KR102244434B1 - 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법 - Google Patents

재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드 및 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.

Description

재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법{Expression Vector and Method of Preparing a Polypeptide of Interest Using the Same}
프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.
항체 등의 치료용 단백질이 신약 시장의 강자로 자리매김 하면서, 다양한 타겟에 대한 치료제로 개발되고 있다. 개발된 단백질 치료제의 제품화는 물론 효능을 시험하기 위해서 단백질의 생산은 필수적이다.
동물세포를 이용한 단백질의 생산은 미생물을 이용하여 치료제를 생산하는 것에 비해 물질의 효능은 증대를 시키지만, 생산량은 제한적이라는 한계점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 하나의 방법으로, 단백질을 생산하기 위한 가장 기본적인 요소인 재조합 벡터에 대한 연구와 개발이 꾸준히 진행되고 있다.
대한민국 공개특허 제2011-0047698호
일 예는 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 예컨대 동물세포에서 작동 가능한 프로모터로서 사용될 수 있다. 따라서, 다른 예는 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 프로모터를 제공한다.
다른 예는 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결되는 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능한 것일 수 있다.
다른 예는 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드 및 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하고, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리펩타이드 암호화 유전자에 작동 가능하게 연결된 것인 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능한 것일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 상기 재조합 세포를 이용하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 인트론의 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 벡터 제작을 위한 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 예컨대 동물 세포 (예컨대, 포유동물 세포)에서 작동 가능한 프로모터로서 사용될 수 있다. 따라서, 다른 예는 인간 CMV 프로모터 및 인트론을 포함하는 융합 프로모터를 제공한다.
프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 인자 중 하나로, 통상적으로 약 100 내지 약 2000 bp, 약 100 내지 약 1500 bp 또는 약 100 내지 약 1000 bp 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이다.
본 발명에서 사용 가능한 프로모터는 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포 (예컨대, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포) 등에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 프로모터는 인간 CMV (Human Cytomegalo Virus; hCMV) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터 등의 원핵 세포 또는 포유류 바이러스의 프로모터, 및 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터 등의 동물 세포 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프로모터는 인간 CMV (hCMV) 프로모터 전부 또는 일부일 수 있다. 상기 인간 CMV 프로모터는 i) 인간 CMV 즉시 조기 인핸서/프로모터(human CMV immediate-early enhancer/promoter; 인간 CMV IE 인핸서/프로모터)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편, ii) 인간 CMV IE 인핸서/프로모터 내의 100bp 이상, 200bp 이상, 300bp 이상, 400bp 이상, 또는 500bp 이상, 예컨대 100 내지 1000bp, 200 내지 900bp, 300 내지 800bp, 400 내지 750bp, 또는 500 내지 750bp의 연속하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편, 또는 iii) 상기 폴리뉴클레오타이드 단편 i) 또는 ii)와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체(프로모터 기능 유지)일 수 있다.
일 예에서, 상기 i) 인간 CMV IE 인핸서/프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 GenBank Accession No. X03922.1 (1848bp; 서열번호 116)의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다:
GenBank Accession No. X03922.1 (1848bp; 서열번호 116)
CTGCAGTGAA TAATAAAATG TGTGTTTGTC CGAAATACGC GTTTGAGATT 50
TCTGTCCCGA CTAAATTCAT GTCGCGCGAT AGTGGTGTTT ATCGCCGATA 100
GAGATGGCGA TATTGGAAAA ATCGATATTT GAAAATATGG CATATTGAAA 150
ATGTCGCCGA TGTGAGTTTC TGTGTAACTG ATATCGCCAT TTTTCCAAAA 200
GTTGATTTTT GGGCATACGC GATATCTGGC GATACGCTTA TATCGTTTAC 250
GGGGGATGGC GATAGACGCC TTTGGTGACT TGGGCGATTC TGTGTGTCGC 300
AAATATCGCA GTTTCGATAT AGGTGACAGA CGATATGAGG CTATATCGCC 350
GATAGAGGCG ACATCAAGCT GGCACATGGC CAATGCATAT CGATCTATAC 400
ATTGAATCAA TATTGGCCAT TAGCCATATT ATTCATTGGT TATATAGCAT 450
AAATCAATAT TGGCTATTGG CCATTGCATA CGTTGTATCC ATATCATAAT 500
ATGTACATTT ATATTGGCTC ATGTCCAACA TTACCGCCAT GTTGACATTG 550
ATTATTGACT AGTTATTAAT AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA 600
GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT 650
GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG ACGTCAATAA TGACGTATGT 700
TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGT 750
ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA 800
AGTACGCCCC CTATTGACGT CAATGACGGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA 850
TGCCCAGTAC ATGACCTTAT GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG 900
TATTAGTCAT CGCTATTACC ATGGTGATGC GGTTTTGGCA GTACATCAAT 950
GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA TTTCCAAGTC TCCACCCCAT 1000
TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA AAATCAACGG GACTTTCCAA 1050
AATGTCGTAA CAACTCCGCC CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA 1100
CGGTGGGAGG TCTATATAAG CAGAGCTCGT TTAGTGAACC GTCAGATCGC 1150
CTGGAGACGC CATCCACGCT GTTTTGACCT CCATAGAAGA CACCGGGACC 1200
GATCCAGCCT CCGCGGCCGG GAACGGTGCA TTGGAACGCG GATTCCCCGT 1250
GCCAAGAGTG ACGTAAGTAC CGCCTATAGA GTCTATAGGC CCACCCCCTT 1300
GGCTTCTTAT GCATGCTATA CTGTTTTTGG CTTGGGGTCT ATACACCCCC 1350
GCTTCCTCAT GTTATAGGTG ATGGTATAGC TTAGCCTATA GGTGTGGGTT 1400
ATTGACCATT ATTGACCACT CCCCTATTGG TGACGATACT TTCCATTACT 1450
AATCCATAAC ATGGCTCTTT GCACAACTCT CTTTATTGGC TATATGCCAA 1500
TACACTGTCC TTCAGAGACT GACACGGACT CTGTATTTTT ACAGGATGGG 1550
GTCTCATTTA TTATTTACAA ATTCACATAT ACAACACCAC CGTCCCCAGT 1600
GCCCGCAGTT TTTATTAAAC ATAACGTGGG ATCTCCAGCG AATCTCGGGT 1650
ACGTGTTCCG GACATGGGGC TCTTCTCCGG TAGCGGCGGA GCTTCTACAT 1700
CCAGCCCTGC TCCCATCCTC CCACTCATGG TCCTCGGCAG CTCCTTGCTC 1750
CTAACAGTGG AGGCCAGACT TAGGCACAGC ACGATGCCCA CCACCACCAG 1800
TGTGCCCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT GTGTCTGAAA ATGAGCTC 1848
상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편은 (a) 서열번호 116 (X03922.1) 내의 400번째 염기부터 1250번째 염기까지의 부위 중의 100bp 이상, 200bp 이상, 300bp 이상, 400bp 이상, 또는 500bp 이상, 예컨대 100 내지 850bp, 200 내지 800bp, 300 내지 750bp, 400 내지 750bp, 400 내지 750bp, 또는 500 내지 750bp의 연속하는 염기서열을 포함하는 (또는 구성되는) 폴리뉴클레오타이드 단편일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편은 서열번호 116의 400 내지 650번째까지의 염기 중에서 선택된 하나의 염기부터 3' 방향으로 100bp 이상, 200bp 이상, 300bp 이상, 400bp 이상, 또는 500bp 이상, 예컨대 100 내지 850bp, 200 내지 800bp, 300 내지 750bp, 400 내지 750bp, 400 내지 750bp, 또는 500 내지 750bp의 연속하는 염기서열; 예컨대, 서열번호 116의 400 내지 410번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기, 530 내지 550번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기, 또는 615 내지 625번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기부터 3' 방향으로 100bp 이상, 200bp 이상, 300bp 이상, 400bp 이상, 또는 500bp 이상, 예컨대 100 내지 850bp, 200 내지 800bp, 300 내지 750bp, 400 내지 750bp, 400 내지 750bp, 또는 500 내지 750bp의 연속하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편은 서열번호 119, 120 또는 121의 염기서열, 또는 상기 염기서열 중의 200bp 이상, 300bp 이상 또는 400bp 이상의 연속하는 염기서열을 포함하는(또는 구성되는) 것일 수 있다.
상기 iii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체는 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기서열(프로모터 기능 유지)을 포함하는(또는 구성되는) 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체로서,
iii-1) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 중의 하나 이상의 염기의 치환 및 결실 및 하나 이상의 위치에 염기 추가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체; 또는
iii-2) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 상기 (iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체를 포함하는 총 길이 200 내지 2000bp, 200 내지 1000bp, 200 내지 800bp, 200 내지 750bp, 300 내지 2000bp, 300 내지 1500bp, 300 내지 1000bp, 300 내지 800bp, 300 내지 750bp, 400 내지 2000bp, 400 내지 1500bp, 400 내지 1000bp, 400 내지 800bp, 400 내지 750bp, 500 내지 2000bp, 500 내지 1500bp, 500 내지 1000bp, 500 내지 800bp, 또는 500 내지 750bp의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체 (이 때 상기 ii) 또는 (iii-1)의 염기서열 이외의 부분은 A, T, G 및 C 중 선택된 하나 이상의 임의의 염기로 이루어지는 것)
일 수 있다
예컨대, 상기 (iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체에 있어서, 상기 염기 치환은, 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편의 염기서열 중에서, 서열번호 116 (X03922.1)의 490번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 529번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 532번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 545번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 504번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 651번째 위치에 해당하는 염기(G), 서열번호 116의 804번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 870번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 946번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 1061번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 1065번째 위치에 해당하는 염기(T), 및 서열번호 116의 1073번째 위치에 해당하는 염기(A)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기가 상이한 염기로 치환되는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 아미노산 치환은 490번째 염기 C가 T로 치환(C490T), 529번째 염기 C가 T로 치환(C529T), 532번째 염기 T가 G로 치환(T532G), 545번째 염기 A가 G로 치환(A545G), 651번째 염기 G가 C로 치환(G651C), 804번째 염기 A가 C로 치환(A804C), 870번째 염기 T가 C로 치환(T870C), 946번째 염기 T가 C로 치환(T946C), 1061번째 염기 C가 T로 치환(C1061T), 1065번째 염기 T가 C로 치환(T1065C), 및 1073번째 염기 A가 G로 치환(A1073G)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다 (상기 염기 위치는 서열번호 116 (X03922.1)의 염기서열 내 위치를 기준으로 함). 상기 염기 결실은 서열번호 116 (X03922.1)의 653번째 위치에 해당하는 염기(C)가 결실된 것일 수 있다. 상기 염기 추가는 서열번호 116 (X03922.1)의 805번째와 806번째 위치 사이에 염기 (A, T, G, 또는 C, 예컨대, G)가 추가된 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 (iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체는 서열번호 118, 122, 또는 124의 염기서열, 또는 상기 염기서열 중의 200bp 이상, 300bp 이상 또는 400bp 이상의 연속하는 염기서열을 포함하는(또는 구성되는) 것일 수 있다.
또한, 상기 (iii-2)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체는 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 상기 (iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두 (예컨대, 3' 말단)에 1 내지 100bp 또는 5 내지 60bp, 예컨대 5 내지 20bp 또는 45 내지 60bp 길이의 임의의 염기로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 추가로 포함되는 염기서열은 서열번호 125 (ACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAG) 또는 서열번호 126 (GACTCTA)으로 표현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 (iii-2)의 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체는 서열번호 117 또는 123의 염기서열, 또는 상기 염기서열 중의 200bp 이상, 300bp 이상 또는 400bp 이상의 연속하는 염기서열을 포함하는(또는 구성되는) 것일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 프로모터의 예를 아래의 표 1에 예시하였다:
서열번호 X03922.1 상 위치1 ) 서열 상동성2 ) 변이3 ) 서열 (밑줄: X03922.1 기준으로 추가된 염기)
117
(도 4 참조)		 407-1148 (742bp) 99% (732/742) C490T, C529T, T532G, A545G, A804C, T870C, T946C, C1061T, T1065C, A1073G
&
3' 말단에 'ACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAG'(서열번호 125) 추가 포함		 TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAG(795bp)
118 (도 5 참조) 545-1138 (594bp) 99% (588/594) A804C, T870C, T946C, C1061T, T1065C, A1073G ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAA(594bp)
119 (도 6 참조) 619-1127 (509bp) 100% - GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(509bp)
120 (도 7 참조) 620-1127 (508bp) 100% - CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(508bp)
121 (도 8 참조) 544-1127 (584bp) 100% - GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(584bp)
122 (도 9 참조) 541-1128 (588bp) 99% (582/588) A804C, T870C, T946C, C1061T, T1065C, A1073G GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC(588bp)
123 (도 10 참조) 541-1213 (673bp) 100% 3' 말단에 'GACTCTA'(서열번호 126) 추가 포함 GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTA(680bp)
124 (도 11 참조) 532-1128 (597bp) 98% (588/597)
2 Gaps		 T532G, G651C, C653 결실,
A804C,
805 & 806 사이 염기(G) 추가, T870C, T946C, C1061T, T1065C, A1073G		 GACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTCGTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC(597bp)
1) 서열번호 116 (X03922.1) 상의 각 프로모터 서열과 상동성을 갖는 부위
2) 상기 1) 부위와 이에 대응하는 각 프로모터 서열 간의 서열 상동성
3) 변이 위치는 서열번호 116 (X03922.1) 상의 위치를 기준으로 기재함
본 명세서에 기재된 서열번호 116 상의 위치를 기준으로 하여 이에 해당하는 각 폴리뉴클레오타이드 단편 상의 위치는 도 4 내지 11을 참조로 명확하게 알 수 있다.
인트론 (intron)은 전사 후 단백질로 해독되는 엑손 (exon) 영역 사이에 위치(intervening sequence)하는 비해독 염기서열이다. 전사된 mRNA 전구체는 스플라이싱(splicing)에 의해 비해독 영역인 인트론이 제거되어 성숙 mRNA로 전환된다. 본 명세서에서 사용된 바로서, 인트론은 스플라이싱 공여체와 수용체, 3배수 구아닌 모티프, 및/또는 분기점 서열을 포함하는 의미로도 사용된다.
본 발명에서 사용 가능한 인트론은 동물, 예컨대 포유 동물 (예컨대, 인간)으로부터 유래하는 유전자에서 분리된 인트론일 수 있다. 상기 인트론은 면역글로불린(Immunoglobulin) 인트론 (예컨대, IGLV 인트론, IGKV 인트론, IGH 인트론 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상), 키메라 인트론, 인트론 A 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 인트론은 IGLV 인트론, IGKV 인트론, 및 IGH 인트론으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
IGLV (immunoglobulin lambda variable) 인트론은 면역글로불린 람다 경쇄의 가변 영역 코딩 유전자의 인트론 부분을 의미하는 것으로, 본 발명에서 사용 가능한 IGLV 인트론은, 예컨대, 인간 IGLV 인트론 (IGLV-1L1; 예컨대, Accession No. X59707의 71~185 부위; 115 bp; 서열번호 109); 상기 서열번호 109 내의 연속하는 10 내지 114bp, 30 내지 114bp, 50 내지 114bp, 80 내지 114bp 또는 100 내지 114bp 길이의 인트론 단편; 상기 서열번호 109의 인트론 또는 이의 인트론 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 인트론 변이체; 또는 상기 서열번호 109의 인트론 또는 이의 인트론 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 50bp 또는 10 내지 30bp 길이의 임의의 염기 (독립적으로 A, T, G, 및 C 중에서 선택됨)로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 인트론 변이체일 수 있다.
IGKV (immunoglobulin kappa variable) 인트론은 면역글로불린 카파 경쇄의 가변 영역 코딩 유전자의 인트론 부분을 의미하는 것으로, 본 발명에서 사용 가능한 IGKV 인트론은, 예컨대 인간 IGKV 인트론 (예컨대, Accession No. M27751.1, 또는 X12688.1의 269~474 부위; 206 bp; 서열번호 110); 상기 서열번호 110 내의 연속하는 100 내지 205bp, 130 내지 205bp, 150 내지 205bp, 180 내지 205bp 또는 200 내지 205bp 길이의 인트론 단편; 상기 서열번호 110의 인트론 또는 이의 인트론 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 인트론 변이체; 또는 상기 서열번호 110의 인트론 또는 이의 인트론 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 50bp 또는 10 내지 30bp 길이의 임의의 염기 (독립적으로 A, T, G, 및 C 중에서 선택됨)로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 인트론 변이체일 수 있다.
IGH (immunoglobulin heavy locus) 인트론은 면역글로불린 중쇄 코딩 유전자의 인트론 부분을 의미한다. IGH은 IgA, IgD, IgG, IgM, 또는 IgE의 서브타입에서 유리하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 IGH 인트론은 인간 IGH 인트론 (예컨대, Accession No. M29811의 197~278 부위; 82 bp; 서열번호 111); 상기 서열번호 111 내의 연속하는 10 내지 81bp, 30 내지 81bp, 또는 50 내지 81bp 길이의 인트론 단편; 상기 서열번호 111의 인트론 또는 이의 인트론 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 인트론 변이체; 또는 상기 서열번호 111의 인트론 또는 이의 인트론 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 50bp 또는 10 내지 30bp 길이의 임의의 염기 (독립적으로 A, T, G, 및 C 중에서 선택됨)로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 인트론 변이체일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 키메라 인트론 (chimeric intron)은 예컨대 서열번호 112 (133bp)의 염기서열을 갖는 것; 상기 서열번호 112 내의 연속하는 10 내지 132bp, 30 내지 132bp, 50 내지 132bp, 80 내지 132bp 또는 100 내지 132bp 길이의 인트론 단편; 상기 서열번호 112의 인트론 또는 이의 인트론 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 인트론 변이체; 또는 상기 서열번호 112의 인트론 또는 이의 인트론 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 50bp 또는 10 내지 30bp 길이의 임의의 염기 (독립적으로 A, T, G, 및 C 중에서 선택됨)로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 인트론 변이체일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 인트론 A (Intron A)는, 예컨대, 인간 인트론 A (예컨대, 서열번호 113 (963 bp)); 상기 서열번호 113 내의 연속하는 100 내지 962bp, 300 내지 962bp, 500 내지 963bp, 800 내지 963bp 또는 900 내지 963bp 길이의 인트론 단편; 상기 서열번호 113의 인트론 또는 이의 인트론 단편과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 인트론 변이체; 또는 상기 서열번호 113의 인트론 또는 이의 인트론 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 100bp, 10 내지 50bp 또는 10 내지 30bp 길이의 임의의 염기 (독립적으로 A, T, G, 및 C 중에서 선택됨)로 이루어진 염기서열이 추가로 포함된 인트론 변이체 일 수 있다.상기 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 융합 프로모터에 있어서, 상기 인트론은 상기 프로모터의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 3' 말단과 5' 말단 모두 (동종 또는 이종의 인트론이 2개 이상 포함되는 경우)에 연결된 것일 수 있으며, 예컨대, 상기 인트론은 상기 프로모터의 3' 말단에 연결된 것일 수 있다. 상기 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 융합 프로모터에 있어서, 상기 프로모터와 인트론은 적절한 링커를 통하여 연결되거나 링커 없이 직접 연결된 것일 수 있다.다른 예는 프로모터의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 3' 말단과 5' 말단 모두 (동종 또는 이종의 인트론이 2개 이상 포함되는 경우)에 인트론을 연결시키는 단계를 포함하는 융합 프로모터 제조 방법을 제공한다. 상기 융합 프로모터는 동물세포, 예컨대 포유 동물 세포에서 작동 가능한 것일 수 있다. 상기 프로모터 및 인트론의 상세한 사항은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 융합 폴리뉴클레오타이드 (또는 융합 프로모터)는 작동 가능하게 연결된 유전자의 강력한 전사 개시를 유도하는 기능을 가질 수 있다. 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 모든 숙주 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포에서 전사 개시를 강력하게 유도할 수 있는 것일 수 있으며, 예컨대, 포유동물 세포와 같은 동물세포에서 전사 개시를 유도하는 것일 수 있다. 상기 포유동물 세포는 마우스 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20 또는 NIH3T3), 래트 (예컨대, PC12, PC12h, GH3, 또는 MtT), 햄스터 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1 및 Vero), 인간 (예컨대, Hela, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포, 또는 HepG2) 등에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자(이하, "목적 유전자")가 작동 가능하게 연결되는 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있다.
다른 예에서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드 및 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 이 때, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 프로모터로서 작용하며 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 프로모터를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예컨대 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈 (Invitrogen), pCI (Promega), Mammalian expression vector (Sigma), pCMV-Tag epitope taggging mammalian vector(Stratagene), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 목적 유전자는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드가 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 목적 유전자의 5' 말단에 연결된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 포함된 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열은 폴리아데닐화 서열(pA; 예컨대, 서열번호 115)과 같은 전사 종결 서열; f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등의 복제 원점 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항 유전자 및/또는 대사 관련 효소 유전자 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타미 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따른 재조합 벡터를 도 12에 예시적으로 나타내었다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터가 숙주 세포 내로 도입(tranfection)된 것을 의미한다. 상기 재조합 세포가 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (목적 유전자)를 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우, 상기 목적 유전자는 상기 인간 CMV 프로모터와 인트론을 포함하는 재조합 벡터와 동일한 벡터 또는 별개의 벡터를 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
상기 재조합 세포로는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드가 프로모터로서 작동 가능하고(즉, 전사 개시 기능을 나타낼 수 있고), 목적 유전자의 발현을 허용하고 하는 모든 종류의 포유동물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명을 위해 적합한 포유동물 숙주 세포는 마우스 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20 또는 NIH3T3), 래트 (PC12, PC12h, GH3, MtT), 햄스터 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 및 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1 및 Vero), 인간 (예컨대, HeLa, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 및 HepG2) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으니, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포(형질전환체)를 선별하는 방법은 통상적인 선별 마커를 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커가 앞서 설명한 바와 같은 특정 항생제 저항 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드가 질병 또는 병적 증상의 예방, 치료 및/또는 경감과 관련된 기능을 갖는 것인 경우, 본 발명의 다른 예는 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 세포 및 상기 재조합 세포의 배양물 (세포 포함 또는 무세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 예에서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및/또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포의 목적 폴리펩타이드 생산 증진 용도가 제공된다. 구체적으로, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드 및 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 상기 재조합 세포를 이용하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다.
일 예에서, 상기 생산 방법은 상기 재조합 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자의 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 유전자를 발현시키는 단계는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 유전자를 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 및 세포 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 상기 생산 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에, 상기 발현물 또는 배양물로부터 상기 목적 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 수득 단계는 상기 재조합 세포의 파쇄물 및/또는 상기 배양 배지(폴리펩타이드가 배지로 분비되는 경우)로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 수득된 폴리펩타이드가 목적하는 품질 및/또는 순도를 갖도록 하기 위한 추가의 처리 단계, 예컨대, 정제 및/또는 변형 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩타이드는 임의의 길이의 폴리펩타이드, 예컨대, 단백질 (예컨대, 50개 초과의 아미노산을 포함) 또는 펩타이드 (예컨대, 2 내지 49개의 아미노산 포함)일 수 있다.
본 발명에서의 "목적 폴리펩타이드"는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드(예컨대, 면역글로불린), 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드는 내부 또는 외래의 것일 수 있으며, 외래의 것인 경우 숙주세포와 동종 또는 이종의 세포에서 유래하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역글로불린 (항체)은 임의의 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 분자일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 부위, 예컨대, CDS, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv, scFv, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody) (예컨대, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 등), 단일 도메인 항체, 애피바디 (affibody) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상일 수 있다. 상기 항체 변이체는 항체와 동일한 결합 기능을 갖지만 본래 항체와 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 예컨대, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 (chimera) 항체, 또는 인간화 항체일 수 있으며, 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 생성된 것 (예컨대, 재조합 또는 합성적으로 생성된 것)일 수 있다. 목적 폴리펩타이드가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 상기 재조합 벡터는 i) 중쇄 유전자, 및/또는 경쇄 유전자, 또는 항원 결합 단편 유전자와, ii) 이와 작동 가능하게 연결된 융합 프로모터(융합 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 중쇄 유전자와 경쇄 유전자는 하나의 벡터에 함께 포함되거나 각각 별도의 벡터에 포함될 수 있다. 숙주 세포에 도입시에 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 함께 또는 각각 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 인슐린, 사람 성장 호르몬(hGH), 인슐린-유사 성장 인자, EGF, VERF 등의 각종 성장 인자, 각종 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 목적 유전자는 내부 또는 외래의 것일 수 있으며, 외래의 것인 경우 숙주세포와 동종 또는 이종의 세포에서 유래하는 것일 수 있다. 상기 목적 유전자는 상기와 같은 목적 폴리펩타이드 정의에 의하여 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 그 구체적 사항 (예컨대 염기서열 등)을 명확하게 알 수 있다.
일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하고,
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13 (서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 생체로부터 분리되거나 비자연적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예컨대, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 목적 폴리펩타이드가 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 이를 암호화하는 목적 유전자는 상기 항 c-Met 항체의 앞서 설명한 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 유전자는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 76, 및 서열번호 77로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 서열번호 124의 염기서열을 포함하는 (또는 구성되는) 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 서열번호 124의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 포유동물과 같은 동물 세포에서 작동가능한 프로모터로서 사용될 수 있다. 또 다른 예는 상기 서열번호 124의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터 및 재조합 세포와 관련된 상세한 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 치료용 단백질 또는 항체의 고발현을 위한 동물세포 재조합 벡터를 제공하며, 이는 항 c-Met 항체를 비롯한 다양한 치료용 단백질의 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제작된 인간 CMV 프로모터와 인트론의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 기본 벡터의 개열지도이다.
도 2는 293F 세포에서 인간 CMV 프로모터와 인트론의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 항 c-Met 항체를 발현한 경우의 항체의 생산량을 인트론을 포함하지 않은 재조합 벡터의 생산량을 비교하여 나타낸 그래프이다 (CMV-Opti301: 단독 human CMV, CA-Opti301: human CMV + Intron A, CK-Opti301: human CMV + IGKV Intron, CC-Opti301: human CMV + chimeric intron).
도 3은 CHO 세포에서 인간 CMV 프로모터와 인트론의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 항 c-Met 항체를 발현한 경우의 항체의 생산량을 인트론을 포함하지 않은 재조합 벡터의 생산량을 비교하여 나타낸 그래프이다 (hCMV-Opti301: 단독 human CMV, CA-Opti301: human CMV + Intron A, hCK-Opti301: human CMV + IGKV Intron, hCH-Opti301: human CMV + IGH Intron, hCC-Opti301: human CMV + chimeric intron).
도 4는 서열번호 116과 서열번호 117 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것으로, 노란색으로 표시된 부분이 서열번호 117의 변이 위치이다.
도 5는 서열번호 116과 서열번호 118 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것으로, 노란색으로 표시된 부분이 서열번호 118의 변이 위치이다.
도 6은 서열번호 116과 서열번호 119 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것이다.
도 7은 서열번호 116과 서열번호 120 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 서열번호 116과 서열번호 121 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것이다.
도 9는 서열번호 116과 서열번호 122 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것으로, 노란색으로 표시된 부분이 서열번호 122의 변이 위치이다.
도 10은 서열번호 116과 서열번호 123 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것이다 (추가된 서열은 표시되지 않음).
도 11은 서열번호 116과 서열번호 124 간의 sequence alignment 결과를 보여주는 것으로, 노란색으로 표시된 부분이 서열번호 124의 변이 위치이다.
도 12는 인간 CMV 프로모터와 인트론의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 벡터의 개열지도를 예시적으로 보여주는 것이다.
도 13은 인간 CMV 프로모터와 인트론의 융합 폴리펩타이드, 선별 마커 (GS 또는 DHFR), 및 IRES (Internal Ribosome Entry Site)를 포함하는 재조합 벡터의 개열지도를 예시적으로 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 벡터의 제작
본 실시예는 인간 CMV (hCMV) 프로모터 및 hCMV 프로모터 와 인트론이 조합(combination)된 융합 프로모터의 제어 하에서 목적단백질의 발현을 비교하기 위한 것이다.
유전자 합성을 통하여 hCMV 프로모터(서열번호 124)와 인트론 A (서열번호 113)가 조합된 융합 프로모터를 일차적으로 합성하고, 이를 이용하여 기본 벡터 pCA를 제작하였다 (도 1 참조). 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터는 hCMV 프로모터와 인트론 A 조합을 기점으로 5'-말단에는 제한효소 (restriction enzyme) MluI 인식 부위를, 3'-말단에는 EcoRI 인식 부위를 가지도록 설계하였다.
hCMV 프로모터와 다른 인트론의 조합을 위해, 3'-말단에 MfeI 제한효소 부위를 가지는 hCMV 프로모터 단편 (hCMV short fragment)을 PCR로 증폭하였다. 정방향 프라이머 (CA-Fw)와 3'-말단에 MfeI 제한효소 부위를 가지는 역방향 프라이머 (hCM-Rv)을 이용하여 pCA 벡터 (도 1 참조)를 주형 (template)으로 하여 94℃ 5분 처리 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 과정을 20회 반복 한 후 72℃ 5분간 연장하는 조건으로 PCR 반응을 수행하여 hCMV 프로모터 단편을 얻었다 (프라이머: 표 3 참조).
또한, hCMV 프로모터와 인트론의 조합에 사용된 인트론 유전자를 아래의 표 2에 나타내었다:
서열번호
IGLV-1L1 Int (115 bP) gtgacaggat ggggaccaag aaaggggccc tgggaagccc atggggccct gctttctcct cttgtctcct tttgtctctt gtcaatcacc atgtctgtgt ctctctcact tccag 109
IGKV Int (206 bp) gtgagaatatttagaaaaagctaaaactaattctttgaaccattaattttcttaattaggaacctggcaccatatggaacttggcttgtttttaaatgtgatttttttttaagtaatgcgtattctttcatcttgtgctactagattagtggtgatttcattaagcagatgcttatattgtgctaatgtttgctgtatgttttcag 110
IGH Int (82 bp) gtgagtgtctcagggatccagacatgggggtatgggaggtgcctctgatcccagggctcactgtgggtctctctgttcacag 111
Chimeric Intron (133 bp) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 112
Intron A (963 bp) gtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgctccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgtgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcacc 113
PCR에 사용한 primer
SEQ ID No . Oligomer Name Sequence
127 CA-Fw 5'- TAACAGGGTAATATAG acgcgtgga - 3'
128 hCMV-Rv 5'- CAATTG agagctctgcttat - 3'
129 LInt-Fw 5'- agagctct CAATTG gtgacagga - 3'
130 KInt-Fw 5'- agagctct CAATTG gt gagaatat - 3'
131 HInt-Fw 5'- agagctct CAATTG gtga gtgtct - 3'
132 CInt-Fw 5'- agagctct CAATTG GTAAGTATC - 3'
133 CA-Rev 5'- ttctcgagttctccgctagctcct - 3'
각각의 인트론은 유전자 합성을 통해 일차적으로 생성하였으며, hCMV 프로모터와 인트론이 융합된 융합 프로모터를 생성하기 위해서, 5'-말단에 MfeI 제한 부위(5'-CAATTG-3')를 가지는 프라이머 (LInt-Fw, KInt-Fw, HInt-Fw, CInt-Fw: 표 3 참조)와, 3'-말단에 EcoRI 제한 부위(5'-GAATTC-3')를 가지는 역방향 프라이머 (CA-Rv: 서열번호 133)를 이용하여 94℃ 5분 처리 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 40초 과정을 20회 반복 한 후 72℃ 5분간 연장하는 PCR반응을 수행하여 각각의 Intron 단편(Intron short fragment)을 증폭하였다.
상기 별개의 PCR 반응으로 얻어진 hCMV 프로모터 단편과 인트론 단편을 주형으로 hCMV 프로모터 단편 정방향 프라이머(CA-Fw)와 인트론 단편 의 3'-말단 역방향 프라이머 (CA-Rv)를 사용하여 94℃ 5분 처리 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 과정을 20회 반복 한 후 72℃ 5분간 연장하는 2차 PCR를 수행하여 상기 두 단편이 조합된 융합 프로모터 단편을 얻었다. 이렇게 얻어진 융합 프로모터 단편은 MluI/EcoRI (New England Biolabs) 으로 사전 절단된 벡터 pCA (도 1) 내로 클로닝하였다.
목적 단백질로서 사용된 항 c-Met 항체를 생산하기 위하여, 상기에서 구축된 각각의 다른 인트론이 조합된 융합 프로모터를 가지는 벡터에 제한 효소 EcoRI와 XhoI를 사용하여 상기 항체의 중쇄 코딩 폴리뉴클레오티드 (서열번호 67)와 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 69) 를 각각 cloning 하여, 항 c-Met 항체의 중쇄 재조합 벡터 및 경쇄 재조합 벡터를 각각 제작하였다.
실시예 2: 재조합 벡터의 단백질 발현효과 비교
상기 실시예 1에서 구축된 재조합 벡터는 각각 Qiagen EndoFree Plasmid Mega kit (Cat no. 12381)을 이용하여 분리하였으며, 동물세포에 transient transfection 한 후, 벡터에 cloning 되어 있는 항 c-Met 항체 유전자로부터 발현된 후 분비되는 단백질(항체) 양을 비교 하였다.
실시예 2-1: HEK293 세포를 대상으로 단백질 발현효과 비교
상기 실시예 1에서 구축된 벡터를 HEK293-F와 Expi293 세포주에 각각 transfection 하였다. 사용된 HEK293-F와 Expi293 세포주는 Invitrogen에서 구입했으며, FreeStyle™ 293 Expression Medium (Invitrogen)과 Expi293™ Expression Medium (Invitrogen)을 배지로 사용하여 부유배양방식으로 각각 배양하였다. 각각의 세포주는 2 x 105 cells/mL의 농도로 접종하여 증식시키며, 매 4일마다 분할하였다.
벡터의 효능을 비교하기 위해 Transient gene expression 하루 전 세포를 5 x 105 cells/mL의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1 x 106 cells/mL이 되었을 때 transfection을 진행하였다. 293-F cell의 경우 250 mL Erlenmeyer flask에 1x106cells/mL의 농도로 90mL을 준비한 후, FreestyleTM MAX reagent (Invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율이 되도록 되도록 실시예 1에서 제작된 각각의 재조합 벡터를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(tube A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(tube B)한 후, (tube A)와 (tube B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 상기 혼합액을 준비한 세포에 천천히 방울로 떨어뜨려 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양한 후 상층액을 수확하여 항 c-Met 항체의 농도를 Octet system (ForteBio)의 Protein A biosensor을 이용하여 측정하였다. 비교를 위하여, 프로모터로서 단독 hCMV 프로모터 (서열번호 123; pcDNA 3.3 TOPO vector (Invitrogen) 유래)를 가지는 벡터를 이용하여 동일한 시험을 수행하였다 (대조군).
각각의 융합 프로모터를 사용하여 얻어진 항체 농도를 단독 hCMV 프로모터를 사용하여 얻어진 농도에 대한 비율로 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 서열번호 124의 hCMV 프로모터와 다양한 인트론이 조합된 융합 프로모터를 포함하는 경우의 항체 생산량이 현저히 증가함을 확인할 수 있다.
실시예 2-2: CHO - K1 세포를 대상으로 단백질 발현효과 비교
CHO-S (Invitrogen) 세포주는 세포주 CHO-K1 의 변이체이다. CHO-S 세포주를 8mM Glutamine이 포함된 FreeStyle™ CHO expression medium을 배지로 사용하여 부유배양방식으로 일상적으로 증식시켰으며, 2 x 105개 세포/mL의 농도로 접종하여 매 4일마다 분할하였다. 플라스크는 36.5℃, 5% CO2, 80% humidity, 130 rpm 조건에서 배양하였다. Transient gene expression 하루 전 세포를 5x105cells/mL의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/mL이 되었을 때 transfection을 진행하였다.
상기 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로, 각각 구축된 재조합 벡터를 이용하여 transfection을 실시하였고, transfection 후 5일째 되는 날에 상층액을 수확하여 항 c-Met 항체의 농도를 Octet system (ForteBio)의 Protein A biosensor을 이용하여 측정하였다. 비교를 위하여, 프로모터로서 단독 hCMV 프로모터 (서열번호 123; pcDNA 3.3 TOPO vector (Invitrogen) 유래)를 가지는 벡터를 이용하여 동일한 시험을 수행하였다 (대조군).
각각의 융합 프로모터를 사용하여 얻어진 항체 농도를 단독 hCMV 프로모터를 사용하여 얻어진 농도에 대한 비율로 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 서열번호 124의 hCMV 프로모터와 다양한 인트론이 조합된 융합 프로모터를 포함하는 경우에 항체 생산량이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Expression Vector and Method of Preparing a Protein of Interest Using the Same <130> DPP20135977KR <160> 133 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Ala or Val <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> X is Asn or Thr <400> 5 Arg Asn Xaa Xaa Asn Gly Xaa Thr 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Ser or Thr <400> 6 Asp Asn Trp Leu Xaa Tyr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is His, Arg, Gln or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> X is His or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> X is Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> X is Ser or Trp <400> 7 Lys Ser Ser Xaa Ser Leu Leu Ala Xaa Gly Asn Xaa Xaa Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> X is Ser or Pro <400> 8 Trp Xaa Ser Xaa Arg Val Xaa 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Gly, Ala or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> X is Arg, His, Ser, Ala, Gly or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> X is Leu, Tyr, Phe or Met <400> 9 Xaa Gln Ser Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of AbF46 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of AbF46 <400> 11 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of AbF46 <400> 12 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 13 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 14 Gly Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 15 Ala Gln Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 16 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 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ccgggtaagg gcctggaatg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct 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catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3840 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3900 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 3960 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4020 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4080 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4140 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4200 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4260 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4320 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4380 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4440 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4500 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4560 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4620 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga 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catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 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atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn 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consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 <210> 70 <211> 240 <212> 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cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag 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gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc 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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of antibody L3-11Y <400> 106 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 107 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of antibody L3-11Y <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 108 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 109 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGLV-1L1 Intron <400> 109 gtgacaggat ggggaccaag aaaggggccc tgggaagccc atggggccct gctttctcct 60 cttgtctcct tttgtctctt gtcaatcacc atgtctgtgt ctctctcact tccag 115 <210> 110 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV Intron <400> 110 gtgagaatat ttagaaaaag ctaaaactaa ttctttgaac cattaatttt cttaattagg 60 aacctggcac catatggaac ttggcttgtt tttaaatgtg attttttttt aagtaatgcg 120 tattctttca tcttgtgcta ctagattagt ggtgatttca ttaagcagat gcttatattg 180 tgctaatgtt tgctgtatgt tttcag 206 <210> 111 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGH Intron <400> 111 gtgagtgtct cagggatcca gacatggggg tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60 ctgtgggtct ctctgttcac ag 82 <210> 112 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Intron <400> 112 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 113 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intron A <400> 113 gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 60 gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 120 gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct ttggctctta 180 tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgctccttat gctataggtg 240 atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact cccctattgg 300 tgacgatact ttccattact aatccataac atggctcttt gccacaacta tctctattgg 360 ctatatgcca atactctgtc cttcagagac tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg 420 ggtcccattt attatttaca aattcacata tacaacaacg ccgtcccccg tgcccgcagt 480 ttttattaaa catagcgtgg gatctccacg cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg 540 ctcttctccg gtagcggcgg agcttccaca tccgagccct ggtcccatgc ctccagcggc 600 tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta acagtggagg ccagacttag gcacagcaca 660 atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat 720 gagctcggag attgggctcg caccgtgacg cagatggaag acttaaggca gcggcagaag 780 aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg 840 tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca 900 ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc 960 acc 963 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping region with huCMV <400> 114 gtctatataa gcagagctct 20 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme site (EcoRI/NheI/XhoI) <400> 115 gaattcgaag gagctagcgg agaactcgag 30 <210> 116 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CMV immediate-early enhancer/promoter <400> 116 ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gtttgagatt tctgtcccga 60 ctaaattcat gtcgcgcgat agtggtgttt atcgccgata gagatggcga tattggaaaa 120 atcgatattt gaaaatatgg catattgaaa atgtcgccga tgtgagtttc tgtgtaactg 180 atatcgccat ttttccaaaa gttgattttt gggcatacgc gatatctggc gatacgctta 240 tatcgtttac gggggatggc gatagacgcc tttggtgact tgggcgattc tgtgtgtcgc 300 aaatatcgca gtttcgatat aggtgacaga cgatatgagg ctatatcgcc gatagaggcg 360 acatcaagct ggcacatggc caatgcatat cgatctatac attgaatcaa tattggccat 420 tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 480 cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat 540 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 600 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 660 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 720 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 780 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 840 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 900 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 960 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 1020 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 1080 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 1140 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 1200 gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg 1260 acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcttat gcatgctata 1320 ctgtttttgg cttggggtct atacaccccc gcttcctcat gttataggtg atggtatagc 1380 ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact cccctattgg tgacgatact 1440 ttccattact aatccataac atggctcttt gcacaactct ctttattggc tatatgccaa 1500 tacactgtcc ttcagagact gacacggact ctgtattttt acaggatggg gtctcattta 1560 ttatttacaa attcacatat acaacaccac cgtccccagt gcccgcagtt tttattaaac 1620 ataacgtggg atctccagcg aatctcgggt acgtgttccg gacatggggc tcttctccgg 1680 tagcggcgga gcttctacat ccagccctgc tcccatcctc ccactcatgg tcctcggcag 1740 ctccttgctc ctaacagtgg aggccagact taggcacagc acgatgccca ccaccaccag 1800 tgtgcccaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctc 1848 <210> 117 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 117 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcag 795 <210> 118 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 118 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg 420 gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480 gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt tgacgcaaat 540 gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaa 594 <210> 119 <211> 509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 119 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 360 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 420 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 480 tacggtggga ggtctatata agcagagct 509 <210> 120 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 120 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagct 508 <210> 121 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 121 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584 <210> 122 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 122 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctc 588 <210> 123 <211> 680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 123 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 660 gatccagcct ccggactcta 680 <210> 124 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter fragment <400> 124 gaccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat 60 tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctc 120 gtgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccggccccc tattgacgtc aatgacggta 300 aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt 360 acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg 420 ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 480 ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc 540 cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctc 597 <210> 125 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence further added to hCMV fragment <400> 125 actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt cag 53 <210> 126 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence further added to hCMV fragment <400> 126 gactcta 7 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-Fw primer <400> 127 taacagggta atatagacgc gtgga 25 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV-Rv primer <400> 128 caattgagag ctctgcttat 20 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LInt-Fw primer <400> 129 agagctctca attggtgaca gga 23 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KInt-Fw primer <400> 130 agagctctca attggtgaga atat 24 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HInt-Fw primer <400> 131 agagctctca attggtgagt gtct 24 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CInt-Fw primer <400> 132 agagctctca attggtaagt atc 23 <210> 133 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-Rev primer <400> 133 ttctcgagtt ctccgctagc tcct 24

Claims (24)

  1. 인간 CMV (Human Cytomegalo Virus) 프로모터, 및
    서열번호 109의 인간 IGLV (immunoglobulin lambda variable) 인트론, 서열번호 110의 인간 IGKV (immunoglobulin kappa variable) 인트론, 및 서열번호 111의 인간 IGH (immunoglobulin heavy locus) 인트론으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역글로불린 인트론
    을 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 CMV 프로모터는,
    i) 서열번호 116의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편,
    ii) 서열번호 116 내의 400번째 염기부터 1250번째 염기까지의 부위 중의 100bp 이상의 연속하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편,
    iii-1) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편의 염기서열 중, 서열번호 116의 490번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 529번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 532번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 545번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 504번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 651번째 위치에 해당하는 염기(G), 서열번호 116의 804번째 위치에 해당하는 염기(A), 서열번호 116의 870번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 946번째 위치에 해당하는 염기(T), 서열번호 116의 1061번째 위치에 해당하는 염기(C), 서열번호 116의 1065번째 위치에 해당하는 염기(T), 및 서열번호 116의 1073번째 위치에 해당하는 염기(A)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기의 치환, 서열번호 116의 653번째 위치에 해당하는 염기(C)의 결실, 및 서열번호 116의 805번째와 806번째 사이에 해당하는 위치에의 염기 추가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편, 또는
    iii-2) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 상기 iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 및 상기 ii) 또는 iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 100bp 길이의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체인,
    융합 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 CMV 프로모터는
    i) 서열번호 116의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편,
    ii) 서열번호 116의 400 내지 410번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기, 530 내지 550번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기, 또는 615 내지 625번째 염기로부터 선택되는 하나의 염기부터 3' 방향으로 400bp 이상의 연속하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편,
    iii-1) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편의 염기서열 중, 490번째 염기 C가 T로 치환(C490T), 529번째 염기 C가 T로 치환(C529T), 532번째 염기 T가 G로 치환(T532G), 545번째 염기 A가 G로 치환(A545G), 651번째 염기 G가 C로 치환(G651C), 804번째 염기 A가 C로 치환(A804C), 870번째 염기 T가 C로 치환(T870C), 946번째 염기 T가 C로 치환(T946C), 1061번째 염기 C가 T로 치환(C1061T), 1065번째 염기 T가 C로 치환(T1065C), 및 1073번째 염기 A가 G로 치환(A1073G)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기 치환 (상기 염기 위치는 서열번호 116의 염기서열 내 위치를 기준으로 함), 서열번호 116의 653번째 위치에 해당하는 염기(C)의 결실, 및 서열번호 116의 805번째와 806번째 사이에 해당하는 위치에의 염기 추가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편, 또는
    iii-2) 상기 ii)의 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 상기 iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편 및 상기 ii) 또는 iii-1)의 폴리뉴클레오타이드 단편의 3' 말단에 5 내지 20bp 또는 45 내지 60bp 길이의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편 변이체인,
    융합 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 117 내지 123으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
    인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포에서 작동가능한 프로모터로 사용하기 위한 것인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO, GS 유전자 결함 CHO, 및 DHFR 유전자 결함 CHO 세포에서 선택된 햄스터 세포인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 인트론은 상기 인간 CMV 프로모터의 3' 말단에 연결된 것인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  8. 인간 CMV 프로모터 및 인트론을 포함하고,
    상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 124의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 단편, 또는 상기 염기서열 내의 200bp 이상의 연속하는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 단편, 또는 상기 염기 서열의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두에 1 내지 100bp 길이의 염기를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편이고,
    상기 인트론은 서열번호 109 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    융합 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제8항에 있어서, 동물 세포에서 작동가능한 프로모터로 사용하기 위한 것인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO, GS 유전자 결함 CHO, 및 DHFR 유전자 결함 CHO 세포에서 선택된 햄스터 세포인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  11. 삭제
  12. 제8항에 있어서, 상기 인트론은 상기 인간 CMV 프로모터의 3' 말단에 연결된 것인, 융합 폴리뉴클레오타이드.
  13. 삭제
  14. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제10항 및 제12항 중 어느 한 항의 융합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 추가로 포함하고, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 것인, 재조합 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 효소 활성 폴리펩타이드, 수용체 폴리펩타이드, 수송체 폴리펩타이드, 살균 또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 폴리펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 조직 플라스미노겐 활성인자, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 재조합 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항체이고, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 항체의 경쇄 유전자, 중쇄 유전자, 또는 항원결합단편의 유전자와 작동 가능하게 연결된, 재조합 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인,
    재조합 벡터.
  19. 제14항에 있어서, 선별 마커를 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 및 글루타미 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 재조합 벡터.
  21. 제14항의 재조합 벡터가 숙주 세포에 도입된, 재조합 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 숙주세포는 포유동물 세포인, 재조합 세포.
  23. 제22항의 재조합 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법.
  24. 삭제
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