diferentes condiciones de reacción entre los grupos y cada valor de referencia calculado puede aplicarse a un grupo respectivo.

<1-4-1> Calibración de conjunto de datos usando SBN aplicada con valor de referencia común

En este ejemplo, los conjuntos de datos se calibraron aplicando un único valor de referencia común a los conjuntos de datos obtenidos de todos los instrumentos. Los conjuntos de datos sin procesar de seis grupos obtenidos en el ejemplo <1-1> se calibraron a nivel de software usando la SBN según las siguientes etapas.

Un ciclo específico en la región de fondo (región de línea de referencia) de los conjuntos de datos sin procesar se designó como un ciclo de referencia. El 5° ciclo se designa como el ciclo de referencia en este ejemplo.

Se designó un valor de referencia para la normalización con una señal de fondo específica. El valor de RFU 8.400 se designó como el valor de referencia en este ejemplo.

Se calculó un coeficiente de normalización a partir de tanto el valor de señal en el ciclo de los conjuntos de datos sin procesar correspondientes al ciclo de referencia como el valor de referencia designado en la etapa 2 anterior.

Coeficiente de normalización = Valor de señal de ciclo de referencia Valor de referencia.

Los valores de la señal en todos los ciclos se calibraron usando el coeficiente de normalización.

Valor de señal calibrado (RFU) = Valor de señal de conjunto de datos sin procesar (RFU) Coeficiente de normalización.

Los seis grupos calibrados de conjuntos de datos se obtuvieron calibrando los seis grupos de los conjuntos de datos sin procesar proporcionados en el ejemplo <1-1> según las etapas anteriores 1 a 4.

A. Análisis de los resultados de calibración de los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware se calibraron por la SBN, y se analizaron los conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 4A y 4B muestran las curvas de amplificación (figura 4A) y los coeficientes de variaciones (CV) intra- e interinstrumento (figura 4B) para los conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron calibrando los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados. La figura 4A muestra las curvas de amplificación proporcionadas representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia), en las que pueden compararse las intensidades de las señales de fondo. Como se representa en la figura 4A, la distribución de las variaciones de señal de fondo entre los instrumentos se redujo sorprendentemente por la calibración usando la SBN. En particular, todas las RFU en el 5° ciclo (es decir, el ciclo de referencia) fueron idénticos al valor de referencia designado, abordando que no hay variación en las señales de fondo.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 4B que representa las curvas con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación en el último ciclo. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 2,3%, 3,0% y 1,0%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 12,1 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la SBN, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 2, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la SBN, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 37,2 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo en 5,6 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención usando la SBN puede reducir las variaciones de señal entre los pocillos dentro de un instrumento, así como entre los instrumentos. En particular, se entenderá que la SBN tiene un efecto de calibración más excelente que los métodos de ajuste de un hardware de un instrumento, abordando que puede lograrse con éxito un efecto de calibración de señal mejor que el de un ajuste de hardware usando solo la SBN sin un ajuste de hardware de un instrumento.

Tabla 2

B. Análisis de los resultados de calibración de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la SBN, y se analizaron los conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 5A y 5B muestran las curvas de amplificación (figura 5A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 5B) para los conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron calibrando los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados. La figura 5A muestra las curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) para los conjuntos de datos calibrados, en las que pueden compararse las intensidades de señal en la región de fondo. Como se representa en la figura 5A, las variaciones de la señal de fondo interinstrumento se redujeron altamente mediante la calibración usando la SBN. En particular, todas las RFU en el 5° ciclo (es decir, el ciclo de referencia) fueron idénticas al valor de referencia designado, abordando que no hay variación en las señales de fondo.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 5B que representa las curvas con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de la señal de amplificación fueron 2,3%, 2,3% y 1,9%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 4,2 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con SBN, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 3, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la SBN, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 45,1 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 13,5 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención usando la SBN puede reducir las variaciones de señal entre los pocillos dentro de un instrumento, así como entre los instrumentos. En particular, se entenderá que los efectos de calibración adicionales en los conjuntos de datos pueden lograrse cuando la SBN normaliza aún más los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware.

Tabla 3

<1-4-2 > Calibración de conjunto de datos por SBN usando el valor de referencia específico de instrumento determinado basándose en el valor de cambio de señal total (no según la invención)

En este ejemplo, un conjunto de datos se calibró usando un valor de referencia específico de instrumento que se había determinado h considerando las variaciones interinstrumento. El valor de referencia específico de instrumento se determina usando la razón de un valor de cambio de señal total de referencia (R-TSC) y un valor de cambio de señal total (TSC) de un conjunto de datos estándar de cada instrumento.

El valor de cambio de señal total de referencia (R-TSC) puede determinarse a partir del valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento estándar o el valor de cambio de señal total de una pluralidad de conjuntos de datos. Además, el valor de cambio de señal total de referencia (R-TSC) puede determinarse por el experimentador basándose en los resultados de una pluralidad de procesos de generación de señal para el analito diana correspondiente.

El conjunto de datos estándar se refiere a un conjunto de datos obtenido a través de un proceso de generación de señal para un analito diana de concentración conocida (concentración estándar). El conjunto de datos estándar de cada instrumento se obtiene realizando un proceso de generación de señal en el instrumento usando un analito diana de concentración conocida.

El valor de cambio de señal total (TSC) significa una cantidad de cambio de señal (aumentada o disminuida) de un conjunto de datos correspondiente. El valor de cambio de señal total específico de instrumento de un conjunto de datos estándar se calcula a partir de un conjunto de datos estándar que se obtiene de cada instrumento.

Para determinar el valor de referencia específico de instrumento, se obtuvo un conjunto de datos estándar de cada instrumento usando un analito diana de concentración estándar y luego se determinó el valor de cambio de señal total (TSC) específico de instrumento del conjunto de datos estándar, después de lo cual se calculó la razón del valor de cambio de señal total específico de instrumento del conjunto de datos estándar al valor de cambio de señal total de referencia predeterminado (R-TSC). Se calibró un valor de señal en un ciclo de referencia del conjunto de datos estándar usando la razón calculada y luego se determinó el valor de señal calibrado resultante en el ciclo de referencia como el valor de referencia que se aplicará a un conjunto de datos obtenido de un instrumento correspondiente.

La variación interinstrumento se redujo adicionalmente calibrando un conjunto de datos obtenido de un instrumento correspondiente usando el valor de referencia específico de instrumento determinado.

En las etapas 1 a 3 a continuación, el valor de referencia específico de instrumento se determinó a partir del conjunto de datos estándar específico de instrumento, y en la etapa 4, cada conjunto de datos sin procesar obtenido en el ejemplo <1-1> se calibró usando el valor de referencia específico de instrumento determinado.

Se obtuvo un conjunto de datos estándar específico de instrumento realizando un proceso de generación de señal estándar usando un analito diana de concentración estándar en la misma condición de reacción que la de los procesos prácticos de generación de señal realizados para obtener conjuntos de datos de una muestra experimental real. Se obtuvieron un valor de señal y un valor de cambio de señal total para determinar un valor de referencia del conjunto de datos estándar.

Dado que el 5° ciclo se designó como un ciclo de referencia en el ejemplo, el valor de señal en el 5° ciclo del conjunto de datos estándar se designó como el valor de señal para su uso en la determinación del valor de referencia.

Para calcular el valor de cambio de señal total del conjunto de datos estándar, la línea de referencia se restó del conjunto de datos estándar obtenido para producir un conjunto de datos con resta de línea de referencia como se describe en el ejemplo <1-1>. El valor de cambio de señal total se calculó a partir de los conjuntos de datos con resta de línea de referencia. El RFU en el último 50° ciclo (punto final) del conjunto con datos de resta de línea de referencia se designó como el valor de cambio de señal total.

En este ejemplo, se prepararon tres conjuntos de datos estándar de cada instrumento, y se calcularon el valor de cambio de señal total y el valor de señal usados para determinar el valor de referencia. Específicamente, la media de los tres valores de cambio de señal total calculados a partir de tres conjuntos de datos estándar específicos de instrumento se designó como el valor de cambio de señal total del instrumento relevante. La media de los tres valores de señal en el ciclo de referencia calculado a partir de tres conjuntos de datos estándar específicos de instrumento se designó como el valor de señal usado para determinar el valor de referencia del instrumento relevante.

Los valores de cambio de señal total (TSC) y los valores de señal que se usarán para determinar los valores de referencia de los conjuntos de datos estándar obtenidos de los instrumentos 1, 2, y 3 sin o con un ajuste de hardware se midieron como se muestra en la tabla 4.

Tabla 4

Se designó el valor de cambio de señal total de referencia (R-TSC) usado para determinar el valor de referencia específico de instrumento junto con el valor de cambio de señal total calculado. En este ejemplo, el RFU 4560, que es similar a la media de los valores de cambio de señal total de los conjuntos de datos obtenidos de tres instrumentos con un ajuste de hardware del ejemplo <1-1, se designó como el valor de cambio de señal total de referencia (véase la figura 3B).

Los valores de referencia que van a aplicarse a los instrumentos respectivos se calcularon con la siguiente ecuación usando tres valores de (i) el valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos estándar (etapa 1), (ii) el valor de señal del ciclo de referencia de los conjuntos de datos estándar (etapa 1), y (iii) el valor de cambio de señal total de referencia (etapa 2).

Valor de referencia = Valor de señal en el ciclo de referencia del conjunto de datos estándar (Valor de cambio de señal total del conjunto de datos estándar / Valor de cambio de señal total de referencia)

Los valores de referencia que se usarán para calibrar los conjuntos de datos obtenidos de los respectivos instrumentos 1, 2, y 3 sin o con un ajuste de hardware se determinaron como se muestra en la tabla 5.

Tabla 5

Los seis grupos de conjuntos de datos sin procesar proporcionados en el ejemplo <1-1> se calibraron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo <1-4-1> usando los valores de referencia determinados en la etapa 3 anterior y dio como resultado los seis grupos calibrados de conjuntos de datos.

A. Análisis de los resultados de la calibración de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware se calibraron por la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, y se analizaron los conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 6A y 6B muestran las curvas de amplificación (figura 6A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 6B) para los conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron calibrando los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados. La figura 6A muestra las curvas de amplificación proporcionadas representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia), en las que pueden compararse las intensidades de las señales en las regiones de fondo y de amplificación. Los valores de señal en el 5° ciclo de los conjuntos de datos de los tres instrumentos se calibraron para dar RFU 9862, 8400, y 7383 (es decir, los valores de referencia específicos de instrumento), respectivamente y, por lo tanto, las señales en la región de fondo pasaron a ser similares entre sí y las señales en la región de amplificación también pasaron a ser similares entre sí.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 6B que representa la curva de amplificación con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 2,3%, 3,0% y 1,0%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de la señal de amplificación fue 3,0 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento de este ejemplo, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 6, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de la señal de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de la señal de amplificación se redujo notablemente en 46,3 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo en 14,7 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención puede reducir eficazmente tanto las variaciones de señal interinstrumento como las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento incluso ajustando los valores de referencia específicos de instrumento usando los conjuntos de datos estándar específicos de instrumento.

Tabla 6

Los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la SBN usando un valor de referencia específico de instrumento, y se analizaron los conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 7A y 7B muestran las curvas de amplificación (figura 7A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 7B) para los conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron calibrando los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos calibrados. La figura 7A muestra las curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) para los conjuntos de datos calibrados, en las que pueden compararse las intensidades de señal en las regiones de fondo y de amplificación. Los valores de señal en el 5° ciclo de los conjuntos de datos de los tres instrumentos respectivos se calibraron para dar RFU 9099, 8251, y 8316 (es decir, los valores de referencia específicos de instrumento), respectivamente y, por lo tanto, las señales en la región de fondo pasaron a ser similares entre sí y las señales en la región de amplificación también pasaron a ser similares entre sí.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia se obtuvieron restando la línea de referencia de los conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 7B que representa la curva con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia), se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variación de las señales de amplificación. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 2,3%, 2,3% y 1,9%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 2,3 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de la señal en los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos por la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento de este ejemplo, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 7, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos por la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en un 47 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 15,4 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención puede reducir eficazmente tanto las variaciones de señal interinstrumento como las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento incluso ajustando los valores de referencia específicos de instrumento usando los conjuntos de datos de referencia específicos de instrumento. En particular, se entenderá que los efectos de calibración adicionales en los conjuntos de datos pueden lograrse cuando la SBN normaliza aún más los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware.

Tabla 7

El presente método para calibrar señales de un instrumento de PCR en tiempo real usando la SBN puede usarse para reducir tanto las variaciones de señales intrainstrumento como las variaciones de señales interinstrumento con acceso fácil y de software. Además, el presente método de calibración puede aplicarse universalmente a diversos instrumentos de PCR en tiempo real porque ajusta los conjuntos de datos de una manera a nivel de software no basada en hardware. Además, el método de la invención puede calibrar adicionalmente señales que ya se han calibrado por hardware. Los instrumentos tales como los instrumentos de PCR en tiempo real se han sometido a un ajuste de hardware antes de comercializarse. Cuando se aplica a instrumentos con ajuste de hardware, el presente método puede proporcionar instrumentos calibrados con mayor precisión.

Ejemplo 2: Calibración y análisis del conjunto de datos mediante el uso de la resta de señal de blanco de instrumento y la normalización basada en señal de fondo específica (IBS-SBN)

La calibración de los conjuntos de datos usando la SBN será más precisa si un valor de señal correspondiente a una señal de blanco de instrumento se resta de los conjuntos de datos. En este ejemplo, se usó el método de resta de señal de blanco de instrumento y normalización basada en señal de fondo específica (IBS-SBN) para la calibración de las variaciones de señal amplificadas.

Se compararon y analizaron las variaciones de señal de amplificación en los siguientes tres grupos de conjuntos de datos: (i) un grupo de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware del ejemplo <1-1>; (ii) un grupo de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware del ejemplo <1-1>; y (iii) un grupo de conjuntos de datos obtenidos calibrando los conjuntos de datos del ejemplo <1-1> a nivel de software por la IBS-SBN.

<2-1> Medición de señal de blanco de instrumento

Los conjuntos de datos sin procesar generalmente incluyen tanto señales generadas por la molécula fluorescente como una señal de blanco de instrumento generada básicamente en ausencia de la molécula fluorescente. Por consiguiente, es preferible medir una señal de blanco de instrumento y restarla de conjuntos de datos sin procesar para utilizar señales generadas solo por la molécula fluorescente y así obtener resultados más precisos.

En este ejemplo, la señal medida desde un tubo vacío se usó como la señal de blanco de instrumento.

La medición de una señal de blanco de instrumento puede realizarse alrededor de la temperatura para detectar señales de una PCR en tiempo real o puede realizarse en presencia o ausencia de la repetición de un ciclo de amplificación. En este ejemplo, se realizaron 10 ciclos de amplificación en la misma condición que se describe en el ejemplo <1-1> y el valor de señal medido en el 10° ciclo se usó como la señal de blanco de instrumento. La señal de blanco de instrumento se midió respectivamente como se muestra en la tabla 9.

Tabla 9

<2-2> Obtención del 1er conjunto de datos calibrados por resta de señal de blanco de instrumento (IBS) El 1er conjunto de datos calibrados se obtuvo restando la señal de blanco de instrumento del ejemplo <2-1> de los conjuntos de datos sin procesar del ejemplo <1-1> como la siguiente ecuación:

1er conjunto de datos calibrados = conjunto de datos sin procesar - señal de blanco de Instrumento Mediante el cálculo usando la ecuación anterior, se proporcionó un total de seis grupos de 1os conjuntos de datos calibrados, incluyendo tres grupos de los 1os conjuntos de datos calibrados obtenidos usando los conjuntos de datos sin procesar de los instrumentos sin un ajuste de hardware y los otros tres grupos de los 1os conjuntos de datos calibrados obtenidos usando los conjuntos de datos sin procesar de los instrumentos con un ajuste de hardware. <2-3> Calibración de conjunto de datos por SBN y análisis de conjunto de datos calibrados

Los 2os conjuntos de datos calibrados se proporcionaron aplicando la SBN del ejemplo <1-4> a los 1os conjuntos de datos calibrados, y luego se analizaron.

<2-3-1> Calibración de conjunto de datos usando IBS-SBN aplicada con valor de referencia común

En este ejemplo, los seis grupos de los 1os conjuntos de datos calibrados obtenidos por la resta de señal de blanco de instrumento (IBS) del ejemplo <2-2> se calibraron a nivel de software usando la SBN según las siguientes etapas.

Un ciclo específico en la región de línea de referencia de los conjuntos de datos se designa como un ciclo de referencia. En este ejemplo, el 5° ciclo se designó como el ciclo de referencia.

Se designa un valor de referencia para la normalización con una señal de fondo específica. En este ejemplo, el valor de RFU 5.350 se designó como el valor de referencia.

Se calculó un coeficiente de normalización a partir de tanto el valor de señal en el ciclo correspondiente al ciclo de referencia en el 1er conjunto de datos calibrados como el valor de referencia designado en la etapa 2 anterior.

Coeficiente de normalización = Valor de señal en el ciclo de referencia -5- Valor de referencia

Los valores de señal en todos los ciclos se calibraron usando el coeficiente de normalización.

2° valor de señal calibrado (RFU) = Valor de señal de 1er conjunto de datos calibrados (RFU) Coeficiente de normalización.

Los seis grupos de los 2os conjuntos de datos calibrados se obtuvieron calibrando los seis grupos de los 1os conjuntos de datos calibrados proporcionados por el ejemplo <2-2> según las etapas 1 a 4.

El 2° conjunto de datos calibrados se obtuvo calibrando los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware con la IBS-SBN, y se analizaron los 2os conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 8A y 8B muestran las curvas de amplificación (figura 8A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 8B) para los 2os conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron restando las señales de blanco de instrumento de los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware y luego calibrando los mismos a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados. La figura 8A muestra las curvas de amplificación proporcionadas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia), en las que pueden compararse las intensidades de las señales de fondo. La distribución de las variaciones de la señal de fondo entre los instrumentos se redujo altamente por la IBS-SBN. En particular, todas las RFU en el 5° ciclo (es decir, el ciclo de referencia) fueron idénticas a los valores de referencia designados, abordando que no hay variación en las señales de fondo.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los 2os conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 8B que representa las curvas con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación en el último ciclo. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 1,1 %, 1,3% y 0,8% respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 1,3 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos por la IBS-SBN en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 10, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos se obtuvieron del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 48,0 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 16,4 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención usando la IBS-SBN puede reducir tanto las variaciones de señal interinstrumento como las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento. En particular, se entendería que la IBS-SBN tuvo efectos de calibración superiores al método de calibración del instrumento en hardware, abordando que un efecto de calibración de señal mejor que el de la calibración de hardware puede lograrse con éxito usando solo la IBS-SBN sin un ajuste de hardware del instrumento.

Tabla 10

Los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la IBS-SBN y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 9A y 9B muestran las curvas de amplificación (figura 9A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 9B) para los 2os conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron restando las señales de blanco de instrumento de los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware y luego calibrando los mismos a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados. La figura 9A muestra las curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) para los 2os conjuntos de datos calibrados, en las que pueden compararse las intensidades de señal en la región de fondo. Las variaciones de señal de fondo interinstrumento se redujeron altamente mediante el uso de la IBS-SBN (véase la figura 9A). En particular, todas las RFU en el 5° ciclo (es decir, el ciclo de referencia) fueron idénticas al valor de referencia designado, abordando que no hay variación en las señales de fondo.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los 2os conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 9B que representa las curvas con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación en el último ciclo. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 1,2%, 1,7% y 1,0%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 1,6 %.

Se compararon y analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos por la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos se obtuvieron del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 11, los conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos se obtuvieron del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: Al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 47,3 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en 16,1 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el método de calibración de señal de la invención usando la IBS-SBN puede reducir eficazmente tanto las variaciones de señal interinstrumento como las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento. En particular, se entenderá que los efectos de calibración adicionales en los conjuntos de datos pueden lograrse cuando la IBS-SBN normaliza aún más los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware.

Tabla 11

<2-3-2> Calibración de conjunto de datos por IBS-SBN usando valor de referencia específico de instrumento determinado basándose en el valor de cambio de señal total (no según la invención)

En este ejemplo, los conjuntos de datos se calibraron usando un valor de referencia específico de instrumento que se había determinado considerando las variaciones interinstrumento.

En las etapas 1-3 a continuación, los valores de referencia específicos de instrumento se determinaron a partir de los conjuntos de datos estándar específicos de instrumento, y en la etapa 4 a continuación, los 1os conjuntos de datos calibrados obtenidos en el ejemplo <2-2> se calibraron respectivamente usando los valores de referencia específicos de instrumento determinados.

Para calcular el valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos estándar, los 1os conjuntos de datos calibrados se proporcionaron a través de las mismas etapas que se describen en el ejemplo <2-2> usando los conjuntos de datos estándar obtenidos y los conjuntos de datos con resta de línea de referencia se proporcionaron restando la línea de referencia de los conjuntos de datos estándar obtenidos según los mismos métodos que se describen en el ejemplo <1-1>. Los valores de cambio de señal total se calcularon a partir de los conjuntos de datos con resta de línea de referencia. El RFU en el último 50° ciclo (punto final) del conjunto con datos de resta de línea de referencia se designó como el valor de cambio de señal total.

En este ejemplo, se obtuvieron tres conjuntos de datos estándar de cada instrumento, y se calcularon el valor de cambio de señal total y el valor de señal usado para determinar el valor de referencia. Específicamente, la media de los tres valores de cambio de señal total calculados a partir de tres conjuntos de datos estándar específicos de instrumento se designó como el valor de cambio de señal total del instrumento relevante. La media de los tres valores de señal en el ciclo de referencia calculado a partir de tres conjuntos de datos estándar específicos de instrumento se designó como el valor de señal usado para determinar el valor de referencia del instrumento relevante.

Los valores de cambio de señal total (TSC) y los valores de señal que van a usarse para determinar los valores de referencia de los conjuntos de datos estándar obtenidos de los instrumentos 1, 2, y 3 sin o con un ajuste de hardware se midieron como se muestra en la tabla 12.

Tabla 12

Se designó el valor de cambio de señal de referencia total (R-TSC) usado para determinar el valor de referencia específico de instrumento junto con el valor de cambio de señal total calculado. En este ejemplo, el RFU 4560, que es similar a la media de los valores de cambio de señal total de los conjuntos de datos obtenidos de tres instrumentos con un ajuste de hardware del ejemplo <1-1>, se designó como el valor de cambio de señal total de referencia (figura 3B).

Los valores de referencia que van a aplicarse a los instrumentos respectivos se calcularon a partir de tres valores de (i) el valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos estándar (etapa 1), (ii) el valor de señal del ciclo de referencia de los conjuntos de datos estándar (etapa 1), y (iii) el valor de cambio de señal total de referencia (etapa 2) y se muestran en la tabla 13.

Tabla 13

Los seis grupos de los 1os conjuntos de datos calibrados preparados usando la resta de señal de blanco de instrumento (IBS) en el ejemplo <2-2> se calibraron mediante el mismo método que se describe en el Ejemplo <2-3-1> usando el valor de referencia determinado en la etapa 3 anterior y dio como resultado los seis grupos de los 2os conjuntos de datos calibrados.

A. Análisis de los resultados de calibración de conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware se calibraron por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, y se analizaron los 2os conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 10A y 10B muestran las curvas de amplificación (figura 10A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 10B) para los 2os conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron restando las señales de blanco de instrumento de los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware y luego calibrando los mismos a través de las etapas 1 a 4. Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados. La figura 10A muestra las curvas de amplificación proporcionadas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia), en las que pueden compararse las intensidades de las señales en las regiones de fondo y de amplificación. Como resultado del análisis, se verificó que los valores de señal en el 5° ciclo de los conjuntos de datos de los tres instrumentos respectivos se calibraron para dar RFU 5325, 5411 y 5416 (es decir, los valores de referencia específicos de instrumento), respectivamente y, por lo tanto, las señales en la región de fondo pasaron a ser similares entre sí y las señales en la región de amplificación también pasaron a ser similares entre sí.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia se obtuvieron restando la línea de referencia de los 2os conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 10B que representa la curva de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia), se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento fueron 1,1 %, 1,3% y 0,8 %, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 1,1 %.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento de este ejemplo, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 14, los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en un 48,2 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo en un 16,6 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el presente método para calibrar los conjuntos de datos usando la IBS-SBN puede reducir de manera efectiva las variaciones de señal interinstrumento y las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento incluso ajustando los valores de referencia específicos de instrumento usando los conjuntos de datos estándar específicos de instrumento.

Al compararse con el método que usa la SBN del ejemplo <1-4>, el método de calibración que usa la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento es más efectivo para reducir las variaciones de señal entre los instrumentos y entre los pocillos dentro de un instrumento.

Tabla 14

Los conjuntos de datos obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos calibrados resultantes. Las figuras 11A y 11B muestran la amplificación de las curvas de amplificación (figura 11A) y los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento (figura 11B) para los 2os conjuntos de datos calibrados que se proporcionaron restando las señales de blanco de instrumento de los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware y luego calibrando los mismos a través de las etapas 1 a 4. Las curvas de amplificación se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos calibrados. La figura 11A muestra las curvas de amplificación sin resta de línea de referencia (curva sin resta de línea de referencia) para los 2os conjuntos de datos calibrados, en el que pueden compararse las intensidades de señal en las regiones de fondo y de amplificación. Como resultado del análisis, se verificó que los valores de señal en el 5° ciclo de los conjuntos de datos de los tres instrumentos respectivos se calibraron para dar RFU 5236, 5218 y 5332, (es decir, los valores de referencia específicos de instrumento), respectivamente y, por lo tanto, las señales en la región de fondo pasaron a ser similares entre sí y las señales en la región de amplificación también pasaron a ser similares entre sí.

Además, las curvas de amplificación con resta de línea de referencia (curva con resta de línea de referencia) se obtuvieron restando la línea de referencia de los 2os conjuntos de datos calibrados y representando gráficamente los conjuntos de datos con resta de línea de referencia, y luego se calculó el coeficiente de variación en el 50° ciclo. En la figura 11B que representa las curvas de amplificación con resta de línea de referencia, se compararon las variaciones de señal en la región de amplificación. Se analizaron los coeficientes de variaciones de las señales de amplificación. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de las señales de amplificación fueron 1,2 %, 1,7 % y 1,0% respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación fue 1,3%.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <1-2>; (ii) el coeficiente de variación de las señales en los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <1-3>; y (iii) el coeficiente de variación de las señales en los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 15, los 2os conjuntos de datos calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos con la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en el que los conjuntos de datos se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en un 48 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de las señales de amplificación se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de las señales de amplificación se redujo notablemente en un 16,4 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el presente método para calibrar los conjuntos de datos usando la IBS-SBN puede reducir de manera efectiva las variaciones de señal interinstrumento y las variaciones de señal interpocillo dentro de un instrumento incluso ajustando los valores de referencia específicos de instrumento usando el conjunto de datos estándar específico de instrumento. En particular, se entendería que los efectos de calibración adicionales en el conjunto de datos pueden lograrse cuando el conjunto de datos obtenido del instrumento con un ajuste de hardware se normalizó adicionalmente por la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento.

Al compararse con el método que usa la SBN del ejemplo <1-4> (véase la tabla 8), el método de la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento tiene efectos más excelentes que el método de la SBN usando el valor de referencia específico de instrumento en términos de efectos de calibración adicionales en el instrumento con un ajuste de hardware.

Tabla 15

El presente método para calibrar las señales de un instrumento de PCR en tiempo real usando la IBS-SBN puede usarse para reducir las variaciones de señal intra- e interinstrumento con acceso de software y fácil y tiene un efecto de calibración superior al método que usa la SBN.

Cuando se usa la SBN o IBS-SBN, el ciclo destinado a normalizarse (es decir, ciclo de referencia) puede designarse dentro de la región de generación de señal, así como la región de fondo en la que no se genera la señal indicada. Esto significa que el método de normalización en sí tiene efectos de calibración de señal y solo hay una diferencia en el nivel de calibración según el ciclo de referencia dependiendo de la posición del ciclo de referencia. Las variaciones de señal de fusión en el análisis de la curva de fusión se calibraron utilizando las características mencionadas anteriormente del presente método en el siguiente ejemplo 3.

Ejemplo 3: Calibración y análisis del conjunto de datos de fusión mediante el uso de la resta de señal de blanco de instrumento y la normalización basada en señal de fondo específica (IBS-SBN)

En los ejemplos anteriores1 y 2, los conjuntos de datos de amplificación de ácido nucleico se calibraron usando la SBN o la IBS-SBN. En el ejemplo 3, se investiga si los conjuntos de datos de fusión pueden calibrarse a nivel de software mediante el presente método.

Se compararon y se analizaron las variaciones de señal de fusión en los siguientes tres grupos de conjuntos de datos: (i) un grupo de conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware; (ii) un grupo de conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware; y (iii) un grupo de conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos calibrando los conjuntos de datos de fusión a nivel de software usando la IBS-SBN.

<3-1> Preparación de conjuntos de datos de fusión

Se realizó un análisis de fusión para una molécula de ácido nucleico diana usando un ensayo PTOCE como medios de generación de señal con 50 ciclos de una amplificación en los seis sistemas de detección por PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad) enumerados en la tabla 16. La molécula de ácido nucleico diana era un ADN de beta-globina humana. El marcador dual interactivo se proporcionó por CTO marcado con una molécula indicadora (Quasar 670) y una molécula inactivadora (BHQ-1) (CTO de marcaje dual).

La reacción se realizó en el tubo que contenía una molécula de ácido nucleico diana, un cebador en dirección 3', un cebador en dirección 5', CTO de marcaje dual, PTO y mezcla maestra que contiene MgCh, dNTPs y ADN polimerasa Taq. El tubo que contenía la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 15 min a 95°C y se sometió a 50 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. Los conjuntos de datos de fusión se obtuvieron detectando señales fluorescentes dependientes de la temperatura mientras que los productos de PCR en tiempo real se calentaron desde 55°C hasta 85°C de 0,5°C en 0,5°C.

Las 96 reacciones en los respectivos 96 pocillos se llevaron a cabo en la misma condición en los respectivos instrumentos usando las muestras que contenían el mismo ácido nucleico diana de la misma concentración. Al analizar los conjuntos de datos de fusión obtenidos de las reacciones anteriores, se analizaron el nivel de las variaciones de señal de fusión intra- e interinstrumento y el nivel de la reducción de las variaciones de señal de fusión realizadas por el presente método.

Se prepararon un total de seis grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar que consisten en el valor de fluorescencia (RFU) por temperatura usando un total de seis instrumentos de PCR que consisten en tres instrumentos sin un ajuste de hardware y los otros tres instrumentos con un ajuste de hardware. Cada grupo incluye conjuntos de 96 datos obtenidos de reacciones de 96 pocillos.

Las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se calcularon como las derivadas negativas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar. Para calcular las derivadas, el método de mínimos cuadrados se aplicó a los conjuntos de datos de fusión sin procesar según la siguiente ecuación y las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron como las derivadas negativas.

I: un número de ciclo de conjuntos de datos de los cuales van a calcularse

Xí: un número de ciclo de i-ésimo ciclo

yi: una intensidad de señal medida en i-ésimo ciclo

sí la cantidad de cambio de datos en i-ésimo ciclo

“a” y “b”: un número entero desde 0 hasta 10

n: a b 1, un número de datos usados para calcular derivadas

x: un valor medio de números de ciclo desde “ I-a” hasta “ I+b”

y: un valor medio de intensidades de señal medidas en ciclos desde “ I-a” hasta “ I+b”

En los ejemplos, “1” se usa para “a” y “b”. Para puntos de datos en los que “I-a” es menor que “1”, la “a” puede alterarse para permitir que “ I-a” pase a ser “1”. Para puntos de datos en los que “I+b” es mayor que el número de todos los puntos de datos, la “b” puede alterarse para permitir que “ I+b” sea igual al número de todos los puntos de datos. Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos de fusión sin procesar y las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se obtuvieron representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar.

Tabla 16

<3-2> Análisis de conjunto de datos de fusión obtenido de instrumento sin ajuste de hardware

Se usaron los conjuntos de datos de fusión sin procesar y sus derivadas obtenidas en el ejemplo <3-1 >. Las variaciones de señal se analizaron en tres grupos de conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos de los instrumentos sin un ajuste de hardware y en tres grupos de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar.

Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los conjuntos de datos de fusión sin procesar para identificar los patrones de señal de fusión globales de tres instrumentos (figura 12A).

Como resultado del análisis de las curvas de fusión, como se muestra en la figura 12A, las señales entre los instrumentos se dividieron entre sí, lo que es diferente de la expectativa teórica de que el mismo valor de las derivadas se representará gráficamente para reacciones de amplificación en la misma condición. Además, se observó que había una diferencia de señal entre las reacciones realizadas en los pocillos ubicados de manera diferente dentro del instrumento idéntico.

Para comparar variaciones de señal en el análisis de curva de fusión, las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se prepararon representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar que se obtuvieron de los tres instrumentos respectivos. La variación del pico de fusión es la variación de las derivadas del conjunto de datos de fusión.

El punto en el que se maximizó el valor (pendiente) del pico de fusión se designó como temperatura analítica y se calculó el coeficiente de variación del valor del pico de fusión a la temperatura analítica.

El coeficiente de variación del pico de fusión, es decir, el coeficiente de variación de la derivada del conjunto de datos de fusión es el coeficiente de variación del valor de los picos de fusión a la temperatura analítica. El método para calcular el coeficiente de variación se describe en el ejemplo <1-2>.

El coeficiente de variación del pico de fusión se representó en la figura 12B. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión se analizaron como un 4,9 %, un 5,9 % y un 7,5 %, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión se analizó como un 37,8 %.

<3-3> Análisis de conjunto de datos de fusión obtenido de instrumento con ajuste de hardware

Las variaciones de señal se analizaron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo <3-2> entre tres grupos de los conjuntos de datos de fusión sin procesar obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <3-1> y tres grupos de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar.

Las curvas de fusión se analizaron según el mismo método que se describe en el ejemplo <3-2>. Como se muestra en la figura 13A, se reveló que las variaciones de señal interinstrumento se redujeron en comparación con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware. Sin embargo, todavía había variaciones de señal ampliamente distribuidas entre los instrumentos y entre las reacciones.

El coeficiente de variación de las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se calculó según el mismo método que se describe en el ejemplo <3-2>. Como se muestra en la figura 13B, se reveló que los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión analizados como un 5,8 %, un 8,3 %, y un 7,9 %, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión se analizó como un 7,5 %.

Cuando los resultados anteriores se compararon con los resultados de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <3-2>, se demostró que el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión se redujo en un 30,3 % P (puntos porcentuales) mientras que hubo una diferencia insignificante en el coeficiente de variación intrainstrumento del pico de fusión.

A partir de los resultados anteriores, puede concluirse que, aunque la calibración inducida por el ajuste de hardware puede reducir parcialmente el coeficiente de variación interinstrumento del pico de fusión, todavía existe un nivel considerable de variaciones de señal entre los instrumentos y el ajuste del hardware no puede reducir el coeficiente de variación del pico de fusión entre los pocillos dentro de un solo instrumento.

<3-4> Análisis de software de conjunto de datos de fusión calibrado usando IBS-SBN

<3-4-1 > Medición de señal de blanco de instrumento

La señal de blanco de instrumento puede medirse según el mismo método que se describe en el ejemplo <2-1>.

Debido a que las señales se detectan a diversas temperaturas en el análisis de fusión, es posible medir señales de blanco de instrumento independientes a diversas temperaturas y aplicar cada señal de blanco de instrumento medida según las temperaturas respectivas.

En este ejemplo, la señal de blanco de instrumento se midió a la temperatura única y el valor de señal en el 10° ciclo de los conjuntos de datos se usó como la señal de blanco de instrumento, en el que los conjuntos de datos se obtuvieron realizando 10 ciclos de amplificación usando un tubo vacío en la misma condición de reacción de PCR en tiempo real como se describe en el ejemplo <2-1>. Las señales de blanco de instrumento se midieron respectivamente como en la tabla 17.

Tabla 17

<3-4-2> Preparación del 1er conjunto de datos de fusión calibrados por resta de señal de blanco de instrumento (IBS)

Los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados se obtuvieron restando la señal de blanco de instrumento en el ejemplo <3-4-1> de los conjuntos de datos de fusión sin procesar en el ejemplo <3-1> según la siguiente ecuación.

1er conjunto de datos de fusión calibrados = conjunto de datos sin procesar - señal de blanco de instrumento

Mediante el cálculo usando la ecuación anterior, se proporcionaron un total de seis grupos de los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados, que incluye tres grupos de los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos usando el conjunto de datos de fusión sin procesar obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware y los otros tres grupos de los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos usando el conjunto de datos de fusión sin procesar obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

<3-4-3 > Calibración del 1er conjunto de datos de fusión calibrado por SBN y análisis de conjunto de datos de fusión calibrado

Las señales se calibraron mediante normalización específica basada en señal de fondo (SBN) según el mismo método que se describe en <2-3>.

<3-4-3-1> Calibración del 1er conjunto de datos de fusión calibrado usando SBN aplicada con valor de referencia común

En este ejemplo, los seis grupos de 1os conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos en el ejemplo <3-4-2> se calibraron a nivel de software usando la SBN según las siguientes etapas. Se aplicó un único valor de referencia a los conjuntos de datos de fusión obtenidos de todos los instrumentos.

Para aplicar la SBN al análisis de curva de fusión en el que la unidad del ciclo es la temperatura, el punto destinado a normalizarse, en otras palabras, se designa la temperatura específica de los conjuntos de datos de fusión como la temperatura de referencia, es decir, el ciclo de referencia. En este ejemplo, los conjuntos de datos de fusión se calibraron con las temperaturas de referencia de 55°C y 85°C y los resultados se compararon entre sí.

Se designa un valor de referencia para la normalización con la señal específica. En este ejemplo, cuando la temperatura de referencia fue de 55°C, se designó el valor de referencia como RFU 4.900, y cuando la temperatura de referencia fue 85°C, se designó el valor de referencia como RFU 2.700.

Se calcula un coeficiente de normalización a partir del valor de señal correspondiente a la temperatura de referencia en los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados y el valor de referencia proporcionado en la etapa 2.

Coeficiente de normalización = Valor de señal a temperatura de referencia Valor de referencia

Los valores de señal a todas las temperaturas se calibran usando el coeficiente de normalización.

2° valor de señal calibrado RFU = Valor de señal de 1er conjunto de datos de fusión calibrado (RFU) Coeficiente de normalización.

Los seis grupos de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados se obtuvieron calibrando los seis grupos de los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados preparados a partir de <3-4-2> según las etapas 1 a 4.

A. Análisis de los resultados de calibración de conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware se calibraron por la IBS-SBN y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos.

Las figuras 14A, 14B y 14C muestran las curvas de amplificación (figura 14A) y los coeficientes de variaciones intra e interinstrumento (figura 14B y 14C) para los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se proporcionaron restando las señales de blanco de instrumento de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware y luego calibrando los mismos a través de las etapas 1 a 4.

Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. La figura 14A muestra curvas de fusión proporcionadas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados sin resta de línea de referencia, en las que pueden compararse las intensidades de las señales de fusión. Como resultado del análisis, se verificó que las variaciones de señal interinstrumentos se redujeron notablemente cuando las señales se calibraron usando la IBS-SBN a la temperatura de referencia de 55°C. En particular, todas las RFU a la temperatura de referencia de 55°C fueron idénticas al valor de referencia designado, abordando que no hay variación de señal.

Además, las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados, las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se obtuvieron representando gráficamente las derivadas de conjuntos de datos de fusión sin procesar y se calculó el coeficiente de variación a la temperatura de referencia de 55°C u 85°C.

La figura 14B muestra los picos de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se calibraron con la temperatura de referencia de 55°C. Se analizaron los coeficientes de variaciones de los picos de fusión (es decir, los coeficientes de variaciones de derivadas de los conjuntos de datos de fusión). Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión fueron de un 1,8 %, un 1,1 % y un 1,8 %, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión fue de un 1,8 %.

La figura 14C muestra el pico de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se calibraron con la temperatura de referencia de 85°C. Se analizaron los coeficientes de variaciones de los picos de fusión. Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión fueron de un 1,5 %, un 1,9 % y un 2,5%, respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión fue de un 2,3%.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <3-2>; (ii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <3-3>; y (iii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos de fusión con la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 18, los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos de fusión con la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento del pico de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) los coeficientes de variaciones interinstrumento de los picos de fusión a las temperaturas de referencia respectivas de 55°C y 85°C se redujeron notablemente en un 36,0 % P (puntos porcentuales) y un 35,5 % P (puntos porcentuales) respectivamente. Además, al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento del pico de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) los coeficientes de variaciones interinstrumento de los picos de fusión a las temperaturas de referencia respectivas de 55°C y 85°C se redujeron notablemente en un 5,7 % P (puntos porcentuales) y un 5,2 % P (puntos porcentuales) respectivamente.

Se demostrará que el presente método para calibrar los conjuntos de datos usando la IBS-SBN puede reducir de manera efectiva las variaciones inter- e intrainstrumento de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar. En particular, se entenderá que la IBS-SBN tiene efectos de calibración más excelentes que los métodos de ajuste de un hardware de un instrumento, abordando que un efecto de calibración de señal de fusión mejor que el del ajuste de hardware puede lograrse con éxito usando solo la IBS-SBN sin un ajuste de hardware de un instrumento.

Cuando se compararon los resultados según la temperatura de referencia (ciclo de referencia), se analizó que había poca diferencia en la tasa de reducción de las variaciones de la derivada de los conjuntos de datos de fusión sin procesar según la temperatura de referencia y también se analizó que el coeficiente de variación de la derivada de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se redujo independientemente de la temperatura de referencia. Por consiguiente, los experimentos en los siguientes ejemplos se realizaron a la temperatura de referencia de 55°C.

Tabla 18

B. Análisis de los resultados de calibración de conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware

Los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la iBS-SBN a través de las etapas 1 a 4 y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados.

La figura 15A muestra las curvas de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se proporcionaron restando la señal de blanco de instrumento de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware y luego calibrando los conjuntos de datos de fusión con resta a través de las etapas 1 a 4.

La figura 15B muestra los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento obtenidos de los picos de fusión de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar para los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados.

Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. La figura 15A muestra las curvas de fusión proporcionadas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados sin resta de línea de referencia, en las que las intensidades de las señales de fusión pueden compararse entre sí. Como se representa en la figura 15A, las variaciones de señal interinstrumentos se redujeron altamente mediante la calibración de señal usando la IBS-SBN a la temperatura de referencia de 55°C. En particular, todas las RFU a la temperatura de referencia de 55°C fueron idénticas al valor de referencia designado, abordando que no hay variación de señal.

Además, las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron del 2° conjunto de datos de fusión calibrados, las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se obtuvieron representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar, y se calculó el coeficiente de variación a la temperatura de referencia de 55°C.

La figura 15B representa los picos de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se calibraron con la temperatura de referencia de 55°C. El coeficiente de variación de los picos de fusión (es decir, el coeficiente de variación de una derivada del conjunto de datos de fusión). Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión fueron de un 1,6 %, un 1,5 % y un 2,3% respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento del pico de fusión fue de un 2,0%.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <3-2>; (ii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <3-3>; y (iii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos de fusión con IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 19, los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos de fusión con la IBS-SBN, en los que los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de los picos de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión a la temperatura de referencia de 55°C se redujo notablemente en un 35,8 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con el conjunto de datos de fusión obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de los picos de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión a la temperatura de referencia de 55°C se redujo notablemente en un 5,5 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el presente método de calibración de señal usando la IBS-SBN puede reducir las variaciones inter e intrainstrumento de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar. En particular, se entenderá que los efectos de calibración adicionales en los conjuntos de datos de fusión pueden lograrse cuando los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware se normalizan adicionalmente por la IBS-SBN de la presente invención.

Tabla 19

<3-4-2-2> Calibración del 1er conjunto de datos de fusión calibrado por SBN usando un valor de referencia específico de instrumento determinado basándose en el valor de cambio de señal total (no según la invención)

El valor de referencia específico de instrumento se determinó teniendo en cuenta las variaciones interinstrumentos y el conjunto de datos de fusión se calibró usando el valor de referencia específico de instrumento determinado. Los conjuntos de datos estándar se obtuvieron usando el analito diana de concentración estándar como se describe en el ejemplo <2-3-2>. Se investigó si el método que usa el valor de referencia específico de instrumento también podría aplicarse al análisis de la curva de fusión.

El conjunto de datos de fusión estándar específico de instrumento se obtuvo realizando un proceso de generación de señal estándar usando un analito diana de concentración estándar en las mismas condiciones de reacción que el proceso práctico de generación de señal realizado para obtener conjuntos de datos de fusión de una muestra experimental real en los instrumentos respectivos. Se obtuvieron un valor de señal y un valor de cambio de señal total para determinar un valor de referencia del conjunto de datos estándar.

Debido a que la temperatura de 55°C se designó como temperatura de referencia (el ciclo de referencia) en el ejemplo, el valor de señal de fusión a 55°C de los conjuntos de datos de fusión estándar se designó como el valor de señal para su uso en la determinación del valor de referencia.

Para calcular el valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos de fusión estándar, los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados se proporcionaron usando los conjuntos de datos de fusión estándar obtenidos según el mismo método que se describe en el ejemplo <3-4-2> y las derivadas de los conjuntos de datos de fusión se obtuvieron según el mismo método que se describe en el ejemplo <3-1>. El valor de cambio de señal total se calculó a partir de la derivada de los conjuntos de datos de fusión. El valor máximo de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión (es decir, el valor máximo de los picos de fusión) se designó como el valor de cambio de señal total.

En este ejemplo, se obtuvieron tres conjuntos de datos de fusión estándar de cada instrumento y se calcularon los valores de cambio de señal total de los respectivos conjuntos de datos de fusión y el valor de señal que va a usarse para determinar el valor de referencia. Específicamente, la media de los tres valores de cambio de señal total calculados a partir de tres conjuntos de datos de fusión estándar específicos de instrumento se designó como el valor de cambio de señal total del instrumento relevante. La media de los tres valores de señal en el ciclo de referencia (temperatura de referencia) calculada a partir de tres conjuntos de datos de fusión estándar específicos de instrumento se designó como el valor de señal que va a usarse para determinar el valor de referencia del instrumento relevante.

Los valores de cambio de señal total (TSC) y los valores de señal usados para determinar los valores de referencia de los conjuntos de datos de fusión estándar obtenidos de los instrumentos 1, 2 y 3 sin o con un ajuste de hardware se midieron como se muestra en la tabla 20.

Tabla 20

Se designó el valor de cambio de señal total de referencia (R-TSC) usado para determinar el valor de referencia específico de instrumento junto con el valor de cambio de señal total calculado. En este ejemplo, el valor de la pendiente 300 que es similar a la media de los valores de cambio de señal total de los conjuntos de datos obtenidos de tres instrumentos con un ajuste de hardware del ejemplo <3-1>, se designó como el valor de cambio de señal total de referencia (véase la figura 13B).

Los valores de referencia que van a aplicarse a los instrumentos respectivos se calcularon usando la siguiente ecuación a partir de los tres valores de (i) el valor de cambio de señal total de los conjuntos de datos de fusión estándar (etapa 1), (ii) el valor de señal a la temperatura de referencia (el ciclo de referencia) de los conjuntos de datos de fusión estándar (etapa 1), y (iii) el valor de cambio de señal total de referencia (etapa 2):

Valor de referencia = Valor de señal en el ciclo de referencia de conjunto de datos de fusión estándar (Valor de cambio de señal total del conjunto de datos de fusión estándar / Valor de cambio de señal total de referencia)

Al analizar los conjuntos de datos de fusión estándar obtenidos de los instrumentos respectivos, los valores de referencia que van a usarse para calibrar los conjuntos de datos obtenidos de los instrumentos 1,2 y 3 con o sin ajuste de hardware se determinaron como se muestra en la tabla 21.

Tabla 21

Los seis grupos de los 1os conjuntos de datos de fusión calibrados preparados en el ejemplo <3-4-2> se calibraron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo <3-4-3-1> usando el valor de referencia específico de instrumento determinado en la etapa anterior 3 y dio como resultado los seis grupos de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados.

Los conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento sin un ajuste de hardware se calibraron por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos calibrados obtenidos. La figura 16A muestra las curvas de fusión para los resultados de calibrar los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware a través de las etapas anteriores 1 a 4. La figura 16B muestra los coeficientes de variaciones intra- e interinstrumento obtenidos de los picos de fusión para los resultados de calibrar los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware a través de las etapas anteriores 1 a 4. Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos de fusión sin procesar usando la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware.

La figura 16A muestra las curvas de fusión obtenidas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados sin resta de línea de referencia, en las que pueden compararse las intensidades de las señales de fusión. Los valores de señal a la temperatura de referencia de 55°C de los conjuntos de datos de fusión de tres instrumentos se calibraron para dar los valores de referencia específicos de instrumento de RFU 4854, 5006 y 4943, respectivamente y, por lo tanto, las señales de fusión pasaron a ser similares entre sí.

Las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados, las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se obtuvieron representando gráficamente la derivada de los conjuntos de datos de fusión sin procesar, y el coeficiente de variación a la temperatura de referencia de 55°C se calculó a partir de las curvas de derivadas de fusión.

La figura 16B muestra los picos de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se calibraron con la temperatura de referencia de 55°C. Los coeficientes de variaciones de los picos de fusión (es decir, se analizaron los coeficientes de variaciones de derivadas de los conjuntos de datos de fusión). Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión fueron de un 1,8 %, un 1,1 % y un 1,8 % respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión fue de un 1,7 %.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <3-2>; (ii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <3-3>; y (iii) el coeficiente de variación de los picos de fusión de las derivadas de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos de fusión por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en los que los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 22, los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos de fusión por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en donde los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento sin un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento del pico de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento del pico de fusión se redujo notablemente en un 36,1 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento del pico de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de la derivada se redujo notablemente en un 5,8 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que el presente método para ajustar el valor de referencia específico de instrumento usando el conjunto de datos de fusión estándar específico de instrumento puede reducir de manera efectiva las variaciones de la señal intra- e interinstrumento de los conjuntos de datos de fusión en los que la temperatura corresponde al ciclo, abordando que un efecto de calibración de señal de fusión mejor que el de la calibración de hardware puede lograrse con éxito usando solo la IBS-SBN con el valor de referencia determinado por el valor de cambio total de señal sin un ajuste de hardware del instrumento.

Tabla 22

Los conjuntos de datos de fusión obtenidos de un instrumento con un ajuste de hardware se calibraron adicionalmente por la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento y dieron como resultado los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados. Se analizaron los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados obtenidos. La figura 17A muestra las curvas de fusión para los resultados de calibrar los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware a través de las etapas anteriores 1 a 4. La figura 17B muestra los coeficientes de variaciones intra e interinstrumento de los picos de fusión para los resultados de calibrar los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware a través de las etapas anteriores 1 a 4. Las curvas de fusión se obtuvieron representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos de fusión sin procesar usando la IBS-SBN con el valor de referencia específico de instrumento, en las que los conjuntos de datos de fusión sin procesar se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

La figura 17A muestra las curvas de fusión obtenidas representando gráficamente los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados sin resta de línea de referencia, en las que pueden compararse las intensidades de las señales de fusión. Los valores de señal a la temperatura de referencia de 55°C de los conjuntos de datos de fusión de los tres instrumentos respectivos se calibraron para dar los valores de referencia específicos de instrumento de RFU 4875, 4963 y 4963, respectivamente y, por lo tanto, las señales de fusión pasaron a ser similares entre sí.

Las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar se obtuvieron de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados, las curvas de derivadas de fusión (picos de fusión) se obtuvieron representando gráficamente las derivadas de los conjuntos de datos de fusión sin procesar, y el coeficiente de variación a la temperatura de referencia de 55°C se calculó a partir de los picos de derivada de fusión.

La figura 17B muestra el pico de fusión de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados que se calibraron con la temperatura de referencia de 55°C. Se analizaron los coeficientes de variaciones de los picos de fusión (es decir, los coeficientes de variaciones de la derivada de los conjuntos de datos de fusión). Los coeficientes de variaciones intrainstrumento de los picos de fusión fueron de un 1,6 %, un 1,5 % y un 2,3% respectivamente y el coeficiente de variación interinstrumento del pico de fusión fue de un 1,9 %.

Se compararon y se analizaron los siguientes tres coeficientes de variaciones: (i) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware en el ejemplo <3-2>; (ii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware en el ejemplo <3-3>; y (iii) el coeficiente de variación de los picos de fusión calculados a partir de las derivadas de los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados calibrando los conjuntos de datos de fusión por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en donde los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware.

Como se muestra en la tabla 23, los 2os conjuntos de datos de fusión calibrados proporcionados mediante la calibración de los conjuntos de datos de fusión por la IBS-SBN usando el valor de referencia específico de instrumento, en donde los conjuntos de datos de fusión se habían obtenido del instrumento con un ajuste de hardware, tienen las siguientes características: al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento sin un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de los picos de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación (CV) interinstrumento de los picos de fusión se redujo notablemente en un 35,9 % P (puntos porcentuales). Además, al compararse con los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware, (i) el coeficiente de variación intrainstrumento de los picos de fusión se redujo en más de la mitad; y (ii) el coeficiente de variación interinstrumento de los picos de fusión se redujo notablemente en un 5,6 % P (puntos porcentuales).

Se demostrará que puede lograrse un efecto de calibración más preciso cuando los conjuntos de datos de fusión obtenidos del instrumento con un ajuste de hardware se normalizan adicionalmente por la IBS-SBN usando el valor de referencia determinado por el valor de cambio total de señal.

Tabla 23

Por consiguiente, el presente método de una calibración de señal usando la IBS-SBN también es aplicable a la calibración de las señales de fusión, así como a las señales de amplificación con el mismo efecto. Debido a que el análisis de curva de fusión requiere un control preciso de la temperatura para la detección de señales, existe una mayor posibilidad de las variaciones de señal interinstrumentos en el análisis de curva de fusión en comparación con el análisis de curva de amplificación. Por lo tanto, se espera que el método de calibración de señal de la invención sea más útil en el análisis de curva de fusión.

Ejemplo 4: El control de la intensidad de señal del conjunto de datos mediante el uso de resta de señal de blanco de instrumento y la normalización basada en señal de fondo específica (IBS-SBN)

Se investigó en el ejemplo 4 si el control de intensidad de señal, así como la calibración de señal, pueden realizarse en los conjuntos de datos mediante el uso de la resta de señal de blanco de instrumento y la normalización basada de señal de fondo específica (IBS-SBN) y si la concentración de materiales usados como medios de generación de señal (por ejemplo, sonda TaqMan) puede disminuirse mediante el control de la intensidad de señal de los conjuntos de datos.

En primer lugar, los conjuntos de datos se obtuvieron a través de una PCR en tiempo real en cuanto a la molécula de ácido nucleico diana usando una baja concentración de una sonda TaqMan y luego los 2os conjuntos de datos calibrados se obtuvieron calibrando los mismos usando la IBS-SBN aplicada con los diversos valores de referencia. Los 2os conjuntos de datos calibrados se analizaron comparándolos con los conjuntos de datos que se habían obtenido a través de una PCR en tiempo real en cuanto a la molécula de ácido nucleico diana usando diversas concentraciones prácticas de sondas TaqMan.

Además, también se investigó si el cambio de las variaciones de señal entre los instrumentos en los conjuntos de datos se generó cuando los conjuntos de datos se calibraron usando la IBS-SBN aplicada con diversos valores de referencia.

<4-1> Comparación de los conjuntos de datos calibrados usando la IBS-SBN con los conjuntos de datos específicos de concentración

Se realizó una PCR en tiempo real para la molécula de ácido nucleico diana usando una sonda TaqMan como medios de generación de señal con 50 ciclos de una amplificación en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad).

Se obtuvieron cuatro conjuntos de datos sin procesar usando un solo instrumento con diversas concentraciones de sonda TaqMan de 1 pmol, 2 pmoles, 3 pmoles, y 5 pmoles por reacción.

Los conjuntos de datos con resta de línea de referencia específicos de concentración (Grupo A) se calcularon a partir de los conjuntos de datos sin procesar a través del mismo método que se describe en el ejemplo <1-1>.

Los tres 2os conjuntos de datos calibrados se proporcionaron calibrando los conjuntos de datos obtenidos usando 1 pmol de una sonda TaqMan según el método descrito en el ejemplo 2, en el que tres 2os conjuntos de datos calibrados tienen valores de señal similares a los de los respectivos conjuntos de datos obtenidos usando 2 pmoles, 3 pmoles y 5 pmoles.

Específicamente, la señal de blanco de instrumento usada se midió por el mismo método que se describe en el ejemplo <2-1>. La señal de blanco de instrumento se midió como RFU 3466. El 1er conjunto de datos calibrados se obtuvo restando la señal de blanco de instrumento de RFU 3466 del conjunto de datos obtenido usando 1 pmol de una sonda TaqMan.

Los tres 2os conjuntos de datos calibrados se proporcionaron designando el 5° ciclo de los 1os conjuntos de datos calibrados como el ciclo de referencia y también designando RFU 2.700, 4.100 y 5.900 como valores de referencia, respectivamente, de modo que se detectaron las intensidades de señal similares con respecto a las de los conjuntos de datos específicos de concentración de sonda TaqMan. Los conjuntos de datos con resta de línea de referencia (Grupo B) se calcularon a partir de los 2os conjuntos de datos calibrados según el método descrito en el ejemplo <1 1>.

Los conjuntos de datos de los grupos A y B se compararon y se analizaron representando gráficamente los mismos.

En primer lugar, se compararon los valores de señal de los grupos A y B en el último ciclo (es decir, 50° ciclo) para comparar las intensidades de señal de los conjuntos de datos.

Como resultado, como se muestra en la figura 18, el patrón del aumento en la intensidad de señal de los conjuntos de datos del grupo A inducido por el aumento de la concentración de sonda TaqMan es similar al patrón del aumento en la intensidad de señal de los conjuntos de datos del grupo B inducido por el cambio del valor de referencia usando la IBS-SBN.

En segundo lugar, se analizaron los valores de Ct (ciclo umbral) de los respectivos conjuntos de datos de los grupos A y B para comparar la diferencia en el tiempo para detectar el objetivo entre los conjuntos de datos en los grupos A y B. El valor de Ct se estableció como el valor de ciclo correspondiente al valor umbral de RFU 500.

Como se muestra en la figura 18, los valores de Ct de los conjuntos de datos específicos de concentración de sonda TaqMan del grupo A son similares a los valores de Ct de los conjuntos de datos específicos de valor de referencia del grupo B.

Como se demuestra en lo anterior, la intensidad de señal de los conjuntos de datos puede controlarse a discreción mediante el cambio de valor de referencia, lo que demuestra el hecho de que la intensidad de señal de los conjuntos de datos puede ajustarse a nivel de software sin el ajuste de hardware del instrumento o sin aumentar la concentración de los materiales de generación de señal (por ejemplo, sonda TaqMan).

Se investigó en el ejemplo <4-2>, a continuación, si hay una diferencia en el efecto de calibración en las variaciones de señal cuando la intensidad de señal se controla mediante el cambio de valor de referencia usando la IBS-SBN.

<4-2> Confirmación de coeficiente de variación de conjuntos de datos calibrados según el control de intensidad de señal por IBS-SBN

Se investigó si un cambio en la variación de señal (es decir, coeficiente de variación) de los conjuntos de datos se indujo mediante el control de valor de referencia cuando se obtuvieron los 2os conjuntos de datos calibrados en los que sus intensidades se controlaron mediante el método de IBS-SBN.

Los 2os conjuntos de datos calibrados se obtuvieron calibrando los 1os conjuntos de datos calibrados usando la SBN con los valores de referencia de RFU 5.000, 10.000, y 15.000 según el mismo método que se describe en el ejemplo 2-3, en el que los 1os conjuntos de datos calibrados se habían obtenido de tres instrumentos sin un ajuste de hardware en el ejemplo <2-2>. Después de eso, la curva de amplificación y el coeficiente de variación se obtuvieron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo <1-2>. El 5° ciclo se designó como ciclo de referencia. Los resultados se muestran en la tabla 24.

Tabla 24

Mín.: Mínimo; Máx.: Máximo; Intervalo : Máx-Mín; DE: Desviación estándar; CV: Coeficiente de variación

Como se muestra en la tabla 24, incluso aunque la señal máxima, la señal mínima, el intervalo, el valor medio, y la desviación estándar de los instrumentos respectivos se cambiaron según el cambio del valor de referencia, los coeficientes de variaciones que corresponden a las variaciones de señal intrainstrumento e interinstrumento tenían el mismo valor independientemente del cambio del valor de referencia.

Como se demuestra en lo anterior, dado que el ajuste de software de la intensidad de señal en los conjuntos de datos puede lograrse con éxito mediante el cambio de valor de referencia usando la IBS-SBN, no hay necesidad de un ajuste de hardware en el instrumento o no hay necesidad de controlar la concentración de los materiales de generación de señal (por ejemplo, sonda TaqMan) para aumentar la intensidad de señal. Se espera que el método de la invención tenga el efecto de reducir el coste de producción de los materiales para una calibración, tiempo para una calibración, y un coste para una producción de materiales de generación de señal. El método de la invención tiene la utilidad en vista de que las variaciones de señal de los conjuntos de datos pueden calibrarse a nivel de software al mismo tiempo.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Método implementado por ordenador para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos; en el que el conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para el analito diana usando unos medios de generación de señal; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos; en el que el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; en el que el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos; en el que el valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real excepto cero; en el que el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia; en el que el proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal; en el que el coeficiente de normalización se proporciona para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos;

en el que el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se proporciona usando el ciclo de referencia idéntico y el valor de referencia idéntico; y

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el analito diana es una molécula de ácido nucleico diana.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de datos de la etapa (a) es un conjunto de datos que se elimina de una señal de blanco de instrumento.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el ciclo de referencia es un único ciclo de referencia.
5. Método según la reivindicación 1, en el que el ciclo de referencia comprende al menos dos ciclos de referencia.
6. Método según la reivindicación 1, en el que el proceso de generación de señal es un proceso que amplifica el valor de señal y el proceso de amplificación de los valores de señal es un proceso que proporciona valores de señal de una región de señal de fondo y una región de amplificación de señal; en el que el ciclo de referencia se selecciona dentro de la región de señal de fondo.
7. Método según la reivindicación 1, en el que el ciclo de referencia se selecciona de un grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos, en el que el grupo de ciclos de referencia de cada conjunto de datos se proporciona de la misma manera entre sí.
8. Método según la reivindicación 1, en el que la pluralidad de los procesos de generación de señal se realiza en instrumentos diferentes entre sí.
9. Método según la reivindicación 1, en el que el valor de referencia se determina dentro del promedio ± desviación estándar de valores de señal en ciclos de la pluralidad de conjuntos de datos correspondientes al ciclo de referencia.
10. Método según la reivindicación 1, en el que la relación entre el valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia y el valor de referencia es una diferencia entre el valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia y el valor de referencia.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la diferencia entre el valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia y el valor de referencia es una razón del valor de señal en el ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia con respecto al valor de referencia.
12. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de datos calibrados se usa para la detección cualitativa o cuantitativa del analito diana en la muestra.
13. Método según la reivindicación 1, en el que el valor de señal calibrado se obtiene usando la siguiente ecuación matemática 1:

Ecuación 1

Valor de señal calibrado = valor de señal / coeficiente de normalización

Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además la siguiente etapa antes de la etapa (a):

realizar el proceso de generación de señal para obtener un conjunto de datos del analito diana en la muestra.

Medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos; en el que el conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para el analito diana usando unos medios de generación de señal; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos; en el que el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; en el que el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos; en el que el valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real excepto cero; en el que el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia; en el que el proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal; en el que el coeficiente de normalización se proporciona para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos;

en el que el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se proporciona usando el ciclo de referencia idéntico y el valor de referencia idéntico; y

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos.

Dispositivo para analizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, que comprende (a) un procesador de ordenador y (b) el medio de almacenamiento legible por procesador de ordenador de la reivindicación 15 acoplado al procesador de ordenador.

Programa informático que va a almacenarse en un medio de almacenamiento legible por ordenador para configurar un procesador para realizar un método para calibrar un conjunto de datos de un analito diana en una muestra, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un coeficiente de normalización para calibrar el conjunto de datos; en el que el conjunto de datos se obtiene de un proceso de generación de señal para el analito diana usando unos medios de generación de señal; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de puntos de datos que comprenden ciclos del proceso de generación de señal y valores de señal en los ciclos; en el que el coeficiente de normalización se proporciona usando un valor de referencia, un ciclo de referencia y el conjunto de datos; en el que el ciclo de referencia se selecciona de los ciclos del conjunto de datos; en el que el valor de referencia es un valor determinado arbitrariamente a partir de un número real excepto cero; en el que el coeficiente de normalización se proporciona definiendo una relación entre el valor de referencia y un valor de señal en un ciclo del conjunto de datos correspondiente al ciclo de referencia; en el que el proceso de generación de señal comprende una pluralidad de procesos de generación de señal realizados en diferentes recipientes de reacción; en el que el conjunto de datos comprende una pluralidad de conjuntos de datos obtenidos de la pluralidad de procesos de generación de señal; en el que el coeficiente de normalización se proporciona para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos;

en el que el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se proporciona usando el ciclo de referencia idéntico y el valor de referencia idéntico; y

(b) proporcionar un conjunto de datos calibrados obteniendo valores de señal calibrados aplicando el coeficiente de normalización a los valores de señal del conjunto de datos; en el que cada conjunto de datos de la pluralidad de conjuntos de datos se calibra aplicando el coeficiente de normalización para cada conjunto de datos.