KR102237076B1

KR102237076B1 - 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102237076B1
Application number: KR1020190137134A
Authority: KR
Inventors: 이진영; 강재선; 정유성; 강현아; 양한조; 양우진; 하배진; 동재경
Original assignee: (주)한지
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2021-04-07

Abstract

본 발명은 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명은 적양파(Red Allium cepa) 발효농축 분말, 호박(Cucurbita moschata) 추출 분말 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출 분말이 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 배합된 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법을 기술적 요지로 한다.

Description

적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법{A composition for preventing hair loss or improving hair growth comprising Red Allium cepa fermented concentrate, Cucurbita moschata extract, and Angelica gigas Nakai extract}

본 발명은 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태로, 두피의 성모가 빠지는 것을 의미하며, 탈모의 원인으로는 유전 및 남성 호르몬인 안드로겐(androgen)이 있다.

남성형 탈모증의 원인은 크게 유전적인 원인과 안드로겐을 원인으로 들 수 있는데, 유전적인 원인은 가족 중에 탈모의 가족력이 있는 사람이 유전적으로 정해진 시점에서 적정량의 안드로겐이 모낭에 작용하면 탈모가 진행된다. 남성형 탈모가 이른 나이에 시작된 경우에는 심한 대머리로 진행하는 경우가 많다. 안드로겐의 이유로는 털집에 도달하게 되면 5α-환원효소에 의해 더욱 강력한 안드로겐인 디하이드로테스토스테론으로 변환하게 되어 탈모가 발생하게 되며, 탈모가 발생되는 원인인 안드로겐은 그 양 때문에 일어나는 것보다는 탈모부위에서 5α-환원효소가 유독 높은 작용을 하게 되면 탈모가 진행된다.

여성형 탈모는 남성형 탈모처럼 '완벽한 대머리'는 되지 않지만 앞머리 이마선은 유지된 상태로 20대 중반부터 시작되는 경우가 많다. 여성형 탈모의 원인으로는 호르몬 불균형으로 나이가 들면서 호르몬이 줄게 되고 모발이 많이 빠지게 되고, 다른 호르몬의 이유는 갑상선에 이상이 생기게 되면 호르몬의 불균형이 원인이 되며, 또 다른 이유는 스트레스로 인해 탈모가 발생할 수 있으며 여성형 탈모에서 가장 주된 원인이며, 자율신경이나 교감신경을 자극하고 아드레날린이 분비되어 혈관을 수축시키고 두피가 긴장되어 모근에 영양공급이 불량해져 탈모를 일으키게 된다.

우리 몸에서 혈액은 주요 장기와 세포 활동에 산소와 에너지를 공급해주는 중요한 역할을 하는 공급 수단으로, 쉬지 않고 끊임없이 순환해야지만 정상적인 생활이 가능해진다. 하지만 혈액 속에 노폐물이 쌓여 혈전이 생김으로 인해 혈관이 좁아지게 되면 혈액순환 장애로 인해 동맥경화나 뇌경색과 같은 치명적인 혈관 질환으로 이어지게 되고, 탈모를 일으키는 원인이 되기도 한다.

한편, 본 출원인은 건강식품으로 섭취하여 발모 촉진 효과를 갖는 기술로써, '발모 촉진 효과를 가지는 건강식품(등록번호: 10-1858217)'에서 적양파 및 늙은 호박으로 이루어지는 혼합물에 대하여, 검은콩, 검은깨, 솔잎 및 적양파 식초를 혼합하여 발효시키는 발모 촉진 효과를 가지는 건강식품을 개발하여 특허 등록 받은 바 있으나, 흑설탕의 첨가로 발효시킨 식품에 관한 것으로, 물성 변형의 우려가 있다.

그리고 기존 탈모 치료를 위해서 상품화된 약품으로는 '탈모방지 및 발모촉진용 외용제 조성물(등록번호: 10-1205209)'에서와 같이 미녹시딜 성분의 제품과 피나스테라이드 성분의 제품이 있다.

미녹시딜은 원래 고혈압 치료제로 개발 중 부작용으로 발모 효과가 발견되어 탈모치료제로 개발된 것으로 두피에 도포하는 형태이므로 잘못 사용할 경우 눈의 통증, 도포부위 발진, 홍반 등의 부작용이 초래될 수 있으며, 미성년자는 사용이 불가하고 여성은 3% 농도 이상의 제품은 사용할 수 없는 등, 사용상의 제한이 크고 심각한 알러지 반응을 유발할 수 있어 사용상 주의가 필요하다. 아울러, 기본적으로 화학제품이기 때문에 다양한 부작용이 초래될 가능성이 있다.

피나스테라이드는 탈모에 대해서 꾸분한 복용이 이루어져야지만 효과가 나타나고, 섭취에 따라 남성 성기능 장애, 기형아 출산 등의 발생이 임상사례로 보고된바 있어 그 사용이 제한적이다.

따라서 인체에 무해한 천연조성물을 이용하여 탈모방지 또는 발모개선을 위한 기술개발 연구가 절실히 요구되고 있는 시점이다.

국내 등록특허공보 제10-1858217호, 2018.05.09.자 등록. 국내 등록특허공보 제10-10-1205209호, 2012.11.02.자 등록.

본 발명은 상기한 문제점을 해소하기 위하여 발명된 것으로, 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 상기의 탈모방지 또는 발모개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.

상기의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 적양파(Red Allium cepa) 발효농축 분말, 호박(Cucurbita moschata) 추출 분말 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출 분말이 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 배합된 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기의 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 적양파를 알코올 추출을 통해 얻은 추출액을 균주 배양액에 투입해 발효시킨 다음 농축하여 적양파 발효농축 분말을 형성하는 단계; 호박을 알코올 추출을 통해 호박 추출 분말을 형성하는 단계; 참당귀를 알코올 추출하여 참당귀 추출 분말을 형성하는 단계; 및 상기 적양파 발효농축 분말, 상기 호박 추출 분말 및 상기 참당귀 추출 분말을 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 참당귀 추출 분말은, 참당귀 분말을 35~45℃ 하에서 알코올 추출한 후 여과하여 참당귀 여과액을 얻는 단계; 상기 참당귀 여과액에 물을 첨가한 후 pH 5.0으로 조절하여 정치시켜 침전을 통해 참당귀 침전물을 얻는 단계; 및 상기 참당귀 침전물 1kg 당 주정 4~6L를 첨가한 후 여과 및 농축하여 분말화하는 단계;로 구성되어 형성되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 적양파 발효농축 분말은, 적양파 분말을 알코올에 투입하고 여과시켜 1차 상등액과 1차 추출액으로 1차 추출하는 단계; 상기 1차 추출액을 여과시킨 후 농축하여 적양파 농축물을 얻는 단계; 상기 적양파 농축물을 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액에 투입한 후 발효시켜 적양파 발효물을 형성하는 단계; 상기 적양파 발효물을 원심분리를 통해 2차 상등액과 2차 추출액으로 2차 추출하는 단계; 상기 2차 추출액을 주정에 투입하여 용해시킨 다음 원심분리를 통해 분리된 상등액을 농축 및 분말화하는 단계;로 구성되어 형성되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 호박 추출 분말은, 호박 분말을 주정과 1:1~3의 중량비율로 혼합하여 40~50℃에서 5~7시간 동안 추출한 후, 50~60℃에서 5~10시간 동안 상기 주정에 함유된 알코올을 증류시킨 다음 분말화하여 형성되는 것을 특징으로 한다.

상기 과제의 해결 수단에 의한 본 발명의 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 및 이의 제조방법은 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 적양파를 유용 미생물인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 이용하여 발효시켜 적양파 내에 함유된 항산화 작용 화합물인 퀘르세틴(quercetin)의 추출 효율을 높임으로써, 적양파 추출 분말을 원료로 하여 모발 촉진에 도움을 주는데 효과가 있다.

둘째, 항산화 및 피부재생의 작용을 갖는 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 함유하는 참당귀 추출 분말을 통해 탈모치료 또는 발모개선에 좋은 영향을 주는데 기여하는 효과가 있다.

셋째, 적양파, 참당귀 및 호박은 천연 유래의 물질이어서 독성이 없으므로, 인체에 적용하여도 부작용을 유발하지 않는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 과정도.
도 2는 적양파 발효농축 분말의 제조과정도.
도 3은 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)의 기탁증서.
도 4는 호박 추출에 따른 HPLC diagram.
도 5는 참당귀 추출 분말의 제조과정도.
도 6은 참당귀 추출에 따른 HPLC diagram.
도 7은 신균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스-KJS2(Bacillus polyfermenticus-KJS2)의 기탁증서.
도 8은 3종 미생물로 생물전환 전/후의 HPLC diagram
도 9는 플라보노이드 함량 그래프.
도 10은 항산화 활성을 나타낸 그래프.
도 11은 육안 관찰 결과를 나타낸 사진.
도 12는 피부조직 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 그래프.
도 13은 피부조직 γ-GT(γ-glutamyl transpeptidase) 활성을 나타낸 그래프.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

즉 본 발명의 탈모방지 또는 발모개선용 조성물은 적양파(Red Allium cepa) 발효농축 분말, 호박(Cucurbita moschata) 추출 분말 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출 분말이 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 배합된 혼합물을 포함하는 것이 특징이며, 탈모방지 또는 발모개선용 조성물을 이루는 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말 각각의 출발물질이 되는 적양파, 호박 및 참당귀는 다음과 같이 설명될 수 있다.

첫째, 양파는 매운맛이 약한 감미종과 매운맛이 강한 신미종으로 크게 나뉘고, 다시 비늘줄기의 색깔에 따라 황색·적색·백색계로 나뉜다. 감미종은 생식하는데 많이 이용되고, 신미종은 조리에 주로 이용된다. 또한 양파는 동의보감에서 이르길 "오장의 기에 모두 이롭게 한다" 라고 기록하고 있고, 오래전부터 전통민간요법으로 사용되고 있는 식물로 알려져 있는 바와 같이 인체에 유익한 화학 성분인 퀘르세틴(quercetin) 함량이 생양파의 경우에는 16~42mg/100g 정도 함유되어 있고, 이러한 퀘르세틴(quercetin) 성분은 혈액 속의 불필요한 지방과 콜레스테롤을 용해시키는 작용을 하므로 동맥경화와 고지혈증을 예방하고, 혈압을 내리며, 혈당을 저하시키는 작용을 한다.

본 발명에서 사용되는 적양파는 일반 양파에 비해 퀘르세틴(quercetin) 함량이 풍부하고, 혈액 속의 불필요한 지방과 콜레스테롤을 용해시키는 등의 혈행 개선 효과가 있음과 동시에, 이런 효과를 바탕으로 발모 촉진에 도움을 주는 효과도 있다.

둘째, 호박은 박과에 속하는 1년생 덩굴식물로써 열대 아메리카가 원산지이며, 크게 동양계 호박과 서양계 호박 및 페포호박으로 나눌 수 있다. 호박은 성숙함에 따라 당질과 비타민 A 등의 영양성분이 증가하여 식품적 가치가 높고, 황색을 나타내는 천연색소 등이 존재하는데 이런 천연색소는 여러가지 가공식품의 첨가물로 이용되고 있다. 이중에서도 특히 베타카로틴(β-carotene)은 비타민 A의 좋은 급원이며, 다양한 약리효과를 가지고 있다.

특히 호박은 베타카로틴과 같은 항산화 성분이 많이 함유되어 체내 산소 공급과 혈액 순환에 도움을 주므로, 발모 촉진에 영향을 기여한다. 단, 호박의 경우 수확 시 성장속도에 따라 분류되는 애호박과 늙은 호박 중 본 발명에서는 늙은 호박이 적용될 수 있다.

이처럼 적양파와 호박이 가지는 혈액 순환 촉진 기능과, 이를 바탕으로 한 혈액의 원활한 순환을 통해 두피에 공급되어야 할 영양과 수분이 두피에 효율적으로 공급되도록 하고, 이를 통해 두피, 모근 및 모발 등에 영양을 충분히 공급할 수 있어 발모를 촉진하게 된다.

셋째, 당귀는 미나리과(Umbelliferae)의 식물로써 일본산을 왜당귀(Angelica acutiloba), 중국산을 중국당귀(Angelica sinensis), 한국산을 참당귀(Angelica gigas)라고 하여 항산화 및 피부재생에 도움을 주는 잎과 뿌리를 사용한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 과정도이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 상술된 탈모방지 또는 발모개선용 조성물은, 적양파를 알코올 추출을 통해 얻은 추출액을 균주 배양액에 투입해 발효시킨 다음 농축하여 적양파 발효농축 분말을 형성하는 단계(S10), 호박을 알코올 추출을 통해 호박 추출 분말을 형성하는 단계(S20), 참당귀를 알코올 추출하여 참당귀 추출 분말을 형성하는 단계(S30) 및 적양파 발효농축 분말, 참당귀 추출 분말 및 호박 추출 분말을 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계(S40)를 통하여 제조된다.

적양파를 알코올 추출을 통해 얻은 추출액을 균주 배양액에 투입해 발효시킨 다음 농축하여 적양파 발효농축 분말을 형성한다(S10).

도 2는 적양파 발효농축 분말의 제조과정도이다. 도 2를 참조하면, 탈모방지 또는 발모개선을 위한 조성물의 원료로 사용하는 적양파를 유용 미생물인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 이용하여 발효시켜 적양파 내에 함유된 항산화 작용 화합물인 퀘르세틴(quercetin)의 추출 효율을 높인 과정을 나타낸 것임을 알 수 있다.

먼저, 적양파 분말을 알코올에 투입하고 여과시켜 1차 상등액과 1차 추출액으로 1차 분리함으로써 1차 추출한다(S10a).

즉 적양파를 전처리공정에 의해 세척, 건조 및 분쇄과정을 거쳐 가공한 적양파 분말을 에틸 알코올인 주정에 투입하고 35~45℃로 가온시켜 2~4시간 동안 추출한 후, 여과지(No.2)를 이용해 여과시켜 1차 상등액과 1차 추출액으로 분리한다. 단, 적양파 분말의 입자 크기는 특별히 한정하지 않기로 한다.

이때 적양파 분말과 주정은 1:4~6의 중량비율로 혼합하는데, 주정이 4중량비율 미만이면 적양파에 함유된 퀘르세틴(quercetin)이 충분히 추출되기 어려워 적양파 분말 내의 플라보노이드(flavonoid)계 색소의 추출량이 과포화되어 추출 효율이 낮아질 뿐만 아니라 추출하는데 많은 시간이 소요되고, 6중량비율을 초과하면 추출은 충분히 이루어질지 모르나, 그 이하의 중량비율이 첨가되어 추출된 경우와 비교하여 더 탁월한 추출효율을 얻지 못한다. 바람직하게는, 적양파 분말의 중량 대비 주정이 5배로 혼합되는 것이 좋다.

적양파의 1차 추출 시 온도 조건과 관련하여 35~45℃에서 이루어지는 것이 좋은데, 35℃ 미만이면 적양파의 퀘르세틴(quercetin)과 같은 주성분이 그외 불순물과 함께 침전해버리는 문제점이 발생하고, 45℃보다 높은 경우 퀘르세틴(quercetin) 외에 원하지 않는 다른 성분이 함께 녹아 나오기 때문에 추출 최적의 온도 조건은 40℃가 바람직하다.

적양파의 1차 추출 시 시간 조건과 관련하여 2~4시간 동안 이루어지는 것이 좋은데, 온도 조건과 마찬가지로 2시간 미만이면 적양파의 퀘르세틴(quercetin)과 같은 주성분이 그외 불순물과 함께 침전해버리는 문제점이 발생하고, 4시간을 초과하면 퀘르세틴(quercetin) 외에 원하지 않는 다른 성분이 함께 녹아 나오기 때문에 추출 최적의 시간 조건은 3시간이 바람직하다.

참고로, 1차 추출은 펌프 순환형 교반으로 2회 추출과정으로 이루어지는 것이 바람직하다.

다음으로, 1차 추출액을 여과 후 농축시켜 적양파 농축물을 얻는다(S10b).

1차 추출액을 필터를 이용해 여과시켜 여과액을 취한 후 여과액을 증발농축함으로써, 적양파 농축물을 얻는다.

다음으로, 적양파 농축물을 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액에 투입한 후 발효시켜 적양파 발효물을 형성한다(S10c).

말하자면 발효단계는 적양파 농축물을 유용 미생물 배양액에 투입한 후 발효시켜 적양파 발효물으로 가공하는 단계로써, 적양파 농축물을 공기 중의 오염균에 의한 유입으로 오염을 방지하기 위하여 52~57℃(바람직하게는 55℃)의 온도를 유지하면서 4시간 동안 교반배양한 후, 20℃에서 2시간 동안 정치한다.

적양파 농축물과 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액은 1:3~5의 중량비율로 혼합되는데, 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액이 3중량비율 미만이면 적양파 농축물이 충분히 발효되지 못하고, 5중량비율을 초과하면 적양파 농축물이 오히려 과발효되어 제품화되지 못하는 문제점이 있으므로, 적양파 농축물과 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액이 1:4의 중량비율로 혼합되는 것이 가장 바람직하다.

52~57℃의 온도를 유지하는 이유는 대부분 공기중의 오염균이 45℃ 이상에서 거의 성장할 수 없고, 50℃ 이상에서는 일반적으로 성장할 수 없기 때문에 오염균이 포함된 공기 유입으로 인한 오염을 방지하기 위함이다.

한편, 발효단계에서 사용하는 유용 미생물 배양액은 유용 미생물을 미네랄 배지 용액에 접종하여 배양하는 미네랄 접종 배양단계를 거쳐 제조되어지며, 유용 미생물은 신규주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 사용한다.

본 발명에서 사용하는 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)은 도 5에 첨부된 내용과 같이 한국미생물보존센터에 종균등록번호 KCCM11523P로 기탁되어 있다.

그리고 본 단계에서 사용하는 미네랄 배양액은 옥수수 전분(Corn starch) 1.5w/v%, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5w/v%, K₂HPO₄ 0.25w/v%, KH₂PO₄ 0.25w/v%, MgSO₄·H₂O 0.51g, KCl 0.5w/v%, NaCl 0.03w/v%, MgSO₄ 0.05w/v%, MnSO₄ 0.003w/v%, CaCl₂ 0.02w/v%로 구성된다.

미네랄 접종 배양단계는 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar, TSA) 배지에서 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)의 콜로니 2~3개를 취하여 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy Broth, TSB) 배지 50ml에 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 접종한 다음 40~44℃의 온도를 유지하며, 원심분리기를 이용하여 150rpm의 속도로 충분히 배양한다. 그 후 미네랄 배지 용액 1,000ml에 중간접종한 다음, 38~42℃ 온도를 유지하며 3시간 30분 내지 4시간 30분 동안 진탕 배양하여 유용 미생물 배양액으로 제조된다.

미네랄 배지 용액은 미네랄 농도를 5중량%로 한정하였지만, 상기의 미네랄 함량에만 반드시 한정되지 아니하고, 필요에 따라 미네랄의 농도는 적절이 조절되어질 수 있다. 미네랄 성분의 경우에도 반드시 상기에 열거된 성분들에만 한정되지 아니하고, 그 성분의 종류들은 적절히 조절 가능하다.

다음으로, 적양파 발효물을 원심분리를 통해 2차 상등액과 2차 추출액으로 2차 분리하는 2차 추출을 진행한다(S10d).

이때 2차 추출액이라 함은 침전물을 의미하며, 10,000rpm의 속도로 5~20분 동안 원심분리에 의해 2차 상등액과 2차 추출액으로 분리된다.

다음으로, 침전물인 2차 추출액을 주정에 투입하여 용해시킨 다음 원심분리하여 상등액을 농축 및 분말화한다(S10e).

2차 추출이 완료된 2차 추출액을 주정인 에틸 알코올에 투입하여 용해시킨 다음 원심분리(10,000rpm, 15~20분)를 이용하여 얻은 상등액을 농축하여 적양파 발효농축물로 사용한다.

따라서 유용 미생물인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 이용하여 발효시켜 적양파 내에 함유된 항산화 작용 화합물인 퀘르세틴(quercetin)의 추출 효율을 높임으로써, 적양파 발효농축 분말과 참당귀 추출 분말을 원료로 하여 발모를 촉진시키거나 탈모를 방지하는데 있어서 효능 향상에 기여하게 된다.

호박을 알코올 추출을 통해 호박 추출 분말을 형성한다(S20).

즉 호박 추출 분말은 분쇄된 호박 분말을 주정과 1:1~3의 중량비율로 혼합하여 40~50℃에서 5~7시간 동안 추출한 후, 50~60℃에서 5~10시간 동안 상기 주정에 함유된 알코올을 증류시킨 다음 분말화하여 형성된다.

내용인즉 호박 분말, 초산 발효 호박 분말, 호박씨 분말 각각을 주정과 1:2의 중량비율로 혼합하여 45℃에서 6시간 동안 추출한 후 증류기로 55℃에서 8시간 동안 알코올 성분을 증류시켜 호박 에탄올 추출물, 호박 초산 발효물, 호박씨 에탄올 추출물을 얻는다. 이들 호박 에탄올 추출물, 호박 초산 발효물, 호박씨 에탄올 추출물 중 본 발명에 적용하기 위한 호박 추출 분말을 선택하기 위해 아래의 도 4에서와 같은 HPLC diagram을 확인해 보았다.

도 4는 호박 추출에 따른 HPLC diagram이다. 도 4를 참조하면, 호박 에탄올 추출물, 호박 초산 발효물, 호박씨 에탄올 추출물 중 호박 에탄올 추출물의 β-carotene 함량이 가장 높고, 호박 초산 발효물과 호박씨 에탄올 추출물에는 β-carotene이 검출되지 않음을 알 수 있다. 이에 따라 호박 초산 발효물보다 공정이 간단하고 쉬운 호박 에탄올 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 다만, 경우에 따라 호박 에탄올 추출물에 β-carotene(0.002%)의 양이 많지 않은 경우도 있기 때문에, 경우에 따라 에탄올로 추출하지 않고 호박 파우더 그 자체로도 사용 가능하다.

부가적으로, 호박 추출 분말의 제조 시 호박 분말과 주정을 1:1~3의 중량비율로 혼합할 때 주정이 1중량비율 미만이면 호박에 함유된 β-carotene이 충분히 용출되지 못하고 주정이 3중량비율을 초과하면 주정이 그 이하의 양으로 첨가된 경우와 대비하여 추출효율에 큰 영향을 주지 않는다.

추출 시 40~50℃에서 5~7시간 동안 추출을 하는 이유는, 40℃ 미만이나 5시간 미만으로 이루어지면 100%의 추출효율을 달성할 수 없고, 50℃를 초과하거나 7시간을 초과하여 이루어지면 호박에 함유된 주성분인 β-carotene 분해 우려가 있을 뿐만 아니라 그외에 필요로 하지 않는 기타 부성분이 함께 추출될 우려가 있기 때문이다.

추출이 이루어진 후, 50~60℃에서 5~10시간 동안 주정에 함유된 알코올을 증류시킨 다음 분말화가 진행되는데, 50℃ 미만이나 5시간 미만으로 진행되면 알코올의 증류가 충분히 이루어지지 않아 추후 분말화시키는데 어려움이 있고, 60℃를 초과하거나 10시간을 초과하여 진행되면 오히려 물성이 변형되는 문제점이 초래될 수 있다.

참당귀를 알코올 추출하여 참당귀 추출 분말을 형성한다(S30).

도 5는 참당귀 추출 분말의 제조과정도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 건조 및 분쇄된 참당귀 분말을 두 차례의 추출을 거친 후, 추가적인 후처리를 통해 참당귀 추출 분말을 얻게 된다.

기존 참당귀 추출물의 경우 불순물 함량이 비교적 높아 이를 바로 사용하게 되면 여러가지 부작용이 나타날 가능성이 있으나, 본 발명에서의 참당귀 추출 분말은 당류를 제거하여 불순물 함량을 낮춰 순도를 증가시킨 것이 특징이다.

먼저, 참당귀 분말을 35~45℃ 하에서 알코올 추출한 후 여과하여 참당귀 여과액을 얻는다(S30a).

즉 원료인 참당귀를 수십 메시(mesh)로 잘게 분쇄하여 수분함량이 1~3%가 되도록 건조시킨다. 수분함량이 1% 미만으로까지는 건조가 이루어지지 어렵고, 수분함량이 3%를 초과할 경우 수분이 많이 함유되어 추가되는 공정에서 좋지 못한 영향을 미치게 될 뿐만 아니라 참당귀를 오랜시간 보관하게 되면 썩게될 우려가 있다.

이렇게 준비된 참당귀 분말 100중량부에 대하여 300~700중량부의 70% 에틸 알코올인 주정에 첨가하여 1차적으로 추출하여 1차 상등액과 1차 추출액으로 분리된다. 1차 추출 시 주정이 300중량부 미만이 되면 참당귀 분말의 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)와 같은 주 유용성분이 충분히 추출되지 못하고, 700중량부를 초과하면 그 이하의 주정 양을 첨가하여 추출한 경우와 대비하여 추출에 더 탁월한 효과가 있지 않고 오히려 주정이 불필요하게 많이 사용되는 단점이 있다.

이어서 1차 추출이 완료된 1차 추출액 100중량부에 대하여 300~700중량부의 70% 에틸 알코올인 주정에 첨가하여 2차적으로 추출하여 2차 상등액과 2차 추출액으로 분리한다. 2차 추출을 진행하는 이유는 참당귀 분말에 함유되어 1차 추출 시 추출되지 못한 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 100% 가까이 추출하기 위함이다. 1차 추출할 때와 마찬가지로 주정은 300~700중량부 범위로 첨가하는데, 이는 300중량부 미만으로 첨가하면 1차 추출에 추출되지 못한 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 충분히 재용해되기에 미미한 양이고, 700중량부를 첨가하면 추출효율에 더 좋은 영향이 있지 않기 때문이다.

특히 1차 추출 및 2차 추출 시 35~45℃에서 이루어져야 하는데, 35℃ 미만이면 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)와 같은 주성분이 불순물과 함께 침전하는 단점이 발생하고, 45℃보다 높은 경우 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate) 외에 원하지 않는 다른 성분이 함께 녹아 나올 우려가 있다. 추출 최적 조건으로는 40℃가 바람직하다.

연속적인 추출과정을 통해 얻은 2차 추출액을 여과함으로써, 참당귀 여과액을 형성하는 것으로 본 단계를 마무리짓는다.

다음으로, 참당귀 여과액과 물(water)을 1:2의 중량비율로 혼합한 후, 6N HCl과 같은 산용액으로 pH 5.0으로 조절하여 4~8시간 동안 방치시켜 침전을 통해 참당귀 침전물을 얻는다(S30b).

참당귀 여과액을 물에 혼합하는 이유는 참당귀 침전물을 얻기 위한 것으로, 물은 참당귀 여과액의 중량 대비 2~5배로 혼합되는 것이 좋다. 참당귀 여과액에 물을 2~5배 넣어주게 되면 참당귀 여과액을 안정화시켜줄 수 있게 된다.

그리고 참당귀 여과액을 물에 혼합한 후 산용액으로 pH 5.0으로 조절하는 이유는 pH 5.0로 조절된 경우에 최적의 참당귀 침전물이 형성되기 때문이다. 반대로 산용액이 아닌, 염기성용액으로 알칼리화하게 되면 참당귀의 유용성분이 파괴되어 제품화할 수 없게되는 문제점이 있다.

pH를 5.0으로 조절한 후에는 4시간 이상 8시간 이하로 방치 또는 정치시켜야 하는데, 4시간 미만으로 방치하면 참당귀 침전물이 충분히 만들어지지 못하고, 8시간를 초과하여 방치하면 너무 오랜시간 방치되어 물성 변화를 초래할 수 있기 때문에 주의할 필요성이 있다.

다음으로, 방치 후 원심분리하여 얻은 참당귀 침전물 1kg 당 주정 4~6L를 첨가하여 여과시킨 후 농축 및 분말화를 거쳐 순도 70% 이상의 참당귀 주성분을 포함하는 참당귀 추출 분말을 얻는다(S30c).

도 6은 참당귀 추출에 따른 HPLC diagram이다. 도 6을 참조하면, 순도가 높은 참당귀 추출 분말을 제조함에 있어서, 참당귀의 주요 성분인 데커신(decursin)/데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 최대함량 74%까지 추출하여, 최소 50% 이상은 안정적으로 생산이 가능하며, 74%가 나옴을 알 수 있다.

적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말을 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 혼합하여 혼합물을 형성한다(S40).

적양파 발효농축 분말이 1중량비율 미만이면 퀘르세틴(quercetin) 함량이 풍부하지 못해 혈액 속의 불필요한 지방과 콜레스테롤을 용해시키는 등의 혈행 개선 효과에 도움을 주지 못해, 결과적으로 발모 촉진제 역할을 할 수 없게 되면, 5중량비율을 초과하면 그 이하의 중량비율로 첨가된 경우와 비교하여 더 탁월한 효과가 나타나지 않기 때문에, 적양파 발효농축 분말은 1~5중량비율로 적절하게 혼합하는 것이 바람직하다.

호박 추출 분말이 1중량비율 미만이면 베타카로틴(β-carotene)과 같은 항산화 성분이 부족해 체내 산소 공급과 혈액 순환에 도움을 주지 못해, 이 또한 결과적으로 발모 촉진에 영향을 끼치지 못하게 되고, 5중량비율을 초과하면 사용된 함량 대비하여 그 효과가 더 탁월해지지 않기 때문에 호박 추출 분말은 1~5중량비율로 사용되는 것이 바람직하다.

참당귀 추출 분말이 1중량비율 미만이면 피부재생에 도움을 주지 못해 발모를 개선시키는데 그 효과가 미미하고, 5중량비율을 초과하면 적양파 발효농축 분말과 호박 추출 분말과의 혼화력이 좋지 못해 시너지 효과를 내지 못하게 되므로, 참당귀 추출 분말은 1~5중량비율 내에서 적절하게 사용되는 것이 바람직하다.

예컨대, 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말의 혼합비율을 5:3:2, 5:2:3, 3:5:2, 2:5:3, 3:25, 2:3:5의 중량비율로 혼합될 수 있는데, 이는 표 3에서도 확인이 가능하다. 다만, 상술된 중량비율에 한정되는 것만은 아니고, 경우에 따라 다양하게 변경도 할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다. 단, 이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

적양파 발효농축 분말의 제조

건조된 적양파 분말 15kg을 약 5kg씩 3포로 나누어 추출포에 넣었다. 추출탱크에 추출포를 넣고 70% 주정 혼합액을 내용물 대비 5배수로 넣고 40℃로 가온하여 3시간 동안 추출하였다(펌프순환형 교반으로 2회 추출했다.). 추출액을 25㎛ 이하의 하우징필터를 이용해 여과하여 여과액을 취했다. 여과액을 원심분리(10,000rpm for 15mins)하여 상등액을 감압농축(경우에 따라 증발농축도 가능)했다. 이를 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액과 1:4의 중량비율, 즉 4kg의 농축액을 16kg의 균주 배양액에 혼합 후 교반배양(55℃, 150rpm/4시간)하고 20℃에서 2시간 정치시켰다. 이후, 발효액을 원심분리기(10,000rpm for 15mins)에 넣고 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 70% 주정에 녹여 원심분리(10,000rpm for 15mins)한 후 상등액을 70℃에서 감압농축하여 알코올을 증발시켰다. 알코올을 제거한 침전농축물의 함량을 측정하여 일정비율대로 부형제(만니톨 1,110g(37%) + 전분 1,290(43%)g/3L)를 첨가해 분무건조(spray dry)하여 분말을 회수하였으며, 체 여과하여 균질화로 마무리지었다. 실시예 1의 과정에 따른 함량 변화를 아래의 표 1에 간단히 정리해 보았다.

원료투입량	추출액(5배수×2회)	여과농축액	발효농축	건조물량
15kg	150kg(75kg×2)	450kg (여액 150kg+물 300kg)	20kg(4kg:16kg) 여과농축	0.5kg
15kg	150kg(75kg×2)	3.8~4kg	0.1kg(0.6%)	0.5kg

실시예 1에서 사용한 유용 미생물은 TSA 배지에서 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)의 콜로니 2~3개를 취하여 TSB 배지 50ml에 BS3를 접종한 다음 42℃의 온도를 유지하며, 원심분리기를 이용하여 150rpm의 속도로 배양한 다음, 미네랄 농도가 5중량%인 미네랄 배지 용액 1,000ml에 중간 접종한 후, 40℃의 온도를 유지하며 4시간 동안 진탕 배양하여 유용 미생물 배양액을 제조하였다.

실시예 1에서 사용된 신균주인 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)은 도 3에 첨부된 기탁증서에 나타난 바와 같이, 한국 미생물보존센터에 종균등록번호 KCCM11523P로 기탁되어 있다.

<실시예 2>

호박 추출 분말의 제조

호박 분말과 주정을 1:2의 중량비율로 혼합하여 45℃에서 6시간 동안 추출한 후, 증류기를 이용해 55℃에서 8시간 동안 알코올 성분을 증류시킨 다음 분말화하여 호박 추출 분말을 제조하였다.

<실시예 3>

참당귀 추출 분말의 제조

건조된 참당귀 분말 15kg을 5kg씩 3포로 나누어 추출포에 넣었다. 추출탱크에 추출포를 넣고 70% 주정을 내용물 대비 5배수로 넣고 40℃로 가온하여 3시간 동안 추출하였다(펌프순환형 교반으로 2회 추출했다.). 추출액을 25㎛ 이하의 하우징필터를 이용해 여과하여 여과액을 취했다. 여과액 대비 물을 2배 첨가한 후 6N HCl을 이용해 pH 5.0으로 조절한 후 6시간 동안 방치하여 침전시켰다. 침전물을 원심분리기(10,000rpm for 15mins)로 분리한 후 침전물을 다시 회수했다. 침전물 1kg에 5배수(5L)의 주정(70%)을 첨가하여 여과 후 농축했다(600g). Brix 측정으로 20Brix/L일 때, 만니톨 900g(=30%)과 전분 1,500g/3L(=50%)를 혼합해 일정량 가수해서 SD(spray dry)해 분말화하였다. 이렇게 얻은 분말을 체 여과하여 균질화로 마무리지었다. 실시예 3의 과정에 따른 함량 변화를 아래의 표 2에 간단히 정리해 보았다.

원료투입량	추출액(5배수×2회)	침전액(2배수)	침전물량	건조물량
15kg	150kg(75kg×2)	450kg (여액 150kg+물 300kg)	0.6kg(4%)	3kg

<실시예 4>

혼합물의 제조

적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말을 아래의 표 3에서와 같은 중량비율로 각각 혼합하였다.

	적양파 발효농축 분말	호박 추출 분말	참당귀 추출 분말
#1	5	3	2
#2	5	2	3
#3	3	5	2
#4	2	5	3
#5	3	2	5
#6	2	3	5
단위: 중량비율

가용화 조건은 다음의 표 4와 같다.

Reagent	Contents
EtOH	3%
Lysine	1.5%
tween 80	1%

<비교예 1>

실시예 1과 동일한 방법에 의해 적양파 발효농축 분말을 제조하되, 비교예 1에서는 실시예 1에서 사용한 유용 미생물을 대체하여 바실러스 모자벤시스-KJS3(Bacillus mojavensis-KJS3, 이하, 'BM3'이라 한다.)를 사용하였다.

<비교예 2>

실시예 1과 동일한 방법에 의해 적양파 발효농축 분말을 제조하되, 비교예 2에서는 실시예 1에서 사용한 유용 미생물을 대체하여 신균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스-KJS2(Bacillus polyfermenticus-KJS2, 이하, 'BV0'라 한다.)를 사용하였다.

비교예 2에서 사용하는 신균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스-KJS2(Bacillus polyfermenticus-KJS2)는 도 7에 첨부된 기탁증서에 나타난 바와 같이 한국미생물보존센터에 종균등록번호 KCCM10769P로 기탁되어 있다.

<실험예 1>

본 실험예에서는 적양파 발효농축 분말의 퀘르세틴(quercetin)을 분석하고 함량을 실험해 보았다.

1. HPLC 분석장비를 이용한 퀘르세틴(quercetin)의 함량 분석

아래의 표 5의 내용과 같은 제원을 갖는 HPLC 분석장비(일본, Shimachu사)를 이용하여 퀘르세틴(quercetin)의 함량 분석 시료로써, 실시예 1, 비교예 1, 2의 적양파 발효농축 분말의 시료를 각각 1g씩 사용하여 시료에 함유된 퀘르세틴(quercetin)의 함량을 분석하였다.

구분	제원
컬럼(Column)	ZorbaxEclipse XDB-C18 column
유속(Flow rate)	1.3ml/min
검출 파장(Detection wavelength)	370nm
컬럼 온도(Column temperature)	35℃
주입량(Injection volume)	20㎕
이동 용매(Mobile solvent)	A: 2% acetic acid in water
이동 용매(Mobile solvent)	B: ACN(Acetonitrile)
이동상(Mobile phase)	Isocratic elution A: B(60%:40% v/v)
총 실행 시간(Total	15min for each injection

2. 퀘르세틴(quercetin)의 함량

적양파 추출물, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 적양파 발효농축 분말에 함유된 퀘르세틴(quercetin)의 함량을 측정한 결과는 아래의 표 6의 내용과 같다.

구분 (사용균주)	HPLC 분석 농도 (ppm)	시료 내 quercetin 함량 (ppm)
적양파 추출물	500ppm	39.72
실시예 1 (BS3)	500ppm	90.86
비교예 1 (BM3)	500ppm	64.75
비교예 2 (BV0)	500ppm	55.78

도 8은 3종 미생물로 생물전환 전/후의 HPLC diagram으로써, 3종 미생물(BV0, BM3, BS3)을 이용한 생물전환 전과 후의 HPLC diagram을 나타낸 것이다.

표 6과 도 8에 따르면, 시료 내 퀘르세틴(quercetin)의 함량이 발효과정을 거치지 않은 적양파 추출물(Red-Q)의 시료는 39.72ppm인데 반하여 발효과정을 거친 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에 따른 시료의 경우에는 각각 90.86ppm, 64.75ppm 및 55.78ppm으로 시료 내 퀘르세틴(quercetin)의 함량이 발효과정을 거치지 않은 적양파 추출물(Red-Q)에 비해 높은 것을 확인할 수 있다.

그리고 발효과정을 거친 실시예 1, 비교예 1 및 2의 시료에 대한 퀘르세틴(quercetin)의 함량을 살펴보면, 적양파 추출물(Red-Q)의 발효 시 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3)을 사용하여 적양파 추출물(Red-Q)을 발효시킨 실시예 1의 시료가, 바실러스 모자벤시스-KJS3(Bacillus mojavensis-KJS3)을 사용하여 적양파 추출물(Red-Q)을 발효시킨 비교예 1의 시료 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스-KJS2(Bacillus polyfermenticus-KJS2)를 사용하여 적양파 추출물(Red-Q)을 발효시킨 비교예 2의 시료에 비해 시료 내 퀘르세틴(quercetin)의 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2>

본 실험예에서는 적양파, 호박 및 참당귀 각각과 함께, 표 3에서와 같이 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말의 여섯가지 경우별로 플라보노이드 분석을 실험해 보았다.

도 9는 플라보노이드 함량 그래프이다. 도 9를 참조하면, 적양파, 호박 및 참당귀 각각의 플라보노이드를 분석했을 때, 적양파에서 가장 높은 플라보노이드 성분이 나왔고, 혼합비율로는 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 5:3:2의 중량비율일 때 플라보노이드가 가장 높게 나왔다.

단, 도 9에서 Con은 vehicle, 1은 RA:CM:AG=5:3:2, 2는 RA:CM:AG=5:2:3, 3은 RA:CM:AG=3:5:2, 4는 RA:CM:AG=2:5:3, 5는 RA:CM:AG=3:2:5, 6은 RA:CM:AG=2:3:5의 중량비율로 이루어진 것을 의미하며, RA는 적양파(Red Allium cepa), CM은 호박(Cucurbita moschata), AG는 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 의미한다.

All the values were expressed as means (n=3)S.D.

* p<0.001 compared with control. ** p<0.05 compared with control.

<실험예 3>

본 실험예에서는 적양파, 호박 및 참당귀 각각과 함께, 표 3에서와 같이 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말의 여섯가지 경우별로 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 실험해 보았다.

우선 Free radical은 생물학적 손상의 주요 요인으로 지목되는 것으로 실험에 이용되는 1.1-diphenyl-2-pricrylhydrazyl(DPPH) radical은 화학적으로 안정화 되어 있는 free radical의 형태로 시료에 존재하는 전자나 수소원자와 결합시 환원됨에 따라, 이를 이용한 항산화를 측정해 보기로 하였다.

즉 산화되어있는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 얼마나 환원시킬 수 있는지에 대한 항산화력을 측정하는 것으로, 적양파 발효농축 분말(RA), 호박 추출 분말(CM), 참당귀 추출 분말(AG) 및 이들이 혼합된 혼합물의 항산화 활성 유무를 측정하였다.

실험 과정은 각 시료를 농도별(1000, 500, 250, 125㎍/ml)로 용액 100㎕에 5×10^-4M의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 0.9ml를 넣었다. 20분간 정치한 후, 잔존 라디칼의 농도를 측정하기 위하여 microplate reader기(Wallac 1420, USA)를 사용해 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 10은 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. 도 10을 참조하면, 적양파, 호박 및 참당귀 각각 항산화 활성을 비교해 볼 때 적양파가 가장 활성이 높았고, 혼합비율별로 DPPH 라디칼 소거능을 실험해 본 결과, 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 5의 경우가 항산화 효과가 가장 높게 나타났다.

단, 도 10에서 Con은 vehicle, 1은 RA:CM:AG=5:3:2, 2는 RA:CM:AG=5:2:3, 3은 RA:CM:AG=3:5:2, 4는 RA:CM:AG=2:5:3, 5는 RA:CM:AG=3:2:5, 6은 RA:CM:AG=2:3:5의 중량비율로 이루어진 것을 의미하며, RA는 적양파(Red Allium cepa), CM은 호박(Cucurbita moschata), AG는 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 의미한다.

All the values were expressed as means (n=3)S.D.

* p<0.001 compared with control. ** p<0.05 compared with control.

<실험예 4>

본 실험예에서는 마우스를 통한 육안 관찰을 포함하여 피부조직 ALP(alkaline phosphatase) 활성 및 피부조직 γ-GT(γ-glutamyl transpeptidase) 활성을 통해 발모효과에 대한 생리활성을 검증해 보기로 하였다.

이를 위해 우선 마우스(Mouse)를 1주간 적응 시킨 다음 마우스의 등의 털을 제거하고, 피부 속에 남아 있는 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제를 피부에 도포하여 완전히 털을 제거하였다. 제모 당일로부터 매일 1회 일정한 시간에 경구투여하였으며, 한달간 진행되었다.

육안 관찰

도 11은 육안 관찰 결과를 나타낸 사진으로써, 실험 시작일로부터 일주일마다 사진촬영을 하였으며, 대조군과 실험군의 발모 효과는 사진 상으로 마우스 등피부의 제모 부위에 털이 어느 정도로 자랐는지 육안으로 평가하였다.

도 11에 도시된 바와 같이 제모하고 1주 경과 후에는 모든 털이 자라나지 않았고, 2주 후에도 큰 차이가 나지 않았다. 3주 경과 후부터는 RA, CM, AG 단독보다 M2에서 털이 자라나 피부가 검게 변함이 확인되었다. 이처럼 육안적인 관찰을 통해 M2가 RA, CM, AG 단독이 경구투여된 경우보다 RA, CM 및 AG가 혼합된 M2에서 발모 효과가 있음을 알 수 있다.

단, 도 11에서 N.CON은 판시딜, P.CON은 Statin, RA는 적양파(Red Allium cepa), CM은 호박(Cucurbita moschata), AG는 참당귀(Angelica gigas Nakai), M1은 호박 추출 분말이 첨가되지 않은 참당귀 추출 분말 및 적양파 발효농축 분말만이 1:4 중량비율로 혼합된 혼합물(AG+RA), M2는 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 혼합물(RA+CM+AG)을 나타낸다.

피부조직 ALP(alkaline phosphatase) 활성 측정

모발주기에는 다양한 인자들이 작용함으로써 모발의 성장과 탈모를 유발시키는데, 그중 ALP는 모발이 성장기로 유도될 때 효소 활성이 증가하여 발모의 지표인자로 사용되고 있다.

실험 4주 째 경피 적출한 피부조직을 적출하여 빙냉하에서 미세 절편으로 만들고, 그 중 일정량을 청량한 후, 4배량의 01M 인산완충용액(pH 7.4)을 가하여 마쇄기를 이용하여 20%(w/v)균질액을 만들었다. 이 균질액을 12,000rpm에서 4℃, 30분 간 원심분리하여 그 상층액을 분리하고, ρ-니트로페놀(ρ-nitrophenol)에 알칼리(alkali)를 가하여 비색 정량하는 Bessey-Lowry-Brock 방법에 의하였다. 활성도 단위는 단백질 1mg 당 Bessey-Lowry unit로 하였고, 단백질의 정량은 Lowry 등의 방법에 준하여 보바인 씨럼 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 표준품으로 하여 측정하였다.

도 12는 피부조직 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 그래프이다. ALP는 Alkaline phosphatasecolorimetric assay kit (Genetex:GTX85593)을 이용하여 측정하였으며, 도 12를 참조하면, RA, AG, CM, M1에 비해 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 M2에서 ALP 활성이 높음을 알 수 있다.

단, 도 12에서 CON은 Vehicle, P.CON은 Statin, RA는 적양파(Red Allium cepa), AG는 참당귀(Angelica gigas Nakai), CM은 호박(Cucurbita moschata), M1은 호박 추출 분말이 첨가되지 않은 참당귀 추출 분말 및 적양파 발효농축 분말만이 1:4 중량비율로 혼합된 혼합물(AG+RA), M2는 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 혼합물(RA+CM+AG)을 나타낸다.

피부조직 γ-GT(γ-glutamyl transpeptidase) 활성 측정

γ-GT(γ-glutamyl transpeptidase)는 발모와 관련된 생화학적 효소로 세포막을 통한 아미노산과 펩티드의 배출, 흡수에 관여하며, 모발이 성장기로 될 때 효소활성이 증가한다고 알려져 있어 또 다른 발모 지표로 이용된다.

γ-GT는 ALP분석시료와 같은 방법으로 전처리 하여 Gamma glutamyl transferase activity colorimetric assay kit (Biovision:K784-100)으로 측정하였다.

도 13은 피부조직 γ-GT(γ-glutamyl transpeptidase) 활성을 나타낸 그래프이다. 도 13을 참조하면, RA, AG, CM, M1에 비해 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 M2에서 γ-GT 효소 활성이 가장 증가하여 발모 촉진 효과가 있음을 알 수 있다.

단, 도 13에서 CON은 Vehicle, P.CON은 Statin, RA는 적양파(Red Allium cepa), AG는 참당귀(Angelica gigas Nakai), CM은 호박(Cucurbita moschata), M1은 호박 추출 분말이 첨가되지 않은 참당귀 추출 분말 및 적양파 발효농축 분말만이 1:4 중량비율로 혼합된 혼합물(AG+RA), M2는 적양파 발효농축 분말, 호박 추출 분말 및 참당귀 추출 분말이 3:2:5의 중량비율로 혼합된 혼합물(RA+CM+AG)을 나타낸다.

이와 같은 실시예 및 실험예의 결과로부터, 적양파(Red Allium cepa) 발효농축 분말, 호박(Cucurbita moschata) 추출 분말 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출 분말의 배합으로 혼합물을 얻음으로써, 발모를 촉진시키면서 탈모를 방지하는데 도움을 주어 인체에 대한 안정성을 가지는데 중요한 의미가 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.

따라서 본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것도 아니다.

본 발명의 보호 범위는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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적양파를 알코올 추출을 통해 얻은 추출액을 균주 배양액에 투입해 발효시킨 다음 농축하여 적양파 발효농축 분말을 형성하는 단계;
호박을 알코올 추출을 통해 호박 추출 분말을 형성하는 단계;
참당귀를 알코올 추출하여 참당귀 추출 분말을 형성하는 단계; 및
상기 적양파 발효농축 분말, 상기 호박 추출 분말 및 상기 참당귀 추출 분말을 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비율로 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 참당귀 추출 분말은,
참당귀 분말을 35~45℃ 하에서 알코올 추출한 후 여과하여 참당귀 여과액을 얻는 단계;
상기 참당귀 여과액에 물을 첨가한 후 pH 5.0으로 조절하여 정치시켜 침전을 통해 참당귀 침전물을 얻는 단계; 및
상기 참당귀 침전물 1kg 당 주정 4~6L를 첨가한 후 여과 및 농축하여 분말화하는 단계;로 구성되어 형성되는 것을 특징으로 하는 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 적양파 발효농축 분말은,
적양파 분말을 알코올에 투입하고 여과시켜 1차 상등액과 1차 추출액으로 1차 추출하는 단계;
상기 1차 추출액을 여과시킨 후 농축하여 적양파 농축물을 얻는 단계;
상기 적양파 농축물을 바실러스 서브틸리스-KJ3(Bacillus subtilis-KJ3) 균주 배양액에 투입한 후 발효시켜 적양파 발효물을 형성하는 단계;
상기 적양파 발효물을 원심분리를 통해 2차 상등액과 2차 추출액으로 2차 추출하는 단계;
상기 2차 추출액을 주정에 투입하여 용해시킨 다음 원심분리를 통해 분리된 상등액을 농축 및 분말화하는 단계;로 구성되어 형성되는 것을 특징으로 하는 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 호박 추출 분말은,
호박 분말을 주정과 1:1~3의 중량비율로 혼합하여 40~50℃에서 5~7시간 동안 추출한 후, 50~60℃에서 5~10시간 동안 상기 주정에 함유된 알코올을 증류시킨 다음 분말화하여 형성되는 것을 특징으로 하는 적양파 발효농축물, 호박 추출물 및 참당귀 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물의 제조방법.