KR102251189B1 - Manufacturing method of polysaccharide and cosmetic composition - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계; 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법 및 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention comprises the steps of preparing cells containing polysaccharides; Crushing the cells to obtain an extract obtained by extracting the polysaccharide to the outside of the cell; And a purification step of removing at least one of crude protein, crude fat, and crude powder from the extract; and a method for preparing a functional polysaccharide comprising a functional polysaccharide as an active ingredient, and a cosmetic composition for improving skin moisturization or skin elasticity. .
Description
본 발명은 기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a functional polysaccharide and a cosmetic composition.
현재까지 생산되는 다당체는 통상적으로 보리, 인삼, 쑥, 은행 등의 식물과 클로렐라 및 일부 해조류로부터 추출되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 다당체는 식용 또는 약용버섯으로부터 추출하여 제품화한 것으로, 다당체를 추출하는 방식은 자실체나 균사체를 열수 추출하여 얻어지는 것인데, 이러한 기술적인 방식은 자실체 생산의 한계로 인한 원료 수급의 문제와 균사체에서 다당체를 추출할 경우 많은 양을 얻을 수 없는 단점이 있다. 더구나 인공배양이 되지 않는 몇몇 버섯의 경우는 자실체로부터 다당체의 대량생산 자체가 거의 불가능한 실정이다.Polysaccharides produced to date are usually extracted from plants such as barley, ginseng, mugwort, ginkgo, chlorella and some seaweed, and most of the polysaccharides currently used are extracted from edible or medicinal mushrooms and commercialized. The method is obtained by extracting the fruiting body or mycelium with hot water, and this technical method has a problem of supply and demand of raw materials due to the limitation of production of the fruiting body and the disadvantage that a large amount cannot be obtained when the polysaccharide is extracted from the mycelium. Moreover, in the case of some mushrooms that are not artificially cultured, it is almost impossible to mass-produce polysaccharides from fruiting bodies.
다당체 중 하나인 글리코겐(glycogen)은 동물의 체내에 널리 존재하는 저장 다당류의 하나로, 간이나 근육에 존재하며 세포질 속에서 물에 불용상태인 과립으로 존재하며, 간에는 2~10%, 근육에는 1~2%의 중량을 차지하고 있다. 간이나 근육의 글리코겐은 혈액 중의 포도당 값(혈당치)이나 운동량 등에 따라 변한다. 혈당치가 상승하면 글리코겐의 합성이 촉진되고, 혈당치가 저하하면 글리코겐의 분해가 촉진된다. 이에 의해 혈당치가 일정하게 유지되기 때문에 생리적 의의는 높다. 간에서 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate, G-6-P)은 효소 포스파타아제의 작용으로 인산기가 분리되고 포도당은 혈중에 방출된다. 근육에는 이 포스파타제가 없다. 그 때문에 근육의 글리코겐은 혈당치 상승에 기여하지 않는다. 근육에서는 운동에 의해 글리코겐이 분해되어 G-6-P가 생성되나 그것은 근육세포에서만 이용될 뿐이다.Glycogen, one of the polysaccharides, is one of the storage polysaccharides that exist widely in the body of animals. It exists in the liver or muscle and exists as granules that are insoluble in water in the cytoplasm, 2-10% in the liver, 1~ in the muscle. It occupies 2% of the weight. Glycogen in the liver or muscle varies depending on the blood glucose level (blood sugar level) or the amount of exercise. When the blood sugar level rises, the synthesis of glycogen is promoted, and when the blood sugar level decreases, the breakdown of glycogen is accelerated. Accordingly, the physiological significance is high because the blood sugar level is kept constant. In the liver, glucose-6-phosphate (G-6-P) is separated from the phosphate group by the action of the enzyme phosphatase, and glucose is released into the blood. Muscles do not have this phosphatase. Therefore, muscle glycogen does not contribute to an increase in blood sugar levels. In muscle, glycogen is broken down by exercise to produce G-6-P, but it is only used in muscle cells.
글리코겐의 합성 또는 분해에는 2개의 제어메커니즘이 알려졌다. 한 개는 호르몬에 의한 제어와 그 외의 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소로 작용하는 여러 가지 물질에 의한 제어이다. 호르몬으로는 인슐린이나 피질 코르티코이드는 글리코겐의 합성에, 아드레날린(adrenaline)이나 글루카곤(glucagon)은 글리코겐의 분해에 작용한다. 또 다른 물질에 의한 것으로서는 Ca2＋나 cAMP(cyclic adenosine-3' ,5'-monophosphate, cyclic AMP)가 있고, 그들이 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소의 구조를 바꿔 조절하고 있다. 이를 입체성(allosteric) 조절메커니즘이라 한다.Two control mechanisms are known for the synthesis or degradation of glycogen. One is control by hormones and other substances that act as enzymes involved in the synthesis or breakdown of glycogen. As hormones, insulin or cortical corticosteroids act on the synthesis of glycogen, and adrenaline and glucagon act on the breakdown of glycogen. Other substances are Ca2+ or cAMP (cyclic adenosine-3', 5'-monophosphate, cyclic AMP), and they change the structure of enzymes involved in the synthesis or decomposition of glycogen. This is called an allosteric control mechanism.
글리코겐의 구조는 포도당 분자가 나뭇가지 모양으로 결합되어 있다. 그와 같은 의미로 글리코겐을 식물 전분이라고도 한다. 분자량은 백만 내외이다. 구조는 포도당 분자가 α-1,4 배당체(glycoside) 결합을 하여 10여 개 연속해있는 곳에 α-1,6 배당체 결합으로 다른 포도당 분자가 결합되고 거기에서 다시 α-1,4 배당체 결합으로 포도당 분자가 결합되어 글리코겐은 나뭇가지 모양을 하게 된다. 이 구조는 아밀로펙틴(amylopectin)과 유사하나 가지의 수는 글리코겐이 더 많고 가지의 길이는 더 짧다. 요오드 반응에서는 전분이 보라색 또는 적자색을 보이는 데 대하여 글리코겐은 적색 또는 갈색을 나타낸다. In the structure of glycogen, glucose molecules are bonded in the shape of branches. In the same sense, glycogen is also called plant starch. The molecular weight is around one million. The structure is that glucose molecules are linked to α-1,4 glycosides, and other glucose molecules are bound by α-1,6 glycoside bonds in 10 consecutive places, and from there, glucose molecules are bonded to α-1,4 glycosides again. Molecules are bonded together to give glycogen the shape of a branch. This structure is similar to amylopectin, but the number of branches is more glycogen and the length of branches is shorter. In the iodine reaction, starch appears purple or reddish-purple, while glycogen appears red or brown.
한편, 한국공개특허 제2010-0095829호에는 '글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0700910호에는 '알칼리-용해성 β-글루칸을 생산하는 효모 변이주'에 대해 개시하고 있다.On the other hand, Korean Patent Publication No. 2010-0095829 discloses'a mutant of Saccharomyces cerevisiae producing glutathione at a high concentration and a method for mass-producing glutathione by culturing the same.' The issue discloses'a yeast mutant that produces an alkali-soluble β-glucan'.
이렇듯 생산성을 증대시키기 위한 방법의 하나로 세포 배양 방법을 이용한 다당체의 생산 기술이 연구되고 있으나, 세포로부터 다당체를 얻는 데 있어서, 다당체의 순도가 낮아 활성이 떨어지며, 원치 않는 성분으로 인한 세포, 피부 독성을 야기하는 문제가 있다.As one of the methods to increase productivity as described above, the production technology of polysaccharides using the cell culture method is being studied, but in obtaining polysaccharides from cells, the purity of the polysaccharides is low, and the activity decreases, and cell and skin toxicity due to unwanted ingredients is reduced. There is a problem that causes.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여, 고농도, 고순도로 기능성 다당체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for producing a functional polysaccharide with high concentration and high purity in order to solve the above problems.
또한, 고순도의 기능성 다당체를 유효성분으로 하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, it is an object of the present invention to provide a cosmetic composition for moisturizing skin or improving skin elasticity, using a functional polysaccharide of high purity as an active ingredient.
상기의 과제를 해결하기 위한 수단으로서,As a means for solving the above problems,
본 발명은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계; 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of preparing cells containing polysaccharides; Crushing the cells to obtain an extract obtained by extracting the polysaccharide to the outside of the cell; And a purification step of removing at least one of crude protein, crude fat, and crude powder from the extract.
또한, 상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 다당체를 고생산하는 대장균 변이체 TBP38 균주를 배양하여 균체를 준비하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.In addition, the step of preparing the cells containing the polysaccharide provides a method of preparing a functional polysaccharide by culturing the E. coli mutant TBP38 strain that produces a high polysaccharide.
또한, 상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는, 상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.In addition, in the step of obtaining an extract obtained by crushing the cells to extract the functional polysaccharide to the outside of the cell, the cells are suspended in a citric acid buffer solution in the range of pH 3.5 to 4.5, and then the cells are crushed using high pressure treatment to extract the functional polysaccharide to the outside of the cell. It provides a method for producing a functional polysaccharide.
또한, 상기 정제 단계는, 상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리하는 단계; 구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로 조절하고 침전물을 제거하는 단계; 디터전트(detergent)를 첨가하여 층분리를 한 후 원심분리를 통해 상등액을 회수하는 단계; 상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하고 농축하여 농축액을 얻는 단계; 상기 농축액에 1 내지 5배 부피의 주정을 첨가하여 침전물을 회수하는 단계; 및 상기 침전물을 증류수 또는 탈이온수에 재부유한 후 1 내지 5배 부피의 주정을 재첨가하고 침전물을 회수하는 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.In addition, the purification step, the step of heat-treating the extract for 5 minutes to 60 minutes at 80 to 100 °C; Adding citric acid to adjust the pH to 3.5 to 4.5 and remove the precipitate; Separating layers by adding detergent and recovering the supernatant through centrifugation; Filtering the recovered supernatant through an ultra-fine filter and concentrating to obtain a concentrated solution; Recovering the precipitate by adding 1 to 5 times the volume of alcohol to the concentrate; And re-suspending the precipitate in distilled water or deionized water, and then re-adding 1 to 5 times the volume of alcohol and recovering the precipitate.
또한, 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하인 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.In addition, it provides a method for producing a functional polysaccharide in which the content of each of crude protein, crude fat, and crude powder is 0.5% or less.
또한, 상기 다당체는 글리코겐이며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 갖는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.In addition, the polysaccharide is glycogen, and provides a method for producing a functional polysaccharide having a purity of 99% or more based on solid content.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 기능성 다당체로서, 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하이고, 고형분 기준으로 99% 이상이 글리코겐인 기능성 다당체를 제공한다.The present invention also provides a functional polysaccharide prepared by the above method, wherein the content of each of crude protein, crude fat, and crude powder is 0.5% or less, and 99% or more is glycogen based on solid content.
또한, 항산화 활성을 갖는 기능성 다당체를 제공한다.In addition, it provides a functional polysaccharide having antioxidant activity.
또한, 1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않는 기능성 다당체를 제공한다.In addition, at a concentration of 1000 μg/ml or less, it provides a functional polysaccharide that does not have phototoxicity to the BALB/3T3 clone A31 cell line.
본 발명은 또한, 상기 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for skin moisturizing or skin elasticity improvement containing the functional polysaccharide as an active ingredient.
본 발명은 다당체를 99% 이상의 고순도로 제조할 수 있는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a functional polysaccharide capable of producing a polysaccharide with a high purity of 99% or more.
또한, 항산화 활성, 피부 보습, 피부 탄력 개선 기능이 있으면서, 세포 독성, 피부 독성, 광독성이 없거나 현저히 낮은 기능성 다당체 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, it provides a functional polysaccharide having no or remarkably low cytotoxicity, skin toxicity, phototoxicity, and a cosmetic composition comprising the same, while having antioxidant activity, skin moisturizing, and skin elasticity improvement functions.
상기의 효과 및 추가적 효과에 대하여 아래에서 자세히 서술한다.The above effects and additional effects are described in detail below.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 기능성 다당체 제조방법 수순도이다.1 is a flow chart of a method for producing a functional polysaccharide according to an embodiment of the present invention.
이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Before describing the present invention in detail below, it is understood that the terms used in the present specification are for describing specific embodiments and are not intended to limit the scope of the present invention, which is limited only by the scope of the appended claims. shall. All technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art unless otherwise stated.
본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.Throughout this specification and claims, unless otherwise stated, the term "comprise, comprises, comprising" means to include the recited object, step or group of objects, and steps, and any other object It is not used in the sense of excluding a step, a group of objects, or a group of steps.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 이하, 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.On the other hand, various embodiments of the present invention may be combined with any other embodiments unless clearly indicated to the contrary. Hereinafter, embodiments of the present invention and effects thereof will be described.
본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체의 제조방법은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계, 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계를 포함한다.A method for preparing a functional polysaccharide according to an embodiment of the present invention includes preparing a cell containing a polysaccharide, obtaining an extract obtained by crushing the cell to extract the polysaccharide to the outside of the cell, and among crude protein, crude fat, and crude powder from the extract. And a purification step of removing at least one or more.
상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 다당체를 고생산하는 대장균 변이체 TBP38 균주를 배양하여 균체를 준비한다. 또한, 상기 균주 이외에 사용 가능한 균주로서, 기탁번호가 KCTC18748P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) CEY1 변이 균주, 기탁번호가 KCTC18749P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주 등을 들 수 있다.In the step of preparing the cells containing the polysaccharide, the cells are prepared by culturing the E. coli mutant TBP38 strain that produces high polysaccharides. In addition, as a strain that can be used in addition to the above strain, the accession number is KCTC18748P, the Saccharomyces cerevisiae CEY1 mutant strain that produces high glycogen, the accession number is KCTC18749P, and the Saccharomyces high-producing glycogen Saccharomyces boulardii CEY2 mutant strain, etc. are mentioned.
배양 방법 및 사용 배양액은 제한되지 않는다. 일례로, 다단 배양 방식일 수 있다. 1차 배양시에는 1차 탄소원으로 글루코오스를 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 1~3g/L (NH4)2·HPO4, 6~9g/L KH2PO4, 0.5~1.5g/L 시트르산, 0.5~1g/L MgSO4·7H2O, 15~25g/L 글루코오스 및 미량 금속 용액을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 2차 배양은 1차 배양후 2차 탄소원을 첨가한 후 20~30시간 동안 배양하고 배양된 균체를 획득할 수 있다. 2차 탄소원으로는 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 말토트리오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose), 말토펜파오스(maltopentaose) 및 말토헥사오스(maltohexaose)로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 2차 탄소원은 옥수수전분 당화액 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The culture method and the culture medium used are not limited. For example, it may be a multi-stage culture method. In the first culture, a medium containing glucose as a primary carbon source can be used, and 1~3g/L (NH 4 ) 2 ·HPO 4 , 6~9g/L KH 2 PO 4 , 0.5~1.5g/L citric acid , 0.5 ~ 1g / L MgSO 4 · 7H 2 O, 15 ~ 25g / L may be a medium containing a glucose and trace metal solution, but is not limited thereto. The secondary culture can be cultured for 20 to 30 hours after the secondary carbon source is added after the primary culture and cultured cells can be obtained. The secondary carbon source may be one consisting of glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, and maltohexaose, but is limited thereto. It doesn't work. The secondary carbon source may be corn starch saccharified liquid powder, but is not limited thereto.
다음, 상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는, 상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 것일 수 있다. 바람직한 pH 범위는 3.9 내지 4.1일 수 있다. 한편, 고압처리 대신에 초음파 처리로 세포를 파쇄할 수도 있으며 제한되지 않는다. 고압처리는 homogenizer를 이용하여 1200 psi에서 연속적으로 2차례 고압처리를 하여 세포를 파쇄하는 것일 수 있다.Next, the step of crushing the cells to obtain an extract obtained by extracting the functional polysaccharide to the outside of the cell is to suspend the cells in a citric acid buffer solution in the range of pH 3.5 to 4.5, and then disrupt the cells using high pressure treatment to extract the functional polysaccharide to the outside of the cells. It can be. A preferred pH range may be 3.9 to 4.1. On the other hand, cells may be disrupted by ultrasonic treatment instead of high-pressure treatment, but is not limited thereto. The high-pressure treatment may be to disrupt the cells by continuously performing two high-pressure treatments at 1200 psi using a homogenizer.
다음, 상기 정제 단계는, 기능성 다당체를 고순도로 얻는 과정이다. Next, the purification step is a process of obtaining a functional polysaccharide with high purity.
먼저, 상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리할 수 있다. 그 후 구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로, 바람직하게는 pH 범위는 3.9 내지 4.1로 조절한다. 이를 통해 단백질, 세포 파괴물 등이 침전되게 되며, 이를 반연속식의 tubular type의 원심분리기 등을 이용하여 상등액을 회수하여 1차 불순물을 제거할 수 있다.First, the extract may be heat-treated at 80 to 100 °C for 5 minutes to 60 minutes. Thereafter, citric acid is added to adjust the pH to 3.5 to 4.5, preferably to 3.9 to 4.1. Through this, proteins and cell debris are precipitated, and primary impurities can be removed by recovering the supernatant using a semi-continuous tubular type centrifuge.
다음 엔도톡신(endotoxin) 제거를 위해, 회수한 상등액에 디터전트(detergent)를 사용할 수 있다. 일례로 Triton X-114 등을 들 수 있으며, 제한되지 않는다. 디터전트를 0.1% 내지 5%(v/v) 농도로 첨가하고 혼합한 후 30 내지 40°C에서 충분히 방치시켜 층분리가 일어나도록 한 후, 원심분리(12000 rpm, 30 °C, 15 min)를 이용하여 상등액을 회수한다. 이후 필요에 따라 디터전트를 다수, 바람직하게는 2회 재처리하여 상등액을 회수함으로써 불순물을 더욱 제거할 수 있다.For the next endotoxin removal, a detergent may be used in the recovered supernatant. Examples include Triton X-114, and the like, but is not limited thereto. Detergent was added at a concentration of 0.1% to 5% (v/v), mixed, and allowed to stand at 30 to 40 °C sufficiently to cause layer separation, followed by centrifugation (12000 rpm, 30 °C, 15 min) Use to recover the supernatant. Subsequently, if necessary, a plurality of detergents, preferably twice, are reprocessed to recover the supernatant, thereby further removing impurities.
그 후 상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하여 미세 크기의 단백질 및 DNA 등의 핵산을 제거할 수 있다. 초미세 필터로는 제한되지 않으나 300 kDa size membrane 이상의 초미세 필터를 사용할 수 있다. 여과가 완료된 후 농축할 수 있다.Thereafter, the recovered supernatant may be filtered through an ultrafine filter to remove fine-sized proteins and nucleic acids such as DNA. It is not limited to an ultra-fine filter, but an ultra-fine filter of 300 kDa size membrane or more can be used. After filtration is complete, it can be concentrated.
그 후 농축액에 1 내지 5배 부피(v/v)의 주정을 첨가한 후 원심분리(12000 rpm, 4°C, 15 min)하여 침전물(기능성 다당체 함유)을 회수할 수 있다. 보다 고순도를 얻기 위해, 침전물을 증류수에 재부유한 후, 1 내지 5배 부피(v/v)의 주정을 재첨가하고 원심분리하여 침전물을 회수할 수 있다. 침전물은 동결건조를 진행하여 최종적으로 고순도의 기능성 다당체를 획득할 수 있다.Then, after adding 1 to 5 times the volume (v/v) of alcohol to the concentrate, the precipitate (containing functional polysaccharide) can be recovered by centrifugation (12000 rpm, 4°C, 15 min). In order to obtain higher purity, the precipitate may be resuspended in distilled water, and then 1 to 5 times the volume (v/v) of alcohol may be re-added and centrifuged to recover the precipitate. The precipitate can be freeze-dried to finally obtain a high-purity functional polysaccharide.
상기 과정으로 얻어진 기능성 다당체는 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 중량 기준 0.5% 이하이며, 더욱 구체적으로는 조단백질이 0.50% 이하, 조지방이 0.1% 이하, 조회분이 0.45% 이하로 매우 고순도로 기능성 다당체를 얻을 수 있으며, 기능성 다당체는 주로 글리코겐일 수 있으며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 가질 수 있다.The functional polysaccharide obtained by the above process has a content of each of crude protein, crude fat, and crude powder of 0.5% or less by weight, and more specifically, crude protein of 0.50% or less, crude fat of 0.1% or less, and crude content of 0.45% or less, with very high purity. A functional polysaccharide may be obtained, and the functional polysaccharide may be mainly glycogen, and may have a purity of 99% or more based on solid content.
한편, 후술하는 실시예에서 보듯이, 본 발명에 따른 고순도 기능성 다당체는 항산화 활성을 가지며, 1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않으며, 기타 피부 독성, 세포 독성이 현저히 낮다.On the other hand, as shown in the examples to be described later, the high-purity functional polysaccharide according to the present invention has antioxidant activity, does not have phototoxicity to the BALB/3T3 clone A31 cell line at a concentration of 1000 μg/ml or less, and other skin toxicity, cytotoxicity. Is remarkably low.
또한, 본 발명의 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부 보습, 피부 탄력 개선 성능이 매우 우수하다. In addition, the cosmetic composition containing the functional polysaccharide of the present invention as an active ingredient has excellent skin moisturizing and skin elasticity improvement performance.
화장료 조성물의 제형은 제한되지 않으며, 공지의 제형을 사용할 수 있다.The formulation of the cosmetic composition is not limited, and a known formulation may be used.
상기 화장료 조성물을 포함하는 스킨 및 바디 케어 화장품으로서 에센스, 앰플, 비누, 토닉 및 바디 에센스, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 분말 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 전체 화장품에 대하여 0.05 내지 100 wt%로 포함되고, 앰플 제형의 경우 상기 기능성 조성물 100%로 이루어진 것일 수 있다.As skin and body care cosmetics containing the cosmetic composition, essences, ampoules, soaps, tonics and body essences, emulsions, lotions, creams (oil-in-water, water-in-oil, multi-phase), solutions, suspensions (anhydrous and water-based), It can be prepared in various formulations such as anhydrous products (oil and glycol-based), gels, powders, etc., and the cosmetic composition is contained in an amount of 0.05 to 100 wt% based on the total cosmetics, and in the case of an ampoule formulation, the functional composition is 100%. Can be.
상기 화장료 조성물은 기능성 다당체 이외에 피부 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로서는 알콜, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등이 예시될 수 있다.In addition to the functional polysaccharide, the cosmetic composition may include a carrier acceptable in a skin cosmetic preparation. Examples of the carrier include alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, preservatives, wetting agents, moisturizers, viscosity modifiers, emulsions, stabilizers, sunscreens, color developing agents, fragrances, diluents, and the like.
상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등으로 사용될 수 있는 구체적인 화합물 또는 조성물은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 화합물 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.Specific compounds or compositions that can be used as the alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, preservatives, wetting agents, moisturizing agents, viscosity modifiers, emulsions, stabilizers, sunscreens, coloring agents, fragrances, diluents, etc. are already known in the art. Therefore, those skilled in the art can select and use the appropriate compound or composition.
여기서 몇 가지를 예시하여 보면, 알콜로서는 고급 알콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 다가 알콜 등을 들 수 있고, 오일로서는 아보가드유, 팜유, 우지, 호호바유 등을 들 수 있고, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤 등을 들 수 있으며, 보습제로서는 히알론산, 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 피롤리돈카복실산염 등을 들 수 있으며, 희석제로서는 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다.Here, some examples are given. Examples of alcohols include water-soluble polyhydric alcohols such as higher alcohols, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, sorbitol, and polyethylene glycol, and examples of oils include avocado oil, palm oil, tallow, Jojoba oil, etc., as preservatives, ethylparaben, butylparaben, and the like, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, and pyrrolidone carboxylate as a moisturizing agent, and ethanol, isopropanol, etc. as a diluent. Can be mentioned.
더욱 구체적으로 기능성 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.More specifically, if the formulation of a functional cosmetic is a paste, cream, or gel, as a carrier component, animal fiber, plant fiber, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivatives, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, or zinc oxide, etc. Can be used.
또한 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.In addition, when the formulation is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component. In particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane/butane Or a propellant such as dimethyl ether.
또한 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.In addition, when the formulation is a solution or emulsion, a solvent, a solvating agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3 -Butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan.
또한 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In addition, when the formulation is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, Aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, and the like can be used.
또한 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다In addition, when the formulation is a surfactant containing cleansing, as a carrier component, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide ether sulfate , Alkylamidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, linoline derivative or ethoxylated glycerol fatty acid ester, etc. may be used.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체를 포함하는 비누의 경우, 비누 기재에 기능성 다당체를 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수 연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.In addition, in the case of a soap containing a functional polysaccharide according to an embodiment of the present invention, it may be prepared by including a functional polysaccharide in a soap base, and may be prepared by including a skin moisturizer, an emulsifier, a water softener, and the like as an additive.
상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.As the soap base, vegetable oils such as palm oil, palm oil, soybean oil, perm oil, olive oil, palm kernels, or animal oils such as tallow, pig fat, yangji, fish oil, etc. can be used, and as the skin moisturizer, glycerin, erythritol, polyethylene glycol , Propylene glycol, butylene glycol, pentylene glycol, hexyl glycol, isopropyl myristate, silicone derivatives, aloe vera, sorbitol, etc. may be used, and as the emulsifier, natural oils, wax fatty alcohols, hydrocarbons, natural plant extracts, etc. May be used, and as the water softener, tetrasodium EDTIA or the like may be used.
본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.The soap composition of the present invention may further include an antimicrobial agent, a dispersant, a foam inhibitor, a solvent, a scale inhibitor, a corrosion inhibitor, a fragrance, a colorant, a metal ion sequestering agent, an antioxidant, a preservative, and the like as an additive.
이하, 본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물을 실시예를 통해 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a method for producing a functional polysaccharide and a cosmetic composition according to an embodiment of the present invention will be described in detail through examples. The following examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 기능성 다당체의 제조<Example 1> Preparation of functional polysaccharide
기능성 다당체 추출Functional polysaccharide extraction
기능성 다당체를 고생산하는 대장균(Escherichia coli) 변이체 TBP38 균주를 1차 탄소원으로 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양한 배양액에 2차 탄소원을 첨가한 후 20~30시간 동안 배양하고 배양된 균체를 획득하였다. Escherichia , a high-producing functional polysaccharide coli ) The mutant TBP38 strain was cultured for 20 to 30 hours after adding a secondary carbon source to the culture medium containing glucose as the primary carbon source, and cultured cells were obtained.
고농도로 세포 배양을 통해 획득한 상기 균체로부터 다당체를 추출하기 위해 먼저, 원심분리를 통해 획득한 균체를 pH 4.0 구연산 완충용액으로 재부유시켰다. 이후 homogenizer를 이용하여 1200 psi에서 연속적으로 2차례 고압처리를 하여 세포를 파쇄 후 기능성 다당체를 세포 외로 추출하여 추출액을 얻었다.In order to extract polysaccharides from the cells obtained through cell culture at a high concentration, first, the cells obtained through centrifugation were resuspended in a pH 4.0 citric acid buffer solution. Subsequently, the cells were crushed by high pressure treatment at 1200 psi continuously twice using a homogenizer, and then the functional polysaccharide was extracted outside the cells to obtain an extract.
기능성 다당체 정제Functional polysaccharide purification
기능성 다당체 추출액에 함유되어 있는 조단백질, 조지방, 조회분 등을 제거하여 정제하기 위해, 먼저 90°C에서 20분간 열처리한 후 구연산을 첨가하여 추출액의 pH를 4.0으로 맞추었다. 이후 침전된 단백질, 세포 파괴물(cell debris) 등을 제거하기 위해 반연속식의 tubular type의 원심분리기를 이용하여 상등액을 회수하였다. 엔도톡신(endotoxin) 제거를 위해, 회수한 상등액에 디터전트(detergent)로서 Triton X-114를 1%(v/v)농도로 첨가 후 37°C에 충분히 방치시켜 층분리가 충분히 일어나도록 방치시킨 후 원심분리(12000 rpm, 30 °C, 15 min)를 진행하였고, 회수한 상등액에 Triton X-114를 1%(v/v)농도로 2회 재처리하여 총 3회 처리 후 원심분리를 통하여 상등액을 회수하였다. Ultra filtration(300 kDa size membrane)을 이용하여 회수한 상등액에 잔여하고 있는 작은 크기의 단백질 및 DNA 등의 핵산을 여과하여 제거하고 농축시켰다. 상기 농축액에 2배 부피(v/v)의 주정을 첨가한 후 원심분리(12000 rpm, 4°C, 15 min)하여 침전물(기능성 다당체 함유)을 회수하였다. 그 후 침전물을 증류수에 재부유한 후, 2배 부피(v/v)의 주정을 재첨가하고 원심분리하여 침전물을 회수한 다음 동결건조를 진행하여 기능성 다당체를 획득하였다.In order to purify by removing the crude protein, crude fat, and crude powder contained in the functional polysaccharide extract, it was first heat-treated at 90 °C for 20 minutes, and then citric acid was added to adjust the pH of the extract to 4.0. Afterwards, the supernatant was recovered using a semi-continuous tubular type centrifuge to remove precipitated proteins and cell debris. To remove endotoxin, add Triton X-114 as a detergent to the recovered supernatant at a concentration of 1% (v/v), and then leave it at 37°C to allow sufficient layer separation. Centrifugation (12000 rpm, 30 °C, 15 min) was performed, and Triton X-114 was retreated twice at a concentration of 1% (v/v) to the recovered supernatant, treated a total of 3 times, and then centrifuged the supernatant. Was recovered. Using ultra filtration (300 kDa size membrane), nucleic acids such as small protein and DNA remaining in the recovered supernatant were filtered off and concentrated. After adding twice the volume (v/v) of alcohol to the concentrate, the precipitate (containing a functional polysaccharide) was recovered by centrifugation (12000 rpm, 4 °C, 15 min). Thereafter, the precipitate was resuspended in distilled water, and then twice the volume (v/v) of alcohol was re-added, centrifuged to recover the precipitate, and then freeze-dried to obtain a functional polysaccharide.
<실시예 2><Example 2>
상기 실시예 1에서, 대장균(Escherchia coli) 변이체 TBP38 균주 대신에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) CEY1 변이 균주를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 기능성 다당체를 획득하였다.In Example 1, a functional polysaccharide was obtained in the same manner as in Example 1, except that Saccharomyces cerevisiae CEY1 mutant strain was used instead of the Escherchia coli variant TBP38 strain.
<비교실시예 1><Comparative Example 1>
상기 실시예 1에서, 상기 기능성 다당체 정제 방법 대신에, 획득한 배양된 균체에 110~130℃ 및 10~30psi의 조건으로 20~60분 동안 고온고압 처리한 후 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전시킨 다음, 침전물로부터 다당체를 여과하여 기능성 다당체를 획득하였다.In Example 1, instead of the method for purifying the functional polysaccharide, the obtained cultured cells were subjected to high temperature and high pressure treatment for 20 to 60 minutes under conditions of 110 to 130°C and 10 to 30 psi, and then ethanol was added to precipitate the polysaccharide. , The polysaccharide was filtered from the precipitate to obtain a functional polysaccharide.
<실시예 3> 순도 측정<Example 3> Purity measurement
<실시예 3-1> 수분 함량 측정(가열 감량법)<Example 3-1> Moisture content measurement (heating loss method)
사용 기구로서, 건조기(drying oven), 데시케이터(desiccator), 알루미늄 칭량병(crucible), 저울 (balance)을 사용하였다.As used equipment, a drying oven, a desiccator, an aluminum crucible, and a balance were used.
미리 건조하여 항량을 구한 알루미늄제 칭량병에 시료 2~5g을 정확히 칭량하여 항온건조기로 135±2℃로 정확히 2시간 또는 105~110℃에서 항량이 될 때까지 건조시켜 데시케이터내에서 30분간 방냉한 다음 무게를 달아 감량을 수분함량으로 하였으며, 수분 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.Accurately weigh 2 to 5 g of a sample in a weighing bottle made of aluminum that has been dried in advance to obtain a constant weight, and then dried with a constant temperature dryer at 135±2°C for exactly 2 hours or at 105 to 110°C until the constant weight is reached, and allowed to cool in a desiccator for 30 minutes. Then, the weight loss was determined as the moisture content, and the moisture content was calculated and expressed as follows.
<실시예 3-2> 조단백질 함량 측정(자동 분석법, kjeltec method)<Example 3-2> Measurement of crude protein content (automatic analysis method, kjeltec method)
사용기구 및 시약으로서, 분해장치, 시료주입 및 증류장치, 화학천평, 자석교반기, 메스플라스크, 메스실린더, 분해병, 분해병스탠드, 시약 분주기, 황산(시약 1급)을 사용하였다. As the instruments and reagents used, a digestion apparatus, a sample injection and distillation apparatus, a chemical balance, a magnetic stirrer, a volumetric flask, a measuring cylinder, a digestion bottle, a digestion bottle stand, a reagent dispenser, and sulfuric acid (reagent class 1) were used.
시약의 조제로서, 1 N 염산 : 농염산(비중 1.18) 87 ㎖를 증류수로 희석 10 ℓ로 하고 다음의 식과 같이 factor를 구하였다.To prepare a reagent, 87 ml of 1 N hydrochloric acid: concentrated hydrochloric acid (specific gravity 1.18) was diluted with distilled water to 10 liters, and the factor was calculated as shown in the following equation.
factor 구하는 방법으로, 표준탄산나트륨(Sodium carbonate)을 260~270℃에서 약 1시간 동안 가열한 다음 데시케이터 내에서 30분간 방냉하여 이 중에서 1.5 g을 정확히 칭량하고 증류수로 용해 후 250 ㎖ 메스 플라스크의 표선을 ??추고 혼합한 후 이 중 25 ㎖를 취하여 메틸 오렌지(Methyl orange) 두 방울을 가하고 0.1N 염산을 서서히 떨어뜨려 황색에서 담홍색이 될 때 일단 2~3분간 끓이고 냉각 후 다시 담홍색이 될 때까지 적정함. 이 때 소비된 0.1 N 염산용액의 소비 ㎖로부터 0.1 N 염산용액의 factor를 구하였다.As a method of determining the factor, standard sodium carbonate is heated at 260~270℃ for about 1 hour, then allowed to cool in a desiccator for 30 minutes, and 1.5 g of it is accurately weighed and dissolved in distilled water. After adding and mixing the mark, take 25 ml of it, add two drops of methyl orange, slowly drop 0.1N hydrochloric acid, and boil it for 2~3 minutes when it turns from yellow to pink. After cooling, it becomes pink again. Appropriate to. At this time, the factor of 0.1 N hydrochloric acid solution was calculated from the consumed ㎖ of 0.1 N hydrochloric acid solution.
- 분해촉진제 : 황산칼륨(Potassium sulfate : K2SO4) 10 g에 황산동(Copper sulfate : CuSO45H2SO) 1 g의 비율로 유발에서 완전히 혼합하여 제조하였다.-Decomposition accelerator: Potassium sulfate (K2SO4) 10 g and copper sulfate (Copper sulfate: CuSO45H2SO) 1g in the ratio of 1g was prepared by thoroughly mixing in a mortar.
- 40% 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨(Sodium hydroxide : NaOH) 4 ㎏을 증류수에 녹여 10 ℓ로 제조하였다.-40% sodium hydroxide solution: 4 kg of sodium hydroxide (NaOH) was dissolved in distilled water to make 10 ℓ.
- 1% 붕산용액 : 붕산(Boric acid : H3BO3) 100 g을 증류수에 용해하여 10 ℓ로 하고 여기에 브로모크레졸 그린과 메틸레드 용액(Bromocresol green 100 ㎎과 Methyl red 100 ㎎을 각각 Methanol 100 ㎖에 용해) 각각 100 ㎖와 70 ㎖를 가하여 제조하였다.-1% boric acid solution: 100 g of boric acid (H3BO3) is dissolved in distilled water to make 10 ℓ, and bromocresol green and methyl red solution (100 mg of bromocresol green and 100 mg of methyl red) are added to 100 ml of methanol, respectively. Dissolution) was prepared by adding 100 ml and 70 ml, respectively.
- 시료액의 조제(분해)-Preparation (decomposition) of sample solution
실시예 1, 실시예 2 및 비교실시예 1의 시료 0.7~1 g을 분해병에 취하고 분해촉진제 7~8 g을 가하여 잘 혼합한 다음, 황산(Sulfuric acid, H2SO4) 10 ㎖를 서서히 가해서 혼합하였다. 이를 처음에는 거품이 넘치지 않도록 서서히 가열하다가 거품이 나지 않으면 투명하게 될 때까지 강하게 가열하여 분해시켜주었다. 이후 자동분석기의 작동방법에 따라 조단백질을 측정하였다.0.7 to 1 g of samples of Example 1, Example 2 and Comparative Example 1 were taken in a decomposition bottle, 7 to 8 g of a decomposition accelerator was added to mix well, and then 10 ml of sulfuric acid (H2SO4) was slowly added and mixed. . At first, it was gradually heated so that the bubbles did not overflow, and when bubbles did not occur, it was strongly heated until it became transparent and decomposed. After that, the crude protein was measured according to the operation method of the automatic analyzer.
<실시예 3-3> 조지방 함량 측정(에터 추출법)<Example 3-3> Measurement of crude fat content (ether extraction method)
사용기구로서, 지방 추출장치(FOSS, Soxtec 1043), 건조기, 데시케이터, No. 2 여과지, 에칠 에터 등을 사용하였다.As used equipment, fat extraction device (FOSS, Soxtec 1043), dryer, desiccator, No. 2 Filter paper, ethyl ether, and the like were used.
지방 정량법을 95~100°C에서 2시간 정도 건조하고 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 칭량하고 시료 1~2 g을 원통여지에 넣고 탈지면으로 막은 다음 95~100°C에서 2시간 정도 건조시켰다. 그 후 지방 추출장치에 넣고 에칠 에터를 부어 110°C로 가열하여 1시간 지방을 추출한 다음 에칠 에터를 회수하고 지방 정량컵을 95~100°C에서 3시간 건조 후 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 칭량하여 지방 정량병의 중량을 감한 것을 시료량에 대한 백분율을 구하여 조지방 함량으로 계산하였다.The fat determination method was dried at 95~100°C for 2 hours, allowed to cool in a desiccator for 30 minutes, weighed, put 1~2 g of a sample in a cylindrical filter, covered with cotton wool, and dried at 95~100°C for 2 hours. . After that, put it in a fat extractor, pour ethyl ether, heat it to 110°C to extract fat for 1 hour, recover the ethyl ether, dry the fat measuring cup at 95~100°C for 3 hours, and then cool it in a desiccator for 30 minutes. After weighing and subtracting the weight of the fat determination bottle, the percentage of the sample amount was calculated and calculated as the crude fat content.
조지방 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.The crude fat content was calculated and expressed as follows.
<실시예 3-4> 조회분 함량 측정<Example 3-4> Measurement of crude powder content
사용기구로서, Electric muffle furnace(600°C로 유지), Porcelain crucible, desiccator with silica gel desiccant, metal tong, balance 등을 사용하였다.As a tool for use, an electric muffle furnace (maintained at 600°C), Porcelain crucible, desiccator with silica gel desiccant, metal tong, balance, etc. were used.
깨끗이 씻은 crucible을 600°C의 muffle furnace에서 1~2 시간 동안 방치한 후 desiccator에 옮겨 실온까지(40분간) 방냉하고 중량을 측정하였다. 시료 1~2 g을 정확히 취해 crucible에 담고, 전기곤로 또는 가스버너로 열을 가하여 예비회화 시킨 후 600°C의 muffle furnace에서 2시간 동안 회화시켰다. 이때 회분의 색이 white, light grey 또는 reddish색을 띄도록 하였다. 그 후 desiccator에서 40분간 방냉 후 중량을 측정하였다.The washed crucible was left for 1 to 2 hours in a muffle furnace at 600°C, transferred to a desiccator, allowed to cool to room temperature (40 minutes), and the weight was measured. 1~2 g of a sample was accurately taken and placed in a crucible, preliminarily ignited by heating with an electric stove or gas burner, and then incinerated for 2 hours in a muffle furnace at 600°C. At this time, the color of the ash was made to be white, light gray, or reddish. Then, the weight was measured after cooling for 40 minutes in a desiccator.
조회분 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.The crude powder content was calculated and expressed as follows.
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상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2는 비교실시예 1에 비하여 조단백질, 조지방, 조회분 함량은 모두 0.50% 이하로 나타나 우수하게 정제된 것으로 나타났으며, 수분을 제외시킨 후 정제된 다당체의 순도는 99% 이상으로 확인되었다. As shown in Table 1, in Example 1 and Example 2, compared to Comparative Example 1, the contents of crude protein, crude fat, and crude ash were all 0.50% or less, indicating that they were excellently purified. The purity of the purified polysaccharide was confirmed to be more than 99%.
<실시예 4> 항산화 효과 <Example 4> Antioxidant effect
기능성 다당체의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH assay와 ABTS assay를 진행해 라디칼 소거능을 측정하였다.To measure the antioxidant effect of functional polysaccharides, DPPH assay and ABTS assay were performed to measure radical scavenging ability.
<실시예 4-1> DPPH assay<Example 4-1> DPPH assay
- 96 well plate에 시료와 DPPH solution을 1:1 비율로 각각 0.1 ml씩 주입한 후, 35°C 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. -After injecting 0.1 ml each of the sample and DPPH solution in a 1:1 ratio in a 96 well plate, reacting for 30 minutes in a dark place at 35°C, and absorbance was measured at 517 nm.
라디칼 소거능(%)의 계산은 다음의 식과 같이 계산하였다.The radical scavenging ability (%) was calculated as follows.
- 본 실험에 사용된 시료는 5%농도로 1000 g/20 L 제조 후 사용하였음.-The sample used in this experiment was used after manufacturing 1000 g/20 L at a concentration of 5%.
- DPPH solution : DPPH 0.078 g에 94% 에탄올을 이용해 1 L 용액으로 만들어서 0.2 mM 농도로 용액을 만들어 이용함.-DPPH solution: Make a 1 L solution using 94% ethanol in 0.078 g of DPPH, and make a solution with 0.2 mM concentration.
- 시료 이용 : 94% 에탄올을 이용하여 10배로 희석 수 이용함.-Sample use: Using 94% ethanol, dilute water by 10 times.
- Negative control : 100 mM DPPH solution in 94% 에탄올(94% 에탄올 + 200 mM DPPH solution)을 이용함.-Negative control: Use 100 mM DPPH solution in 94% ethanol (94% ethanol + 200 mM DPPH solution).
- 그 결과를 표 2에 나타내었다.-The results are shown in Table 2.
라디칼 소거능 측정 결과(단위 : %)Radical scavenging ability measurement result (unit: %)
DPPH assay 결과, 실시예 1 및 실시예 2는 5% 농도에서 negative control 대비 통계적으로 유의하게 평균 28.41, 29.12%의 라디칼 소거능을 보여주었다.As a result of the DPPH assay, Examples 1 and 2 showed radical scavenging activity of 28.41 and 29.12% on average statistically significantly compared to the negative control at 5% concentration.
<실시예 4-2> ABTS assay<Example 4-2> ABTS assay
- 96 well plate에 시료 및 trolox standard를 각각 10 μl씩 넣은 후, Myoglobin Working Solution 20 μl, ABTS Substrate Working Solution 150 μl를 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Stop Solution 100 μl 주입하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.-After adding 10 μl of each sample and trolox standard to a 96 well plate, 20 μl of Myoglobin Working Solution and 150 μl of ABTS Substrate Working Solution were added and reacted at room temperature for 5 minutes. After the reaction was over, 100 μl of Stop Solution was injected and absorbance was measured at 405 nm.
라디칼 소거능(%)의 계산은 상기 DPPH assay 와 동일하게 하였다.The calculation of the radical scavenging activity (%) was the same as the DPPH assay.
- Myoglobin Stock Solution : Myoglobin from horse heart에 초순수 280 μl를 첨가함.-Myoglobin Stock Solution: Add 280 μl of ultrapure water to Myoglobin from horse heart.
- Myoglobin Working Solution : Myoglobin Stock Solution을 1x Assay buffer를 이용해 100배 희석함.-Myoglobin Working Solution: Dilute Myoglobin Stock Solution 100 times using 1x Assay Buffer.
- Trolox Working Solution : Trolox((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid)에 2.67 ml의 1x Assay buffer를 첨가함.-Trolox Working Solution: Add 2.67 ml of 1x Assay Buffer to Trolox ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid).
- ABTS Working Solution : ABTS substrate solution 10 ml에 3% hydrogen peroxide solution 25 μl를 넣어서 제조함. -ABTS Working Solution: Prepared by adding 25 μl of 3% hydrogen peroxide solution to 10 ml of ABTS substrate solution.
- 시료이용 : 1x ABTS assay buffer를 이용해 10배로 희석 후 이용함.-Sample use: Use after diluting 10 times using 1x ABTS assay buffer.
- Negative control : ABTS mixture solution(1x ABTS assay buffer + Myoglobin working solution + ABTS substrate working solution)를 이용함.-Negative control: ABTS mixture solution (1x ABTS assay buffer + Myoglobin working solution + ABTS substrate working solution) is used.
** Trolox standard** Trolox standard
- 그 결과를 표 3에 나타내었다.-The results are shown in Table 3.
라디칼 소거능 측정 결과(단위 : %)Radical scavenging ability measurement result (unit: %)
ABTS assay 결과, 실시예 1 및 실시예 2는 5% 농도에서 negative control 대비 통계적으로 유의하게 평균 10.61, 10.87%의 라디칼 소거능을 보여주었다.As a result of the ABTS assay, Examples 1 and 2 showed a radical scavenging ability of 10.61 and 10.87% on average statistically significantly compared to the negative control at 5% concentration.
<실시예 5> 광독성 시험<Example 5> Phototoxicity test
- 본 시험은 in vitro 3T3 NRU 광독성 시험에서 시료를 BALB/3T3 clone A31의 세포에 처리한 후 광독성을 평가하기 위해 세포 생존율, 광조사 유무에 따른 IC50, 농도 반응에 따른 광독성(PIF ; Photo irritation factor 및 MPE ; Mean photo effect)을 평가한 결과는 다음과 같음.-This test is to evaluate the phototoxicity after treating the sample to the cells of BALB/3T3 clone A31 in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. And MPE; Mean photo effect) evaluation results are as follows.
- 본 시험의 시험물질 농도는 용량설정 시험을 통해 UV 조사 및 비조사 시 모두 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81 μg/ml 농도로 설정하였음. 또한 음성대조군은 DMEM에 희석한 PBS를 사용하였음.-The concentration of the test substance in this test was set to 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 and 7.81 μg/ml concentrations for both UV irradiation and non-irradiation through a dose setting test. In addition, PBS diluted in DMEM was used as the negative control group.
- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV 조사 및 비조사 시에 IC50값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV비조사 시, 28.043 μg/ml, UV조사 시 1.650 μg/ml으로 산출되었음.-As a result of calculating the IC50, the concentration value at which the cell viability decreases to 50% according to the presence or absence of light irradiation, the IC50 value was not calculated during UV irradiation and non-irradiation in the test substance group, 28.043 μg/ml, calculated as 1.650 μg/ml upon UV irradiation.
- 시험물질군에서 농도 반응에 따른 광독성을 평가한 결과, PIF가 2 미만, MPE가 0.1 미만으로 산출(PIF ; Not applicable, MPE ; -0.094)되었고, 양성대조물질군에서는 PIF가 6초과, MPE가 0.15이상으로 산출(PIF ; 17.1444, MPE ; 0.459)되었음.-As a result of evaluating the phototoxicity according to the concentration response in the test substance group, PIF was less than 2 and MPE was less than 0.1 (PIF; Not applicable, MPE; -0.094), and in the positive control group, PIF was more than 6 and MPE. Was calculated to be 0.15 or more (PIF; 17.1444, MPE; 0.459).
- 양성대조물질군에서 UV조사 시 IC50이 0.1 ~2.0 μg/ml, UV 비조사 시 IC50이 7.0 ~90.0 μg/ml범위로 나타났으며, PIF는 6 이상으로 나타나 광독성 물질임을 확인할 수 있었음.-In the positive control group, the IC50 ranged from 0.1 to 2.0 μg/ml when irradiated with UV, and the IC50 ranged from 7.0 to 90.0 μg/ml when irradiated with UV, and PIF was 6 or more, confirming that it was a phototoxic substance.
- 또한 모든 군에서 UV 비조사 시에 대한 UV 조사 시의 음성대조물질 세포생존율은 80%이상으로 나타났고, 음성대조물질의 평균 흡광도 값은 0.4 이상으로 나타났음. 본 시험에서는 시험의 성립조건을 만족하였으므로 시험이 적절하게 실시되었다고 판단됨.-In addition, in all groups, the cell viability of the negative control material under UV irradiation with respect to the non-UV irradiation was 80% or more, and the average absorbance value of the negative control material was 0.4 or more. In this test, it was judged that the test was properly conducted because the conditions for establishing the test were satisfied.
- 이상의 결과로부터 BALB/3T3 clone A31 세포주를 이용한 다당체의 광독성 평가 시 “광독성 없음(No phototoxicity)”으로 판단됨.-From the above results, it was judged as “No phototoxicity” when evaluating the phototoxicity of polysaccharides using the BALB/3T3 clone A31 cell line.
<실시예 5-1> 시험방법<Example 5-1> Test method
(1) 시험물질의 조제 및 분석(1) Preparation and analysis of test substances
(1-1) 시험물질의 조제 (1-1) Preparation of test substance
PBS로 시험물질을 용해하여 공비 2로 단계희석한 후, 시험물질 처리직전 DMEM으로 각 농도를 10배 희석하여 시험물질의 최종농도로 조제하였음. 시험물질은 실시예 1의 기능성 다당체를 사용하였음After dissolving the test substance in PBS and diluting it with azeotrope 2, each concentration was diluted 10 times with DMEM immediately before treatment of the test substance to prepare the final concentration of the test substance. As the test substance, the functional polysaccharide of Example 1 was used.
(1-2) 양성대조물질의 조제 (1-2) Preparation of positive control material
양성대조물질인 CPZ는 ethanol로 용해하여 공비 2로 단계희석한 후, 시험물질 처리직전 DMEM으로 각 농도를 100배 희석하여 양성대조물질의 최종농도로 조제하였음. CPZ, a positive control material, was dissolved in ethanol and diluted with azeotrope 2, and then each concentration was diluted 100 times with DMEM immediately before treatment of the test material to obtain the final concentration of the positive control material.
(1-3) 시험물질의 분석(1-3) Analysis of test substance
시험의뢰자와 협의하여 시험물질 및 시험물질 조제물의 농도, 안정성 및 균질성에 대한 분석은 별도로 시행하지 않았음. In consultation with the test sponsor, the concentration, stability and homogeneity of the test substance and test substance preparation were not separately analyzed.
(2) 세포주 준비(2) cell line preparation
(2-1) 세포주(2-1) cell line
세포주 : BALB/3T3 clone A31Cell line: BALB/3T3 clone A31
공급원 : American Type Culture CollectionSource: American Type Culture Collection
Lot No. : 62485414Lot No. : 62485414
(2-2) 세포주 선택 이유(2-2) Reasons for cell line selection
본 시험에 사용되는 BALB/3T3 clone A31세포는 광독성을 평가하기 위해 많이 사용되는 세포로서 비교할 시험기초자료가 많이 축적되어 있으므로 시험결과의 해석이 용이하여 선택하였음.The BALB/3T3 clone A31 cell used in this test is a cell that is widely used to evaluate phototoxicity, and it has been selected because it is easy to interpret the test result because it has accumulated a lot of basic data for comparison.
(2-3) 보존(2-3) preservation
최종 10%(v/v)의 비율로 DMSO를 첨가한 배지에 세포를 부유시켜, 약 1 ml씩 분주하고, 2015-10-19에 동결한 후에 액체질소 보존용기로 옮겨 보존하였음. 시험에 있어서는 이것을 사전 또는 시험 기간 중에 해동 및 배양하고 다른 시험과 공통으로 사용하였음.Cells were suspended in a medium to which DMSO was added at a final ratio of 10% (v/v), dispensed by about 1 ml, frozen in 2015-10-19, transferred to a liquid nitrogen storage container, and stored. In the test, it was thawed and cultivated beforehand or during the test period and used in common with other tests.
(2-4) 배양조건(2-4) Culture conditions
온도 : (37 ± 1)°CTemperature: (37 ± 1)°C
CO2 농도 : 5%CO2 concentration: 5%
습도 : 가습 조건Humidity: Humidification conditions
배양기 : CO2 세포배양기(NUAIRE, NU-4850E)Incubator: CO2 cell incubator (NUAIRE, NU-4850E)
(2-5) 세포주 형태와 오염도 확인(2-5) Confirmation of cell line type and contamination
- 사용 세포에 대해서, 세포 형태 육안 관찰 및 Hoechst Stain Kit(MPBIOMEDICALS, Japan)로 mycoplasma의 오염여부를 2019-03-29에 확인하였음. (형태 관찰 ; 적합, 오염도 확인 ; 음성)-For the cells used, the cell morphology was visually observed and the contamination of mycoplasma was confirmed on Mar 29, 2019 with the Hoechst Stain Kit (MPBIOMEDICALS, Japan). (Observation of morphology; confirmation of conformity and contamination; negative)
(2-6) 세포의 UV 민감도 검사(2-6) Cell UV sensitivity test
- 사용 세포에 대해서, 자외선 조사기를 이용하여 각 광량에 따른 세포의 UV 민감도를 2019-05-15에 확인하였음.-For the cells used, the UV sensitivity of the cells according to the amount of light was confirmed on May 15, 2019 using an ultraviolet irradiator.
(3) 세포배양액(3) Cell culture solution
- DMEM 배지는 사전 혹은 시험 개시 후에 구입, 조제한 것을 다른 시험과 공통으로 사용하였음.-DMEM medium was purchased and prepared before or after the start of the test and used in common with other tests.
- Complete medium -Complete medium
DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) : NBCS(Newborn Calf Serum) : Penicillin Streptomycin = 89 : 10 : 1DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium): NBCS(Newborn Calf Serum): Penicillin Streptomycin = 89: 10: 1
- Serum free medium-Serum free medium
DMEM : Penicillin Streptomycin = 99 : 1DMEM: Penicillin Streptomycin = 99: 1
(4) 시약(4) reagent
- 아래와 같은 조성으로 시약을 사용하였음.-Reagents were used in the following composition.
- Neutral red 배지 -Neutral red badge
Serum free medium : Neutral red solution(0.33%) = 65 : 1Serum free medium: Neutral red solution (0.33%) = 65: 1
- Neutral red 추출액-Neutral red extract
멸균증류수 : Ethanol(99.9%) Absolute : Acetic acid = 49 : 50 : 1Sterile distilled water: Ethanol (99.9%) Absolute: Acetic acid = 49: 50: 1
(5) 자외선 조사(5) UV irradiation
(5-1) 자외선 조사장치(5-1) UV irradiation device
모델명 : BIO-SUNModel Name: BIO-SUN
제조번호 : 15-101159Serial number: 15-101159
광원과 시험계간의 거리 : 최저 23 cm, 최고 26 cmDistance between light source and test system: minimum 23 cm, maximum 26 cm
(5-2) 광원 및 광량(5-2) Light source and amount of light
- 세포에 대한 독성이 없으면서 화학물질을 활성화시켜 광독성 반응을 일으키는 UVA(315-400 nm)를 조사하며, 광량은 5 J/cm2으로 하였음.-Irradiation with UVA (315-400 nm) causing a phototoxic reaction by activating chemical substances without toxicity to cells, and the amount of light was 5 J/cm2.
(5-3) 노출시간(5-3) Exposure time
- 광량(5 J/cm2)에 대하여, 자외선 조사를 시작한 뒤 1분 후 측정한 광세기를 적용하여 노출시간을 산출하였음. 단, 광세기는 1.7 ± 0.5 Mw/cm2으로 유지하도록 하였음.-For the amount of light (5 J/cm2), the exposure time was calculated by applying the light intensity measured 1 minute after the start of ultraviolet irradiation. However, the light intensity was kept at 1.7 ± 0.5 Mw/cm2.
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(6) 용량설정시험(6) Capacity setting test
- 시험물질은 UV 조사 및 비조사 시 모두 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81 μg/ml농도로 설정하였음. 세포생존율을 산출하여 세포독성을 확인하며, PIF(Photo irritation factor) 및 MPE(Mean photo effect)값은 산출하지 않았음.-Test substances were set at 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 and 7.81 μg/ml concentrations for both UV irradiation and non-irradiation. Cell viability was calculated to confirm cytotoxicity, and PIF (photo irritation factor) and MPE (Mean photo effect) values were not calculated.
<용량 설정시험 기준><Based on capacity setting test>
(7) 본시험(7) Main exam
(7-1) 시험군의 구성(7-1) Composition of test group
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* G1과 G2 음성대조군은 DMEM에 10배 희석한 PBS를 사용하였음. G1의 농도는 용량설정시험에서 IC50이 산출되지 않았으며, 시험물질의 침전/석출이 확인되지 않아 용량설정시험과 동일한 농도로 본시험을 진행하였음.* G1 and G2 negative controls were PBS diluted 10 times in DMEM. As for the concentration of G1, IC50 was not calculated in the dose setting test, and the precipitation/precipitation of the test substance was not confirmed, so the main test was conducted at the same concentration as the dose setting test.
(7-2) 시험수행 (7-2) Test execution
- 세포 분주 : 1일-Cell dispensing: 1 day
군당 96 well plate 2개에 세포부유액(1x104 cells/well) 및 배지를 100 μl 분주한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 24 시간 배양하였음.100 μl of cell suspension (1x104 cells/well) and medium were dispensed into two 96 well plates per group, and cultured for 24 hours in a cell incubator at 37°C and 5% CO2.
- 시험물질 처리 : 2일-Test substance treatment: 2 days
배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. 조제물(시험물질 및 양성대조물질), 음성대조물질을 100 μl 처리한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에 1시간 배양하였음.After removing the medium, it was washed once with 150 μl of warm PBS. After 100 μl of the preparation (test material and positive control material) and negative control material were treated, they were incubated for 1 hour in a cell incubator at 37°C and 5% CO2.
- UV 조사 : 2일-UV irradiation: 2 days
UV 조사 plate는 5 J/cm2의 광량으로 UVA를 조사하고, UV가 조사되는 동안 비조사 plate는 알루미늄 호일로 차광하여 실온 방치하였음. 용액을 제거한 다음, 가온한 PBS 150 μl로 2회 세척하였음. 배지를 100 μl 분주하여 37°C, 5% CO2 세포배양기에 20±2시간 배양하였음.The UV irradiation plate was irradiated with UVA at a light amount of 5 J/cm2, and the non-irradiated plate was shielded with aluminum foil while UV irradiated and left at room temperature. After removing the solution, it was washed twice with 150 μl of warm PBS. 100 μl of the medium was dispensed and cultured for 20±2 hours in a cell incubator at 37°C and 5% CO2.
- Neutral red 추출 : 3일-Neutral red extraction: 3 days
현미경을 사용하여 세포의 성장 및 형태를 관찰하고, 배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. Neutral red 배지를 100 μl 분주한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에 3시간 배양하였음. Neutral red 배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. Neutral red 추출액 150 μl을 분주하여 차광상태로 10분 동안 플레이트를 교반하였음.The growth and morphology of the cells were observed using a microscope, the medium was removed, and then washed once with 150 μl of warm PBS. After 100 μl of neutral red medium was dispensed, it was incubated for 3 hours in a cell incubator at 37°C and 5% CO2. After removing the neutral red medium, it was washed once with 150 μl of warm PBS. 150 μl of neutral red extract was dispensed, and the plate was stirred for 10 minutes in a light-shielding state.
- 흡광도 측정 : 3일-Absorbance measurement: 3 days
다채널 마이크로플레이트리더기를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였음.Absorbance was measured at a wavelength of 540 nm using a multi-channel microplate reader.
(8) 시험 성립 조건(8) Test Establishment Conditions
- UV 조사 시 음성대조군의 세포생존율은 UV 비조사 시의 80% 이상이었음.-When irradiated with UV, the cell viability of the negative control group was more than 80% of that of non-UV irradiation.
- 음성대조군의 평균 흡광도 값은 0.4 이상 이였음.-The average absorbance value of the negative control group was 0.4 or more.
- 양성대조물질(CPZ)의 IC50은 UV 조사 시 0.1 ~ 2.0 μg/ml, UV 비조사 시 7.0 ~ 90.0 μg/ml이었고, PIF 값은 6 이상이었음.-The IC50 of the positive control substance (CPZ) was 0.1 ~ 2.0 μg/ml when irradiated with UV, 7.0 ~ 90.0 μg/ml when irradiated with UV, and the PIF value was 6 or more.
(9) 결과의 평가 및 판정(9) Evaluation and judgment of results
(9-1) 평가(9-1) evaluation
- 광조사 유무에 따른 IC50을 평가하였음.-IC50 was evaluated according to the presence or absence of light irradiation.
- 광독성은 각 물질의 농도 반응에 따른 PIF 및 MPE로 평가하였음.-Phototoxicity was evaluated by PIF and MPE according to the concentration response of each substance.
(9-2) 판정(9-2) Judgment
- 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여, PIF 및 MPE 값을 산출하여 광독성을 판정하였음.-Phototoxicity was determined by calculating PIF and MPE values using IC50 according to the presence or absence of light irradiation.
(10) 통계(10) Statistics
- 측정된 흡광도로 소프트웨어(Phototox 2.6, ZEBET at the BFR, Berlin Germany)를 이용하여 PIF값 및 MPE값을 계산하고 통계학적 방법은 실시하지 않았음.-PIF and MPE values were calculated using the software (Phototox 2.6, ZEBET at the BFR, Berlin Germany) with the measured absorbance, and no statistical method was performed.
<실시예 5-2> 결과<Example 5-2> Results
(1) 광조사 유무에 따른 IC50 비교(1) IC50 comparison with or without light irradiation
- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV 비조사 및 조사 시에 IC50 값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV 비조사 시 28.043 μg/ml, UV 조사 시 1.650 μg/ml로 산출되었음.-As a result of calculating the IC50, which is the concentration value at which the cell viability decreases to 50% with or without light irradiation, the IC50 value was not calculated at the time of UV irradiation and irradiation in the test substance group, and 28.043 at the time of UV irradiation in the positive control group μg/ml, calculated as 1.650 μg/ml upon UV irradiation.
<세포생존율 결과><Results of cell viability>
(2) 농도 반응에 따른 광독성(PIF 및 MPE)평가(2) Phototoxicity (PIF and MPE) evaluation according to concentration reaction
- 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여 PIF 값 및 MPE 값을 산출한 결과, 시험물질군에서는 PIF 값이 산출되지 않았고, MPE 값이 -0.094으로 산출되었고, 양성대조물질군에서는 PIF 값이 17.144, MPE 값이 0.459으로 산출되었음.-As a result of calculating the PIF and MPE values using IC50 according to the presence or absence of light irradiation, the PIF value was not calculated in the test substance group, the MPE value was calculated as -0.094, and the PIF value was 17.144 in the positive control substance group. The MPE value was calculated to be 0.459.
<세포독성 측정결과><Cytotoxicity measurement results>
(3) 종합 평가(3) Comprehensive evaluation
- BALB/3T3 clone A31의 세포에 대한 기능성 다당체의 광독성을 평가하기 위해 세포 생존율, 광조사 유무에 따른 IC50, 농도 반응에 따른 광독성(PIF; photo irritation factor, MPE ; Mean photo effect)을 아래와 같이 산출하였음.-To evaluate the phototoxicity of functional polysaccharides against cells of BALB/3T3 clone A31, cell viability, IC50 according to light irradiation, and phototoxicity according to concentration response (PIF; photo irritation factor, MPE; Mean photo effect) are calculated as follows. Did.
- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV비조사 및 조사 시에 IC50값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV 비조사 시 28.043 μg/ml, UV 조사 시 1.650 μg/ml로 산출되었음. 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여 PIF값 및 MPE 값을 산출한 결과, 시험물질군에서는 PIF 값이 산출되지 않았고, MPE 값은 -0.094으로 산출되었고, 양성대조물질군에서는 PIF 값이 17.144, MPE 값이 0.459으로 산출되었음.-As a result of calculating the IC50, the concentration value at which the cell viability decreases to 50% with or without light irradiation, the IC50 value was not calculated at the time of UV irradiation and irradiation in the test substance group, and 28.043 at the time of UV irradiation in the positive control substance group. μg/ml, calculated as 1.650 μg/ml upon UV irradiation. As a result of calculating the PIF and MPE values using IC50 according to the presence or absence of light irradiation, the PIF value was not calculated in the test substance group, the MPE value was calculated as -0.094, and the PIF value was 17.144 and MPE in the positive control substance group. The value was calculated as 0.459.
- 양성대조물질군에서 UV조사 시 IC50이 0.1 ~ 2.0 μg/ml, UV 비조사 시 IC50이 7.0 ~ 90.0 μg/ml범위로 나타났으며, PIF는 6 이상으로 나타나 광독성 물질임을 확인할 수 있었음. 또한 모든 군에서 UV 비조사 시에 대한 UV 조사 시의 음성대조물질 세포생존율은 80%이상으로 나타났고, 음성대조물질의 평균 흡광도 값은 0.4 이상으로 나타났음. 본 시험에서는 시험의 성립 조건을 만족하였으므로 시험이 적정하게 실시되었다고 판단됨.-In the positive control group, the IC50 ranged from 0.1 to 2.0 μg/ml when irradiated with UV, and the IC50 ranged from 7.0 to 90.0 μg/ml when irradiated with UV, and PIF was 6 or more, confirming that it was a phototoxic substance. In addition, in all groups, the cell viability of the negative control material under UV irradiation with respect to the non-UV irradiation was 80% or more, and the average absorbance value of the negative control material was 0.4 or more. In this test, it was judged that the test was conducted properly because the conditions for establishing the test were satisfied.
- 이상의 결과로부터 BALB/3T3 clone A31 세포주를 이용한 다당체의 광독성 평가 시 “광독성 없음(No phototoxicity)”으로 판단됨-From the above results, it was judged as “No phototoxicity” when evaluating the phototoxicity of polysaccharides using the BALB/3T3 clone A31 cell line.
<실시예 6> 인체피부자극시험<Example 6> Human skin irritation test
(1) 시험 개요(1) Exam outline
- 본 연구에서는 서원대학교 산학협력단에서 제공한 원료 2종의 인체피부 일차자극시험을 위하여 한국 성인남녀를 대상으로 실험을 실시하였음.-In this study, an experiment was conducted on Korean adult men and women for the primary human skin irritation test of two raw materials provided by the Seowon University Industry-Academic Cooperation Foundation.
- 패치 제거 후 2번에 거쳐 판정을 실시하였으며, 1차 판정과 2차 판정 결과를 종합하여 평균 피부반응도를 산정하고 이를 이용하여 최종 판정을 진행하였음.-After the patch was removed, the judgment was carried out twice, and the average skin reactivity was calculated by combining the results of the first and second judgments, and the final judgment was made using this.
(2) 시험 물질(2) Test substance
- 시험물질-Test substance
물질명 : CT16-SA25(실시예 1), CT16-SA24(실시예 2)Name of substance: CT16-SA25 (Example 1), CT16-SA24 (Example 2)
제조일자 : 2018-05-15Date of manufacture: 2018-05-15
제품 유형 (외관 및 성상) : 액상 형태Product type (appearance and appearance): liquid form
보관조건 : 고온과 직사광선을 피하여 5~25℃사이에서 보관Storage conditions: Store between 5~25℃ avoiding high temperature and direct sunlight
(3) 피험자(3) subject
- 본 인체적용시험에 참가한 피험자에 대한 정보는 다음 표 6과 같음.-Information on the subjects who participated in this human application test is as shown in Table 6 below.
표 6. 피험자 정보 Table 6. Subject information
(4) 시험 방법(4) Test method
(4-1) 시험 방법(4-1) Test method
- 피험자의 등(척추 부위 제외)부위에 패치를 이용해 24시간 동안 원료를 폐쇄첩포 한 후, 패치를 제거하였음.-A patch was applied to the subject's back (excluding the spine) using a patch for 24 hours, and then the patch was removed.
- 피험자 등(척추 부위 제외)부위에 패치를 제거하고, 해당 부위를 표시 한 다음, 실험용 티슈(킴테크)를 이용해 등(척추 부위 제외)부위의 불순물을 제거하였음. 1차 판정평가는 패치 제거 30분 후에 진행하고, 2차 판정평가는 24시간 후에 진행하였음. 제품에 대한 두 차례의 판정평가를 종합하여 평균 피부반응도를 산정하였으며, 이를 기준으로 하여 최종 판정평가를 진행하였음-After removing the patch on the subject's back (excluding the spine), marking the affected area, and removing impurities from the back (excluding the spine) using an experimental tissue (Kimtech). The first judgment evaluation proceeded 30 minutes after the patch was removed, and the second judgment evaluation proceeded 24 hours later. The average skin reactivity was calculated by integrating two judgment evaluations for the product, and the final judgment evaluation was conducted based on this.
- 모든 판정평가는 공기의 이동과 직사광선이 없는 항온항습 조건에서 피험자가 최소 30분 이상 피부 안정을 취한 다음 실시하였음.-All judgments and evaluations were conducted after the subject had stabilized the skin for at least 30 minutes under constant temperature and humidity conditions without air movement and direct sunlight.
(4-2) 시험 부위 선정 및 패치 부착(4-2) Test site selection and patch attachment
- 패치 부착 부위는 등(척추 부위 제외)으로 선정하였음. -The patch attachment site was selected as the back (excluding the spine).
- 제품을 8 x 8 mm 크기로 잘라 패치에 배치한 후 등 부위에 부착하였음. 음성대조군으로는 증류수를 점적하였으며, 패치 내의 아무것도 점적하지 않은 공란을 blank로 설정하였음.-The product was cut into 8 x 8 mm and placed on a patch and then attached to the back. Distilled water was dropped as a negative control group, and blanks in which nothing was dropped in the patch was set as blank.
- 피부자극을 평가하기 위하여 패치로 IQ Ultra Chamber(Chemotechnique Diagnostics, Sweden)를 사용하였음. IQ Ultra Chamber는 폭 5 mm 길이 118 mm의 직사각형모양의 무자극성 접착테이프 위에 inert polyethylene chamber가 10개가 배열되어 있고 각 chamber volume은 최대 32 μl, 면적은 8 x 8 mm로 구성되어 있음. 각 chamber 간 간격은 열간 12 mm 행간 15 mm로 지정되어 있음.-IQ Ultra Chamber (Chemotechnique Diagnostics, Sweden) was used as a patch to evaluate skin irritation. IQ Ultra Chamber has 10 inert polyethylene chambers arranged on a rectangular non-irritating adhesive tape with a width of 5 mm and a length of 118 mm, each chamber volume is up to 32 μl, and the area is composed of 8 x 8 mm. The spacing between each chamber is designated as 12 mm between columns and 15 mm between lines.
(4-3) 피부 자극 판정(4-3) Determination of skin irritation
- 패치는 24시간 동안 부착 후 제거하였음. 제거에 의한 일과성 홍반의 소실을 기다려 패치 제거 후 30분 후 1차 판정평가를 진행하였음.-The patch was attached for 24 hours and then removed. Waiting for the disappearance of transient erythema due to removal, and 30 minutes after removal of the patch, the first judgment evaluation was conducted.
- 자극 판정 기준은 다음 표 7과 같이 국제 접촉 피부염 연구 그룹(ICDRG)의 판독 기준을 응용하여 Frosch & Kligman이 고안한 측정 평가법으로 사용하였음.-The irritation criterion was used as a measurement evaluation method devised by Frosch & Kligman by applying the reading criteria of the International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) as shown in Table 7 below.
자극 판정 기준Criteria for determining stimulation
(4-4) 데이터 분석(4-4) data analysis
- 평균 피부반응도(mean score)는 다음 식의 계산공식에 따라 산정하였음.-The average skin reactivity (mean score) was calculated according to the calculation formula of the following formula.
_
- 제품에 대한 피부반응도의 판정기준은 mean score 값에 따라 다음 표 8과 같은 기준으로 최종 판정을 진행하였음.-As for the criteria for skin reactivity to the product, the final judgment was conducted according to the criteria shown in Table 8 below according to the mean score value.
최종 판정 기준Final decision criteria
(5) 시험 결과(5) Test result
(5-1) 피부 자극 평가 결과 분석(5-1) Analysis of skin irritation evaluation results
- 판정 결과는 다음과 같음.-The judgment result is as follows.
*평균 피부 반응도 : 위의 공식 참고*Average skin reactivity: Refer to the above formula
(6) 결론(6) Conclusion
- 본 시험은 인체 피부자극 일차자극시험으로, 식품의약품안전처 고시 제 017-4호, 기능성화장품 심사에 관한 규정에 따라 수행되었음.-This test is the primary irritation test for human skin, and was conducted in accordance with the Ministry of Food and Drug Safety Notice No. 017-4, the regulations on functional cosmetics review.
- 총 33명의 피험자를 모집하였고, 시험의 제한조건이나 의무사항을 따르지 않는 경우로 1명, 피험자가 시험을 지속할 수 없다고 시험책임자가 판단하는 경우로 1명, 총 2명의 중도 탈락자가 발생하여 최종적으로 31명이 시험을 완료하였음.-A total of 33 subjects were recruited, 1 as the case of not following the restrictions or obligations of the test, and 1 as the case where the supervisor judges that the subject cannot continue the test, and a total of 2 dropouts occurred. Finally, 31 people completed the test.
- 시험결과 CT16-SA24, CT16-SA25의 평균 피부반응도는 0으로 산정되어, 최종 판정 기준에 의해 모두 무자극으로 판정되었음.-As a result of the test, the average skin reactivity of CT16-SA24 and CT16-SA25 was calculated as 0, and all were judged as non-irritating according to the final criteria.
<실시예 7> 세포독성시험<Example 7> Cytotoxicity test
(1) 요약(1) summary
- 본 시험은 기능성 다당체의 세포독성을 평가하기 위해서 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용하여 세포독성시험(MTT assay)을 실시하였음. 시험물질은 실시예 1의 기능성 다당체를 희석하여 사용함.-In this test, a cytotoxicity test (MTT assay) was conducted using CCD-986SK (Fibroblast) cells to evaluate the cytotoxicity of functional polysaccharides. The test substance was used by diluting the functional polysaccharide of Example 1.
- 기능성 다당체를 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 %의 농도로 처리 결과, 2.0 % 이하 농도에서 70 % 이상의 세포생존율이 관찰됨. -As a result of treating functional polysaccharides at concentrations of 0.1%, 0.5%, 1.0%, and 2.0%, a cell viability of more than 70% was observed at concentrations below 2.0%.
- 이상의 결과로부터 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용한 세포독성시험(MTT assay)결과, 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 세포독성이 없는 것으로 사료됨.-From the above results, as a result of the cytotoxicity test (MTT assay) using CCD-986SK (Fibroblast) cells, it was considered that the functional polysaccharide had no cytotoxicity at a concentration of 2.0% or less.
(2) 시험 방법(2) Test method
- 세포주 : CCD-986SK 공급원 : ATCC CRL-6323TM Lot No. : 60016875-Cell line: CCD-986SK Source: ATCC CRL-6323TM Lot No. : 60016875
- 세포주 보존 Freezing medium에 세포를 부유시켜 약 1 mL씩 분주하고 2015-09-16 에 동결한 후에 액체 질소 보존용기로 옮겨 보존함. 시험에 있어서 이것을 사전 또는 시험 기간 중에 해동 및 배 양하여 사용함.-Preservation of Cell Lines Cells are suspended in the freezing medium, dispensed by about 1 mL, and frozen on September 16, 2015, and transferred to a liquid nitrogen storage container for storage. In the test, it is thawed and cultured beforehand or during the test period.
※ 배양 조건 ※ Culture conditions
온도 : (37±1)℃, CO2 농도 : 5%, 습도 : 가습 조건, 배양기 : CO2 세포배양기Temperature: (37±1)℃, CO2 concentration: 5%, humidity: humidification conditions, incubator: CO2 cell incubator
- 세포배양액-Cell culture solution
완전 배지Complete badge
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) : 445 mlDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM): 445 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) : 50 mlFetal Bovine Serum (FBS): 50 ml
Penicillin-Streptomycin : 5 ml Penicillin-Streptomycin: 5 ml
Total volume : 500 mlTotal volume: 500 ml
무혈청 배지Serum-free medium
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) : 99 mlDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM): 99 ml
Penicillin-Streptomycin : 1 mlPenicillin-Streptomycin: 1 ml
Total volume : 100 mlTotal volume: 100 ml
- 세포독성시험-Cytotoxicity test
군 구성 시험물질 농도는 4개 농도(0.1, 0.5, 1.0, 2.0%)로 희석하여 다음과 같이 실시하였음.The concentration of the test substance in the group was diluted to 4 concentrations (0.1, 0.5, 1.0, 2.0%) and carried out as follows.
G1 : 음성대조군G1: negative control
G2 : 기능성 다당체 0.1%G2: 0.1% functional polysaccharide
G3 : 기능성 다당체 0.5%G3: Functional polysaccharide 0.5%
G4 : 기능성 다당체 1.0%G4: 1.0% functional polysaccharide
G5 : 기능성 다당체 2.0%G5: Functional polysaccharide 2.0%
- 세포 분주 96 well plate에 세포를 3Х104 (100 uL/well)로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시 간 배양함.-Cell dispensing Dispense the cells into a 96 well plate at 3Х104 (100 uL/well) and incubate for 24 hours in an incubator at 37°C and 5% CO2.
- 시험물질처리 시험물질이 농도별로 희석된 무혈청 배지로 교체하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양함.-Test substance treatment Replace the test substance with serum-free medium diluted by concentration and incubate for 24 hours in a 37 ℃, 5% CO2 incubator.
- MTT assay PBS로 2 회 세척하고 MTT용액(0.5 mg/mL, 무혈청 배지)을 200 μL/well 분주하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 4 시간 배양함. -MTT assay Wash twice with PBS and dispense 200 μL/well of MTT solution (0.5 mg/mL, serum-free medium) and incubate for 4 hours in a 37°C, 5% CO2 incubator.
- 흡광도 측정 배양이 끝나면 배지를 제거해주고 DMSO용액을 200 μL/well 넣고 plate shaker에서 20-30 분 추출 후, 570 nm 파장에서 ELISA 이용하여 흡광도를 측정함.-Measurement of absorbance After culturing, remove the medium, add 200 μL/well of DMSO solution, extract for 20-30 minutes with a plate shaker, and measure the absorbance using ELISA at 570 nm wavelength.
- 결과처리 세포 생존율이 시료 무첨가군의 70 % 미만으로 감소되는 경우에 잠재적으로 세포독성이 있는 것으로 판정하며 세포 생존율은 다음의 식에 따라 산출함.-If the resulting treatment cell viability decreases to less than 70% of the sample-free group, it is judged as potentially cytotoxic and the cell viability is calculated according to the following equation.
- 통계처리 실험 결과는 SPSS(Ver. 19)통계 프로그램을 이용하여 t-test(paired t-test, 양측검증)를 실시하여 유의성을 확인함.-The significance of the statistical processing experiment was confirmed by conducting t-test (paired t-test, two-sided verification) using the SPSS (Ver. 19) statistical program.
(3) 결과(3) result
- 세포독성 평가 (Table 1, Figure 1, Appendix 1) 기능성 다당체를 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 %로 처리한 결과, 각각의 농도에서 105.96 ± 29.69 %, 86.66 ± 14.42 %, 126.61 ± 16.46 %, 102.54 ± 21.75 %의 세포 생존율이 관찰되었음.-Cytotoxicity evaluation (Table 1, Figure 1, Appendix 1) As a result of treating functional polysaccharides with 0.1%, 0.5%, 1.0%, and 2.0%, at each concentration, 105.96 ± 29.69%, 86.66 ± 14.42%, 126.61 ± 16.46 %, 102.54 ± 21.75% of cell viability was observed.
(4) 고찰 및 결론(4) Discussion and conclusion
- 본 시험은 기능성 다당체의 세포독성을 평가하기 위해서 CCD-986SK(Fibroblast)세포와 기능성 다당체 희석액을 이용하여 세포독성시험(MTT assay) 수행하였음.-In this test, a cytotoxicity test (MTT assay) was performed using CCD-986SK (Fibroblast) cells and a diluted solution of functional polysaccharides to evaluate the cytotoxicity of functional polysaccharides.
- 하기에 나타낸 것과 같이, 세포독성시험결과 기능성 다당체의 경우 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 % 농도에서 105.96 ± 29.69 %, 86.66 ± 14.42 %, 126.61 ± 16.46 %, 102.54 ± 21.75 %의 세포 생존율이 관찰되었음. -As shown below, in the case of functional polysaccharides as a result of the cytotoxicity test, cell viability of 105.96 ± 29.69%, 86.66 ± 14.42%, 126.61 ± 16.46%, 102.54 ± 21.75% at concentrations of 0.1%, 0.5%, 1.0%, and 2.0%. Was observed.
- 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 70 % 이상의 세포 생존율이 관찰되었음.-In the functional polysaccharide, a cell viability of 70% or more was observed at a concentration of 2.0% or less.
- 세포 생존율이 시료 무첨가군의 70 %미만으로 감소되는 경우에 잠재적으로 세포독성이 있는 것으로 판정하므로, 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서는 세포독성이 없는 것으로 사료됨으로써 이상의 결과로부터 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용한 세포독성시험(MTT assay)에 사용된 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 세포독성이 없는 것으로 사료됨.-If the cell viability decreases to less than 70% of the sample-free group, it is determined to be potentially cytotoxic. Therefore, the functional polysaccharide is considered to be non-cytotoxic at a concentration of 2.0% or less. From the above results, CCD-986SK (Fibroblast) The functional polysaccharide used in the cell cytotoxicity test (MTT assay) was considered to be non-cytotoxic at a concentration of 2.0% or less.
** 희석 농도 별 세포독성 확인 결과** Cytotoxicity check result by dilution concentration
** 희석 농도 별 세포독성 확인 결과** Cytotoxicity check result by dilution concentration
<실시예 8> 피부보습 탄력증진 효과 평가(화장품)<Example 8> Evaluation of skin moisturizing elasticity enhancing effect (cosmetics)
(1) 요약(1) summary
- 본 시험을 종료한 시험대상자 12명은 모두 여성으로 평균연령은 만45.4세였다. 선정된 시험대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용력은 없었음.-All 12 subjects who ended this test were women, and the average age was 45.4 years. The selected subjects had no specific skin symptoms and had no history of disease or drug use that could affect the test.
- 피부보습 개선효과를 확인한 결과, 제품 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 수분함유량이 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였음.-As a result of confirming the effect of improving skin moisturization, the moisture content increased statistically significantly (P ＜0.05) after 2 and 4 weeks of use compared to before use of the product.
- 피부탄력을 확인한 결과, R7 (biological elasticity) 값은 제품 사용 전과 비교하여 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였음.-As a result of checking skin elasticity, the R7 (biological elasticity) value increased statistically significantly (P <0.05) after 4 weeks of use compared to before use of the product.
- 시험대상자에 의한 주관적 설문평가 : 시험물질 사용 후 유효성 평가의 모든 항목에서‘보통’이상으로 평가하였음.-Subjective questionnaire evaluation by test subjects: After using the test substance, all items of the efficacy evaluation were evaluated as'normal' or higher.
- 피부과 전문의에 의한 이상반응 평가 : 시험제품을 사용하는 기간 동안 시험대상자에게서 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에서도 이상소견은 관찰되지 않았음.-Evaluation of adverse reactions by a dermatologist: During the period of using the test product, there were no reports of any special skin adverse reactions in the subjects, and no abnormal findings were observed even on the physical examination by a dermatologist.
(2) 시험 물질(2) Test substance
시험물질Test substance
물질명 : 비교실시예 1의 다당체가 함유된 화장용 크림 AName of substance: Cosmetic cream A containing polysaccharide of Comparative Example 1
실시예 1의 다당체가 함유된 화장용 크림 BCosmetic cream B containing the polysaccharide of Example 1
제품 유형 (외관 및 성상) : 백색의 크림상Product type (appearance and appearance): white creamy
보관조건 : 실온 [(1 ~ 30℃)]Storage conditions: room temperature [(1 ~ 30℃)]
화장용 크림 성분 : 아래와 같음Cosmetic cream ingredients: as follows
(3) 시험 대상자(3) Test subjects
- 시험에 모집된 12명 모두 최종 시험대상자로 선정되었음. 이는 식품의약품안전처‘화장품 표시 광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인(민원인 안내서)’에서 제시한 시험대상자 수에 근거하여 22명으로 설정하려 하였으나, 의뢰자의 요청에 의해 12명의 시험대상자를 목표로 하였음. 시험책임자 또는 시험책임자의 위임을 받은 시험담당자는 시험의 모든 정보를 시험대상자에게 충분히 알렸으며, 시험대상자는 자의에 따라 동의서를 작성하고 시험에 참가하였음.-All 12 people recruited for the test were selected as final subjects. This was to be set to 22 based on the number of test subjects suggested in the'Test Method Guideline for Demonstration of Cosmetics Labeling Advertisement' by the Ministry of Food and Drug Safety, but at the request of the sponsor, 12 subjects were targeted. . The study manager or the study manager who was delegated by the study director fully informed the test subjects of all the information of the test, and the test subjects filled out the consent form at their will and participated in the test.
** 시험대상자 연령대 분포** Age distribution of test subjects
(4) 결론(4) Conclusion
- 최종 12명의 시험대상자를 대상으로 실시예 1 및 비교실시예 1의 다당체가 함유된 크림의 피부보습, 피부탄력 개선효과에 대한 인체적용시험을 시행하였음.-A human application test was conducted on the skin moisturizing and skin elasticity improvement effects of the creams containing the polysaccharides of Example 1 and Comparative Example 1 on the final 12 subjects.
- 본 시험은 만 30 ~ 60세의 건강한 성인 여성 12명을 대상으로 진행하였으며, 시험제품을 4주간 사용하게 하였음. 시험제품 사용 전과 시험제품 사용 2주 및 4주 후 결과는 다음과 같음.-This test was conducted on 12 healthy adult women aged 30 to 60 years old, and the test product was used for 4 weeks. The results before use of the test product and after 2 and 4 weeks of use of the test product are as follows.
- 본 시험을 종료한 시험대상자 12명은 모두 여성으로 평균연령은 만 45.4세였다. 선정된 시험대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용력은 없었음.-All 12 subjects who ended this test were women, and the average age was 45.4 years. The selected subjects had no specific skin symptoms and had no history of disease or drug use that could affect the test.
- Corneometer를 이용한 피부보습을 확인한 결과, 크림 B (실시예 1의 다당체 함유)은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 20.28 %, 31.66 %의 개선율을 보였으며, 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였다. 크림 A (비교제조예 1의 다당체 함유)는 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 18.01 %, 22.75 %의 개선율을 보였으며, 통계학적으로 유의하게 증가(P＜0.05)하였다. 시험제품은 대조제품과 비교하여 사용 4주 후에 유의한 차이(P ＜0.05)를 나타냈음.-As a result of confirming skin moisturization using a Corneometer, Cream B (containing the polysaccharide of Example 1) showed improvement rates of 20.28% and 31.66%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use, and statistically significantly increased. It was (P<0.05). Cream A (containing the polysaccharide of Comparative Preparation Example 1) showed improvement rates of 18.01% and 22.75%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use, and statistically significantly increased (P<0.05). The test product showed a significant difference (P <0.05) after 4 weeks of use compared to the control product.
<피부 보습효과 결과><Results of skin moisturizing effect>
-Cutometer를 이용한 피부탄력을 확인한 결과, 크림 B (시험제품)의 R2 (grosselasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 1.20 % 및 12.49 %의 개선율을 보였다. R5 (net elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -8.1%, -3.33 %로 개선을 보이지 않았다. R7 (biological elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -2.370 %, 7.82 %의 개선율을 보였으며, 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였다. 크림 A (대조제품)의 R2 (gross elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -1.64 % 및 6.91 %의 개선율을 보였다. R5(net elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -14.47 %, -11.6 %로 개선을 보이지 않았다. R7 (biological elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -5.53 %, -0.38 %로 개선을 보이지 않았음.-As a result of checking skin elasticity using a cutometer, the R2 (grosselasticity) value of Cream B (test product) showed improvement rates of 1.20% and 12.49%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use. The R5 (net elasticity) value showed no improvement in -8.1% and -3.33%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use. R7 (biological elasticity) values showed improvement rates of -2.370% and 7.82%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use, and statistically significantly increased (P <0.05) after 4 weeks of use. The R2 (gross elasticity) value of Cream A (control product) showed improvement rates of -1.64% and 6.91%, respectively, after 2 and 4 weeks of use compared to before use. The R5 (net elasticity) value showed no improvement in -14.47% and -11.6%, respectively, after 2 weeks and 4 weeks of use compared to before use. R7 (biological elasticity) values were -5.53% and -0.38%, respectively, not improved after 2 and 4 weeks of use compared to before use.
** 탄력개선 효과 결과** Elasticity improvement effect result
- 시험대상자에 의한 주관적 설문평가 : 시험물질 사용 후 유효성 평가의 모든 항목에서 ‘보통’이상으로 평가되었음.-Subjective questionnaire evaluation by test subjects: After using the test substance, it was evaluated as'normal' or higher in all items of the efficacy evaluation.
** 시험물질 사용 후 피부상태** Skin condition after using test substance
- 피부과 전문의에 의한 이상반응 평가 : 시험제품을 사용하는 동안 시험대상자에게서 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에서도 이상소견은 관찰되지 않았음.-Evaluation of adverse reactions by a dermatologist: During the use of the test product, there were no reports of any special skin adverse reactions from the subject, and no abnormal findings were observed even on the physical examination by a dermatologist.
** 피부이상반응 평가 결과** Results of adverse skin reaction evaluation
따라서 크림 B (실시예 1의 다당체 함유)는 피부보습, 피부탄력 개선에 도움을 주는 제품으로 판단된다.Therefore, Cream B (containing the polysaccharide of Example 1) is considered to be a product that helps skin moisturize and improve skin elasticity.
Claims (10)
상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및
상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 방법에 의해 기능성 다당체를 제조하고,
제조된 기능성 다당체는 1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 다당체의 제조방법.
Preparing cells containing polysaccharides;
Crushing the cells to obtain an extract obtained by extracting the polysaccharide to the outside of the cell; And
To prepare a functional polysaccharide by a method comprising a; purification step of removing at least one or more of crude protein, crude fat, and crude powder from the extract,
The prepared functional polysaccharide is a method for producing a functional polysaccharide, characterized in that it does not have phototoxicity to the BALB/3T3 clone A31 cell line at a concentration of 1000 μg/ml or less.
상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 대장균 변이체 TBP38 균주 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces Cerevisiae) CEY1을 배양하여 균체로 준비하는 기능성 다당체의 제조방법.
The method of claim 1,
The step of preparing the cells containing the polysaccharide is a method of preparing a functional polysaccharide by culturing E. coli mutant TBP38 strain or Saccharomyces Cerevisiae CEY1 as cells.
상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는,
상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 기능성 다당체의 제조방법.
The method of claim 1,
The step of crushing the cells to obtain an extract obtained by extracting the functional polysaccharide to the outside of the cell,
A method for producing a functional polysaccharide in which the cells are suspended in a citric acid buffer solution having a pH of 3.5 to 4.5, and then the cells are crushed using high pressure treatment to extract the functional polysaccharide to the outside of the cell.
상기 정제 단계는,
상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리하는 단계;
구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로 조절하고 침전물을 제거하는 단계;
디터전트(detergent)를 첨가하여 층분리를 한 후 원심분리를 통해 상등액을 회수하는 단계;
상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하고 농축하여 농축액을 얻는 단계;
상기 농축액에 1 내지 5배 부피의 주정을 첨가하여 침전물을 회수하는 단계; 및
상기 침전물을 증류수 또는 탈이온수에 재부유한 후 1 내지 5배 부피의 주정을 재첨가하고 침전물을 회수하는 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법.
The method of claim 1,
The purification step,
Heat-treating the extract at 80 to 100 °C for 5 to 60 minutes;
Adding citric acid to adjust the pH to 3.5 to 4.5 and remove the precipitate;
Separating layers by adding detergent and recovering the supernatant through centrifugation;
Filtering the recovered supernatant through an ultra-fine filter and concentrating to obtain a concentrated solution;
Recovering the precipitate by adding 1 to 5 times the volume of alcohol to the concentrate; And
Re-suspending the precipitate in distilled water or deionized water, and then re-adding 1 to 5 times the volume of alcohol and recovering the precipitate.
조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5 중량% 이하인 기능성 다당체의 제조방법.
The method of claim 1,
A method for producing a functional polysaccharide in which the content of each of crude protein, crude fat, and crude powder is 0.5% by weight or less.
상기 다당체는 글리코겐이며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 갖는 기능성 다당체의 제조방법.
The method of claim 1,
The polysaccharide is glycogen, and a method for producing a functional polysaccharide having a purity of 99% or more based on solid content.
조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5 중량% 이하이고, 고형분 기준으로 99 % 이상이 글리코겐인 기능성 다당체.
As a functional polysaccharide prepared by the manufacturing method of claim 1,
A functional polysaccharide wherein the content of each of crude protein, crude fat, and crude powder is 0.5% by weight or less, and 99% or more based on solid content is glycogen.
항산화 활성을 갖는 기능성 다당체.
The method of claim 7,
Functional polysaccharide with antioxidant activity.
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