KR102234324B1 - 인간 항-타우 항체 - Google Patents

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바이오젠 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

신규한 인간 타우-특이적 항체 뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 변이체, 그리고 이에 관련된 방법이 제공된다. 타우에 특이적인 항체에 관련된 분석, 키트, 및 고형 지지체도 개시된다. 항체, 면역글로불린 사슬(들)뿐만 아니라 이들의 결합 단편, 유도체 및 변이체는 각각 타우 표적화된 면역치료법 및 진단을 위한 약학 및 진단 조성물에서 이용될 수 있다.

Description

인간 항-타우 항체{HUMAN ANTI-TAU ANTIBODIES}
본 발명은 일반적으로 병리적으로 인산화된 타우 및 응집된 형태의 타우를 포함하는 타우 단백질을 인식하는 신규한 타우-특이적 결합 분자, 특히 인간 항체 뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈장 및 CSF 중 타우 및 독성 타우종을 확인하기 위한 진단 도구로서 그리고 신경변성 타우병증, 예컨대 알츠하이머 질환(AD), 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합(ALS-PDC), 은친화성 입자 치매(AGD), 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성(CBD), 크루츠펠트-야콥 질환(CJD), 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17(FTDP-17)에 연관된 파킨슨병을 포함하는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형(NP-C), 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환(PiD), 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비(PSP), 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 수동 백신 접종 전략에서 모두 귀중한 이러한 결합 분자, 항체 및 이들의 모사체를 포함하는 약학 및 진단 조성물에 관한 것이다.
단백질 축적, 개질 및 응집은 여러 신경변성 질환의 병리적 측면이다. 고인산화된 타우 이형태체를 포함하는 병리적으로 개질되고 응집된 타우는 타우병증의 변하지 않는 지표이며 질환 중증도에 연관된다.
타우는 중추신경계에서 발현되는 미세소관-연관 단백질로, 그 일차 기능은 미세소관을 안정화하는 것이다. 성인 인간 뇌에서 주로 발현되는 6가지 주요한 타우 이소형이 존재하며, 이는 대안적 스플라이싱에 의해 단일 유전자에서 유래된다. 병리적 상태 하에서, 타우 단백질은 고인산화되어 튜불린의 결합 상실과 미세소관 불안정화에 이어 병리적 신경섬유 매듭 내 타우의 응집 및 침적을 일으킨다. 타우에 관련된 장애-종합적으로 신경변성 타우병증으로 불림-는 다른 것들 중에서도 알츠하이머 질환(AD), 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 피질기부 변성, FTDP-17을 포함하는 단백질 폴딩오류 장애군의 일부이다. 타우 유전자에서 40개를 초과하는 돌연변이가 선천성 전두측두 치매에 연관된 것으로 보고되었으며 타우 유전자 돌연변이가 신경변성을 유발하기 충분함을 나타내었다(Cairns 등, Am. J. Pathol. 171(2007), 227-40). 유전자삽입 마우스 및 세포 배양에서의 연구로부터 AD에서 타우 병리는 Αβ가 타우의 상류에 놓인 병리적 케스케이드에 의해 유도될 수 있음이 시사된다(Gotz 등, Science 293(2001), 1491-1495). 그러나 다른 발견에서는 두 케스케이드가 서로에 대해 독립적으로 기능하는 이중-경로 모델을 지목한다(van de Nes 등, Acta Neuropathol. 111(2006), 126-138). AD에서 베타-아밀로이드 펩티드를 표적으로 하는 면역치료법은 동물 모델에서 고무적인 결과를 일으켰고, 임상 시험에서 전망을 나타내었다. 소수 대상체로부터의 보다 최근의 부검 데이터는 진행된 AD 환자에서 베타-아밀로이드 플라크의 제거가 인지 저하를 중단시키기 충분하지 않을 수 있음을 제시하여, AD에 대한 추가적 치료 전략에 대한 필요성을 강조한다(Holmes 등, Lancet 372(2008), 216-223; Boche 등, Acta Neuropathol. 120(2010), 13-20). 유전자삽입 동물 모델에서 A베타-기반 면역화 치료법의 성공으로부터, 능동 면역치료법의 개념이 타우 단백질까지 확장되었다. 그러나 타우 단백질을 이용한 야생형 마우스의 능동 백신접종은 신경학적 결손이 동반되는 신경섬유 매듭의 형성, 축삭 손상 및 중추 신경계에서의 단핵구 침윤을 유도하는 것으로 나타났다(Rosenmann 등, Arch Neurol. 63(2006), 1459-1467). 인산화된 타우 펩티드로의 능동 백신접종을 이용한 유전자삽입 마우스 라인에서의 후속 연구는 뇌에서 타우 응집물의 감소된 뇌 수준 및 거동 손상의 진행 완화를 드러내었다(Sigurdsson, J. Alzheimers. Dis. 15(2008), 157-168; Boimel 등, Exp. Neurol. 224(2010), 472-485). 이들 발견은 잠재적 이익을, 그러나 또한 타우를 표적으로 하는 능동 면역치료법 접근에 연관된 엄청난 위험을 강조한다. 유효하고 안전한 치료법으로 병리적 타우 단백질을 해결하는 신규한 치료 전략이 긴급하게 필요하다.
진화적으로 최적화되고 인간 면역계에 의해 친화도 성숙되는 건강한 인간 대상체로부터 유래된 인간 항체를 이용한 수동 면역화는 뛰어난 유효성과 안전성에 대한 높은 개연성을 갖는 새로운 치료 방법을 제공할 것이다.
발명의 간략한 요약
본 발명은 천연 항-타우 특이적 인간 모노클로날 항체의 단리를 위한 건강한 인간 대상체의 타우-특이적 면역 반응을 이용한다. 특히, 본 발명에 따라 수행된 실험은 신경변성 타우병증의 징후가 없는 건강한 인간 대상체 풀로부터 모노클로날 타우-특이적 항체의 단리에 성공적이었다.
따라서 본 발명은 타우를 특이적으로 인식할 수 있는 인간 항체, 항원-결합 단편 및 유사한 항원-결합 분자에 대한 것이다. "타우를 특이적으로 인식하는", "타우에 대해 특이적인 항체" 및 "항-타우 항체"란 구체적으로, 일반적으로, 그리고 종합적으로, 타우의 천연 형태, 또는 응집되거나 병리적으로 개질된 타우 이소형에 대한 항체를 의미한다. 전장의, 병리적으로 인산화된 및 응집된 형태에 선택적인 인간 항체가 본원에 제공된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 인간 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 도 7에 나타낸 가변 영역 VH 및/또는 VL을 특징으로 하는 항체의 면역학적 결합 특징을 나타낸다.
항체의 항원-결합 단편은 단일 사슬 Fv 단편, F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, 또는 임의의 다른 항원-결합 단편일 수 있다. 하기 특정 구현예에서, 항체 또는 이들의 단편은 인간 IgG 이소형 항체이다. 대안적으로, 항체는 키메라성 인간-쥐과 또는 쥐과화된 항체이고, 후자가 특히 동물에서의 진단 방법 및 연구에 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이들의 활성 단편, 또는 작용제 및 인지체 분자를 포함하는 조성물, 또는 대안적으로 그 길항제 및 타우병증의 예방, 진단 또는 치료에서 이러한 조성물을 이용한 면역치료 및 면역진단 방법에 대한 것이며, 여기서 유효량의 조성물이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
자연적으로, 본 발명은 아래에 정의되는 바와 같이 독특하고 고유한 특징을 갖는 항체를 생산하는 불멸화된 인간 B 메모리 림프구 및 B 세포로 각각 연장된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 하나의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 가변 영역은 도 7에 나타낸 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이로 형질전환된 숙주 세포뿐만 아니라 타우에 특이적인 항체 및 균등 결합 분자의 생산을 위한 이들의 용도를 포괄한다. 항체 및 이들의 모사체의 재조합 생산을 위한 수단 및 방법뿐만 아니라 경쟁 결합 분자, 예로 항체의 스크리닝 방법이 당분야에 공지되어 있다. 그러나 특히 인간에서의 치료 적용에 대해 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 상기 항체의 적용이 다른 경우 키메라성, 그리고 심지어 인간화된 항체에 대해 관찰되는 해당 항체에 대한 면역 반응이 실질적으로 없다는 점에서 인간 항체이다.
또한, 표본 중에서 타우를 확인하기 위해 이용될 수 있는 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 개시된 항-타우 항체를 이용하여, 예를 들어 ELISA-기반 또는 표면 채택 분석을 이용해서 표본 중 타우의 존재에 대해 인간혈, CSF 및 소변을 스크리닝할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 신경변성 타우병증, 예컨대 알츠하이머 질환 진단을 보조할 수 있고, 질환 진행 및 치료 유효성을 모니터링하기 위해 이용할 수 있다.
따라서, 신경변성 타우병증, 예컨대 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중의 치료, 진단 또는 예방 방법을 제공하는 것이 본 발명의 특정 목적이다. 이 방법은 대상체에 유효 농도의 인간 항체 또는 항체 유도체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 타우를 표적으로 한다.
본 발명의 추가 구현예는 후술되는 설명 및 실시예로부터 자명할 것이다.
도면/도의 간략한 설명
도 1. 인간 항체 NI-105.4E4(A), NI-105.24B2(B) 및 NI-105.4A3(C)의 가변 영역, 즉 중쇄 및 람다 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열. CDR을 밑줄쳐서 틀(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)을 나타낸다. 클로닝 전략으로 인해, 중쇄 및 경쇄의 N-말단에서의 아미노산 서열은 잠재적으로 FR1에서 프라이머-유도된 변형을 함유할 수 있지만, 실질적으로 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다. 공통 인간 항체를 제공하기 위해, 원래 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 데이터베이스에서 관련 인간 생식계열 가변 영역 서열과 정렬하고 이에 따라 조정하였다; 예로, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅하는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참고하라. PCR 프라이머로 인해 공통 생식계열 서열에서 잠재적으로 일탈하는 것으로 간주되고, 이에 따라 아미노산 서열에서 대체된 아미노산은 진하게 나타낸다.
도 2. NI-105.4E4는 AD 뇌 및 인간 타우P301L 발현 마우스에서 신경섬유 매듭(NFT), 비정상조직 신경돌기 및 신경망 맥에 결합한다. NI-105.4E4 염색은 AD 뇌(A)에서 NFT 및 신경망 맥을 확인하며, 건강한 대조군 대상체(B)의 뇌에서는 타우에 대해 유의미한 결합이 없다. 타우P301L 유전자삽입 마우스(E-I)에서, NI-105.4E4는 NFT(E, F 및 H), 신경망 맥(E 및 G) 및 비정상조직 신경돌기(E 및 H)와 유사한 병리적 타우에 강하게 결합한다. 또한, NI-105.4E4는 매듭-전 단계(I)에서 타우 응집물도 확인한다. NI-105.4E4는 스웨덴 및 북극 돌연변이 및 타우P301L을 갖는 인간 APP를 발현하는 유전자삽입 마우스에서 NFT, 비정상조직 신경돌기 및 신경망 맥에 결합한다; 화살표는 NI-105.4E4(J)로 인식되는 비정상조직 신경돌기가 둘러싼 베타-아밀로이드 플라크를 표시한다. 이차 항체만으로는 인간 AD(C) 및 건강한 대조군(D) 모두에서 신호를 제공하지 않는다.
도 3. 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석. 신경섬유 매듭을 항-인산화-타우 항체 AT100 또는 건강한 노령 대상체에서 단리된 혈청으로 염색하였다.
도 4. NI-105.4E4 및 NI-105.4A3 에피토프 및 시판 마우스 모노클로날 타우 항체에서 일반적으로 이용되는 에피토프의 도식적 예시를 나타낸다. 인간 항체 NI-105.4E4는 두 선형 폴리펩티드를 포함하는 고유한 에피토프를 표적으로 하며, 그 하나는 생리적 미세소관-연관 타우에서 차폐된 타우의 미세소관 결합 도메인(R4)에 위치한다. 타우-12(Covance, California, U.S.A.), HT7, AT8, AT180(Thermo Scientific, U.S.A.); PHF1(Lewis 등, Science 293(2001), 1487-1491).
도 5. 30mg/kg NI-105.4E4 또는 NI-105.4A3 인간 항-타우 항체의 복강 내 투여 후 마우스 혈장 중 인간 IgG 수준.
도 6. 30mg/kg NI-105.4E4 또는 NI-105.4A3 인간 항-타우 항체의 복강 내 투여 후 마우스의 뇌 균질액 중 인간 IgG 수준.
도 7. (A) NI-105.17C1, (B) NI-105.6C5, (C) NI-105.29G10, (D) NI-105.6L9, (E) NI-105.40E8, (F) NI-105.48E5, (G) NI-105.6E3, (H) NI-105.22E1, (I) NI-105.26B12, (J) NI-105.12E12, (K) NI-105.60E7, (L) NI-105.14E2, (M) NI-105.39E2, (N) NI-105.19C6, 및 (O) NI-105.9C4 인간 항-타우 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열. 상보성 결정 영역(CDR)은 밑줄 쳐 나타낸다.
도 8. (A) ELISA 분석에서 재조합 타우에 대한 ch17C1, ch17C1(N31Q) mIgG2a 및 ch17C1(N31Q) mIgG1 Agly의 결합. (B) ELISA 분석에서 ch17C1(N31Q) mIgG2a 및 ch17C1(N31Q, I48V) mIgG2a에 의한 재조합 타우 결합의 비교.
도 9. ELISA 분석에서 NI-105.40E8 hIgG1 및 NI-105.40E8(R104W) hIgG1에 의한 재조합 타우 결합의 비교.
도 10. AD 뇌 및 타우병증의 유전자삽입 마우스 모델의 뇌에서 병리적으로 응집된 타우에 대한 NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6C5 및 NI-105.17C1(I48V) 인간 항-타우 항체의 결합. 알츠하이머 질환(AD)의 뇌 및 타우병증(Tg)의 유전자삽입 마우스의 뇌에서 병리적 타우 응집물에 대한 인간 항-타우 항체 결합의 대표적 이미지. 대조군 조직 표본을 정신적으로 건강한 대상체(Ctr) 또는 야생형 마우스 뇌(Wt)로부터 수득하였다.
도 11. 타우P301L 마우스에서 NI-105.6C5 또는 NI-105.6E3 인간 항-타우 항체의 뇌 투과. "tg"는 처리된 또는 미처리된 유전자삽입 동물로부터의 대표적 구획을 나타내며, "wt"는 처리되지 않은 비-유전자삽입 동물을 나타낸다. 스케일 막대: 50㎛.
도 12. ch4E4(N30Q) 및 ch17C1(N31Q)을 이용한 타우P301L 마우스의 만성 치료 효과. 뇌 단백질 추출물의 가용성 및 불용성 분획 중 총 인간 타우(A), 인간 pS199 타우(B), 인간 pT231 타우(C) 및 인간 pT181 타우(D) 수준을 상업적 ELISA로 정량하였다.
도 13. 웨스턴 블롯으로 검출된 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)로 처리된 타우P301L 마우스에서의 가용성 및 불용성 인간 타우.
도 14. 최종 용량의 i.p. 투여 24h 후 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q) 처리 동물에 대한 평균 혈장 약물 농도. ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)에 대한 평균 혈장 약물 농도는 각각 145 및 200㎍/ml이었다.
도 15. ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)로 처리된 타우P301L 마우스에서의 공간 작업 기억력을 2-시험 Y-미로로 평가하였다.
본 발명의 상세한 설명
I. 정의
신경변성 타우병증은 주로 뉴론 및/또는 아교 세포에서 병리적으로 고인산화된 타우로 이루어진 비정상적 잔섬유의 세포 내 응집물로 구성된 일반적인 병리적 병소를 공유하는 다양한 신경변성 장애군이다. 타우병증의 임상적 특징은 이종성이며, 치매 및/또는 운동 증후군을 특징으로 한다. 잔섬유성 타우 포함의 진행성 축적은, 예로 알츠하이머 질환에서 베타-아밀로이드로서 다른 침적물과 함께, 또는 선천성 형태의 전두측두 치매 및 염색체 17에 연관된 파킨슨병(FTDP-17)에 연관된 타우 유전자에서의 돌연변이로 나타나는 단독 병원성 물체로서 뉴론 및 아교 변성을 유도할 수 있다. 이들의 임상적 발현의 이종성으로 인해, 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발 경색 치매 및 허혈성 뇌졸중을 포함하는 비제한적 목록의 타우병증 질환이 제공될 수 있다; 리뷰를 위해, 예로 표 1에서 타우병증의 고유 구성원을 나타내는 [Lee 등, Annu. Rev. Neurosci. 24(2001), 1121-1159] 또는 [Sergeant 등, Bioch. Biophy. Acta 1739(2005), 179-97]을 그 안의 도 2의 목록과 함께 참고하라.
본 명세서에서, 용어 "타우"는 타우의 천연 단량체 형태를 구체적으로 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 용어 "타우"는 또한 일반적으로 타우의 다른 이형태체, 예를 들어 타우의 올리고머 또는 응집물을 확인하기 위해 이용된다. 용어 "타우"는 또한 종합적으로 타우의 모든 유형과 형태를 나타내기 위해 이용된다. 대안적 스플라이싱으로 인해, 6가지 타우 이소형이 인간 뇌에 존재한다. 이들 이소형에 대한 단백질 서열은 다음과 같다:
352aa의 이소형 태아-타우
Figure 112015069089787-pct00001
(서열 목록 번호 1)
381aa의 이소형 타우-B
Figure 112015069089787-pct00002
(서열 목록 번호 2)
410aa의 이소형 타우-C
Figure 112015069089787-pct00003
(서열 목록 번호 3)
383aa의 이소형 타우-D
Figure 112015069089787-pct00004
(서열 목록 번호 4)
412aa의 이소형 타우-E
Figure 112015069089787-pct00005
(서열 목록 번호 5)
441aa의 이소형 타우-F
Figure 112015069089787-pct00006
(서열 목록 번호 6)
"야생형" 타우 아미노산 서열은 또한 "h타우40", "타우F", "타우-4" 또는 "전장 타우"로 부르는 441aa의 이소형 타우-F(서열 목록 번호 6)로 나타낸다. 타우의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스에서 검색할 수 있다; [Goedert 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988), 4051-4055, Goedert 등, EMBO J. 8(1989), 393-399, Goedert 등, EMBO J. 9(1990), 4225-4230 및 GenBank UniProtKB/swissprot: 유전자위 TAU_HUMAN, 접근 번호 P10636-2(태아-타우) 및 P10636-4 내지 -8(이소형 B 내지 F)]을 참고하라.
타우 단백질의 또 다른 독특한 특징은 인산화로, 이는 79개의 잠재적 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr) 인산화 부위 중 약 30개에서 일어난다. 타우는 뇌 발생 동안 고도 인산화된다. 성인기에는 인산화 정도가 감소한다. 일부 인산화 부위는 타우의 미세소관 결합 도메인 내에 위치하며, 타우 인산화 증가가 미세소관의 결합을 음성적으로 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 미세소관 결합 모티프 내에 또는 인접하여 놓여 있는 Ser262 및 Ser396은 AD 환자의 뇌에서 신경섬유 매듭(NFT)의 주 성분인 비정상적 페어형성 나선형 잔섬유(PHF)의 타우 단백질에서 고인산화된다. PHF는 비정상적으로 고인산화되고 특이적 항-타우 항체로 염색되고 광학 현미경으로 검출될 수 있는 타우 단백질의 잔섬유성 응집물이다. 이는 소위 직선형 타우 잔섬유에 대해서도 해당된다. PHF는 약 80nm 주기로 서로에 대해 꼬인 두 잔섬유로 구성된 꼬인 리본을 형성한다. 이러한 병리적 특성은 일반적으로 "타우-병리", "타우병리" 또는 "타우-관련 병리"로 불린다. 타우병증의 신경병리적 특성에 대한 보다 자세한 설명은 그 개시 내용이 본원에 참조로 도입되는 [Lee 등, Annu. Rev. Neurosci. 24(2001), 1121-1159 및 Goetz, Brain. Res. Rev. 35(2001), 266-286]을 참고하라. 생리적 타우 단백질은 뉴론에서 미세소관을 안정화한다. 병리적 인산화는 비정상적 타우 편재 및 응집을 유도하며, 이는 미세소관의 불안정화 및 세포 수송 손상을 야기한다. 응집된 타우는 시험관 내에서 신경독성이 있다(Khlistunova 등, J. Biol. Chem. 281(2006), 1205-1214). 그러나 정확한 신경독성종은 이들이 뉴론 사망을 야기하는 기전(들)과 마찬가지로 여전히 명확하지 않다. 타우 응집물은 여러 타우병증, 예컨대 알츠하이머 질환(AD), 전두측두 치매, 핵상 마비, 픽 질환, 은친화성 과립 질환(AGD), 피질기부 변성, FTDP-17, 파킨슨병 질환, 권투선수 치매에서 신경섬유 매듭(NFT)의 주성분으로 관찰될 수 있다(Gendron and Petrucelli, Mol. Neurodegener. 4:13(2009)에서 리뷰됨). 이러한 관찰 이외에도, 타우-매개된 뉴론 사망이 매듭 형성의 부재 시에도 일어날 수 있다는 증거가 나오고 있다. 가용성 인산화-타우종이 CSF에 존재한다(Aluise 등, Biochim. Biophys. Acta. 1782(2008), 549-558). 타우 응집물은 세포 밖에서 안으로 잘못 폴딩된 상태를 전송하고 공동 배양된 세포 간에 전달할 수 있다(Frost 등, J. Biol. Chem. 284(2009), 12845-12852).
신경변성 타우병증에서의 관여에 부가하여, 허혈/재관류 동안 및 이후 타우 인산화에서 관찰된 변형은 타우가 신경혈관 장애, 예컨대 허혈성 뇌졸중의 뉴론 손상 및 임상적 병태생리에서 중추적 역할을 담당한다는 것을 제시한다(Zheng 등, J. Cell. Biochem. 109(2010), 26-29).
본원에 개시된 인간 항-타우 항체는 타우 및 이들의 에피토프 그리고 타우 및 이들의 에피토프의 다양한 입체형태에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 타우, 그 전장 타우, 병리적으로 개질된 타우 이소형 및 타우 응집물에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에 개시된다. 본원에서 이용되는 타우에 "특이적으로 결합하는", "선택적으로 결합하는", 또는 "선호적으로 결합하는" 항체에 대한 언급은 다른 미관련 단백질에 결합하지 않는 항체를 나타낸다. 하나의 예에서, 본원에 개시된 타우 항체는 타우 또는 이들의 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 단백질에 대해 배경의 약 1.5배를 초과하는 결합을 나타내지 않는다. 타우 이형태체에 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는" 항체는 타우의 모든 입체형태에 결합하지 않는, 즉 적어도 하나의 다른 타우 이형태체에 결합하지 않는 항체를 나타낸다. 예를 들어, AD 조직에서 응집된 형태의 타우에 선호적으로 결합할 수 있는 항체가 본원에 개시된다. 본 발명의 인간 항-타우 항체는 타우-특이적 면역 반응을 나타내는 건강한 인간 대상체 풀로부터 단리되었으므로, 본 발명의 타우 항체는 이들 항체가 대상체에 의해 실제로 발현되었으며, 예를 들어 지금까지 인간 유사 항체를 제공하기 위한 시도에 있어 하나의 일반적인 방법을 나타낸 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리로부터 단리되지 않았음을 강조하기 위해 "인간 자가-항체"로도 불릴 수 있다.
단수 용어는 하나 이상의 그 대상체를 나타냄이 주지되어야 한다; 예를 들어 "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나"(또는 단수), "하나 이상," 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포괄하려는 것이며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의 사슬 또는 사슬들을 나타내며, 특정 길이의 산물을 나타내지는 않는다. 따라서 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신 또는 이와 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 또는 비천연 생성 아미노산에 의한 개질을 포함하는, 폴리펩티드의 발현 후 개질 산물을 나타내려는 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 원천으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학적 합성을 포함하는 임의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 또는 2,000 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것으로 불리며, 정의된 3차원 구조를 보유하지 않지만 다수의 상이한 입체형태를 채용할 수 있는 폴리펩티드는 폴딩되지 않은 것으로 불린다. 본원에서 이용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예로 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그 천연 환경에 있지 않은 폴리펩티드에 대한 것이다. 특정한 정제 수준은 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
또한 본 발명의 폴리펩티드로서 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의 조합이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드를 나타낼 때의 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 해당 천연 결합 분자, 항체, 또는 폴리펩티드의 적어도 일부 항원-결합 특성을 보유하는 임의의 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편에는 단백분해 단편뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 논의되는 특정 항체 단편에 부가하여 결실 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체에는 상술된 단편 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 변이체는 천연 생성되거나 천연 생성되지 않을 수 있다. 천연 생성되지 않은 변이체는 당분야에 공지된 돌연변이화 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 타우 특이적 결합 분자의 유도체, 예로 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가적인 특성을 나타내기 위해 변형된 폴리펩티드이다. 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 불릴 수 있다. 본원에서 이용되는 결합 분자 또는 이들의 단편, 항체, 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상체 폴리펩티드를 나타낸다. 또한 "유도체"로서 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 생성 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-히드록시라이신이 라이신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린이 세린에 대해 치환될 수 있고; 오르니틴이 라이신에 대해 치환될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수의 핵산 뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예로 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상적 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합(예로, 펩티드 핵산(PNA)에서 확인되는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예로 폴리뉴클레오티드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란 그 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA에 대한 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사체가 포함된다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성적으로 생산된 이러한 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자이거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성된 핵산 부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않아도 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 둘 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물로, 예로 단일 벡터 상에서, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물로, 예로 별도의(상이한) 벡터 상에서 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수도 있고, 또는 둘 이상의 코딩 영역을 포함할 수도 있다. 예로 단일 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 별도로 인코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역에는 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인이 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소가 포함될 수 있다. 작동 가능한 연관은 유전자 산물, 예로 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절 하에 유전자 산물의 발현을 두는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 경우이다. 두 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 그리고 두 DNA 단편 간 연결의 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동 가능하게 연관된" 또는 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 그 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 작동인자, 조절인자, 및 전사 종결 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연관되어 세포-특이적 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역이 본원에 개시된다.
다양한 전사 조절 영역이 당분야 숙련가에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께 최조기 프로모터), 시미안 바이러스 40(조기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 다른 전사 조절 영역에는 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가적인 적합한 전사 조절 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도 가능한 프로모터(예로, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)가 포함된다.
유사하게, 다양한 번역 조절 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 CITE 서열로도 불리는 IRES)가 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA)의 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가적인 코딩 영역과 연관될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비되는 단백질은 조면 소포체에 걸쳐 성장하는 단백질 사슬의 내보내기가 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이는 전체 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생산함을 인지한다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩티드, 예로 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동 가능하게 연관된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이들의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "장애" 및 "질환"은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 "결합 분자"는 일차적으로는 항체, 및 이들의 단편에 관련될 수 있지만, 또한 비제한적으로 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직적합 복합체(MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질(HSP)뿐만 아니라 세포-세포 접착 분자, 예컨대 카드헤린, 인테그린, C-유형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리의 구성원을 포함하여, 타우에 결합하는 다른 비-항체 분자도 나타낼 수 있다. 따라서 단지 명확성을 위해 그리고 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 대부분의 하기 구현예는 치료제 및 진단제 개발을 위한 결합 분자의 특정 구현예를 나타내는 항체 및 항체-유사 분자에 대해 논의된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 타우-결합 분자이다. 척추동물 시스템에서 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다; 예로 [Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참고하라.
아래에서 보다 상세히 논의될 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 광범위한 폴리펩티드 클래스를 포함한다. 당분야 숙련가는 중쇄가 이들 가운데 일부 서브클래스를 갖는(예로, γ1-γ4) 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류됨을 이해할 것이다. 이것이 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "클래스"를 결정하는 상기 사슬의 성질이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 분석되어 있고 기능적 특화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형 각각의 개질된 버전은 본 개시의 관점에서 당분야 숙련가가 쉽게 구별할 수 있고, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 클래스가 명확히 본 발명의 범위 내이며, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000달톤의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개 사슬은 전형적으로 "Y" 배치로 디설피드 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 지속되는 중쇄를 둘러싼다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄에 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 디설피드 결합 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배치의 포크형 말단에서 N-말단으로부터 각 사슬 저부에서 C-말단으로 간다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 구분된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 이용된다. 이에 관해, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례 상, 불변 영역 도메인의 번호 지정은 이들이 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단에서 멀어질 수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
전술된 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트가 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 상기 4차 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 VH 및 VL 사슬 각각에서 3개의 CDR에 의해 정의된다. 타우에 특이적으로 결합하기 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로불린 단편은 본원에서 상호 교환적으로 "결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로 표시된다.
천연 생성 항체에서, 항체는 각각의 항원-결합 도메인에 존재하며 때때로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 6개의 고가변 영역을 포함하고, 이는 항체가 수성 환경에서 3차원 구조를 취할 때 특이적으로 배치되어 항원-결합 도메인을 형성하는 짧고 인접하지 않은 아미노산 서열이다. "CDR"에는 더 적은 분자 간 가변성을 나타내는 4개의 상대적으로 보존된 "틀" 영역 또는 "FR"이 인접한다. 틀 영역은 대부분 β-시트 입체형태를 채용하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 틀 영역은 사슬 간 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR 배치를 제공하는 골격을 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상에서 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 상기 상보적 표면은 그 인지체 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 틀 영역을 포함하는 아미노산은 정확히 정의되었으므로, 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인될 수 있다; 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., 등, U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196(1987), 901-917]을 참고하라.
당분야 내에서 이용되고/되거나 승인되는 2 이상의 용어 정의가 존재하는 경우, 본원에서 이용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하려는 것이다. 구체예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 확인되는 비인접 항원 조합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 이용이다. 이러한 특정 영역은 본원에 참조로 도입된 [Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983) 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196(1987), 901-917]에 기재되며, 여기서 정의에는 서로 비교되는 경우 중첩되거나 하위세트의 아미노산 잔기가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 나타내는 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 이용되는 용어의 범위 내이다. 상기 언급된 참고문헌 각각에서 정의된 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기를 대조로서 표 1에 아래에 나타낸다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당분야 숙련가는 주어진 항체의 가변 영역 아미노산 서열에서 어느 잔기가 항체의 인간 IgG 하위유형의 특정 고가변 영역 또는 CDR을 포함하는지 일상적으로 결정할 수 있다.
표 1: CDR 정의1
Figure 112015069089787-pct00007
1표 1에서 모든 CDR 정의의 번호 지정은 Kabat 등에 나타낸 번호 지정 관례에 따른다(하기 참고).
Kabat 등은 또한 임의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 지정 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어선 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 대해 "Kabat 번호 지정"의 상기 시스템을 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본원에서 이용되는 "Kabat 번호 지정"은 [Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)]에 나타낸 번호 지정 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호 지정에 대한 언급은 Kabat 번호 지정 시스템에 따르지만, 이는 이론적인 것이 아니며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 하나의 구현예에서, 첫 번째 CDR의 위치에 따라 다음 CDR이 어느 방향으로든 이동될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 변이체, 또는 유도체에는 비제한적으로 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 쥐과화된 또는 키메라성 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예로 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv(scFv), 단일-사슬 항체, 디설피드 연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 항-개별특이형(항-Id) 항체(예로, 본원에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체)가 포함된다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있으며, 예로 US 특허 5,892,019에 기재된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의 유형(예로, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgM 또는 5가 구조를 갖는 이들의 유도체가 아니다. 특히 본 발명의 특정 용도, 특히 치료 용도에서, IgM은 이들의 5가 구조 및 친화도 성숙의 부재로 인해 IgM이 종종 특이적이지 않은 교차 반응성과 매우 낮은 친화도를 나타내므로, IgG 및 다른 2가 항체 또는 대응하는 결합 분자보다 덜 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체가 아니다, 즉 실질적으로 혈장 면역글로불린 표본에서 수득된 혼합물보다 하나의 특정 항체종으로 구성된다.
단일-사슬 항체를 포함하는 항체 단편은 단독으로 또는 하기의 전체 또는 일부와의 조합으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 본 발명에서는 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인과 가변 영역(들)의 임의 조합을 포함하는 타우-결합 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이들의 면역특이적 단편은 새 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원에서 유래될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아픽, 낙타, 라마, 말 또는 닭 항체이다. 다른 구현예에서, 가변 영역은 연골어류 기원일 수 있다(예로 상어 유래).
하나의 측면에서, 본 발명의 항체는 인간에서 단리된 인간 모노클로날 항체이다. 선택적으로, 인간 항체의 틀 영역은 데이터베이스에서 관련 인간 생식계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 채택된다; 예로, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅되는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참고하라. 예를 들어, 실제 생식계열 서열로부터 잠재적으로 일탈되는 것으로 간주된 아미노산은 클로닝 절차 동안 도입된 PCR 프라이머 서열 때문일 수 있다. 파지 디스플레이된 항체 라이브러리 또는 이종발생성 마우스로부터 인공적으로 생성된 인간-유사 항체, 예컨대 단일 사슬 항체 단편(scFv)에 비해, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 (i) 동물 대리물에 비해 인간 면역 반응을 이용하여 수득되는, 즉 항체가 인체에서의 그 관련 입체형태로 천연 타우에 반응하여 생성되었음을, (ii) 개인을 보호했거나 적어도 타우의 존재에 대해 유의미함을, 그리고 (iii) 항체가 인간 기원이므로 자가-항원에 대한 교차-반응성의 위험이 최소화됨을 특징으로 한다. 따라서 본 발명에 따르면, 용어 "인간 모노클로날 항체", "인간 모노클로날 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인, 즉 인간 세포, 예컨대 B 세포 또는 이들의 하이브리도마 또는 인간 세포, 예를 들어 인간 메모리 B 세포의 mRNA로부터 직접 클로닝된 cDNA로부터 단리된 타우 결합 분자를 나타내기 위해 이용된다. 인간 항체는 아미노산 치환이 항체에서, 예로 결합 특징을 개선하기 위해 제조된 경우라도 여전히 "인간"이다.
인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하기 및 예를 들어 US 특허 번호 5,939,598(Kucherlapati 등)에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자삽입되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 유래된 항체는 본 발명의 실제 인간 항체와 이들을 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.
예를 들어, 인간-유사 항체, 예컨대 전형적으로 파지 디스플레이로부터 단리된 합성 및 반-합성 항체의 중쇄 및 경쇄의 페어 형성은 원래 인간 B 세포에서 일어나는 것과 같은 원래 페어형성을 반드시 반영하지는 않는다. 따라서 선행 기술에서 일반적으로 이용되는 재조합 발현 라이브러리로부터 수득되는 Fab 및 scFv 단편은 면역원성과 안정성에 대한 모든 가능한 연관 효과와 더불어 인공적인 것으로 간주될 수 있다.
대조적으로, 본 발명은 선택된 인간 대상체로부터 단리된 친화도 성숙 항체를 제공하며, 이는 이들의 치료 유용성 및 이들의 인간에서의 관용성을 특징으로 한다.
본원에서 이용되는 용어 "쥐과화된 항체" 또는 "쥐과화된 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 이상의 CDR; 및 마우스 항체 서열에 기반하여 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 인간 틀 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "모계" 또는 "수신체"로 불리며 틀 변화를 제공하는 마우스 항체는 "공여체"로 불린다. 불변 영역이 존재해야 하는 것은 아니지만, 존재하는 경우 보통 마우스 항체 불변 영역과 실질적으로 동일하다, 즉 적어도 약 85-90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상 동일하다. 따라서 일부 구현예에서, 전장 쥐과화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 마우스 불변 영역, 인간 CDR 및 여러 "쥐과화" 아미노산 치환을 갖는 실질적 인간 틀을 함유한다. 전형적으로 "쥐과화된 항체"는 쥐과화된 가변 경쇄 및/또는 쥐과화된 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 쥐과화된 항체는, 예로 키메라성 항체의 전체 가변 영역이 마우스가 아니므로, 전형적인 키메라성 항체를 포괄하지 않을 것이다. "쥐과화" 절차에 의해 "쥐과화된" 개질된 항체는 CDR을 제공하는 모계 항체와 동일한 항원에 결합하며, 보통 모계 항체에 비해 마우스에서 면역원성이 더 적다.
본원에서 이용되는 용어 "중쇄 부분"에는 면역글로불린 중쇄에서 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지(예로, 상부, 중앙부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 변이체 단편. 예를 들어, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드에는 CH2 도메인의 적어도 일부(예로, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 없다. 위에 나타낸 바와 같이, 당업자는 이들 도메인(예로, 중쇄 부분)에서 천연 생성 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 다르도록 개질될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 개시된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 두 번째 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분과 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어 이중특이적 항체 또는 디아바디를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 단일 폴리펩티드 사슬, 예컨대 scFv로 이루어지며, 잠재적인 생체 내 치료 및 진단 적용을 위해 세포 내에서 발현된다(인트라바디).
본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서 그리고 부분적으로 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서 그리고 부분적으로 IgG4 분자에서 유래된 키메라성 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "경쇄 부분"에는 면역글로불린 경쇄에서 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 하나의 구현예에서, 경쇄 부분은 적어도 하나의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5 아미노산으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 적어도 7, 적어도 9, 또는 적어도 약 15 내지 약 30 아미노산을 함유할 수 있다. CDR은 그 3차 형태로 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산이 인접할 필요는 없으며, 일부 경우 심지어 동일한 펩티드 사슬 상에 있지 않아도 될 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 타우의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 약 5 내지 약 30, 약 10 내지 약 30 또는 약 15 내지 약 30 인접 또는 비-인접 아미노산 서열을 함유한다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"이란 일반적으로 결합 분자, 예로 항체가 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합에 항원-결합 도메인 및 에피토프 간 일부 상보성이 수반됨을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 이것에 해당 에피토프에 결합하는 경우, 무작위 미관련 에피토프에 결합하는 것보다 쉽게 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 것으로 불린다. 당분야 숙련가는 항체가 비인접 에피토프의 선형 부분에 해당하는 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하거나 이를 특이적으로 인식할 수 있음을 이해한다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정성평가하기 위해 본원에서 이용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"에 비해 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 가진 것보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항체와 항원과의 다른 결합 특징은 그 모든 문법적 형태로 항체의 특이성, 친화도, 교차-반응성, 및 다른 결합 특징을 나타낸다.
"선호적으로 결합하는"이란, 결합 분자, 예로 항체가 관련된, 유사한, 상동성 또는 유사성 에피토프에 결합하는 것에 비해 더 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "선호적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있더라도, 관련 에피토프에 비해 해당 에피토프에 더 잘 결합할 수 있을 것이다.
비제한적 예로서, 결합 분자, 예로 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적은 해리 상수(KD)로 상기 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 한 단위 더 적은 친화도로 상기 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 2 단위 더 적은 친화도로 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
다른 비제한적 예에서, 결합 분자, 예로 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적은 오프 속도(k(off))로 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 한 단위 적은 친화도로 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 두 단위 적은 친화도로 첫 번째 에피토프에 결합하는 경우, 첫 번째 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
결합 분자, 예로 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 x 10-2초-1, 10-2초-1, 5 x 10-3초-1 또는 10-3초-1 이하의 오프 속도(k(off))로 타우 또는 이들의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 5 x 10-4초-1, 10-4초-1, 5 x 10-5초-1 또는 10-5초-1, 5 x 10-6초-1, 10-6초-1, 5 x 10-7초-1 또는 10-7초-1 이하의 오프 속도(k(off))로 타우 또는 이들의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
결합 분자, 예로 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 103 M-1 초-1, 5 x 103 M-1 초-1, 104 M-1 초-1, 또는 5 x 104 M-1 초-1 이상의 온 속도(k(on))로 타우 또는 이들의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 105 M-1 초-1, 5 x 105 M-1 초-1, 106 M-1 초-1, 5 x 106 M-1 초-1 또는 107 M-1 초-1 이상의 온 속도(k(on))로 타우 또는 이들의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
결합 분자, 예로 항체는 이것이 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 해당 에피토프에 선호적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다고 불린다. 경쟁적 저해는 당분야에 공지된 임의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해하는 것으로 불릴 수 있다. 당분야 숙련가는 그 에피토프에 대한 항체의 결합이 또한 항체가 아닌 결합 분자에 의해 경쟁적으로 저해될 수도 있음을 이해한다. 예를 들어, 타우, 예로 h타우40에 대한 본원에 기재된 항체의 특이적 결합은 미세소관에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "친화도"는 결합 분자, 예로 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 나타낸다; 예로 [Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.(1988) at pages 27-28]을 참고하라. 본원에서 이용되는 용어 "결합력"은 면역글로불린 모집단 및 항원 간 복합체의 전반적 안정성, 즉 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 조합 강도를 나타낸다; 예로 [Harlow at pages 29-34]를 참고하라. 결합력은 모집단 내 개별 면역글로불린 분자와 특정 에피토프의 친화도, 그리고 또한 면역글로불린 및 항원의 가수에 모두 관련된다. 예를 들어, 고도 반복 에피토프 구조를 갖는 항원, 예컨대 중합체와 2가 모노클로날 항체 간 상호작용은 높은 결합력을 가질 것이다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어 [Berzofsky 등, "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y(1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y(1992)], 및 여기에 기재된 방법을 참고하라. 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하기 위한 일반 기법에는 ELISA, RIA, 및 표면 플라즈몬 공명이 포함된다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예로 염 농도, pH 하에 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예로 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액으로 수행된다.
본 발명의 결합 분자, 예로 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이들의 교차-반응성의 견지에서 기재되거나 명시될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체가 두 번째 항원과 반응하는 능력; 두 상이한 항원성 물질 간 관련성의 척도를 나타낸다. 따라서 항체는 이것이 그 형태를 유도한 것과 다른 에피토프에 결합하는 경우 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 에피토프를 유도하는 것과 동일한 여러 상보적 구조 특성을 함유하며, 일부 경우에는 원래보다 실제로 더 잘 피팅될 수 있다.
예를 들어, 특정 항체는 이들이 관련되지만 동일하지 않은 에피토프, 예로 기준 에피토프에 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도 교차-반응성을 갖는다. 항체는 이것이 기준 에피토프에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우 교차-반응성이 없거나 거의 없는 것으로 불릴 수 있다. 항체는 이것이 해당 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르소로그 또는 상동체에 결합하지 않는 경우, 특정 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 결합 분자, 예로 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 타우에 대한 이들의 결합 친화도의 견지에서 기재되거나 명시될 수 있다. 하나의 구현예에서, 결합 친화도에는 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
앞서 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 잘 알려져 있다. 본원에서 이용되는 용어 "VH 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되며, 용어 "CH1 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 첫 번째(가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본원에서 이용되는 용어 "CH2 도메인"에는, 예로 통상적 번호 지정 방식을 이용하여 항체의 잔기 약 244부터 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 부분이 포함된다(잔기 244 내지 360, Kabat 번호 지정 시스템; 및 잔기 231-340, EU 번호 지정 시스템; Kabat EA 등 op. cit 참고). CH2 도메인은 이것이 또 다른 도메인과 밀접하게 페어를 형성하지 않는다는 점에서 고유하다. 오히려 2개의 N-연결된 분기형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 또한 CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인으로부터 C-말단까지 연장되며 약 108 잔기를 포함하는 것이 잘 보고되어 있다.
본원에서 이용되는 용어 "힌지 영역"에는 CH1 도메인을 CH2 도메인으로 연결하는 중쇄 분자의 부분이 포함된다. 상기 힌지 영역은 약 25 잔기를 포함하며 가요성이고, 이에 따라 두 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 3개의 개별 도메인: 상부, 중앙부, 및 하부 힌지 도메인으로 하위 구분될 수 있다; [Roux 등, J. Immunol. 161(1998), 4083] 참고.
본원에서 이용되는 용어 "디설피드 결합"에는 두 황 원자 간에 형성된 공유 결합이 포함된다. 아미노산 시스테인은 두 번째 티올기와 디설피드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 생성 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디설피드 결합에 의해 연결되며 두 중쇄는 Kabat 번호 지정 시스템을 이용하여 239 및 242에 해당하는 위치에서 두 디설피드 결합에 의해 연결된다(위치 226 또는 229, EU 번호 지정 시스템).
본원에서 이용되는 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 교환적으로 이용된다. 이들 용어는 화학적 콘주게이션 또는 재조합 수단을 포함하는 여하한 수단에 의해 둘을 초과하는 요소 또는 성분의 공동 연결을 나타낸다. "틀-내 융합"은 원래 ORF의 정확한 번역 해독틀을 유지하는 방식으로 연속적이고 더 긴 ORF를 형성하기 위한 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 개방 해독틀(ORF) 연결을 나타낸다. 따라서 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 대응하는 둘 이상의 절편을 함유하는 단일 단백질이다(이 절편은 보통 자연에서는 이렇게 연결되지 않음). 따라서 해독틀이 융합 절편에 걸쳐 연속적으로 제조되지만, 절편은, 예를 들어 틀-내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 틀-내 융합될 수 있지만 "융합된" CDR이 연속적인 폴리펩티드의 일부로 함께 번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 틀 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 절차를 나타낸다. 이 절차에는 비제한적으로 유전자 녹다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현을 모두 포함하는 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의 표시가 포함된다. 여기에는 비제한적으로 유전자의 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 방해 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학 물질인 경우, 발현에는 해당 생화학 물질 및 임의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 이용되는 유전자 산물은 핵산, 예로 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물에는 전사 후 개질, 예로 폴리아데닐화를 갖는 핵산, 또는 번역 후 개질, 예로 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 연합, 단백분해 절단 등을 갖는 폴리펩티드가 추가로 포함된다.
본원에서 이용되는 용어 "표본"은 대상체 또는 환자에서 수득된 임의의 생물학적 물질을 나타낸다. 하나의 측면에서, 표본은 혈액, 뇌척수액("CSF"), 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 표본은 전혈, 혈장, 혈액 표본에서 농축된 B 세포, 및 배양된 세포(예로, 대상체로부터의 B 세포)를 포함할 수 있다. 표본에는 또한 신경 조직을 포함하는 생검 또는 조직 표본이 포함될 수 있다. 또 다른 측면에서, 표본은 전체 세포 및/또는 세포의 용해액을 포함할 수 있다. 혈액 표본은 당분야에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다. 하나의 측면에서, 펠렛은 200㎕ 완충액(20mM Tris, pH 7.5, 0.5% Nonidet, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.1M NaCl, 1X Sigma 프로테아제 저해제, 및 1X Sigma 포스파타아제 저해제 1 및 2) 중 4℃에서 볼텍싱하여 재현탁될 수 있다. 현탁액은 간헐적인 볼텍싱으로 20분 동안 얼음 상에 유지될 수 있다. 약 4℃에서 5분 동안 15,000 x g에서의 회전 후, 상청액 분취물은 약 -70℃에서 저장될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애, 에컨대 파킨슨병의 발생을 예방하거나 완화시키는(경감시키는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상적 결과에는 비제한적으로 검출 가능하건 검출 불가능하건 간에 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 완화 또는 억제 및 경감(부분적이건 전체적이건 간에)이 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비해 생존의 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 이미 상태 또는 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 상태 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 상태 또는 장애의 표시가 예방되어야 하는 자들이 포함된다.
"대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대해 진단, 예후, 예방 또는 치료법을 원하는 임의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예로 인간 환자를 의미한다.
II. 항체
본 발명은 일반적으로 인간 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 실시예에 예시된 항체에 대해 개요된 바와 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 타우에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체는 건강한 인간 대상체 풀로부터 클로닝되었다.
본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 타우 특이적 항체를 클로닝하려는 초기 시도는 실패하였고, 거의 항상 위양성 클론을 생성하였다. 이러한 문제를 피하고자, 인간 메모리 B 세포 배양의 컨디셔닝된 배지 중 항체를 재조합 타우 단백질, AD 뇌로부터 추출된 PHF타우, 건강한 대조군 뇌 추출물 및 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 결합과 병렬적으로 스크리닝하였다. 재조합 타우 및/또는 PHF타우에 대해 양성이지만 대조군 뇌 추출물 또는 BSA에는 양성이 아닌 B-세포 배양만 항체 클로닝의 대상이 되었다.
특이적 항체를 단리하기 위한 초기 시도는 순환하는 타우 항체 혈장의 상승된 수준을 시사하는 타우에 대해 높은 혈장 결합 활성을 갖는 건강한 인간 대상체 풀에 초점을 맞추었다. 예측하지 못하게도, 이들 시도는 타우 특이적 인간 메모리 B 세포를 생산하는데 실패하였고, 본 발명에 기재된 항체는 높은 타우 혈장 반응성에 대해 사전 선택되지 않았거나 타우에 대해 낮은 혈장 반응성을 가진 건강한 인간 대상체 풀로부터 단리되었다.
이러한 조치로 인해, 몇몇 항체가 단리될 수 있었다. 선택된 항체를 클래스 및 경쇄 서브클래스 결정을 위해 추가 분석하였다. 이어서 메모리 B 세포 배양으로부터의 선택된 관련 항체 메시지가 RT-PCR에 의해 전사되고, 클로닝되고, 재조합 생산을 위해 발현 벡터 내로 조합된다; 첨부된 실시예를 참고하라. HEK293 또는 CHO 세포에서 인간 항체의 재조합 발현 및 웨스턴 블롯 상에서 전장 타우, 이들의 병리적으로 개질된 형태에 대한 이들의 결합 특이성 및 병리적으로 응집된 타우에 대한 이들의 독특한 결합의 후속 분석으로 타우에 대해 고도로 특이적이며 타우 단백질의 병리적으로 개질된 형태를 구별되게 인식하는 인간 항체를 최초로 클로닝하였음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 일반적으로 단리된 천연 생성 인간 모노클로날 항-타우 항체 및 이들의 결합 단편, 유도체 및 변이체에 대한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 항체는 웨스턴 블롯 상의 변성 조건 하에 AD 뇌로부터 단리된 전장 재조합 타우 및/또는 병리적으로 응집되고/되거나 인산화된 형태(PHF타우)에 특이적으로 결합할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 항-타우 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것으로, 여기서 항체는 NI-105.17C1, NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 또는 NI-105.9C4로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 타우 에피토프에 특이적으로 결합한다.
추가적인 인간 항-타우 항체는 그 내용의 전문이 본원에 참조로 도입되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0087861에 개시된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 타우에 특이적으로 결합한다: h타우40(서열 목록 번호 6)의 잔기 125-131, 397-441, 226-244, 217-227, 37-55, 387-406, 421-427, 427-439, 1-158, 197-207, 57-67, 355-441, 313-319, 309-319, 및 221-231에 해당하는 잔기. 추가 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 h타우40(서열 목록 번호 6)의 잔기 37-55 및 387-406에 해당하는 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 타우에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 타우는 h타우40(서열 목록 번호 6)이다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 타우의 미세소관 결합 도메인을 포함하는 에피토프에서 타우에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 도 4에 도시된 타우의 R4 영역으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 타우에 결합한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 타우로의 특이적 결합에 대해 미세소관과 경쟁한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 미세소관에 연관되지 않은 타우에 대한 항체 결합 친화도에 비해 미세소관 연관된 타우에 대해 감소된 결합 친화도를 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 미세소관에 연관된 타우에 결합하지 않거나 또는 실질적으로 결합하지 않는다. 특이적 구현예에서, 타우 단백질은 천연 타우 단백질 또는 재조합 타우 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 타우는 h타우40이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 인간 항-타우 항체는 병리적으로 응집된 타우에 특이적으로 결합할 수 있으며 뇌 조직 중 생리적 형태의 타우에는 실질적으로 결합할 수 없다. 또한, 본 발명의 인간 항-타우 항체는 뇌 내 신경섬유 매듭(NFT), 호중구 맥 및/또는 비정상조직 신경돌기에서 매듭-전 단계에 타우를 인식하는 능력을 추가 특징으로 할 수 있다. 그러므로 본 발명은 결합 특이성을 갖는 인간 타우 항체 세트를 제공하며, 이에 따라 진단 및 치료 목적을 위해 특히 유용하다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-타우 항체는 특히 실시예 4 및 18에 따라 분석되는 경우, 생리적 형태에 비해 병리적으로 응집된 타우를 선호적으로 인식한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-타우 항체는 특히 실시예 4에 기재된 인간 타우의 질환 유도 돌연변이체에 결합한다. 상기 맥락에서, 결합 특이성은 야생형 타우에 있어서 약 100pM 내지 100nM의 절반 최대 유효 농도(EC50), 또는 약 100pM 내지 10nM의 EC50를 갖는 범위일 수 있다.
따라서 본 발명의 항-타우 항체는 실시예 4 및 18에 기재된 면역조직화학 염색으로 예시되는 바와 같이 뇌에서 타우의 병리적으로 개질된 형태, 예로 타우의 병리적 응집물에 선호적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 웨스턴 블롯에 의해 실시예 2에서 예시된 바와 같이 재조합 타우 및 병리적으로 개질된 형태의 타우에 모두 선호적으로 결합한다.
본 발명은 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 NI-105.17C1, NI-105.17C1(N31Q), NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 및 NI-105.9C4로 구성된 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 몇몇 상기 결합 분자, 예로 항체 및 결합 이들의 단편을 추가로 예시하며, 이는 이들의 가변 영역, 예로 결합 도메인에 도 7에 도시된 아미노산 서열의 임의 하나를 포함하는 VH 및/또는 VL 가변 영역의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 확인된 가변 영역을 인코딩하는 해당 뉴클레오티드 서열을 하기 표 4에 나타낸다. VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열의 CDR의 예시적 세트는 도 7에 도시된 바와 같다. 그러나 하기에 논의된 바와 같이, 당분야 숙련가는 부가적으로 또는 대안적으로 도 7에 나타낸 것들로부터 이들의 아미노산 서열이 CDR2 및 CDR3의 경우 1, 2, 3 또는 심지어 더 많은 아미노산 서열만큼 상이한 CDR이 이용될 수 있다는 점을 잘 인지한다.
표 2. 타우 특이적 항체의 VH 영역, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR2, VL 영역, VL CDR2, VL CDR2, 및 VL CDR3의 아미노산 서열.
Figure 112015069089787-pct00008
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79-168 및 224로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79-168 및 224로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 각각 서열 목록 번호 79-84, 85-90, 91-96, 97-102, 103-108, 109-114, 115-120, 121-126, 127-132, 133-138, 139-144, 145-150, 151-156, 157-162, 또는 163-168의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 각각 서열 목록 번호 79, 80, 81, 224, 83, 및 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79-81, 85-87, 91-93, 97-99, 103-105, 109-111, 115-117, 121-123, 127-129, 133-135, 139-141, 145-147, 151-153, 157-159, 및 163-165로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 1, 2 또는 3개의 VH CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 각각 서열 목록 번호 79-81, 85-87, 91-93, 97-99, 103-105, 109-111, 115-117, 121-123, 127-129, 133-135, 139-141, 145-147, 151-153, 157-159, 또는 163-165의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 82-84, 88-90, 94-96, 100-102, 106-108, 112-114, 118-120, 124-126, 130-132, 136-138, 142-144, 148-150, 154-156, 160-162, 166-168, 및 224로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 1, 2 또는 3개의 VL CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 각각 서열 목록 번호 82-84, 88-90, 94-96, 100-102, 106-108, 112-114, 118-120, 124-126, 130-132, 136-138, 142-144, 148-150, 154-156, 160-162, 또는 166-168의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 하나의 구현예에서, 각각 서열 목록 번호 83, 84, 및 224의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163의 VH CDR1; 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164의 VH CDR2; 또는 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 항체는 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166 또는 224의 VL CDR1; 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167의 VL CDR2; 또는 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163의 VH CDR1; 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164의 VH CDR2; 또는 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224의 VL CDR1; 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167의 VL CDR2; 또는 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163의 VH CDR1; 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164의 VH CDR2; 및 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 항체는 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224의 VL CDR1; 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167의 VL CDR2; 및 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163의 VH CDR1; 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164의 VH CDR2; 및 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224의 VL CDR1; 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167의 VL CDR2; 및 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79의 VH CDR1, 서열 목록 번호 80의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 81의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 82의 VL CDR1, 서열 목록 번호 83의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 84의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 79의 VH CDR1, 서열 목록 번호 80의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 81의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 224의 VL CDR1, 서열 목록 번호 83의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 84의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 85의 VH CDR1, 서열 목록 번호 86의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 87의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 88의 VL CDR1, 서열 목록 번호 89의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 90의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 91의 VH CDR1, 서열 목록 번호 92의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 93의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 94의 VL CDR1, 서열 목록 번호 95의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 96의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 97의 VH CDR1, 서열 목록 번호 98의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 99의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 100의 VL CDR1, 서열 목록 번호 101의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 102의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 103의 VH CDR1, 서열 목록 번호 104의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 105의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 106의 VL CDR1, 서열 목록 번호 107의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 108의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 109의 VH CDR1, 서열 목록 번호 110의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 111의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 112의 VL CDR1, 서열 목록 번호 113의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 114의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 115의 VH CDR1, 서열 목록 번호 116의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 117의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 118의 VL CDR1, 서열 목록 번호 119의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 120의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 121의 VH CDR1, 서열 목록 번호 122의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 123의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 124의 VL CDR1, 서열 목록 번호 125의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 126의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 127의 VH CDR1, 서열 목록 번호 128의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 129의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 130의 VL CDR1, 서열 목록 번호 131의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 132의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 133의 VH CDR1, 서열 목록 번호 134의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 135의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 136의 VL CDR1, 서열 목록 번호 137의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 138의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 139의 VH CDR1, 서열 목록 번호 140의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 141의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 142의 VL CDR1, 서열 목록 번호 143의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 144의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 145의 VH CDR1, 서열 목록 번호 146의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 147의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 148의 VL CDR1, 서열 목록 번호 149의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 150의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 151의 VH CDR1, 서열 목록 번호 152의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 153의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 154의 VL CDR1, 서열 목록 번호 155의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 156의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 157의 VH CDR1, 서열 목록 번호 158의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 159의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 160의 VL CDR1, 서열 목록 번호 161의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 162의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 163의 VH CDR1, 서열 목록 번호 164의 VH CDR2, 및 서열 목록 번호 165의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 서열 목록 번호 166의 VL CDR1, 서열 목록 번호 167의 VL CDR2, 및 서열 목록 번호 168의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 7 및 표 3에 도시된 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 임의 하나이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 B-세포에 존재하는 바와 같은 중쇄 및 경쇄의 인지체 페어 형성의 보존을 특징으로 한다.
표 3: 타우 특이적 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열. BG - 생식세포 이전
Figure 112015069089787-pct00009
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 44, 45, 47, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 및 220으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 및 222로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 목록 번호 44, 45, 47, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 및 220로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 및 222로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열 목록 번호 45의 VH 및 서열 목록 번호 46의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 45의 VH 및 서열 목록 번호 221의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 45의 VH 및 서열 목록 번호 222의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 48의 VH 및 서열 목록 번호 49의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 50의 VH 및 서열 목록 번호 51의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 52의 VH 및 서열 목록 번호 53의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 54의 VH 및 서열 목록 번호 55의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 220의 VH 및 서열 목록 번호 55의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 56의 VH 및 서열 목록 번호 57의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 58의 VH 및 서열 목록 번호 59의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 60의 VH 및 서열 목록 번호 61의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 62의 VH 및 서열 목록 번호 64의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 65의 VH 및 서열 목록 번호 66의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 67의 VH 및 서열 목록 번호 68의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 69의 VH 및 서열 목록 번호 70의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 71의 VH 및 서열 목록 번호 72의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 73의 VH 및 서열 목록 번호 74의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 76의 VH 및 서열 목록 번호 78의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 44의 VH 및 서열 목록 번호 46의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 47의 VH 및 서열 목록 번호 49의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 62의 VH 및 서열 목록 번호 63의 VL을 포함하거나; 서열 목록 번호 75의 VH 및 서열 목록 번호 77의 VL을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 타우, 예컨대 h타우40으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 유도체 또는 변이체이며, 적어도 하나의 항체는 도 7 및 표 3에 도시된 VH 및/또는 VL 영역을 갖는다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 NI-105.17C1, NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 또는 NI-105.9C4와 h타우40으로의 특이적 결합에 대해 경쟁한다. 이들 항체는 특히 치료 적용을 위해 역시 인간 항체일 수 있다. 대안적으로, 항체는 쥐과, 쥐과화된 및 키메라성 쥐과-인간 항체이며, 이는 동물에서의 진단 방법과 연구에 특히 유용하다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 배양된 단일 또는 올리고클로날 B-세포의 배양에 의해 제공되며, 상기 B-세포에 의해 생산되는 항체를 함유하는 배양 상청액이 내부의 항-타우 항체의 존재 및 친화도에 대해 스크리닝된다. 스크리닝 절차는, 예컨대 그 개시 내용이 본원에 참조로 도입되는 국제 출원 WO2004/095031에 기재된 바와 같은 감수성 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석; 뇌 섹션 상에서 PHF타우로의 결합에 대한 스크리닝; 서열 목록 번호 6으로 나타내며 상기 서열의 아미노산 Ser-202 및 Thr-205; 아미노산 Thr-231; 및/또는 아미노산 Ser-396 및 Ser-404 상의 포스페이트기를 갖는 아미노산 서열의 타우로부터 유래된 펩티드의 결합에 대한 스크리닝; 서열 목록 번호 6으로 나타내는 아미노산 서열의 재조합 인간 타우의 결합에 대한 스크리닝 및 결합이 검출되는 항체 또는 상기 항체를 생산하는 세포의 단리 단계를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이 인간 면역 반응 시의 그 생성으로 인해, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 특히 병리적 관련성을 가지며, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 생성을 위한 면역화 절차 및 파지 디스플레이 라이브러리의 시험관 내 스크리닝 각각에서 접근 불가능하거나 덜 면역원성일 수 있는 에피토프를 인식할 것이다. 따라서 본 발명의 인간 항-타우 항체의 에피토프가 고유하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합할 수 있는 다른 항체는 존재하지 않는다고 규정하는 것이 신중하다. 그러므로 본 발명은 또한 일반적으로 타우로의 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 항-타우 항체 및 타우 결합 분자로 연장된다. 본 발명은 보다 구체적으로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이며, 여기서 항체는 NI-105.17C1, NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 및 NI-105.9C4로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 타우 에피토프에 특이적으로 결합한다.
항체 간 경쟁은 평가 하의 면역글로불린이 공통 항원, 예컨대 타우에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, 하기와 같은 여러 유형의 경쟁적 결합 분석이 알려져 있다: 고상 직접 또는 간접 방사선면역분석(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석[Stahli 등, Methods in Enzymology 9(1983), 242-253] 참고; 고상 직접 바이오틴-애비딘 EIA[Kirkland et a, J. Immunol. 137(1986), 3614-3619 및 Cheung 등, Virology 176(1990), 546-552] 참고; 고상 직접 표지 분석, 고상 직접 표지 샌드위치 분석[Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1988)] 참고; I125 표지를 이용한 고상 직접 표지 RIA[Morel 등, Molec. Immunol. 25(1988), 7-15 및 Moldenhauer 등, Scand. J. Immunol. 32(1990), 77-82] 참고. 전형적으로 이러한 분석에는 고형 표면에 결합된 정제된 타우 또는 이들의 응집물 또는 이를 보유하는 세포, 표지되지 않은 평가 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린, 즉 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 이용이 관여된다. 경쟁적 저해는 평가 면역글로불린의 존재 하에 고형 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정된다. 보통 평가 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 하나의 구현예에서, 경쟁적 결합 분석은 첨부된 실시예에서 ELISA 분석에 기재된 조건 하에 수행된다. 경쟁 분석(경쟁 항체)에 의해 확인되는 항체에는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 기준 항체가 결합된 에피토프에 입체 장애가 일어나도록 충분히 인접한 근접 에피토프에 대한 결합하는 항체가 포함된다. 보통 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50% 또는 75% 저해할 것이다. 그러므로 본 발명은 추가로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이며, 여기서 항체는 타우에 대한 결합으로부터 NI-105.17C1, NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 또는 NI-105.9C4로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체를 경쟁적으로 저해한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 하나 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 2개는 본원에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 7에 나타낸 그룹에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 7은 Kabat 시스템에 의해 정의되는 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예로 Chothia 시스템에 의해 정의되는 VH-CDR도 본 발명에 포함되고, 도 7에 나타낸 데이터를 이용해서 당업자가 쉽게 확인할 수 있다. 하나의 구현예에서, 기준 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이고; 기준 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; 기준 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 도 7에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이고; VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 임의 하나의 VH-CDR 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고는 도 7에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 하나의 구현예에서, VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이고; VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 2개는 본원에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 대안적으로 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 7에 나타낸 폴리펩티드에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 7은 Kabat 시스템에 의해 정의되는 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예로 Chothia 시스템에 의해 정의되는 VL-CDR도 본 발명에 포함된다. 하나의 구현예에서, 기준 VL-CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224이고; 기준 VL-CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; 기준 VL-CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 도 7에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224이고; VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 임의 하나의 VL-CDR에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고는 도 7에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 하나의 구현예에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224이며; VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 도 7 및 표 3에 나타낸 기준 중쇄 가변 영역과 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 기준 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 44, 45, 47, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 또는 220을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고 도 7 및 표 3에 나타낸 기준 중쇄 가변 영역(VH)과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 하나의 구현예에서, 기준 중쇄 가변 영역 서열의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 44, 45, 47, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 또는 220을 포함한다.
하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 7 및 표 3에 나타낸 경쇄 가변 영역에 관련된 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 기준 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 또는 222를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 도 7 및 표 3에 나타낸 기준 경쇄 가변 영역과 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 기준 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 또는 222를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 도 7 및 표 3에 나타낸 기준 경쇄 가변 영역(VL)과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 하나의 구현예에서, 기준 경쇄 가변 영역 서열의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 또는 222를 포함한다.
면역글로불린 또는 그 인코딩 cDNA는 추가 개질될 수 있다. 따라서 추가 구현예에서, 본 발명의 방법은 키메라성 항체, 쥐과화된 항체, 단일-사슬 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 임의 하나의 유사체의 생산 단계(들)의 임의 하나를 포함한다. 해당 방법은 당분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예로 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor(1988)]에 기재되어 있다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIAcore 시스템에 채용되는 표면 플라즈몬 공명을 이용해서 본원에 기재된 항체 중 임의 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Method 183(1995), 7-13). 키메라성 항체의 생산은, 예를 들어 국제 출원 WO89/09622에 기재되어 있다. 인간화된 항체의 생산 방법은, 예로 유럽 출원 EP-A1 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 이용될 항체의 추가 원천은 소위 이종발생성 항체이다. 이종발생성 항체, 예컨대 마우스에서의 인간-유사 항체의 생산을 위한 일반 원칙은, 예로 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO 96/33735에 기재되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일 사슬을 포함하는 완전 항체 이외의 다양한 형태로 존재할 수 있다; 예로 국제 출원 WO88/09344를 참고하라.
본 발명의 항체 또는 이들의 대응하는 면역글로불린 사슬(들)은 당분야에 공지된 통상적 기법을 이용하여, 예를 들어 단독으로 또는 조합하여 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 당분야에 공지된 임의의 다른 개질(들)을 이용함으로써 추가 개질될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 기본이 되는 DNA 서열 내의 이러한 개질의 도입 방법은 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다; 예로 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1994)]을 참고하라. 본 발명의 항체의 개질에는 아세틸화, 히드록실화, 메틸화, 아미드화, 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조인자 등의 부착을 포함하는 측쇄 개질, 골격 개질, 그리고 N-및 C-말단 개질을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화가 포함된다. 마찬가지로, 본 발명은 아미노 말단 이종성 분자, 면역자극 리간드의 예컨대 카르복실 말단에 융합된 기재된 항체 또는 이들의 일부 단편을 포함하는 키메라성 단백질의 생산을 포괄한다; 예로, 해당 기술의 상세 내용에 대해서는 국제 출원 WO00/30680을 참고하라.
추가적으로 본 발명은 상술된 결합 분자를 함유하는, 예를 들어 상기 언급된 항체 중 임의 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄 CDR3(HCDR3)이 항원-항체 상호작용에 주로 참여하고 더 큰 정도의 가변성을 갖는 영역으로 빈번하게 관찰되었으므로 중쇄의 CDR3을 함유하는 것들을 포함하는 펩티드를 포괄한다. 이러한 펩티드는 본 발명에 따라 유용한 결합제를 생산하기 위한 재조합 수단에 의해 쉽게 합성되거나 생산될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 펩티드는, 예를 들어 시판되는 자동화 펩티드 합성장치를 이용해서 합성될 수 있다. 펩티드는 또한 펩티드를 발현하는 DNA를 발현 벡터 내로 도입하고 세포를 발현 벡터로 형질전환하여 펩티드를 생산하는 재조합 기법에 의해서도 생산될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 인간 항-타우 항체에 대해 배향되고 언급된 특성, 즉 타우를 특이적으로 인식하는 특성을 나타내는 임의 결합 분자, 예로 항체 또는 이들의 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항체 및 결합 분자는 본원에 기재된 ELISA 및 웨스턴 블롯 그리고 면역조직화학에 의해 이들의 결합 특이성 및 친화도에 대해 평가될 수 있으며, 예로 실시예를 참고하라. 또한, 본 발명에 따라 수행된 후속 실험의 예비 결과는 하나의 구현예에서 본 발명의 인간 항-타우 항체가 알츠하이머 질환(AD)을 또한 겪는 환자의 인간 뇌 구획 상에 존재하는 신경섬유 매듭(NFT), 신경망 맥과 유사한 병리적으로 응집된 타우에 주로 결합함을 드러내었다. 따라서 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간 항체 또는 이들의 결합 단편, 유도체 또는 변이체는 인간 AD 뇌 구획 상에서 타우를 인식한다.
불멸화된 B 세포 또는 B 메모리 세포의 배양에서 직접 면역글로불린을 수득하는 대안으로서, 불멸화된 세포가 후속 발현 및/또는 유전자 조작을 위해 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자위의 원천으로 이용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 원하는 경우, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형의 것으로 교환되거나 모두 함께 제거될 수 있다. 가변 영역이 연결되어 단일 사슬 Fv 영역을 인코딩할 수 있다. 다중 Fv 영역이 연결되어 하나를 초과하는 표적에 대한 결합능을 부여할 수도 있고 또는 키메라성 중쇄 및 경쇄 조합이 채용될 수도 있다. 유전 재료를 이용 가능한 경우, 원하는 표적에 결합하는 이들의 능력을 모두 보유하는 전술된 유사체의 설계는 간단하다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성 방법은 당분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들어 [Gilliland 등, Tissue Antigens 47(1996), 1-20; Doenecke 등, Leukemia 11(1997), 1787-1792]에 기재되어 있다.
일단 적절한 유전 재료가 수득되고 원하는 경우 유사체를 인코딩하기 위해 개질되면, 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 것들을 포함하는 코딩 서열이 표준 재조합 숙주 세포 내로 전달감염될 수 있는 벡터 상에 함유된 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 다양한 상기 숙주 세포가 이용될 수 있다; 그러나 효율적인 절차 수행을 위해, 포유류 세포가 고려될 수 있다. 상기 목적을 위해 전형적인 포유류 세포주에는 비제한적으로 CHO 세포, HEK 293 세포, 또는 NSO 세포가 포함된다.
이어서 항체 또는 유사체의 생산이 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현에 적절한 배양 조건 하에 개질된 재조합 숙주를 배양함으로써 수행된다. 그 뒤 항체는 배양물로부터 이들을 단리하여 회수된다. 발현 시스템은 생성 항체가 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드를 포함하여 설계된다; 그러나 세포 내 생산도 가능하다.
상기 내용에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 균등 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 상술된 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 인코딩한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
당분야 숙련가는 상술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 원하는 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다른 폴리펩티드 또는 항체의 구축을 위해 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 또한 상술된 가변 도메인의 적어도 하나의 CDR을 포함하며 유리하게는 첨부된 실시예에 기재된 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 폴리펩티드 및 항체를 포괄한다. 당분야 숙련가는 부분적으로 Kabat에 의해 정의된 CDR과 중첩되는 CDR 내에 또는 고가변 루프 내에 아미노산 치환을 수행함으로써(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(1987), 901-917) 결합 친화도가 증강될 수 있음을 안다; 예로 [Riechmann, 등, Nature 332(1988), 323-327]을 참고하라. 따라서 본 발명은 또한 하나 이상의 언급된 CDR이 하나 이상, 또는 둘 이하의 아미노산 치환을 포함하는 항체에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 그 면역글로불린 사슬의 하나 또는 둘 다에 도 1에 나타낸 가변 영역의 2 또는 모든 3개의 CDR을 포함한다.
결합 분자, 예로 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 당업자가 인지하는 바와 같이, 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 불변 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화할 수 있다. 보체의 활성화는 옵소닌화 및 세포 병원체의 용해에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하며, 또한 자가면역 과민성에 관여될 수 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통해 다양한 세포 상에서 수용체에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하는 상이한 항체 클래스에 특이적인 여러 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존적 세포-매개 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증성 매개자의 방출, 태반 전달 및 면역글로불린 생산의 조절을 포함하는 여러 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다.
따라서 본 발명의 특정 구현예에는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 포함되며, 여기서 하나 이상의 불변 영역 도메인의 적어도 한 분획은 원하는 생화학적 특징, 예컨대 효과기 기능 감소, 비공유적으로 이량체화하는 능력, 타우 응집 및 침적 부위에 편재되는 능력 증가, 혈청 반감기 감소, 또는 대략 동일한 면역원성의 변형되지 않은 전체 항체에 비한 혈청 반감기 증가를 제공하기 위해 결실되거나 다르게 변형되었다. 예를 들어, 본원에 기재된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하지만, 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 한 부분이 없는 도메인 결실 항체이다. 예를 들어 특정 항체에서, 개질된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이다, 예를 들어 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 불변 영역, 예로 IgG 중쇄 불변 영역을 가지며, 이는 본원의 다른 곳에서 비글리코실화 또는 "agly" 항체로 불리는 글리코실화를 제거하도록 변형된다. 이러한 "agly" 항체는 효소적으로 뿐만 아니라 불변 영역에서 공통 글리코실화 부위(들)를 조작함으로써 제조될 수 있다. 이론에 구애되지 않고, "agly" 항체는 생체 내에서 개선된 안전성 및 안정성 프로필을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 원하는 효과기 기능을 갖는 비글리코실화 항체의 생산 방법은, 예를 들어 그 전문이 참조로 도입되는 국제 출원 WO2005/018572에서 확인된다.
본원에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, Fc 부분은 당분야에 공지된 기법을 이용해서 효과기 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 순환하는 개질 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜서 타우 편재를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 영역 개질이 보체 결합을 완화시키고, 이에 따라 혈청 반감기 및 콘주게이트된 세포독소의 비특이적 연합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 개질이 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인해 증강된 편재를 허용하는 디설피드 결합 또는 올리고당 모이어티를 개질하기 위해 이용될 수 있다. 생성되는 개질의 생리적 프로필, 생체이용률 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 타우 편재, 생체분포 및 혈청 반감기는 부당한 실험 없이 널리 알려진 면역학적 기법을 이용해서 쉽게 측정되고 정량될 수 있다.
본원에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, Fc 부분은 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환되어, 예로서 Fcγ 수용체, LRP, 또는 Thy1 수용체를 통해 또는 항체가 살아있는 세포에 해를 가하지 않고 이동할 수 있도록 한다고 언급되는 'SuperAntibody 기술'에 의해 항체의 수용체-매개 세포내 섭취를 증강시킴으로써 항체의 세포 섭취를 증가시킬 수 있다(Expert Opin. Biol. Ther.(2005), 237-241). 예를 들어, 타우뿐만 아니라 세포 표면 수용체에 결합하는 특이적 서열을 갖는 이중- 또는 다중-특이적 항체 또는 세포 표면 수용체의 인지체 단백질 리간드 및 항체 결합 영역의 융합 단백질의 생성은 당분야에 공지된 기법을 이용해서 조작될 수 있다.
본원에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, Fc 부분은 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환될 수도 있고, 또는 항체는 화학적으로 개질되어 그 혈액 뇌 장벽 투과를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 개질된 형태는 당분야에 공지된 기법을 이용해서 전체 전구체 또는 모계 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기법이 본원에서 보다 상세히 논의된다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 당분야에 공지된 기법을 이용해서 제조되거나 제작될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 분자 또는 이들의 단편은 "재조합적으로 생산된다", 즉 재조합 DNA 기법을 이용해서 생산된다. 항체 분자 또는 이들의 단편의 제조를 위한 예시적 기법이 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 논의된다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에는 또한, 예로 항체가 그 인지체 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 공유 부착이 방지하지 않도록 항체에 대한 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 개질되는 유도체가 포함된다. 예를 들어 그러나 비제한적으로, 항체 유도체에는 예로 글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 개질된 항체가 포함된다. 임의의 여러 화학적 개질이 비제한적으로 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료받을 동물, 예로 인간에서 해로운 면역 반응을 야기하지 않을 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 예로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편은 환자, 예로 인간 환자로부터 유래되며, 이후 이들이 유래되는 동일한 종, 예로 인간에서 이용되어 해로운 면역 반응의 발생을 완화시키거나 최소화한다.
또한 탈면역화가 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "탈면역화"에는 T 세포 에피토프를 개질하기 위한 항체의 변형이 포함된다; 예로 국제 출원 W098/52976 및 WO00/34317을 참고하라. 예를 들어, 시작 항체로부터의 VH 및 VL 서열이 분석되며, 각각의 V 영역으로부터의 인간 T 세포 에피토프 "지도"가 서열 내에서 상보성 결정 영역(CDR) 및 다른 주요 잔기에 대해 에피토프의 위치를 나타낸다. T 세포 에피토프 지도로부터의 개별 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성을 변형하는 위험이 낮은 대안적 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 일정 범위의 대안적인 VH 및 VL 서열이 설계되며, 이들 서열은 이후 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서의 이용을 위해 일정 범위의 결합 폴리펩티드, 예로 타우-특이적 항체 또는 이들의 면역특이적 단편 내로 도입된 후 기능에 대해 평가된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되고 평가된다. 이어서 개질된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 전체 중쇄 및 경쇄 유전자가 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이후 플라스미드가 전체 항체의 생산을 위해 세포주 내로 도입된다. 이어서 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 분석에서 비교되고, 최적 변이체가 확인된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 이용을 포함하여 당분야에 공지된 광범위한 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당분야에 공지되고, 예를 들어 [Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.(1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681(1981)]에서 교시된 것들을 포함하는 하이브리도마 기법을 이용해서 생산될 수 있으며, 상기 참고문헌은 이들의 전문이 참조로 도입된다. 본원에서 이용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하여 단일 클론에서 유도되는 항체를 나타내지, 이것이 생산되는 방법을 나타내지는 않는다. 따라서 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 엡스타인-바 바이러스의 형질전환을 통해 불멸화된 인간 B 세포로부터 유도된다.
널리 공지된 하이브리도마 절차(Kohler 등, Nature 256(1975), 495)에서, 포유류로부터의 상대적으로 짧게 살거나 유한한 림프구, 예로 본원에 기재된 인간 대상체로부터 유도된 B 세포는 불멸 종양 세포주(예로 골수종 세포주)와 융합되고, 이에 따라 불멸이며 B 세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생산한다. 생성 하이브리드는 단일 항체의 형성을 위한 특이적 유전자를 포함하는 각각의 개별 계통의 선택, 희석 및 재성장에 의해 단일 유전 계통으로 분리된다. 이들은 원하는 항원에 대해 그리고 이들의 순수한 유전적 혈통에 대해 동질성인 항체를 생산하며, "모노클로날"로 불린다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 성분을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 키운다. 당분야 숙련가는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 여러 공급원에서 시판되며, 표준화된 프로토콜이 잘 구축되어 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 자라는 배양 배지는 원하는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 시험관 내 분석, 예컨대 본원에 기재된 면역침전, 방사선면역분석(RIA) 또는 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다. 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 배양될 수 있다; 예로 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103(1986)]을 참고하라. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체가 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 통상적 정제 절차, 예컨대 단백질-A, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
다른 구현예에서, 림프구는 마이크로조작에 의해 선택되고 가변 유전자가 단리될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵구는 면역화되거나 천연 면역인 포유류, 예로 인간으로부터 단리되고, 시험관 내에서 약 7일 동안 배양될 수 있다. 배양은 스크리닝 기준에 부합하는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 웰의 세포가 단리될 수 있다. 개별 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해 또는 이들을 보체-매개 용혈 플라크 분석에서 확인하여 단리될 수 있다. Ig-생산 B 세포는 튜브 내로 마이크로조작될 수 있고, VH 및 VL 유전자는, 예로 RT-PCR을 이용해서 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터 내로 클로닝되고 발현을 위해 세포(예로, 진핵생물 또는 원핵생물 세포) 내로 전달감염될 수 있다
대안적으로, 항체-생산 세포주는 당분야 숙련가에게 널리 공지된 기법을 이용해서 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기법은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 문헌에 기재되어 있다. 상기 측면에서, 후술되는 바와 같이 본 발명에서 이용하기 적합한 기법은 보충서를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 도입되는 [Current Protocols in Immunology, Coligan 등, Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)]에 기재되어 있다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 재조합적으로 또는 효소, 예컨대 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위해)을 이용해서 면역글로불린 분자의 단백분해 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 단편은, 예를 들어 검출 시약, 예컨대 방사선 동위원소에 대한 면역글로불린의 면역특이적 부분의 커플링이 관여되는 면역진단 절차에서 이용하기 충분하다.
예컨대 본원에 기재된 인간 항체는 인간 환자에서의 치료 용도에 특히 바람직하다. 본 발명의 인간 항체는, 예로 이들의 나이로 인해 타우병증 장애, 예로 알츠하이머 질환이 발생할 위험이 있는 것으로 추정될 수 있는 건강한 인간 대상체, 또는 장애를 갖지만 일반적이지 않게 안정한 질환 경과를 갖는 환자로부터 단리된다. 그러나 건강한 노인 및 무증상 대상체가 각각 더 어린 대상체에 비해 더 규칙적으로 보호적 항-타우 항체를 발생시킬 것으로 예상하는 것이 신중하며, 후자도 본 발명의 인간 항체의 수득 원천으로서도 이용될 수 있다. 이는 특히 타우병증 질환의 가족력 형태가 발생할 소인이 있지만 이들의 면역계 기능이 나이 많은 성인에서보다 효율적으로 기능하므로 무증상으로 남아 있는 어린 환자들에 있어 해당된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 대상체 항체에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적 항체 분자가 본원에 기재된다.
본 발명의 항체는 항체 합성을 위해 당분야에 공지된 임의 방법에 의해, 특히 화학적 합성에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 기법에 의해 생산될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실된 합성 불변 영역을 포함한다("도메인-결실 항체"). 특정 구현예에서, 상용성 개질 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체(ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 다른 구현예에 있어서, 짧은 연결 펩티드가 가변 영역에 있어서 가요성 및 이동의 자유를 제공하기 위해 결실된 도메인에 대해 치환될 수 있다. 당분야 숙련가는 이러한 구축물이 항체의 대사율 상에서 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 도메인 결실 구축물은 IgG1 인간 불변 도메인을 인코딩하는 벡터를 이용해서 유도될 수 있으며, 예로 국제 출원 WO02/060955 및 WO02/096948A2를 참고하라. 상기 벡터는 CH2 도메인을 결실시키고 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하기 위해 조작된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 미니바디이다. 미니바디는 당분야에 기재된 방법, 예로 US 특허 5,837,821 또는 국제 출원 WO 94/09817을 이용하여 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이것이 단량체성 서브유닛 간 연합을 허용하는 한, 소수 또는 심지어 단일 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서 단일 아미노산의 돌연변이가 실질적으로 Fc 결합을 감소시켜서 타우 편재를 증가시키기 충분할 수 있다. 유사하게, 조절될 효과기 기능(예로 보체 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은 대상체 불변 영역 도메인에 연관된 다른 바람직한 기능은 온전하게 놔두면서 항체의 선택된 특징(혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한 상기에 언급된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성 구축물의 프로필을 증강시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 상기 측면에서, 개질된 항체의 배치 및 면역원성 프로필은 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위(예로 Fc 결합)에 의해 제공되는 활성이 손상될 수 있다. 다른 구현예는 바람직한 특징, 예컨대 효과기 기능을 증강시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함한다. 이러한 구현예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유도된 특정 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 분자(예로, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 항체를 제공하며, 상기 항체 또는 이들의 단편은 타우에 면역특이적으로 결합한다. 당분야 숙련가에게 공지된 표준 기법은 비제한적으로 아미노산 치환을 야기하는 부위 지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화를 포함하여, 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 변이체(유도체 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3에 대해 50 미만의 아미노산 치환, 40 미만의 아미노산 치환, 30 미만의 아미노산 치환, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 인코딩한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄의 아미노산(예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄의 아미노산(예로, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄의 아미노산(예로, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄의 아미노산(예로, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기형 측쇄의 아미노산(예로, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄의 아미노산(예로, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 대안적으로, 돌연변이는, 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 코딩 서열 전부 또는 일부를 따라 무작위 도입될 수 있고, 생성 돌연변이체는 활성(예로, 타우에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 돌연변이를 항체 분자의 틀 영역 내로만 또는 CDR 영역 내로만 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이, 예로 항원에 결합하는 항체의 능력에 대해 효과를 전혀 또는 거의 갖지 않는 것일 수 있고, 실제로 일부 이러한 돌연변이는 아미노산 서열을 어떻게도 변형시키지 않는다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 이용을 최적화하거나 하이브리도마의 항체 생산을 개선하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 인코딩하는 코돈-최적화된 코딩 영역이 본원에서 다른 곳에 개시된다. 대안적으로, 비-중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변형시킬 수 있다. 가장 침묵하고 중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 아마도 틀 영역 내일 것이지만 가장 비-중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 절대 조건은 아닐지라도 CDR 내일 것이다. 당분야 숙련가는 원하는 특성을 갖는, 예컨대 항원-결합 활성의 변형 또는 결합 활성의 변형(예로 항원-결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화)없이 돌연변이체 분자를 설계하고 평가할 수 있을 것이다. 돌연변이화 후, 인코딩된 단백질은 일상적으로 발현될 수 있고, 인코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예로, 타우의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에 기재된 기법을 이용해서 또는 당분야에 공지된 기법을 일상적으로 개질해서 결정될 수 있다.
타우 결합 제제, 예를 들어 비제한적으로 본 발명의 타우 결합 항체는 신경변성 타우병증의 임의의 생체 내 또는 시험관 내 모델을 이용해서 분석될 수 있다. 당분야 숙련가는 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)가 신경변성 타우병증에 대한 마우스 모델에서 분석될 수 있음을 쉽게 이해한다. 예를 들어 그러나 비제한적으로, 타우병증에 대한 하기 3개의 상이한 동물 모델 중 임의 하나가 본 발명의 타우 항체(및 이들의 결합 특이성을 갖는 분자)를 분석하고 검증하기 위해 이용될 수 있다.
1. 유전자삽입 타우P301 L 마우스(라인 183): 쥐과 Thy1.2 프로모터 하에 P301L 돌연변이를 갖는 인간 타우40을 발현함(이들 유전자삽입 동물의 생성은 Gotz 등, J. Biol. Chem. 276(2001), 529-534 및 국제 출원 WO 2003/017918에 기재되며, 그 개시 내용이 본원에 참조로 도입된다).
2. 쥐과 PrP 프로모터 하에 P301L 돌연변이를 갖는 가장 짧은 4R 인간 타우 이소형을 발현하는 JNPL3 마우스(Taconic, Hudson, NY, U.S.A에서 입수 가능).
3. 쥐과 PrP 프로모터 하에 P301S 돌연변이를 갖는 인간 타우를 발현하는 P301S타우(라인 PS19) 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, U.S.A에서 입수 가능).
당분야 숙련가는 신경변성 타우병증의 실험 모델이 예방 설정에서 이용될 수도 있고 또는 치료 설정에서 이용될 수도 있음을 이해한다. 예방 설정에서, 동물의 투여는 신경변성 타우병증 또는 이들의 증상의 개시 이전에 시작된다. 예방 설정에서, 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)는 신경변성 타우병증 또는 이들의 증상 개시를 예방하거나, 감소시키거나 또는 지연시키는 능력에 대해 평가된다. 치료 설정에서, 동물의 투여는 신경변성 타우병증 또는 이들의 증상 개시 후 시작된다. 치료 설정에서, 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)는 신경변성 타우병증 또는 이들의 증상을 치료하거나 감소시키거나 완화시키는 그 능력에 대해 평가된다. 신경변성 타우병증의 증상에는 비제한적으로 실험 대상체의 뉴론, 뇌, 척추, 뇌척수액 또는 혈청 중 병리적 타우 침적물, 신경섬유 매듭(NFT), 고인산화된 타우 폴리펩티드, 불용성 타우 분획의 축적이 포함된다. 당분야 숙련가는 신경변성 타우병증의 임의의 동물 모델에서 긍정적 예방 또는 치료 결과는 특정 타우 결합 제제(예로, 항체)가 실험 동물 개체 이외의 대상체에서 예방 또는 치료 목적으로 이용될 수 있음을 시사한다는 것을, 예를 들어 이것이 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 신경변성 타우병증의 치료에 이용될 수 있다는 것을 이해한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)는 타우병증 마우스 모델 및 대응하는 대조군 야생형 마우스에 투여될 수 있다. 투여되는 항체는 본 발명의 쥐과화된 항체 또는 본 발명의 항체의 인간-쥐과 키메라일 수 있다. 타우 결합 제제(예로, 항체)는 당분야에 공지된 임의 수단에 의해, 예를 들어 복강 내, 두개 내, 근육 내, 정맥 내, 피하, 경구, 및 에어로졸 투여에 의해 투여될 수 있다. 실험 동물은 타우 결합 제제(예로, 항체) 또는 대조군 조성물, 예컨대 PBS의 1, 2, 3, 4, 5 이상의 용량으로 주어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 실험 동물은 타우 결합 제제(예로, 항체)의 1 또는 2 용량으로 투여될 것이다. 예를 들어, 실시예 9를 참고하라. 다른 구현예에서, 동물에게 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 타우 결합 제제(예로, 항체)가 만성 투여된다. 예를 들어, 실시예 10을 참고하라. 당분야 숙련가는 실험 목적에 맞는 투여 요법, 예를 들어 급성 연구를 위한 투여 요법, 만성 연구를 위한 투여 요법, 독성 연구를 위한 투여 요법, 예방 또는 치료 연구를 위한 투여 요법을 쉽게 설계할 수 있다. 특히 실험 동물의 조직 구획, 예를 들어 비제한적으로 혈청, 혈액, 뇌척수액, 뇌 조직 중 타우 결합 제제(예로, 항체)의 존재는 당분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 구축될 수 있다. 예를 들어, 실시예 9 및 10을 참고하라. 하나의 구현예에서, 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)는 혈액 뇌 장벽을 투과할 수 있다. 당분야 숙련가는 타우 결합 제제(예로, 항체) 용량 및 투여 빈도를 조정함으로써, 실험 동물에서 원하는 타우 결합 제제(예로, 항체) 농도가 유지될 수 있음을 이해한다. 타우병증 모델에서 본 발명의 타우 결합 제제(예로, 항체)의 임의 효과는 치료군 및 대조군 동물에서 타우의 수준, 생화학적 특징 또는 분포를 비교하여 평가될 수 있다. 하나의 예에서, 신경섬유 매듭(NFT)은 Gallyas의 은 함침 기법을 이용하여 또는 NFT에서 병리적으로 인산화된 타우를 인식하는 모노클로날 마우스 항체 AT100 및 AT180을 이용한 면역염색에 의해 조사된다. 항체 처리 마우스 및 대조군 동물의 뇌 및 척추 내에서 Gallyas-양성 뉴론 및/또는 AT100, AT180 표지된 뉴론의 수 및 빈도가 항체 처리의 효과를 평가하기 위해 결정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 및 척추 내의 신경섬유 매듭의 수준, 양 또는 농도를 감소시킬 수 있다. 항체는 신경섬유 매듭의 수준, 양 또는 농도를 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 또는 척추의 Gallyas-양성 뉴론의 수 또는 빈도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 및 척추의 AT100 또는 AT180 항체 양성 뉴론의 수 또는 빈도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 본 발명의 항체의 효과는 또한 항체 투여 후 타우의 분포 및 생화학적 특성을 조사하여 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 및 척추의 타우 단백질의 양 또는 농도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 또는 척추의 불용성 타우 단백질의 양 또는 농도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 불용성 타우 분획은, 예를 들어 실시예 10에 또는 [Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159(1992)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 생물학적 표본 중 타우 단백질의 양은, 예를 들어 실시예 10에 기재된 바와 같이 당분야 숙련가에게 공지된 임의 방법에 의해 결정될 수 있다. 추가 구현예에서, 본 발명의 항체는 동물 모델에서 뇌 또는 척추의 고인산화된 타우 단백질의 양 또는 농도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 감소시킬 수 있다. 고인산화된 타우는 타우의 병리적으로 고인산화된 형태에 특이적인 항체, 예컨대 AT100 또는 AT180을 이용해서 검출될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 혈액, 혈청 또는 뇌척수액 또는 동물 모델에서 타우 농도를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 이상 변형, 예를 들어 감소 또는 증가시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 감소% 또는 증가%는 치료 전에 존재하는 수준, 수, 빈도, 양 또는 농도, 또는 미처리/대조군 처리 대상체에 존재하는 수준, 수, 빈도, 양 또는 농도에 비해 상대적이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 대상체에서 신경변성 타우병증의 적어도 하나의 증상의 개시를 예방하거나 지연시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 대상체에서 신경변성 타우병증의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거할 수 있다. 증상은 대상체의 뇌 또는 척추에서 병리적 타우 침적물, 고인산화된 타우 침적물, 불용성 타우 침적물, 신경원섬유 섬유, 신경원섬유 섬유, 매듭-전 인산화 타우 응집물, 뉴론 내 신경섬유 매듭 또는 뉴론 외 신경섬유 매듭의 형성일 수 있다. 예로 [Augustinack 등, Acta Neuropathol 103:26-35(2002)]를 참고하라. 증상은 또한 혈청, 혈액, 소변 또는 뇌척수액 중 타우의 존재 또는 상승된 농도 또는 양일 수 있고, 여기서 상승된 농도량이 건강한 대상체와 비교된다. 증상은 신경학적 증상, 예를 들어 변형된 조건화된 미각 혐오, 변형된 배경 공포 조건화, 기억력 손상, 운동 기능 상실일 수 있다. 하나의 구현예에서, 기억력 손상은 2-시험 Y-미로 태스크를 이용해서 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 2-시험 Y-미로 태스크는 실질적으로 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행된다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 증상은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 또는 90% 감소된다. 다른 구현예에서, 2-시험 Y-미로 태스크 비는 대조군 대상체에 비해 항체 처리 대상체에서 유의미하게 더 높다. 특정 구현예에서, 2-시험 Y-미로 태스크 비는 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 증가된다. 다른 구현예에서, 2-시험 Y-미로 태스크 비는 적어도 약 2배 3배, 4배, 5배, 10배 또는 20배 더 높다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 치료 유효량의 타우 항체의 투여 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 신경변성 타우병증의 적어도 하나의 증상의 개시의 예방 또는 지연 방법을 제공한다. 본 발명은 본원에 기재된 치료 유효량의 타우 항체의 투여 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 신경변성 타우병증의 적어도 하나의 증상의 감소 또는 제거 방법을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 실험 개체, 예컨대 비제한적으로 유전자삽입 마우스이다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
III. 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 이는 개질되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 및 이중쇄 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 RNA, 및 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 RNA, 단일쇄이거나 보다 전형적으로 이중쇄이거나 또는 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중쇄 영역으로 이루어질 수 있다. 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 개질된 염기 또는 안정성 또는 다른 이유로 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "개질된" 염기에는, 예를 들어 트리틸화 염기 및 비일반 염기, 예컨대 이노신이 포함된다. 다양한 개질이 DNA 및 RNA로 제조될 수 있다; 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 개질된 형태를 포괄한다.
면역글로불린에서 유도된 폴리펩티드(예로, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)의 비-천연 변이체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 인코딩된 단백질 내로 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 비-필수 아미노산 잔기에서 수행된다.
널리 공지된 바와 같이, RNA는 표준 기법, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전에 이어 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 원래 B 세포, 하이브리도마 세포 또는 다른 형질전환된 세포로부터 단리될 수 있다. 바람직한 경우, mRNA는 표준 기법, 예컨대 올리고 dT 셀룰로오스 상의 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 단리될 수 있다. 적합한 기법은 당분야에 친숙하다. 하나의 구현예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 폴리머라아제를 이용해서 동시에 또는 별도로 제조될 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반하여 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 이용될 수 있다. 이 경우, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 탐침, 예컨대 인간 불변 영역 탐침에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는, 예로 재조합 DNA 기법에 대한 상기 참고문헌에서 상세히 나타낸, 널리 공지된 표준 기법에 따라 당분야에 공지된 기법을 이용해서 세포로부터 단리되고, 제한효소 맵핑되고 서열분석될 수 있다. 물론, DNA는 단리 절차 또는 후속 분석 동안 임의 시점에 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 CDR 또는 중쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VH-CDR은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 영역은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 7에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 기준 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이며; 기준 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; 기준 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3은 임의 하나의 VH-CDR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 도 7에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 하나의 구현예에서, VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이며; VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 VL-CDR 또는 경쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VL-CDR은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 영역은 본원에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 7에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 기준 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154. 160, 166, 또는 224이며; 기준 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; 기준 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 임의 하나의 VL-CDR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 도 7에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이며, 하나의 구현예에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224이며; VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 영역은 도 7에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 또는 163이며; VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 또는 164이고; VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 또는 165이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 영역은 도 7에 나타낸 VL-CDR 1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 또는 224이며; VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 149, 155, 161, 또는 167이고; VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 또는 168이다.
당분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드 간 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 아미노산 또는 핵산 서열을 두 번째 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열과 비교하여 결정된다. 본원에서 논의되는 경우, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지 여부는 당분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대 비제한적으로 BESTFIT 프로그램(Wisconsin 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 간 최적 상동성 절편을 찾기 위해 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘[Advances in Applied Mathematics 2(1981), 482-489]을 이용한다. 특정 서열이, 예를 들어 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 상동성인지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 당연히 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 서열 내 아미노산 총 수의 최대 5%까지의 상동성 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 4에 표시된 항-타우 항체의 VH 또는 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 상기 측면에서, 당분야 숙련가는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 두 면역글로불린 사슬 또는 하나만의 가변 도메인을 인코딩할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
표 4: 타우 특이적 항체의 VH 및 VL 영역의 뉴클레오티드 서열. BG - 생식세포 이전
Figure 112015069089787-pct00010
하나의 구현예에서, 본 발명은 기준 중쇄 VH에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 95% 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 기준 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 44, 45, 47, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 또는 220을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 기준 경쇄 VL에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 95% 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 기준 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록 번호 46, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 78, 221, 또는 222를 포함한다.
본 발명에는 또한 다른 곳에 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편이 포함된다. 추가적으로 본원에 기재된 융합 폴리뉴클레오티드, Fab 단편, 및 다른 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 의해 고려된다.
폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의 방법에 의해 생산되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예로 [Kutmeier 등, BioTechniques 17(1994), 242]에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고, 여기에는 간략하게 항체를 인코딩하는 서열 부분을 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭이 관여된다.
대안적으로, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 원천의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없지만 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 항체를 인코딩하는 핵산은 화학적으로 합성되거나, 서열의 3' 및 5' 말단에 가수 분해 가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 적합한 원천(예로, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 타우-특이적 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+ RNA)으로부터, 또는 예로 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여 클로닝에 의해 수득될 수 있다. 이어서 PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산이 당분야에 널리 공지된 임의 방법을 이용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 당분야에 널리 공지된 방법, 예로 재조합 DNA 기법, 부위 지정 돌연변이화, PCR 등(예를 들어, 모두 이들의 전문이 참조로 도입되는 [Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1990) 및 Ausubel 등, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1998)]에 기재된 기법 참고)을 이용하여 조작되어 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다, 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성할 수 있다.
IV. 항체 폴리펩티드의 발현
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제공하기 위해 단리된 유전 재료의 조작 후, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 원하는 양의 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위해 발현 벡터에 삽입된다. 항체, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 유사체, 예로 표적 분자에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현이 본원에 기재된다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유하는 부분)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터가 당분야에 널리 공지된 기법을 이용해서 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 단백질의 제조 방법이 본원에 기재된다. 당분야 숙련가에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법에는, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합이 포함된다. 따라서 본 발명은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본 발명의 항체 분자, 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터에는 항체 분자의 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있으며(예로, 국제 출원 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 US 특허 번호 5,122,464 참고) 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로 도입되고 여기서 원하는 유전자를 발현하기 위한 전달체로서 본 발명에 따라 이용되는 벡터를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 당분야 숙련가에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상용성인 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한효소 부위 및 진핵생물 또는 원핵생물 세포에 들어가고/가거나 복제하는 능력을 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 여러 발현 벡터 시스템이 채용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 클래스의 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스에서 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들에는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다중 시스트론 시스템의 이용이 관여된다. 추가적으로, 이들의 염색체 내로 DNA가 통합된 세포는 전달감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커 도입에 의해 선택될 수 있다. 마커는 기본영양균주에 대해 영양요구 숙주, 살생물제 내성(예로, 항생제) 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 발현되거나 도입될 DNA 서열로 직접 연결될 수 있다. 추가적인 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예로, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자)와 발현 벡터 내로 삽입된다. 하나의 구현예에서, 이는 US 특허 번호 6,159,730에 개시되며 NEOSPLA로 불리는 Biogen IDEC, Inc.의 독점적 발현 벡터를 이용해서 시행된다. 상기 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 상기 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 도입, CHO 세포에서의 전달감염에 이어 G418 함유 배지에서의 선택 및 메토트렉세이트 증폭 시 매우 고수준의 항체 발현을 일으키는 것으로 나타났다. 물론, 진핵생물 세포에서 발현을 야기할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 비제한적으로 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CA에서 입수 가능), 및 플라스미드 pCI(Promega, Madison, WI에서 입수 가능)가 포함된다. 일반적으로, 고수준의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 적합하게 발현하는 것들에 있어서 다수의 형질전환된 세포의 스크리닝은, 예를 들어 로보트 시스템으로 수행될 수 있는 일상적 실험이다. 벡터 시스템은 또한 그 각각이 본원에 참조로 도입되는 US 특허 번호 5,736,137 및 5,658,570에서 교시된다. 상기 시스템은 높은 발현 수준, 예로 > 30pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은, 예로 US 특허 번호 6,413,777에 개시되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 다중 시스트론 구축물, 예컨대 US 특허 출원 공개 번호 2003-0157641 A1에 개시되며 본원에 그 전문이 도입된 것들을 이용해서 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 관심 다중 유전자 산물, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄는 단일 다중 시스트론 구축물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 상대적으로 고수준의 항체를 제공하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용한다. 상용성 IRES 서열은 역시 본원에 도입된 US 특허 번호 6,193,980에 개시된다. 당분야 숙련가는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시된 전체 범위의 항체를 효과적으로 생산하기 위해 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
보다 일반적으로, 항체의 단량체 서브유닛을 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입은 당분야 숙련가에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이들에는 비제한적으로, 예로 Fugene® 또는 리포펙타민을 이용한 지질 전달감염, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외피함유 DNA를 이용한 세포 융합, 마이크로주입 및 온전한 바이러스로의 감염을 포함하는 전달감염이 포함된다. 전형적으로, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 표준 칼슘 포스페이트 공-침전 방법을 통한다. 발현 구축물을 보유하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에 배양되고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기법에는 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 또는 형광-활성화 세포 정렬기 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
발현 벡터는 통상적 기법에 의해 숙주 세포로 전달되며, 전달감염된 세포는 본원에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체를 생산하기 위해 통상적 기법에 의해 배양된다. 따라서 본 발명에는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 항체, 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 포함된다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 인코딩하는 벡터는 후술되는 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 두 발현 벡터, 중쇄 유래 폴리펩티드를 인코딩하는 첫 번째 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 벡터로 공동-전달감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동일한 발현을 구현할 수 있는 동일하고 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두 인코딩하는 단일 벡터가 이용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 과량의 무독성 중쇄를 배제하기 위해 중쇄 앞에 배치된다; [Proudfoot, Nature 322(1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(1980), 2197]을 참고하라. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용하여 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터의 항체 단리를 위한 절차 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양"은 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 항체의 원천을 표시하기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 달리 말하면, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 전체 세포의 회전 침강으로부터 또는 배지 및 현탁된 세포를 모두 함유하는 세포 배양으로부터의 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 방법에 이용하기 위한 항체 분자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산된 후 정제되는 전달체를 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 전달감염되는 경우 본 발명의 항체 분자를 원 위치에서 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들에는 비제한적으로 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예로, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예로, 사카로마이세스, 피치아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예로, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예로, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예로, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예로, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 세포)가 포함된다. 하나의 구현예에서, 박테리아 세포, 예컨대 에스체리키아 콜라이, 보다 바람직하게는 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 진핵생물 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 이용된다. 예를 들어, 벡터, 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 함께 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 항체를 위해 효과적인 발현 시스템이다; 예로 [Foecking 등, Gene 45(1986), 101; Cockett 등, Bio/Technology 8(1990), 2]를 참고하라.
단백질 발현을 위해 이용된 숙주 세포주는 종종 포유류 기원의 것이다; 당분야 숙련가는 내부에서 발현될 원하는 유전자 산물에 대해 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 능력이 있는 것으로 믿어진다. 예시적인 숙주 세포주에는 비제한적으로 CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR-), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), VERY, BHK(아기 햄스터 신장), MDCK, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포주는 CHO 또는 293 세포이다. 숙주 세포주는 전형적으로 시판 공급처, American Tissue Culture Collection 또는 공개된 문헌에서 이용 가능하다.
또한, 원하는 특정 방식으로 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 유전자 산물을 개질 및 가공하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 개질(예로, 글리코실화) 및 가공(예로, 절단)은 단백질 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 개질을 위한 특징 및 특정 기전을 갖는다. 발현되는 외래 단백질의 정확한 개질 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 상기 목적을 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기전을 보유하는 진핵생물 숙주 세포가 이용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 가공될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 요소(예로, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 가공된 세포가 농축 배지 중에서 1-2일 크도록 둔 뒤 선택 배지로 교체될 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 이들의 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합하고, 발생부위를 형성하도록 자랄 수 있게 하며, 다시 클로닝되고 세포주로 증식될 수 있다. 상기 방법은 유리하게는 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 가공하기 위해 이용될 수 있다.
여러 선택 시스템이 이용될 수 있고, 비제한적으로 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler 등, Cell 11(1977), 223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48(1992), 202), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Lowy 등, Cell 22(1980), 817) 유전자가 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 채용될 수 있다. 또한, 항-대사물질 내성이 하기 유전자에 대한 선택의 기준으로 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대해 내성을 부여하는 dhfr(Wigler 등, Natl. Acad. Sci. USA 77(1980), 357; O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(1981), 1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(1981), 2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Goldspiel 등, Clinical Pharmacy 12(1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3(1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32(1993), 573-596; Mulligan, Science 260(1993), 926-932; 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62(1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre 등, Gene 30(1984), 147). 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당분야에서 일반적으로 공지된 방법은 이들의 전문이 본원에 참조로 도입되는 [Ausubel 등(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990); 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli 등(eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1(1981)]에 기재되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있으며, 리뷰를 위해서는 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3.(1987)]을 참고하라. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포 배양에 존재하는 저해제 수준 증가는 마커 유전자의 복제수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연관되므로, 항체 생산도 증가할 것이다; [Crouse 등, Mol. Cell. Biol. 3(1983), 257]을 참고하라.
시험관 내 생산은 다량의 원하는 폴리펩티드를 제공하기 위한 스케일-업을 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유류 세포 배양을 위한 기법은 당분야에 공지되어 있으며, 예로 에어리프트 반응기 내 또는 연속적 교반 반응기 내에서의 균질한 현탁 배양, 또는 예로 중공 섬유, 마이크로캡슐 내, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 고정화되거나 트랩핑된 세포 배양이 포함된다. 필요하고/하거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액은, 예로 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 선호적 생합성 후 또는 본원에 기재된 HIC 크로마토그래피 단계 이전 또는 이후의 통상적 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에 걸친 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 유전자는 또한 비-포유류 세포, 예컨대 박테리아 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 섭취하는 박테리아에는 엔테로박테리아세애의 구성원, 예컨대 에스체리키아 콜라이 또는 살모넬라 계통; 바실라세애, 예컨대 바실러스 서브틸리스; 뉴모코커스; 스트렙토코커스 및 해모필러스 인플루엔재가 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우, 이종성 폴리펩티드가 전형적으로 봉입체의 일부가 되는 것이 추가로 이해될 것이다. 이종성 폴리펩티드는 단리되고, 정제된 후 기능적 분자로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태를 원하는 경우, 서브유닛이 4가 항체로 자가 조립될 것이다; 예로, 국제 출원 WO02/096948을 참고하라.
박테리아 시스템에서, 여러 발현 벡터는 유리하게는 항체 분자가 발현되기 위한 용도에 의존하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위해, 쉽게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 비제한적으로 융합 단백질이 생산되도록 항체 코딩 서열이 lacZ 코딩 영역과 틀 내로 벡터 내에 개별 결찰될 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther 등, EMBO J. 2(1983), 1791); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13(1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24(1989), 5503-5509) 등이 포함된다. pGEX 벡터도 외래 폴리펩티드를 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로 발현하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 가용성이며 글루타치온-아가로오스 비드의 기질에 대한 흡착 및 결합 후 자유 글루타치온의 존재 하 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 설계된다.
원핵생물에 부가하여, 진핵생물 미생물도 이용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시애 또는 일반 제빵용 효모는 진핵생물 미생물 중에서 가장 일반적으로 이용되지만, 여러 다른 계통, 예로 피치아 파스토리스도 일반적으로 이용 가능하다. 사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchcomb 등, Nature 282(1979), 39; Kingsman 등, Gene 7(1979), 141; Tschemper 등, Gene 10(1980), 157)이 일반적으로 이용된다. 상기 플라스미드는 이미 트립포탄에서 자라는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 계통, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics 85(1977), 12)에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유한다. 이어서 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로 trp1 병소의 존재는 트립토판의 부재 하 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그래파 캘리포니카 핵 다면체형성 바이러스(AcNPV)가 전형적으로 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 이용된다. 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다 세포에서 자란다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓일 수 있다.
본 발명의 항체가 재조합적으로 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는, 예를 들어 크로마토그래피(예로, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후 특정 항원에 대한 친화도, 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이, 예로 암모늄 설페이트 침전, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법을 포함하는 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 예로 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y.(1982)]를 참고하라. 대안적으로, 본 발명의 항체 친화도를 증가시키기 위한 다른 방법은 US 특허 공개 2002-0123057 A1에 개시되어 있다.
V. 융합 단백질 및 콘주게이트
특정 구현예에서, 항체 폴리펩티드는 보통 항체와 연관되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 개질이 아래에 보다 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 단일-사슬 Fv 항체 단편은 가요성 링커 서열을 포함할 수도 있고, 또는 기능적 모이어티(예로, PEG, 약물, 독소, 또는 표지, 예컨대 형광, 방사활성, 효소, 핵 자기, 중금속 등)를 부가하도록 개질될 수도 있다.
본 발명의 항체 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 적어도 하나의 표적 결합 부위, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉 자연에서 천연 연결되지 않는 부분을 갖는 면역글로불린 타우-결합 도메인을 포함하는 키메라성 분자이다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩티드로 함께 모이는 별도의 단백질로 존재할 수도 있고, 또는 보통 동일한 단백질에 존재하지만 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치될 수도 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 인코딩되는 폴리뉴클레오티드의 생성 및 번역에 의해 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 대상체의 나머지와 구별되는 대상체로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 이용되는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유사체에 융합될 "이종성 폴리펩티드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩티드, 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에서 유래된다.
본원의 다른 곳에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 콘주게이트될 수 있다(공유 및 비-공유 콘주게이션 포함). 예를 들어, 항체는 검출 분석에서 표지 및 효과기 분자로 유용한 분자, 예컨대 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사선핵종, 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 콘주게이트될 수 있다; 예로, 국제 출원 WO92/08495; W091/14438; W089/12624; US 특허 번호 5,314,995; 및 유럽 특허 출원 EP 0 396 387을 참고하라.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 펩티드 결합 또는 개질된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산, 즉 펩티드 동배체로 이루어질 수 있고, 20가지 유전자-인코딩 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 항체는 당분야에 널리 공지된 자연적 절차, 예컨대 번역 후 가공 또는 화학적 개질 기법에 의해 개질될 수 있다. 이러한 개질은 기본 교과서 및 보다 상세한 단행물뿐만 아니라 여러 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 개질은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 항체 내의 임의 위치 또는 모이어티, 예컨대 탄수화물 상에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 개질이 주어진 항체의 여러 분위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 주어진 항체는 여러 개질 유형을 함유할 수 있다. 항체는, 예를 들어 유비퀴틴화의 결과 분기형일 수 있고, 이들은 분기를 포함하거나 포함하지 않는 고리형일 수 있다. 고리형, 분기형, 및 분기형 고리형 항체는 번역 후 자연 절차에서 생성될 수도 있고 또는 합성 방법에 의해 제조될 수도 있다. 개질에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디설피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 부착 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, peg화, 단백분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가, 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 포함된다; 예로, [Proteins-Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12(1983); Seifter 등, Meth. Enzymol. 182(1990), 626-646; Rattan 등, Ann. NY Acad. Sci. 663(1992), 48-62)]를 참고하라.
본 발명은 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열 또는 이들의 단편 또는 변이체, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에 이용하기 위한 융합 단백질은 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 또는 3개의 VH-CDR의 아미노산 서열 또는 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 3개의 VL-CDR의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체, 또는 이들의 단편, 유도체, 또는 변이체의 VH-CDR3의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 융합 단백질은 타우에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 VH 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항체 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체의 적어도 하나의 VL 영역의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 타우에 특이적으로 결합하는 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 해당한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에 이용하기 위한 융합 단백질은 항체의 임의의 1, 2, 3개 이상의 VH CDR의 아미노산 서열 및 항체, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 임의의 1, 2, 3개 이상의 VL CDR의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 VH-CDR(들) 또는 VL-CDR(들)은 본 발명의 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 해당한다. 이들 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본 발명에 의해 포괄된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질에는 T 세포 수용체(Gascoigne 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987), 2936-2940; CD4(Capon 등, Nature 337(1989), 525-531; Traunecker 등, Nature 339(1989), 68-70; Zettmeissl 등, DNA Cell Biol. USA 9(1990), 347-353; 및 Byrn 등, Nature 344(1990), 667-670); L-셀렉틴(귀소 수용체)(Watson 등, J. Cell. Biol. 110(1990), 2221-2229; 및 Watson 등, Nature 349(1991), 164-167); CD44(Aruffo 등, Cell 61(1990), 1303-1313); CD28 및 B7(Linsley 등, J. Exp. Med. 173(1991),721-730); CTLA-4(Lisley 등, J. Exp. Med. 174(1991), 561-569); CD22(Stamenkovic 등, Cell 66(1991), 1133-1144); TNF 수용체(Ashkenazi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991), 10535-10539; Lesslauer 등, Eur. J. Immunol. 27(1991), 2883-2886; 및 Peppel 등, J. Exp. Med. 174(1991), 1483-1489(1991); 및 IgE 수용체 a(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115(1991), Abstract No. 1448)의 융합이 포함된다.
본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 폴리펩티드의 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 또는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 면역분석에서 이용하기 위해 이종성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어 하나의 구현예에서, PEG는 이들의 생체 내 반감기를 증가시키 위해 본 발명의 항체에 콘주게이트될 수 있다; 예로 [Leong 등, Cytokine 16(2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54(2002), 531; 또는 Weir 등, Biochem. Soc. Transactions 30(2002), 512] 참고.
또한, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 마커 서열, 예컨대 이들의 정제 또는 검출을 촉진하기 위한 펩티드에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드(HIS), 예컨대 다른 것들 가운데 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Cliatsworth, Calif, 91311)에서 제공되는 태그이며, 이들 다수는 시판된다. 예를 들어 [Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989), 821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그에는 비제한적으로 "HA" 태그가 포함되며, 이는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프(Wilson 등, Cell 37(1984), 767) 및 "플래그" 태그에 해당한다.
융합 단백질은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 제조될 수 있다; 예를 들어 US 특허 번호 5,116,964 및 5,225,538을 참고하라. 융합이 일어나는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 경험적으로 선택될 수 있다. 이어서 융합 단백질을 인코딩하는 DNA가 발현을 위한 숙주 세포 내로 전달감염된다.
본 발명의 항체는 콘주게이트되지 않은 형태로 이용될 수도 있고, 또는 예로 분자의 치료 특성을 개선하거나 표적 검출을 촉진하거나 또는 환자의 조영 또는 치료법을 위해 적어도 하나의 다양한 분자에 콘주게이트될 수도 있다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 정제가 수행되는 경우, 정제 이전 또는 이후 표지되거나 콘주게이트될 수 있다. 특히 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료제, 전구약물, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학 제제, 또는 PEG에 콘주게이트될 수 있다.
통상적 항체를 포함하는 면역독소인 콘주게이트는 당분야에 널리 기재되어 있다. 독소는 통상적 커플링 기법에 의해 항체에 커플링될 수도 있고, 또는 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소가 융합 단백질로 생산될 수도 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위한 해당 방식으로 이용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 [Byers, Seminars Cell. Biol. 2(1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12(1991), 51-54]에 기재된 것들이다.
당분야 숙련가는 또한 콘주게이트될 선택된 제제에 따라 다양한 기법을 이용하여 콘주게이트가 조립될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 바이오틴을 함유하는 콘주게이트는, 예로 바이오틴의 활성화된 에스테르, 예컨대 바이오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 타우 결합 폴리펩티드를 반응시켜 제조된다. 유사하게, 형광 마커를 갖는 콘주게이트는 커플링제, 예로 본원에 기재된 것들의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트, 또는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 콘주게이트가 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 또한 진단제 또는 치료제에 콘주게이트된 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 추가로 포괄한다. 항체는 진단적으로, 예를 들어 신경학적 질환의 존재를 나타내기 위해, 신경학적 질환의 획득 위험을 나타내기 위해, 임상적 평가 절차의 일환으로 신경학적 질환, 즉 타우병증 질환의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해, 예로 주어진 치료 및/또는 예방 요법의 유효성을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 검출은 검출 가능한 물질에 대한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 커플링에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보철기, 형광 재료, 발광 재료, 생체발광 재료, 방사활성 재료, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사활성 상자성 금속 이온이 포함된다; 예로, 본 발명에 따른 진단제로 이용하기 위해 항체에 콘주게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 US 특허 번호 4,741,900을 참고하라. 적합한 효소의 예에는 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스터라아제가 포함되며; 적합한 보철기 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴이 포함되며; 적합한 형광 재료의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되며; 발광 재료의 예에는 루미놀이 포함되며; 생체발광 재료의 예에는 루시퍼라아제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되며; 적합한 방사활성 재료의 예에는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc가 포함된다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이어서 화학발광-태그화 항체의 존재가 화학 반응 과정 동안 생기는 발광의 존재를 검출하여 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 써로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 검출 가능하게 표지될 수 있는 하나의 방식은 이를 효소에 연결하고 연결된 산물을 효소 면역분석(EIA)에서 이용하는 것이다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2(1978), 1-7); Voller 등, J. Clin. Pathol. 31(1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73(1981), 482-523; Maggio, E.(ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa. E. 등, (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo(1981). 항체에 결합된 효소는, 예를 들어 분광측정, 형광측정 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생산하는 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출 가능하게 표지하기 위해 이용될 수 있는 효소에는 비제한적으로 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트, 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스터라아제가 포함된다. 추가적으로, 검출은 효소에 대한 발색 기질을 채용하는 비색측정 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물질에 대비된 기질의 효소 반응 정도의 시각적 비교에 의해 달성될 수 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 방사활성으로 표지함으로써, 방사선면역분석(RIA)의 이용을 통해 항체를 검출할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 도입된 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986))] 참고. 방사활성 동위원소는, 비제한적으로 감마 측정기, 신틸레이션 측정기, 또는 자가 방사 기록법을 포함하는 수단으로 검출될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것들을 이용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트기를 이용해서 항체에 부착될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에 대해 다양한 모이어티를 콘주게이트하기 위한 기법은 널리 공지되어 있으며, 예로 [Arnon 등, "Monoclonal For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등(eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc.(1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson 등(eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53(1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등(eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등(eds.), Academic Press pp. 303-16(1985), 및 Thorpe 등, "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62(1982), 119-158]을 참고하라.
언급된 바와 같이, 특정 구현예에서 결합 분자, 예로 결합 폴리펩티드, 예로 항체 또는 이들의 면역특이적 단편의 안정성 또는 유효성을 증강시키는 모이어티가 콘주게이트될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, PEG가 이들의 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 결합 분자에 콘주게이트될 수 있다. [Leong 등, Cytokine 16(2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54(2002), 531; 또는 Weir 등, Biochem. Soc. Transactions 30(2002), 512].
VI. 조성물 및 이용 방법
본 발명은 상기 언급된 타우 결합 분자, 예로 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 또는 이들의 유도체 또는 변이체, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 목적 용도에 따라 추가 제제, 예컨대 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수 있다. 타우병증 질환, 예로 알츠하이머 질환의 치료에서의 이용을 위해, 추가 제제는 유기 소분자, 항-타우 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증 질환의 예방적 및 치료적 처리를 위한 약학 또는 진단 조성물의 제조를 위한, 타우병증 질환의 진행 또는 타우병증 질환 치료에 대한 반응 모니터링을 위한 또는 타우병증 질환 발생에 대한 대상체의 위험 결정을 위한, 타우 결합 분자, 예로 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 또는 이들 중 임의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 용도에 관한 것이다.
따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 각각 뇌 및 중추신경계에서 타우의 비정상적인 축적 및/또는 침적을 특징으로 하는 신경학적 장애의 치료 방법에 관한 것이며, 이 방법은 상술된 타우 결합 분자, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 중 치료 유효량의 임의 하나를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 용어 "신경학적 장애"에는 비제한적으로 타우병증 질환, 예컨대 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중이 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 신경변성, 신경학적 또는 신경정신은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
본 발명의 치료 전략의 특정 장점은 본 발명의 항체가 타우병증 질환의 징후가 없고, 이에 따라 타우병증 질환의 임상적 발현을 방지할 수 있거나 임상적 발현 질환의 발생 위험을 감소시키거나, 또는 임상적 발현 질환의 개시 또는 진행을 지연시킬 수 있는 특정한 개연성을 갖는 건강한 인간 대상체로부터의 B 세포 또는 B 메모리 세포로부터 유래된다는 사실에 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 또한 체세포 성숙, 즉 항체 가변 영역의 체세포 변이에 의해 표적 타우 분자에 대한 고친화도 결합의 선택성 및 유효성에 대한 최적화를 이미 성공적으로 거쳤다.
이러한 세포가 생체 내, 예로 인간에서 자가면역학적 또는 알러지성 반응의 측면에서 관련되거나 다른 생리적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않았다는 사실은 이것이 임상적 평가상을 통해 상당히 증가된 성공적 생존 기회를 나타내므로 또한 중요한 의학적 중요성을 갖는다. 말하자면, 효율성, 허용 가능성 및 관용성이 적어도 하나의 인간 대상체에서 예방적 또는 치료적 항체의 전임상 및 임상 개발 전에 이미 나타났다. 따라서 본 발명의 인간 항-타우 항체는 치료제로서의 그 표적 구조-특이적 유효성 및 그 감소된 부작용 개연성이 모두 그 임상적 성공 개연성을 크게 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 상술된 성분, 예로 본 발명의 항-타우 항체, 이들의 결합 단편, 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 각각의 약학 및 진단 팩 또는 키트를 제공한다. 약학제 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 처방되는 형태의 통지가 이러한 용기(들)에 연관될 수 있고, 이 통지는 인간 투여에 대한 제조, 이용 또는 판매의 당국에 의한 승인을 반영한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 분석에서 이용하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물, 예로 키트는 당연히, 타우의 존재가 수반되고, 특히 알츠하이머 질환(AD), 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합체(ALS-PDC), 은친화성 입자 치매(AGD), 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성(CBD), 크루츠펠트-야콥 질환(CJD), 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17(FTDP-17)에 연관된 파킨슨병을 포함하는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형(NP-C), 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환(PiD), 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비(PSP), 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중의 치료에 적용 가능한 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 약학 조성물은 당분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472]를 참고하라. 적합한 약학 담체의 예는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식으로, 예로 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 비강 내, 국소 또는 피내 투여 또는 척추 또는 뇌 전달에 의해 시행될 수 있다. 에어로졸 제형물, 예컨대 비강 스프레이 제형물에는 보존제 및 등장화제를 포함하는 활성 제제의 정제된 수성 또는 다른 용액이 포함된다. 이러한 제형물은 비강 점막과 상용성인 pH 및 등장성 상태로 조정된다. 직장 또는 질 투여용 제형물은 적합한 담체를 포함하는 좌약으로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에 본 발명의 약물을 투여하기 위해 두개에 작은 구멍을 드릴링하는 현재의 표준(다행스럽게도 빈번하지 않은) 절차가 포함되지만, 하나의 측면에서 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 또는 항체 기반 약물은 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있어서 정맥 내 또는 경구 투여를 허용한다.
투여 방식은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1000㎍(또는 상기 범위에서 발현 또는 발현의 저해를 위한 핵산)의 범위일 수 있다; 그러나 상기 예시적인 범위 미만 또는 초과 용량이, 특히 상기 언급된 요인을 고려하여 포괄된다. 일반적으로, 투여량은 숙주 체중을 기준으로, 예로 약 0.0001 내지 100mg/kg, 보통 0.01 내지 5mg/kg(예로, 0.02mg/kg, 0.25mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 2mg/kg 등)의 범위일 수 있다. 예를 들어 투여량은 1mg/체중kg 또는 10mg/체중kg 또는 1-10mg/kg 범위 이내, 또는 적어도 1mg/kg일 수 있다. 상기 범위의 중간 용량도 본 발명의 범위 내로 의도된다. 대상체는 이러한 용량이 매일, 수 일마다, 수 주마다 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 예를 들어 적어도 6개월에 걸쳐 다중 투여량의 투여를 포함한다. 추가적인 예시적 치료 방식은 2주 마다 또는 1개월 마다 또는 3 내지 6개월 마다의 투여를 포함한다. 예시적인 투여량 일정에는 연속일로의 1-10mg/kg 또는 15mg/kg, 수 일마다의 30mg/kg 또는 수 주마다의 60mg/kg이 포함된다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 나타낸 범위 내에 속한다. 진행이 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는 식염수 및 완충 매질을 포함하는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 전달체에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥 내 전달체에는 수액 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 목적 용도에 따라 추가 제제, 예컨대 도파민 또는 정신약리 약물을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 특정 구현예에서, 약학 조성물은 예를 들어 본 발명의 약학 조성물이 수동 면역화를 위해 항-타우 항체 또는 이들의 결합 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 경우, 백신으로 제형화될 수 있다. 배경 섹션에서 언급된 바와 같이, 인산화-타우종은 세포 외에서 혈장 및 CSF 중에 보고되었고(Aluise 등, Biochim. Biophys. Acta. 1782(2008), 549-558), 인산화된 타우 펩티드로의 능동 백신접종을 이용한 유전자삽입 마우스 라인에서의 연구는 뇌에서 타우 응집물의 뇌 수준의 감소 및 거동 손상의 진행 완화를 드러내었다(Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15(2008), 157-168; Boimel 등, Exp Neurol. 224(2010), 472-485). 따라서, 본 발명의 인간 항-타우 항체 및 균등 타우 결합 분자를 이용한 수동 면역화는 배경 섹션에서 이미 논의된 바와 같이 능동 면역화 치료법 개념의 몇몇 유해 반응의 우회를 도울 것으로 예상하는 것이 신중하다. 그러므로, 본 발명의 항-타우 항체 및 이들의 균등물은 이전에 언급된 바와 같이 타우병증 질환, 예컨대 AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP 또는 다른 타우병증의 예방 또는 완화를 위한 백신으로 특히 유용할 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 재조합 이중특이적 또는 다중특이적 구축물을 이용하는 것이 유익할 수 있다. 참조를 위해, [Fischer and Leger, Pathobiology 74(2007), 3-14]를 참고하라. 이러한 이중특이적 분자는 하나의 결합 팔로 타우를 그리고 두 번째 결합 팔로 다른 병리적 대상체, 예컨대 Αβ 또는 알파-시누클레인 또는 타우의 상이한 병리적 입체형태를 표적화하도록 설계될 수 있다. 대안적으로 두 번째 결합 팔은 뇌 내로의 항체 투과를 촉진하기 위해 혈액-뇌-장벽에 존재하는 단백질을 표적화하도록 설계될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 재조합 Fab(rFab) 및 단일 사슬 단편(scFvs)를 이용하는 것이 유익할 수 있고, 이는 세포막을 보다 쉽게 투과할 수 있다. 예를 들어, 이미 온라인으로 공개된 [Robert 등, Protein Eng. Des. Sel.(2008) Oct 16; S1741-0134]는 Αβ의 N-말단 영역에서 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 WO-2의 키메라성 재조합 Fab(rFab) 및 단일 사슬 단편(scFv)의 용도를 기재한다. 조작된 단편은 (i) 아밀로이드 미소섬유 형성을 예방하고, (ii) 사전 형성된 Αβ1-42 원섬유를 분해하고, (iii) 전체 IgG 분자만큼 효율적으로 시험관 내 Αβ1-42 올리고머-매개 신경독성을 저해할 수 있었다. 효과기 기능이 없는 작은 Fab 및 scFv 조작 항체 포맷 이용의 인지된 장점에는 혈액-뇌 장벽을 통한 보다 효율적인 통과 및 염증성 부작용의 유발 위험 최소화가 포함된다. 또한, scFv 및 단일-도메인 항체는 전장 항체의 결합 특이성을 보유하는 것 외에도, 이들은 이들 표적의 폴딩, 상호작용, 개질 또는 세포하 편재의 변형 가능성과 더불어, 인트라바디로서 포유류 세포에서 단일 유전자로 그리고 세포 내에서 발현될 수 있다; 리뷰를 위해서는, 예로 [Miller and Messer, Molecular Therapy 12(2005), 394-401]을 참고하라.
상이한 접근에서, [Muller 등, Expert Opin. Biol. Ther.(2005), 237-241]은 살아있는 세포에 유해를 가하지 않고 항체가 전달될 수 있는 것으로 언급되는 소위 'SuperAntibody 기술'의 기술 플랫폼을 기재한다. 이러한 세포-투과 항체는 새로운 진단 및 치료 윈도우를 열어준다. 이들 항체에 대해서는 용어 '트랜스맵(TransMab)'이 주어졌다.
추가 구현예에서, 타우병증 질환을 치료하기 위해 유용한 다른 항체의 공동-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 하나의 구현예에서, 추가적인 항체는 본 발명의 약학 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 항체의 예에는 비제한적으로 베타-아밀로이드, 알파-시누클레인, TDP-43 및 SOD-1을 표적으로 하는 항체가 포함된다.
추가 구현예에서, 타우병증 질환의 치료를 위해 유용한 다른 신경보호 제제의 공동 투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 하나의 구현예에서, 추가 제제가 본 발명의 약학 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 신경보호 제제의 예에는 비제한적으로 아세틸콜린에스터라아제 저해제, 글루탐산 수용체 길항제, 키나아제 저해제, HDAC 저해제, 항-염증제, 디발프로엑스 나트륨, 또는 이들의 임의 조합이 포함된다. 본 발명의 약학 조성물과 동시에 이용될 수 있는 다른 신경보호 제제의 예는 당분야에 기재되어 있다; 예로, 국제 출원 WO2007/011907을 참고하라. 하나의 구현예에서, 추가 제제는 도파민 또는 도파민 수용체 작용제이다.
치료 유효 용량 또는 양은 증상 또는 상태를 완화시키기 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 이러한 화합물의 치료 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예로 ED50(모집단의 50%에서의 치료 유효 용량) 및 LD50(모집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 간 용량비가 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물 내의 치료제는 앞서 언급된 바와 같은 AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP 또는 다른 타우병증 질환의 경우 정상 거동 및/또는 인지 특성을 복원하거나 보존하기 충분한 양으로 존재한다.
상기로부터, 본 발명이 특히 상기 언급된 타우병증 질환, 특히 알츠하이머 질환의 진단 및/또는 치료를 위해, 상술된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 타우 결합 분자의 임의 용도를 포괄함이 자명하다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬이다. 또한, 본 발명은 전술된 임의 하나의 항체의 항-개별특이형 항체에 관한 것이다. 이들은 항원-결합 부위 근처의 항체 가변 영역 상에 위치하는 고유한 항원성 펩티드 서열에 결합하며, 예로 대상체의 표본에서 항-타우 항체의 검출을 위해 유용한 항체 또는 다른 결합 분자이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 상술된 타우 결합 분자, 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 임의 하나 및 선택적으로 검출을 위해 적합한 수단, 예컨대 면역 또는 핵산 기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 이들이 액상에서 이용되거나 고상 담체에 결합될 수 있는 면역분석에서 이용하기 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역분석의 예는 직접 또는 간접 포맷의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역분석이다.
이러한 면역분석의 예는 방사선면역분석(RIA), 샌드위치(면역계측 분석), 유세포 측정 및 웨스턴 블롯 분석이다. 본 발명의 항원 및 항체는 여러 상이한 담체에 결합되고 이들에 특이적으로 결합된 세포를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예에는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 개질된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자에 공지된 여러 상이한 표지 및 표지 방법이 존재한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 표지 유형의 예에는 효소, 방사선동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 및 생체발광 화합물이 포함된다; 또한 본원에서 상기 논의된 구현예를 참고하라.
추가 구현예에 의해, 타우 결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 혈액 표본, 림프 표본 또는 임의의 다른 체액 표본일 수 있는 평가된 개인으로부터의 체액 표본을 수득하고, 항체-항원 복합체의 형성을 가능케 하는 조건 하에 체액 표본을 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 개인에서 장애의 진단을 위한 방법에서 이용될 수 있다. 이어서 이러한 복합체의 수준은 당분야에 공지된 방법에 의해 결정되며, 대조군 표본에서 형성된 것보다 유의미하게 더 높은 수준은 평가된 개인에서 질환을 시사한다. 동일한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 결합된 특이적 항원도 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 결합 분자, 예로 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 시험관 내 면역분석에 관한 것이다.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 상기 목적을 위해 특이적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, 항체-기반 어레이가 이용될 수 있고, 여기에는 예를 들어 타우를 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 균등 항원-결합 분자가 로딩된다. 마이크로어레이 면역분석의 설계는 [Kusnezow 등, Mol. Cell Proteomics 5(2006), 1681-1696]에 요약되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인된 타우 결합 분자가 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증 질환의 진단 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명의 적어도 하나의 항체, 이들의 타우 결합 또는 이들 중 임의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 타우-결합 분자로 진단될 대상체로부터의 표본 중 타우 및/또는 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우의 존재를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우의 존재는 신경변성 타우병증을 시사하며, 생리적 타우 형태 수준에 비해 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우 수준의 증가는 상기 대상체에서 신경변성 타우병증의 진행을 시사한다.
진단될 대상체는 질환에 대해 무증상성이거나 전임상 상태일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대조군 대상체는 타우병증 질환, 예를 들어 앞서 언급된 바와 같은 AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP 또는 다른 타우병증을 가지며, 여기서 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우 수준 및 기준 표준물질 간 유사성은 진단될 대상체가 타우병증 질환을 가짐을 시사한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 두 번째 대조군으로서 대조군 대상체는 타우병증 질환을 갖지 않으며, 여기서 타우 및/또는 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우 수준 및 기준 표준물질 간 차이는 진단될 대상체가 타우병증 질환을 가짐을 시사한다. 하나의 구현예에서, 진단될 대상체 및 대조군 대상체(들)는 연령-매치된다. 분석될 표본은 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우를 함유하는 것으로 추정되는 임의의 체액, 예를 들어 혈액, CSF, 또는 소변 표본일 수 있다.
타우 및/또는 병리적으로 개질된 및/또는 응집된 타우 수준은, 예로 타우를 웨스턴 블롯, 면역침전, 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 형광 활성화 세포 정렬(FACS), 2차원 겔 전기영동, 질량 분광측정(MS), 기질-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간-MS(MALDI-TOF), 표면-증강 레이저 탈착 이온화-비행시간(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC)에 이은 일렬 질량 분광측정(MS/MS), 및 레이저 밀도측정으로부터 선택된 하나 이상의 기법에 의해 분석하는 단계를 포함하는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 타우의 상기 생체 내 조영은 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 조영 또는 자기 공명 조영(MRI)을 포함한다.
본 발명에 따라 채택될 수 있는 항체 및 관련 수단을 이용한 타우병증 질환, 예컨대 알츠하이머 질환의 진단 방법, 타우병증 질환 진행의 모니터링 방법, 및 타우병증 질환 치료의 모니터링 방법은 또한 국제 출원 WO93/08302, W094/13795, WO95/17429, WO96/04309, WO2002/062851 및 WO2004/016655에 기재되어 있다. 유사하게, 타우에 대한 항체 기반 검출 방법은 국제 출원 WO2005/080986에 기재되어 있으며, 전체의 개시 내용이 본원에 참조로 도입된다. 이들 방법은 기재된 바와 같이, 그러나 본 발명의 타우 특이적 항체, 결합 단편, 유도체 또는 변이체와 함께 적용될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 임의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 타우 에피토프를 갖는 펩티드에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 이러한 펩티드는 서열 목록 번호 6의 잔기 125-131, 397-441, 226-244, 217-227, 37-55, 387-406, 421-427, 427-439, 1-158, 197-207, 57-67, 355-441, 313-319, 309-319, 221-231, 및 이들의 임의 조합, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 이들의 개질된 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성되며, 여기서 펩티드는 본 발명의 임의 항체에 의해 인식된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 이러한 펩티드는 대상체에서 신경변성 타우병증의 진단을 위해 이용될 수 있고, 상기 대상체의 생물학적 표본 중 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하고, 본 발명의 상술된 펩티드를 인식하는 항체 수준을 측정하고 비슷한 연령 및 성별의 건강한 대상체에서 확인되는 수준에 대해 측정치를 비교하여 상기 대상체에서 타우병증의 진단을 위해 이용하는 단계를 포함한다. 본 발명의 상기 펩티드에 대해 특이적인 측정된 항체의 수준 상승은 상기 대상체에서 타우병증의 진단을 시사할 것이다. 본 발명의 펩티드는 각각 이전에 기재된 바와 같이 어레이, 키트 및 조성물로 제형화될 수 있다.
이들 및 다른 구현예가 본 발명의 설명 및 실시예에 개시되며 포괄된다. 본 발명에 따라 채용될 재료, 방법, 용도 및 화합물 중 임의 하나에 관한 추가 문헌은, 예를 들어 전자 장치를 이용해서 공개 라이브러리 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들어, NIH의 National Center for Biotechnology Information 및/또는 National Library of Medicine에 의해 호스팅되는 공개 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있다. 추가 데이터베이스 및 웹 주소, 예컨대 EMBL(European Molecular Biology Laboratory)의 일부인 EBI(European Bioinformatics Institute)가 당분야 숙련가에게 공지되어 있고 또한 인터넷 검색 엔진을 이용해서 수득될 수 있다. 후행적 검색 및 현재의 인식에 유용한 특허 정보의 관련 출처 조사 및 생물기술의 특허 정보에 대한 개론은 [Berks, TIBTECH 12(1993), 352-364]에 제공된다.
상기 개시는 본 발명을 일반적으로 설명한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 이용된 용어는 [Oxfored Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2]에 제공된 정의로서 제공된다. 몇몇 문헌은 본 명세서 텍스트에 걸쳐 언급된다. 전체 서지 인용은 특허청구범위 바로 앞의 명세서 말미에서 찾아볼 수 있다. 모든 언급된 참고문헌(본 출원 및 제조업체의 명세, 지침 등에 걸쳐 언급되는 문헌 참조, 허여된 특허, 공개 특허 출원 포함)의 내용은 본원에서 명시적으로 참조로 포함된다; 그러나 인용된 임의 문헌이 본 발명에 대해 실제로 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
보다 완전한 이해는 단지 예시 목적으로 본원에 제공되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아닌 하기 구체적 실시예를 참조하여 수득될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 하기 실시예에서의 실험은 클로닝된 항체 NI-105.4E4, NI-105.24B2 및 NI-105.4A3, 즉 인간 가변 중쇄 및 경쇄의 생식계열(GL) 서열에 대해 조정되지 않은 틀 1(FR1) Ig-가변 영역에 대해 예시되고 기재된다; 도 1을 참고하라.
재료 및 방법
통상적 방법, 예컨대 본원에 채용된 것들의 상세한 설명은 언급된 문헌에서 찾아볼 수 있다; 또한 그 내용의 전문이 참조로 본원에 도입된 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. edited by Beers and Berkow(Merck & Co., Inc. 2003)] 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0087861을 참고하라.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자삽입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적 기법을 채용할 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 일반 기법의 추가 내용에 대해, 실시자는 세포 생물학 및 조직 배양의 표준 교과서 및 리뷰를 참조할 수 있다; 또한 실시예에 언급된 참고문헌을 참고하라. 분자 및 세포 생화학에서의 일반 방법은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II(Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization(Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells(Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition(Ausubel 등, eds.); 및 Recombinant DNA Methodology(Wu, ed., Academic Press), Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Method In Enzymology, Vols. 154 and 155(Wu 등, eds.); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods(Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy(Wagner 등 eds., Academic Press 1999); Viral Vectors(Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual(Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]과 같은 표준 교과서에서 찾아볼 수 있다. 본 개시에서 언급되는 유전 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 상업적 공급업체, 예컨대 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech에서 입수 가능하다. 세포 배양 및 배지 수집에서의 일반 기법은 [Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu 등, Curr. Opin. Biotechnol. 8(1997), 148); Serum-free Media(Kitano, Biotechnology 17(1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture(Curr. Opin. Biotechnol. 2(1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells(Birch 등, Bioprocess Technol. 19(1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel 등, CHAOS 11(2001), 98-107]에 요약되어 있다.
타우 -특이적 B-세포의 확인 및 각 항체의 클로닝 방법
아래에 달리 나타내지 않는 한, 타우-특이적 B 세포의 확인 및 관심 특이성을 나타내는 항-타우 항테의 분자 클로닝뿐만 아니라 이들의 재조합 발현 및 기능적 특징은 그 개시 내용의 전문이 본원에 참조로 도입되는 WO2008/081008로 공개된 국제 출원 PCT EP2008/000053의 실시예 및 보충 방법에 기재되었고 일반적으로 이와 같이 수행될 수 있다. 또한 그 내용의 전문이 본원에 참조로 도입된 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0087861을 참고하라. 타우-특이적 B 세포의 확인 및 관심 특이성을 나타내는 타우 항체의 분자 클로닝뿐만 아니라 이들의 재조합 발현 및 기능적 특징분석을 위한 새로운 방법이 본 출원 내에 제공된다. 상술된 바와 같이 본 발명의 하나의 구현예에서, 단일 또는 올리고클로날 B-세포의 배양물이 배양되고, 상기 B-세포에 의해 생산된 항체를 함유하는 배양 상청액이 내부의 새로운 항-타우 항체의 존재 및 친화도에 대해 스크리닝된다. 스크리닝 절차는 감수성 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석 단계, 예컨대 그 개시 내용이 본원에 참조로 도입되고 도 3에 나타낸 국제 출원 WO 2004/095031에 기재된 단계; 실시예 2에 기재된 PHF타우로의 결합에 대한 뇌 추출물 상의 스크리닝 단계; 항체 NI-105.4E4에 대한 에피토프 확인 실험으로 인해 인산화되지 않은 펩티드를 갖는 실시예 3에 기재된 것과 유사한 상기 서열의 아미노산 Ser-202 및 Ser-205 상에; 아미노산 Thr-231 상에; 및/또는 아미노산 Ser-396 및 Ser-404 상에 포스페이트기를 갖는 서열 목록 번호 6으로 나타내는 아미노산 서열의 타우에서 유래된 펩티드의 결합에 대한 스크리닝 단계; 서열 목록 번호 6으로 나타낸 아미노산 서열의 전장 타우의 결합에 대한 스크리닝 단계 및 실시예 1에 기재되고 국제 특허 WO2008/081008에 기재된 바와 같이 결합이 검출되는 항체 또는 상기 항체를 생산하는 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
항원의 정제
재조합 인간 타우40을 rPeptide(Bogart, GA, USA)에서 구매하였다. PHF타우를 AD 뇌로부터 추출하였다.
병리적으로 인산화된 타우 잔섬유(PHF타우)를 함유하는 페어 형성 나선 잔섬유의 단리를 개질을 포함하여 Goedert 등(Goedert 등, Neuron 8(1992), 159-168)에 의한 방법에 따라 수행하였다. 1g의 AD 뇌 조직을 모든 가시적인 혈관을 제거하고 5mm 절편으로 절단하였다. 조직을 40ml 빙냉 세척 용액(100mM Tris pH 7.4, 6mM EGTA, 1mM Na3VO4 및 1mM NaF)으로 3회 세척한 뒤 20ml 용해 완충액(10mM Tris pH 7.4, 0.8M NaCl, 1mM EGTA, 1x프로테아제 저해제 칵테일, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1mM AEBSF, 10% 수크로오스)으로 균질화하였다. 균질액을 20분 동안 4℃, 20,000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 1%(w/v)로 N-라우로일 사르코시네이트(Sigma, Switzerland)를 부가하여 수집하였다. 진탕하면서 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 상청액을 1시간 동안 4℃, 100,000xg에서 원심분리하였다. 펠렛을 수집하고 PBS 중에 재현탁하였다. 단백질 A 자기 비드로 가능한 오염 면역글로불린을 세척 제거한 후, 이용 전까지 PHF타우 현탁액을 -80℃에 보관하였다. 건강한 대조군 인간 뇌 조직으로부터의 대조군 추출물을 이에 따라 제조하였다.
인간 타우 항체 스크리닝
ELISA:
96웰 절반 면적 마이크로플레이트(Corning)를 4℃에서 하룻밤 동안 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(pH 9.6) 중 1㎍/ml 표준물질 농도의 재조합 타우 단백질(rPeptide, Bogart, USA)로 코팅하였다. PHF타우 스크리닝을 위해, 96웰 고정장치 마이크로플레이트(Nunc, Denmark)를 4℃에서 하룻밤 동안 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(pH 9.6) 중 1:100의 희석도로 인간 AD 뇌로부터 추출된 PHF타우로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T pH 7.6 중에 세척하고, 비-특이적 결합 부위를 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland)를 함유하는 PBS-T로 RT에서 2hr 동안 차단하였다. B 세포 컨디셔닝된 배지를 메모리 B 세포 배양 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮기고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T 중에 세척한 뒤 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP)-콘주게이트된 당나귀 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적) 폴리클로날 항체(Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)와 인큐베이션하였다. PBS-T로의 세척 후, 표준 비색측정 분석에서 HRP 활성의 측정에 의해 인간 항체의 결합을 결정하였다.
MULTI-ARRAY ® 마이크로플레이트 스크리닝
표준 96웰 10-스팟 MULTI-SPOT 플레이트(Meso Scale Discovery, USA)를 PBS 중 30㎍/ml r타우(rPeptide), PHF타우 뇌 추출물 및 건강한 대조군 뇌 추출물로 코팅하였다. 비-특이적 결합 부위를 3% BSA를 함유하는 PBS-T로 RT에서 1hr 동안 차단한 뒤 RT에서 1hr 동안 B 세포 컨디셔닝된 배지와 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T 중에 세척한 뒤 SULFO-태그 콘주게이트된 항-인간 폴리클로날 항체(Meso Scale Discovery, USA)와 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척 후, 결합된 항체를 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery, USA)을 이용한 전기화학발광 측정으로 검출하였다.
타우 항체의 분자 클로닝
메모리 B 세포를 함유한 표본을 건강한 인간 대상체로부터 수득하였다. 선택된 메모리 B 세포 배양의 살아있는 B 세포를 수확하고 mRNA를 제조한다. 이어서 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 네스트화 PCR 접근을 이용해서 수득한다.
인간 면역글로불린 생식계열 레퍼토리의 모든 서열 패밀리를 나타내는 프라이머 조합을 리더 펩티드, V-절편 및 J-절편의 증폭을 위해 이용한다. 첫 번째 회의 증폭은 5'-말단에서 리더 펩티드-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 불변 영역-특이적 프라이머를 이용해서 수행한다(Smith 등, Nat Protoc. 4(2009), 372-384). 중쇄 및 카파 경쇄에 있어서, 두 번째 회의 증폭을 5'-말단에서 V-절편-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 J-절편-특이적 프라이머를 이용해서 수행한다. 람다 경쇄에 있어서, 두 번째 회의 증폭을 5'-말단에서 V-절편-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 C-영역-특이적 프라이머를 이용해서 수행한다(Marks 등, Mol. Biol. 222(1991), 581-597; de Haard 등, J. Biol. Chem. 26(1999), 18218-18230).
원하는 특이성을 갖는 항체 클론의 확인은 완전 항체의 재조합 발현 시 ELISA 상의 재스크리닝에 의해 수행한다. 완전 인간 IgG1 항체 또는 키메라성 IgG2a 항체의 재조합 발현은 적절한 불변 도메인(들)을 인코딩하는 서열로 3'-말단에서 그리고 5'-말단에서 리더 펩티드를 인코딩하는 서열로 가변 영역 서열을 보완하는 발현 벡터 내로 "정확한 해독틀에" 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 삽입 시 달성된다. 그 목적을 위해, 프라이머는 항체 발현 벡터 내로 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 클로닝을 촉진하기 위해 설계된 제한효소 부위를 함유하였다. 중쇄 면역글로불린은 신호 펩티드 및 인간 면역글로불린 감마 1 또는 마우스 면역글로불린 감마 2a의 불변 도메인을 보유하는 중쇄 발현 벡터 내로 틀 내에 면역글로불린 중쇄 RT-PCR 산물을 삽입하여 발현된다. 카파 경쇄 면역글로불린은 신호 펩티드 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린의 불변 도메인을 제공하는 경쇄 발현 벡터 내로 틀 내에 카파 경쇄 RT-PCR-산물을 삽입하여 발현된다 람다 경쇄 면역글로불린은 신호 펩티드 및 인간 또는 마우스 람다 경쇄 면역글로불린의 불변 도메인을 제공하는 람다 경쇄 발현 벡터 내로 틀 내에 람다 경쇄 RT-PCR-산물을 삽입하여 발현된다.
기능적 재조합 모노클로날 항체는 Ig-중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig-경쇄 발현 벡터의 HEK293 또는 CHO 세포(또는 인간 또는 마우스 기원의 임의의 다른 적절한 수신체 세포주) 내로의 공동-전달감염 시 수득된다. 재조합 인간 모노클로날 항체는 이후 표준 단백질 A 컬럼 정제를 이용해서 컨디셔닝된 배지로부터 정제된다. 재조합 인간 모노클로날 항체는 일시적으로 또는 안정적으로 전달감염된 세포를 이용해서 무제한의 양으로 생산될 수 있다. 재조합 인간 모노클로날 항체를 생성하는 세포주는 Ig-발현 벡터를 직접 이용해서 또는 Ig-가변 영역을 상이한 발현 벡터 내로 재클로닝하여 구축될 수 있다. 유도체, 예컨대 F(ab), F(ab)2 및 scFv도 이들 Ig-가변 영역으로부터 생성될 수 있다.
항체
마우스 모노클로날 항-인간 타우 항체 타우12(Covance, California, U.S.A.) 및 마우스 모노클로날 타우 항체 AT180(Thermo Scientific, U.S.A.)을 제조업체의 프로토콜에 따라 이용하였다. 재조합 인간 타우 항체 NI-105.4E4, NI-105.24B2 및 NI-105.4A3은 그 내용의 전문이 본원에 참조로 도입되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0087861에 기재되어 있다. 재조합 인간 타우 항체 NI-105.17C1, NI-105.17C1(N31Q), NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 및 NI-105.9C4는 본 발명의 항체이다. 이들은 달리 언급되지 않는 한 HEK293 또는 CHO 세포에서 발현되고, 컨디셔닝된 배지로부터 정제되고, 후속 적용에서 직접 이용되었다.
직접적 ELISA
96 웰 마이크로플레이트(Costar, Coming, USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(50mM, pH 9.6) 중 1㎍/ml 농도로 희석된 재조합 타우 단백질(h타우40, rPeptide, Bogart, USA)로 코팅하였다. 비-특이적 결합 부위를 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland) 및 0.5% Tween20을 함유하는 PBS로 RT에서 2hr 동안 차단하였다. 본 발명의 인간 항체의 결합은 HRP 콘주게이트된 염소 항-인간 IgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)에 이어, 표준 비색측정 분석에서 HRP 활성의 측정을 이용하여 결정하였다. EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, USA)를 이용해서 비-선형 회귀에 의해 산정하였다.
웨스턴 블로팅 단백질 염색
PHF타우 및 재조합 h타우40을 구배 SDS-PAGE(NuPAGE 4-12%; Invitrogen, Basel, Switzerland)에 이어 니트로셀룰로오스막 상의 전기블로팅에 의해 분해하였다. 실온에서 1시간 동안 2% BSA를 이용한 비-특이적 결합의 차단 후, 블롯을 일차 인간 항-타우 항체 또는 타우12(마우스 모노클로날 항체, Covance, California, U.S.A.)에 이어 HRP-콘주게이트된 염소 항-인간 IgGFcγ(인간 일차 항체에 있어서) 또는 HRP-콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG 이차 항체와 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
블롯을 ECL 및 ImageQuant 350 검출(GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland)을 이용해서 전개하였다.
AD 뇌로부터의 PHF타우 추출
병리적으로 인산화된 타우 잔섬유(PHF타우)를 함유하는 페어 형성 나선형 잔섬유의 단리를 개질을 포함하는 [Goedert 등(Goedert 등, Neuron 8(1992), 159-168)]의 방법에 따라 수행하였다. 1g의 AD 뇌 조직을 모든 가시적인 혈관을 제거하여 5mm 절편으로 절단하였다. 조직을 40ml 빙냉 세척 용액(100mM Tris pH 7.4, 6mM EGTA, 1mM Na3VO4 및 1mM NaF)으로 3회 세척한 뒤 20ml 용해 완충액(10mM Tris H 7.4, 0.8M NaCl, 1mM EGTA, 1x프로테아제 저해제 칵테일, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1mM AEBSF, 10% 수크로오스)으로 균질화하였다. 균질액을 20분 동안 4℃, 20'000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 1%(w/v)로 N-라우로일 사르코시네이트(Sigma, Switzerland)를 부가하며 수집하였다. 진탕하면서 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 상청액을 1시간 동안 4℃, 100'000xg에서 원심분리하였다. 펠렛을 수집하고 PBS 중에 재현탁하였다. 단백질 A 자기 비드로 가능한 오염 면역글로불린을 세척 제거 후, PHF타우 현탁액을 이용 전까지 -80℃에 보관하였다. 건강한 대조군 인간 뇌 조직으로부터의 대조군 추출물을 그에 따라 제조하였다.
타우 펩티드 합성
Pepspot 맵핑에 의해 확인된 NI-105.4E4의 에피토프(아미노산 337-343)를 포함하는 h타우40(333GGGQVEVKSEKLDF346)의 아미노산 333-346에 해당하는 펩티드를 Schafer-N(Copenhagen, Denmark)에 의해 합성하였다. 추가 시스테인을 C-말단에 부가하여 고정화장치 마이크로플레이트(Nunc, Denmark)로의 공유 결합을 허용하였다. 인간 타우의 아미노산 226-239에 해당하는 두 번째 펩티드(226VAVVRpTPPKSPSSA239), 시판 마우스 모노클로날 타우 항체 AT180(Thermo Scientific, USA)의 인지체 에피토프를 이에 따라 합성하고 대조군으로 이용하였다.
유전자삽입 마우스
타우병증에 대한 3 상이한 동물 모델을 이용하여 본 발명의 타우 항체(및 이들의 결합 특이성을 갖는 분자)를 검증한다.
1. 유전자삽입 타우P301L 마우스(라인183): 쥐과 Thy 1.2 프로모터 하에 P301L 돌연변이를 갖는 인간 타우40을 발현함(이들 유전자삽입 동물의 생성은 그 개시 내용이 본원에 참조로 도입되는 Goetz et at, J. Biol. Chem. 276(2001), 529-534 및 국제 출원 WO 2003/017918에 기재되어 있다) .
2. 쥐과 PrP 프로모터 하에 P301L 돌연변이를 갖는 최단형 4R 인간 타우 이소형을 발현하는 JNPL3 마우스(Taconic, Hudson, NY, U.S.A에서 입수 가능함).
3. 쥐과 PrP 프로모터 하에 P301S 돌연변이를 갖는 인간 타우를 발현하는 P301S타우(라인 PS19) 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, U.S.A에서 입수 가능함),
타우병증 마우스 모델 및 대응하는 야생형 마우스를 음식 및 물에 자유롭게 접근시키면서 역전된 12h:12h 명/암주기 상에서 표준 수용 조건 하에 유지한다. 치료군은 성별 및 연령에 대해 균형을 맞춘다.
실시예 1
인간 타우-항체의 표적 및 결합 특이성의 검증
단리된 항체의 인식된 표적으로서의 타우를 검증하기 위해, 직접적 ELISA 분석을 상술된 바와 같이 수행하였다. 예시적인 재조합 인간 NI-105.4A3 항체에 있어서, 96웰 마이크로플레이트(Costar, Corning, USA)를 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(pH 9.6) 중 BSA 또는 3㎍/ml 농도로 희석된 재조합 인간 타우(h타우40, rPeptide, Bogart, USA)로 코팅하고, 항체의 결합 효율을 평가하였다. 예시적인 NI-105.4A3 항체는 ELISA에 의해 인간 타우에 특이적으로 결합하였다. BSA에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
예시적인 항체 NI-105.4E4 및 NI-105.24B2의 절반 최대 유효 농도(EC50)의 결정을 위해, 다양한 항체 농도로 추가적인 직접적 ELISA 실험을 수행하였다. 96웰 마이크로플레이트(Costar, Corning, USA)를 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액 중 1㎍/ml(NI-105.4E4 항체를 이용한 분석을 위해), 또는 3㎍/ml(NI-105.24B2 항체를 이용한 분석을 위해) 농도로 희석된 재조합 인간 타우(h타우40, rPeptide, Bogart, USA)로 코팅하고, 항체의 결합 효율을 평가하였다. EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 비-선형 회귀에 의해 산정하였다. 재조합 인간-유래 항체 NI-105.4E4는 낮은 나노몰 농도 범위의 높은 친화도로 2.4nM EC50로 h타우40에 결합하였다. NI-105.24B2는 낮은 나노몰 농도 범위의 높은 친화도로 6.6nM EC50로 h타우40에 결합하였다.
예시적인 항체 NI-105.4A3의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 또한 직접적 ELISA 실험을 이용해서 결정하였다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 타우(h타우40, 1ug/ml), PHF타우(1:100) 및 대조군 제조물(1:100)로 코팅하고, 다양한 항체 농도로 인큐베이션하였다. NI-105.4A3은 낮은 나노몰 농도 범위의 높은 친화도로 1.4nM EC50로 r타우에 결합하였다. NI-105.4A3은 낮은 나노몰 농도 범위의 높은 친화도로 1.2nM EC50로 PHF타우에 결합한다.
실시예 2
AD 뇌에서 추출된 재조합 타우 및 병리적 타우에 대한 재조합 인간 항체 결합 분석
AD 뇌에서 추출된 병리적 타우종에 대한 NI-105.4E4 및 NI-105.24B2의 결합능을 결정하기 위해, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 상술된 바와 같이 수행하였다. 블롯을 하룻밤 동안 일차 항체 NI-105.4E4(인간), NI-105.24B2(인간) 또는 타우12(마우스 모노클로날 항체, Covance, California, U.S.A.), 이어서 HRP-콘주게이트된 염소 항-인간 IgGFcγ(인간 항체에 대해) 또는 HRP-콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG 이차 항체와 인큐베이션하였다.
재조합 항체 NI-105.4E4 및 NI-105.24B2는 웨스턴 블롯 상에서 재조합 h타우40 뿐만 아니라 AD 뇌로부터 추출된 병리적으로 개질된 PHF타우를 인식하였다. 대조군 항체 타우 12도 두 타우종을 인식하였다.
추가적으로 상기 실시예 1에서 논의된 바와 같이, 예시적인 항체 NI-105.4A3의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 PHF타우를 이용해서 직접적 ELISA 실험에서 결정하였다. NI-105.4A3은 낮은 나노몰 농도 범위의 높은 친화도로 1.2nM EC50로 PHF타우에 결합하였다.
실시예 3
h타우40 상에서 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3 결합 에피토프의 맵핑
두 인접 펩티드 간에 11 아미노산의 중첨을 갖는 전장 h타우40(아미노산 1-441)을 커버하는 118 펩티드 서열의 펩티드 어레이를 니트로셀룰로오스막(JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany) 상에 스폿팅하였다. 항체의 면역표지뿐만 아니라 막 재생을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 검출 항체의 비-특이적 결합을 배제하기 위해, 막을 먼저 HRP-콘주게이트된 염소 항-인간 IgG를 탐침으로 하여 일차 항체를 제외하였다. 재생 후, 막을 100nM 재조합 NI-105.4E4 항체를 탐침으로 하였다. 결합된 항체를 ECL 및 ImageQuant 350 검출(GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland)을 이용해서 검출하였다.
검출 항체 단독에 비해, 인접한 펩티드 스팟의 2 그룹(펩티드 83, 84 및 85; 펩티드 96 및 97)이 NI105.4E4에 의해 특이적으로 확인되었다. 이들 2 그룹의 펩티드로 커버된 서열은 h타우40의 아미노산 329-351 및 387-397에 해당한다. 이들 데이터는 NI-105.4E4가 하나는 R4 미세소관 결합 도메인 내에 그리고 다른 하나는 C-말단 도메인에 있는 두 선형 서열을 포함하는 불연속 에피토프를 인식함을 제시하였다.
펩티드 83-85에 의해 공유되는 서열은 h타우40의 아미노산 잔기 337-343을 포함한다. Pepspot(JPT) 데이터는 NI-105.4E4가 인간 타우의 아미노산 337-343을 포함하는 h타우 내 에피토프를 인식함을 제시하였다. 상기 영역은 타우의 미세소관 결합 도메인 내에 위치하며, 모든 뉴론의 인간 타우 이소형뿐만 아니라 마우스 및 래트를 포함하는 다른 종에 걸쳐 보존된다.
상기 도메인이 생리적 미세소관-연관 타우에서 미세소관에 결합되므로, NI-105.4E4는 미세소관에서 탈착되는 타우의 병리적 관련 풀을 선호적으로 표적화하는 것으로 예상된다.
NI-105.4E4 결합 펩티드 내의 주요 잔기를 결정하기 위해, 알라닌 스캐닝을 수행하여 각 잔기를 한 번에 하나씩 알라닌으로 치환하였다. 원래 서열에서의 알라닌 잔기(A384 및 A390)는 프롤린 및 글리신으로 치환하였다. 스팟 35-50 및 51-68은 원래 펩티드(스팟 35 및 스팟 51) 및 이들의 알라닌 치환된 변이체이다. 알라닌 스캔은 V339, E342, D387, E391 및 K395가 NI-105.4E4 결합을 위해 필요함을 제시하였다.
타우 펩티드에 대한 NI-105.4E4의 결합을 평가하여 추가 실험을 수행하였다. 직접적 ELISA는 NI-105.4E4가 h타우40의 아미노산 333-346에 해당하는 펩티드를 특이적으로 인식함을 나타내었고, 이는 Pepspot 맵핑에 의해 확인되는 아미노산 잔기 337-343을 함유한다. AT180 에피토프를 커버하는 대조군 펩티드에 대한 NI-105.4E4의 교차-반응성은 관찰되지 않았다. 반대로, AT180은 그 인지체 에피토프 함유 펩티드를 인식하였지만, NI-105.4E4 특이적 펩티드에 결합하지 못했다. 종-특이적 이차 항체는 어느 펩티드에도 결합하지 않았다. 종합하면, 코팅된 펩티드를 이용한 직접적 ELISA로 NI-105.4E4가 Pepspot 맵핑에 의해 확인되는 인간 타우의 아미노산 잔기 337-343을 함유하는 펩티드를 특이적으로 인식함을 확인하였다.
h타우40 상에 NI-105.4A3 결합 에피토프를 거시적으로 맵핑하기 위해, 4 타우 도메인 폴리펩티드(타우 도메인 I, 도메인 II, 도메인 III 및 도메인 IV)를 생산하였다. GeneArt®(Invitrogen)를 이용해서 합성되고 N-말단에 6xHis 태그화된 각각의 타우 도메인을 인코딩하는 DNA 단편을 pRSET-A 발현 벡터(invitrogen) 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21(DE3)(New England Biolabs) 내로 전달감염시켰다. 박테리아를 초음파 분쇄를 이용해서 리소자임으로 용해시키기 전에 His-태그화된 타우 도메인의 발현을 6시간 동안 IPTG로 유도하였다. Ni-NTA Superflow 컬럼(Qiagen)으로 추가 정제하기 전에 용해액을 5분 동안 끓였다. 용출된 His-태그화 타우 도메인을 ELISA 플레이트 상에 코팅하거나 웨스턴 블롯을 위해 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하였다. 이러한 순차적으로 중첩되는 타우 도메인 폴리펩티드가 h타우40의 전장을 커버하였다. 정제된 타우 도메인을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, NI-105.4A3의 결합을 평가하였다. NI-105.4A3은 타우 도메인 I 및 전장 h타우40에만 결합하여, 에피토프가 h타우40(aa 1-136)의 N-말단 부분 내에 있음을 시사하였다. 웨스턴 블롯으로 NI-105.4A3의 타우 도메인 I에 대한 특이적 결합을 확인하였다. Pepspot(JPT) 기술을 이용한 NI-105.4A3 에피토프 맵핑으로 인간 타우40의 아미노산 Q35-Q49를 확인하였다. NI-105.4A3 결합을 위한 에피토프 내의 중요 잔기를 결정하기 위해, 알라닌 스캐닝을 수행하여 각 잔기를 한 번에 하나씩 알라닌으로 치환하였다. 원래 서열에서의 알라닌 잔기(A41)는 글리신 또는 프롤린으로 치환하였다. 알라닌 스캔은 D40, A41 및 K44가 NI-105.4A3 결합을 위해 중요 잔기임을 나타내었다.
실시예 4
생리적 형태뿐만 아니라 타우 AD 뇌 조직 및 인간 타우 유전자삽입 마우스에서의 병리적 응집물에 대한 NI-105.4E4의 결합 평가
고인산화된 타우 잔섬유로 이루어진 신경섬유 매듭(NFT)은 AD의 신경병리적 지표이다. 고인산화된 타우 잔섬유는 또한 둘 다 AD에서의 일반적 신경병리적 특성인 비정상조직 신경돌기 및 신경망 맥의 주성분이다. 마우스에서 선천성 P301L 타우 돌연변이를 함유하는 인간 타우의 과발현은 6개월령에 NFT 형성을 유도한다(Gotz 등, 2001a).
타우의 생리적 형태뿐만 아니라 병리적 응집물에 대한 재조합 인간 타우 항체의 결합을 평가하기 위해, 본 발명의 예시적인 NI-105.4E4 항체로 AD 뇌 조직 및 타우P301L 유전자삽입 마우스에서 면역조직학적 염색을 수행하였다.
마우스를 깊은 마취 하에 실온에서 20ml 100mM TrisCl/6mM EGTA(pH7.4)를 관류시켰다. 뇌를 꺼내고 고정을 위해 하룻밤 동안 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중 4% PFA에서 침지한 뒤 파라핀에 임베딩하였다. 인간 조직에 있어서, AD 및 건강한 대조군 대상체로부터의 뇌 조직 파라핀 블록을 이용하였다. DAB 염색을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 양성 대조군으로, 마우스 모노클로날 항체 타우-12(Covance, California, U.S.A.)를 이용하였다. 일차 항체 없이 HRP-콘주게이트된 검출 항체도 포함시켰다.
재조합 인간 항체 NI-105.4E4는 AD 뇌에서 여러 NFT 및 신경망 맥을 확인하였고(도 2a), 이는 건강한 대조군 뇌에서는 없었다(도 2b). 이차 항체만으로는 AD(도 2c) 및 대조군 뇌(도 2d) 모두에서 신호를 내지 않았다. P301L 타우 유전자삽입 마우스 뇌에서, NI-105.4E4는 NFT(도 2e, f 및 h), 신경망 맥(도 2e 및 g) 및 비정상조직 신경돌기(도 2e 및 h)와 유사한 병리적 타우에 강하게 결합하였다. 또한, NI-105.4E4도 매듭-전 단계에 타우 응집물을 확인하였다(도 2i). 인간 P301L 타우 및 스웨덴 및 북극 돌연변이를 갖는 인간 APP를 모두 과발현하는 유전자삽입 마우스의 뇌에서, NI-105.4E4는 베타-아밀로이드 플라크 주위의 비정상조직 신경돌기에 특이적으로 결합하였다(도 2j).
실시예 5
본 발명의 항체의 생체 내 평가
이미 상술된 바와 같이, 인산화된 타우 펩티드를 이용한 능동 백신접종을 이용한 유전자삽입 마우스 라인에서의 연구는 뇌에서 타우 응집물의 뇌 수준 감소 및 거동 손상의 진행 완화를 드러내었다(Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15(2008), 157-168; Boimel 등, Exp. Neurol. 224(2010), 472-485). 그러나 능동 백신접종은 고령 집단의 상당부가 백신접종에 대해 비반응자로 예상되기 때문에, 특히 인간에서는 이용 불가능할 수 있다. 또한, 타우-지정 면역 반응에 연관된 잠재적 부작용은 조절하기 어려울 수 있다. 본 발명의 타우 결합 분자는 병리적 타우종에 대한 이들의 유사한 결합 특이성으로 인해, 마우스 항체에 대해 상술된 바와 같은 타우 응집물의 뇌 수준에서 유사한 감소를 달성할 것으로 합리적으로 예상될 수 있다. 그러나 인간 면역계 내의 진화적 최적화 및 친화도 성숙으로 인해, 본 발명의 항체는 뛰어난 안전성 프로필 및 면역원성의 부재에 대한 높은 개연성을 가지며 건강한 인간 대상체로부터 단리되는 것으로 인해 귀중한 치료 도구를 제공한다. 이러한 예상된 치료 효과의 확인은 마우스 항체를 이용해서 상기 언급된 실험에 기재된 바와 같은 평가 방법에 의해 제공될 수 있다. 특히 스크리닝될 항체는 동물로의 다양하고 가능한 경로 상에, 예컨대 복강 내 항체 주사, 두개 내 주사, 뇌실 내 뇌 주입으로 적용되고 치료 효과에 대해 평가될 수 있다. 상기 언급된 어느 하나의 적용 가능성이 또한 베타 아밀로이드 유도된 타우 병리에 대한 치료 효과를 평가하기 위해 타우 유전자삽입 마우스의 뇌 내로 베타-아밀로이드 제조물의 사전 뇌 주사 후 이용될 수 있다.
치료 효과의 평가는 Gallyas 양성 세포수의 정량, 총 인간 타우 염색, 인산화된 타우의 뇌 부담 및/또는 순차적 뇌 추출 시 뇌 가용성 및 불용성 타우 및 인산화-타우 수준의 생화학적 결정을 포함하는 조직화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한 처리된 마우스의 거동 평가, 예로 본 발명의 항체의 치료 효과 확인을 위한 조건화된 미각 혐오 또는 배경 공포 조건화가 수행될 수 있다(Pennanen, Genes Brain Behav. 5(2006), 369-79, Pennanen Neurobiol Dis. 15(2004), 500-9.)
실시예 6
항체 NI-105.4E4 및 N1-105.4A3와 마우스 IgG2a 불변 도메인의 키메라화
만성 치료 연구에서의 이용을 위해 감소된 면역원성을 갖는 항체를 생성하기 위해, 항체 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3의 마우스 키메라 버전을 재조합 DNA 기술을 이용해서 생성하였다. 마우스 Fc-감마 수용체에 대해 높은 친화도로 결합하고 이에 따라 면역 효과기 반응을 유도할 수 있는 분자를 생성하기 위해, 마우스 IgG2a/람다 이소형을 이들 키메라 항체에 대해 선택하였다. 키메라 NI-105.4E4("ch4E4") 및 키메라 NI-105.4A3("ch4A3") 중쇄 및 경쇄 구축물의 아미노산 서열을 아래에 나타낸다.
표 5: 키메라 NI-105.4E4(ch4E4) 및 키메라 NI-105.4A3(ch4A3)의 아미노산 서열
Figure 112015069089787-pct00011
실시예 7
ch4E4 중쇄(마우스 IgG2a)로부터 공통 N-연관 글리코실화 부위의 제거
공통 N-연관 글리코실화 부위를 NI-105.4E4 중쇄의 CDR1 영역에서 확인하였다. 포유류(CHO) 세포 발현 시, 예측된 N-글리코실화 부위(Asn-30)는 질량 분광측정으로 드러난 바와 같이 글리칸에 의해 완전 점유되었다. 상기 영역에서 N-글리코실화를 제거하고 산물 이질성을 감소시키기 위해, ch4E4 중쇄의 Asn-30을 Gln으로 변화시켰다(표 4). CHO 세포에서 생산되고 정제되면, 개질된 항체는 원래의 글리코실화된 항체에 비해 ~4배 더 높은 겉보기 결합 친화도로 재조합 타우에 결합하였다.
표 6: 성숙 ch4E4(N30Q) 중쇄(마우스 IgG2a)의 아미노산 서열. 치환된 Gln 잔기를 진한 글씨체로 밑줄친다.
Figure 112015069089787-pct00012
실시예 8
비글리코실화 키메라성 NI-105.4E4(N30Q)(ch4E4(N30Q) mIgG1 Agly)의 생산
항체 효과기 기능 및 활성 간 상관관계를 평가하기 위해 생식계열 NI-105.4E4의 마우스 키메라성 비글리코실화 변이체를 생산하였다("ch4E4(N30Q) IgG1-Agly"). 중쇄(서열 목록 214)에 있어서, NI-105.4E4(N30Q)(서열 목록 번호 43)의 가변 도메인을 Asn에서 Gln으로의 돌연변이를 함유하는 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역에 융합하여 공통 Fc 글리코실화 부위를 제거하였다. 중쇄 가변 영역은 CDR1에서 공통 N-글리코실화 부위를 제거하기 위한 N30Q 변화를 함유하였다(실시예 7). 경쇄는 상술된 ch4E4 람다 경쇄였다(서열 목록 21).
실시예 9
인간 4E4 및 4A3의 급성 뇌 투과 연구
인간 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3 생식계열 항체를 CHO 세포의 일시적 전달감염에 의해 생산하고 친화도 정제로 정제하였다. 내독소 수준을 조절하였고 모두 1EU/mg 미만이었다. 타우P301L 마우스에 1일 및 4일에 30mg/kg의 NI-105.4E4(n=7), 4A3(n=7) 항체 또는 동일 부피의 PBS(n=7)를 복강 내 주사하였다. 5일째에 마우스를 1단위/ml 헤파린을 함유하는 PBS로 마취 하에 관류시켰다. 혈액, 뇌 및 척추를 분석을 위해 수집하였다. 뇌의 우반구를 -80℃에서 냉동하였고, 뇌의 좌반구 및 척추를 파라핀 블록에 임베딩하고 절편화하기 전에 2일 동안 4℃에서 10% 중화 포르말린 중에 후고정하였다. 혈장 분취량을 -80℃에 보관하였다.
뇌 단백질 추출: 냉동된 우반구를 칭량하고, 50mM NaCl, 0.2% 디에틸아민, 프로테아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH) 및 포스파타아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH)를 함유하는 5부피(5mL/습식 조직g) 용액 중에 균질화하였다. 이어서 표본을 폴리카르보네이트 튜브로 옮기고, 다른 5부피의 균질화 용액을 첨가하고 30분 동안 얼음 상에 유지하였다. 그 뒤 가용성 분획을 30분 동안 100,000g, 4℃에서 원심분리 후 수집하였다. 상기 가용성 분획을 인간 IgG 분석에서 이용하였다. 펠렛을 프로테아제 및 포스파타아제 저해제를 포함하는 3부피의 PBS 중에 재현탁하였다. 30분 동안 16,000g, 4℃에서 원심분리 후, 상청액 및 펠렛을 추가 불용성 타우 추출을 위해 -80℃에 별도 저장하였다. 펠렛을 개질된 사르코실 추출로 추가 추출하였다(Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159(1992)).
인간 IgG-특이적 샌드위치 ELISA: 50mM 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(pH9.6) 중 2㎍/ml의 염소 항-인간 IgG Fab(Jackson)를 포획 항체로 이용하였다. 절반 면적 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 하룻밤 동안 4℃에서 30㎕/웰의 포획 항체로 코팅하였다. 이어서 플레이트를 1시간 동안 실온에서 2% BSA를 함유하는 50㎕/웰의 PBS와 인큐베이션하기 전에 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 4회 세척하였다. 뇌 추출물, 혈장 표본 및 항체 표준(4A3)의 가용성 분획을 2% BSA 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 중에 희석하였다. 30㎕의 희석된 표본을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 뒤, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 HRP-콘주게이트된 당나귀 항-인간 Fcγ(Jackson, 2% BSA 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 중에 1:10,000으로 희석됨)와 인큐베이션하기 전에 0.1% Tween 20을 함유하는 200㎕/웰의 PBS로 4회 세척하였다. 이어서 20㎕/웰의 TMB(10mM 시트레이트 용액 pH=4.1 중 1:20)를 첨가하기 전에 0.1% Tween 20을 함유하는 200㎕/웰의 PBS로 4회 세척하였다. 이어서 각 웰에 10㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. NI-105.4A3의 연속 희석으로 항체 표준 곡선을 수득하였다. 혈장 및 뇌 표본 내 항체 농도를 표준물질에 따라 계산하였다. 이어서 뇌 인간 IgG 수준을 도 6에 나타낸 바와 같이 항체㎍/신선 뇌 조직g(1g/10ml로 가정)으로 변환하였다.
모든 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3 처리 마우스의 혈장에서 고수준의 인간 IgG가 검출되었다. 대조적으로, PBS 처리 마우스의 혈장에서는 인간 IgG가 검출되지 않았다(도 5). 상당량의 인간 IgG가 4E4 및 4A3 처리 마우스의 뇌 균질액에서 검출되었다(도 6).
실시예 10
키메라성 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3을 이용한 만성 연구
원래 인간 항체의 가변 도메인 및 마우스 IgG2a의 불변 영역을 함유하는 키메라성 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3을 CHO 세포의 일시적 전달감염에 의해 생산하고 친화도 정제에 의해 정제할 수 있었다. 항체의 각 배치에서 내독소 수준을 조절하고 1Eu/mg 미만으로 유지한다. 7.5-8월령의 성별 균형을 맞춘 타우P301L 마우스에 10mg/kg, 3mg/kg의 항체 용액, 또는 동일 부피의 PBS 대조군을 복강 내 주사한다. 각 치료군은 20-25마리 마우스를 갖는다. 치료는 26주 동안 주 1회 수행된다. 대안적으로, 치료는 13주 동안 주 2회 수행된다. 체중을 2주마다 모니터링한다. 마우스를 치료 기간 말기에 마취 하에 관류시킨다. 뇌, 척추 및 혈액을 수집한다. 뇌의 반구와 척추를 파라핀 블록에 임베딩하기 3일 전에 10% 포르말린 중에 후고정할 수 있다. 이들 조직 블록에서 절단된 4-6㎛ 두께 절편을 면역조직화학 연구를 위해 이용할 수 있다. 뇌의 다른 반구를 칭량하고 생화학적 분석을 위해 -80℃에서 급속 냉동하였다.
치료군 및 대조군 표본에서 상이한 용해도 특징을 갖는 신경섬유 매듭(NFT) 수준 및 타우 수준을 비교하여 약물 효과를 평가한다. NFT는 Gallyas 은 함침(F Gallyas Acta Morphol. Acad. Sci. Hung 19.1(1971)) 또는 NFT에서 병리적으로 인산화된 타우를 인식하는 모노클로날 마우스 항체 AT100 및 AT180을 이용한 면역조직화학에 의해 가시화할 수 있다. 항체 처리의 효과를 평가하기 위해, 항체 처리군 마우스 및 대조군 동물에서 뇌 및 척추 내 Gallyas-양성 뉴론 및/또는 AT100, AT180 표지된 뉴론의 수 또는 빈도를 결정할 수 있다.
가용성 및 불용성 타우는 본원에 기재된 뇌 단백질 추출 프로토콜에 따라 추출할 수 있다. 대안적으로, 가용성 및 불용성 타우는 개질된 사르코실 추출로 추출할 수 있다(Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159(1992)). 간략하게, 냉동된 뇌를 10mM Tris·HCl(pH 7.4), 0.8M NaCl, 1mM EGTA, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1mM AEBSF, 프로테아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH) 및 포스파타아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH)로 구성된 10부피(wt/vol)의 10% 수크로오스 균질액 완충액 중에 균질화하였다. 균질액을 20분 동안 20,000g에서 회전 침강시키고, 상청액을 보유하였다. 펠렛을 10부피의 균질화 완충액 중에 균질화하고, 두 번째로 원심분리하였다. 상청액을 함께 풀링하고, N-라우릴-사르코시네이트(Sigma)를 1%(wt/vol) 최종 농도로 첨가하고, 1.5시간 동안 300rpm 회전으로 37℃에서 인큐베이션한 뒤 1h 동안 100,000g에서 원심분리하였다. 상청액을 사르코실 가용성 분획으로 수집하고, 1g의 뇌 조직 펠렛을 PHF 분획으로 0.2ml 50mM Tris·HCl(pH 7.4) 중에 재현탁한다.
가용성 및 불용성 타우 수준을 시판 타우 ELISA 키트(Invitrogen)로 측정한다. 또한, 뇌 단백질 추출물을 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE에 이어 타우12(인간 타우), AT8(pS202/pT205), AT100(pT212/pS214), AT180(pT231) 및 E178(pS396) 항체를 이용한 면역블로팅으로 분리한다. 공지된 양의 타우 표준물질에 대한 각 표본의 적분 밀도를 측정하여 반정량적 분석을 수행한다.
추가적으로, 거동 평가를 상기 실시예 5에 나타낸 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 처리 타우P301L 마우스에서 작업 기억력의 개선을 2-시험 Y-미로 태스크(예로, Pennanen, Genes Brain Behav. 5(2006), 369-79, 본원에 그 전문이 참조로 도입됨)를 이용해서 평가할 수 있다. 미로의 3부문은 22cm 길이, 5cm 폭 및 15cm 깊이이다. 검은색 및 백색의 추상적 단서를 미로 주위의 검은색 커튼 상에 둔다. 암상 동안에는 6lux의 주변 광 수준으로 실험을 수행한다. 각 실험은 훈련 세션 및 관찰 세션을 포함한다. 훈련 세션 동안, 마우스를 3부문 중 2부문(시작 부문 및 두 번째 부문)으로 할당하고, 이는 4분 동안 자유 탐색될 수 있으며, 세 번째 부문(신규 부문)에는 접근할 수 없다. 이어서 마우스를 미로에서 꺼내서 1.5-5분 동안 수용 우리에 유지하면서 미로를 70% 에탄올로 철저히 세정하여 모든 후각적 단서를 제거한다. 그 뒤, 마우스를 모든 3부문이 4분 동안 접근 가능하게 미로에 다시 넣어 관찰하였다. 진입 순서, 각 부문으로의 진입 횟수 및 각 부문에서 소요한 시간을 기록한다. 다른 두 부문(시작 부문 및 두 번째 부문)에서 소요한 평균 시간에 비해 신규한 세 번째 부문에서 소요한 시간의 비를 계산하고, 타우병증 마우스 모델 및 대응하는 대조군 야생형 마우스에서 상이한 치료군 간에 비교한다. 설치류는 전형적으로 이미 방문한 곳으로의 복귀에 비해 미로의 새로운 부문을 조사하는 것을 선호한다. 이들의 장애 관련된 작업 기억력 손상으로 인해 미처리 마우스의 차별되지 않는 거동에 비해 처리된 타우병증 모델 마우스에 의한 상기 선호에 대해 항체의 효과가 모니터링될 수 있다. 그러므로 1에 가까운 비는 손상된 작업 기억력을 시사한다. 더 높은 비는 더 우수한 작업 기억력을 시사한다. 타우P301L 마우스에서 손상된 작업 기억력은 인간 타우의 과발현으로 생성되는 타우 병리로 기인하는 것으로 간주된다. 그러므로 대조군 타우P301L 마우스에 비해 항-타우 항체 처리된 타우P301L 마우스에서 관찰되는 유의미하게 더 높은 비는 항-타우 항체가 타우 병리에 대해 치료 효과를 가짐을 시사할 것이다.
실시예 11
인간 항-타우 항체의 확인.
재조합 인간 타우 항체 NI-105.17C1, NI-105.6C5, NI-105.29G10, NI-105.6L9, NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6E3, NI-105.22E1, NI-105.26B12, NI-105.12E12, NI-105.60E7, NI-105.14E2, NI-105.39E2, NI-105.19C6, 및 NI-105.9C4를 본원에 기재된 방법에 따라 단리하였다. 이들 인간 타우-항체의 표적 및 결합 특이성을 상술된 바와 같이 검증하였다. 발견 내용의 요약을 표 5에 제공한다. NI-105.17C1을 제외한 모든 항체가 생식계열이었다.
표 7: 인간 항-타우 항체의 시험관 내 특징분석
Figure 112015069089787-pct00013
*: h타우40 상의 결합 영역을 PepSPOT, 타우-단편 웨스턴 블롯 및 ELISA, 타우-펩티드 ELISA 및 알라닌 스캐닝의 조합된 접근에 의해 확인하였다.
**: 항체 결합이 타우 단백질 상의 특정 아미노산에서 인산화를 필요로 하는지 여부를 PepSPOT 및 직접적 ELISA 상에서 r타우, PHF타우, 소 내장 포스파타아제에 의해 탈인산화된 PHF타우, GSK3β 또는 GSK3β/CDK5/p35에 의해 시험관 내 인산화된 r타우, 및 인산화된 타우 펩티드에 대한 항체의 결합을 비교하여 확인하였다.
실시예 12
인간 항체와 마우스 IgG2a 불변 도메인의 키메라화
만성 치료 연구에 이용하기 위해 감소된 면역원성을 갖는 항체를 생성하기 위해, 항체 NI-105.17C1("ch17C1"), NI-105.6C5("ch6C5"), NI-105.40E8("ch40E8"), 및 NI-105.6E3("ch6E3")의 마우스 키메라 버전을 재조합 DNA 기술을 이용해서 생성하였다. 마우스 Fc-감마 수용체에 고친화도로 결합하고 이에 따라 면역 효과기 반응을 유도할 수 있는 분자를 생성하기 위해, 이들 키메라 항체에 대해 마우스 IgG2a/람다 이소형을 선택하였다. ch17C1, ch6C5, ch40E8, ch40E8(R104W), 및 ch6E3 중쇄 및 경쇄 구축물의 아미노산 서열을 아래에 나타낸다.
Figure 112015069089787-pct00014
실시예 13
NI-105.17C1 경쇄에서 CDR 글리코실화 부위의 제거.
공통 N-연관 글리코실화 부위를 NI-105.17C1 경쇄의 CDR1 영역에서 확인하였다. 포유류(CHO) 세포 발현 시, 질량 분광측정에 의해 나타난 바와 같이 예측된 N-글리코실화 부위(Asn-31)는 글리칸으로 전체 점유되었다. 상기 영역에서 N-글리코실화를 제거하고 산물 이종성을 개선하기 위해, ch17C1 경쇄의 Asn-31을 Gln으로 변경하였다(하기 서열 참고). CHO 세포에서 생산 및 정제되는 경우, 개질된 항체(ch17C1(N31Q) mIgG2a)는 원래 글리코실화 항체에 비해 유사한 겉보기 결합 친화도로 재조합 타우에 결합하였다(도 8a 참고). NI-105.17C1(N31Q) 경쇄 가변 영역은 서열 목록 번호 221의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure 112015069089787-pct00015
실시예 14
감소된 효과기 기능을 갖는 항체의 생산
중쇄 Fc 도메인의 공통 N-글리코실화 부위 내에 돌연변이를 함유하는 항체 변이체를 생성하였다. 감소된 면역 효과기 기능을 갖는 항-타우 항체를 생성하기 위해 "Agly"로 명명된 이들 변이체를 설계하였다. 타우 항체의 Agly 변이체의 아미노산 서열을 아래에 제공한다.
Figure 112015069089787-pct00016
실시예 15
ch17C1-mIgG2a 및 ch17C1-mIgG1-Agly의 결합 활성 비교.
항체 효과기 기능 및 활성 간 상관관계를 ch17C1 Agly에 대해 평가하였다(도 8a). ch17C1 항체는 ch17C1 중쇄(서열 목록 번호 203), 및 ch17C1 경쇄(서열 목록 번호 204)로 이루어졌다. ch17C1(N31Q) mIgG2a 항체는 ch17C1 중쇄(서열 목록 번호 203), 및 ch17C1(N31Q) 경쇄(서열 목록 번호 212)로 이루어지며, 여기에는 CDR 글리코실화 부위를 제거하기 위해 CDR1에 N31Q 돌연변이가 도입된다. ch17C1(N31Q) mIgG1 Agly 항체는 ch17C1-mIgG1-Agly 중쇄(서열 목록 번호 216)로 이루어지며, 여기서 17C1의 가변 도메인은 공통 Fc 글리코실화 부위를 제거하기 위해 위치 294(Kabat 잔기 297)에서 Asn에서 Gln로의 돌연변이를 함유하는 마우스 IgG1 중쇄, 및 ch17C1(N31Q) 경쇄(서열 목록 번호 212)에 융합된다. CHO 세포에서 생산 및 정제되는 경우, ch17C1(N31Q) mIgG1 Agly는 원래의 글리코실화 항체에 비해 유사한 겉보기 결합 친화도로 재조합 타우에 결합하였다(도 8a 참고).
실시예 16
17C1 경쇄의 위치 48에서 발린 대 이소류신의 비교.
생식계열 항체 NI-105.17C1의 마우스 키메라 IgG2a 버전을 생성하는 절차에서, 경쇄의 잔기 48도 발린에서 이소류신으로 변경되었다. 상기 치환이 NI-105.17C1의 결합 친화도에 영향을 미치지 않았음을 확인하기 위해, 위치 48에 발린을 갖는 NI-105.17C1의 마우스 키메라 IgG2a 버전을 제조하였다. CHO 세포에서 생산 및 정제되는 경우, ch17C1(N31Q, I48V) mIgG2a 항체는 ch17C1(N31Q) mIgG2a에 비해 유사한 겉보기 결합 친화도로 재조합 타우에 결합하였다(도 8b). ch17C1(N31Q) mIgG2a 항체는 ch17C1 중쇄(서열 목록 번호 203), 및 ch17C1(N31Q, I48V) 경쇄(서열 목록 번호 217)로 이루어졌다.
Figure 112015069089787-pct00017
실시예 17
NI-105.40E8의 위치 104에서 Arg 대 Trp의 비교.
페어 형성 인간 나선형 잔섬유(PHF)에서 확인된 타우의 인산화된 형태에 대해 선택적인 항체 NI-105.40E8은 NI-105.40E8 VH의 위치 104에 일반적이지 않은 아르기닌 잔기를 함유한다. 전형적으로 인간 면역글로불린 레퍼토리 내의 상기 위치는 트립토판 잔기에 의해 점유된다. 잔기 Arg104가 트립토판으로 대체된 NI-105.40E8 중쇄의 한 형태인 NI-105.40E8(R104W)-hIgG1을 생성하였다. CHO 세포에서 생산 및 정제되는 경우, NI-105.40E8(R104W)-hIgG1 항체는 NI-105.40E8-hIgG1에 대해 유사한 겉보기 결합 친화도로 인간 PHF 타우에 결합하였다(도 9 참고). 두 항체의 경쇄는 동일하였다.
Figure 112015069089787-pct00018
실시예 18
인간 항-타우 항체는 AD 뇌 및 타우병증의 유전자삽입 마우스 모델의 뇌에서 병리적으로 응집된 타우에 결합한다.
알츠하이머 질환 및 대조군 환자에서 수득된 뇌 조직 표본뿐만 아니라 타우병증의 유전자삽입 마우스 및 야생형 대조군의 뇌 조직 표본을 본원에 기재된 생식계열 인간 항-타우 항체로 염색하였다. 알츠하이머 질환(AD)의 뇌 및 타우병증(Tg)의 유전자삽입 마우스의 뇌에서 병리적 타우 응집물에 대한 생식계열 인간 NI-105.40E8, NI-105.48E5, NI-105.6C5 및 NI-105.17C1 항-타우 항체 결합의 대표 이미지를 도 10에 나타낸다. 이들 항체 중 어느 것도 정신적으로 건강한 대상체(Ctr) 또는 야생형 마우스 뇌(Wt)에서 정상 타우에 결합하지 않는다. 이들 항체 사이의 상이한 패턴은 이들의 에피토프 특이성 및 결합 친화도 차이를 반영하였다.
실시예 19
타우P301L 마우스에서 항체의 뇌 투과.
동물 및 항체 처리: 인간 NI-105.6C5, NI-105.40E8 및 NI-105.6E3 항-타우 항체를 CHO 세포의 일시적 전달감염에 의해 생산하고 표준 방법을 이용해서 정제하였다. 마우스 항원에 대해 교차-반응성을 갖지 않는 인간화된 항체를 이소형 대조군(hIgG1)으로 이용하였다. 첫 번째 실험에서, 주사된 NI-105.6C5, NI-105.6E3 및 hIgG1 항체의 절반을 대략 1:3의 항체:Cy3비로 Cy3(GE Healthcare, PA13105)으로 표지하였다. Cy3-표지는 타우P301L 뇌의 ELISA 및 면역염색으로 확인된 바와 같이 항체 결합을 변화시키지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 두 번째 실험에서, 표지되지 않은 NI-105.6C5 및 NI-105.40E8 항-타우 항체를 이용하였다.
18-22월령의 타우P301L 마우스에 7일 내에 i.p. 주사를 통해 2 용량의 30mg/kg NI-105.6C5, NI-105.6E3 또는 인간 IgG1 이소형 대조군 hIgG1을 투여하였다. 두 번째 투여 후 1일, 8일 및 22일 시점에 각 처리군의 3마리 마우스로부터 조직 표본을 수집하였다. 두 번째 실험에서, 타우P301L 마우스에 7일 내에 30mg/kg h40E8 및 h6C5를 7일 내에 2회 i.p. 주사하고, 조직 표본을 두 번째 주사 후 1일에 이들 마우스로부터 수집하였다.
조직 표본 수집을 위해, 혈액을 우심방을 통해 수집하기 전에 마우스를 케타민/실라진으로 깊이 마취하였다. 이어서 CSF를 대수조 천자로 수집하였다. 이후 뇌 및 척추를 10UI/ml의 헤파린을 함유하는 빙냉 PBS로 2분 및 좌심실을 통한 10% 중화 포르말린으로 5분 관류 후 수집하였다. 뇌를 4℃에서 3h 더 10% 중화 포르말린으로 고정한 뒤 48h 동안 30% 수크로오스 중에 침지하였다. 이어서 뇌를 드라이 아이스 중에 냉동한 뒤 30㎛ 두께의 관상 절편 시리즈로 절편화하였다. 절편 시리즈를 이용 전에 0.025% 나트륨 아지드를 포함하는 5mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 중 1M 글루코오스, 37.5% 에틸렌 글리콜을 함유하는 부동 용액 중 -20℃에서 보관하였다. 척추를 2일 동안 10% 중화 포르말린 중에 후고정하고, 파라핀 블록에 임베딩하였다.
면역조직화학: 30㎛ 두께의 관상 절편을 자유 부동 염색에 의해 바이오틴화된 당나귀 항-인간 IgG(H+L)를 탐침으로 하였다. 자유 부동 절편을 Tris-Triton pH7.4(50mM Tris, 150mM NaCl, 0.05% Triton X-100) 중에 세척하고, 30분 동안 1% H2O2 PBS 중에 인큐베이션하고, 실온에서 1h 동안 추가적인 0.2% Triton X-100와 함께 Tris-Triton 중 2% 일반 염소 및 말 혈청을 함유하는 차단 용액과 인큐베이션하였다. 이어서 뉴론 인간 IgG를 검출하기 위해 100rpm에서 진탕하며 4℃에서 16h 동안 차단 용액 중 1:200의 바이오틴화 당나귀 항-인간 IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch Labs, 709-065-149)과 절편을 인큐베이션하였다. 조직-결합된 바이오틴화 항체를 Vectastain Elite ABC 키트(벡터 Laboratories, PK6100, 1:100)를 이용해서 페록시다아제 발색 반응으로 가시화하였다. 효소 반응을 빙냉 PBS로 정지시키고, 절편을 PBS 중에 3회 세척하였다. 이어서 절편을 유리 슬라이드 상에 실장하고, 헤말룸 용액으로 역염색하기 전에 하룻밤 동안 공기 건조하여 핵을 가시화하였다(Carl Roth GmbH + Co., T865.1). 탈수 단계 후, Olympus dotSlide 2.1 가상 현미경 시스템으로 스캐닝하기 전에 슬라이드에 커버슬립을 덮었다.
i.p. 주사를 통해 인간 항-타우 항체 또는 hIgG1 대조군 항체를 투여한 타우P301L 마우스의 뇌에서 인간 항체가 검출되었으나, 항체를 처리하지 않은 타우P301L 및 야생형 마우스에서는 검출되지 않았다(도 11). 그러나 뉴론 염색은 NI-105.6C5, NI-105.6E3 및 NI-105.40E8 항-타우 항체 처리 마우스의 해마에서만 관찰되었고, hIgG1 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다. 항-타우 항체를 이용한 뉴론 염색은 주사 1일 후 쉽게 검출 가능하였고, 주사 8일 후 덜 현저했으며, 주사 22일 후 검출 불가능하였다(데이터는 나타내지 않음). 타우P301L 마우O스는 해마 형성에서 고수준의 유전자삽입 인간 타우를 생산하며, 해마는 신경섬유 매듭이 발생하는 초기 영역 중 하나이다. 따라서 말초 주사된 항-타우 항체는 뇌에 들어갈 뿐만 아니라 고수준의 타우를 함유한 뉴론 내로도 들어갈 수 있을 것이다.
실시예 20
ch4E4(N30Q) 및 ch17C1(N31Q)을 이용한 타우P301L 마우스의 만성 치료 효과.
동물 및 항체 처리: 인간 항체의 가변 도메인 및 마우스 IgG2a의 불변 영역을 함유하는 키메라성 NI-105.4E4(N30Q)("ch4E4(N30Q)") 및 키메라성 NI-105.17C1(N31Q)("ch17C1(N31Q)")를 CHO 세포의 일시적 전달감염에 의해 생산하고 표준 방법을 이용해서 정제하였다.
7.5-8월령의 성비 균형을 맞춘 타우P301L 마우스에 매주 10mg/kg ch17C1(N31Q)(n=20), 10mg/kg ch4E4(N30Q)(n=20) 또는 동일 부피의 PBS(n=20)를 복강 내 주사를 통해 투여하였다. 체중을 2주마다 모니터링하였다. 심각한 체중 감소는 관찰되지 않았다. PBS군의 2마리 마우스 및 ch17C1(N31Q) 처리군의 1마리 마우스가 조기 사망하였다. 마우스를 조직 수집을 위해 25번째 처리 1일 후 마취하였다. 혈액을 안와동을 통해 수집하였다. 이후 뇌 및 척추를 좌심실을 통해 10Ul/ml 헤파린을 함유하는 빙냉 PBS로 2분 동안 관류 후 수집하였다. 이후 뇌 좌반구를 칭량하고, 드라이 아이스에서 급속 냉동하고, 이용 전에 -80℃에서 보관하였다. 뇌의 우반구 및 척추를 2일 동안 4℃에서 중화 10% 포르말린 중에 후-고정한 뒤 파라핀 임베딩된 뇌 및 척추 블록으로 처리 전에 PBS 중에 추가 보관하였다.
뇌 단백질 추출: 이후 뇌 단백질을 용해도에 기반하여 추출하였다. 뇌의 좌반구를 먼저 0.2% 디에틸아민, 1X 프로테아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH) 및 1X 포스파타아제 저해제(Roche Diagnostics GmbH)를 함유하는 10배 w/v의 50mM NaCl 중에 균질화하였다. 얼음 상에서 30분 인큐베이션 후, 균질액을 30분 동안 4℃, 100,000g에서 원심분리하였다. 이후, 상청액을 수집하고 가용성 분획으로 정의하였다. 잔여 펠렛을 10mM Tris 7.4, 0.8M NaCl, 1mM EGTA, 1X 포스파타아제 저해제, 1X 프로테아제 저해제, 1mM Na3VO4, 1mM NaF 및 1mM AEBSF를 함유하는 12배 w/v의 10% 수크로오스 용해 완충액 중에 균질화하였다. 얼음 위에서 30분 인큐베이션 후, 균질액을 20분 동안 4℃, 20,500g에서 원심분리하였다. 사르코실 추출을 위해 95% 상청액을 조심스럽게 수집하였다. 펠렛을 -80℃에 보관하였다. N-라우릴-사르코시네이트를 상청액(1%(w/v) 최종 농도)에 첨가하였다. 220rpm에서 진탕하면서 37℃에서 1h 인큐베이션 후, 용액을 1시간 동안 4℃, 100,000g에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 사르코실 가용성 분획으로 정의하였다. 펠렛을 30분 동안 실온에서 건조하게 놔둔 뒤, 50mM Tris pH 7.4(20% v/w 초기 뇌 중량) 중에 용해하고 PHF 불용성 분획으로 정의하여 이용 전까지 -80℃에 보관하였다.
ELISA 측정 3 뇌 단백질 분획에서 인간 총 타우 및 인산화된 타우를 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적 ELISA 키트(Life Technologies)로 정량하였다. 총 인간 타우, 트레오닌 231(pT231 타우)이 인산화된 인간 타우, 세린 199가 인산화된(pS199 타우) 인간 타우 및 트레오닌 181 타우가 인산화된(pT181) 인간 타우가 검출되었다. 가용성 분획 표본을 50mM Tris pH 7.4를 이용해서 BCA 단백질 분석(Pierce)으로 측정된 총 단백질 함량에 근거하여 1mg/ml으로 표준화하였다. 표준화된 표본의 분취물을 ELISA 측정 및 웨스턴 블로팅을 위해 제조하였다. ELISA를 위해 가용화된 PHF 불용성 분획을 제조하기 위해, 10㎕ PHF타우를 1시간 동안 실온에서 10㎕의 8M 구아니딘 히드로클로라이드와 인큐베이션 후 180㎕의 50mM Tris 7.4를 첨가하였다. ELISA 측정을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. ELISA에 의해 측정된 각 표본 중 타우 수준을 최종 분석을 위해 초기 뇌 중량으로 정상화하였다.
종결점 혈장 약물 수준을 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다. 간략하게, 100nM 카르보네이트 ELISA 코팅 완충액(pH 9.6) 중 3㎍/ml r타우(rPeptide)(서열 목록 번호 6)를 하룻밤 동안 4℃에서 Costar 절반 면적 ELISA 플레이트 중에 인큐베이션하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 혈장 표본을 1:200, 1:400 및 1:800로 0.1% Tween®20을 함유하는 PBS 중 3% BSA 중에 희석하였다. ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)의 연속 희석을 이용하여 표준 곡선을 생성하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 0.1% Tween®20 함유 PBS로 4회 세척한 뒤 당나귀 항-마우스 IgGFcγ-HRP(1:10,000)와 1시간 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 항체를 표준 비색 분석으로 추가 결정하였다. 표준 곡선을 GraphPad Prism 5로 사인형 곡선 피트에 의해 생성하였다.
웨스턴 블롯: 3개 분획의 단백질 표본을 4X NuPAGE® LDS 표본 완충액(Life Technologies) 중에 10분 동안 70℃에서 가열하고, 각 표본으로부터 동일량의 총 단백질을 NuPAGE® 4-12%(w/v) 겔 상에 전기영동하였다. PVDF막으로의 단백질의 반건조 전달 후, 막을 TBS 중 0.1% Tween-20을 함유하는 3% BSA 중에 차단한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 상이한 항-타우 항체를 탐침으로 하였다. 이어서 페록시다아제-콘주게이트된 이차 항체를 1h 동안 실온에서 인큐베이션 후 TBST로 4회 세척하였다. 이후, 결합된 항체를 증강된 화학발광(ECL)(Pierce)으로 검출하였다. 면역블롯의 밀도측정 분석을 National Institutes of Health의 ImageJ 프로그램으로 수행하였다.
2-시험 Y 미로: 마우스를 2-시험 Y-미로 평가를 이용해서 단기 공간 기억력에 대해 평가하였다. 미로의 부문은 35cm 길이, 5cm 폭 및 10cm 깊이였다. 추상적 단서를 미로 주위의 커튼 상에 두었다. 실험을 6lux의 주변 광 수준으로 수행하였다. 노출 상 동안, 마우스를 2부문(시작 부문 및 다른 부문)으로 할당하며, 이는 4분 동안 자유 탐색할 수 있고, 미로와 동일한 재료로 제조된 도어로 차단된 세 번째 부문(새로운 부문)에 대해 접근하지 못했다. 이어서 마우스를 미로에서 꺼내고, 2분 동안 수용 우리에 유지하였으며, 이 때 미로를 50% 에탄올로 세정하였다. 평가 상 동안, 마우스를 시작 부문 끝에 배치하고, 모든 3부문을 4분 동안 자유롭게 탐색하도록 두었다. 평가 상을 비디오 추적 및 동물 거동 분석을 위해 TSE videoMot2 소프트웨어로 기록하였다(TSE 시스템, Bad Homburg, Germany). 부문 진입 횟수와 새로운 부문에서 소요한 시간을 기록하였다. 부문 진입 평균 횟수와 훈련 세션 동안 개방된 다른 두 부문에서 소요한 시간의 평균을 계산하였다. 새로운 부문 내 부문 진입 횟수(또는 소요 시간) 및 다른 두 부문의 평균 간 비를 계산하였다. 공간 작업 기억력에 결핍이 없는 야생형 대조군 동물은 전형적으로 상기 평가에서 1.5 내지 2 사이의 비를 가질 것이다[Pennanen 등, Genes Brain Behav 5(5):369-79(2006)].
데이터 분석: ELISA 데이터를 2웨이 분산 분석을 위한 정규성 가정에 부합하기 위해 로그 전환하였다. p<0.05인 경우, 차이가 유의미한 것으로 간주하였다.
ch4E4(N30Q)는 타우P301L 마우스에서 가용성 인간 타우를 유의미하게 감소시켰다: 뇌 단백질 추출물의 DEA-가용성, 사르코실-가용성, 및 불용성 분획 중 인간 타우 수준을 ELISA로 정량하였다. 대부분의 인간 타우가 DEA-가용성 분획에서 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 총 인간 타우(h타우)는 PBS 처리 마우스(ch17C1(N31Q)에서 평균 29% 및 ch4E4(N30Q)에서 37% 감소, 도 12a)에 비해 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q) 처리 마우스의 DEA-가용성 분획에서 감소되었다. DEA-가용성 분획의 인산화된 타우(pT231, pS199 및 pT181)에서도 감소가 나타났다(각각 도 12b, c 및 d). 앞서 본 발명자들은 웅성 대응체에 비해 자성 타우P301L 마우스에서 더 낮은 인간 타우 발현을 관찰하였다. 그러므로 데이터를 정확히 분석하기 위해, 성별 및 처리를 2 변수로 하는 투웨이 ANOVA를 이용하였다. 모든 가용성 인간 타우 측정에서(총 인간 타우, pS199, pT181 및 pT231 인간 타우) p<0.01로 성별 효과가 확인되었다. 성별 및 처리 간에는 상호작용이 없었다(모든 가용성 인간 타우 측정에서 0.49<p<0.91). 중요하게는 DEA-가용성 인간 타우에서 유의미한 치료 효과가 있었다(h타우, pS199 및 pT231에 있어서 p<0.05, 및 pT181에 있어서 p=0.06). 치료 효과는 ch4E4(N30Q)에 의해 주로 유도되었다. PBS 대조군과 비교하면, ch4E4(N30Q)는 h타우(p<0.05), pS199(p<0.01), pT231(p<0.01) 및 pT181(p<0.05)을 유의미하게 감소시켰다. 사르코실-불용성 분획을 이용한 ELISA 측정은 동물 간에 높은 가변성을 나타내었고, 유의미한 성별 효과는 관찰되지 않았다. 사르코실-불용성 분획에서 유의미한 치료 효과는 관찰되지 않았다. 유사하게, 사르코실-가용성 분획에서 ELISA에 의해 유의미한 치료 효과는 관찰되지 않았다.
인간 타우-특이적 모노클로날 항체 타우12를 이용한 웨스턴 블롯은 DEA-가용성 분획에서 주요 타우 면역반응성 성분으로 62kDa의 단일 밴드로 전장 인간 타우를 나타내었다. ch4E4(N30Q) 및 ch17C1(N31Q)로 처리된 대다수 마우스에서 전장 인간 타우의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 사르코실 불용성 분획에서, 64kDa 밴드 및 몇몇 다른 더 고분자량 밴드뿐만 아니라 인간 타우 단편에 해당하는 것으로 추정되는 더 저분자량 밴드가 관찰되었다. 밀도측정 분석은 개별 동물 간에 고도의 가변성을 나타내었으며, 이는 임의의 정량적 비교를 방지하였다. 그러나 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q) 처리된 마우스에서 타우12에 의해 검출된 사르코실 불용성 분획에서 모든 인간 타우 단백질의 전반적인 정량적 감소가 존재하였다(도 13에 나타낸 대표적 웨스턴 블롯).
혈장 약물 수준: 마우스에 10mg/kg의 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)를 매주 i.p. 주사를 통해 처리하였다. 약물 노출을 평가하기 위해, 혈장 표본을 마지막 치료 24h 후 수집하였다. 혈장 약물 수준을 포획제로서 r타우를 이용한 ELISA로 측정하였다. ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q)의 평균 혈장 수준은 각각 200㎍/ml 및 145㎍/ml이어서, 두 항체가 모두 우수한 혈액 노출을 가짐을 제시하였다(도 14).
항체 처리 및 공간 기억력: 초기 연구는 타우P301L 마우스에서 해마-의존적인 공간 참조 기억력의 결핍을 제시하였다(Pennanen 등, Genes Brain Behav 5(5):369-79(2006)). 타우 유전자삽입 마우스에서 단기 공간 기억력 결핍을 검출하기 위해 2-시험 Y 미로를 감수성 평가로 보고하였다(Troquier 등, Curr Alzheimer Res. 9(4):397-405(2012)). 노출 상 동안, 모든 군은 각각의 이용 가능한 부문에서 유사한 양의 시간을 소요하며 미로를 동일하게 탐색하였다(데이터는 나타내지 않음). 이동 거리를 비교하여 차이는 확인되지 않았다. 평가 상 동안, PBS 처리된 타우P301L 마우스는 노출 상 동안 탐색된 다른 두 부문의 평균과 거의 동일한 횟수의 새로운 부문 진입 횟수를 만들어서(비=1.18), PBS 처리된 타우P301L 마우스에서 불량한 공간 작업 기억력을 제시하였다. ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q) 처리된 마우스는 다른 두 부문에 비해 새로운 부문에 대한 선호를 나타내었으며, 이들은 다른 두 부문의 평균에 비해 새로운 부문에 더 많이 방문하였다(ch17C1(N31Q)에 대한 비=1.50 및 ch4E4(N30Q)에 대한 비=1.30). PBS 처리군 대비 ch17C1(N31Q) 및 ch4E4(N30Q) 처리 타우P301L 마우스에서의 새로운 부문 진입 비를 도 15에 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 개별 측면의 하나의 예시로 의도되는 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 균등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 발명의 범위 내이다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 개질이 상기 기재 및 동반 도면으로부터 당분야 숙련가에게 자명해질 것이다. 이러한 개질은 첨부되는 특허청구범위의 범위 내에 속하려는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen Idec MA Inc. Biogen Idec International Neuroscience GmbH Weinreb, Paul H. Chen, Feng Garber, Ellen A. Grimm, Jan Montrasio, Fabio <120> HUMAN ANTI-TAU ANTIBODIES <130> 2159.404PC01 <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/745,410 <151> 2012-12-21 <160> 224 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(352) <223> Isoform Fetal-Tau <300> <301> Goedert M., Wischik C., Crowther R., Walker J., Klug A. <302> Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. <303> Proc. Natl. Acad. Sci. 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human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. <303> Neuron <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300> <308> P10636-4 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(381) <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly 65 70 75 80 Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala 85 90 95 Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala 115 120 125 Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala 130 135 140 Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 145 150 155 160 Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 180 185 190 Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser 195 200 205 Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu 210 215 220 Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser 245 250 255 Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro 260 265 270 Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp 275 280 285 Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro 290 295 300 Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu 305 310 315 320 Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser 325 330 335 Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser 340 345 350 Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu 355 360 365 Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 3 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(410) <223> Isoform Tau-C <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. <302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. <303> Neuron <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300> <308> P10636-5 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(410) <400> 3 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln 305 310 315 320 Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys 340 345 350 Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val 355 360 365 Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly 370 375 380 Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu 385 390 395 400 Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 405 410 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(383) <223> Isoform Tau-D <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Potier M.-C., Ulrich J., Crowther R.A. <302> Cloning and sequencing of the cDNA encoding an isoform of microtubule-associated protein tau containing four tandem repeats: differential expression of tau protein mRNAs in human brain. <303> EMBO J. <304> 8 <306> 393-399 <307> 1989-02-01 <300> <308> P10636-6 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(383) <400> 4 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu 210 215 220 Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 225 230 235 240 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 245 250 255 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His 260 265 270 Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe 275 280 285 Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 290 295 300 Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe 305 310 315 320 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 325 330 335 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn 340 345 350 Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala 355 360 365 Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 5 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(412) <223> Isoform Tau-E <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. <302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. <303> Neuron <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300> <308> P10636-7 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(412) <400> 5 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly 65 70 75 80 Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala 85 90 95 Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala 115 120 125 Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala 130 135 140 Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 145 150 155 160 Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 180 185 190 Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser 195 200 205 Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu 210 215 220 Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser 245 250 255 Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys 275 280 285 Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly 290 295 300 Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 305 310 315 320 Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly 325 330 335 Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn 340 345 350 Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 355 360 365 Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser 370 375 380 Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala 385 390 395 400 Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 405 410 <210> 6 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(441) <223> Isoform Tau-F <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. <302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. <303> Neuron <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300> <308> P10636-8 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(441) <400> 6 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Epitope recognized by NI-105.4E4 antibody <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Epitope NI-105.4E4 <400> 7 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys 1 5 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-105.4E4-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(204) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (301)..(330) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 8 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc aat ttc aac atc tct 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser 20 25 30 gct ata cac tgg gtc cgc cag gct tcc ggg aaa ggg ctg gag tgg gtt 144 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 ggc cga ata aga agt aaa tct cac aat tac gcg act tta tat gct gcg 192 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala 50 55 60 tcc ctg aaa ggc cgg ttc acc ctc tcc aga gat gat tca agg aac acg 240 Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 gcg tat ctg caa atg agc agc ctg caa acc gag gat atg gcc gtc tat 288 Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr 85 90 95 tac tgt act gtt ctg agt gcg aat tac gac acc ttt gac tac tgg ggc 336 Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-105.4E4-VL variable light chain (VL) sequence wherein amino acid sequence Ser-Tyr-Glu at positions 1-3 may also be Leu-Pro-Val <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 10 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc tcc tgc ttt gga gat aca ttg cca aag caa tat act 96 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr 20 25 30 tat tgg tat cag cag aag cct ggc cag gcc cct gtg tta gtg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 aaa gac act gag agg ccc tca ggg atc ccc gag cga ttc tct ggc tcc 192 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca ggg aca aca gtc acc ttg acc atc agt gga gtc cag gca gaa 240 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gac gag gct gac tat tac tgt cta tca gct gac aac agt gct act tgg 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp 85 90 95 gtg ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc cta 321 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 12 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <223> NI-105.24B2-VH variable heavy chain (VH) sequence wherein Gln at position 1 of the sequence may also be Glu <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(312) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 12 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcg gtg aag gtt tcc tgt aag gca tct gga tac acc ttc gtc aat tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asn Tyr 20 25 30 att ata cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga atc atc aat cct aat ggc gga aac aca agt tat gca gag aaa ttc 192 Gly Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 cag gcc cga gtc acc ttg acc agc gac acg tct acg agt acg gtg tac 240 Gln Ala Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 atg gac ctg agc agc ctg aca tct gag gac acg gcc gtc tat tac tgt 288 Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc gtc ctt tcc cct tcg aat ccc tgg ggc cag ggg acc acg gtc acc 336 Ala Val Leu Ser Pro Ser Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 gtc tcc tcg 345 Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asn Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Ala Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Leu Ser Pro Ser Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-105.24B2-VL variable light chain (VL) sequence wherein Glu at position 3 in the sequence may also be Val <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 14 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc ggg atc acc tgc tct gga gat gct ttg cca aag caa ttt gtt 96 Thr Ala Gly Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val 20 25 30 tat tgg tac cag aag aag cca ggc cag gcc cct gtg tta ttg ata tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 aaa gac act gag agg ccc tca cga atc cct gag cgc ttc tct ggc tcc 192 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 acc tca ggg aca aca gtc gcg ttg acc atc aat ggg gtc cag gca gag 240 Thr Ser Gly Thr Thr Val Ala Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gac gag gct gac tat tac tgt caa tca gcc gac cgc agt ggt gct ctt 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu 85 90 95 tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 324 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Gly Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Thr Val Ala Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 16 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> NI-105.4A3-VH variable heavy chain (VH) sequence wherein Gln at positon 1 of the sequence may also be Glu and Ser at position 7 of the sequence may also be Thr <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(345) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 16 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gcg gtc cag cct ggg ggg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt gac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 gcc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg cag tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tcg tat gag gga act tat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg aac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 ttg cag atg agc agc ctg aga gtt gaa gac acg gct gtg tat ttc tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gtg aaa gct cga gcc ttt gcc tcc gga cag cga agc acc tcc acc gta 336 Val Lys Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val 100 105 110 cct gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378 Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Lys Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val 100 105 110 Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-105.4A3-VL variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 18 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga caa 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca ttg cca aaa aaa tat gct 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30 tat tgg tac cag cag aag tca ggc cag gcc cct gtg ttg gtc atc tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 gag gac aac aaa cga ccc tcc ggg atc cct gag aga ttc tct ggc tcc 192 Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca ggg aca gtg gcc acc ttg act atc agt ggg gcc cag gtg gac 240 Ser Ser Gly Thr Val Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Asp 65 70 75 80 gat gaa gct gac tac tac tgc tac tcg aca gac atc agt ggt gac ctt 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu 85 90 95 cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc ctc 324 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Val Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Asp 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu 85 90 95 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 20 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mature ch4E4 heavy chain (mouse IgG2a) <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 21 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mature ch4E4 light chain (mouse lambda) <400> 21 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser 100 105 110 Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Glu Thr 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Val 130 135 140 Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln Gly Met 145 150 155 160 Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Met Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg His Ser Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser 195 200 205 Arg Ala Asp Cys Ser 210 <210> 22 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mature ch4E4(N30Q) heavy chain (mouse IgG2a) <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gln Ile Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR1 <400> 23 Ile Ser Ala Ile His 1 5 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR2 <400> 24 Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Leu Lys Gly <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR3 <400> 25 Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VL (variable light chain sequence VL) CDR1 <400> 26 Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VL (variable light chain sequence VL) CDR2 <400> 27 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4E4-VL (variable light chain sequence VL) CD3 <400> 28 Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp Val 1 5 10 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR1 <400> 29 Asn Tyr Ile Ile His 1 5 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VH (variable heavy chain sequence VH) CD2 <400> 30 Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ala <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR3 <400> 31 Leu Ser Pro Ser Asn Pro 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VL (variable light chain sequence VL) CDR1 <400> 32 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VL (variable light chain sequence VL) CDR2 <400> 33 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.24B2-VL (variable light chain sequence VL) CDR3 <400> 34 Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu Trp Val 1 5 10 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR1 <400> 35 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR2 <400> 36 Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VH (variable heavy chain sequence VH) CDR3 <400> 37 Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val Pro Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VL (variable light chain sequence VL) CDR1 <400> 38 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VL (variable light chain sequence VL) CDR2 <400> 39 Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NI-105.4A3-VL (variable light chain sequence VL) CDR3 <400> 40 Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu Arg Val 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide <400> 41 Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide <400> 42 Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 1 5 10 15 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VH antibody <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gln Ile Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Gly His Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Phe Trp Thr Gly Ser Gln Ile Glu Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Gly His Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Phe Trp Thr Gly Ser Gln Ile Glu Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly His 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asn Tyr 20 25 30 Ser Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Phe Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Glu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Lys Tyr Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 47 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ser Val Thr Thr Ser Asn Ala Glu Asn Phe 100 105 110 His His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 48 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 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tctgaagatc 60 tcctgcaagg catttggata cagttttacc aacttctgga tcggctgggt gcgccaggtg 120 cccgggaaag gcctggagtg ggtgggaatc atctatcctg gtgactctga caccagatac 180 agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatt tcagccgaca agtccattga caccgcctac 240 ctacagtggg gccacctgaa ggcctcggac agcgccatgt atttctgtgc cagacggggt 300 ttttggactg gaagtcaaat tgaatactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctcg 360 <210> 170 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgcaagg catttggata cagttttacc aacttctgga tcggctgggt gcgccaggtg 120 cccgggaaag gcctggagtg ggtgggaatc atctatcctg gtgactctga caccagatac 180 agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatt tcagccgaca agtccattga caccgcctac 240 ctacagtggg gccacctgaa ggcctcggac agcgccatgt atttctgtgc cagacggggt 300 ttttggactg gaagtcaaat tgaatactgg ggccagggca cccaggtcac cgtctcctcg 360 <210> 171 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacactc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaactagtag tgacgttggt aattatagtt ttgtctcctg gtatcaacag 120 tatcccggca aagcccccaa agtcatcatt tatgacgtca gtaagcggtc ctcaggggtc 180 cctgatcgct tctttggctc caagtctgcc aacacggcct ccctgaccgt ctctggggtc 240 caggaagagg atgaggctga ctatttttgc agctcatacg gaggcagcaa atatccgtgg 300 gtgtttggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctt 333 <210> 172 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagagtc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtt atatggtttg atggaagtaa tgaattctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaccta 300 ggggcctcag tgactacttc caacgctgaa aacttccacc actggggcca gggcaccctg 360 gtcaccgtct cctcg 375 <210> 173 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagagtc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtt atatggtttg atggaagtaa tgaattctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaccta 300 ggggcctcag tgactacttc caacgctgaa aacttccacc actggggcca gggcaccctg 360 gtcaccgtct cctcg 375 <210> 174 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgcatt gccaaaaaga tatgtttatt ggtaccagca gaagtcaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgaggac agcaaacgac cctccgggat ccctgagaca 180 ttctctggct ccagctcagg gacaatggcc accttgacta tcagtggggc ccaggtagag 240 gatgaagctg actactactg ttactcaaca gacagcaatg gtcatcattg ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 175 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgacttcagc ggctatagca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcgtat attagcggca cttatgttag tggtggtaca 180 ggcacgatgt attatttaga ctctgtgaag ggccgattct tcatctccag agacgatgcc 240 accagttcac tgtatctgca aatggacagc ctgagggacg aggacacggc tgtgtattac 300 tgtgcgagag tttatgacta cggtgaagac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcg 363 <210> 176 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 gatattgtga tgactcaatc accagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagccg gagtgtctta tacagctcca acagtaagaa ctacttagct 120 tggtatcagc agaaacccgg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacgcgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagaatt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggcg gtttattact gtcagcaata ttatggtact 300 cctcgcacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 177 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 177 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag gcactagatt cacctttagc acctatgcca tgggctgggt ccgccaggct 120 ccagggaggg ggctggagtg ggtctcggct attggtggta gtggtgatag cacatcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attattgtgc gaaaggggtt 300 tatgattacc tttgggggag ttatcggctc tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct cg 372 <210> 178 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 178 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccagattt 60 acctgtgggg gaaacaacat tgcaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcacggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtacta gtgatcatgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 179 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 179 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttccc aactatgtca tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacagactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac 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Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 225 230 235 240 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 245 250 255 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Phe Arg Ser 290 295 300 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 370 375 380 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met 385 390 395 400 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 405 410 415 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 420 425 430 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 216 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 216 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Gly His Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Phe Trp Thr Gly Ser Gln Ile Glu Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 210 215 220 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 290 295 300 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 340 345 350 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 355 360 365 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 405 410 415 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 420 425 430 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 217 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 217 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly His 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gln Tyr 20 25 30 Ser Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Phe Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Glu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Lys Tyr Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val 145 150 155 160 Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg 180 185 190 His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 210 215 <210> 218 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 218 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asn Tyr 20 25 30 Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gln Ser Ala Leu Thr 435 440 445 Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly 450 455 <210> 219 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 219 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp His Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Val Gly Ser 85 90 95 Tyr Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 220 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 220 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asn Tyr 20 25 30 Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 221 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 221 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly His 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gln Tyr 20 25 30 Ser Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Phe Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Glu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Lys Tyr Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 222 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaera <400> 222 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly His 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gln Tyr 20 25 30 Ser Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Phe Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Glu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Lys Tyr Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 223 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 223 gatattgtta tgactcaatc accagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtcaagcca gaatatttta tacagctccg acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaactactca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtatt 300 cctcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gagatcaaa 339 <210> 224 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gln Tyr Ser Phe Val Ser 1 5 10

Claims (42)

  1. VH 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2, 및 3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 VL CDR 1, 2, 및 3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편으로서, 하기를 특징으로 하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편:
    (a) VH CDR 1, 2, 및 3 은, 각각, 서열 목록 번호 85, 서열 목록 번호 86, 및 서열 목록 번호 87 에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, VL CDR 1, 2, 및 3 은, 각각, 서열 목록 번호 88, 서열 목록 번호 89, 및 서열 목록 번호 90 에 제시된 아미노산 서열로 이루어짐; 또는
    (b) VH CDR 1, 2, 및 3 은, 각각, 서열 목록 번호 103, 서열 목록 번호 104, 및 서열 목록 번호 105 에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, VL CDR 1, 2, 및 3 은, 각각, 서열 목록 번호 106, 서열 목록 번호 107, 및 서열 목록 번호 108 에 제시된 아미노산 서열로 이루어짐.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편:
    (a) VH 은 서열 목록 번호 48 에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 은 서열 목록 번호 49 에 제시된 아미노산 서열을 포함함;
    (b) VH 은 서열 목록 번호 47 에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 은 서열 목록 번호 49 에 제시된 아미노산 서열을 포함함;
    (c) VH 은 서열 목록 번호 54 에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 은 서열 목록 번호 55 에 제시된 아미노산 서열을 포함함; 또는
    (d) VH 은 서열 목록 번호 220 에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 은 서열 목록 번호 55 에 제시된 아미노산 서열을 포함함.
  3. 제 1 항에 있어서, 항-타우 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 서열 목록 번호 218 에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 목록 번호 219 에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 타우-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 항체, 및 디설피드 연결된 Fv (sdFv) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 항-타우 항체가 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  6. 제 1 항에 있어서, 항-타우 항체가 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  7. 제 1 항에 있어서, 항-타우 항체가 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편이 폴리에틸렌 글리콜 또는 효소, 방사선동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 및 중금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 검출 가능한 표지를 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들.
  10. 제 9 항에 있어서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들:
    (a) 서열 목록 번호 173, 서열 목록 번호 174, 또는 서열 목록 번호 173 및 서열 목록 번호 174 에 제시된 핵산 서열; 또는
    (b) 서열 목록 번호 179, 서열 목록 번호 180, 또는 서열 목록 번호 179 및 서열 목록 번호 180 에 제시된 핵산 서열.
  11. 제 9 항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터들.
  12. 제 11 항의 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  13. 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편의 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    세포 배양물에서 제 12 항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    세포 배양물로부터 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편을 단리하는 단계.
  14. 제 13 항에 있어서, 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편을 인간 대상체에게로의 투여에 적합한 멸균 약학 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
  15. 인간 대상체에서 신경변성 타우병증을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물;
    여기서 신경변성 타우병증은 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
  16. 인간 대상체에서 중추 신경계에서의 타우의 비정상적인 축적 또는 침적을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 인간 대상체가 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경변성 타우병증을 갖는 약학 조성물.
  18. 제 15 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 알츠하이머 질환인 약학 조성물.
  19. 제 15 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매인 약학 조성물.
  20. 제 15 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 전두측두엽 변성인 약학 조성물.
  21. 신경변성 타우병증을 진단하기 위한 진단 조성물로서, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편을 포함하는 진단 조성물;
    여기서 신경변성 타우병증은 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
  22. 제 21 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 알츠하이머 질환인 진단 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매인 진단 조성물.
  24. 제 21 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 전두측두엽 변성인 진단 조성물.
  25. 하기 단계를 포함하는, 신경변성 타우병증의 진행을 모니터링하기 위한 시험관 내 (in vitro) 방법으로서, 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준과 기준 표준 간의 차이 또는 유사성은 인간 대상체가 신경변성 타우병증을 가짐을 시사하는 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편으로 인간 대상체로부터 수득된 표본에서의 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 측정하는 단계, 및
    (b) 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 하나 이상의 대조군 대상체에서의 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 시사하는 기준 표준과 비교하는 단계;
    여기서 신경변성 타우병증은 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
  26. 하기 단계를 포함하는, 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 신경변성 타우병증의 지표로서 사용하는 시험관 내 방법으로서, 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준 및 기준 표준 간의 차이 또는 유사성은 인간 대상체가 신경변성 타우병증을 가짐을 시사하는 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편으로 인간 대상체로부터 수득된 표본에서의 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 측정하는 단계, 및
    (b) 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 하나 이상의 대조군 대상체에서의 병리적으로 개질된 또는 응집된 타우의 수준을 시사하는 기준 표준과 비교하는 단계;
    여기서 신경변성 타우병증은 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화성 입자 치매, 영국인 유형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기부 변성, 크루츠펠트-야콥 질환, 권투선수 치매, 석회화된 확산성 신경섬유 매듭, 다운 증후군, 전두측두 치매, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 다기관계 위축증, 근긴장 디스트로피, 니만-픽 질환 C형, 신경섬유 매듭을 갖는 비-게르만인 운동 뉴런 질환, 픽 질환, 뇌염 후 파킨슨병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화 범뇌염, 매듭만 있는 치매, 다발경색 치매 및 허혈성 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
  27. 제 25 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 알츠하이머 질환인 시험관 내 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 갖는 전두측두 치매인 시험관 내 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 신경변성 타우병증이 전두측두엽 변성인 시험관 내 방법.
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