KR102267463B1 - 암 항원 펩티드 - Google Patents

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타카유키 오쿠리
아케미 코사카
히로야 코바야시
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코쿠리츠다이가쿠호진 아사히카와 이카다이가쿠
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Abstract

KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열; DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열; 또는 QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는 1개 내지 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드가 제공된다. 또한, 상기 펩티드에 관련된 산물, 예컨대 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 상기 펩티드 및 산물의 의약 또는 헬퍼 T 세포 활성화를 위한 조성물로서의 용도가 제공된다.

Description

암 항원 펩티드
본 출원은 일본 특허 출원 제2018-024972호의 우선권을 주장하며, 그 전문 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 신규한 암 항원 펩티드에 관한 것이다.
면역계는 정상 세포가 암화되는 경우에 발현되는 면역원성이 높은 암 항원 단백질을 인식하여, 암 세포를 배제하는 메커니즘을 가지고 있다. 최근 연구에 따르면 항-PD-1 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제의 현저한 치료 효과에 의해 입증된 바와 같이, 암 성장을 제어하는 데 면역계의 효과적인 활성화가 매우 중요하다는 사실이 밝혀진 바, 암 백신 요법에 주목이 집중되어 있다.
종래의 암 백신 요법에서 표적으로서 선택된 항원 분자의 대부분은 정상 조직에서는 드물게 또는 적당히 발현되나, "성장한" 암 조직에서만 고도로 발현되는 분자였다. 그러나, 암세포는 면역계로부터 벗어나는 다양한 면역편집 메커니즘을 가지고 있다. 정상 세포가 암화되는 경우, 면역계에 의해 쉽게 표적이 되는 분자의 발현이 감소되면서 세포가 성장하게 된다 (비특허문헌 1). 즉, "성장"된 암 조직에서 발현되는 항원은 면역계에 의해 표적이 거의 되지 않고, 따라서 암 조직은 "성장"의 과정에서 이러한 항원의 발현을 감소시킬 필요가 없음을 시사한다. 따라서 종래의 암 백신 요법로부터 선택된 표적 항원은 면역계를 활성화시키기에는 불충분한 항원일 가능성이 있다.
암세포가 그들 자신에게 불리한 항원의 발현을 감소시키는 보고된 메커니즘 중 하나는 프로모터 영역의 메틸화에 의해 면역원성 암 항원 유전자의 발현을 억제하는 것이다 (비특허문헌 2). 이는 암 조직을 형성하기 위해 면역 감시에서 탈출한 암세포가 그들의 프로모터 영역을 메틸화함으로써 그들 자신에게 불리한 면역원성 암 항원 단백질을 은폐하고 있음을 시사한다.
보다 효과적인 암 백신 요법을 확립하기 위해, 암 성장 과정 동안 암세포에 의해 하향조절되는, "암세포에 불리한" 면역원성 암 항원, 즉 스텔스 (stealth) 암 항원의 동정이 요구되고 있다.
선행기술분헌
비특허문헌
[비특허문헌 1] Schreiber RD et al. Science 2011, Mar 25;331(6024):1565-70
[비특허문헌 2] DuPage et al. Nature 2012 Feb 8;482(7385):405-9
본 개시내용의 목적은 신규 암 항원 펩티드 및 그의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 사용하여 몇몇의 스텔스 (stealth) 암 항원을 발견하였고, 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 그들의 부분 펩티드를 동정하였다.
따라서, 본 개시내용의 측면은,
KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열;
DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열; 또는
QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열
을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
1개 내지 3개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드 및 HLA 클래스 II 분자를 포함하는 HLA 멀티머를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드, 핵산, 발현 벡터, 항원 제시 세포, 또는 헬퍼 T 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 상기 펩티드, 핵산, 발현 벡터, 또는 항원 제시 세포를 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물을 제공한다.
스텔스 암 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 본원에 개시된 펩티드는, 스텔스 암 항원을 발현할 수 있는 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
도 1은 5-AZA로 처리된 암세포주 EBC1 및 Lu65의 세포에서의 SYCP3의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 2는 5-AZA로 처리된 암세포주 HT-29 및 SAS의 세포에서의 SYCP3의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 5-AZA로 처리된 암세포주 SW839, 5637, LC2/Ad, 및 EBC1의 세포에서의 SPESP1의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 5-AZA로 처리된 암세포주 HT-29, Lu65, 및 SAS의 세포에서의 SPESP1의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 5-AZA로 처리된 암세포주 WEHI-3의 세포에서의 DAZL1의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 6은 대장암(colorectal cancer) 세포주의 세포를 주사하고, 5-AZA를 투여한 면역결핍 마우스로부터 수집한 종양 조직에서의 SYCP3의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 7은 폐암 세포주의 세포를 주사하고 5-AZA를 투여한 면역결핍 마우스로부터 수집한 종양 조직에서의 SPESP1의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 8은 부분 SYCP3-A 펩티드에 대한 CD4-양성 T 세포의 반응성을 나타낸다.
도 9는 마우스에서 헬퍼 T 세포를 활성화하는 DAZL-1C 펩티드의 능력을 나타낸다.
도 10은 SYCP3-A 자극에 대한 SYCP3-A-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다. 도 11은 부분 SYCP3-A 펩티드에 대한 SYCP3-A-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다.
도 12는 부분 SYCP3-A 펩티드에 대한 SYCP3-A-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다.
도 13은 SPESP1-B 자극에 대한 SPESP1-B-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다.
도 14는 부분 DAZL1 펩티드에 대한 DAZL1-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다.
도 15는 5-AZA로 처리된 DR53-양성 암세포에 대한 SYCP3-A-특이적 Th 세포의 반응성을 나타낸다.
도 16은 5-AZA 및 SYCP3-특이적 인간 Th 세포의 조합의 종양 성장 억제 효과를 나타낸다.
도 17은 인간 SYCP3 (서열번호: 1), 인간 SPESP1 (서열번호: 2), 및 인간 DAZL1 (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 용어는 유기 화학, 의학, 제약 과학, 분자 생물학, 및 미생물학과 같은 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 읽혀진다. 본원에 사용되는 몇몇 용어는 하기 기재된 바와 같이 정의된다. 본원의 정의는 일반적인 이해보다 우선한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "스텔스 암 항원"은 암세포의 면역편집 시스템에 의해 유전자의 프로모터 영역의 메틸화를 통해 발현이 억제된 단백질을 의미한다. 스텔스 암 항원의 예는 SYCP3 (이음실 복합체 단백질(synaptonemal complex protein) 3), SPESP1 (정자 적도 분절 단백질(sperm equatorial segment protein) 1), 및 DAZL1 (무정자증-유사(azoospermia-like) 1에서 결실)을 포함한다. SYCP3는 감수분열에서 염색체 쌍형성, 재조합, 및 분리에 관여하는 이음실 복합체의 중요한 구성 요소이다. SYCP3의 돌연변이는 무정자증 및 불임증과 연관이 있다. 인간 SYCP3은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. SPESP1은 정자-난자 결합 및 융합에 관여하는 인간 동종항원이다. 인간 SPESP1은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. DAZL1은 DAZ 패밀리의 구성원이며 자웅 둘 다의 출생 전 및 출생 후 생식 세포에서 발현되는 RNA 결합 단백질이다. 인간 DAZL1은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "헬퍼 펩티드"는 암 항원 단백질로부터 유래되고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드를 의미한다.
SYCP3으로부터 유래된 헬퍼 펩티드의 예는 KILQQSRIVQ (서열번호: 3) 및 KILQQSRIVQS (서열번호: 4)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 KILQQSRIVQSQ (서열번호: 5), QKILQQSRIVQS (서열번호: 6), QQKILQQSRIVQ (서열번호: 7), 및 QQQKILQQSRIVQSQRLKT (서열번호: 8)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 5 내지 8로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나, 특별히 서열번호: 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
서열번호: 5 내지 8로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 예는 RQQQKILQQSRIVQSQRLKT (서열번호: 22), LNMFRQQQKILQQSRIVQSQRLKT (서열번호: 23), QQQKILQQSRIVQSQRLKTI (서열번호: 24), 및 QQQKILQQSRIVQSQRLKTIKQLY (서열번호: 25)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한 펩티드,및 서열번호: 22 내지 25로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다.
SYCP3로부터 유래된 헬퍼 펩티드의 추가 예는 KILQQSRVVQ (서열번호: 26) 및 KILQQSRVVQS (서열번호: 27)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 및 서열번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 KILQQSRVVQSQ (서열번호: 28), QKILQQSRVVQS (서열번호: 29), QQKILQQSRVVQ (서열번호: 30), QQQKILQQSRVVQSQRLKT (서열번호: 31), RQQQKILQQSRVVQSQRLKT (서열번호: 32), LNMFRQQQKILQQSRVVQSQRLKT (서열번호: 33), QQQKILQQSRVVQSQRLKTI (서열번호: 34), 및 QQQKILQQSRVVQSQRLKTIKQLY (서열번호: 35)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 28 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
서열번호: 3 및 4의 아미노산 서열은 본원에서 서열 (I): KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)에 의해 포괄적으로 나타낼 수 있다. 서열번호: 26 및 27의 아미노산 서열은 본원에서 서열 (I'): KILQQSRVVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)에 의해 포괄적으로 나타낼 수 있다.
SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드의 예는 QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 2의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드의 예는 DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 16의 아미노산 서열 중의 20개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 16의 아미노산 서열 중의 10개 이상 또는 20개 이상의 연속적인 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 15의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드는 서열번호: 16, DVQKIVESQINFHGKKLKLG (서열번호: 17), INFHGKKLKLGPAIRKQNLC (서열번호: 18), LGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 19), DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLC (서열번호: 20), 및 INFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 21)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 16 내지 21로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 헬퍼 펩티드는 MHC 클래스 II 분자에 대한 그의 결합을 가능하게 하는 길이, 예를 들어 10 내지 45, 10 내지 40, 10 내지 35, 10 내지 30, 또는 10 내지 25 아미노산의 길이를 갖는다. 예를 들어, 헬퍼 펩티드는 10 내지 18, 10 내지 19, 10 내지 20, 11 내지 18, 11 내지 19, 11 내지 20, 12 내지 18, 12 내지 19, 또는 12 내지 20개 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 항원 펩티드가 더 길 수 있는데, 그 이유는 상기 펩티드가 약 9개의 아미노산으로 이루어진 MHC 클래스 II 분자 결합 모티프를 가지며, 상기 모티프가 MHC 클래스 II 분자의 펩티드-결합 홈에 결합하여, 펩티드의 양쪽 말단은 홈로부터 툭 튀어나올 수 있기 때문인 것으로 생각된다. 예를 들어, 헬퍼 펩티드는 10개 내지 45개, 15개 내지 40개, 또는 20개 내지 38개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 그러나, 더 긴 펩티드는 일반적으로 펩티다제에 의해 13개 내지 17개 아미노산의 길이로 절단된다 (Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)).
헬퍼 펩티드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된다는 점에서 상기 언급된 아미노산 서열 중 어느 하나와 상이한 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 헬퍼 T 세포 활성화능이 유지되는 한, 임의의 위치에서 임의의 수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 부가될 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 펩티드는 1 내지 9개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개, 예를 들어, 1개의, 아미노산(들)이 치환, 결실 또는 부가된다는 점에서 상기 언급된 아미노산 서열 중 어느 하나와 상이한 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 헬퍼 펩티드의 본성으로 인해, 임의의 수의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 20개, 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산이 N- 또는 C- 말단에 부가될 수 있다.
치환은 임의의 아미노산 사이에서 발생할 수 있다. 보존적인 아미노산 치환이 바람직하다. 용어 "보존적인 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 특성의 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 아미노산 잔기는 측쇄를 기준으로 일부 패밀리로 분류된다. 측쇄의 예는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 및 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판), β-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 및 이소류신), 지방족 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 및 트레오닌), 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 및 트립토판), 아미드 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴 및 글루타민), 및 황-함유 측쇄 (예를 들어, 시스테인 및 메티오닌)를 포함한다. 보존적인 아미노산 치환은 바람직하게는 동일한 패밀리 내의 아미노산 잔기 사이의 치환이다. 보존적인 아미노산 치환의 예는 글루탐산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 페닐알라닌 잔기를 티로신 잔기로, 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 그리고 히스티딘 잔기를 아르기닌 잔기로 치환하는 것을 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 원하는 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 항원 펩티드에서 공통적인 서열 특징 (모티프)이 유지되도록 치환될 수 있다. 일반적으로, 항원 펩티드는 MHC 클래스 II 분자의 펩티드-결합 홈에 들어가 고정된다. 고정은 펩티드의 아미노산 잔기의 측쇄를 펩티드-결합 홈에 결합하고 펩티드의 주쇄를 모든 MHC 클래스 II 분자의 펩티드-결합 홈에서 보존되는 아미노산 잔기의 측쇄에 결합함으로써 달성된다. 원하는 MHC 클래스 II 분자의 펩티드-결합 홈에 결합하는 아미노산 잔기의 모티프는 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 펩티드에서 흔히 발견되는 아미노산 잔기의 패턴을 분석함으로써 추정할 수 있다. 펩티드-결합 홈의 크고 작은 포켓을 구성하는 아미노산 잔기 사이에서 아미노산 다형성이 관찰된다. 각각의 대립유전자로부터 유래된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대해, 각각의 아미노산 모티프를 추정할 수 있다.
한 실시양태에서, SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR, 특별히 HLA-DR53에 대한 결합을 통해 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다. 한 실시양태에서, DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR, 특별히 HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53에 대한 결합을 통해 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다. 한 실시양태에서, DAZL1로부터 유래되고 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR4, 9, 또는 53에 대한 결합을 통해 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다. 한 실시양태에서, DAZL1로부터 유래되고 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR15에 대한 결합을 통해 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다. 한 실시양태에서, DAZL1로부터 유도되고 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR8에 대한 결합을 통해 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다.
펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 임의의 공지된 방법에 의해 변형될 수 있다. 변형의 예는 아미노산 잔기의 측쇄에 있는 관능기, N-말단의 아미노산의 아미노기, 또는 C 말단의 아미노산의 카르복실 기에 에스테르화, 알킬화, 아실화 (예를 들어, 아세틸화), 할로겐화, 및 인산화를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드의 N-말단은 아세틸화된다. 또한 하나 이상의 물질, 예를 들어 아미노산, 펩티드, 및 그의 유사체를 헬퍼 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 부가하는 것이 가능하다. 예를 들어, 히스티딘 태그를 부가하거나, 티오레독신과 같은 단백질과 함께 융합 단백질이 형성될 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 표지는 헬퍼 펩티드에 결합될 수 있다. 이러한 물질이 헬퍼 펩티드에 결합되는 경우, 물질은, 예를 들어, 생물학적 효소로 또는 세포내 처리를 통해 처리되어, 헬퍼 펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 물질은 헬퍼 펩티드의 용해도를 조절하고, 프로테아제 내성과 같은 펩티드의 안정성을 개선하고, 원하는 조직 또는 기관에 헬퍼 펩티드의 특이적 전달을 가능하게 하거나, 항원 제시 세포에 의한 헬퍼 펩티드의 흡수를 증강시킬 수 있다. 이러한 물질은 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 증가시키는 물질, 예를 들어 헬퍼 T 세포를 활성화하는 다른 펩티드일 수 있다.
펩티드는 관련 기술분야에서 통상 사용되는 방법 또는 변형된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 합성 방법은, 예를 들어, 문헌 [Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976]; [Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975]; [Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985]; 및 [Development of Medicines (continuation), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991]에 기재되어 있다.
펩티드는 또한 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 정보를 기반으로 하여 유전 공학 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 유전 공학 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기법은 예를 들어 문헌에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)] 및 [DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)]).
일반적으로, 헬퍼 T 세포는, T 세포 표면의 TCR-CD3 복합체가 항원 제시 세포 표면의 MHC 클래스 II 분자로 복합체화된 항원 펩티드를 인식하고, T 세포 표면의 인테그린이 항원 제시 세포의 표면의 인테그린 리간드에 의해 자극되는 경우, 활성화된다. 본 개시내용에서, 헬퍼 T 세포의 활성화는 헬퍼 T 세포의 유도, 헬퍼 T 세포의 증식의 증강, 및 헬퍼 T 세포의 시토카인 생산의 유도를 포함한다.
헬퍼 T 세포를 활성화하는 변이체 펩티드의 능력은 펩티드를 합성하고 펩티드가 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 시험함으로써 결정할 수 있다. 이러한 시험에, 문헌 [Hassane M. Zarour et al., Cancer Research 62, 213-218, January 1, 2002]에 기재된 방법, 실시예에 기재된 방법, 또는 하기 방법을 사용할 수 있다.
수지상 세포 (부착 세포)는 인간 대상체로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하고 비-부착 세포를 제거함으로써 제조한다. 헬퍼 T 세포 (CD4-양성 T 세포)는, 예를 들어, 피콜-파크(Ficoll-Paque) 또는 자기 세포 분류를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 동일한 대상체로부터 별도로 제조한다. 수지상 세포는 후보 펩티드와 함께 배양하고, 헬퍼 T 세포와 혼합되어 배양된다. 이어서 헬퍼 T 세포는 후보 펩티드와 함께 배양된 수지상 세포와 유사한 방식으로 수회 회수되고 자극된다. 헬퍼 T 세포의 활성화 (유도)는, 예를 들어, (1) 헬퍼 T 세포의 증식 활성 또는 (2) 헬퍼 T 세포의 시토카인-생산 활성을 결정함으로써 확인할 수 있다. 증식 활성 (1)은, 예를 들어, 헬퍼 T 세포에 혼입되는 [3H]-티미딘의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 시토카인-생산 활성 (2)은, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 방법에 의해 활성화된 헬퍼 T 세포에 의해 생산된 IFN-γ와 같은 시토카인의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 헬퍼 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA와 같은 임의의 핵산 형태일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 펩티드의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 DNA의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 기반으로 쉽게 제조할 수 있다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 통상의 DNA 합성 방법 또는 PCR에 의한 증폭에 의해 제조될 수 있다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에 헬퍼 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 혼성화하고 헬퍼 T 세포를 활성화하는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "엄격한 조건 하에 혼성화"와 관련하여, 혼성화는 임의의 종래의 방법, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 엄격한 조건은 6 x SSC (10 x SSC는 1.5 M NaCl과 0.15 M 시트르산삼나트륨을 함유하는 용액이다) 및 50% 포름아미드를 함유하는 용액에서 45℃에서 혼성화를 수행한 후, 2 x SSC에서 50℃에서 세척하는 조건일 수 있다 (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6).
상기에서 제조된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입함으로써 헬퍼 펩티드를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 구축할 수 있다. 숙주 및 목적에 따라 임의의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지 벡터, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 숙주가 대장균(Escherichia coli)인 경우, 벡터의 예는 pUC118, pUC119, pBR322, 및 pCR3과 같은 플라스미드 벡터, 및 λZAPII 및 λgt11과 같은 파지 벡터를 포함한다. 숙주가 효모인 경우, 벡터의 예는 pYES2 및 pYEUra3을 포함한다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 벡터의 예는 pAcSGHisNT-A를 포함한다. 숙주가 동물 세포인 경우, 벡터의 예는 pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, 및 pRc/CMV와 같은 플라스미드 벡터, 및 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 터를 포함한다.
발현 벡터는 발현을 유도할 수 있는 프로모터, 신호 서열을 코딩하는 유전자, 선택을 위한 마커 유전자, 및 종료자와 같은 인자를 임의로 함유할 수 있다.
더욱이, 발현 벡터는 단리 및 정제를 용이하게 하도록 티오레독신, His 태그, 또는 GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제)와 같은, 모이어티와의 융합 단백질을 생성하기 위한 추가 서열을 함유할 수 있다. 이러한 벡터의 예는, 숙주세포내에서 기능하는 적절한 프로모터 (예를 들어, lac, tac, trc, trp, CMV, 또는 SV40 초기 프로모터)를 갖는 GST 융합 단백질 벡터 (예를 들어, pGEX4T), Myc 또는 His와 같은 태그 서열을 함유하는 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1/Myc-His), 및 티오레독신 및 His 태그와의 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터 (예를 들어, pET32a)를 포함한다.
발현 벡터를 함유하는 형질전환된 세포는 기재된 바와 같이 수득된 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다. 숙주의 예는 대장균, 효모, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 대장균의 예는 이. 콜라이(E. coli) K-12의 균주 예컨대 HB101, C600, JM109, DH5α, 및 AD494 (DE3)를 포함한다. 효모 종의 예는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다. 동물 세포의 예는 L929, BALB/c3T3 세포, C127 세포, CHO 세포, COS 세포, Vero 세포, 및Hela 세포를 포함한다. 곤충 세포의 예는 sf9를 포함한다.
발현 벡터는 숙주 세포에 적합한 종래의 방법, 예를 들어, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 전기천공법, 및 유전자 전달용 지질 (예를 들어, 리포펙타민, 리포펙틴; 깁코(Gibco)-BRL)을 사용하는 방법을 사용함으로써 숙주 세포에 도입할 수 있다. 도입 후, 세포는 발현 벡터를 함유하는 형질전환된 세포를 수득하기 위해 선택 마커를 포함하는 종래의 배지에서 배양될 수 있다.
헬퍼 펩티드는 형질전환된 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 제조할 수 있다. 생성된 펩티드는 표준 생화학적 정제 절차에 따라 추가로 단리 및 정제될 수 있다. 정제 절차의 예는 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함한다. 헬퍼 펩티드가 기재된 바와 같이 티오레독신, His 태그, 또는 GST와의 융합 펩티드로서 발현되는 경우, 펩티드는 융합 단백질 또는 태그의 특성을 사용하여 적절한 정제 절차에 의해 단리 및 정제될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 헬퍼 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 종래 방법에 따라 제조될 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons., Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al., ed., Cold Spring Harber Laboratory Press, New York 1989). 폴리클로날 항체는 펩티드를 항원으로서 사용하여 토끼와 같은 비인간 동물을 면역화하고, 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체를 종래 방법으로 회수함으로써 수득할 수 있다. 모노클로날 항체는 마우스와 같은 비인간 동물을 펩티드로 면역화하고, 생성된 비장 세포를 골수종 세포와 세포 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성하고, 하이브리도마 세포로부터 모노클로날 항체를 회수함으로써 수득할 수 있다. 면역학적 반응은 숙주 동물에 적합한 아주반트로 증강될 수 있다.
헬퍼 펩티드를 인식하고 그의 활성을 중화시킬 수 있는 항체는, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 면역학적 진단 방법에 사용될 수 있다. 면역학적 진단 방법은, 예를 들어, 면역블롯팅, 방사면역검정 (RIA), 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 형광 또는 발광 검정을 사용함으로써 수행할 수 있다. 이러한 면역학적 진단 방법은 DNA 메틸화 억제에 의해 SYCP3, SPESP1, 또는 DAZL1의 발현이 유도되는 암, 예를 들어, 혈액 질환(hematological disease) 예컨대 백혈병, 악성 흑색종, 유방암, 두경부 종양, 비뇨기 종양, 식도암, 간암, 폐암, 또는 결장암(colon cancer)의 진단에 효과적이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 헬퍼 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 HLA 멀티머를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 HLA 멀티머는 HLA 단량체의 멀티머를 의미하며, 이는 공지된 방법에 의해 2개 이상의 HLA 단량체를 서로 결합시켜 수득된다. HLA 단량체는 펩티드가 HLA 단백질과 회합된 복합체이다. SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR53과 복합체를 형성할 수 있다. DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53과 복합체를 형성할 수 있다. 멀티머는 멀티머에 의해 결합된 헬퍼 T 세포가 유동 세포측정법 또는 형광 현미경법과 같은 공지된 검출 수단에 의해 쉽게 선택되거나 검출될 수 있도록 형광 표지될 수 있다. HLA 멀티머는 사량체, 오량체, 또는 덴드리머, 예를 들어 비오틴화된 HLA 단량체를 아비딘 분자에 결합시켜 제조된 HLA 사량체일 수 있다. 다양한 항원 펩티드를 함유하는 HLA 사량체가 시판되고 있어, 헬퍼 펩티드를 함유하는 HLA 사량체는 유사한 방식으로 쉽게 제조할 수 있다 (Science 279: 2103-2106(1998), Science 274: 94-96 (1996)).
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR53과 복합체를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53과 복합체를 형성할 수 있다. 항원 제시 세포는 말초 혈액 단핵 세포 또는 수지상 세포와 같은 헬퍼 T 세포에 상기 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시할 수 있는 세포로부터 유래될 수 있다.
항원 제시 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기법에 의해 항원 제시 능력을 갖는 세포에 펩티드를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 펩티드는 펩티드 자체로서 직접 또는 기재된 바와 같이 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 형질전환된 세포를 통해 간접적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 항원 제시 능력을 가진 세포를 펩티드와 접촉시키거나 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 이러한 세포에 도입함으로써 첨가될 수 있다 (Cancer Immunol. Immunother. 46:82, 1998; J. Immunol., 158: p1796, 1997; Cancer Res., 59: p1184, 1999; Cancer Res., 56: p5672, 1996; J.Immunol., 161: p5607, 1998; J. Exp. Med., 184: p465, 1996). 본원에 사용된 바와 같은 항원 제시 능력을 갖는 세포는 말초 혈액 단핵 세포 및 수지상 세포를 포함하는, 세포 표면에 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포이다. 항원 제시는 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 헬퍼 T 세포의 활성을 결정함으로써 확인할 수 있다. 헬퍼 T 세포의 활성은, 예를 들어, 인터페론 -γ와 같은 시토카인의 생산에 의해 확인될 수 있다. 항원 제시 세포는 세포 요법 (예를 들어, 수지상 세포 요법)에서 활성 성분으로 사용될 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 항원 제시 세포를 제조하기 위한, 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 또는 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 항원 제시 세포를 제조하기 위한, 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 또는 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포의 용도를 제공한다.
기재된 바와 같은 항원 제시 세포는 상기 헬퍼 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포를 활성화할 수 있다. 따라서, 한 측면에서 본 개시내용은 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 또는 상기 항원 제시 세포를 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물을 제공한다.
활성화된 헬퍼 T 세포는 B 세포 및 세포독성 T 세포의 유도, 증식, 및 활성화를 증강시켜 면역계를 활성화할 수 있다. 따라서, 헬퍼 T 세포 또는 활성화된 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물은 B 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 유도, 증식 및 활성화를 증강시키거나, 이에 의해 면역계를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물은 활성 성분 이외의 성분, 예컨대 담체, 부형제, 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다. 조성물의 생체내 사용은 하기 기재된 제약 조성물의 사용에 따를 수 있다. 상기 조성물의 용법은 원하는 헬퍼 T 세포 활성화 정도 및 항원 제시 세포의 상태와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 제한 없이, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경비 투여, 또는 경구 투여로 대상체에게 투여될 수 있거나, 배양 배지에 첨가될 수 있다. 조성물의 용법, 예를 들어 조성물에 함유된 활성 성분의 양, 조성물의 유형, 또는 사용 빈도는 원하는 헬퍼 T 세포 활성화 정도 및 항원 제시 세포의 상태와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한, 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 또는 상기 항원 제시 세포를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물을 제조하기 위한, 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 또는 상기 항원 제시 세포의 용도를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 또는 상기 항원 제시 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 또는 성가 항원 제시 세포를 시험관내에서 헬퍼 T 세포에 첨가하는 것을 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 헬퍼 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포를 제공한다. SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR53과 복합체를 형성할 수 있다. DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드는, 제한 없이, HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53과 복합체를 형성할 수 있다. 헬퍼 T 세포는 관련 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 제조할 수 있다 (Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081 (1996)).
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 상기 항원 제시 세포 또는 상기 헬퍼 T 세포를 활성 성분으로서 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 암을 치료 또는 예방하기 위해 또는 이를 보조하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 암 백신이다.
제약 조성물은 DNA 메틸화 억제에 의해 SYCP3, SPESP1, 또는 DAZL1의 발현이 유도되는 암을 치료하거나 예방할 수 있다. 암은 고형 종양 또는 혈액 종양(hematologic tumor), 예를 들어, 혈액 질환 예컨대 백혈병, 악성 흑색종, 유방암, 두경부 종양, 비뇨기 종양, 식도암, 간암, 폐암, 또는 결장암일 수 있다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드가 SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래되는 경우, 제약 조성물은, 제한 없이, HLA-DR53을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 헬퍼 펩티드가 DAZL1로부터 유래되는 경우, 제약 조성물은, 제한 없이, HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
제약 조성물은 담체 또는 부형제와 같은 활성 성분 이외의 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다. 조성물의 투여 방법은 질환의 종류, 대상체의 상태, 및 표적 부위와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 투여 방법은 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경비 투여, 및 경구 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약 조성물에 함유된 활성 성분의 양, 조성물의 투여 형태, 투여 빈도와 같은 투여의 세부사항은 질환의 유형, 대상체의 상태와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
제약 조성물은 적어도 1종의 추가적인 활성 성분을 함유하거나 병용될 수 있다. 추가적인 활성 성분의 예는 화학요법제, 예컨대 항대사산물, 알킬화제, 항암 항생제, 항미세관제(antimicrotubule), 백금 기반 약물, 토포이소머라제 억제제, 분자 표적 약물, 암 백신, 면역조정제, 면역 체크포인트 억제제, 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제; 및 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포의 활성화제, 증식제, 또는 유도제를 포함한다. 통상의 임상의는 그들의 기술 및 판단 내에서 추가적인 활성 성분 및 그의 치료 유효량을 결정할 수 있다. 제약 조성물은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 조혈 줄기 세포 이식, 또는 수술과 같은 다른 요법과 병행하여, 또는 그 전후에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 추가적인 활성 성분은 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제이다. DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제의 예는, 데시타빈, 구아데시타빈, 아자시티딘, 제불라린, 테트라히드로우리딘, 테트라히드로우리딘, 및 그의 유도체, 특별히 데시타빈 및 아자시티딘을 포함한, 문헌 [J. Med. Chem. 2015, 58, 2569-2583]에 개시된 약물을 포함한다.
일부 성분이 "병용"되는 경우, 모든 성분을 함유하는 투여 형태가 투여될 수 있거나, 각각의 성분을 함유하는 투여 형태의 조합, 즉 키트가 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합은 모든 성분을 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여함으로써 달성될 수 있으며, 즉, 성분이 동일한 질환을 치료하기 위해 사용되는 한, 하나 이상의 성분이 나중 시점에 투여될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 상기 항원 제시 세포, 또는 상기 헬터 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은, 예를 들어 암의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 의약으로서 사용하기 위한 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 상기 항원 제시 세포, 또는 상기 헬퍼 T 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 의약, 예를 들어 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 상기 헬퍼 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 멀티머, 이들 성분 중 어느 하나를 포함하는 세포, 상기 항원 제시 세포, 또는 상기 헬퍼 T 세포의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 스텔스 암 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하는 방법이며,
(a) 상기 대상체로부터 수득한 샘플을 헬퍼 펩티드로 자극하는 단계,
(b) 헬퍼 T 세포 또는 상기 헬퍼 T 세포에 의해 생성된 시토카인의 양을 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서 단계 (b)에서 결정된 양의 증가가 스텔스 암 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
샘플은, 말초 혈액 단핵 세포, 침습성 림프구, 종양 세포, 복수 중의 세포, 흉막삼출액 중의 세포, 뇌척수액 중의 세포, 골수 세포, 및 림프절 세포와 같은 항원 제시 세포를 함유하는 한, 임의의 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 건강한 공여자 또는 암 환자로부터 유래될 수 있다. 건강한 공여자로부터 유래된 샘플은 공여자가 실제로 암에 의해 영향을 받는지 여부, 또는 공여자가 암의 소인이 있는지 여부를 진단하는 데 사용할 수 있다. 암 환자로부터 유래된 샘플을 이용하여 스텔스 암 항원을 사용한 면역요법이 환자에게 효과적인지 여부를 진단할 수 있다. 한 실시양태에서, HLA-DR-양성 대상체, 특별히 HLA-DR53-양성 대상체에서 SYCP3 또는 SPESP1로부터 유래된 헬퍼 펩티드에 특이적인 헬퍼 T 세포의 양이, 제한 없이, 결정된다. 한 실시양태에서, HLA-DR-양성 대상체, 특별히 HLA-DR4, 8, 9, 15, 또는 53-양성 대상체에서 DAZL1로부터 유래된 헬퍼 펩티드에 특이적인 헬퍼 T 세포의 양이, 제한 없이, 결정된다. 수득된 샘플은 헬퍼 펩티드로 자극 전 및/또는 후에 배양될 수 있으며, 배양 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 헬퍼 펩티드에 의한 이들 세포의 자극은 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있으며, 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 헬퍼 T 세포 또는 헬퍼 T 세포에 의해 생성되는 시토카인의 양은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용은 하기 실시양태를 제공한다.
[1] KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다) 또는 QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[2] 항목 1에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[3] 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 서열번호: 1의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[4] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, KILQQSRIVQ (서열번호: 3), KILQQSRIVQS (서열번호: 4), KILQQSRIVQSQ (서열번호: 5), QKILQQSRIVQS (서열번호: 6), QQKILQQSRIVQ (서열번호: 7), 및 QQQKILQQSRIVQSQRLKT (서열번호: 8)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[5] 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 3 내지 8로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[6] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[7] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 6 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[8] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[9] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[10] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[11] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[12] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[13] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 12 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 내지 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[14] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 내지 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[15] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 14 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 내지 7로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[16] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[17] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 16 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[18] 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[19] 항목 1 내지 항목 3 및 항목 18 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[20] 항목 1에 있어서, QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[21] 항목 1 또는 항목 20에 있어서, 서열번호: 2의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[22] 항목 1, 항목 20, 또는 항목 21에 있어서, 서열번호: 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[23] KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다), 또는 QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열
을 포함하는, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드,
또는
1개 내지 3개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드.
[24] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
[25] 항목 24에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[26] 항목 25에 따른 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
[27] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
[28] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드 및 HLA 클래스 II 분자를 포함하는 HLA 멀티머.
[29] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포.
[30] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포.
[31] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드, 항목 24에 따른 핵산, 항목 25에 따른 발현 벡터, 항목 28에 따른 HLA 멀티머, 항목 29에 따른 항원 제시 세포, 또는 항목 30에 따른 헬퍼 T 세포를 포함하는 제약 조성물.
[32] 항목 31에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
[33] 항목 31 또는 항목 32에 있어서, 암 백신인 제약 조성물.
[34] 항목 32 또는 항목 33에 있어서, 암이 폐암 또는 결장암인 제약 조성물.
[35] 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 따른 펩티드, 항목 24에 따른 핵산, 항목 25에 따른 발현 벡터, 항목 28에 따른 HLA 멀티머, 또는 항목 29에 따른 항원 제시 세포를 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물.
예를 들어, 본 개시내용은 하기 실시양태를 추가로 제공한다.
[1] KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열;
DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열; 또는
QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열
을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
1개 내지 3개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드.
[2] 항목 1에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드.
[3] 항목 2에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다), 또는 KILQQSRVVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[4] 항목 2 또는 항목 3에 있어서, 서열번호: 5 내지 7 및 28 내지 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[5] 항목 2 또는 항목 3에 있어서, 서열번호: 3 내지 8 및 22 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[6] 항목 2에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[7] 항목 6에 있어서, 서열번호: 1의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[8] 항목 6 또는 항목 7에 있어서, 서열번호: 5 내지 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[9] 항목 6 또는 항목 7에 있어서, 서열번호: 3 내지 8 및 22 내지 25로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[10] 항목 6, 항목 7, 또는 항목 9에 있어서, 서열번호: 3 내지 8로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[11] 항목 1에 있어서, 서열번호: 16의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드.
[12] 항목 11에 있어서, 서열번호: 16의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[13] 항목 11 또는 항목 12에 있어서, 서열번호: 16의 아미노산 서열 중의 20개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, 20개 내지 38개의 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[14] 항목 11 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 15의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[15] 항목 11 내지 항목 14 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 16 내지 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
[16] 항목 11 내지 항목 15 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 16 내지 21로부터 선택된 아미노산 서열으로 이루어진 펩티드.
[17] 항목 1에 있어서,
서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는다는 점에서 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
[18] 항목 17에 있어서, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[19] 항목 17 내지 항목 18에 있어서, 서열번호: 2의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩티드.
[20] 항목 17 내지 항목 19 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호: 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
[21] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
[22] 항목 21의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[23] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드 및 HLA 클래스 II 분자를 포함하는 HLA 멀티머.
[24] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포.
[25] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포.
[26] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드, 항목 21에 따른 핵산, 항목 22에 따른 발현 벡터, 항목 23에 따른 HLA 멀티머, 항목 24에 따른 항원 제시 세포, 또는 항목 25에 따른 헬퍼 T 세포를 포함하는 제약 조성물.
[27] 항목 26에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 추가로 포함하거나 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제와 병용되는 제약 조성물.
[28] 항목 27에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제가 데시타빈, 구아데시타빈, 아자시티딘, 제불라린, 테트라히드로우리딘, 테트라히드로우리딘 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
[29] 항목 27 또는 항목 29에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제가 데시타빈 및 아자시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
[30] 항목 26 내지 항목 29 중 어느 한 항목에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
[31] 항목 26 내지 항목 30 중 어느 한 항목에 있어서, 암 백신인 제약 조성물.
[32] 항목 30 또는 항목 31에 있어서, 암이 혈액 종양, 악성 흑색종, 유방암, 두경부 종양, 비뇨기 종양, 식도암, 간암, 폐암, 또는 결장암인 제약 조성물.
[33] 항목 30 내지 항목 32 중 어느 한 항목에 있어서, 암이 폐암 또는 결장암인 제약 조성물.
[34] 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 따른 펩티드, 항목 21에 따른 핵산, 항목 22에 따른 발현 벡터, 항목 23에 따른 HLA 멀티머, 또는 항목 24에 따른 항원 제시 세포를 포함하는 헬퍼 T 세포를 활성화하기 위한 조성물.
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실시예
시험 1: 후보 유전자의 탐색
DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제 (5-아자-2'-데옥시시티딘 (데시타빈): 5-AZA)으로 처리한 후 다시 상향조절된 유전자를 하기 절차에 의해 동정하였다. 폐암 세포주 A549의 세포를 5-AZA (10 μM)로 3일 동안 처리하고 RNA를 추출하였다. 유전자 발현 수준은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정하였다. 후보 유전자를 동정하기 위한 기준은 미처리 세포에서는 발현 수준이 0에 가깝고 5-AZA 처리 세포에서는 30배 이상 증가한 것이었다. SPESP3 (미처리: 3.0, 5-AZA 처리 후: 340.9, 발현 상승률(fold-change): 112.3), SPESP1 (미처리: 1.7, 5-AZA 처리 후: 65.3, 발현 상승률: 38.8), 및 DAZL1 (미처리: 2.8, 5-AZA 처리 후: 341.3, 발현 상승률: 123.6)을 포함한, 일부 후보 유전자를 밝혀냈다.
시험 2: 5-AZA 처리에 의해 유도된 SYCP3, SPESP1, 및 DAZL1의 상향조절된 유전자 발현의 연구
암 세포주 (폐암 세포주 EBC1, 폐암 세포주 Lu65, 결장암 세포주 HT-29, 및 구강 편평상피세포 암종(oral squamous cell carcinoma) 세포주 SAS)의 세포를, 5-AZA (10 μM)를 함유하는 완전 배지 (100 U/mL 페니실린 (메이지 세이카(Meiji Seika)) 및 100 μg/L 스트렙토마이신 (메이지 세이카)을 가진 RPMI 1640 배지 (나카라이 테스크(nacalai tesque) 30264-56)에, 56℃에서 30분 동안 비동화된 10% 소 태아 혈청 (바이오세라(biosera) FB-1365/500)이 첨가된 것)를 사용하여 2 x 105개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트 (팰콘(Falcon) 353046)에서, 37℃, 5% CO2, 및 95% 습도로 설정된 인큐베이터 (산요(SANYO))에서 3일 동안 배양하였다. 하기 시험에서 모든 세포 배양에 이와 동일한 인큐베이터를 사용하였다. 세포를 2 mL의 인산염-완충 식염수 (PBS, 칸토 케미칼 콤파니, 인크.(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 73111)로 세척하였다. RNA는 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen) 74106)로 추출하고, cDNA는 프라임스크립트 제1 스트랜드(PrimeScript 1st strand) cDNA 합성 키트(Synthesis Kit) (타카라 바이오(Takara Bio) 6110A)를 사용함으로써 합성하고, GAPDH (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) Hs02786624_g1) 및 SYCP3 (어플라이드 바이오시스템즈 Hs00538146_m1)의 유전자 발현 수준은 라이트사이클러(LightCycler)480 (로슈(Roche))을 사용하여 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 각각의 단계는 각각의 시약에 첨부된 패키지 삽입물의 설명에 따라 수행하였다. 결과는 도 1 및 도 2에 나타냈다. SYCP3이 모든 시험된 세포주에서 5-AZA 처리에 의해 상향조절되었다.
유사하게, 신장 암 세포주 SW839, 방광암 세포주 5637, 폐 선암종 세포주 LC2/Ad, 폐암 세포주 EBC1, 결장암 세포주 HT-29, 폐암 세포주 Lu65, 및 구강 편평상피세포 암종 세포주 SAS의 세포를 5-AZA의 존재 하에 배양하고, GAPDH 및 SPESP1 (어플라이드 바이오시스템즈 Hs00377364_m1)의 유전자 발현 수준을 분석하였다. 결과는 도 3 및 도 4에 나타냈다. SPESP1이 모든 시험된 세포주에서 5-AZA 처리에 의해 상향조절되었다.
유사하게, 마우스 백혈병 세포주 WEHI-3 (Balb/c)의 세포를 5-AZA의 존재 하에서 배양하고, 마우스 GAPDH (어플라이드 바이오시스템즈 Mm99999915_g1) 및 마우스 DAZL1 (어플라이드 바이오시스템즈 Mm01273546_m1)의 유전자 발현 수준을 분석하였다. 결과는 도 5에 나타냈다. DAZL1이 WEHI-3에서 5-AZA 처리에 의해 상향조절되었다.
5-AZA로 처리된 EBC1 및 Lu65에서의 SYCP3 단백질의 양은 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 1차 항체로서 1:200으로 희석된 항-SYCP3 항체 (마우스 항-SCP3, 비디 바이오사이언스(BD Bioscience) 611230)를 사용하였다. 5-AZA 처리에 의한 SYCP3의 상향조절이 단백질 수준에서 또한 관찰되었다.
마우스 암 세포주 (E0771:C57BL/6 마우스 유방암 세포주 및 C1498:C57BL/6 마우스 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 세포주)의 세포를 5-AZA (10 μM)로 처리하고, DAZL1 단백질의 양을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. DAZL1이 세포주 둘 다에서 5-AZA 처리에 의해 상향조절되었다.
다른 한편으로, 암세포주 EBC1, Lu65, 및 HT-29의 세포를 DNA 합성 억제제 인 겜시타빈의 존재 하에 배양한 경우, SYCP3, SPESP1, 및 DAZL1의 유전자 발현 수준은 대조군의 것들과 동등하였다. 결과는 시험 2에서 관찰된 각각의 유전자의 상향조절이 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제의 독특한 효과에 기반을 두고 있음을 시사한다.
시험 3: 면역결핍 마우스에서 5-AZA 처리에 의해 유도된 SYCP3 및 SPESP1의 상향조절된 유전자 발현의 확인
BALB/c 누드 마우스 (10 내지 14 주령, 찰스 리버 래보러토리즈 재팬(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN))에 마이젝터(Myjector) (TERUMO SS_05M2913)를 사용하여 대장암 세포주 HT-29 (5 x 105개 세포) 또는 WiDr (5 x 105개 세포)의 세포를 피내주사하고, 5, 10, 15 및 20일째에, 5-AZA (1.6 μg/g 마우스 체중)를 함유하는 200 μL의 PBS를 마이젝터를 사용하여 복강내 투여하였다. 대조군 마우스에는, 200 μL의 PBS를 복강내 투여하였다. 25일째에 마우스를 200 μL의 500 μg/mL 펜토바르비탈 (나카라이 테스크 02095-04)을 복강내 투여함으로써 안락사시키고, 종양 조직을 해부용 가위 (노나카리카키 컴파니, 리미티드(NONAKARIKAKI Co., Ltd), 11301)로 절제하고 바이오매셔(BioMasher) II (니피, 인코포레이티드(Nippi, Incorporated), 320103)에 의해 파쇄하였다. SYCP3 및 GAPDH의 유전자 발현 수준은 시험 2에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 결과는 도 6에 나타냈다. PBS만으로 처리한 마우스와 비교하여, 5-AZA로 처리된 마우스로부터 수집한 종양 조직에서 SYCP3이 상향조절되었다.
유사하게, 누드 마우스에 폐암 세포주 EBC1 (5 x 105개 세포) 또는 Lu65 (5 x 105개 세포)의 세포를 피내 주사하고, 5-AZA 또는 PBS (대조군)을 복강내 투여하였다. RNA는 25일째에 수집된 종양 조직으로부터 추출하였고, SPESP1 및 GAPDH의 유전자 발현 수준은 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 결과는 도 7에 나타냈다. PBS만으로 처리한 마우스와 비교하여, 5-AZA로 처리된 마우스로부터 수집한 종양 조직에서 SPESP1이 상향조절되었다.
시험 4: 후보 단백질에서 HLA-결합 아미노산 서열을 갖는 영역의 탐색
HLA에 결합할 수 있는 시험 1로부터 선택된 단백질의 아미노산 서열을 확인하기 위해, 각각의 서열을 일본인과 서양인에서 빈번히 발현되는 5 가지 유형의 HLA인, HLA-DRB1*01:01 (약 10%), HLA-DRB1*04:05 (약 25%), HLA-DRB1*09:01 (약 26%), HLA-DRB1*15:01 (약 15%), 및 HLA-DR53 (60% 이상)에 결합할 수 있는지에 대해 컴퓨터 알고리즘에 의해 분석하였다. SYCP3-A (서열번호: 8), SPESP1-B (서열번호: 9), 및 DAZL-1C (서열번호: 20)을 함유하는 아미노산 서열을 동정하였다.
시험 5: HLA 트랜스제닉 마우스를 사용한 후보 아미노산 서열의 면역자극 능력의 연구
HLA-A*02:01/DRB1*01:01 트랜스제닉 마우스 (A2.DR1-Tg 마우스, 10 내지 16 주령; 파스퇴르 인스티투트(Pasteur Institute),프랑스)에 0일 및 10일째에 마이젝터를 사용하여 100 μL의 PBS에 용해시킨 SYCP3-A 펩티드 (젠스크립트(GenScript)에 의해 합성)를 피내 주사하였다. 15일째에 200 μL의 500 μg/mL 펜토바르비탈을 복강내 투여하여 마우스를 안락사시켰다. 개복술 후, 종양-소속 림프절(tumor-draining lymph node) (dLN) 및 비장을 수집하고 림프구 및 비장 세포, 각각을 단리하였다.
림프구 (3 x 105개 세포) 및 비장세포 (5 x 105개 세포)를 ELISPOT 플레이트 (EMD 밀리포어(Millipore), MAHAS4510)에 첨가하고, 세포를 대조군 펩티드 (SYCP3에 포함되지 않은 서열을 갖는 15개 아미노산 잔기의 펩티드) 또는 시험 4로부터 선택된 SYCP3-A 펩티드 (3 μg/mL)의 존재 하에 완전 배지에서 150 μL/웰에서 24시간 동안 공동 배양하였다. SYCP3-A 펩티드에 특이적으로 IFN-γ를 생산하는 세포를 검출하기 위해, 마우스 IFN-γ ELISpot BASIC (ALP) 키트 (MABTECH 3321-2A)를 사용하여 ELISPOT 검정을 수행하였다. 절차는 첨부된 패키지 삽입물의 설명을 따랐다. ELISpot용 BCIP-NBT-플러스(plus) 기질 (MABTECH 3650-10)을 발색 기질로서 사용하였고, PBS-T를 사용하여 각각의 단계에서 세척하였다. 게다가, CD4-양성 T 세포에 의해 반응이 생성되는지를 확인하기 위해, 항-마우스 CD4 항체 (바이오레전드(BioLegend) 100435) 또는 항-마우스 CD8 항체 (바이오레전드 100735)를 일부 배양물에 5 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다.
결과는 하기 표에 나타냈다. SYCP3-A 펩티드의 자극에 의해 특이적 T 세포 반응이 유도되었다. 반응이 CD4에 대한 항체에 의해 억제되었다는 사실은 반응이 CD4-양성 T 세포에 의해 유도되었음을 나타낸다.
SYCP3-A 펩티드-특이적 IFN-γ 생산
1 2 3 4
SYCP3-A - + + +
항-CD8 항체 - - + -
항-CD4 항체 - - - +
IFN-γ 생산 세포 - + + -
더욱이, CD4-양성 T 세포가 상호작용하는 SYCP3-A 펩티드의 영역을 확인하기 위해, 출발 아미노산이 1개 아미노산에 의해 순차적으로 이동한 SYCP3-A 펩티드의 서열 중의 연속적인 12개 아미노산을 갖는 부분 펩티드를, 시그마-알드리치(Sigma-aldrich) 펩스크린(Pepscreen)을 사용하여 합성하였다 (하기 표).
SYCP3-A QQQKILQQSRIVQSQRLKT (서열번호: 8)
T1 QQQKILQQSRIV (서열번호: 10)
T2 QQKILQQSRIVQ (서열번호: 7)
T3 QKILQQSRIVQS (서열번호: 6)
T4 KILQQSRIVQSQ (서열번호: 5)
T5 ILQQSRIVQSQR (서열번호: 11)
T6 LQQSRIVQSQRL (서열번호: 12)
T7 QQSRIVQSQRLK (서열번호: 13)
T8 QSRIVQSQRLKT (서열번호: 14)
상기에 기재된 바와 같이, A2.DR1-Tg 마우스를 이들 부분 펩티드로 백신 접종하고, 각각의 마우스로부터 dLN 및 비장을 수집하고, 림프구 및 비장세포를 단리하고, 세포를 각각의 부분 펩티드 (3 μg/mL)로 24시간 동안 자극하고, T 세포 반응은 ELISPOT에 의해 결정하였다. 결과는 도 8에 나타냈다. CD4-양성 T 세포는 부분 펩티드 T2, T3, 및 T4에 반응하였다. 결과는 CD4-양성 T 세포가 상호작용하는 SYCP3-A 펩티드의 영역이 T2, T3, 및 T4 펩티드에서 공통되는 아미노산 서열 KILQQSRIVQ임을 시사한다.
시험 6: 마우스를 사용한 DAZL1 후보 펩티드의 면역자극 능력의 연구
2 마리의 BALB/cAnNCrlCrlj 마우스 (Balb/c, 10 내지 16 주령, 찰스 리버)에 0일 및 10일째에 마이젝터 (TERUMO SS_05M2913)를 사용하여 인산염-완충 식염수 (PBS, 칸토 케미칼 콤파니, 인크. 73111)에 용해시킨 100 μg/50 μL DAZL-1C 펩티드 (DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLC (서열번호: 20): 젠스크립트에 의해 합성됨)를 피내 주사하였다. 마우스에 12일째에 200 μL의 500 μg/mL 펜토바르비탈 (나카라이 테스크 02095-04)을 복강내 투여하여 안락사시켰다. 개복술 후, dLN 및 비장을 수집하고 각각 림프구와 비장세포를 단리하였다.
림프구 (3 x 105개 세포) 및 비장세포 (5 x 105개 세포)를 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트 (팰콘 353072)에 첨가하고, 세포를 대조군 펩티드 또는 DAZL-1C (2.5 μg/mL)의 존재 하에 완전 배지에서 200 μL/웰로 24시간 동안 공동 배양하였다. DAZL-1C 펩티드에 특이적인 IFN-γ 생산을 검출하기 위해, 24시간 후 각각의 100 μL의 배양 상청액를 수집하고, 첨부된 패키지 삽입물의 설명에 따라 ELISA 세트 (비디 바이오사이언스 551866)를 사용하여 IFN-γ 농도를 측정하였다. CD4-양성 T 세포에 의해 반응이 생성되는지를 확인하기 위해, 항-마우스 CD4 항체 (aCD4; 바이오레전드 100435) 또는 항-마우스 CD8 항체 (aCD8; 바이오레전드 100735)를 일부 배양물에 5 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다.
결과는 도 9에 나타냈다. DAZL-1C 펩티드에 특이적인 IFN-γ 생산이 항-CD4 항체에 의해 억제되었다는 사실은 DAZL-1C 펩티드가 마우스의 헬퍼 T 세포를 활성화한다는 것을 나타낸다.
시험 7: 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 SYCP3-A 또는 SPESP1-B 펩티드-특이적 헬퍼 T (Th) 세포의 유도
PBMC는 림포프렙(Lymphoprep) (알레레 테크놀로지즈(Alere Technologies) AS 1114547)을 사용하는 밀도 구배 분리 방법에 의해 건강한 공여자의 말초 혈액 샘플에서 수집하였다. CD14 양성 세포는 자기 세포 분리 시스템 (Miltenyi 130-050-201)을 사용하여 PBMC로부터 분리하였다. 수지상 세포 (DC)로의 분화는 50 ng/mL GM-CSF (peprotech AF-300-03) 및 50 ng/mL IL-4 (peprotech AF-200-04)의 존재 하에 3 mL의 인간 세포용 배지를 사용하여 6-웰 배양 플레이트 (팰콘 353046)에서 세포를 7일 동안 배양하여 유도하였다. 배양 배지는 56℃에서 30분 동안 불활성화된 3%의 인간 AB 혈청 (이노베이티브 리서치(Innovative RESEARCH) IPLA-SERAB)이 보충된 AIM-V 배지 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher SCIENTIFIC) 0870112DK)였다. 유사하게, CD4-양성 T 세포를 PBMC (Miltenyi 130-045-101)로부터 단리하고, 1 x 105개의 CD4-양성 T 세포는 SYCP3-A 또는 SPESP1-펩티드 (3 μg/mL)의 존재 하에 5 Х 104개의 DC와 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트 (팰콘 353072)에서 200 μL의 부피로 공동 배양되었다. 7일 후, 펩티드로 CD4-양성 T 세포를 자극하기 위해, 100 μL의 배양 상청액을 각각의 웰에서 제거한 다음에, SYCP3-A 또는 SPESP1-B 펩티드 (3 μg/mL) 및 감마선-조사 (40 Gy)에 의해 불활성화된 PBMC (2 x 105개)를 100 μL의 부피로 첨가하였다. 2일 후, 50 μL의 배양 상청액을 제거하고, 50 μL의 IL-2 (이뮤네이스(Imunace)35, 시오노기(Shionogi))를 최종 농도 10 U/mL로 첨가하였다. 활성화된 CD4-양성 T 세포의 지속적인 증식을 위해, 세포 (1 x 106개 세포)를 격주로 SYCP3-A 또는 SPESP1-B 펩티드 및 불활성화된 PBMC (1 x 106개 세포)로 자극하여 하기 기재된 실험에서 사용하였다.
시험 8: SYCP3-A 펩티드 특이적-헬퍼 T 세포주의 HLA 구속성
SYCP3-A 펩티드에 대한 증식된 CD4-양성 T 세포의 특이적 반응성을 연구하기 위해, CD4-양성 T 세포 (5 x 104개 세포) 및 PBMC (1 x 105개 세포)를 SYCP3-A 펩티드 (3 μg/mL)의 존재 하에 인간 세포용 배양 배지 200 μL를 사용하여 96-웰 펑평한 바닥 배양 플레이트에서 공동 배양하였다. CD4-양성 T 세포의 HLA 구속성을 연구하기 위해, 항-DR 항체 (바이오레전드 307612) 또는 대조군으로서 항-HLA-클래스 I 항체 (바이오레전드 311412)를 일부 배양물에 5 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 24 내지 48 시간 후 100 μL의 배양 상청액을 각각 웰로부터 수집하고, 첨부된 패키지 삽입물의 설명에 따라 ELISA 키트 (비디 바이오사이언스 555142)를 사용하여 IFN-γ 농도를 결정하였다.
결과를 도 10에 나타냈다. 3명의 건강한 공여자로부터 복수개의 SYCP3-A-특이적 Th 세포 클론을 확립하였다. 항-HLA-DR 항체 (aDR)를 클론에 첨가한 경우에 펩티드 특이적 IFN-γ 생산이 억제되었다. 결과는 SYCP3-A 펩티드가 HLA-DR 구속적으로 Th 세포를 자극하고 있음을 나타낸다.
더욱이, 펩티드가 구속된 HLA 유형을 동정하기 위해, SYCP3-A 펩티드 (3 μg/mL)의 존재 하에, CD4-양성 T 세포 (5 x 104개 세포) 및 HLA-DR4, DR8, DR9, 또는 DR53 유전자를 가진 3 x 104개의 마우스 섬유모세포 세포주 (L-DR4, L-DR8, L-DR9, 또는 L-DR53)를 200 μL의 인간 세포용 배양 배지를 사용하여 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트에서 공동 배양하고, 24 내지 48 시간 후 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.
모든 시험된 SYCP3-A 펩티드-특이적 Th 세포는 L-DR53 세포에 대해 강한 펩티드-특이적 반응 (INF-γ의 높은 발현 수준)을 나타냈다. SYCP3-A 펩티드는 또한 DR53 대립유전자를 갖지 않는 샘플에서도 일부 반응성을 나타냈다. 결과는 펩티드가 DR53 이외의 일부 대립유전자에 효과적임을 시사한다.
Th 세포 인식에 필요한 SYCP3-A 펩티드의 최소 서열을 동정하기 위해, 3 μg/mL의 농도로 부분 SYCP3-A 펩티드 T1 내지 T8 중 어느 하나 (시험 5 참조)의 존재하에, 5 x 104개 SYCP3-A 펩티드-특이적 Th 세포 (건강한 공여자 3의 세포주 ID 번호 #14) 및 동일한 공여자로부터 유래된 1 x 105개 PBMC를 200 μL의 인간 세포용 배양 배지를 사용하여 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트에서 공동 배양하였다. 결과는 도 11에 나타냈다. T3 및 T4 펩티드에 대해 증가된 IFN-γ 생산이 관찰되었다. 결과는 SYCP3-A 펩티드-특이적 Th 세포에 의한 인식에 필요한 최소 서열이 T3 및 T4에서 공통되는 아미노산 서열 KILQQSRIVQS임을 시사한다.
하기 표에 열거된 펩티드는 유사하게 시험하였다.
SYCP3-A QQQKILQQSRIVQSQRLKT（서열번호: 8）
SYCP3-B-1) RQQQKILQQSRIVQSQRLKT（서열번호: 22）
SYCP3-B-2) LNMFRQQQKILQQSRIVQSQRLKT（서열번호: 23）
SYCP3-B-3) QQQKILQQSRIVQSQRLKTI（서열번호: 24）
SYCP3-B-4) QQQKILQQSRIVQSQRLKTIKQLY（서열번호: 25）
SYCP3-B-5) Ac-QQQKILQQSRIVQSQRLKT (Ac: 아세틸 기)
결과는 도 12에 나타냈다. 증가된 IFN-γ 생산은 모든 펩티드에 대해 관찰되었다. 결과는 최소 서열의 N- 또는 C- 말단에 하나 이상의 아미노산이 부가되어도 반응성이 유지됨을 시사한다. 아세틸 기의 부가는 반응성을 변경하지 않았다. 이는 펩티드의 변형이 허용됨을 시사한다. 두 클론간에 반응성의 어떠한 차이도 발견되지 않았다.
SYCP3-A 펩티드의 11번째 이소류신 잔기를 발린 잔기로 치환하고 상기 펩티드 (서열번호: 31)를 유사하게 시험하였다. 반응성은 저하되지 않았다. 이는 CD4-양성 T 세포와 상호작용하는 SYCP3-A 펩티드 영역에서 특정 아미노산 돌연변이가 허용됨을 시사한다.
시험 9: SPESP1-B 펩티드-특이적 헬퍼 T 세포주의 HLA 구속성
배양 상청액의 IFN-γ 농도는, SYCP3-A 펩티드 대신에 SPESP1-B 펩티드를 사용한 것을 제외하고는, 시험 8에서와 동일한 방식으로 결정하였다. 결과는 도 13에 나타냈다. 2개의 SPESP1-B-특이적 Th 세포 클론 (HK15 및 HK18)이 1명의 건강한 공여자로부터 확립되었다. 항-HLA-DR 항체 (aDR)를 클론에 부가한 경우 펩티드 특이적 IFN-γ 생산이 억제되었다. 결과는 SPESP1-B 펩티드가 HLA-DR 구속적으로 Th 세포를 자극하고 있음을 나타낸다. 시험 8에 기재된 바와 같이 L-DR53을 사용한 추가 실험에 따르면, SPESP1-B 펩티드가 HLA-DR53에 결합하고 Th 세포를 자극하고 있음이 밝혀졌다.
펩티드에 대한 SPESP1-B 펩티드-특이적 Th 세포의 반응성을 연구하기 위해, Th 세포를 0.0003 내지 30 μg/mL로 연속 희석된 SPESP1-B 펩티드로 자극하였다. SPESP1-B 펩티드는 낮은 농도 (0.0003 μg/mL)에서도 충분한 IFN-γ 생산을 유도하였다.
시험 10: DAZL-1 펩티드-특이적 Th 세포의 유도 및 HLA 구속성의 연구
SYCP3-A 또는 SPESP1-B 펩티드 대신에 부분 DAZL-1 펩티드 p11, p12, 또는 p13 (표 4)을 사용한 것을 제외하고는, 시험 7과 동일한 방식으로 DAZL-1 펩티드-특이적 Th 세포를 유도하였다.
Figure 112020096679159-pct00001
배양 상청액의 IFN-γ 농도는 SYCP3-A 펩티드 대신에 부분 DAZL-1 펩티드 p11, p12 또는 p13을 사용한 것을 제외하고는, 시험 8과 동일한 방식으로 결정하였다. HLA 구속성을 연구하기 위해, 항-HLA-DP 항체, 항-HLA-DQ 항체 (SPV-L3: 앱캄(Abcam) ab85614), 및 항-HLA-DR 항체 (BRAFB6: 산타 클루즈(Santa Cluz)를 사용하였다. 결과는 도 14에 나타냈다. 항-HLA-DR 항체 (aDR)를 사용하는 경우에 펩티드-특이적 IFN-γ 생산이 억제되었다. 결과는 부분 DAZL-1 펩티드가 HLA-DR 구속적으로 Th 세포를 자극하고 있음을 나타낸다. p13으로 유도된 IFN-γ 생산이 항-HLA-DQ 항체로 또한 억제되었다. 결과는 DAZL-1로부터 유래된 펩티드가 다양한 HLA에 효과적임을 시사한다.
시험 8에서와 같이 L-DR4, L-DR8, L-DR9, L-DR15, 및 L-DR53을 사용한 추가 실험에 따르면, p11, p12, 및 p13이 HLA-DR4/9/53, HLA-DR15, 및 HLA-DR8에 각각 결합하여 Th 세포를 자극하고 있음이 밝혀졌다.
시험 11: 암세포에 대한 SYCP3-A 펩티드-특이적 CD4-양성 T 세포의 반응성
암세포주 세포에 대한 SYCP3-A 펩티드-특이적 CD4-양성 T 세포의 반응성을 연구하기 위해, DR53-양성 암세포주 (WiDr, Lu65, 및 Calu1)를 사용하였다. 암세포는 10 μM 5-AZA 및, 암 세포의 표면 상에 HLA 클래스 분자의 발현을 유도할 수 있는, 500 U/mL IFN-γ (이뮤노맥스(Immunomax)-γ 주사액 50, 시오노기(Shionogi))를 함유하는 2 mL의 완전 배지를 사용하여 6-웰 배양 플레이트에서 3 일 동안 배양하였다. 배양 플레이트를 PBS로 철저히 세척하고, 1 mL의 5 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산, 나카라이 테스크 14347-21)를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 세포를 회수하였다. 시험 8에서와 동일한 방식으로, 1 x 104개 세포의 각각의 세포주 및 5 x 104개 CD4-양성 T 세포를 200 μL의 인간 세포용 배양 배지를 사용하여 96-웰 펑평한 바닥 배양 플레이트에서 공동 배양하였다. 반응성이 HLA-DR에 의존한다는 것을 확인하기 위해, 항-HLA-DR 항체를 5 μg/mL의 최종 농도로 배양물에 첨가하였다. 24시간 후 100 μL의 배양 상청액을 각각의 웰로부터 수집하고, ELISA 키트를 사용하여 IFN-γ 농도를 결정하였다.
결과는 도 15에 나타냈다. 5-AZA 처리는 IFN-γ 생산을 증가시켰다. 결과는 SYCP3-A 펩티드로 활성화된 Th 세포가 5-AZA로 처리된 DR53-양성 암세포에 효과적으로 반응함을 나타낸다.
시험 12: 면역결핍 마우스에서 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제 및 SYCP3-특이적 Th 세포의 종양 성장 억제 효과
BALB/c 누드 마우스 (10 내지 14 주령, 찰스 리버 래보러토리즈 재팬)에 마이젝터를 사용하여 3 x 106개 폐암 세포주 Lu65를 피내 주사하였다. 그리고 7, 12, 17, 및 22일째에, 5-AZA (150 nmol/g 마우스 체중)를 함유하는 200 μL의 PBS를 마이젝터를 사용하여 복강내 투여하였다. 대조군 마우스에는, 200 μL의 PBS를 복강내 투여하였다. 13, 20, 및 27일째에, 200 μL의 SYCP3-특이적 인간 Th 세포 (3 내지 5 x 106개 세포)를 꼬리 정맥 투여에 의해 투여하였다. 대조군 마우스에는, 200 μL의 PBS를 꼬리 정맥 투여에 의해 투여하였다. 종양의 표면적은 시간이 지남에 따라 측정하였다. 결과는 도 16에 나타냈다. 5-AZA 단독으로는 효과가 관찰되지 않았으며, 한편 5-AZA와 SYCP3-특이적 인간 Th 세포의 조합에서는 종양 성장 억제 효과가 관찰되었다.
산업상 이용 가능성
본원에 개시된 암 항원 펩티드는 펩티드에 특이적인 헬퍼 T 세포를 활성화하여, 암 백신으로서 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 높은 빈도로 공유되는 HLA-DR53을 포함한 HLA에 결합하여, 많은 암 환자에서 효과적일 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION ASAHIKAWA MEDICAL UNIVERSITY <120> TUMOR ANTIGEN PEPTIDE <130> 674674 <150> JP 2018-024972 <151> 2018-02-15 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ser Ser Gly Lys Lys Tyr Ser Arg Lys Ser Gly Lys Pro Ser 1 5 10 15 Val Glu Asp Gln Phe Thr Arg Ala Tyr Asp Phe Glu Thr Glu Asp Lys 20 25 30 Lys Asp Leu Ser Gly Ser Glu Glu Asp Val Ile Glu Gly Lys Thr Ala 35 40 45 Val Ile Glu Lys Arg Arg Lys Lys Arg Ser Ser Ala Gly Val Val Glu 50 55 60 Asp Met Gly Gly Glu Val Gln Asn Met Leu Glu Gly Val Gly Val Asp 65 70 75 80 Ile Asn Lys Ala Leu Leu Ala Lys Arg Lys Arg Leu Glu Met Tyr Thr 85 90 95 Lys Ala Ser Leu Lys Thr Ser Asn Gln Lys Ile Glu His Val Trp Lys 100 105 110 Thr Gln Gln Asp Gln Arg Gln Lys Leu Asn Gln Glu Tyr Ser Gln Gln 115 120 125 Phe Leu Thr Leu Phe Gln Gln Trp Asp Leu Asp Met Gln Lys Ala Glu 130 135 140 Glu Gln Glu Glu Lys Ile Leu Asn Met Phe Arg Gln Gln Gln Lys Ile 145 150 155 160 Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg Leu Lys Thr Ile Lys 165 170 175 Gln Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Lys Ser Met Glu Glu Leu Glu Lys Asn 180 185 190 His Asp Asn Leu Leu Thr Gly Ala Gln Asn Glu Phe Lys Lys Glu Met 195 200 205 Ala Met Leu Gln Lys Lys Ile Met Met Glu Thr Gln Gln Gln Glu Ile 210 215 220 Ala Ser Val Arg Lys Ser Leu Gln Ser Met Leu Phe 225 230 235 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Pro Ser Ile Thr Val Thr Pro Asp Glu Glu Gln Asn Leu Asn His 1 5 10 15 Tyr Ile Gln Val Leu Glu Asn Leu Val Arg Ser Val Pro Ser Gly Glu 20 25 30 Pro Gly Arg Glu Lys Lys Ser Asn Ser Pro Lys His Val Tyr Ser Ile 35 40 45 Ala Ser Lys Gly Ser Lys Phe Lys Glu Leu Val Thr His Gly Asp Ala 50 55 60 Ser Thr Glu Asn Asp Val Leu Thr Asn Pro Ile Ser Glu Glu Thr Thr 65 70 75 80 Thr Phe Pro Thr Gly Gly Phe Thr Pro Glu Ile Gly Lys Lys Lys His 85 90 95 Thr Glu Ser Thr Pro Phe Trp Ser Ile Lys Pro Asn Asn Val Ser Ile 100 105 110 Val Leu His Ala Glu Glu Pro Tyr Ile Glu Asn Glu Glu Pro Glu Pro 115 120 125 Glu Pro Glu Pro Ala Ala Lys Gln Thr Glu Ala Pro Arg Met Leu Pro 130 135 140 Val Val Thr Glu Ser Ser Thr Ser Pro Tyr Val Thr Ser Tyr Lys Ser 145 150 155 160 Pro Val Thr Thr Leu Asp Lys Ser Thr Gly Ile Gly Ile Ser Thr Glu 165 170 175 Ser Glu Asp Val Pro Gln Leu Ser Gly Glu Thr Ala Ile Glu Lys Pro 180 185 190 Glu Glu Phe Gly Lys His Pro Glu Ser Trp Asn Asn Asp Asp Ile Leu 195 200 205 Lys Lys Ile Leu Asp Ile Asn Ser Gln Val Gln Gln Ala Leu Leu Ser 210 215 220 Asp Thr Ser Asn Pro Ala Tyr Arg Glu Asp Ile Glu Ala Ser Lys Asp 225 230 235 240 His Leu Lys Arg Ser Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Glu His Lys Leu 245 250 255 Lys Thr Met Tyr Lys Ser Gln Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Ser Asn 260 265 270 Lys Ile Asp Asp Ile Glu Thr Val Ile Asn Met Leu Cys Asn Ser Arg 275 280 285 Ser Lys Leu Tyr Glu Tyr Leu Asp Ile Lys Cys Val Pro Pro Glu Met 290 295 300 Arg Glu Lys Ala Ala Thr Val Phe Asn Thr Leu Lys Asn Met Cys Arg 305 310 315 320 Ser Arg Arg Val Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr 325 330 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Asn Leu Asn His Tyr Ile Gln Val Leu Glu Asn Leu Val Arg Ser 1 5 10 15 Val Pro Ser <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg Leu Lys Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 295 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ser Thr Ala Asn Pro Glu Thr Pro Asn Ser Thr Ile Ser Arg Glu 1 5 10 15 Ala Ser Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ser Gln Gly Tyr Ile Leu 20 25 30 Pro Glu Gly Lys Ile Met Pro Asn Thr Val Phe Val Gly Gly Ile Asp 35 40 45 Val Arg Met Asp Glu Thr Glu Ile Arg Ser Phe Phe Ala Arg Tyr Gly 50 55 60 Ser Val Lys Glu Val Lys Ile Ile Thr Asp Arg Thr Gly Val Ser Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Gly Phe Val Ser Phe Phe Asn Asp Val Asp Val Gln Lys Ile 85 90 95 Val Glu Ser Gln Ile Asn Phe His Gly Lys Lys Leu Lys Leu Gly Pro 100 105 110 Ala Ile Arg Lys Gln Asn Leu Cys Ala Tyr His Val Gln Pro Arg Pro 115 120 125 Leu Val Phe Asn His Pro Pro Pro Pro Gln Phe Gln Asn Val Trp Thr 130 135 140 Asn Pro Asn Thr Glu Thr Tyr Met Gln Pro Thr Thr Thr Met Asn Pro 145 150 155 160 Ile Thr Gln Tyr Val Gln Ala Tyr Pro Thr Tyr Pro Asn Ser Pro Val 165 170 175 Gln Val Ile Thr Gly Tyr Gln Leu Pro Val Tyr Asn Tyr Gln Met Pro 180 185 190 Pro Gln Trp Pro Val Gly Glu Gln Arg Ser Tyr Val Val Pro Pro Ala 195 200 205 Tyr Ser Ala Val Asn Tyr His Cys Asn Glu Val Asp Pro Gly Ala Glu 210 215 220 Val Val Pro Asn Glu Cys Ser Val His Glu Ala Thr Pro Pro Ser Gly 225 230 235 240 Asn Gly Pro Gln Lys Lys Ser Val Asp Arg Ser Ile Gln Thr Val Val 245 250 255 Ser Cys Leu Phe Asn Pro Glu Asn Arg Leu Arg Asn Ser Val Val Thr 260 265 270 Gln Asp Asp Tyr Phe Lys Asp Lys Arg Val His His Phe Arg Arg Ser 275 280 285 Arg Ala Met Leu Lys Ser Val 290 295 <210> 16 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Ser Gln Ile Asn Phe His Gly Lys Lys 1 5 10 15 Leu Lys Leu Gly Pro Ala Ile Arg Lys Gln Asn Leu Cys Ala Tyr His 20 25 30 Val Gln Pro Arg Pro Leu 35 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Ser Gln Ile Asn Phe His Gly Lys Lys 1 5 10 15 Leu Lys Leu Gly 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Asn Phe His Gly Lys Lys Leu Lys Leu Gly Pro Ala Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Gly Pro Ala Ile Arg Lys Gln Asn Leu Cys Ala Tyr His Val Gln 1 5 10 15 Pro Arg Pro Leu 20 <210> 20 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Ser Gln Ile Asn Phe His Gly Lys Lys 1 5 10 15 Leu Lys Leu Gly Pro Ala Ile Arg Lys Gln Asn Leu Cys 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Asn Phe His Gly Lys Lys Leu Lys Leu Gly Pro Ala Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys Ala Tyr His Val Gln Pro Arg Pro Leu 20 25 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln 1 5 10 15 Arg Leu Lys Thr 20 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Asn Met Phe Arg Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Arg Leu Lys Thr 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr Ile 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Ile Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr Ile Lys Gln Leu Tyr 20 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln 1 5 10 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser Gln 1 5 10 15 Arg Leu Lys Thr 20 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Asn Met Phe Arg Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Arg Leu Lys Thr 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr Ile 20 <210> 35 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Gln Gln Lys Ile Leu Gln Gln Ser Arg Val Val Gln Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Thr Ile Lys Gln Leu Tyr 20

Claims (15)

  1. KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열;
    DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열; 또는
    QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열
    을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
    1개 내지 3개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드, 또는
    1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 상기 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고 헬퍼 T 세포 활성화능을 갖는 펩티드인, 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, KILQQSRIVQX (여기서 X는 부재하거나 S이다)의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진, 펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호: 1의 아미노산 서열 중의 연속적인 아미노산으로 이루어진, 펩티드.
  5. 제4항에 있어서, KILQQSRIVQSQ (서열번호: 5), QKILQQSRIVQS (서열번호: 6), 및 QQKILQQSRIVQ (서열번호: 7)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 16)의 아미노산 서열 중의 10개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, 10개 내지 45개의 아미노산으로 이루어진, 펩티드.
  7. 제6항에 있어서, DVQKIVESQINFHGKKLKLG (서열번호: 17), INFHGKKLKLGPAIRKQNLC (서열번호: 18), 및 LGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
  8. 제7항에 있어서, DVQKIVESQINFHGKKLKLG (서열번호: 17), INFHGKKLKLGPAIRKQNLC (서열번호: 18), 및 LGPAIRKQNLCAYHVQPRPL (서열번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진, 펩티드.
  9. 제1항에 있어서, QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하고, 19개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진, 펩티드.
  10. 제9항에 있어서, QNLNHYIQVLENLVRSVPS (서열번호: 9)의 아미노산 서열로 이루어진, 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자를 포함하는 HLA 멀티머, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포, 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드와 HLA 클래스 II 분자의 복합체를 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 추가로 포함하거나, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제와 병용되는, 제약 조성물.
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 암 백신인, 제약 조성물.
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