KR102260007B1 - Immunoassay device and method based on light scattering - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원 및 항체의 면역 반응을 분석하는 면역 분석 장치로, 시료가 주입되는 시료 주입구 및 주입된 시료가 흐르며 자성 나노입자의 표면에 항체가 고정된 항체-자성 나노입자 복합체가 위치하는 센싱영역을 연결하는 미세 유체 채널을 포함하는 마이크로칩; 상기 마이크로칩에 이격되어 위치하는 자기장 인가부;상기 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부; 및 상기 센싱영역에서 산란된 광을 검출하는 산란광 검출부;를 포함한다. The present invention is an immunoassay device for analyzing immune responses of antigens and antibodies. A sample inlet through which a sample is injected and an antibody-magnetic nanoparticle complex in which an antibody is immobilized on the surface of magnetic nanoparticles through which the injected sample flows are located. a microchip including a microfluidic channel that connects them; a magnetic field applying unit spaced apart from the microchip; a light source unit irradiating light passing through the sensing region; and a scattered light detector configured to detect light scattered in the sensing region.
Description
본 발명은 광산란을 이용한 면역 분석 장치 및 방법에 관한 것이다. The present invention relates to an immunoassay apparatus and method using light scattering.
면역 분석법은 시료의 분석 과정에서 항체를 이용하는 기술을 의미하며, 항원-항체의 특이적 결합반응을 이용하는 기술이다. 이때 항체는 표지(labeling)하여 사용하거나 별도의 표지 없이 사용하기도 한다. 주로 단백질의 검출이나 정량을 위하여 사용되었으나, 최근에는 항체 기술의 발전으로 저분자 화합물, 탄수화물, 지질 등의 분석 및 각종 미생물의 분석에도 활용되어, 임상 진단, 약물 전달, 식품 안전 및 환경 감시 등의 분야에서 중요한 역할을 수행한다. Immunoassay refers to a technique using an antibody in the process of analyzing a sample, and is a technique using an antigen-antibody specific binding reaction. In this case, the antibody may be used with labeling or used without a separate label. It was mainly used for the detection or quantification of proteins, but recently, with the development of antibody technology, it has been used in the analysis of small-molecular compounds, carbohydrates, lipids, etc. and various microorganisms, in clinical diagnosis, drug delivery, food safety and environmental monitoring plays an important role in
면역 분석법의 한 종류로, 측면유동 면역 분석법 (lateral flow immunoassay: LFA)은 나노입자를 이용한 샌드위치 면역분석 기술과 멤브레인을 이용한 시료 유동을 통해 미지 시료 내 표적물질을 검출할 수 있는 분석기술이다. 측면유동 면역 분석법은 가격이 저렴하고 휴대 및 빠른 검출이 용이하고 전문적인 기술 없이 일반인들이 쉽게 이용할 수 있어 널리 이용되고 있지만, 육안 식별 평가에 의존함에 따라 분석 민감도가 우수하지 않고 정량분석이 어려운 문제점이 있다. As a type of immunoassay, lateral flow immunoassay (LFA) is an analysis technique that can detect a target substance in an unknown sample through a sandwich immunoassay technique using nanoparticles and a sample flow using a membrane. The lateral flow immunoassay is widely used because of its low price, easy portability and quick detection, and easy use by the general public without specialized skills. However, as it relies on visual identification evaluation, it has problems with poor analytical sensitivity and difficult quantitative analysis. have.
한편, 표면 증강 라만 기반 면역 분석법은 라만 리포터 분자 (라만 표지자)의 증폭된 특징적인 표면 증강 라만 분산 (SERS) 스펙트럼 피크의 세기 변화를 측정하여 표적물질을 정량할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 빠르고 민감한 센싱능력 때문에 많은 연구자들로부터 관심을 받고 있지만 실험 조건을 최적화하기가 어렵고, 입자의 형상에 따라 편차가 커서 감도가 떨어지는 문제점이 있다. On the other hand, the surface-enhanced Raman-based immunoassay is a method capable of quantifying a target substance by measuring the intensity change of the amplified characteristic surface-enhanced Raman dispersion (SERS) spectrum peak of a Raman reporter molecule (Raman marker). Although this method is attracting attention from many researchers because of its fast and sensitive sensing ability, it is difficult to optimize the experimental conditions, and there is a problem that the sensitivity is lowered due to the large deviation depending on the shape of the particle.
따라서 정확도 및 민감도가 높은 동시에 간편하고 측정시간이 짧은 면역 분석 장치 및 방법의 제공이 필요하다. Therefore, there is a need to provide an immunoassay device and method with high accuracy and sensitivity, and a simple and short measurement time.
본 발명의 목적은 광산란을 이용한 면역 분석 장치 및 방법을 제공하는 것으로, 보다 구체적으로, 면역 분석 장치에 광을 조사하고, 검출하고자 하는 항원과 나노입자가 결합함으로써 발생되는 광산란 특성을 이용하여 시료 내에 존재하는 항원을 정확하게 검출할 수 있는 면역 분석 장치 및 분석 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an immunoassay apparatus and method using light scattering, and more specifically, by irradiating light to the immunoassay apparatus, and using light scattering characteristics generated by binding of an antigen to be detected and nanoparticles to a sample within the sample. To provide an immunoassay device and analysis method capable of accurately detecting an antigen present.
본 발명의 다른 목적은 짧은 시간 내에 정확하게 분석할 수 있는 간편한 면역 분석 장치 및 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a simple immunoassay apparatus and method capable of accurately analyzing within a short time.
본 발명은 항원 및 항체의 면역 반응을 분석하는 면역 분석 장치로,The present invention is an immunoassay device for analyzing immune responses of antigens and antibodies,
시료가 주입되는 시료 주입구 및 주입된 시료가 흐르며 자성 나노입자의 표면에 항체가 고정된 항체-자성 나노입자 복합체가 위치하는 센싱영역을 연결하는 미세 유체 채널을 포함하는 마이크로칩; a microchip including a sample inlet through which a sample is injected and a microfluidic channel through which the injected sample flows and connects a sensing region in which an antibody-immobilized antibody-magnetic nanoparticle complex is located on the surface of a magnetic nanoparticle;
상기 마이크로칩에 이격되어 위치하는 자기장 인가부; a magnetic field applying unit spaced apart from the microchip;
상기 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부; 및a light source unit irradiating light passing through the sensing region; and
상기 센싱영역에서 산란된 광을 검출하는 산란광 검출부;a scattered light detector for detecting light scattered in the sensing region;
를 포함하는 면역 분석 장치를 제공한다. It provides an immunoassay device comprising a.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 자기장 인가부는 하부에 위치하는 제1자기장 인가부 및 상부에 위치하는 제2자기장 인가부를 포함할 수 있다.In an embodiment according to the present invention, the magnetic field applying unit may include a first magnetic field applying unit located at a lower portion and a second magnetic field applying unit located at an upper portion.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 산란광 검출부는 상기 광원부에 의해 조사된 광이, 상기 시료에 함유된 항원과 상기 복합체의 항체가 특이적 결합하여 생성된 결합체에 의해, 상기 미세 유체 채널 외부로 산란된 광을 검출하는 것일 수 있다. In an embodiment according to the present invention, the scattered light detection unit emits light irradiated by the light source unit to the outside of the microfluidic channel by a conjugate generated by the specific binding between the antigen contained in the sample and the antibody of the complex. It may be to detect the scattered light.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 면역 분석 장치는 상기 자기장 인가부를 제어하여 상기 센싱영역에 인가되는 자기장의 방향과 세기를 조절하는 제어부를 더 포함할 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the immunoassay apparatus may further include a control unit for controlling the magnetic field applying unit to adjust the direction and strength of the magnetic field applied to the sensing region.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 센싱영역은 하부 면에 항원과 특이적으로 결합하는 1차 항체 (Primary antibody)가 고정된 것일 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the sensing region may have a primary antibody that specifically binds to an antigen is fixed to the lower surface.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 항체-자성 나노입자 복합체는 상기 센싱영역의 상부면에 증착되어 있는 것일 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the antibody-magnetic nanoparticle complex may be deposited on the upper surface of the sensing region.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 산란광 검출부는 상기 마이크로칩의 상부에 위치하는 것일 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the scattered light detector may be located on the top of the microchip.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 항체-자성 나노입자의 자성 나노입자는 Fe3O4, Fe2O3, 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬, 코발트, 니켈 및 이의 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the antibody-magnetic nanoparticles of the magnetic nanoparticles are Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, cobalt, nickel and alloys thereof. It may be any one or two or more selected from the group consisting of.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 자성 나노입자는 0.1 내지 1 ㎛의 평균입경을 가질 수 있다. In one embodiment according to the present invention, the magnetic nanoparticles may have an average particle diameter of 0.1 to 1 ㎛.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 마이크로칩은 센싱영역과 이격되어, 분석장치의 정상 작동여부를 판단할 수 있는 참조영역 (Reference zone)을 더 포함할 수 있다. In an embodiment according to the present invention, the microchip may further include a reference zone that is spaced apart from the sensing zone and can determine whether the analysis apparatus is operating normally.
본 발명은 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 장치를 이용하는 분석 방법으로, The present invention is also an analysis method using the immunoassay apparatus according to an embodiment of the present invention,
1) 마이크로칩의 시료 주입구에 시료를 주입하는 단계; 1) injecting a sample into the sample inlet of the microchip;
2) 자기장을 인가하는 단계; 2) applying a magnetic field;
3) 광을 조사하는 단계; 3) irradiating light;
4) 상기 조사된 광의 산란광을 검출하는 단계; 및4) detecting scattered light of the irradiated light; and
5) 상기 산란광 검출 신호를 분석하는 단계; 를 포함하는 면역 분석 방법을 제공한다. 5) analyzing the scattered light detection signal; It provides an immunoassay method comprising a.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 자기장을 인가하는 단계는,In one embodiment according to the present invention, the step of applying the magnetic field,
2-1) 제1자기장 인가부 제어를 통해 상기 결합체를 상기 1차 항체에 결합시키는 단계; 및 2-1) binding the conjugate to the primary antibody by controlling the first magnetic field applying unit; and
2-2) 제2자기장 인가부 제어를 통해 결합체를 형성하지 못한 항체-자성 나노입자 복합체를 상기 마이크로칩의 하부 면으로부터 제거하는 단계;2-2) removing the antibody-magnetic nanoparticle complex that did not form a conjugate from the lower surface of the microchip by controlling the second magnetic field applying unit;
를 포함할 수 있다. may include.
본 발명에 따른 면역 분석 장치는 시료 내의 표적물질 (항원)을 짧은 시간 내에 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 단순한 구조를 가짐으로써 정확도 및 경제성을 동시에 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 면역 분석 장치는 비교적 간단한 구조를 가지며, 적은 양의 시료를 사용하면서도 신속하고 정확하게 시료 내의 항원 농도를 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한 비싼 장비나 염색 물질의 표지없이 항원의 존재 여부 검출 및 항원의 농도의 측정이 가능하여 정확도 및 경제성이 모두 향상된 면역 분석 방법을 제공할 수 있다. The immunoassay apparatus according to the present invention has the advantage of being able to accurately detect a target substance (antigen) in a sample within a short time, and having a simple structure, thereby improving both accuracy and economic efficiency. Specifically, the immunoassay apparatus according to the present invention has a relatively simple structure and has the advantage of rapidly and accurately detecting the antigen concentration in the sample while using a small amount of sample. In addition, since it is possible to detect the presence of an antigen and measure the concentration of an antigen without expensive equipment or labeling of a dye, it is possible to provide an immunoassay method with improved accuracy and economical efficiency.
도 1은 본 발명에 따른 면역 분석 장치의 구조를 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 면역 분석 장치에 의해 일어나는 광도파 및 광산란을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 면역 분석 장치에 포함되는 마이크로칩의 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 장치의 구조를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 장치에 따라 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 장치에 따라 측정한 산란광의 세기 및 항원 농도의 관계를 나타낸 그래프이다. 1 is a diagram showing the structure of an immunoassay apparatus according to the present invention.
2 is a view showing light waveguide and light scattering generated by the immunoassay apparatus according to the present invention.
3 is a diagram showing the structure of a microchip included in the immunoassay apparatus according to the present invention.
4 is a diagram showing the structure of an immunoassay apparatus according to an embodiment of the present invention.
5 is a view showing the results measured by the immunoassay apparatus according to an embodiment of the present invention.
6 is a graph showing the relationship between the intensity of scattered light and the antigen concentration measured by the immunoassay apparatus according to an embodiment of the present invention.
본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Unless otherwise defined in technical terms and scientific terms used in this specification, those of ordinary skill in the art to which this invention belongs have the meanings commonly understood, and in the following description and accompanying drawings, the subject matter of the present invention Descriptions of known functions and configurations that may unnecessarily obscure will be omitted.
본 명세서에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미하며, "-들을 포함하다" 및 이러한 용어의 변형, 예를 들어, "-들을 포함하는" 및 "-을 포함하다"는 다른 부가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하고자 하는 것이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 동등하게 사용된다. 약 또는 대략을 갖거나 갖지 않는 본 명세서에서 사용되는 임의의 숫자는 관련 분야의 당업자에 의해 인지되는 임의의 일반적인 변동을 포함하는 것을 의미한다.In this specification, the use of "or" means "and/or" unless stated otherwise, and includes "including" and variations of these terms, such as "including" and "-". "comprises" is not intended to exclude other adducts, components, integers or steps. As used herein, the terms “about” and “approximately” are used interchangeably. Any number used herein with or without about or approximation is meant to include any general variations recognized by one of ordinary skill in the relevant art.
본 발명은 면역 분석 장치 및 방법에 관한 것으로, 표적물질은 본 발명의 면역 분석 장치에 의하여 검출하고자 하는 물질을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생체 시료에서 검출하고자 하는 특정 항원, 항체, 핵산, 압타머, 단백질, 펩티드, 세포, 암세포, 종양 마커 등이 포함될 수 있으며, 기타 분석 대상 표적 물질이 포함될 수 있다. 또한, 결합성분은 상기 표적물질과 특이적인 상호작용을 통해 결합할 수 있는 물질을 의미하는 바, 예컨대, 항체, 핵산, 단백질, 펩티드, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 표적물질은 특정 항원이고, 상기 결합성분은 상기 특정 항원에 특이적인 항체일 수 있다.The present invention relates to an immunoassay apparatus and method, and the target material refers to a material to be detected by the immunoassay apparatus of the present invention, for example, a specific antigen, antibody, nucleic acid, Tamers, proteins, peptides, cells, cancer cells, tumor markers, etc. may be included, and other target materials to be analyzed may be included. In addition, the binding component refers to a substance capable of binding through a specific interaction with the target substance, for example, an antibody, a nucleic acid, a protein, a peptide, a substance capable of specifically binding to a tumor marker, etc. may be included. have. Preferably, the target material is a specific antigen, and the binding component may be an antibody specific for the specific antigen.
이하에서 면역 분석 장치 및 방법의 표적물질은 편의상 항원으로 칭하고, 결합성분은 항체로 칭하여 설명하기로 한다.Hereinafter, the target material of the immunoassay apparatus and method will be referred to as an antigen for convenience, and the binding component will be referred to as an antibody.
본 발명은 항원 및 항체의 면역 반응을 분석하는 면역 분석 장치로,The present invention is an immunoassay device for analyzing immune responses of antigens and antibodies,
시료가 주입되는 시료 주입구 및 주입된 시료가 흐르며 자성 나노입자의 표면에 항체가 고정된 항체-자성 나노입자 복합체가 위치하는 센싱영역을 연결하는 미세 유체 채널을 포함하는 마이크로칩; a microchip including a sample inlet through which a sample is injected and a microfluidic channel through which the injected sample flows and connects a sensing region in which an antibody-immobilized antibody-magnetic nanoparticle complex is located on the surface of a magnetic nanoparticle;
상기 마이크로칩에 이격되어 위치하는 자기장 인가부;a magnetic field applying unit spaced apart from the microchip;
상기 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부; 및a light source unit irradiating light passing through the sensing region; and
상기 센싱영역에서 산란된 광을 검출하는 산란광 검출부;a scattered light detector for detecting light scattered in the sensing region;
를 포함하는 면역 분석 장치에 관한 것이다. It relates to an immunoassay device comprising a.
본 발명에 따른 면역 분석 장치는 시료 주입구 및 센싱영역이 형성된 미세 유체 채널을 포함하는 마이크로칩, 자기장 인가부, 광원부 및 산란광 검출부를 포함함으로써, 적은 양의 시료를 사용하면서도 신속하고 정확하게 항원 농도를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 값비싼 장비 없이 단순한 구조를 가지므로, 정확도 및 경제성이 모두 향상되는 장점을 가지고 있다. The immunoassay device according to the present invention includes a microchip including a sample inlet and a microfluidic channel having a sensing region, a magnetic field application unit, a light source unit, and a scattered light detection unit, thereby rapidly and accurately detecting the antigen concentration while using a small amount of sample. Not only can it be done, but it also has a simple structure without expensive equipment, so it has the advantage of improving both accuracy and economy.
본 발명에 따른 면역 분석 장치의 구조는 도 1을 통해 자세히 설명한다. 도시되는 바와 같이, 상기 면역 분석 장치는 항원 및 항체의 특이적 결합반응이 일어나는 센싱영역 (210), 상기 센싱영역 (210)의 일단에 연결되는 시료 주입구 (100), 상기 센싱영역 (210)의 타단에 연결되는 에어 벤트 (230), 및 상기 시료 주입구 (100), 센싱영역 (210) 및 에어 벤트 (230)를 연결하는 미세 유체 채널 (200)을 포함하는 마이크로칩 (300); 제1자기장 인가부 (410) 및 제2자기장 인가부 (420); 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부 (500); 및 센싱영역에서 산란된 광을 검출하며, 상기 마이크로칩 (300)의 상부에 위치하는 산란광 검출부 (600)을 포함한다. The structure of the immunoassay device according to the present invention will be described in detail with reference to FIG. 1 . As shown, the immunoassay device includes a
구체적으로, 상기 센싱영역 (210) 및 에어 벤트 (230)가 미세 유체 채널(200)을 통해 직렬적으로 위치하고, 상기 미세 유체 채널(200)은 시료의 주입을 위해 시료 주입구 (100)와 연결되어 있을 수 있다. 즉, 시료 주입구로 시료가 주입되면, 시료는 미세 유체 채널을 따라 흐르며, 미세 유체 채널을 통해 연결된 센싱영역에 최종적으로 도달할 수 있다.Specifically, the
상기 미세 유체 채널 (200)은 시료 주입구를 통해 주입된 액상의 시료가 흐를 수 있는 것이면 무방하며, 액상의 시료와 접하는 미세 유체 채널 (200)의 표면은 액상 시료의 빠른 유동을 위해 선택적으로 친수성 개질제로 표면처리될 수도 있다.As long as the
더욱 구체적으로, 상기 미세 유체 채널의 폭은 3㎜이하, 좋게는 0.8 내지 1.5㎜일 수 있으며, 높이는 1㎜이하, 좋게는 0.2 내지 0.6㎜일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다. 또한 상기 참조영역 및 센싱영역의 폭은 장축 방향으로 4㎜이하, 좋게는 2 내지 3.5㎜를 가질 수 있으며, 길이는 상기 폭과 동일할 수 있으며 높이는 5㎜이하, 좋게는 2 내지 4㎜일 수 있으나 이에 제한하지는 않는다. More specifically, the width of the microfluidic channel may be 3 mm or less, preferably 0.8 to 1.5 mm, and the height may be 1 mm or less, preferably 0.2 to 0.6 mm, but is not limited thereto. In addition, the width of the reference region and the sensing region may be 4 mm or less in the major axis direction, preferably 2 to 3.5 mm, the length may be the same as the width, and the height may be 5 mm or less, preferably 2 to 4 mm However, it is not limited thereto.
상기 미세 유체 채널 (200)은 상기 마이크로칩 상에 형성되며, 상기 마이크로칩은 유기소재 또는 무기소재인 기재로부터 형성될 수 있다.The
상기 시료 주입구 (100)는 마이크로칩 상에 위치하는 것으로 마이크로칩의 면의 상부 방향으로 개구부를 통해 구성될 수 있거나 마이크로칩의 측부 방향으로 개구부를 통해 구성될 수도 있다.The
상기 기재로 사용되는 상기 유기소재 또는 무기소재는 광도파를 위한 별도의 채널을 형성하지 않고서도 광도파 성질을 가질 수 있으며, 입사되는 광이 기재를 통해 상기 센싱영역 (210)으로 광도파될 수 있다. 구체적으로 도 2를 통해 설명한다. 광원부 (500)을 통해 광이 공급되면, 센싱영역 (210) 내부에서 광도파가 일어나고, 항원-항체 결합반응에 의해 센싱영역의 하부에 존재하는 항체-자성 나노입자 복합체의 자성 나노입자 (700)에 의해 광산란이 발생하며, 광산란되는 강도를 측정하여 항원과 결합된 항체-자성 나노입자 복합체의 농도를 측정하고, 이로부터 최종적으로 항원의 농도를 정량할 수 있다.The organic or inorganic material used as the substrate may have optical waveguide properties without forming a separate channel for optical waveguide, and incident light may be optically guided to the
상기 광도파 성질을 가지는 기재를 사용함으로써, 광원부에서 조사되는 광이 손실 없이 상기 항체-자성 나노입자 복합체와 시료에 함유된 항원의 결합체에 의해 모두 산란되어 상기 산란광 검출부에 의해 검출될 수 있어, 훨씬 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 소량의 항원을 함유하는 시료에 대해서도 민감하게 반응할 수 있어서 면역 분석 장치의 정확도 및 민감도를 모두 향상시킬 수 있다. By using the substrate having the optical waveguide property, the light irradiated from the light source unit is scattered by the antibody-magnetic nanoparticle complex and the antigen contained in the sample without loss, and can be detected by the scattered light detection unit, Not only can it be accurately detected, but it can also react sensitively to a sample containing a small amount of antigen, thereby improving both the accuracy and sensitivity of the immunoassay device.
상기 광도파 성질을 가지는 기재는 공기의 굴절율보다 높은 굴절율을 가지는 재료로 이루어지는 것이 바람직하며, 공기의 굴절율보다 높은 굴절율을 가짐에 따라 광원부에서 기재로 조사되는 광이 상기 기재 외부로 소산되지 않고 굴절되어 센싱영역 (210)으로 안정적으로 광도파될 수 있다. 상기와 같은 특성을 가진 기재로서, 유기소재는 고분자 소재일 수 있으며, 무기소재로는 유리, 세라믹 또는 실리콘 등의 재질을 가지는 소재일 수 있다. 높은 굴절율을 가지는 고분자 소재의 일 예로는, 폴리디메틸실록산 (PDMS, polydimethyl siloxanes), 폴리카보네이트 (Polycarbonate), 폴리스타이렌 (Polystyrene), 폴리이미드(Polyimide), 폴리에스터(Polyester) 등의 소재에서 하나 이상을 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.The substrate having the optical waveguide property is preferably made of a material having a refractive index higher than that of air, and as it has a refractive index higher than that of air, the light irradiated from the light source to the substrate is refracted without being dissipated to the outside of the substrate The light may be stably guided to the
상기 마이크로칩 (300)은 도 3와 같이, 상층 (Upper layer) 및 하층 (Bottom layer)으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로칩의 상층에서, 센싱영역의 상부면에 항체-자성 나노입자 복합체를 증착할 수 있다. 상기 항체-자성 나노입자 복합체는 상기 센싱영역의 상부면에 공지의 방법으로 증착될 수 있으며, 구체적인 일 예로 디스펜서로 상기 상부면에 용액 캐스팅하여 증착될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 마이크로칩의 하층에서, 센싱영역의 하부면에는 항원과 특이적으로 결합하는 1차 항체 (Primary antibody)를 고정화될 수 있다. 상기 1차 항체는 공지의 방법으로 하부면에 고정화될 수 있으며, 구체적인 일 예로 실란화 반응 (Silanization), 공유 결합 또는 물리적인 흡착에 의해 센싱영역의 하부 면에 고정될 수 있으나 이에 제한하지는 않는다. 다음, 항체-자성 나노입자 복합체가 증착된 마이크로칩의 상층과 1차 항체가 고정화된 마이크로칩의 하층을 서로 결합하여 마이크로칩 (300)이 제조될 수 있다. The
보다 구체적으로, 상기 상층과 하층이 결합하여 제조된 상기 마이크로칩 (300)은 상하부가 밀폐된 센싱영역 (210)을 형성하며, 상기 센싱영역 (210)은 자성 나노입자의 표면에 항체가 고정된 항체-자성 나노입자 복합체를 포함한다. 시료 주입구를 통해 시료가 공급되면, 상기 시료는 미세 유체 채널을 따라 흘러 센싱영역에 도달하게 되는데 상기 증착된 항체-자성 나노입자 복합체가 시료에 용해되면서 시료에 포함되는 항원과 특이적 결합을 통해 결합체가 센싱영역에서 형성된다.More specifically, the
본 발명의 다른 일 예에 따른 면역 분석 장치에 의해, 상기 센싱영역 (210)의 하부면에는 서로 상이한 여러 종류의 1차 항체 (Primary antibody)가 고정화될 수 있다. 상기 서로 상이한 1차 항체는 복수개 포함할 수 있으며, 2개 이상일 수 있으나 이에 제한받지 않는다. 구체적인 예를 들어, 면역 분석 장치의 센싱영역 하부를 세 구역으로 나누어 각각 서로 다른 세 종류의 1차 항체가 각각 고정화할 수 있다. 이에 따라 측정하고자 하는 특정 항원을 포함하는 시료의 주입시 상기 센싱영역에 존재하는 특정 1차 항체와 결합하여 특정 항원의 유무 및 농도를 측정할 수 있으며, 또한 시료 내에 존재하는 다른 항원의 유무 및 농도의 측정도 동시에 가능하게 된다.Different types of primary antibodies may be immobilized on the lower surface of the
상기 "항체"는 특정 표적 항원에 특이적인 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 자연에서 생산된 무손상 항체는 일반적으로 "Y-형" 구조로 불리는 서로 회합된 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 구성된 약 150 kD의 사합체 작용제이다. 각 중쇄는 적어도 4개의 도메인을 포함하며, Y 구조의 끝에 위치하는 아미노-말단 가변 도메인에 이어 3개의 불변 도메인을 포함하는데, 상기 3개의 불변 도메인은 CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3로 구성된다. By "antibody" is meant a polypeptide comprising canonical immunoglobulin sequence elements sufficient to confer specific binding to a particular target antigen. Intact antibodies produced in nature usually contain two identical heavy chain polypeptides (approximately 50 kD each) and two identical light chain polypeptides (approximately 25 kD each) associated with each other, commonly referred to as "Y-shaped" structures, of about 150 kD. It is a tetrameric agonist. Each heavy chain comprises at least four domains, and an amino-terminal variable domain located at the end of the Y structure, followed by three constant domains, the three constant domains being CH1, CH2, and the carboxy-terminal CH3. .
한편 항체 단편은 무손상 항체의 부분, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 트리아보디; 테트라보디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 분리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자("ScFv 단백질"), 및 과가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인지 단위를 포함한다. 구체적으로, 항체 단편은 항체와 유사한 친화도로 항원에 결합하거나 항원과의 결합에 대해 항체와 경쟁할 수 있다. 항체의 단편에 결합하는 항원의 예는, 비제한적으로, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아보디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역을 포함할 수 있다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 수단으로 생산될 수 있다. 따라서 본 명세서에 달리 언급하지 않는다면 본 명세서에서 언급되는 항체는 부모 항체뿐만 아니라 항체 단편을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.An antibody fragment, on the other hand, comprises a portion of an intact antibody, eg, the antigen-binding or variable region of an antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab', F(ab')2, and Fv fragments; tria body; tetrabodies; linear antibody; single chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. For example, antibody fragments include isolated fragments, "Fv" fragments consisting of the variable regions of a heavy and light chain, recombinant single chain polypeptide molecules in which the light and heavy chain variable regions are linked by a peptide linker ("ScFv protein"), and hypervariable It contains the smallest recognition unit composed of amino acid residues that mimic a region. Specifically, an antibody fragment can bind to an antigen with a similar affinity to the antibody or compete with the antibody for binding to the antigen. Examples of antigens that bind fragments of antibodies include, but are not limited to, Fab fragments, Fab' fragments, F(ab')2 fragments, scFv fragments, Fv fragments, dsFv diabodies, dAb fragments, Fd' fragments, Fd fragments, and an isolated complementarity determining region (CDR) region. Antigen-binding fragments of antibodies can be produced by any means. Accordingly, unless otherwise stated herein, the antibody referred to herein may be interpreted as a concept including an antibody fragment as well as a parent antibody.
상기 항체-자성 나노입자의 자성 나노입자는 Fe3O4, Fe2O3, 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬, 코발트, 니켈 및 이의 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으나 이에 제한하지는 않는다. 또한 상기 자성 나노입자는 평균입경 0.1 내지 1㎛, 좋게는 0.1 내지 0.8㎛, 더욱 좋게는 0.1 내지 0.5㎛를 가질 수 있다. 상기 수치범위에서 항원이 결합되지 아니한 항체-자성 나노입자와의 분리가 외부 자기장의 인가에 의해 용이하게 구현될 수 있다.The antibody-magnetic nanoparticles of the magnetic nanoparticles are any one or two or more selected from the group consisting of Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, cobalt, nickel, and alloys thereof. can, but is not limited thereto. In addition, the magnetic nanoparticles may have an average particle diameter of 0.1 to 1 μm, preferably 0.1 to 0.8 μm, and more preferably 0.1 to 0.5 μm. In the above numerical range, the antibody to which the antigen is not bound - separation from the magnetic nanoparticles can be easily implemented by the application of an external magnetic field.
상기 자성 나노입자의 평균 크기는 동적 광산란(DLS)에 의해 측정된 것을 의미한다.The average size of the magnetic nanoparticles is measured by dynamic light scattering (DLS).
상기 자성 나노입자는 후술하는 바와 같이 다관능성 링커와의 화학결합을 위해 표면에 관능기를 포함할 수 있다. 구체적인 일 예로 1차 아민기 또는 카르복실산기가 상기 자성 나노입자의 표면에 수식된 것일 수 있다.The magnetic nanoparticles may include a functional group on the surface for chemical bonding with the polyfunctional linker, as will be described later. As a specific example, a primary amine group or a carboxylic acid group may be modified on the surface of the magnetic nanoparticles.
상기 항체-자성 나노입자는 자성 나노입자의 표면과 항체가 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있으며, 바람직하게는 자성 나노입자의 표면과 항체가 다관능성 링커의 도입에 의해 공유적으로 결합되어 제조될 수 있다. 구체적으로, 자성 나노입자의 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1관능기 및 항체의 특정 치환기와 화학결합할 수 있는 제2관능기를 모두 포함하는 다관능성 링커가 선택될 수 있다. 상기 다관능성 링커의 관능기는 2 개 이상 및 4개 이하일 수 있으며, 구체적인 종류로는 카르보디이미드계 화합물 일 수 있으나 이에 제한받지 않는다. The antibody-magnetic nanoparticles may be covalently or non-covalently bonded to the surface of the magnetic nanoparticles and the antibody, and preferably, the surface of the magnetic nanoparticles and the antibody are covalently bonded by introduction of a polyfunctional linker. can be manufactured. Specifically, a multifunctional linker including both a first functional group capable of forming a chemical bond with the surface of the magnetic nanoparticles and a second functional group capable of chemical bonding with a specific substituent of an antibody may be selected. The functional group of the polyfunctional linker may be 2 or more and 4 or less, and a specific type may be a carbodiimide-based compound, but is not limited thereto.
상기 카르보디이미드계 화합물의 비한정적이며 구체적인 예로, 3-(3-다이메틸아미노프로필)-1-에틸 카르보디이미드(3-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethyl carbodiimide; EDC)나 그 염산염, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸 카르보디이미드 메트아이오다이드(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide methiodide), N-시클로헥실-3-(2-몰피노에틸)카르보디이미드 메토 -p-톨루엔술포네이트(N-cyclohexyl-3-(2-morphinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate), 1-에틸 -3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 메트아이오다이드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide methiodide; ETC) 및 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide; DIC) )로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Non-limiting and specific examples of the carbodiimide-based compound include 3-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethyl carbodiimide (3-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethyl carbodiimide; EDC) or a hydrochloride thereof; 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide methiodide (1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide methiodide), N-cyclohexyl-3-(2 -morphinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (N-cyclohexyl-3-(2-morphinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide It may be at least one selected from the group consisting of methiodide (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide methiodide; ETC) and diisopropylcarbodiimide (DIC).
상기 항체-자성 나노입자의 항체는 항원과 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 채널 영역의 하부 면에 결합되어 있는 1차 항체 (Primary antibody)와 동일한 것이 바람직할 수 있다.The antibody of the antibody-magnetic nanoparticle is an antibody that specifically binds to an antigen, and may preferably be the same as the primary antibody bound to the lower surface of the channel region.
상기 광원부 (500)는 빛의 공급원을 말한다. 상기 광원부는 발광 다이오드, 램프 등과 같은 파장 범위를 가지는 빛을 발생하는 공급원을 포함할 수 있으나 이에 제한하지는 않는다. 상기 광원부는 상기 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 부위로, 구체적으로 상기 마이크로칩의 일 측면에 위치할 수 있다. The
상기 광원부에서 입사되는 광은 연속광이거나 특정 파장의 레이저일 수 있으며, 레이저의 구체적인 일 예로 632.8nm의 He-Ne 레이저, 488nm의 Ar 레이저, 또는 532nm의 DPSS(diode pumped solid state) 타입 레이저일 수 있으나, 이는 일 예일 뿐 이에 제한받지 않는다.The light incident from the light source may be continuous light or a laser of a specific wavelength, and a specific example of the laser may be a 632.8 nm He-Ne laser, 488 nm Ar laser, or 532 nm DPSS (diode pumped solid state) type laser. However, this is only an example and is not limited thereto.
상기 산란광 검출부 (600)는 상기 광원부에 의해 조사된 광이, 상기 시료에 함유된 항원과 상기 복합체의 항체가 특이적 결합하여 생성된 결합체에 의해, 상기 미세 유체 채널 외부로 산란된 광을 검출하는 것으로, CCD 카메라 또는 일반 핸드폰 카메라로 구성될 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.The scattered
일반적으로 입자가 분산되어 있는 분산계에서, 입자가 분산되어 유동하는 영역 내에의 입자의 농도를 정량 또는 정성적으로 측정하기 위하여 사용되는 방법은 광감쇄(Light Extinction), 광산란(light scattering), 탁도(turbidity)를 측정하는 방법이 있을 수 있다. 그러나 상기 방법들 중 낮은 농도로 존재하는 입자의 농도를 측정하기 위해서는 광산란 방법이 가장 효과적이다. 상기 광산란은 입자가 분산되어 있는 용액 또는 분산액에서 광을 조사할 때 입자에 의한 발생하는 산란 현상을 의미하는 것으로, 광산란(light scattering)을 이용하여 입자의 농도를 측정할 수 있다. In general, in a dispersion system in which particles are dispersed, methods used to quantitatively or qualitatively measure the concentration of particles in a region in which particles are dispersed and flow are light attenuation, light scattering, turbidity ( There may be a way to measure turbidity. However, among the above methods, the light scattering method is the most effective for measuring the concentration of particles present at a low concentration. The light scattering refers to a scattering phenomenon occurring by particles when light is irradiated from a solution or dispersion in which the particles are dispersed, and the concentration of the particles can be measured using light scattering.
광산란 특성의 측정시 광산란되는 광의 강도를 측정하여 입자의 농도를 측정하게 되는데, 본 발명에 있어서는, 항원과 결합된 항체-자성 나노입자 복합체의 농도를 측정함으로써 시료 내에 존재하는 항원의 농도를 정량할 수 있다. When measuring the light scattering properties, the concentration of the particles is measured by measuring the intensity of light scattering. In the present invention, the concentration of the antigen present in the sample can be quantified by measuring the concentration of the antigen-bound antibody-magnetic nanoparticle complex. can
상기 산란광 검출부 (600)는 상기 마이크로칩 (300)의 상부에 위치할 수 있으며, 구체적으로 상기 마이크로칩 (300)의 면방향에 대해 90도의 방향으로 마이크로칩 (300)에 대해 이격하여 위치하는 것일 수 있다.The scattered
상기 자기장 인가부 (400)는 상기 마이크로칩의 하부에 위치하는 제1자기장 인가부 (410) 및 상부에 위치하는 제2자기장 인가부 (420)를 포함하며, 구체적으로 Helmholtz 코일을 포함하는 전자석 또는 영구자석으로 구성될 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다. 상기 자기장 인가부를 제어하여 상기 센싱영역에 인가되는 자기장의 방향과 세기를 조절하는 제어부를 더 포함할 수 있다. The magnetic field applying unit 400 includes a first magnetic
상기 제어부는 상기 마이크로칩 하부에 위치하는 제1자기장 인가부를 제어하여 상기 결합체를 상기 1차 항체에 결합시키고, 상기 마이크로칩 상부에 위치하는 제2자기장 인가부를 제어하여 결합체를 형성하지 못한 항체-자성 나노입자 복합체를 상기 하부 면으로부터 제거할 수 있다. 더욱 구체적으로 제1자기장 인가부의 자기장 세기를 강하게 조절함으로써, 시료 내의 항원과 항체-자성 나노입자 복합체의 결합속도 및 상기 결합체가 센싱영역 하부의 1차 항체와 결합하는 속도를 증가시킬 수 있어, 검출시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 제2자기장 인가부에 자기장을 인가함으로써, 상기 결합체를 형성하지 못한 항체-자성 나노입자 복합체를 센싱영역의 하부 면으로부터 제거할 수 있다. 이에 따라 센싱영역 하부 면에는 항체-자성 나노입자 복합체와 항원의 결합체가 1차 항체와 결합된 상태인 최종 반응 결과물만 존재하게 되므로, 노이즈를 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 보다 정확하게 시료 내의 항원 농도를 검출할 수 있다.The control unit controls the first magnetic field application unit located below the microchip to bind the conjugate to the primary antibody, and controls the second magnetic field application unit located above the microchip to control the first magnetic field application unit located above the microchip to prevent the formation of the antibody-magnetic The nanoparticle complex may be removed from the lower surface. More specifically, by strongly controlling the magnetic field strength of the first magnetic field applying unit, the binding rate of the antigen in the sample and the antibody-magnetic nanoparticle complex and the binding rate of the conjugate with the primary antibody under the sensing region can be increased, so that detection time can be shortened. In addition, by applying a magnetic field to the second magnetic field applying unit, the antibody-magnetic nanoparticle complex that does not form the conjugate may be removed from the lower surface of the sensing region. Accordingly, only the final reaction product in which the antibody-magnetic nanoparticle complex and the antigen binding body are bound to the primary antibody exists on the lower surface of the sensing region, thereby reducing noise and more accurately detecting the antigen concentration in the sample can do.
상기 제1자기장 인가부의 전자기력은 2 내지 1000 lbs, surface field는 3000 내지 10000 가우스, 인가시간은 1 내지 4분일 수 있다. 상기 제2자기장 인가부의 전자기력은 1 내지 800 lbs, surface field는 1000 내지 8000 가우스, 인가시간은 1 내지 4분일 수 있다. 바람직하게 제1자기장의 전자기력은 제2자기장의 전자기력보다 높은 것일 수 있다.The electromagnetic force of the first magnetic field applying unit may be 2 to 1000 lbs, the surface field may be 3000 to 10000 gauss, and the application time may be 1 to 4 minutes. The electromagnetic force of the second magnetic field applying unit may be 1 to 800 lbs, the surface field may be 1000 to 8000 gauss, and the application time may be 1 to 4 minutes. Preferably, the electromagnetic force of the first magnetic field may be higher than the electromagnetic force of the second magnetic field.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 마이크로칩은 센싱영역과 이격되어, 분석장치의 정상 작동여부를 판단할 수 있는 참조영역 (Reference zone)을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 도 4에서 도시되는 바와 같이, 상기 면역 분석 장치는 항원 및 항체의 특이적 결합반응이 일어나는 센싱영역 (210), 상기 센싱영역 (210)의 일단에 연결되는 참조영역 (220) 및 시료 주입구 (100), 상기 센싱영역 (210)의 타단에 연결되는 에어 벤트 (230), 및 상기 시료 주입구 (100), 참조영역 (220), 센싱영역 (210) 및 에어 벤트 (230)를 연결하는 미세 유체 채널 (200)을 포함하는 마이크로칩 (300); 제1자기장 인가부 (410) 및 제2자기장 인가부 (420); 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부 (500); 및 센싱영역에서 산란된 광을 검출하며, 상기 마이크로칩 (300)의 상부에 위치하는 산란광 검출부 (600)을 포함할 수 있다. The microchip according to an embodiment of the present invention may further include a reference zone that is spaced apart from the sensing zone and can determine whether the analysis apparatus is operating normally. Specifically, as shown in FIG. 4 , the immunoassay device includes a
구체적으로, 상기 참조영역은 마이크로칩의 면 방향에 위치하되, 센싱영역과 이격되어 위치하는 영역으로서 센싱영역과 동일하게 상부면에는 항체-자성 나노입자 복합체가 증착되어 있고, 하부 면에는 항원과 상기 복합체의 결합체와 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체가 고정되어 있을 수 있다. 상기 참조영역에는 이미 알고 있는 항원 농도를 포함하는 시료를 주입함으로써, 이에 따른 산란광을 검출하여 분석 장치의 정상 작동여부를 판단할 수 있다. Specifically, the reference region is located in the direction of the surface of the microchip, and is a region spaced apart from the sensing region. The same as the sensing region, the antibody-magnetic nanoparticle complex is deposited on the upper surface, and the antigen and the above are on the lower surface. A primary antibody capable of specifically binding to the conjugate of the complex may be immobilized. By injecting a sample containing a known antigen concentration into the reference region, it is possible to determine whether the analysis device operates normally by detecting the scattered light.
본 발명은 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 장치를 이용하는 면역 분석 방법을 제공하며,The present invention also provides an immunoassay method using the immunoassay device according to an embodiment of the present invention,
1) 마이크로칩의 시료 주입구에 시료를 주입하는 단계;1) injecting a sample into the sample inlet of the microchip;
2) 자기장을 인가하는 단계; 2) applying a magnetic field;
3) 광을 조사하는 단계; 3) irradiating light;
4) 상기 조사된 광의 산란광을 검출하는 단계; 및4) detecting scattered light of the irradiated light; and
5) 상기 산란광 검출 신호를 분석하는 단계; 5) analyzing the scattered light detection signal;
를 포함한다. includes
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 면역 분석 방법의 자기장을 인가하는 단계는 2-1) 제1자기장 인가부 제어를 통해 상기 결합체를 상기 1차 항체에 결합시키는 단계 및 2-2) 제2자기장 인가부 제어를 통해 결합체를 형성하지 못한 항체-자성 나노입자 복합체를 상기 마이크로칩의 하부 면으로부터 제거하는 단계를 포함할 수 있다. The step of applying the magnetic field of the immunoassay method according to an embodiment of the present invention includes 2-1) binding the conjugate to the primary antibody through the control of the first magnetic field applying unit, and 2-2) the second magnetic field. The method may include removing the antibody-magnetic nanoparticle complex that did not form a conjugate through the control of the application unit from the lower surface of the microchip.
구체적으로, 마이크로칩의 일단에 위치하는 시료 주입구에 시료를 주입하면 상기 시료는 미세 유체 채널을 통과하여 센싱영역에 도달하게 된다. 상기 센싱영역의 상부면에는 항체-자성 나노입자 복합체가 증착되어 있으므로, 상기 시료 용액이 센싱영역에 도달하게 되면, 상기 복합체가 시료 용액에 용해되면서 시료 내의 항원과 상기 복합체의 결합반응이 일어나게 된다. 이때 제1자기장을 인가하여 상기 결합체의 형성 및 상기 결합체와 센싱영역 하부 면의 1차항체의 결합반응 속도를 증가시킬 수 있다. 다음, 제1자기장 인가를 멈추고 제2자기장을 인가하여 상기 결합체를 형성하지 못한 복합체를 센싱영역을 포함하는 마이크로칩의 하부 면으로부터 제거할 수 있다. 이에 따라 센싱영역 하부 면에는 항체-자성 나노입자 복합체와 항원의 결합체가 1차 항체와 결합된 상태인 최종 반응 결과물만 존재하게 되므로, 노이즈를 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 훨씬 정확하게 시료 내의 항원 농도를 검출할 수 있다. Specifically, when a sample is injected into the sample inlet located at one end of the microchip, the sample passes through the microfluidic channel to reach the sensing region. Since the antibody-magnetic nanoparticle complex is deposited on the upper surface of the sensing region, when the sample solution reaches the sensing region, the complex is dissolved in the sample solution and a binding reaction between the antigen in the sample and the complex occurs. In this case, by applying the first magnetic field, the formation of the conjugate and the binding reaction rate of the binding body and the primary antibody on the lower surface of the sensing region may be increased. Next, by stopping the application of the first magnetic field and applying the second magnetic field, the complex in which the combination is not formed may be removed from the lower surface of the microchip including the sensing region. Accordingly, only the final reaction product in which the antibody-magnetic nanoparticle complex and the antigen-binding body are bound to the primary antibody exists on the lower surface of the sensing region, so noise can be reduced and the antigen concentration in the sample can be detected more accurately can do.
다음, 상기 최종 반응 결과물이 존재하는 센싱영역을 통과하는 광을 조사하여 조사된 광이 상기 시료에 함유된 항원과 상기 복합체의 항체가 특이적으로 결합하여 생성된 결합체에 의해, 상기 미세 유체 채널 외부로 산란된 광을 검출한 후 상기 검출된 산란광 신호를 분석하여 시료 내의 항원 농도를 검출할 수 있다. 구체적으로, 상기 산란광 검출부에 의해 검출된 이미지는 Metlab/Image 프로그램을 통해 흰색 또는 검정색을 나타내는 이미지를 세기 (Intensity)로 변환할 수 있다. 즉 알려진 항원 농도의 표준 시료로부터 산란광의 세기를 측정하고, 상기 항원 농도와 측정된 산란광 세기를 플로팅 (Plotting)하여 표준곡선 (Standard curve)을 얻을 수 있다. 다음, 상기 표준곡선을 통해 농도와 산란광 사이의 관계식을 얻은 후, 상기 관계식을 통하여 미지 시료로부터 측정된 산란광 세기로부터 상기 시료 중의 항원농도를 구할 수 있다. 상기 표준곡선은 정확도를 향상시키기 위하여, 센싱 영역의 서로 다른 최소 3개의 위치에서 각각 산란광을 측정하고 각각의 산란광으로부터 각각의 항원농도를 환산하여 평균값을 구하여 사용할 수 있다.Next, by irradiating light passing through the sensing region in which the final reaction product exists, the irradiated light is generated by the specific binding of the antigen contained in the sample and the antibody of the complex to the outside of the microfluidic channel After detecting the scattered light, the concentration of the antigen in the sample may be detected by analyzing the detected scattered light signal. Specifically, the image detected by the scattered light detector may convert an image representing white or black into intensity through a Metlab/Image program. That is, a standard curve can be obtained by measuring the intensity of scattered light from a standard sample of known antigen concentration, and plotting the antigen concentration and the measured intensity of scattered light. Next, after obtaining the relational expression between the concentration and the scattered light through the standard curve, the antigen concentration in the sample can be obtained from the scattered light intensity measured from the unknown sample through the relational expression. In order to improve accuracy, the standard curve may be used by measuring scattered light at at least three different positions of the sensing region, converting each antigen concentration from each scattered light, and obtaining an average value.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 방법에 의해, 한 번의 측정으로 상이한 여러 종류의 항원을 동시에 검출할 수 있다. 예를 들어, 면역 분석 장치의 센싱영역 하부를 세 구역으로 나누어 각각 서로 다른 세 종류의 1차 항체를 각각 고정화할 수 있다. 이에 따라 특정 항원을 포함하는 시료의 주입시 상기 센싱영역에 존재하는 특정 1차 항체와 결합하여 특정 항원의 유무 및 농도를 측정할 수 있으며, 또한 동시에 다른 항원의 유무 및 농도의 측정도 가능하게 된다.By the immunoassay method according to an embodiment of the present invention, different types of antigens can be simultaneously detected by a single measurement. For example, the lower part of the sensing region of the immunoassay device may be divided into three regions to immobilize three different types of primary antibodies, respectively. Accordingly, when a sample containing a specific antigen is injected, the presence and concentration of a specific antigen can be measured by binding to a specific primary antibody present in the sensing region, and the presence and concentration of other antigens can also be measured at the same time. .
검출 결과는 도 5와 같이 나타날 수 있으며, 각 구역의 항체-자성 나노입자 복합체, 항원 및 1차 항체의 결합체에 의한 빛의 세기로부터 각 항원의 유무 및 농도를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 면역 분석 방법은 같은 시료 내의 상이한 여러 종류의 항원을 동시에 검출할 수 있는 장점을 가질 수 있다.The detection result can be displayed as shown in FIG. 5, and the presence and concentration of each antigen can be detected from the intensity of light by the antibody-magnetic nanoparticle complex, antigen and primary antibody conjugate in each region. Therefore, the immunoassay method according to the present invention may have the advantage of simultaneously detecting different types of antigens in the same sample.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples, but these are for describing the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by the Examples below.
평균입경이 0.2㎛인 자성입자 철의 표면에 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 반응을 통하여 항체가 고정화된 항체-자성 나노입자 복합체를 제조하였다. An antibody-magnetic nanoparticle complex with an antibody immobilized thereon was prepared by EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)/NHS (N-hydroxysuccinimide) reaction on the surface of magnetic particles having an average particle diameter of 0.2㎛. prepared.
구체적으로, 항체로는 심근경색 마커 Troponin I에 특이적인 Troponin I antibody 2b를 사용하였으며, 1mg/mL 농도의 Troponin I antibody 2b를 20 μL를 준비하였다.Specifically, as the antibody, Troponin I antibody 2b specific for the myocardial infarction marker Troponin I was used, and 20 μL of Troponin I antibody 2b at a concentration of 1 mg/mL was prepared.
상기 철 자성입자는 표면에 카르복실산기로 치환된 나노입자를 사용하였으며, PBS 버퍼 내에서 14 mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다. 상기 철 자성입자 분산액에 EDC 20 mM, NHS 40 mM이 되도록 투입하고 상온에서 교반한 후, 상기 Troponin I antibody 2b 항체 수용액을 투입한 후 상온에서 6시간 더 교반하였다. 제조된 항체-자성 나노입자 복합체는 PBS 버퍼로 세 번 세척하고 원심분리하여 제조하였다. As the magnetic iron particles, nanoparticles substituted with carboxylic acid groups on the surface were used and prepared to have a concentration of 14 mg/mL in PBS buffer. After adding EDC 20 mM and NHS 40 mM to the magnetic iron particle dispersion and stirring at room temperature, the Troponin I antibody 2b antibody aqueous solution was added, followed by stirring at room temperature for 6 hours. The prepared antibody-magnetic nanoparticle complex was prepared by washing three times with PBS buffer and centrifuging.
상기 제조된 항체-자성 나노입자 복합체를 센싱영역에 해당하는 채널의 상부에 디스펜서로 캐스팅하여 상기 항체-자성 나노입자 복합체가 상부에 결합되도록 하였다.The prepared antibody-magnetic nanoparticle complex was cast with a dispenser on the upper part of the channel corresponding to the sensing region so that the antibody-magnetic nanoparticle complex was bound to the upper part.
한편 하부에는 EDC/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 상기와 동일한 반응을 통하여 상기와 동일한 항체를 고정화하여, 하부 기판에 고정화된 항체(1차 항체)를 제조하였다. 상기 센싱영역과 연결된 시료 주입구에 항원 농도 50000ng/㎖ 시료를 1.6㎕ 주입한 후, 제1자기장 인가부를 통해 복합체와 1차 항체를 결합시킨 다음 제1자기장 인가부를 끄고 제2자기장 인가부를 통해 자력을 인가하였다. 다음 LED광을 조사하여 산란광의 세기를 측정하였다.Meanwhile, by using EDC/NHS (N-hydroxysuccinimide) to immobilize the same antibody as above through the same reaction as above using EDC/NHS (N-hydroxysuccinimide), an antibody (primary antibody) immobilized on the lower substrate was prepared. After injecting 1.6 μl of a sample with an antigen concentration of 50000 ng/ml into the sample inlet connected to the sensing region, the complex and the primary antibody are bound through the first magnetic field applying unit, and then the first magnetic field applying unit is turned off and the magnetic force is applied through the second magnetic field applying unit. Approved. Then, the intensity of the scattered light was measured by irradiating the LED light.
상기와 동일한 방법으로 농도 5000ng/㎖, 500ng/㎖, 50ng/㎖, 5ng/㎖ 및 항원을 포함하지 않는 시료 (Negative control; NC)를 각각 측정한 후, 검출된 산란광의 세기와 상기 시료 중의 항원 농도 값을 플로팅 (Plotting)하였으며 그 결과를 도 6에 표시하였다. Concentrations of 5000 ng/ml, 500 ng/ml, 50 ng/ml, 5 ng/ml and an antigen-free sample (Negative control; NC) were respectively measured in the same manner as above, and then the intensity of the detected scattered light and the antigen in the sample were measured. The concentration values were plotted and the results are shown in FIG. 6 .
도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 면역 분석 장치 이용 시 항원 농도와 산란광의 세기는 일정한 관계를 나타내는 것을 알 수 있으며, 특히 저농도의 항원 포함시에도 높은 정확도로 측정가능하다는 것을 알 수 있다.As can be seen from FIG. 6 , it can be seen that the antigen concentration and the intensity of scattered light show a certain relationship when using the immunoassay device according to the present invention, and in particular, it can be seen that the antigen concentration can be measured with high accuracy even when the antigen is included at a low concentration.
100: 시료 주입구, 200: 미세 유체 채널
210: 센싱영역, 220: 참조영역
230: 에어 벤트; 300: 마이크로칩
410 제1자기장 인가부; 420: 제2자기장 인가부
500: 광원부; 600: 산란광 검출부
700: 자성 나노입자100: sample inlet, 200: microfluidic channel
210: sensing area, 220: reference area
230: air vent; 300: microchip
410 first magnetic field applying unit; 420: second magnetic field applying unit
500: light source unit; 600: scattered light detection unit
700: magnetic nanoparticles
Claims (12)
시료가 주입되는 시료 주입구 및 주입된 시료가 흐르며 자성 나노입자의 표면에 항체가 고정된 항체-자성 나노입자 복합체가 위치하는 센싱영역을 연결하는 미세 유체 채널을 포함하는 마이크로칩;
상기 마이크로칩에 이격되어 위치하는 자기장 인가부;
상기 센싱영역을 통과하는 광을 조사하는 광원부; 및
상기 센싱영역에서 산란된 광을 검출하는 산란광 검출부;
를 포함하며,
상기 센싱영역은 하부 면에 항원과 특이적으로 결합하는 1차 항체 (Primary antibody)가 고정되고,
상기 자기장 인가부는 하부에 위치하는 제1자기장 인가부 및 상부에 위치하는 제2자기장 인가부를 포함하며,
상기 제1자기장 인가부는 상기 시료에 함유된 항원과 상기 복합체의 항체가 특이적 결합하여 생성된 결합체를 상기 1차 항체에 결합시키고,
상기 제2자기장 인가부는 결합체를 형성하지 못한 복합체를 상기 센싱영역의 하부 면으로부터 제거하며,
상기 제1 및 제2 자기장 인가부의 자기장 세기는 1 내지 1000 lbs이고,
상기 산란광 검출부는 상기 마이크로칩의 상부에 위치하는 면역 분석 장치. An immunoassay device that analyzes the immune response of antigens and antibodies,
a microchip including a microfluidic channel connecting a sample inlet through which a sample is injected and a sensing region through which the injected sample flows and an antibody-immobilized antibody-magnetic nanoparticle complex is located on the surface of magnetic nanoparticles;
a magnetic field applying unit spaced apart from the microchip;
a light source unit irradiating light passing through the sensing region; and
a scattered light detector for detecting light scattered in the sensing region;
includes,
In the sensing region, a primary antibody that specifically binds to an antigen is fixed on the lower surface,
The magnetic field applying unit includes a first magnetic field applying unit located at a lower portion and a second magnetic field applying unit located at an upper portion,
The first magnetic field applying unit binds a conjugate produced by specific binding of the antigen contained in the sample to the antibody of the complex to the primary antibody,
The second magnetic field applying unit removes the complex that does not form a binder from the lower surface of the sensing region,
The magnetic field strength of the first and second magnetic field application units is 1 to 1000 lbs,
The scattered light detector is located above the microchip.
상기 산란광 검출부는 상기 광원부에 의해 조사된 광이, 상기 시료에 함유된 항원과 상기 복합체의 항체가 특이적 결합하여 생성된 결합체에 의해, 상기 미세 유체 채널 외부로 산란된 광을 검출하는 면역 분석 장치.The method of claim 1,
The scattered light detection unit is an immunoassay device that detects light irradiated by the light source unit, scattered outside the microfluidic channel by a conjugate generated by the specific binding of the antigen contained in the sample to the antibody of the complex .
상기 면역 분석 장치는 상기 자기장 인가부를 제어하여 상기 센싱영역에 인가되는 자기장의 방향과 세기를 조절하는 제어부를 더 포함하는 면역 분석 장치. The method of claim 1,
The immunoassay apparatus further comprises a control unit for controlling the magnetic field applying unit to adjust the direction and strength of the magnetic field applied to the sensing region.
상기 항체-자성 나노입자 복합체는 상기 센싱영역의 상부면에 증착되어 있는 것인 면역 분석 장치.According to claim 1,
The antibody-magnetic nanoparticle complex is an immunoassay device that is deposited on the upper surface of the sensing region.
상기 산란광 검출부는 상기 마이크로칩의 상부에 위치하는 면역 분석 장치. According to claim 1,
The scattered light detector is located above the microchip.
상기 항체-자성 나노입자의 자성 나노입자는 Fe3O4, Fe2O3, 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬, 코발트, 니켈 및 이의 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 면역 분석 장치. According to claim 1,
The antibody-magnetic nanoparticles of the magnetic nanoparticles are any one or two or more selected from the group consisting of Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, cobalt, nickel, and alloys thereof. immunoassay device.
상기 자성 나노입자는 0.1 내지 1 ㎛의 평균입경을 가지는 면역 분석 장치. According to claim 1,
The magnetic nanoparticles have an average particle diameter of 0.1 to 1 ㎛ immunoassay device.
상기 마이크로칩은 센싱영역과 이격되어, 분석장치의 정상 작동여부를 판단할 수 있는 참조영역 (Reference zone)을 더 포함하는 면역 분석 장치. According to claim 1,
The microchip further comprises a reference zone spaced apart from the sensing region to determine whether the analyzer operates normally.
1) 마이크로칩의 시료 주입구에 시료를 주입하는 단계;
2) 자기장을 인가하는 단계;
3) 광을 조사하는 단계;
4) 상기 조사된 광의 산란광을 검출하는 단계; 및
5) 상기 산란광 검출 신호를 분석하는 단계; 를 포함하는 면역 분석 방법. An analysis method using the immunoassay device of any one of claims 1, 3, 4, and 6 to 10,
1) injecting a sample into the sample inlet of the microchip;
2) applying a magnetic field;
3) irradiating light;
4) detecting scattered light of the irradiated light; and
5) analyzing the scattered light detection signal; Immunoassay method comprising a.
상기 자기장을 인가하는 단계는,
2-1) 제1자기장 인가부 제어를 통해 상기 결합체를 상기 1차 항체에 결합시키는 단계; 및
2-2) 제2자기장 인가부 제어를 통해 결합체를 형성하지 못한 항체-자성 나노입자 복합체를 상기 마이크로칩의 하부 면으로부터 제거하는 단계;
를 포함하는 면역 분석 방법.
12. The method of claim 11,
The step of applying the magnetic field,
2-1) binding the conjugate to the primary antibody by controlling the first magnetic field applying unit; and
2-2) removing the antibody-magnetic nanoparticle complex, which did not form a conjugate, from the lower surface of the microchip by controlling the second magnetic field applying unit;
Immunoassay method comprising a.
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