KR102209346B1 - Hydrogel micro-well arrays based on micro-through-hole and method for three dimensional single cell isolation and culture using thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 및 이를 이용한 3차원 단일세포 분리 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막 간에는 일정한 간격을 유지하고 있는 미세관통막 및 상기 미세관통막을 채우고 있는 수화젤을 포함하는 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이; 상기 수화젤 마이크로웰 어레이의 제조방법; 이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법; 및 단일 세포 분리장치에 관한 것이다.The present invention relates to a micro-penetration-based hydration gel microwell array and a three-dimensional single cell separation and cultivation method using the same.In particular, the present invention is disposed in a non-contact manner on the bottom of a cell culture vessel, and a constant gap between the micro-penetrating membranes A micro-penetrating-based hydration gel microwell array for separation and cultivation of single cells including a micro-penetrating membrane holding the micro-penetrating membrane and a hydration gel filling the micro-penetrating membrane; A method of manufacturing the hydrogel microwell array; Isolation and culture method of single cells using this; And a single cell separation device.

Description

미세관통막 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 및 이를 이용한 3차원 단일세포 분리 및 배양방법{Hydrogel micro-well arrays based on micro-through-hole and method for three dimensional single cell isolation and culture using thereof}Hydrogel micro-well arrays based on micro-through-hole and method for three dimensional single cell isolation and culture using the same

본 발명은 미세관통막 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이, 이의 제조방법 및 이를 이용한 3차원 단일세포의 분리 및 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a micro-penetrating membrane-based hydration gel microwell array, a method for manufacturing the same, and a method for separating and culturing three-dimensional single cells using the same.

단일세포 분석 기술은 1개의 단일세포로 분리하여 극미량의 재료로부터 DNA나 RNA와 같은 분석 대상을 증폭해서 해당 세포의 특징을 분석하는 기술이다. 이러한 분석기술의 핵심은 생체 조직을 단일 세포 수준으로 세포를 분리하는 것, 단단하고 복잡한 조직일수록 특정 세포만 편중되지 않고 모든 세포의 특성을 살려두면서 세포를 하나씩 분리하는 것이다. 따라서 단일세포 분리 기술의 우선적인 해결과제는, 물리적인 힘과 효소를 이용해서 조직에서 세포를 분리하고, 현탁액 (suspension) 상태로 만든 후에 각각의 세포를 분석할 수 있도록 단일 세포 단위로 물리적으로 분획하고 배양하는 것이다.Single cell analysis technology is a technology that analyzes the characteristics of the cell by separating it into one single cell and amplifying an analysis object such as DNA or RNA from a trace amount of material. The core of this analysis technology is to separate cells from living tissues at the level of a single cell, and to separate cells one by one while maintaining the characteristics of all cells without being biased by only specific cells in hard and complex tissues. Therefore, the primary challenge of single cell separation technology is to separate cells from tissues using physical force and enzymes, make them into suspension, and then physically fractionate them into single cell units so that each cell can be analyzed. And cultivate it.

생체 조직을 단일 세포 수준으로 분리하는 대표적인 방법으로 레이저를 이용한 극소해부 방법, 세포가 들어있는 현탁액을 점진적으로 희석하거나, 미세 파이펫팅을 이용하는 방법 등이 있다. 또한, 미세용기를 만들어서 희석하기도 하고, 현탁액에서 광학 트위져(optical tweezer)를 이용하거나 형광 활성화 세포 분류기(fluorescence activated cell sorting, FACS)를 이용해 세포나 핵을 온전한 상태로 분리하는 방법 등이 개발되었다. 이외에도, 조직으로부터 분리된 세포를 세포가 붙는 기질(substrate) 표면 위에 세포 친화적인 물질을 패터닝(patterning)하는 방법이 있다. 세포가 배합된 현탁액을 기질에 흘려주었을 때, 세포 친화적인 물질에 선택적으로 결합하는 것을 이용한 방법이다. 미세 구조물을 만들어서 유체 흐름의 변화를 이용해 단일 세포를 분리하는 방법 또한 활용되고 있다. 하지만, 상기에서 설명한 방법들의 대부분이 조직에서 세포를 분리한 후 단일세포 단위로 분획하고 배양하는 환경이 아직까지 2차원이다. 상기에서 설명한 방법을 사용하면, 분리된 후 배양된 단일 세포가 생체내 환경(in vivo)에서 가지고 있던 세포의 형상적 또는 기능적 특성을 잃어버리게 된다. 그래서 생체조직에서 세포를 분리하고 3차원 환경에서 세포 하나 단위로 분획하고 배양하는 방법이 필요하다. Representative methods of separating living tissues at the level of single cells include micro-dissection using a laser, gradually diluting a suspension containing cells, or using fine pipetting. In addition, a method of separating cells or nuclei in an intact state by making and diluting microcontainers, using an optical tweezer or fluorescence activated cell sorting (FACS) from a suspension, has been developed. . In addition, there is a method of patterning cells isolated from tissues with a cell-friendly material on the surface of a substrate to which the cells adhere. This is a method that uses a selective binding to a cell-friendly material when a suspension containing cells is poured onto a substrate. A method of separating single cells using changes in fluid flow by creating microstructures is also being used. However, in most of the above-described methods, the environment in which cells are separated from tissues and then fractionated and cultured in single cell units is still two-dimensional. When the above-described method is used, a single cell cultured after being isolated loses the shape or functional characteristics of the cell that it had in an in vivo environment. So, there is a need for a method of separating cells from living tissues and fractionating and culturing cells in a three-dimensional environment.

대부분의 3차원 세포 배양 방법은 세포에서 추출한 세포외기질(Extra Cellular Matrix; ECM)와 같은 수화젤을 지지체로서 사용한다. 세포 친화적인 물질로 구성된 수화젤이 지지체의 역할을 하며 안쪽에서 세포가 분리되어 포함시켜 세포가 공간 안에서 포함되게 할 수 있기 때문이다. 하지만, 수화젤은 다른 세포 배양액에 비해 점성 (viscosity)이 크기 때문에, 기존의 단일 세포 분리 방법을 사용할 수가 없다. 상기에서 설명한 세포가 붙은 표면에 세포 친화적인 물질을 패터닝하는 방법을 사용했을 경우, 수화젤이 떨어지지 않을 뿐만 아니라 세포가 수화젤 안에 있기 때문에 일정한 단위로 세포 하나씩 분리하여 분획할 수가 없다. 미세 구조물을 이용하는 방법도 마찬가지로, 수화젤을 이용한 방법으로 구조물 사이에서 유체의 속도 차가 크지 않다. 세포에 섞인 수화젤은 손쉽게 제어하기 힘들기 때문에 현탁액 상태를 기반으로 만들어진 기존의 방법으로 단일 세포를 분리하고 배양하는 방법에는 적용할 수가 없다. 따라서 3차원 환경에서 1개의 세포 단위로 세포를 분획하고 배양할 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요할 실정이다.Most 3D cell culture methods use a hydrating gel such as an Extra Cellular Matrix (ECM) extracted from cells as a support. This is because the hydration gel composed of a cell-friendly material acts as a support and allows cells to be included in space by separating cells from the inside. However, since the hydration gel has a higher viscosity than other cell culture solutions, conventional single cell separation methods cannot be used. When the above-described method of patterning a cell-friendly material on the surface to which the cells are attached is used, not only does the hydration gel fall off, but also because the cells are in the hydration gel, it is impossible to separate and fractionate cells one by one in a certain unit. Similarly, a method using a microstructure is a method using a hydrogel, so that the difference in fluid velocity between the structures is not large. Since the hydration gel mixed with cells is difficult to control easily, it cannot be applied to the method of separating and culturing single cells by the conventional method made based on the suspension state. Therefore, it is necessary to develop a new technology capable of fractionating and culturing cells in a single cell unit in a three-dimensional environment.

대한민국 공개특허 제10-2017-0089020호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0089020

따라서 본 발명의 목적은 조직 유래의 초대 세포를 단일 세포로 효과적으로 분리 및 배양할 수 있는 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a micro-penetrating-based hydrogel microwell array capable of effectively separating and culturing tissue-derived primary cells into single cells.

본 발명의 다른 목적은 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a micro-penetration-based hydrogel microwell array for isolation and cultivation of single cells.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for separating and culturing single cells using the micro-penetration-based hydrogel microwell array of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 단일 세포 분리 및 배양 장치를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an apparatus for separating and culturing single cells.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막들 간에는 일정한 간격을 유지하고 있는 다수의 미세관통막; 및 상기 다수의 미세관통막을 채우고 있는 수화젤층을 포함하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a plurality of micro-penetrating membranes disposed non-contact on the bottom of the cell culture vessel and maintaining a constant spacing between the micro-penetrating membranes; And it provides a micro-penetration-based hydration gel microwell array for separation and cultivation of single cells, including a hydration gel layer filling the plurality of micro-penetrating membranes.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 두께는 10 μm ∼ 500 μm의 크기를 가지며, 상기 간격은 1 μm ~ 500 μm일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, a thickness of 10 μm to 500 μm, and the interval is 1 μm to 500 μm Can be

본 발명의 일실시예에 있어서, 미세관통막 사이에 형성되는 공간은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the space formed between the micro-penetrating membranes may have a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세관통막은 기판의 주요성분이 유리, 실리콘, 나일론(nylon), 폴리에스터(polyester) 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(이)미드(poly(i)mide), 액정크리스탈폴리머 (liquid crystal polymer), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 메실메타아크릴레이트(methyl methacrylate), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리테트라플루오로에텔렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리다이메틸실록레인(polydimethylsiloxane)이거나; 상기 물질로 코팅된 기판으로 그 구조가 그물망형 또는 규칙성 관통형 다공성막일 수 있다.In one embodiment of the present invention, in the micro-penetrating membrane, the main components of the substrate are glass, silicon, nylon, polyester, polypropylene, polyethylene, poly(imide). (i)mide), liquid crystal polymer, polyethylene terephthalate, methyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polytetra Fluoroetherene (polytetrafluoroethylene) or polydimethylsiloxane (polydimethylsiloxane); The substrate coated with the material may have a mesh structure or a regular through-type porous membrane.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수화젤은 세포외기질(ECM-matrigelTM 포함), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 라미닌(laminin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 피브린 (fibrin), 피프로넥틴(fibronectin), 폴리락티드 계열 폴리머 스캐폴드(PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), 폴리스티렌 폴리머 스캐폴드(polystylene polymer scaffold), 히알루론산(hyaluronic acid), 다공성 실크(porous silk) 및 펩타이드 하이드로겔(peptide hydrogel(PuraMatrixTM포함))로 이루어진 매트릭스 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the hydration gel is an extracellular matrix (ECM-matrigel TM Including), collagen, gelatin, chitosan, laminin, polyethylene glycol, fibrin, fibronectin, polylactide polymer scaffold ( PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), polystylene polymer scaffold, hyaluronic acid, porous silk, and peptide hydrogel (including PuraMatrix TM ) It may be selected.

또한, 본 발명은, (1) 산소 플라즈마를 처리하여 미세관통막을 준비하는 단계; (2) 산소 플라즈마가 처리된 기판 상에 수화젤을 도포하는 단계;(3) 상기 미세관통막 상에 상기 수화젤을 부착시키되, 최상단은 기판이 오도록 하고 수화젤이 미세관통막과 부착되도록 하는 단계;(4) 상기 수화젤이 미세관통막 안으로 삽입하는 단계;(5) 상기 최상단에 위치하고 있는 기판이 최하단이 되도록 상기 미세관통막을 뒤집는 단계; 및 (6) 상기 최하단에 위치하고 있는 기판의 무게와 상기 기판 및 수화젤의 인력의 차이로 인해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시키는 단계를 포함하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention, (1) preparing a micro-penetrating membrane by treating the oxygen plasma; (2) applying the hydration gel on the substrate treated with oxygen plasma; (3) attaching the hydration gel on the micro-penetrating film, with the substrate at the top and the hydration gel being attached to the micro-penetrating film Step; (4) inserting the hydration gel into the micro-penetrating membrane; (5) turning the micro-penetrating membrane over so that the uppermost substrate is at the bottom; And (6) gelling the surface of the hydration gel of the micro-penetrating membrane to become a concave shape due to the difference between the weight of the substrate located at the bottom and the attractive force of the substrate and the hydration gel, for separation and culture of single cells It provides a micro-penetration-based hydration gel microwell array manufacturing method.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 산소 플라즈마는 대기압 하의 진공상태에서 산소 농도 5% ~ 100%, 산소의 유류양 0 ~ 500 sccm, 플라즈마의 파워 10 ~ 1000 W 및 1초 ~ 1시간의 작동시간으로 수행하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the oxygen plasma is operated in a vacuum state under atmospheric pressure of 5% to 100% of oxygen, 0 to 500 sccm of oxygen oil, 10 to 1000 W of plasma power, and 1 second to 1 hour It can be done with time.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 두께는 10 μm ∼ 500 μm의 크기를 가지며, 상기 미세관통막 간의 간격은 1 μm ~ 500 μm이고, 상기 미세관통막 사이에 형성되는 공간은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, a thickness of 10 μm to 500 μm, and the interval between the micropenetrating membranes is 1 μm to 500 μm, and the space formed between the micropenetrating membranes may be 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm in width × length.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세관통막은 기판의 주요성분이 유리, 실리콘, 나일론(nylon), 폴리에스터(polyester) 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(이)미드(poly(i)mide), 액정크리스탈폴리머 (liquid crystal polymer), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 메실메타아크릴레이트(methyl methacrylate), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리테트라플루오로에텔렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리다이메틸실록레인(polydimethylsiloxane)이거나; 상기 물질로 코팅된 기판으로 그 구조가 그물망형 또는 규칙성 관통형 다공성막일 수 있다.In one embodiment of the present invention, in the micro-penetrating membrane, the main components of the substrate are glass, silicon, nylon, polyester, polypropylene, polyethylene, poly(imide). (i)mide), liquid crystal polymer, polyethylene terephthalate, methyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polytetra Fluoroetherene (polytetrafluoroethylene) or polydimethylsiloxane (polydimethylsiloxane); The substrate coated with the material may have a mesh structure or a regular through-type porous membrane.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수화젤은 세포외기질(ECM-matrigelTM 포함), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 라미닌(laminin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 피브린 (fibrin), 피프로넥틴(fibronectin), 폴리락티드 계열 폴리머 스캐폴드(PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), 폴리스티렌 폴리머 스캐폴드(polystylene polymer scaffold), 히알루론산(hyaluronic acid), 다공성 실크(porous silk) 및 펩타이드 하이드로겔(peptide hydrogel(PuraMatrixTM포함))로 이루어진 매트릭스 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the hydration gel is an extracellular matrix (ECM-matrigel TM Including), collagen, gelatin, chitosan, laminin, polyethylene glycol, fibrin, fibronectin, polylactide polymer scaffold ( PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), polystylene polymer scaffold, hyaluronic acid, porous silk, and peptide hydrogel (including PuraMatrix TM ) It may be selected.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (6) 단계에서 젤화는 중력이외에 원심력(centrifugal foce), 모세관 힘 (capillary foce), 흡인에 의한 힘 (suction force) 또는 유체 압력 (fluid pressure)에 의해 수화젤이 받는 힘과 표면 장력의 차이에 의해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the gelation in step (6) is hydrated by centrifugal foce, capillary foce, suction force or fluid pressure in addition to gravity It may include gelling so that the surface of the hydration gel of the micro-penetrating membrane becomes concave by the difference between the force received by the gel and the surface tension.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수화젤을 젤화시키는 온도가 10 ∼ 42°C일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the temperature at which the hydration gel is gelled may be 10 to 42 °C.

또한, 본 발명은, (1) 세포 현탁액과 수화젤을 혼합하여 세포 및 수화젤의 혼합물을 제조하는 단계; (2) 상기 세포 및 수화젤의 혼합물을 제1항의 수화젤 마이크로웰 어레이 상에 분주하고 젤화를 유도하는 단계; 및 (3) 상기 세포가 상기 수화젤 마이크로웰 어레이의 미세관통막 간의 사이로 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치하는 단계를 포함하는, 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법을 제공한다.In addition, the present invention, (1) preparing a mixture of cells and hydration gel by mixing the cell suspension and hydration gel; (2) dispensing the mixture of the cells and the hydration gel onto the hydration gel microwell array of claim 1 and inducing gelation; And (3) separation and cultivation of single cells using a micro-penetration-based hydration gel microwell array, comprising the step of separating and positioning the cells into single cells one by one between the micro-penetrating membranes of the hydration gel microwell array Provides a way.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 현탁액에는 세포가 1 × 104 ~ 1 × 106 개/mL의 세포수로 포함되어 있는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cell suspension may contain cells in a cell number of 1 × 10 4 to 1 × 10 6 cells/mL.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 단일 세포로의 분리는 중력, 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 상기 세포가 미세관통막 간의 세포 포획 공간으로 단일세포 형태로 위치되어 분리되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the separation into a single cell in the step (3) is performed by means of gravity, centrifugal force, capillary force, suction force, or fluid pressure. It may be located in a form and separated.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분리는, 중력에 의한 방법은 10분 ~ 1 시간 동안 수행되고, 원심력에 의한 분리는 50 ~ 500g에 의해 수행되며, 유체압력이나 흡인에 의한 힘, 또는 모세관 힘은 30 초 ~ 60분 동안 수행되어, 세포가 미세관통막 간의 세포 포획 공간으로 단일세포 형태로 위치되어 분리되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the separation, the method by gravity is performed for 10 minutes to 1 hour, the separation by centrifugal force is performed by 50 to 500 g, and the force by fluid pressure or suction, or a capillary tube The force may be performed for 30 seconds to 60 minutes, so that the cells are positioned in the form of single cells into the cell capture space between the micropenetrating membranes and separated.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분리는 단일세포에 특이적으로 결합하거나 반응할 수 있는 비드(bead)도 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the separation may include a bead capable of specifically binding or reacting to a single cell.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 단일 세포로의 분리 위치 이후, 세포와 함께 수화젤을 젤화시키는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 젤화는 10 ∼ 42°C의 온도 및 5 ~ 10%의 이산화탄소 농도 조건에서 수행하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, after the separation position into a single cell in step (3), the step of gelling a hydrogel with the cells is further included, wherein the gelling is performed at a temperature of 10 to 42 °C and 5 It may be performed under a carbon dioxide concentration condition of ~ 10%.

또한 본 발명은, (1) 세포 현탁액과 수화젤을 혼합하여 세포 및 수화젤의 혼합물을 제조하는 단계; (2) 상기 세포 및 수화젤의 혼합물을 미세관통막에 분주하는 단계; 및 (3) 상기 세포가 중력, 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 상기 미세관통막 간의 사이로 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치하는 단계를 포함하는, 미세관통 기반의 단일세포 분리 및 배양 방법을 제공한다. In addition, the present invention, (1) preparing a mixture of cells and hydrogel by mixing the cell suspension and hydrogel; (2) dispensing the mixture of the cells and the hydration gel onto the micropenetrating membrane; And (3) separating the cells into single cells one by one between the micro-penetrating membranes by gravity, centrifugal force, capillary force, suction force, or fluid pressure. And a culture method.

나아가 본 발명은, 세포 배양 용기; 상기 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막 간에는 일정한 간격을 유지하면서 배열되어 있는 다수의 미세관통막; 및 상기 미세관통막을 채우고 있는 수화젤 층을 포함하는, 단일 세포 분리 및 배양 장치를 제공한다.Further, the present invention is a cell culture vessel; A plurality of micro-penetrating membranes disposed in a non-contact manner on the bottom of the cell culture vessel and arranged while maintaining a constant gap between the micro-penetrating membranes; And it provides a single cell separation and culture apparatus comprising a hydration gel layer filling the micro-penetrating membrane.

본 발명에 따른 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용할 경우, 별도의 장치 없이 간단한 방법으로 손쉽게 3차원 환경에서 분석하고자 하는 세포를 단일 세포 단위로 효과적으로 분리 및 배양할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 종류의 다양한 세포에 대한 동시 관찰 및 분석이 가능하고, 다양한 환경 변화에 따른 세포 간의 반응성에 대한 변이 및 영향을 3차원 환경에서 보다 손쉽게 관찰할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 별도의 장치가 요구되지 않고 사용방법이 간단할 뿐만 아니라, 높은 생체 적합성을 가지는 수화젤을 사용하기에 세포 및 생물학적 시료를 연구하는 생물학 및 관련 의약학 분야에 모두 활용할 수 있다.In the case of using the micro-penetration-based hydration gel microwell array according to the present invention, cells to be analyzed in a three-dimensional environment can be effectively separated and cultured in a single cell unit with a simple method without a separate device. Simultaneous observation and analysis of various types of cells is possible, and variations and influences on reactivity between cells according to various environmental changes can be more easily observed in a three-dimensional environment. In addition, since the method of the present invention does not require a separate device and is simple to use, and uses a hydrogel having high biocompatibility, it can be used in both biology and related fields of medicine to study cells and biological samples. .

도 1은 본 발명에 따른 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이에 관한 모식도로서, 1a는 본 발명에 따른 미세관통 기반의 수화젤 마이크로 웰을 제조하는 과정을 나타낸 것이고, 1b는 제조된 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 3차원 환경에서의 단일 세포 분리 및 배양에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 미세관통막의 종류로 사용된 나일론 메쉬(nylon mesh)(2a), 커버 유리(0.17mm)(2b) 및 PDMS 관통막(2c)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 셀스트레이너와 원심분리기를 이용한 본 발명의 수화젤 마이크로웰의 제조 공정 및 단일 신경세포의 분리와 배양에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 셀스트레이너를 이용한 수화젤 마이크로웰 어레이 안에 단일 신경 세포가 1개의 세포단위로 분리되어 있음을 확인한 사진을 나타낸 것이고(4a), 또한, 단일 신경 세포가 1개의 세포단위로 분리되어 3차원 환경에서 배양되었음을 확인한 사진이다(4b).
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 수화젤 마이크로 웰 안에 분리되어 배양된 3차원 단일 신경세포의 광학 자극 신경 신호 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 PDMS 미세관통막에 세포와 배합된 수화젤이 통과하면서 미세관통막 안으로 3차원 단일 신경세포가 1개의 단일세포 단위로 분리되는 것을 개념도로 나타낸 것이다.
도 6b는 세포와 배합된 수화젤이 PDMS 관통막을 통과하면서 분리된 신경세포를 3차원에서 배양한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6c는 세포와 배합된 수화젤이 PDMS 관통막을 통과하면서 분리되어 세포가 각 미세용기에 3차원적으로 정렬되어 있음을 확인한 결과를 나타낸 사진이다.1 is a schematic diagram of a micro-penetration-based hydration gel microwell array according to the present invention, 1a is showing a process of manufacturing a micro-penetration-based hydration gel microwell according to the present invention, 1b is A schematic diagram of single cell isolation and culture in a three-dimensional environment using a hydrogel microwell array is shown.
Figure 2 shows a nylon mesh (2a), a cover glass (0.17mm) (2b) and a PDMS penetrating membrane (2c) used as the type of the micro-penetrating membrane in an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows a schematic diagram of the manufacturing process of the hydration gel microwell of the present invention using a cell strainer and a centrifuge according to an embodiment of the present invention and the isolation and culture of single neurons.
4 is a photograph showing a picture confirming that a single nerve cell is separated into one cell unit in a hydration gel microwell array using the cell strainer of the present invention in an embodiment of the present invention (4a), and a single nerve cell Is a photograph confirming that is separated into one cell unit and cultured in a three-dimensional environment (4b).
FIG. 5 shows the results of measuring changes in optical stimulation nerve signals of three-dimensional single nerve cells separated and cultured in the hydration gel micro-well according to an embodiment of the present invention.
Figure 6a is a conceptual diagram showing that the three-dimensional single nerve cells are separated into one single cell unit into the micropenetrating membrane as the hydration gel blended with cells passes through the PDMS micropenetrating membrane of the present invention.
6B is a photograph showing a result of culturing isolated nerve cells in 3D while passing through the PDMS penetrating membrane of the hydration gel mixed with the cells.
6C is a photograph showing the result of confirming that the hydration gel mixed with the cells is separated while passing through the PDMS penetrating membrane, and the cells are three-dimensionally aligned in each microcontainer.

본 발명은 3차원 환경에서 단일 세포를 효과적으로 분리 및 배양할 수 있는 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 및 이의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a micro-penetration-based hydration gel microwell array capable of effectively separating and culturing single cells in a three-dimensional environment and a method of manufacturing the same.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이는, 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막 간에는 일정한 간격을 유지하면서 배열되어 있는 다수의 미세관통막; 및 상기 다수의 미세관통막을 채우고 있는 수화젤층을 포함한다.Specifically, the micro-penetrating-based hydration gel microwell array for isolation and cultivation of single cells provided in the present invention is disposed non-contact at the bottom of the cell culture vessel and is arranged while maintaining a constant gap between the micro-penetrating membranes. A number of micropenetrating membranes; And a hydration gel layer filling the plurality of micro-penetrating membranes.

본 발명에서 상기 “미세관통막”은 분리 및 배양하고자 하는 세포를 1개의 단일 세포 단위로 포획할 수 있는 공간을 형성하기 위해 사용하는 것으로, 상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 두께는 10 μm ∼ 500 μm이며, 미세관통막과 또 다른 미세관통막 간의 간격은 1 μm ~ 500 μm의 간격이 되도록 다수의 미세관통막을 위치시킨다.In the present invention, the “micro-penetrating membrane” is used to form a space capable of capturing cells to be separated and cultured in one single cell unit, and the micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm ∼ It is 500 μm × 500 μm, the thickness is 10 μm to 500 μm, and the distance between the micropenetrating membrane and another micropenetrating membrane is 1 μm to 500 μm.

또한, 상기 미세관통막은 기판의 주요성분으로 유리, 실리콘, 나일론(nylon), 폴리에스터(polyester) 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(이)미드(poly(i)mide), 액정크리스탈폴리머 (liquid crystal polymer), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 메실메타아크릴레이트(methyl methacrylate), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리테트라플루오로에텔렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리다이메틸실록레인(polydimethylsiloxane)이거나; 상기 물질로 코팅된 기판으로 그 구조가 그물망형 또는 규칙성 관통형 다공성막인 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.In addition, the micro-penetrating membrane is a major component of the substrate, including glass, silicon, nylon, polyester, polypropylene, polyethylene, poly(i)mide, and liquid crystal. Liquid crystal polymer, polyethylene terephthalate, methyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polytetrafluoroethylene Or polydimethylsiloxane; The substrate coated with the material may have a mesh structure or a regular through-type porous membrane, but is not limited thereto.

예컨대, 미세관통막으로 유리 기판을 사용할 경우, 얇은 유리 기판을 레이저로 가공하여 사용할 수 있으며, 상기 미세관통막으로 나일론 메쉬, 폴리프로필렌 메쉬, 폴리에틸렌 메쉬와 같은 그물망 형태를 갖는 소재를 사용할 다공성막 자체를 미세관통막으로 사용할 수 있다. For example, when a glass substrate is used as a micro-penetrating membrane, a thin glass substrate can be processed with a laser, and the micro-penetrating membrane itself is a porous membrane that uses a material having a mesh shape such as nylon mesh, polypropylene mesh, and polyethylene mesh. Can be used as a micropenetrating membrane.

본 발명에서 상기 “수화젤(hydrogel)”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하는, 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 구조 망상물을 이루는 물질을 말하며, 세포 부착 및 배양에 적합한 하이드로겔이라면 특별히 제한되지 않는다. In the present invention, the “hydrogel” is a three-dimensional structure network formed by crosslinking a hydrophilic polymer through covalent or non-covalent bonds, in which a liquid using water as a dispersion medium hardens through a sol-gel phase transition and loses fluidity. It refers to a substance and is not particularly limited as long as it is a hydrogel suitable for cell adhesion and culture.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 수화젤로는 일반적으로 3차원 세포 배양할 때 사용할 수 있는 젤이라면 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, 세포외기질(ECM-matrigelTM 포함), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 라미닌(laminin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 피브린 (fibrin), 피프로넥틴(fibronectin), 폴리락티드 계열 폴리머 스캐폴드(PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), 폴리스티렌 폴리머 스캐폴드(polystylene polymer scaffold), 히알루론산(hyaluronic acid), 다공성 실크(porous silk) 및 펩타이드 하이드로겔(peptide hydrogel(PuraMatrixTM포함))로 이루어진 매트릭스 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.The hydration gel that can be used in the present invention can be used as long as it is a gel that can be used in general three-dimensional cell culture, but is not limited thereto, but the extracellular matrix (ECM-matrigel TM Including), collagen, gelatin, chitosan, laminin, polyethylene glycol, fibrin, fibronectin, polylactide polymer scaffold ( PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), polystylene polymer scaffold, hyaluronic acid, porous silk, and peptide hydrogel (including PuraMatrix TM ) You can use whatever you choose.

또한, 본 발명은 상기 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이의 제조방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 제조방법은, (1) 산소 플라즈마를 처리하여 미세관통막을 준비하는 단계; (2) 산소 플라즈마가 처리된 기판 상에 수화젤을 도포하는 단계;(3) 상기 미세관통막 상에 상기 수화젤을 부착시키되, 최상단은 기판이 오도록 하고 수화젤이 미세관통막과 부착되도록 하는 단계; (4) 상기 수화젤이 미세관통막 안으로 삽입하는 단계; (5) 상기 최상단에 위치하고 있는 기판이 최하단이 되도록 상기 미세관통막을 뒤집는 단계; 및 (6) 상기 최하단에 위치하고 있는 기판의 무게와 상기 기판 및 수화젤의 인력의 차이로 인해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시키는 단계를 포함할 수 있다.In addition, the present invention can provide a method of manufacturing a micro-penetrating-based hydration gel microwell array for the separation and cultivation of the single cell, preferably, the manufacturing method comprises: (1) treating a micro-penetrating membrane by treating oxygen plasma. Preparing; (2) applying the hydration gel on the substrate treated with oxygen plasma; (3) attaching the hydration gel on the micro-penetrating film, with the substrate at the top and the hydration gel being attached to the micro-penetrating film step; (4) inserting the hydration gel into the micro-penetrating membrane; (5) turning over the micro-penetrating membrane so that the substrate positioned at the top is at the bottom; And (6) gelling the surface of the hydration gel of the micro-penetrating membrane into a concave shape due to a difference between the weight of the substrate positioned at the bottom and the attractive force of the substrate and the hydration gel.

본 발명의 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.A detailed description of the method of manufacturing the micro-penetration-based hydration gel microwell array of the present invention is as follows.

먼저, (1) 산소 플라즈마를 처리하여 미세관통막을 준비한다.First, (1) oxygen plasma is treated to prepare a micro-penetrating membrane.

여기서 상기 산소 플라즈마는 대기압 하의 진공상태에서 산소 농도 5% ~ 100%, 산소의 유류양 0 ~ 500 sccm, 플라즈마의 파워 10 ~ 1000 W 및 1초~ 1시간의 작동시간으로 수행하여, 상기 미세관통막의 성질을 소수성에서 친수성으로 변화되도록 하였다.Here, the oxygen plasma is performed in a vacuum state under atmospheric pressure with an oxygen concentration of 5% to 100%, an amount of oxygen of 0 to 500 sccm, a power of the plasma of 10 to 1000 W, and an operating time of 1 second to 1 hour, and the micro-penetration The properties of the membrane were changed from hydrophobic to hydrophilic.

본 발명에 사용한 상기 미세관통막에 대한 정의는 앞서 기재한 바와 같으며, 상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 막의 두께는 10 μm ∼ 500 μm이며, 미세관통막들 사이의 간격은 1 μm ~ 500 μm의 간격이 되도록 다수의 미세관통막을 일정 간격으로 배열시켰다.The definition of the micropenetrating membrane used in the present invention is as described above, the micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, and the thickness of the membrane is 10 μm to 500 μm, A plurality of micropenetrating membranes were arranged at regular intervals so that the spacing between the micropenetrating membranes was 1 μm to 500 μm.

이와 같이 특정 크기를 갖는 미세관통막의 사용은 조직 유래의 초대 세포들을 1개의 단일세포로 분리하여 포획하기에 가장 적합하도록 크기를 조절한 것이며, 미세관통막 사이의 공간이 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ~ 500 μm × 500 μm이 되도록 하여, 1개의 세포 단위로 분리된 단일세포에 대해 세포배양 및 세포분석이 용이하도록 공간을 확보할 수 있도록 하였다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 공간에서, 분리된 1개의 단일신경세포에 대한 축삭 성장 여부를 분석할 수 있었다.In this way, the use of a micropenetrating membrane having a specific size is the size of the tissue-derived primary cells to be separated into one single cell and adjusted in size to be most suitable for capturing, and the space between the micropenetrating membranes is horizontal × vertical × 1 μm × 1 μm ~ 500 μm × 500 μm, so that a space can be secured for easy cell culture and cell analysis for single cells separated by one cell unit. In one embodiment of the present invention, in the space, it was possible to analyze whether axon growth for one isolated single nerve cell.

미세관통막에 대한 산소 플라즈마 처리가 완료되면, (2) 산소 플라즈마가 처리된 기판 상에 수화젤을 도포한다.When the oxygen plasma treatment of the micro-penetrating membrane is completed, (2) a hydration gel is applied on the oxygen plasma-treated substrate.

상기 기판에 대한 산소 플라즈마 처리는 상기 미세관통막에 처리하는 조건과 동일 조건으로 수행할 수 있으며, 상기 기판은 바람직하게 유리 기판을 사용할 수 있다.The oxygen plasma treatment of the substrate may be performed under the same conditions as those of the micro-penetrating film, and the substrate may preferably be a glass substrate.

상기 기판 상에 적절한 두께의 수화젤 도포가 완료되면, 이후 (3) 상기 미세관통막 상에 상기 수화젤을 부착시키는데, 미세관통막 윗쪽에 수화젤이 오도록 하고 그 위에 기판이 위치되도록 하여, 최상단은 기판이 있고 그 밑에 있는 수화젤이 미세관통막과 부착되도록 한다.After application of the hydration gel of an appropriate thickness on the substrate is completed, (3) the hydration gel is attached to the micro-penetrating membrane. The hydration gel is placed on the micro-penetrating membrane and the substrate is placed on the top of the micro-penetrating membrane There is a silver substrate and the hydration gel beneath it is attached to the micropenetrating membrane.

이후, (4) 상기 수화젤이 미세관통막 안으로 채워지도록 방치한다. 상기 수화젤은 중력에 의해 일정 시간이 지나면 다수의 일정 간격으로 배열된 미세관통막 쪽으로 이동하여 미세관통막에 수화젤 층이 형성된다.Thereafter, (4) the hydration gel is left to be filled into the micro-penetrating membrane. The hydration gel moves toward the micro-penetrating membranes arranged at a plurality of regular intervals after a certain period of time by gravity, and a hydration gel layer is formed on the micro-penetrating membrane.

이후, (5) 최상단에 위치하고 있는 기판이 최하단이 되도록 상기 미세관통막을 뒤집어, (6) 상기 최하단에 위치하고 있는 기판의 무게와 상기 기판 및 수화젤의 인력의 차이에 의해 미세관통막 윗쪽의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시킨다.Thereafter, (5) the micropenetrating membrane is turned over so that the substrate positioned at the top is the bottom end, and (6) the hydration gel on the top of the micropenetrating membrane due to the difference between the weight of the substrate positioned at the bottom and the attractive force of the substrate and the hydration gel. Gel is made so that the surface becomes concave.

이러한 방법에 의해, 다수의 미세관통막들이 일정 간격으로 위치하고 있고, 일정 간격으로 배열된 상기 미세관통막들 사이의 공간이 수화젤로 채워져 있으며, 수화젤의 상단 표면이 오목한 형태를 갖는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 제조하였다. 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이의 제조공정은 도 1a에 나타내었다.By this method, a plurality of micro-penetrating membranes are located at regular intervals, the space between the micro-penetrating membranes arranged at regular intervals is filled with hydration gel, and the top surface of the hydration gel is concave, single cell A micro-penetration-based hydration gel microwell array was prepared for separation and cultivation. The manufacturing process of the hydration gel microwell array of the present invention is shown in FIG. 1A.

나아가 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용할 경우, 실제적으로 세포를 단일 세포 단위로 분리할 수 있는지 확인하기 위하여, 초대 신경 세포를 대상으로 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 세포 분리를 수행한 결과, 높은 효율로 단일 세포를 분리 및 배양할 수 있음을 확인하였고, 분리된 단일 세포를 대상으로 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 함유한 세포 배양용기에서 세포 분석, 구체적으로 광학적 신경 신호의 변화를 측정할 수 있음을 알 수 있었다.Further, the present inventors, when using the micro-penetration-based hydration gel microwell array prepared in the present invention, in order to confirm whether cells can be actually separated into a single cell unit, the hydration gel micro- As a result of performing cell separation using a well array, it was confirmed that single cells can be isolated and cultured with high efficiency, and cells in the cell culture vessel containing the hydration gel microwell array of the present invention targeting the isolated single cells. Analysis, specifically, it was found that the change in the optical neural signal can be measured.

따라서 본 발명은 본 발명의 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 바람직하게, (1) 세포 현탁액과 수화젤을 혼합하여 세포 및 수화젤의 혼합물을 제조하는 단계; (2) 상기 세포 및 수화젤의 혼합물을 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이 상에 분주하고 젤화를 유도하는 단계; 및 (3) 상기 세포가 상기 수화젤 마이크로웰 어레이의 미세관통막 간의 사이로 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치하는 단계를 포함한다.Accordingly, the present invention can provide a method for separating and culturing single cells using the micro-penetration-based hydration gel microwell array of the present invention, and the method is preferably (1) a cell suspension and a hydration gel are mixed to Preparing a mixture of hydrogel; (2) dispensing the mixture of the cells and the hydration gel onto the hydration gel microwell array of the present invention and inducing gelation; And (3) separating and positioning the cells into single cells one by one between the micro-penetrating membranes of the hydrogel microwell array.

이때 상기 세포 현탁액에는 세포가 1 × 104 ~ 1 × 106 개/mL의 세포수로 포함되도록 하는데, 상기 세포수보다 너무 많은 세포수의 농도로 포함할 경우, 단일 세포로의 분리 효율이 저하되는 문제점이 있으므로, 상기 세포수의 범위 내로 포함되도록 하였다.At this time, the cell suspension contains cells at a cell number of 1 × 10 4 ~ 1 × 10 6 cells/mL, but if the cell number is included in a concentration of too many cells than the cell number, the efficiency of separation into single cells decreases. Since there is a problem, it was included within the range of the number of cells.

또한, 상기 세포 현탁액과 혼합하는 수화젤의 최종 농도는 40~50%의 농도가 되도록 하는데, 이는 수화젤의 농도가 세포 활성에 영향을 미치기 때문이다.In addition, the final concentration of the hydration gel mixed with the cell suspension is made to be a concentration of 40-50%, because the concentration of the hydration gel affects cell activity.

수화젤의 농도가 40% 미만일 경우, 점성이 너무 낮아 3차원의 환경 조성을 형성할 수 없는 문제가 발생하고, 수화젤의 농도가 50%를 초과할 경우, 점성이 너무 높아 세포가 움직일 수 없고 세포 활성을 억제할 수 있기 때문이다. If the concentration of the hydration gel is less than 40%, the viscosity is too low to form a three-dimensional environment, and if the concentration of the hydration gel exceeds 50%, the viscosity is too high and the cells cannot move and the cells This is because it can inhibit the activity.

또한, 본 발명에 따른 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일 세포로의 분리는, 다수의 미세관통막들이 배열되어 형성된 공간(즉, 세포 포획 공간)에 채워진 상단 표면이 오목한 형태를 갖는 수화젤층 안으로 세포가 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치된다. 구체적으로 상기 오목한 형태를 갖는 수화젤층의 형성은 중력에 의해서도 형성될 수 있고, 중력 이외에 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 기판이 받는 힘과 표면 장력에 의해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화될 수 있다. In addition, the separation into single cells using the hydrogel microwell array according to the present invention is performed in a hydrogel layer having a concave upper surface filled in a space formed by arranging a plurality of micropenetrating membranes (ie, a cell capture space). Each is separated into single cells and positioned. Specifically, the formation of the hydration gel layer having the concave shape may be formed by gravity, and in addition to gravity, the hydrogel of the micro-penetrating membrane is caused by the force and surface tension of the substrate by centrifugal force, capillary force, suction force, or fluid pressure. It can be gelled so that the surface becomes concave.

본 발명에서 상기 단일 세포로의 분리는 중력, 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 상기 수화젤층 안으로 단일세포의 형태로 세포가 분리되어 포집된다.In the present invention, the cells are separated and collected in the form of single cells into the hydration gel layer by gravity, centrifugal force, capillary force, force by suction, or fluid pressure.

상기 세포 분리방법에 있어서, 중력에 의한 방법은 10분 ~ 1 시간 동안 수행될 수 있고, 원심력에 의한 분리는 50 ~ 500g에 의해 수행될 수 있으며, 유체압력이나 흡인에 의한 힘, 또는 모세관 힘 (capillary foce)은 30 초 ~ 60분 동안 수행될 수 있다. In the cell separation method, the method by gravity may be performed for 10 minutes to 1 hour, separation by centrifugal force may be performed by 50 to 500 g, and force by fluid pressure or suction, or capillary force ( capillary foce) can be performed for 30 seconds to 60 minutes.

또한 상기 본 발명의 방법에서, 단일 세포로의 분리 위치 이후 세포와 함께 수화젤을 젤화시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때 상기 젤화는 10 ∼ 42°C의 온도 및 5 ~ 10%의 이산화탄소 농도 조건 하에서 수행할 수 있다.In addition, in the method of the present invention, the step of gelling the hydration gel together with the cells after the separation position into a single cell may be further included, wherein the gelation is performed at a temperature of 10 to 42 °C and a carbon dioxide concentration of 5 to 10%. Can be carried out under conditions.

이와 같이 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 통해 3차원 환경인 수화젤 층 안으로 분리된 단일 세포는 배양 배지가 함유된 조건 하에서 세포 배양이 가능하며, 나아가 단일 세포에 대한 세포 분석도 가능하다(도 1b 참조).As described above, single cells separated into the hydration gel layer, which is a three-dimensional environment through the hydration gel microwell array of the present invention, can be cultured under conditions containing a culture medium, and further, cell analysis for single cells is also possible (Fig. 1b).

또한, 본 발명에 따른 상기 분리는 단일 세포의 분리뿐만 아니라 상기 단일 세포에 특이적으로 결합하거나 반응할 수 있는 비드(bead)도 분리할 수 있다. In addition, the separation according to the present invention can separate not only single cells but also beads capable of specifically binding or reacting to the single cells.

또한 본 발명은 미세관통을 기반으로 하는 단일세포의 분리 및 배양 방법에 있어서 또 다른 방법으로, (1) 세포 현탁액과 수화젤을 혼합하여 세포 및 수화젤의 혼합물을 제조하는 단계; (2) 상기 세포 및 수화젤의 혼합물을 미세관통막에 분주하는 단계; 및 (3) 상기 세포가 중력, 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 상기 미세관통막 간의 사이로 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치하는 단계를 포함하는 미세관통 기반의 단일세포의 분리 및 배양 방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention is another method for the separation and cultivation of single cells based on micro-penetration, comprising: (1) preparing a mixture of cells and hydration gel by mixing a cell suspension and a hydration gel; (2) dispensing the mixture of the cells and the hydration gel onto the micropenetrating membrane; And (3) separation of single cells based on micro-penetration comprising the step of separating the cells into single cells one by one between the micro-penetrating membranes by gravity, centrifugal force, capillary force, force by suction, or fluid pressure. And it can provide a culture method.

상기 방법은 단일 세포로 분리하고자 하는 세포를 포함하는 수화젤 또는 세포와 수화젤의 혼합물을 상기 미세관통막에 통과시켜 3차원 환경 내에서 상기 세포를 1개의 단일세포로 분리 및 배양할 수 있다.The method may separate and culture the cells into one single cell in a three-dimensional environment by passing a hydration gel including cells to be separated into single cells or a mixture of cells and hydration gels through the micropenetrating membrane.

이때 사용할 수 있는 상기 미세관통막은 앞서 기술한 본 발명의 미세관통막이라면 모두 사용할 수 있다.The micro-penetrating membrane that can be used at this time may be any of the micro-penetrating membranes of the present invention described above.

나아가 본 발명은, 세포 배양 용기; 상기 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막 간에는 일정한 간격을 유지하면서 배열되어 있는 다수의 미세관통막; 및 상기 미세관통막을 채우고 있는 수화젤층을 포함하는, 단일 세포 분리 및 배양 시스템을 제공할 수 있으며, 상기 “ 단일 세포 분리 및 배양 시스템”은 세포를 배양하는 용기, 장치 또는 기기를 말한다. Further, the present invention is a cell culture vessel; A plurality of micro-penetrating membranes disposed in a non-contact manner on the bottom of the cell culture vessel and arranged while maintaining a constant gap between the micro-penetrating membranes; And it is possible to provide a single cell separation and culture system including a hydration gel layer filling the micropenetrating membrane, and the “single cell separation and culture system” refers to a container, device, or device for culturing cells.

상기 세포 배양 용기는 일반적으로 세포를 배양할 수 있는 용기라면 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 셀트레이너 등을 사용할 수 있다.In general, the cell culture vessel may be used as long as it is a vessel capable of culturing cells, but is not limited thereto, but a dish, a cell trainer, or the like used for cell culture may be used.

본 발명에서 제공하는 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이는 분석하고자 하는 세포를 1개의 단일 세포 형태로 3차원 환경 조건에서 분리 및 배양하는데 사용할 수 있다. The micro-penetration-based hydration gel microwell array for isolation and cultivation of single cells provided in the present invention can be used to separate and culture cells to be analyzed in the form of one single cell under three-dimensional environmental conditions.

본 발명에서 상기 “3차원 환경 조건”은 본 발명의 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 또는 미세관통막에서의 분리 및 배양 조건을 말하는 것으로, 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있으며 일정 간격으로 배열된 미세관통막들 간에 형성된 공간에 채워진 수화젤 내부로의 분리 및 배양을 말한다. In the present invention, the "three-dimensional environmental condition" refers to the separation and culture conditions in the micro-penetration-based hydration gel microwell array or the micro-penetration membrane of the present invention, and is disposed in a non-contact manner on the bottom of the cell culture vessel It refers to the separation and cultivation into the hydration gel filled in the space formed between the micro-penetrating membranes arranged at intervals.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.

<실시예 1><Example 1>

3차원 환경에서의 단일세포 분리 및 배양을 위한 수화젤 마이크로웰 어레이의 제조 Preparation of hydration gel microwell array for single cell isolation and culture in a three-dimensional environment

3차원 환경에서의 단일세포 분리 및 배양을 위한 수화젤 마이크로웰 어레이를 다음과 같은 방법으로 제조하였고, 제조 과정의 모식도를 도 1a에 나타내었다. 먼저, 미세관통막에 산소 플라즈마 처리를 하였고, 수화젤(hydrogel)은 마찬가지로 산소 플라즈마 처리를 한 유리 기판에 얇게 도포한 후, 산소 플라즈마가 처리된 미세 관통막의 윗면에 붙였다. 이후, 이렇게 붙인 수화젤은 중력에 의해서 미세 관통막 안으로 들어가도록 하였다. 수화젤이 충분히 미세 관통막으로 들어간 후에는 미세 관통막을 뒤집어 유리 기판이 바닥에 오도록 하였고 미세 관통막이 위쪽이 되도록 함으로써, 다시 기판의 무게와 상기 기판 및 수화젤의 인력의 차이에 의해 미세 관통막에서 수화젤을 끌어당겨지도록 하였다. 이 때, 수화젤은 젤화되는 과정이고, 미세관통막과 수화젤의 표면 장력 때문에 수화젤의 표면은 각 관통막마다 오목하게 변하였다. 이렇게 표면이 오목한 형태로 변한 후, 젤화의 완료를 통해 본 발명의 수화젤 마이크로 웰 어레이를 제조하였다.A hydrogel microwell array for isolation and cultivation of single cells in a three-dimensional environment was prepared by the following method, and a schematic diagram of the manufacturing process is shown in FIG. 1A. First, oxygen plasma treatment was performed on the micropenetrating membrane, and a hydrogel was applied thinly to a glass substrate treated with oxygen plasma, and then attached to the upper surface of the micropenetrating membrane treated with oxygen plasma. Thereafter, the hydration gel attached in this way was allowed to enter the micro penetrating membrane by gravity. After the hydration gel has sufficiently entered the micro-penetrating membrane, the micro-penetrating membrane is turned over so that the glass substrate is on the bottom, and the micro-penetrating membrane is made upward. The hydration gel was allowed to pull. At this time, the hydration gel is a process of gelation, and the surface of the hydration gel is concave for each penetrating membrane due to the surface tension of the micropenetrating membrane and the hydration gel. After the surface was changed to a concave shape, the hydrogel microwell array of the present invention was prepared through completion of gelation.

<실시예 2><Example 2>

나일론 nylon 메쉬로With mesh 구성된 셀 Configured cell 스트레이너를Strainer 이용하여 제조된 본 발명의 Of the present invention manufactured using 수화젤Hydration Gel 마이크로웰Microwell 어레이 및 이를 이용한 3차원 초대 신경세포의 분리 및 배양 Isolation and culture of arrays and 3D primary neurons using the same

상기 실시예 1에 기재된 본 발명의 마이크로웰 어레이 제조에 있어서, 미세 관통막으로, 세포 필터링할 때 사용되는 나일론 메쉬(가로 × 세로가 50 μm × 50 μm)로 구성된 셀 스트레이너를 사용하여 수화젤 마이크로웰 어레이를 제조하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 셀 스트레이너(100 μm Cell Strainer, SPL, Korea)를 산소 플라즈마 장비(CUTE-1MP, 펨토사이언스, Korea)로 100W, 100 sccm, 30분간 처리하여, 표면을 친수성으로 변화시켰다. 이후 18mm 커버 글래스(Cover glasses thickness No. 1 circular 18mm Ø, MARIENFELD, Germany)도 셀 스크레이너와 동일 조건으로 산소 플라즈마를 처리하였다. 이후 산소 플라즈마가 처리된 커버 글래스 위에 수화젤로서 피브린을 50 μL 도포하고 셀 스트레이너 위쪽으로 수화젤과 커버 글래스가 오도록 위치시켰다. 이때 상기 피브린은 피브리노겐(Fibrinogen from human plasma, Sigma Aldrich, USA)과 쓰롬빈 (Thrombin from bovine plasma, Sigma Aldrich, USA)을 50:1로 섞어 효소 반응을 일으켜 만드는 것을 사용하였다. 이후 셀 스트레이너를 뒤집어서 커버 글래스가 아래쪽으로 향하게 한 후, 37°C 및 5% CO2 가 유지되는 세포 배양기(MCO-17AIC, Sanyo, Japan)에 45분간 방치하면서 충분히 피브린을 젤화시켰다. 이때 젤화된 피브린의 표면은 젤이 중력에 의해 오목한 형태가 형성된다. 이후, ECM중의 하나인 Matrigel Matrix (Standard Corning Matrigel matrix, Corning, USA)을 세포 배양 미디어 (Neurobasal Media, Thermo Fisher, USA)와 1:1로 섞은 50% Matrigel에 초대 신경 세포 현탁액을 첨가하여 배합하였다. 이 때, 세포의 농도는 세포의 크기에 따라 다르게 조절할 수 있는데, 초대 신경 세포의 경우 1 ~ 5 × 105 개/mL를 최종 농도로 할 수 있으며, 본 실험에서는 3 × 105 개/mL가 최종 농도가 되도록 하였다. In the preparation of the microwell array of the present invention described in Example 1, using a cell strainer composed of a nylon mesh (horizontal × length 50 μm × 50 μm) used as a fine penetrating membrane and used to filter cells A well array was prepared. Specifically, as shown in FIG. 1, a cell strainer (100 μm Cell Strainer, SPL, Korea) was treated with an oxygen plasma equipment (CUTE-1MP, Femtoscience, Korea) for 100W, 100 sccm, 30 minutes, and the surface was hydrophilic. Changed to. After that, 18mm cover glasses (Cover glasses thickness No. 1 circular 18mm Ø, MARIENFELD, Germany) were also treated with oxygen plasma under the same conditions as the cell screener. Thereafter, 50 μL of fibrin was applied as a hydration gel on the cover glass treated with oxygen plasma, and the hydration gel and the cover glass were positioned above the cell strainer. At this time, the fibrin was used to generate an enzymatic reaction by mixing fibrinogen from human plasma (Sigma Aldrich, USA) and thrombin (Thrombin from bovine plasma, Sigma Aldrich, USA) at 50:1. Thereafter, the cell strainer was turned over to face the cover glass downward, and then left in a cell incubator (MCO-17AIC, Sanyo, Japan) maintained at 37°C and 5% CO 2 for 45 minutes to sufficiently gelate fibrin. At this time, the surface of the gelled fibrin is formed in a concave shape by the gravity of the gel. Thereafter, one of the ECMs, Matrigel Matrix (Standard Corning Matrigel matrix, Corning, USA) was mixed with 50% Matrigel mixed 1:1 with cell culture media (Neurobasal Media, Thermo Fisher, USA) by adding primary nerve cell suspension. . At this time, the concentration of cells can be adjusted differently depending on the size of the cells. In the case of primary neurons, 1 ~ 5 × 10 5 cells/mL may be the final concentration, and in this experiment, 3 × 10 5 cells/mL It was brought to the final concentration.

이때 실험에 사용한 상기 초대 신경 세포는 14일 임신한 어미쥐 (CD1 mouse, 코아텍, Korea)에서 태아쥐의 뇌를 적출한 후, 뇌막 (meninges)을 벗겨내고, 각 hemisphere 안쪽에 있는 해마 (hippocampus)를 절개하였다. 이렇게 준비된 해마는 Trysin-EDTA (Trypsin-EDTA 0.25%, ThermoFisher, USA)에 15분간 37°C에 방치한 후, 10% FBS (Fetal Bovine Serum, ThermoFisher, USA)에 포함된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, ThermoFisher, USA)을 첨가하여 세포들을 떼어낸 후, 원심 분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 수득한 세포 펠렛에 상기 신경세포 배양액을 첨가하고 상기 수화젤과 배합해서 사용하였다.At this time, the primary nerve cells used in the experiment were, after extracting the brain of a fetal mouse from a 14-day pregnant mother rat (CD1 mouse, Coretech, Korea), peeling the meninges, and removing the hippocampus inside each hemisphere. ) Was incised. The prepared hippocampus was left in Trysin-EDTA (Trypsin-EDTA 0.25%, ThermoFisher, USA) for 15 minutes at 37°C, and then DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, ThermoFisher, USA) was added to remove the cells, followed by centrifugation to obtain a cell pellet. The neuron culture solution was added to the obtained cell pellet, and then used in combination with the hydrogel.

초대 신경 세포와 배합된 ECM(또는 Matrigel) 150 μL를 상기 표면이 오목한 형태를 갖는 젤화된 피브린 위에 뿌려준 후, 산소 플라즈마로 처리한 18mm 커버 글래스를 덮어주었다. 이후 상온에서 10분 동안 놓아두어 ECM이 젤화 되기를 기다린 후, 원심 분리기에 넣는다. 원심분리기 (1248, LABOGENE, Korea)에 넣을 때, 50mL Tube (Conical Centrifuge Tube, SPL, Korea) 에 넣어서 돌리며, 원심 분리기의 시간과 세기는 세포의 종류에 따라 다르게 적용할 수 있다. 초대 신경세포 배양의 경우, 200g 이하에서는 세포의 활성도가 큰 차이가 없으며, 10분 동안 원심 분리를 수행하였다. 원심 분리한 ECM은 다시 세포 배양기에 넣어서 45분간 젤화시켜 주었다. 충분히 젤화된 후, B27 (B-27TM Supplement serum free, ThermoFisher, USA)과 L-Glutamine (GlutaMaxTM, ThermoFisher, USA) 가 포함된 세포 배양액 (Neurobasal Media, ThermoFisher, USA)을 넣어주었다. 이때, 위쪽 면의 18mm 커버 글래스는 제거하였고 아래쪽면의 18mm 커버 글래스는 보통 하루가 지나면 떨어진다. 초대신경세포 배양의 경우, 배양 후 1일 후에, 신경교세포가 배양된 18mm 커버 글래스를 셀 스트레이너 위쪽에 넣어준 다음 같이 배양하였다. 3차원 환경에서 배양된 단일 신경세포를 관찰할 때는 18mm 커버 글래스를 뗀 상태에서 공초점 현미경(TCS SP8, Leica, Germany)을 통해 관찰하였다.150 μL of ECM (or Matrigel) combined with primary nerve cells was sprayed onto gelled fibrin having a concave surface, and then covered with an 18 mm cover glass treated with oxygen plasma. Thereafter, it is left at room temperature for 10 minutes to wait for the ECM to gel, and then put it in a centrifuge. When putting it in a centrifuge (1248, LABOGENE, Korea), it is put in a 50mL tube (Conical Centrifuge Tube, SPL, Korea) and rotated, and the time and intensity of the centrifuge can be applied differently depending on the type of cell. In the case of primary nerve cell culture, there was no significant difference in the activity of the cells below 200 g, and centrifugation was performed for 10 minutes. The centrifuged ECM was again put into a cell incubator and gelled for 45 minutes. After sufficiently gelling, a cell culture solution (Neurobasal Media, ThermoFisher, USA) containing B27 (B-27 TM Supplement serum free, ThermoFisher, USA) and L-Glutamine (GlutaMax TM , ThermoFisher, USA) was added. At this time, the 18mm cover glass on the upper side was removed, and the 18mm cover glass on the lower side usually falls off after a day. In the case of culturing primary nerve cells, one day after the culture, an 18 mm cover glass in which glial cells were cultured was put on the top of the cell strainer and then cultured. When observing a single neuron cultured in a three-dimensional environment, it was observed through a confocal microscope (TCS SP8, Leica, Germany) with the 18mm cover glass removed.

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미세관통막으로 나일론 메쉬를 이용한 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 경우, 신경 세포가 하나씩 분리되어 위치하고 있음을 알 수 있었고(4a 참조), 분리된 세포 하나하나에 대한 3차원 이미징을 도 4b에 나타내었다.As a result of the analysis, as shown in FIG. 4, in the case of using the hydration gel microwell array of the present invention using a nylon mesh as a micro-penetrating membrane, it was found that the nerve cells were separated and located one by one (see 4a), and the separated cells 3D imaging for each one is shown in FIG. 4B.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 수화젤 마이크로웰 어레이를 사용할 경우, 3차원 공간 안에서 신경 세포를 1개의 단일세포로 분리할 수 있음을 알 수 있었고 세포의 배양 및 신경 세포 간의 신호 전달 분석도 가능함을 알 수 있었다.Through these results, the present inventors found that when using the hydrogel microwell array devised in the present invention, nerve cells can be separated into one single cell in a three-dimensional space, and culture of cells and signal transmission between nerve cells It was found that analysis was also possible.

<실시예 3><Example 3>

본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용하여 배양한 단일 신경세포의 광학적 신경 전달 분석 Optical neurotransmission analysis of single neurons cultured using the hydrogel microwell array of the present invention

실시예 2와 같이 단일세포로 분리하고 배양한 신경세포를 대상으로 세포의 기능을 분석할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 상기 실시예 2에서 분리된 신경 세포에 광학적 자극을 주기 위해서, AAV-CaMK2-ChR2-GFP를 B27과 L-Glutamine 이 포함된 세포 배양액에 1:200의 양으로 섞은 후, 3차원 환경에서 배양된 신경세포에 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 여기서 상기 신경세포의 광학적 신경 신호 전달의 분석을 위해 ChR2-GFP의 발현을 확인하는 방법을 사용하였는데, 이는 프로모터(Promoter)가 CaMK2이기 때문에, 신경세포에서만 빛에 반응하여 세포를 활성화시키는 ChR2 단백질이 발현되기 때문이다. ChR2-GFP의 발현을 확인한 후, 1μM Rhod-XF (Rhod-XF, ThermoFisher, USA)를 첨가한 세포 배양액으로 배지를 교체하여 45분간 배양한 후, 다시 정상적인 세포배양액으로 교체한 다음, 실시간 공초점 현미경(Opterra, Bruker, USA)을 이용하여 관찰하였다. 현미경내 프로그램을 활용하여, 561nm 중심파장의 레이저를 이용해 계속적으로 세포 내 칼슘 농도를 측정하였다. 또한 5분이 지난 후 2분 동안, 561nm 중심파장의 레이저와 동시에 488 nm 중심파장의 레이저를 1초 간격으로 100ms 동안 조사하여 관찰하였다.As in Example 2, the following experiment was performed to confirm whether the function of the cells can be analyzed for the neurons separated and cultured as single cells. That is, in order to give optical stimulation to the nerve cells isolated in Example 2, AAV-CaMK2-ChR2-GFP was mixed in a cell culture solution containing B27 and L-Glutamine in an amount of 1:200, and then in a three-dimensional environment. The cultured neurons were treated and cultured for 72 hours. Here, a method of confirming the expression of ChR2-GFP was used to analyze the optical neural signal transduction of the neuron. This is because the promoter is CaMK2, so the ChR2 protein that activates the cell in response to light only in the neuron is Because it is expressed. After confirming the expression of ChR2-GFP, replace the medium with a cell culture solution to which 1 μM Rhod-XF (Rhod-XF, ThermoFisher, USA) was added, incubate for 45 minutes, and then replace it with normal cell culture solution, and then confocal in real time. It was observed using a microscope (Opterra, Bruker, USA). Using the program in the microscope, the concentration of calcium in the cells was continuously measured using a laser with a center wavelength of 561 nm. In addition, for 2 minutes after 5 minutes, a laser with a central wavelength of 561 nm and a laser with a central wavelength of 488 nm were simultaneously irradiated for 100 ms at 1-second intervals.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 총 6개의 분리된 단일 신경세포에 대한 광학적 신경 신호 분석 결과, 4개의 단일 세포에서 칼슘의 농도가 증가함을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용하면, 세포를 단일세포, 즉 1개의 단일세포 단위로 분리할 수 있을 뿐만 아니라 각 분리된 단일세포에 대한 세포 기능 분석도 가능하다는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, as a result of optical neural signal analysis for a total of 6 isolated single neurons, it was confirmed that the concentration of calcium increased in 4 single cells. Therefore, the present inventors can see that using the hydration gel microwell array of the present invention, not only can cells be separated into single cells, that is, one single cell unit, but also cell function analysis for each isolated single cell is possible. there was.

<실시예 4><Example 4>

PDMSPDMS 미세 minuteness 관통막을Through 이용하여 제조된 Manufactured using 수화젤Hydration Gel 마이크로웰Microwell 어레이 및 이를 이용한 3차원 초대 신경세포의 분리 및 배양 Isolation and culture of arrays and 3D primary neurons using the same

또한 본 발명자들은 미세관통막으로 PDMS(폴리다이메틸실록레인)을 이용하여 수화젤 마이크로웰 어레이를 제조하였고, 이를 이용하여 초대 신경세포를 단일세포로 분리 및 배양할 수 있는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.In addition, the present inventors prepared a hydration gel microwell array using PDMS (polydimethylsiloxane) as a micropenetrating membrane, and conducted the following experiments to see if primary neurons can be separated and cultured into single cells using this. It was confirmed through.

구체적으로, PDMS를 이용한 미세관통막의 제조를 위해, SU8 Pattern은 SU8 (SU8 2150, MicroChem, USA)를 500 μm 두께로 도포한 후, 자동 마스크 정렬기 (MA8, SUSS MicroTec, Germany)에 노광하여, SU8 Developer (SU8 Developer, MicroChem, USA) 로 식각하였고, PDMS는 Silicone Elastomer Kit (Sylgard 184 Kit, Dow Corning, USA)를 10:1로 배합한 혼합물을 SU8 pattern 위에 200 μm 이내의 두께로 도포한 후, 95°C에서 반응시킨 다음, 떼어내어 커버 글래스(Cover glasses thickness No. 1 24mm×40mm, MARIENFELD, Germany)에 부착하였다. 또한 산소 플라즈마 방법은 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 처리하였고, 초대 신경 세포의 배양은 상기 실시예 2에서 사용한 동일한 세포를 사용하였다. 또한, 수화젤로는 ECM중의 하나인 Matrigel Matrix를 사용하였다.Specifically, for the production of a micropenetrating membrane using PDMS, SU8 Pattern was applied to a 500 μm thickness of SU8 (SU8 2150, MicroChem, USA), and then exposed to an automatic mask aligner (MA8, SUSS MicroTec, Germany), Etched with SU8 Developer (SU8 Developer, MicroChem, USA), and PDMS was applied with a 10:1 Silicone Elastomer Kit (Sylgard 184 Kit, Dow Corning, USA) mixture to a thickness within 200 μm on the SU8 pattern. , After reacting at 95°C, it was removed and attached to a cover glass (Cover glasses thickness No. 1 24mm×40mm, MARIENFELD, Germany). In addition, the oxygen plasma method was treated under the same conditions as in Example 1, and the same cells used in Example 2 were used for culturing primary nerve cells. In addition, Matrigel Matrix, one of ECMs, was used as the hydration gel.

미세 관통막으로 PDMS를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수화젤 마이크로웰 어레이를 제조한 후, 수화젤과 배합된 신경세포를 PDMS 미세 관통막과 커버글래스 사이에 넣어주고 PDMS 미세 관통막으로 퍼지게 하였다. 이후 커버 글래스에 부착된 PDMS 관통막을 뒤집어 주어 중력을 받게 하였고, 상온에서 10분 동안 젤화를 기다린 후, 37°C 5% CO2 가 유지되는 세포 배양기에 45분간 충분히 젤화시켰다. 수화젤과 배합된 세포는 수화젤이 젤화되는 동안에 관통막 내로 움직이게 되며, 세포의 무게에 의해 관통막 안쪽에 단일세포로 분리하여 위치하게 된다(도 6a 참조).After manufacturing a hydrogel microwell array in the same manner as in Example 1, except that PDMS was used as the fine penetrating membrane, nerve cells blended with the hydrogel were put between the PDMS micro penetrating membrane and the cover glass, and PDMS fine penetration Spread to the membrane. Thereafter, the PDMS penetrating membrane attached to the cover glass was inverted to receive gravity, and after waiting for gelation at room temperature for 10 minutes, gelation was sufficiently performed for 45 minutes in a cell incubator maintained at 37°C 5% CO 2 . The cells mixed with the hydration gel move into the penetrating membrane while the hydration gel is gelled, and are separated and positioned as single cells inside the penetrating membrane by the weight of the cells (see FIG. 6A).

PDMS를 이용한 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용하여 신경세포가 단일세포로 잘 분리될 수 있는지 확인하기 위해 신경세포를 확인할 수 있는 대표인자인 Neuronal Marker인 NeuN (Anti-NeuN Antibody, Alexa 488 conjugated, abcam, USA) 와 Tuj (Anti-beta Ⅲ Tubulin Antibody, BioLegend, USA)를 이용해 면역 염색 방법을 수행하였는데, 도 6b 및 6c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법을 적용할 경우, 신경세포가 단일세포로 잘 분리되었고 3차원 환경으로 위치하여 있음을 확인할 수 있었다.Neuronal Marker NeuN (Anti-NeuN Antibody, Alexa 488 conjugated, abcam, a representative factor that can identify nerve cells) to check whether nerve cells can be separated into single cells by using a PDMS hydrogel microwell array. USA) and Tuj (Anti-beta Ⅲ Tubulin Antibody, BioLegend, USA) were used to perform the immunostaining method. As shown in Figs. 6b and 6c, when the method of the present invention is applied, neurons are well formed into single cells. It was confirmed that it was separated and located in a three-dimensional environment.

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 미세관통막 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용할 경우, 3차원 환경 또는 조건으로 분석하고자 하는 세포를 1개의 단일세포 단위로 효과적으로 분리할 수 있고, 배양할 수 있으며, 1개 단일세포에 대한 다양한 분석을 수행할 수 있음을 알 수 있었다.Through the above results, the present inventors can effectively separate cells to be analyzed in a three-dimensional environment or condition into one single cell unit when using the micro-penetrating membrane-based hydration gel microwell array devised in the present invention. It can be done, and it was found that various analyzes can be performed on one single cell.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at around its preferred embodiments. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative point of view rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the above description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.

Claims (20)

세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치되어 있고 미세관통막들 간에는 일정한 간격을 유지하고 있는 산소 플라즈마가 처리된 다수의 미세관통막; 및
상기 다수의 미세관통막을 채우고 있는 수화젤층을 포함하며,
상기 수화젤층은 미세관통막들 사이의 공간에 채워져 있고 수화젤의 상단 표면이 오목한 형태로 젤화되어 있으며,
상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 두께는 10 μm ∼ 500 μm의 크기를 가지며, 상기 간격은 1 μm ~ 500 μm이며, 상기 미세관통막 사이에 형성되는 공간은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm인 것을 특징으로 하는,
단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이.A plurality of micro-penetrating membranes treated with oxygen plasma that is non-contact disposed on the bottom of the cell culture vessel and maintaining a constant gap between the micro-penetrating membranes; And
It includes a hydration gel layer filling the plurality of micro-penetrating membranes,
The hydration gel layer is filled in the space between the micro-penetrating membranes, and the upper surface of the hydration gel is gelled in a concave shape,
The micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, a thickness of 10 μm to 500 μm, and the interval is 1 μm to 500 μm, and is formed between the micropenetrating membranes. The space is characterized in that the width × length is 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm,
Micro-penetration-based hydrogel microwell array for isolation and culture of single cells. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 미세관통막은 주요성분이 유리, 실리콘, 나일론(nylon), 폴리에스터(polyester) 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(이)미드(poly(i)mide), 액정크리스탈폴리머 (liquid crystal polymer), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 메실메타아크릴레이트(methyl methacrylate), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리테트라플루오로에텔렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리다이메틸실록레인(polydimethylsiloxane)이며, 그 구조가 그물망형 또는 규칙성 관통형 다공성막인 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이.The method of claim 1,
The main components of the micropenetrating membrane are glass, silicone, nylon, polyester, polypropylene, polyethylene, poly(i)mide, and liquid crystal crystal polymer. crystal polymer), polyethylene terephthalate, methyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polytetrafluoroethylene or polydimethyl Siloxane (polydimethylsiloxane), characterized in that the structure is a mesh-like or regular through-type porous membrane, micro-penetration-based hydrogel microwell array for the separation and culture of single cells. 제1항에 있어서,
상기 수화젤은 세포외기질(ECM-matrigelTM 포함), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 라미닌(laminin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 피브린 (fibrin), 피프로넥틴(fibronectin), 폴리락티드 계열 폴리머 스캐폴드(PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), 폴리스티렌 폴리머 스캐폴드(polystylene polymer scaffold), 히알루론산(hyaluronic acid), 다공성 실크(porous silk) 및 펩타이드 하이드로겔(peptide hydrogel(PuraMatrixTM포함))로 이루어진 매트릭스 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이.The method of claim 1,
The hydration gel is an extracellular matrix (ECM-matrigel TM Including), collagen, gelatin, chitosan, laminin, polyethylene glycol, fibrin, fibronectin, polylactide polymer scaffold ( PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), polystylene polymer scaffold, hyaluronic acid, porous silk, and peptide hydrogel (including PuraMatrix TM ) Hydrogel microwell array based on micro-penetration for isolation and cultivation of single cells, characterized in that selected. (1) 산소 플라즈마를 처리하여 미세관통막을 준비하는 단계;
(2) 산소 플라즈마가 처리된 기판 상에 수화젤을 도포하는 단계;
(3) 상기 미세관통막 상에 상기 수화젤을 부착시키되, 최상단은 기판이 오도록 하고 수화젤이 미세관통막과 부착되도록 하는 단계;
(4) 상기 수화젤이 미세관통막 안으로 삽입하는 단계;
(5) 상기 최상단에 위치하고 있는 기판이 최하단이 되도록 상기 미세관통막을 뒤집는 단계; 및
(6) 상기 최하단에 위치하고 있는 기판의 무게와 상기 기판 및 수화젤의 인력의 차이로 인해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시키는 단계를 포함하는,
단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.(1) preparing a micro-penetrating membrane by treating oxygen plasma;
(2) applying a hydration gel on the substrate treated with oxygen plasma;
(3) attaching the hydration gel on the micro-penetrating membrane, with a substrate at the top and allowing the hydration gel to be attached to the micro-penetrating membrane;
(4) inserting the hydration gel into the micro-penetrating membrane;
(5) turning over the micro-penetrating membrane so that the substrate positioned at the top is at the bottom; And
(6) gelling such that the surface of the hydration gel of the micro-penetrating membrane becomes concave due to the difference between the weight of the substrate positioned at the bottom and the attractive force of the substrate and the hydration gel,
Micro-penetration-based hydrogel microwell array manufacturing method for isolation and culture of single cells. 제6항에 있어서,
상기 산소 플라즈마는 대기압 하의 진공상태에서 산소 농도 5% ~ 100%, 산소의 유류양 0 ~ 500 sccm, 플라즈마의 파워 10 ~ 1000 W 및 1초 ~ 1시간의 작동시간으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
The oxygen plasma is characterized in that it is performed in a vacuum state under atmospheric pressure with an oxygen concentration of 5% to 100%, an amount of oxygen of 0 to 500 sccm, a power of the plasma of 10 to 1000 W, and an operating time of 1 second to 1 hour, Micro-penetration-based hydrogel microwell array manufacturing method for isolation and culture of single cells. 제6항에 있어서,
상기 미세관통막은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm 이고, 두께는 10 μm ∼ 500 μm의 크기를 가지며, 상기 미세관통막 간의 간격은 1 μm ~ 500 μm이고, 상기 미세관통막 사이에 형성되는 공간은 가로 × 세로가 1 μm × 1 μm ∼ 500 μm × 500 μm인 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
The micropenetrating membrane has a width × length of 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, a thickness of 10 μm to 500 μm, and the interval between the micropenetrating membranes is 1 μm to 500 μm, and the micropenetration The space formed between the membranes is characterized in that the horizontal × vertical 1 μm × 1 μm to 500 μm × 500 μm, characterized in that, micro-penetration-based hydrogel microwell array manufacturing method for the isolation and culture of single cells. 제6항에 있어서,
상기 미세관통막은 주요성분이 유리, 실리콘, 나일론(nylon), 폴리에스터(polyester) 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(이)미드(poly(i)mide), 액정크리스탈폴리머 (liquid crystal polymer), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 메실메타아크릴레이트(methyl methacrylate), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리테트라플루오로에텔렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리다이메틸실록레인(polydimethylsiloxane)이며, 그 구조가 그물망형 또는 규칙성 관통형 다공성막인 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
The main components of the micropenetrating membrane are glass, silicone, nylon, polyester, polypropylene, polyethylene, poly(i)mide, and liquid crystal crystal polymer. crystal polymer), polyethylene terephthalate, methyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polytetrafluoroethylene or polydimethyl Siloxane (polydimethylsiloxane), characterized in that the structure is a mesh-like or regular through-type porous membrane, micro-penetration-based hydrogel microwell array manufacturing method for the separation and culture of single cells. 제6항에 있어서,
상기 수화젤은 세포외기질(ECM-matrigelTM 포함), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 라미닌(laminin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 피브린 (fibrin), 피프로넥틴(fibronectin), 폴리락티드 계열 폴리머 스캐폴드(PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), 폴리스티렌 폴리머 스캐폴드(polystylene polymer scaffold), 히알루론산(hyaluronic acid), 다공성 실크(porous silk) 및 펩타이드 하이드로겔(peptide hydrogel(PuraMatrixTM포함))로 이루어진 매트릭스 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
The hydration gel is an extracellular matrix (ECM-matrigel TM Including), collagen, gelatin, chitosan, laminin, polyethylene glycol, fibrin, fibronectin, polylactide polymer scaffold ( PLA/PDLA/PLLA polymer scaffold), polystylene polymer scaffold, hyaluronic acid, porous silk, and peptide hydrogel (including PuraMatrix TM ) Characterized in that selected, micro-penetration-based hydration gel microwell array manufacturing method for isolation and cultivation of single cells. 제6항에 있어서,
상기 (6) 단계에서 젤화는 중력이외에 원심력, 모세관 힘, 흡인에 의한 힘 또는 유체압력에 의해 기판이 받는 힘과 표면 장력에 의해 미세관통막의 수화젤 표면이 오목한 형태가 되도록 젤화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
The gelation in step (6) includes gelling so that the surface of the hydration gel of the micropenetrating membrane becomes concave by the force and surface tension of the substrate by centrifugal force, capillary force, suction force, or fluid pressure in addition to gravity. Characterized in that, micro-penetration-based hydration gel microwell array manufacturing method for isolation and culture of single cells. 제6항에 있어서,
상기 수화젤을 젤화시키는 온도는 10 ∼ 42°C인 것을 특징으로 하는, 단일 세포의 분리 및 배양을 위한 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이 제조방법.The method of claim 6,
A method for producing a micro-penetration-based hydration gel microwell array for isolation and cultivation of single cells, characterized in that the temperature at which the hydration gel is gelled is 10 to 42 °C. (1) 세포 현탁액과 수화젤을 혼합하여 세포 및 수화젤의 혼합물을 제조하는 단계;
(2) 상기 세포 및 수화젤의 혼합물을 제1항의 수화젤 마이크로웰 어레이 상에 분주하고 젤화를 유도하는 단계; 및
(3) 상기 세포가 상기 수화젤 마이크로웰 어레이의 미세관통막 간의 사이로 1개씩 단일 세포로 분리되어 위치하는 단계를 포함하며,
상기 (3) 단계에서 단일 세포로의 분리는 원심력 또는 흡인에 의한 힘으로 수행되며, 이때 상기 원심력은 50 ~ 500g에서 수행하고 상기 흡인에 의한 힘은 30 초 ~ 60분 동안 수행하여, 상기 세포가 미세관통막 간의 세포 포획 공간으로 1개의 단일세포 형태로 위치되어 분리되는 것을 특징으로 하는,
미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법.(1) preparing a mixture of cells and hydrogel by mixing the cell suspension and hydrogel;
(2) dispensing the mixture of the cells and the hydration gel onto the hydration gel microwell array of claim 1 and inducing gelation; And
(3) the cell is separated and positioned as single cells one by one between the micro-penetrating membranes of the hydrogel microwell array,
Separation into single cells in step (3) is performed by centrifugal force or force by suction, wherein the centrifugal force is performed at 50 to 500 g, and the force by suction is performed for 30 seconds to 60 minutes, so that the cells are It is characterized in that it is located and separated in the form of one single cell as a cell capture space between the micropenetrating membranes,
Separation and culture method of single cells using micro-penetration-based hydration gel microwell array. 제13항에 있어서,
상기 세포 현탁액에는 세포가 1 × 104 ~ 1 × 106 개/mL의 세포수로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법.The method of claim 13,
The cell suspension is characterized in that the cells are contained in a cell number of 1 × 10 4 ~ 1 × 10 6 /mL, a single cell separation and culture method using a micro-penetration-based hydrogel microwell array. 삭제delete 삭제delete 제13항에 있어서,
상기 분리는 단일세포에 특이적으로 결합하거나 반응할 수 있는 비드(bead)도 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법.The method of claim 13,
The separation is a single cell separation and culture method using a micro-penetration-based hydration gel microwell array, characterized in that it also includes a bead capable of specifically binding or reacting to a single cell. 제13항에 있어서,
상기 (3) 단계의 단일 세포로의 분리 위치 이후, 세포와 함께 수화젤을 젤화시키는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 젤화는 10 ∼ 42°C의 온도 및 5 ~ 10%의 이산화탄소 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 미세관통 기반의 수화젤 마이크로웰 어레이를 이용한 단일세포의 분리 및 배양 방법.The method of claim 13,
After the position of separation into a single cell in step (3), the step of gelling the hydrogel together with the cells, wherein the gelation is performed at a temperature of 10 to 42 °C and a carbon dioxide concentration of 5 to 10% A method of separating and culturing single cells using a micro-penetration-based hydration gel microwell array. 삭제delete 삭제delete
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