KR102249560B1

KR102249560B1 - N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102249560B1
Application number: KR1020190117192A
Authority: KR
Inventors: 홍진태; 이희범
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2021-05-10
Also published as: KR20210035425A

Abstract

본 발명은 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘- 5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-yl)설페닐]아세트아마이드는 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하여 기능을 저해하고, 신경 염증을 완화하여 불안증세를 호전시키므로 불안증 또는 신경 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide for treating and preventing anxiety or Neuroinflammatory diseases}

본 발명은 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

불안장애는 불안과 공포를 특징으로 하며 일반 불안장애, 공황장애, 공포증, 사회적 불안장애, 강박장애, 외상 후 스트레스 장애를 포함하는 정신장애의 일종이다. 세계보건기구(WHO)의 역학 자료에 따르면 세계 인구의 3분의 1 이상이 불안장애의 영향을 받는다. 현재까지 불안장애와 관련한 많은 연구가 있었으나 불안장애의 발병 기전에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없다. 현재 FDA 승인을 받은 불안장애 치료 약물에는 세로토닌 노르에피네프린 재흡수 억제제(SSRI), 삼환계 항우울제(TCA), 벤조디아제핀(DBZ) 및 모노아민 산화효소 억제제(MAOI)가 있으며, 이들은 설사, 두통, 불면증, 성기능장애와 같은 심각한 부작용이 있거나 치료 효과가 낮다는 단점이 있다. 따라서 부작용이 적으며 항불안효과가 뛰어난 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있다.

불안장애의 발병 기전은 아직 불분명하나, 불안장애와 신경염증 사이에 상관관계가 있다는 여러 연구 결과가 있다. 불안장애 환자의 혈청에서 종양괴사인자(TNF)-α 및 인터페론(IFN)-γ와 같은 전염증성 사이토카인의 농도가 정상인에 비교해 높다는 연구 결과가 있으며, TNF-α 및 IL-1β 신호 전달을 차단할 때 불안 상태가 호전된다는 연구 결과가 있다. NF-κB는 염증 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자로 잘 알려져 있다. 우울증과 불안장애 치료에 사용되는 이미프라민(Imipramine)과 플로옥세틴(Fluoxetine)은 NF-κB 신호전달을 억제하고 항염증 효과를 가지고 있다는 연구 결과가 있다. 따라서 이들을 종합하여 볼 때, 신경염증이 불안장애의 발병 기전에 관여한다는 것을 알 수 있다.

(0001) 대한민국 등록 특허 KR 10-1733578

이에 본 발명자들은 불안증 또는 신경 염증성 질환을 효과적으로 억제하는 화합물을 연구한 결과, 본 발명의 N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide가 염증성 질환의 지표가 되는 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)의 기능을 억제하고, 동물 모델에서 본 발명의 화합물을 투여하여 불안증을 효과적으로 억제한다는 것을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 불안증 또는 신경염증 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하는 것이다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하여 CHI3L1의 효소 활성 기능을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 신경염증 질환은 뇌염증 질환, 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 (i) 상기 설명된 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공된다.

상기 용어“약제학적 유효량”은 본 발명의 화합물이 약학적 활성성분으로서 생체내로 투여되었을 때 실질적인 불안증 또는 신경염증 질환의 억제 효과를 발휘하기에 충분하고 적합한 양을 의미한다.

상기 용어“약제학적으로 허용되는”은 사람에게 투여되었을 때 알레르기반응이나 이와 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정되며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-yl)설페닐]아세트아마이드는 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하여 기능을 저해하고, 신경 염증을 완화하여 불안증세를 호전시키므로 불안증 또는 신경 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 CUMS(Chronic unpredictable mild stress) 스케줄 및 행동 실험 설계방법을 나타낸 것이다.
도 2는 G721-0282가 CHI3L1의 결합 분석을 나타낸 도면이다:
A: G721-0282의 화학적 구조, B: 풀다운 분석, C: 가상의 도킹 모델 분석.
도 3은 CUMS-유도된 동물 모델에서 G721-0282 처리에 따른 항불안 효과를 나타낸 그래프이다:
A, B: 고가 십자 미로 시험(EPMT)
C, D, E, F: Open field test(OFT)
G, H: Novelty suppressed feeding test(NSFT)
I: 자당 선호도 검사(SPT).
도 4는 CUMS-유도된 동물 모델에서 G721-0282의 처리에 따른 신경 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
A: 염증 세포 지표(iNOS, COX-2, GFAP, IBA-1)
B; 염증 인자(IκBα, p65, p50)
C: 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6).
도 5는 LPS-유도된 신경 염증에 대한 G721-0282의 처리에 따른 신경 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
A: 산화 질소 농도
B: 염증성 단백질(iNOS, COX-2), IBA-1
C: 염증 인자(IκBα, p65, p50)
D: 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6).
도 6은 BV-2 세포에서 CHI3L1 siRNA에 의한 신경 염증에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 그래프이다:
A: 염증 세포 지표(iNOS, COX-2, IBA-1)
B: 염증 인자(IκBα, p65, p50)
C: 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6).

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드(N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide)는 "G721-0282"로 약칭하여 기재한다.

본 발명에서는 신경 염증이 불안장애의 발명 기전에 관여한다는 것과, CHI3L1(Chitinase 3-like 1)이 염증성 질환의 지표가 된다는 이전 연구를 통하여 본 발명의 G721-0282은 CHI3L1의 기능을 억제하여 CHI3L1이 매개하는 신경염증을 완화함으로써 불안의 정도를 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 G721-0282은 CUMS(Chronic unpredictable mild stress)를 유도한 동물 모델에서 불안 장애가 완화되었고, 신경 염증을 억제하는데 효과가 뛰어났다.

본 발명의 '불안증'은 불안장애(anxiety disorder)라고도 하며, 극도의 공포, 불안 및 관련된 행동 장애의 특징을 지닌 질환들을 포함한다. 불안은 광범위하게 매우 불쾌하고 막연하게 불안한 느낌으로 미래의 위협에 대한 예측에서 발생하는 현상이며, 공포는 실제로 있거나 혹은 지각된 즉각적인 위협에 대한 감정적 반응이다. 이는 정상적 범위를 넘어선 불안과 공포로 인하여 두통, 심장 박동 증가, 호흡수 증가, 위장관계 이상 등과 같은 신체적 증상이 나타나며, 이로 인해 일상 활동을 수행하기 어려운 경우에 불안장애로 진단할 수 있다. 공황장애, 특정 공포증, 사회 공포증, 강박장애, 범불안장애, 급성 스트레스 장애, 외상 후 스트레스 장애 등이 불안증에 해당한다.

본 발명의 'CHI3L1(Chitinase 3-like 1)'은 키틴을 표적으로 하고 효소 활성이 없는 글리코시드 가수 분해 효소 중의 하나이다. CHI3L1은 대식세포, 호중구, 성상세포 등의 면역세포를 비롯한 다양한 세포에서 분비되는 당단백질로, CHI3L1이 염증성 질환의 지표가 될 수 있다.

따라서 본 발명의 G721-0282은 불안증 또는 신경 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

<실시예 1> 동물 모델

8주령 수컷 BALB/c 마우스를 7일간의 적응기를 가진 후에 그룹당 8마리의 마우스로 총 5개의 그룹 1) 대조군, 2) CUMS(Chronic unpredictable mild stress) 군, 3) CUMS+G721-0282(2.5 mg/kg) 군, 4) CUMS+G721-0282(5 mg/kg) 군, 5) G721-0282(5 mg/kg) 군)으로 나누었다. G721-0282(순도 98%)는 ChemiDiv Inc.(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 원래 용액을 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 함유된 200 ug/ml 저장 용액으로 가공하여 사용하였다.

7일간의 적응기가 끝난 후, 2~4번 그룹은 4주 동안 일요일을 제외한 나머지 날에 매일 다른 경미한 스트레스 요인에 노출시켰다(도 1A).

실험 14일 째부터 3~5번 그룹은 G721-0282를 4주 동안 주 2회 경구투여하였다(도 1B). 1번과 5번 그룹은 동일한 양의 용매를 투여하였다. 불안 정도를 측정하기 위해서 고가 십자 미로 시험(EPMT), Open field test(OFT), Novelty suppressed feeding test(NSFT), 자당 선호도 검사(SPT)를 수행하였다.

<실시예 2> G721-0282 및 CHI3L1의 결합 분석

G721-0282가 CHI3L1과 직접 결합하는지 확인하기 위해 풀다운 분석과 가상의 도킹 모델 분석을 하였다.

구체적으로, G721-0282 접합 세파로오스(Sepharose) 6B 비드, 용매 대조군 비드와 CHI3L1을 과발현하는 BV-2 세포 용해물을 함께 배양한 후 CHI3L1 항체로 검출하였다.

그 결과, CHI3L1 수준은 G721-0282 접합 Sepharose 6B 비드에서 훨씬 높았고, 이는 G721-0282가 CHI3L1과 결합함을 의미한다(도 2B).

또한, G721-0282와 CHI3L1의 결합 부위를 알기 위해 G721-0282와 CHI3L1 간의 가상 도킹 분석을 수행했다.

구체적으로, CHI3L1을 사용한 G721-0282의 도킹 연구는 Autodock VINA (Trott and Olson, 2010)를 사용하여 수행되었다. CHI3L1[PDB : 1NWR]의 3차원 구조를 Protein Data Bank에서 검색하고 AutodockTools를 사용하여 추가로 준비하였다. 그리드 박스(grid box)는 CHI3L1 모노머를 중심으로하고, 그리드 박스의 크기는 전체 모노머를 포함하도록 조정하였다. 도킹 실험은 16, 24, 32, 40 및 60의 다양한 기본 소진 값에서 수행하였고, Molecular graphics for the best binding model은 Discovery Studio Visualizer 2.0을 사용하여 생성하였다.

그 결과, 가상의 도킹 분석으로 G721-0282가 CHI3L1의 아미노산(Trp31, Arg35, Phe58, Trp69, Trp99, Asn100, Arg263, E290, Thr293, Trp352, Leu356)에 결합하는 것을 확인하였으며, 결합 친화력(best binding affinity)은 -7.2 kcal/mol이다(도 2C).

<실시예 3> G721-0282의 항불안 효과 분석

G721-0282의 항불안효과를 측정하기 위해 고가 십자 미로 시험(EPMT), Open field test(OFT), Novelty suppressed feeding test(NSFT), 자당 선호도 검사 (SPT)를 통해 마우스의 불안의 정도를 측정하였다.

구체적으로, 고가 십자 미로 시험(EPMT)에서 마우스가 열린 공간에 체류 시간이 길고 열린 공간으로의 출입 횟수가 많을수록 덜 불안하다고 평가하였다.

그 결과, 열린 공간에서의 체류 시간과 열린 공간으로의 출입 횟수의 비율은 대조군에서 64.66±3.892%, 63.83±3.918%였으며 CUMS 군에서는 32.71±6.437%, 42.80±2.759%로 유의하게 감소했다. 반면 G721-0282 투여 그룹에서는 감소한 체류 시간과 출입 횟수가 투여 용량에 비례하여 증가하였다. 2.5 mg/kg 투여군에서 체류 시간과 출입 횟수의 백분율은 각각 41.36±3.736%와 44.13±3.795%였고, 5 mg/kg 투여군에서는 45.10±6.818%와 57.42±4.144%로 유의하게 증가하였다(도 3A 및 3B).

또한, OFT에서 마우스가 필드 중심에서 체류 시간이 길고 중심에서의 이동거리가 길고 필드 중심으로의 출입 횟수가 많을수록 덜 불안하다고 평가하였다.

그 결과, 모든 그룹에서 총 이동거리에는 차이가 없었다(도 3C).

또한, 필드 중심에서의 이동거리는 대조군에서 284.2±33.94cm이었고 CUMS군에서 174.5±26.58cm로 현저히 감소했다. 그러나 G721-0282 투여군에서는 감소한 이동거리가 회복되었다. 2.5 mg/kg 투여군에서는 233.9±23.19cm로 5 mg/kg 투여군에서는 272.7±36.94cm로 유의하게 증가하였다(도 3D).

또한, 필드 중심으로의 출입 횟수는 대조군에서 29.56±2.422회이고 CUMS 군에서 18.75±2.562회, G721-0282 2.5 mg/kg 투여군에서는 23.13±2.985회, G721-0282 5 mg/kg 투여군에서는 28.14±2.558회로 CUMS를 주었을 때, 감소하고 G721-0282 투여 농도 의존적으로 증가하였다(도 3E).

또한, 필드 중심에서의 체류 시간은 대조군에서 31.28±4.857초였고 CUMS 군에서 15.34±2.349초, G721-0282 2.5 mg/kg 투여군에서 18.73±1.728초, 5 mg/kg 투여군에서 23.00±3.154초로 중심에서의 이동거리와 출입 횟수와 동일한 경향을 보였다(도 3F).

또한, NSFT에서는 필드 중간에 있는 음식을 먹기 시작하기까지의 대기 시간이 짧고, 음식 섭취량이 많을수록 불안의 정도가 낮다고 평가하였다.

음식을 먹기 시작하기까지의 대기 시간은 대조군에서 111.3±18.85초였고 CUMS군에서 252.1±16.32초로 유의하게 증가하였고, G721-0282 투여군에서의 음식을 먹기 시작하기까지의 대기 시간은 2.5 mg/kg 투여군에서 172.0±22.57초, 5 mg/kg 투여군에서 134.9±27.09 초로 투여 농도 의존적으로 감소하였다(도 3G).

또한, 음식 섭취량은 대조군에서 0.1214±0.01969g이었고 CUMS 군에서 0.04889±0.01695g으로 유의하게 감소하였다. G721-0282 투여군에서의 음식섭취량은 2.5 mg/kg 투여군에서 0.09375±0.01762g으로 5 mg/kg 투여군에서는 0.1114±0.02344g으로 증가하였다(도 3H).

또한, SPT에서는 마우스가 스트레스를 많이 받을수록 자당 용액에 대한 선호도가 낮아지는 성질을 이용한다. 자당 선호도는 한 시간 동안 섭취한 자당 용액의 부피와 한 시간 동안 섭취한 자당 용액과 물의 총 부피의 비율로 정의하였다. 자당 선호도는 대조군에서 56.08±2.745%, CUMS 군에서 34.31±0.9804%, G721-0282 투여군에서 2.5 mg/kg 투여군에서는 42.26±0.5952%, 5 mg/kg 투여군에서는 57.14±4.286%로 CUMS 군에서 자당 선호도가 감소하고 G721-0282 투여 농도 의존적으로 증가하였다(도 3I).

따라서, CUMS로 인해 불안함이 증가하고 G721-0282를 투여함으로써 완화된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 4> G721-0282의 신경 염증 억제 효과 분석

CUMS(Chronic unpredictable mild stress)와 G721-0282 투여가 뇌의 염증 반응에 미치는 영향을 측정하기 위해 웨스턴 블롯과 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 웨스턴 블롯으로 염증성 단백질인 iNOS, COX-2 및 reactive astrocyte의 지표인 GFAP, activated microglia의 지표인 IBA-1의 수준을 측정하였다. 웨스턴 블롯은 균질화된 뇌 조직 및 세포를 단백질 추출 용액 PRO-PREP, iNtRON, 성남, 한국)에 의해 용해시키고 Bradford reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다. 80 ㎍의 추출된 단백질을 SDS/PAGE로 분리하고 Immobilon® PVDF 멤브레인(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 5% BSA로 차단한 후, 4℃에서 오버나잇으로 1 차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 멤브레인을 0.05% Tween-20(TBST)을 함유하는 TBS(Tris-buffered saline)로 세척하고 희석된 HRP(horseradish peroxidase)와 결합된 이차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, Immobilon Western Chemilum HRP substrate (Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 PVDF 막에 대한 항체의 결합을 검출하였다. 밴드 강도는 Fusion FX 7 image acquisition system (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany)을 사용하여 측정되었고 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

표적 단백질을 검출하기 위하여, CHI3L1에 특이적인 항체 iNOS, IBA-1 및 GFAP(1:1000; Abcam, Inc., Cambridge, UK), COX-2(1:1000; Novus Biologicals, Inc., CO, USA), NF-κB 억제제(IκB)α, p-IκBα, p65 및 p50(1:000; Cell signaling Technology, Inc., MA, USA), IGFBP3(1:1000; Abnova, Inc., Taipei, Taiwan) 및 β- 액틴(1:200; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다. 블롯은 Santa Cruz Biotechnology Inc(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입한 항-마우스, 항-토끼 및 항-염소와 같은 상응하는 컨쥬 게이트된 이차 항체와 인큐베이션하였다.

그 결과, iNOS, COX-2, GFAP, IBA-1은 CUMS로 인해 유의적으로 증가하고, G721-0282 투여 농도 의존적으로 감소하였다(도 4A).

또한, NF-κB 신호 전달은 염증 반응과 높은 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. CUMS로 인해 마우스의 뇌에서 IκBα의 인산화가 증가하고, p65와 p50의 핵으로의 전좌(Translocation)이 증가하였고, G721-0282 투여시 이러한 NF-κB 신호 전달의 활성화가 감소하였다(도 4B).

또한, CUMS에서 전염증성 사이토카인의 생성은 신경염증의 발생과 밀접한 관련이 있다. 마우스의 뇌에서 전염증성 사이토카인의 발현량을 정량적으로 분석하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, qRT-PCR은 해마 조직 및 BV-2 세포로부터 RiboEX(Geneall biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출하고, High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. Quantitative real-time PCR은 맞춤형 설계 프라이머를 위해 7500 real-time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하였으며, β-액틴는 HiPi Real-Time PCR SYBR green master mix(ELPIS biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 house-keeping 대조군으로 사용하였다. 사이클링 조건은 94℃에서 3분의 초기 변성 단계, 94℃에서 30초의 변성 단계, 60℃에서 30초의 어닐링 단계 및 72℃에서 1분의 연장 단계로 총 40 사이클로 수행하였다. 표적 유전자 발현에서 얻은 값을 β-액틴으로 정규화하고 대조군의 발현에 대하여 정량하였다.

그 결과, CUMS로 인하여 뇌에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현량이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였고 G721-0282 투여 시 증가한 전염증성 사이토카인의 발현량이 감소하였다(도 4C).

따라서 만성적인 스트레스로 인해 염증성 단백질 및 사이토카인의 증가되고, NF-κB 신호 전달의 활성화와 같은 신경염증이 발생하나, G721-0282의 투여로 인해 신경 염증의 완화됨을 확인하였다.

<실시예 5> G721-0282의 세포에서 염증 억제 효과 분석

G721-0282의 신경염증 억제 효과를 microglial BV-2 세포에서 측정하기 위해 산화 질소 분석(Nitric oxide assay), 웨스턴 블롯, qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 산화 질소 분석(Nitric oxide assay)은 BV-2 세포를 96-웰 플레이트에서 성장시킨 후, 다양한 농도의 G721-0282(5, 10, 20 μM)를 처리하여 24 시간 동안 LPS(1 μg/mL)를 첨가 또는 첨가하지 않고 배양하였다. 상층액에서 아질산염 농도는 NO detection kit(Intron Biotechnology, Kyungki-do, Korea)로 측정하였다. 520 nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 흡광도 판독기에서 측정되었고, 일련의 공지된 농도의 아질산 나트륨이 표준으로 사용하였다. 웨스턴 블롯, qRT-PCR의 실험방법은 상기 실시예 4에 개시하였다.

그 결과, LPS 처리로 산화질소의 농도가 증가하였지만. G721-0282 처리 농도 의존적으로 산화질소의 농도가 감소하였다(도 5A).

또한, 염증성 단백질인 iNOS, COX-2 및 활성화된 microglia의 지표인 IBA-1의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

그 결과, LPS 처리군에서 iNOS, COX-2, IBA-1의 발현량이 증가하였고, G721-0282의 투여 농도(5, 10, 20 μM) 의존적으로 감소하였다(도 5B).

또한, LPS에 의해 BV-2 세포에서 IκBα의 인산화와 p65, p50의 핵 안으로의 전좌(Translocation) 증가는 G721-0282 처리로 인해 감소하였다(도 5C).

또한, LPS로 유도된 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 전염증성 사이토카인 증가가 G721-0282 처리로 인해 농도 의존적으로 감소하였다(도 5D).

<실시예 6> G721-0282의 항염증 및 항불안 효과 분석

G721-0282가 CHI3L1을 표적으로 하여 항염증 및 항불안효과를 발휘하는지를 조사하기 위해 BV-2 세포에 CHI3L1 siRNA를 처리하여 CHI3L1 결핍 환경을 만들었다.

구체적으로, CHI3L1 KD 세포와 정상 세포에서 G721-0282의 항신경염증 효과를 웨스턴 블롯과 qRT-PCR로 비교하였다. 웨스턴 블롯, qRT-PCR의 실험방법은 상기 실시예 4에 개시하였다.

그 결과, 정상 세포에서 LPS에 의해 증가한 iNOS, COX-2, IBA-1은 G721-0282 처리로 인해 감소하였으나, CHI3L1 KD 세포에서는 G721-0282 투여에도 불구하고 감소하지 않았다(도 6A).

또한, LPS로 인해 증가한 IκB의 인산화와 p65, p50의 핵 안으로의 Translocation의 증가와 같은 NF-κB 신호의 활성화는 정상 세포에서 G721-0282에 의해 감소하였으나, CHI3L1 KD 세포에서는 감소하지 않았다(도 6B).

또한, LPS로 인해 증가한 TNF-α, IL-1β, IL-6과 같은 전염증성 사이토카인의 발현량은 G721-0282의 처리로 인해 정상 세포에서는 유의적으로 감소하였으나 CHI3L1 KD 세포에서는 유의적인 감소가 없었다(도 6C).

따라서 G721-0282는 CHI3L1을 표적으로 하여 항염증 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
불안증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하는 것인 불안증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 CHI3L1(Chitinase 3-like 1)와 결합하여 CHI3L1의 효소 활성 기능을 억제하는 것인 불안증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
뇌염증 질환, 다발성 경화증, 우울증, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 정신분열증 및 근위축성측색경화증 중 어느 하나의 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 1]

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