KR102244161B1

KR102244161B1 - 다중의 질환 바이오마커의 기능 및 발현을 억제하는 펩타이드의 신규한 용도

Info

Publication number: KR102244161B1
Application number: KR1020190105917A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 정종평; 이주연
Original assignee: 주식회사 나이벡
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-04-26
Also published as: US20210340182A1; US20240166688A1; EP3862015A1; EP3862015B1; EP4218788A1; KR20200026122A; EP3862015A4; CN112912093A; DK3862015T3

Abstract

본 발명은 다중의 질환 바이오마커의 기능 및 발현을 억제하는 펩타이드의 신규한 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환에 관계하는 바이오마커인 HDAC5, GDF15, ATF3에 대해, HDAC5 인산화 저해, GDF15 단백질의 발현 저해, ATF3 단백질의 발현 저해하는 기능을 가지고 있는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 질환에 관계된 바이오마커에 대해 Histone deacetylase (HDAC)의 인산화 저해, GDF15 단백질의 발현저해, ATF3 단백질의 발현저해 등으로 삼중 차단함으로써, 염증유발 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 감소시킬 수 있는바, 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 및 예방용 약학적 조성물 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다.

Description

다중의 질환 바이오마커의 기능 및 발현을 억제하는 펩타이드의 신규한 용도{Use of Peptides having Ability to inhibit multiple disease biomarkers' expression}

본 발명은 다중의 질환 바이오마커의 기능 및 발현을 억제하는 펩타이드의 신규한 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 염증 및 대사성 질환 바이오마커인 HDAC5, GDF15, ATF3와 관련하여, HDAC5 단백질의 인산화, GDF15 단백질의 발현, 및/또는 ATF3 단백질의 발현을 억제하는 기능을 가지고 있는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만, 제 2형 당뇨병을 포함한 대사 질환 (metabolic disease)은 우리나라 뿐만 아니라 세계적으로 급증하고 있는데, 이러한 대사 질환들은 만성적인 염증반응과 관계가 있다고 알려져 있다 (Nature, 2017, 542, 177). 이러한 현상은 전신적으로 또는 조직별로 관찰되고 있다. 특히 비만은 만성적으로 낮은 수준의 염증상태를 보이고 있으며, 이는 지방조직 내 염증세포의 축적 및 변화에 의해 시작되고 조절됨이 밝혀졌다. 만성적인 지방 조직 염증은 지방세포의 인슐린 저항성을 유도하고, 지방조직의 잉여 에너지 축적 기능을 저해한다.

또한, 알콜성 지방간은 우리나라에 흔하며, 알콜 섭취로 인해 간에서 지방합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않음으로써 발병하며, 알콜 섭취 정도에 따라 간염이나 간경변으로 발전될 수 있다. 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 음주와 관계없이 비만, 당뇨, 지질대사이상 등으로 인해 체내, 특히 간세포 내 지방이 축적(5% 이상)되어 생기는 질환으로 단순지방 축적에서부터 지방간(steatosis), 간세포의 염증반응(hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 진행 섬유화증(advanced fibrosis) 및 간경변(cirrhosis)까지 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다.

현재 알콜성 또는 비알콜성 지방간 환자에게 사용되고 있는 치료제는 크게 두 가지로 분류되며 첫째로 위험인자의 교정을 통해 지방간을 치료 및 개선하는 약제인 비만치료제(orlistat), 인슐린저항치료제(metformin, pioglitazone, rosiglitazone), 고지혈증치료제(clofibrate, gemfibrozil, bezafibrate, atorvastatin,simvastatin) 등과, 두 번째로 지방간의 위험인자 교정과는 독립적으로, 이미 손상된 간세포 및 간기능 회복을 위한 약물로서 간세포 보호제(ursodeoxycholic acid 및 taurine), 항산화제 (vitamine E) 및 nutritional supporter(lectin, betaine, N-acetylcystein)등이 있으나, 그 치료 효과는 미미한 실정이다.

한편, 진핵생물의 염색체 DNA는 히스톤 (Histone)이라는 중심 단백질에 감겨 응축되어 뉴클레오솜이라 불리는 기본 구조를 취한다. 또한, 그 뉴클레오솜 구조가 집합함으로써 크로마틴 구조를 형성하고 있다. 이 크로마틴 구조의 구성에는 히스톤의 번역 후 수식 (post translational modification)이 밀접하게 관계하고 있고, 그 번역 후 수식으로서, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화 등이 알려져 있다. 그 중, 히스톤의 아세틸화 (acetylation)와 탈아세틸화 (deacetylation) 간의 균형은 유전자 발현에 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 히스톤의 아세틸화는, 히스톤 아세틸화 효소(histone acetylase, HAT)와 히스톤 탈아세틸화 효소(histone deacetylase, HDAC)에 의해 가역적으로 제어된다. HDAC를 저해하면 HAT에 의한 히스톤의 아세틸화가 항진되고, 히스톤으로부터 유전자가 풀어지면서 유전자의 발현이 시작된다. HDAC은 면역반응, 세포주기, 분화, 사멸과 같은 다양한 생물학적 과정에 관여한다고 알려져 있다. 그 중 HDAC5는 class II HDAC (HDAC 4-7, 9, 10)에 속하고, class II HDAC은 조직 선택성이 있으며 세포내 신호 단백질인 p53, NF-κB, p65, c-jun transcription factors, JAK/STAT의 유전자를 탈아세틸화하여 전사를 조절하며, 이들 세포내 신호단백질은 다양한 염증 사이토카인의 생산에 관련된 중요한 매개체이다 (Gene. 2005;363:15-23).

HDAC5는 평상시에 염증성 사이토카인 유전자의 뉴클레오좀에 결합되어 있다가, 리포폴리사카라이드, TNF-α와 같은 염증유발 인자에 노출되게 되면, HDAC5가 인산화되면서 protein chaperone 14-3-3과 결합하고, 이들 결합체는 핵으로부터 세포질로 나가게 된다. 이후 히스톤에 아세틸레이션이 시작되면서, DNA구조가 풀리고, NF-kB와 같은 매개체가 염증유발 사이토카인의 유전자에 결합되면서, 유전자의 발현이 시작된다. 따라서, HDCA5의 인산화를 억제함으로써 핵내에 존재하게 해준다면 염증성 사이토카인이 발현될 수 없으므로 염증반응이 일어나지 않는다.

HDAC 저해제들이 개발되었으며, 세포 주기 정지 작용, 형질 전환 세포의 정상화 및 분화 작용 등을 갖는 부티르산(J. Biol. Chem., 1979, 254, 1716-1723), 세포 주기 정지 작용, 형태 분화 작용 등을 갖는 미생물의 대사산물인 트리코스타틴 A(Cancer Res., 1987, 47, 3688-3691, Exp. Cell Res., 1988, 177, 122-131, J. Biol. Chem., 1990, 265, 17174-17179), 세포 증식 억제 작용을 갖는 미생물의 대사산물인 트라폭신(J. Antibiotics, 1990, 43, 1524-1534, J. Biol. Chem., 1993, 268, 22429-22435) 등을 들 수 있고, 항암제로서, vorinostat(SAHA), romidepsin(FK228), panobinostat(LBH-589) 등이 개발되었다. 그러나, 이들 저분자 합성물질 기반의 HDAC 저해제는 HDAC의 활성부위에 비가역적으로 결합하여 효소의 활성을 완전히 억제함으로써, 오히려 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, 기존의 저분자 합성물질 기반의 HDAC 저해제보다 부작용이 적으며 다른 기전을 가진 HDAC 저해제가 필요하다.

ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로 ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다.

ATF3 단백질은 알려진 표적 유전자들의 활성인자(activator) 또는 억제제(repressor)로서 역할을 하고, 현재까지 문헌적으로 알려져 있는 ATF3의 잠재적 표적 유전자들은 20여 개가 넘으며, 여기에는 AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A, CCL2, CCL4, Cyclin D1, FN-1, GLUT4, HIF-2α, IFN-γβα, TWIST1, p53, p73, PDX-1, 아디포넥틴(adiponectin) 등이 포함되는 것으로 알려져 있다.

또한, 대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), T 세포(T cell), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 면역세포에서 뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NF-κB, JNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸(apoptosis), 세포성장(cell proliferation), 세포이동(cell motility), DNA수선(DNA repair), 대사(metabolism)에 관여하며, 그 중에 NF-κB가 관계된 염증반응 유도에도 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. ATF3 단백질의 발현은 당뇨, 비만과 같은 대사이상으로 발생한 비알코올성 간질환의 바이오마커로도 알려져 있다 (Kim et al., Journal of Hepatology 2017 vol. 67, 349-359).

따라서, ATF3 단백질의 발현 또는 기능을 조절하는 물질에 의해, ATF3에 의해 유도되는 염증반응을 억제할 수 있으나, 현재까지는 ATF3 단백질에 대한 저해제가 개발되지 않은 실정이다.

GDF15(Growth differentiation factor 15)는 Transforming growth factor β(TGF- β에 속하는 단백질로써, 다른 이름으로는 macrophage inhibitory cytokine 1, placental TGF-βprostate-derived factor (PDF), nonsteroidal anti-inflammatory drug-activator gene 등으로 불리기도 한다. GDF15 단백질은 NAFLD 환자들의 간에서 많이 발현되는 것으로 알려졌으며, 섬유화 진행 단계가 증가함에 따라, 간조직에서 GDF15 단백질의 발현량이 증가하였으며, 재조합 인간 GDF15 (rhGDF15)를 human hepatic stellate cells에 처리하면 간경화에 관련된 단백질 (SMAD2, SMAD3)의 발현이 증가하였다 (Koo et al., Liver International. 2018;38:695-705). 따라서, GDF15 단백질은 NAFLD에서 간경화로 발전시키는데 역할을 하며, 바이오마커로서의 작용도 한다. GDF15의 발현을 저해할 수 있는 물질을 개발하여 NAFLD의 진행을 감소시킬 수 있으나, 현재까지는 GDF15 단백질에 대한 저해제가 개발되지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 종래 개발된 펩타이드가 HDAC의 인산화를 억제하는 효과가 있고, 이와 더불어 간질환 마커인 ATF3 및 GDF15의 발현을 억제하는 효과를 나타내며, 이로써 다양한 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있음을 확인하였고, 나아가 관절염 동물 모델, 대장염 동물 모델 및 지방간 동물 모델에서 각각 상기 펩타이드를 투여함으로써 해당 질환의 치료 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

Gene. 2005;363:15-23. J. Biol. Chem., 1979, 254, 1716-1723 Cancer Res., 1987, 47, 3688-3691 Exp. Cell Res., 1988, 177, 122-131 J. Biol. Chem., 1990, 265, 17174-17179 J. Antibiotics, 1990, 43, 1524-1534 J. Biol. Chem., 1993, 268, 22429-22435 Nature, 2017, 542, 177 Journal of Hepatology 2017 vol. 67, 349-359

본 발명의 목적은 다중의 질환 바이오마커의 기능 및 발현을 억제하는 펩타이드의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드의 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 염증 및 대사성 질환에 관계된 바이오마커에 대해 Histone deacetylase (HDAC)의 인산화 저해, GDF15 단백질의 발현저해, ATF3 단백질의 발현저해 등으로 삼중 차단함으로써, 염증유발 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 감소시킬 수 있는바, 대사성 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다.

도 1a는 인산화된 단백질의 마이크로어레이를 실시한 결과이다.
도 1b는 서열번호 1 내지 3의 펩타이드의 농도 변화에 따른 인산화된 HDAC5 단백질의 발현량을 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 1c는 서열번호 1 내지 3의 펩타이드에 의한 HDAC5 단백질의 인산화 억제 효과를 양성 대조군인 LMK, SAHA와 비교하기 위한 Western blot 결과이다.
도 2a는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여에 따른 hind paw swelling (%)를 보여주는 결과이다.
도 2b는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여에 따른 hind paw swelling inhibition (%)을 보여주는 결과이다.
도 3a는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여 후 마이크로씨티의 3차원 이미지이다.
도 3b는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여에 따른 bone volume (BV), bone volume/tissue volume (BV/TV), bone surface areas adjusted to BV (BS/BV), trabecular thickness (Tb.Th)를 분석한 결과이다.
도 4a는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여 후 현미경으로 관찰한 관절의 조직사진 결과이다.
도 4b는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 후의 염증지수를 나타낸 결과이다.
도 5는 관절염 유도 동물모델에서 서열번호 1 및 etanercept 투여에 따른 혈중 내 TNF-a 와 IL-6의 농도 결과이다.
도 6a는 대장염 유도 동물모델에서 서열번호 1의 투여 후 8일 째 대장을 적출하여 육안으로 관찰한 결과이다.
도 6b는 대장염 유도 동물모델에서 서열번호 1의 투여에 따른 대장의 길이 변화를 측정한 결과이다
도 6c는 대장염 유도 동물모델에서 서열번호 1의 투여에 따른 p40, TNF-α, IL-12의 발현을 ELISA로 측정할 결과이다.
도 7은 서열번호 1 내지 4의 펩타이드 처리에 의한 간질환 마커인 GDF15와 ATF3 단백질의 발현량 변화를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 8은 지방간 유도 동물모델에서 서열번호 1의 투여에 따른 간 비대증 및 피하지방 감소 효과를 관찰한 사진이다.
도 9a는 DSS로 유도한 염증성 장질환 동물모델에서 서열번호 1-4의 투여 후 10일 째 대장의 길이 변화를 측정한 결과이다.
도 9b는 DSS로 유도한 염증성 장질환 동물모델에서 서열번호 1-4의 투여 후 10일 째 대장내 융털을 H&E 염색하여 관찰한 결과이다.
도 10a는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호1-6 투여에 따른 간 조직내 간조직내 염증과 지방 감소효과를 H&E 염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 10b는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호1-6 투여에 따른 간 조직내 섬유화 감소 효과를 Sirius red 염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 10c는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호1-6 투여에 따른 간 조직내 섬유화 감소 효과를 Masson trichrome 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 10d는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호1-6 투여에 따른 군 별 NAS score 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 의 바이오마커인 HDAC5, GDF15, ATF3에 대해 HDAC5의 인산화를 억제하고, GDF15 및 ATF3 단백질의 발현을 감소시켜, 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키고, 이와 연관된 관절염, 치주염, 아토피, 염증성 대장염, 당뇨 및 비만에 의해 발생하는 비알코올성 간질환, 지방간 및 피하지방 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드의 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드를 염증 및 대사성 질환 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 염증, 대사성 또는 섬유화 질환의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.

서열번호 1 GKCSTRGRKCCRRKK

서열번호 2 (M1) GKCSTRGRKCMRRKK

서열번호 3 (M2) GKCSTRGRKMCRRKK

서열번호 4 (M3) GKCSTRGRKMMRRKK

서열번호 5 (M4) GKMSTRGRKCCRRKK

서열번호 6 (M5) GKMSTRGRKMCRRKK

서열번호 7 (M6) GKMSTRGRKCMRRKK

서열번호 8 (M7) GKMSTRGRKMMRRKK

본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 경우뿐만 아니라, 이와 60% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 70% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 80% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 90% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 95% 이상의 상동성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어 서열번호 1 내지 8의 펩타이드의 아미노산 서열 중 일부 아미노산(예를 들어, 1 내지 6개의 아미노산)을 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노산을 일부(예를 들어, 1 내지 6개의 아미노산을) 추가 또는 결손시킨 경우로, 이로 인하여 상기 펩타이드가 목적하는 구조 또는 기능에 큰 영향이 없는 경우 내지는 상기 펩타이드의 안정성 등에 유리한 효과를 발휘하는 경우라면 서열번호 1 내지 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 적절히 대체하여 본 발명의 목적을 달성하기 위해 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서, 상기 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 은 생체 내에서 HDAC5 단백질의 과인산화 GDF15 단백질의 과발현 및/또는 ATF3 단백질의 과발현 상태에 의해 직/간접적으로 발병하는 질환인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 펩타이드는 HDAC5 단백질의 인산화, GDF15 단백질의 발현 및/또는 ATF3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 염증, 대사성 또는 섬유화 질환은 관절염, 염증성 대장염, 궤양성 장염, 크론병, 간염, 지방간, 및 비만으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, HDAC5 단백질의 과인산화 GDF15 단백질의 과발현 및/또는 ATF3 단백질의 과발현과 관계된 모든 염증, 대사성 또는 섬유화 질환 의 치료 및 예방 용도로 활용될 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 간염은 당뇨 및/또는 비만에 의한 비알코올성 지방간염인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 섬유성 질환은 섬유화에 의한 간경화, 폐섬유증, 폐쇄성 폐질환, 심부전, 동맥경화, 만성신부전, 당뇨병, 수술후 후유증으로 발생하는 켈로이드 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.본 발명에서, 상기 과인산화란 해당 질환이 발병하지 않은 객체에 비해 해당 단백질의 인산화가 증가된 상태를 의미하고, 과발현이란 해당 질환이 발병하지 않은 객체에 비해 해당 단백질의 발현이 증가된 상태를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 펩타이드 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡슐, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 제제는 당분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.

상기 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유하도록 제제화 될 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용가능한 보조제는 부형제, 희석제, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 증점제 및 점도개질제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 펩타이드를 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 사용할 때, 상기 펩타이드의 일일 투여량은 약 1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 5 내지 50 ㎎/㎏ 이며, 일일 일회 또는 주 2-3회에 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이 경우, 투여 용법 및 투여 용량은 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 적합한 투여 용법 및 투여 용량은 이러한 인자를 당연히 고려하는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 펩타이드 합성

N 말단으로부터 순서대로 서열번호 1 내지 8의 펩타이드를 F-moc 고체상 화학합성방법(Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.

서열번호 1 GKCSTRGRKCCRRKK

서열번호 2 (M1) GKCSTRGRKCMRRKK

서열번호 3 (M2) GKCSTRGRKMCRRKK

서열번호 4 (M3) GKCSTRGRKMMRRKK

서열번호 5 (M4) GKMSTRGRKCCRRKK

서열번호 6 (M5) GKMSTRGRKMCRRKK

서열번호 7 (M6) GKMSTRGRKCMRRKK

서열번호 8 (M7) GKMSTRGRKMMRRKK

실험예 1. 합성 펩타이드의 HDAC5 인산화 저해 및 결합 친화성 확인

RAW 264.7 세포를 0.5% FBS에서 2시간 동안 스타베이션(starvation) 시키고, 200 μM 서열번호 1의 펩타이드를 1 시간 동안 처리한 후, LPS (1 μg/mL)로 30분, 37℃로 염증을 유발시켰다. 처리하지 않은 세포 (NT), LPS로 처리한 세포, 서열번호 1과 LPS로 처리한 세포의 라이세이트 (cell lysate)를 Full Moon Biosystems사의 포스포 마이크로 어레이 (Phospho Explorer Antibody Microarray)에 적용하였다. 해당 포스포 마이크로 어레이는 30개의 신호전달체계와 관련 있는 1318 개의 항체를 인식할 수 있다. 각각의 항체는 표준화된 사이즈의 글래스 마이크로스코프 슬라이드 (standard-size coated glass microscope slides)에 코팅되어 있고, 슬라이드의 스캔닝은 GenePix 4100A scanner (Axon Instrument, Foster City, CA, USA)로 실시하였다. 데이터는 Genowiz 4.0TM (Ocimum Biosolutions, Hyderabad, India)로 분석하였다. 인산화 비율은 아래와 같이 계산하였다.

각 항체에서의 인산화 비율 계산식:

phosphorylation ratio = (실험군의 인산화 수치/실험군의 비인산화 수치)/(대조군의 인산화 수치/대조군의 비인산화 수치)

분석 후, 각 단백질의 정보는 UniPort 데이터베이스를 이용하여 검색하였다. 그 결과, 서열번호 1의 펩타이드와 LPS를 처리하였을 때, LPS 만 처리한 세포보다 HDAC5의 인산화가 가장 많이 저해되었고 (0.278), NF-κB p100/p52 (0.451), NF-κB p100/p52 (0.485), IκBα (0.509) 등 NF-κB신호와 관련된 단백질의 인산화가 저해된 것을 확인할 수 있었다(도 1a).

상기 마이크로 어레이 결과를 기초로, 웨스턴블럿을 실시하여 서열번호 1-3의 펩타이드에 의한 HDAC5 및 p65의 인산화의 변화를 검증하고자 하였다. 6-well plate 에 70%의 density로 RAW 264.7 cells을 plating한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2시간 동안 cell starvation 하였다. 서열번호 1~3의 펩타이드 각각을 50~1000μM 농도로 포함한 배지를 1시간 동안 처리한 후, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 30분 동안 염증 반응을 유도하였다. Protease inhibiotr와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer (25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 lysis하였다. BCA protein assay를 통해 단백질을 정량하고, western blot 으로 HDAC 5와 p65 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 8% SDS PAGE gel 에 size marker와 함께 sample을 동량 loading하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer 한 membrane은 5% skim milk로 1시간 blocking하고, 1st antibody를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척 하고 HRP가 부착된 2nd antibody로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.

그 결과, LPS만 단독으로 처리한 경우에는 HDAC5의 인산화가 증가하였으나 LPS와 서열번호 1 내지 3의 펩타이드를 동시에 처리하였을 때, HDCA5의 인산화가 감소하였다. 이를 통해, 서열번호 1 내지 3의 펩타이드가 HDAC5를 통해 신호전달을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 서열번호 1 내지 3의 펩타이드와 기존에 알려진 HDAC 인산화 저해제인 SAHA, LMK와 비교하여 인산화된 HDAC5 단백질과 HDAC5 단백질의 인산화 정도를 Western blot으로 확인한 결과, 서열번호 1 내지 3의 펩타이드는 SAHA, LMK와 비교하여 HDAC5 인산화 저해가 더 우수한 것으로 확인되었다.

한편, HDAC5와 서열번호 1 내지 8의 펩타이드의 결합 친화력을 Biacore T200 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)으로 확인하였다. 이를 위하여 HDAC5 단백질 (Abcam, MA, USA)을 sodium acetate buffer (pH 4.5)에 녹이고, N-hydroxysuccinimide (NHS)와 N-ethyl-N0-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDAC)를 크로스링커로 사용하여 dextran-covered sensor chip surface (CM5 chip)에 결합시켰다. 덱스트란의 반응하지 않은 활성 그룹은 ethanolamine (1M)을 가하여 블록시켰다. 칩에 결합된 HDAC5의 수치는 4440RU (1000RU=1 ng/mm²)로 측정되었다. 서열번호 1 내지 8의 펩타이드를 각각 다양한 농도(15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500nM)로 30μL/min 속도로 반응시켰고, 해리반응은 5분 동안 유지하였다. 1:1 binding model을 사용하여 BIAevaluation software로 rate constants for association (ka), dissociation (kd), dissociation constant (KD)를 계산하였다.

하기 표 1은 서열번호 1 내지 8의 펩타이드와 HDAC5 단백질간의 결합친화성을 나타내는 Biacore의 분석결과이다. 미스매치 펩타이드 (mismatch peptide)와 비교했을 때, 서열번호 1 내지 8의 펩타이드는 KD값이 10^-7 정도였고, 미스매치 펩타이드는 10^- ⁴으로 나왔다. KD값이 작을수록 결합친화력이 더 좋은 것이기 때문에, 서열번호 1 내지 8의 펩타이드는 HDAC5 단백질에 대한 결합력이 우수하며, HDAC5 단백질과 결합하면서 인산화를 감소시키는 것으로 예측할 수 있었다.

Analyte	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
서열번호 1	1.075E+5	0.07264	6.756E-7
서열번호 2 (M1)	7.437E+4	0.06872	9.241E-7
서열번호 3 (M2)	8.213E+4	0.05953	7.248E-7
서열번호 4 (M3)	7.223E+4	0.06788	9.399E-7
서열번호 5 (M4)	6.592E+4	0.03088	4.685E-7
서열번호 6 (M5)	1.004E+5	0.04463	4.443E-7
서열번호 7 (M6)	6.754E+4	0.04757	7.043E-7
서열번호 8 (M7)	5.501E+4	0.004776	8.682E-8
미스매치 펩타이드	2.168E+3	1.847	8.521E-4

실험예 2. 합성 펩타이드의 관절염 치료효과 확인

본 발명에 따른 펩타이드가 in vivo 상에서 류마티스 관절염 치료 효과가 있는지 조사하기 위하여, 콜라겐 유도 관절염 동물 모델에서 관절염 치료 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 암컷 Wistar rats (105-135 g, n=67)을 Harlan Co. Ltd. (Indianapolis, IN, USA) 에서 구입하였다. 모든 랫트는 병원균이 없는 환경에서 사육되었고, 멸균된 표준 랫트사료(Harlan Co. Ltd, USA)와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물 실험은 서울대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인하에서 이루어졌다. 콜라겐 유도 관절염은 공지된 바에 따라 유도되었다(Nishikawa et al., Arthritis and rheumatism. 2003;48:2670-81).

구체적으로, 랫트의 근육에 0.1 M acetic acid 0.5 mL와 Freund's incomplete adjuvant 0.5 mL 혼합액에 소 콜라겐 타입 II 500μg을 주사하였다. 7일째에 0.1 M acetic acid 0.5 mL와 Freund's incomplete adjuvant 0.5 mL에 소 콜라겐 타입 II 250㎍을 추가 접종하여 collagen induced arthritis (CIA) 랫트를 제작하였다. CIA 유발군 (n=10), 저농도의 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군(LD AIP, 15 mg/kg, n=10), 고농도의 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군 (HD AIP, 30 mg/kg, n=10), etanercept (Enbrel)을 주사한 CIA 유발군 (10 mg/kg, n=10), 정상군 (n=6)으로 나누었다. 최초 콜라겐을 주사한 28일 후부터 서열번호 1의 펩타이드를 주 2회 4주간 목 뒷덜미에 피하주사 하였다. etanercept는 주 3회 4주간 복강내에 주사하였다. 양쪽의 hind paw swelling (뒷발의 붓기)를 22, 29, 31, 35, 38, 42, 45, 49, 52, 56 일에 plethysmometer (LE7500 N, IWOO Scientific Corporation, KOREA)를 사용하여 2번씩 측정하였다. Plethysmometer는 3mL의 무게로 보정한 이후 사용하였다. 측정된 부위는 선을 그어 표시하고, 발목에 가깝게 측정하였다. Hind paw swelling increase (%) 와 hind paw swelling inhibition (%) 은 아래식을 사용하여 구하였다.

hind paw swelling (%) 측정 결과, 정상그룹과 비교하여 CIA 유발군은 hind paw swelling이 증가하였고, 양성 대조군인 Etanercept (Enbrel^ⓡ)를 주사한 CIA 유발군은 35 - 56일 사이에 hind paw swelling (%)가 감소하였다 (P<0.05). 서열번호 1을 주사한 CIA 유발군은 hind paw swelling (%)가 농도 의존적으로 감소하였다. 고농도 (30mg/kg)의 서열번호 1 의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군은 38 -49일 사이에 hind paw swelling (%)가 감소하였다 (P<0.05).

hind paw swelling inhibition (%) 측정 결과, 고농도 (30mg/kg)의 서열번호 1의 펩타이드를 투여한 CIA 유발 그룹은 38일째 35%가 저해되었다. 저농도 (15mg/kg)의 서열번호 1의 펩타이드를 투여한 CIA 유발 그룹은 38일째에 32%의 저해를 보였고, etanercept를 투여한 CIA 유발 그룹은 37%의 저해율을 보여, 고농도의 서열번호 1의 펩타이드는 양성 대조군인 etanercept와 유사한 효과를 보여 주었다.

hind paw의 뼈 손상 정도를 관찰하기 위해 microcomputed tomography (micro-CT)를 SkyScan 1172 (SkyScan, Aartselaar, Belgium)을 이용하여 측정하였다. total volume (TV; mm³), bone volume (BV;mm³), bone volume fraction (BV/TV;%)을 CTAn software를 사용하여 분석하였다. 57일째 랫트를 희생하여 조직학적 분석을 진행하였다. 양 뒷발과 관절을 채취하여 10% buffered formalin에 고정하고, 30% citrate-buffered formic acid에 3일 동안 4℃에서 탈회하였다. 파라핀블럭을 만든 후 4 μm 두께로 섹션하고, 헤마톡실린-에오신 (hematoxylin and eosin, HE) 염색을 하였고, 광학현미경으로 병리학적 점수를 평가하였다. 관절의 염증지수는 하기와 같은 기준으로 측정하였다(Shiozawa et al., J Clin Invest. 1997;99(6):1210-1216). 0, normal synovium; 1, synovial membrane hypertrophy and cell infiltrates; 2, pannus and cartilage erosion; 3, major erosion of cartilage and subchondral bone; and 4, loss of joint integrity and ankylosis.

그 결과, CIA 유발군에서는 심한 골손상이 관찰되었으나. 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군에서는 골조직이 보존되었고, 특히 고농도의 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군은 etanercept를 주사한 CIA 유발군과 비교했을 때 유사한 효과를 나타내었다(도 3a).

또한, bone volume (BV), bone volume/tissue volume (BV/TV), bone surface areas adjusted to BV (BS/BV), trabecular thickness (Tb.Th)를 분석한 결과, 고농도의 서열번호 1을 주사한 CIA 유발군은 높은 BV, BV/TV, Tb.Th를 보였고, 낮은 BS/BV를 보여주어, 서열번호 1의 펩타이드는 관절염을 경감시키면서 관절부위의 뼈손상을 감소시키는 기능이 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3b). 여기서, BV와 BV/TV는 서로 다른 크기의 샘플에서 골이 보존되는 것을 비교할 수 있는 파라미터이다. BS/BV는 erosion에 의해 bone surface가 손실되는 것을 알려주는 파라미터이다. Tb.Th는 관절염증에 의해 periarticular osteopenia와 상반된 연관이 있는 파라미터이다 (Parfitt AM et al., J Bone Miner Res. 1987;2(6):595-610).

또한, 조직을 현미경으로 관찰한 결과, CIA 유발군은 synovial tissue에서 만성염증을 보였고, pannus 형성, 관절 및 뼈의 파괴를 나타내는 반면, 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA유발군은 농도 의존적으로 염증의 감소를 확인할 수 있었다. Etanercept를 주사한 CIA 유발군은 저농도의 서열번호 1을 주사한 CIA 유발군과 유사한 결과를 나타내었다(도 4a).

염증지수에서도 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 CIA 유발군(1.5±1.17) 에서 염증 지수가 CIA 유발군(3.3±0.67; p<0.01)보다 현저히 낮은 것으로 나타났다. 한편, Etanercept를 주사한 CIA 유발군 (2.3±1.16) 은 CIA 유발군보다 염증지수가 유의하게 낮지 않은 것으로 나타났다. 따라서 서열번호 1의 펩타이드는 Etanercept 보다 염증세포의 침윤을 저해하고 CIA 유발 랫트에서 관절염 증상은 감소시키는 효과가 더 높은 것으로 확인되었다(도 4b).

랫트를 희생시켜 전신혈액을 채취하여 혈액내 TNF-α 와 IL-6의 농도를 ELISA kit (R&D, Minneapolis, MN, USA)로 측정하였다.

그 결과, CIA 유발군은 TNF-α 농도는 128 pg/ml, IL-6의 농도는 109pg/ml이였으나, 고농도의 서열번호 1의 펩타이드를 주사하였을 때, TNF-α 농도는 40.3 pg/mL, IL-6의 농도는 35.2 pg/mL이었고, etanercept를 주사하였을 때, TNF-α 농도는 39 pg/mL, IL-6의 농도는 24 pg/mL로 확인되었다(도 5). 이로써, 서열번호 1의 펩타이드는 etanercept과 유사한 정도로 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 혈중 농도를 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 결과를 종합하면, 서열번호 1 내지 8의 펩타이드는 HDAC5의 인산화를 저해하고, 그에 따라 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염 활성 및 관절염 치료 효과를 나타내는 것으로 예측할 수 있다.

실험예 3: 합성 펩타이드의 염증성 대장염 치료효과 확인

본 발명에 따른 펩타이드가 in vivo 상에 염증성 대장염 치료 효과가 있는지 조사하기 위하여, 대장염 유도 동물 모델에서 대장염 치료 효과를 확인하고자 하였다. 대장염 유도 전, 랫트는 24시간 동안 음식 섭취는 제한하였으나 물은 자유롭게 마실 수 있도록 하였다. 랫트를 에테르로 가볍게 마취시켰다. 고무 캐뉼라(rubber cannula; o.d., 2 mm)를 결장내로 삽입하였는데, 그 끝은 항문(anus)에서 8 cm 정도 떨어진 부위로서 대략 비장굴곡부(splenic flexture) 근처에 올 수 있도록 하였다. 50% (v/v) 에탄올 수용액에 녹인 2,4,6-trinitro benzene sulfonic acid (TNBS; Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA)를 고무 캐뉼라(15 mg/0.3 mL/rat)를 통해 결장 내로 주입하였다. 대장염 유도 72시간 후, 서열번호 1의 펩타이드 (30mg/kg)을 하루에 한번 씩 복강주사 하였고, 7일 동안 투약 후, 랫트를 희생시켰다. 랫트의 체중은 매일 오전 9시에 측정되었고, 대장의 길이는 랫트를 희생시키고, 맹장에서 항문까지 vernier caliper (Mitutoyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

실험 8일째 렛트로부터 대장을 적출하여 육안으로 관찰해 본 결과, TNBS 주입으로 대장염을 유발시킨 군(TNBS)의 대장은 정상군(Normal)에 비하여 현저히 그 길이가 단축되고 대장 조직의 충혈이 관찰되었으나, 대장염을 유발시킨 후 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 군은 정상군(CON)과 유사하게 관찰되어 대장염이 뚜렷하게 억제되었음을 알 수 있었다(도 6a).

또한, 적출한 대장의 길이를 측정한 결과에서도, TNBS 주입으로 대장염을 유발시킨 군(TNBS)의 대장은 정상군(Normal)에 비하여 현저히 감소하였으나, 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 군은 대장의 길이가 정상군과 유사하게 증가하였다.

적출된 대장은 -70℃에서 냉동저장 된 후, 대장의 근육층(muscle layer)에서 점막조직을 채취하여 점막 조직의 무게를 측정하고, 10mg의 점막조직을 삼중세척완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.1% sodium deoxycholate and 1mM phenylmethysulfonyl fluoride)에 용해시켜서 균질화하였다. 이후 ELISA kit (R&D, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 p40, TNF-α, IL-12을 정량하였다.

그 결과, TNBS를 처리한 군에서 p40, TNF-α, IL-12의 발현이 증가하였으나, 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 군은 정상군과 유사하게 p40, TNF-α, IL-12가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6c).

실험예 4: 합성 펩타이드에 의한 간질환 마커 GDF15와 ATF3 단백질의 발현 감소 효과 확인

웨스턴블럿을 실시하여 서열번호 1 내지 4의 펩타이드에 의해 유도되는 간질환 마커인 GDF15와 ATF3 단백질의 발현의 변화를 확인하고자 하였다. 6-well plate 에 70%의 density로 HepG2 cells을 plating 한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2시간 동안 cell starvation 하였다. 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 각각 100, 200μM 농도로 포함한 배지를 2시간 동안 처리한 후, 팔미틱 액시드 (palmitic acid)를 200μM 농도로 처리하여 24시간 동안 염증 반응을 유도하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer (25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 lysis하였다. BCA protein assay를 통해 단백질을 정량하고, western blot으로 GDF15, ATF3, FAS, tubulin 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 8% SDS PAGE gel 에 size marker와 함께 sample을 동량 loading하여 약 2시간 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer 한 membrane은 5% skim milk로 1시간 blocking하고, 1st antibody를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척 하고 HRP가 부착된 2nd antibody로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.

그 결과, 팔미틱액시드 (PA)만 단독으로 처리한 경우에는 간질환 마커인 GDF15와 ATF3 단백질의 발현이 증가하였으나, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 처리하였을 때, 각각 GDF15와 ATF3 단백질의 발현이 감소하였다. 이를 통해, 서열번호 1-4의 펩타이드가 간질환 마커인 GDF15와 ATF3 발현을 억제하는 것으로 보아 팔미틱 액시드에 의해 유도된 간질환을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 7).

실험예 5: 합성 펩타이드에 의한 간염 치료효과 및 비만 억제효과 확인

본 발명에 따른 펩타이드가 in vivo 상에 간염 치료 효과 및 비만 억제효과가 있는지 조사하기 위하여, 고지방식이로 유도된 비알코올성 간염 유발 동물 모델을 이용하였다. 수컷 C57BL/6종 마우스(7주령)를 1주간 순화시키고, 20마리의 동물을 각각 정상식이군(control), 고지방식이군(DIO: HFD induced obesity), 서열번호 1의 펩타이드 저용량 (LD 서열번호1, 15mg/kg) 또는 고용량 (HD 서열번호 1, 30mg/kg)을 주사한 고지방식이군 등 실험군 당 5 마리씩으로 분리하고 7주간 고지방식이 또는 정상식이로 사육하였다. 고지방식이는 60% high fat diet(Dyets, Inc)를 식이하였다. 7주간 사육하는 동안 매주 2회씩 체중과 사료섭취량을 측정하였으며, 7주간 사육한 후 50일째에 동물을 희생시켜, 간 및 지방조직을 채취하여 크기를 비교하였다.

그 결과, 고지방식이군은 간과 피하지방조직의 크기가 정상식이군에 비해 크게 증가하였으나, 고지방식이에 의해 증가된 간과 피하지방의 크기가 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 실험군에서는 감소하는 효과를 확인할 수 있었다(도 8).

이로써, 서열번호 1 펩타이드가 간 비대증 및 지방간을 치료하는 효과를 발휘하고, 또한 피하지방 증가를 감소시켜 비만을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 6: 합성 펩타이드의 DSS유도 염증성 장질환 동물모델에서의 치료효과 확인

동물수준에서 합성 펩타이드의 치료효과를 확인하기 위해, DSS로 ICR 마우스에 염증성 장질환을 유도하며 동시에 합성 펩타이드를 주입하였다. 10일 동안 5% DSS를 식용수로 사용하면서 마우스에 염증을 유발 하였고, 동시에 합성 펩타이드를 IP injection 하였다. Normal, Defect, 양성대조군(SAHA), 면역조절대조군(anti-TNF-a antibody), 서열번호 1-4 펩타이드를 처리하였다. 10일 후, CO2 과호흡에 의한 희생 후, Colon 확보하여 길이 비교하였다 (도 9a). 조직을 고정 및 처리과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하고, H&E 염색을 진행하여 장내 융털 손상여부를 확인하였다.

그 결과, DSS로 염증을 유도한 군에서 염증세포가 증가하고, 장내 융모가 손상되었으나, 서열번호 1-4의 펩타이드를 주사한 군은 정상군과 비슷하게 염증세포와 융모 손상이 감소한 것을 확인할 수 있었다.(도 9b).

실험예 7: 합성 펩타이드의 MCD 다이어트 마우스 모델을 이용한 비알콜성 지방간염 치료효과 확인

본 발명에 따른 동물수준에서 펩타이드의 지방 간염 치료 효과를 확인하기 위하여, MCD(Methionine/Choline Deficient) 다이어트 마우스 모델을 이용하였다. 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하였고, Methionine/Choline Deficient(MCD) 사료를 8주간 자율급이 하는 방식으로 비알콜성 지방간염을 유도하였다. 유도 후, 서열번호 1-6의 펩타이드를 피하투여 방법으로 1일 1회 투여, 3일 간격으로 총 12회를 투여하였다. 매주 2회 모든 동물에 대하여 체중 측정하였다. 투여 종료 후 isoflurane으로 호흡 마취 하에 후대정맥으로 혈액 채취한 후, 방혈시키는 방식으로 안락사를 진행하였다. 동물 부검을 하고 간을 확보하여 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였다. 파라핀 블록을 제작하여 H&E 염색을 통해 간조직 내에 축적된 지방을 확인하고, 섬유화 된 정도를 확인하여, NAS score를 평가하였다.

그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, MCD 다이어트를 유도한 군에서 염증 및 지방입자의 크기와 수가 증가하였고, 펩타이드를 주입한 군에서는 염증과 지방입자가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 도 10b와 도 10c에 나타난 바와 같이, MCD 다이어트를 유도한 군에서 섬유화(도 10b는 붉은색, 도 10c는 푸른색)가 크게 진행 되었고, 펩타이드를 주입한 군에서는 섬유화가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

NAS Score는 Ballooning degeneration, Lobular inflammation, Steatosis의 합계를 측정한 것이다. NAS Score에서도 펩타이드를 처리한 군에서 50% 이상 감소하였기 때문에 비알콜성 지방간이 개선된 것을 확인할 수 있었다 (도 10d)

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Nano Intelligent Biomedical Engineering Corporation. co. Ltd Seoul National University R&DB Foundation <120> Use of Peptides having Ability to inhibit multiple disease biomarkers' expression <130> P19-B245 <150> KR 1020180103615 <151> 2018-08-31 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 1 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 2 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Met Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 3 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Met Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 4 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Met Met Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 5 Gly Lys Met Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 6 Gly Lys Met Ser Thr Arg Gly Arg Lys Met Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 7 Gly Lys Met Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Met Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aritificial Sequence <400> 8 Gly Lys Met Ser Thr Arg Gly Arg Lys Met Met Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 염증성 대장염, 궤양성 장염 및 크론병으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 간 질환은 간염, 지방간, 간경화 및 간 비대증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 간염은 당뇨 및/또는 비만에 의해 발생하는 비알코올성 지방간염인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 비만은 HDAC5 단백질의 과인산화, GDF15 단백질의 과발현 및/또는 ATF3 단백질의 과발현에 의해 발병하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 HDAC5 단백질의 인산화, GDF15 단백질의 발현 및/또는 ATF3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡술, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 보조제는 부형제, 희석제, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 증점제 및 점도개질제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보조제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 일일 투여량은 1 내지 100 ㎎/㎏ 이며, 일일 일회 또는 주 2-3회 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.