KR20150063751A - Integrated meshed hydrogel constructs for cell differentiated growth and method for manufacturing the same - Google Patents

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KR20150063751A
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박제균
배채윤
김하일
민문경
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한국과학기술원
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Abstract

The present invention relates to a three dimensional cell culture apparatus which includes fine pattern parts as meshes in a hydrogel structure, and the three dimensional cell culture apparatus grows and differentiates a single cell fixed in the hydrogel structure to grow the single cell into a multicellular group having a certain size according to a mesh hole designed in the hydrogel structure. According to the present invention, sizes of, and intervals between, mesh holes can be adjusted and amounts and types of cells can be changed, to be controlled in such a way that a multicellular group can be formed as an array in the hydrogel structure. Also, such hydrogel structure which is membrane-shaped can be combined with each other in three dimensional form to serve as a cell three dimensional culture apparatus and as a scaffold. As a result, growth and differentiation of human or animal cells can be controlled, and accordingly a multicellular group which is similar to one in vivo can be formed as an array on a membrane-type hydrogel structure and obtained and separated individually. Through the process of forming a simple hydrogel structure, cells can be cultured ex vivo relatively easily. Also, such a three dimensional culture apparatus having a hydrogel structure can be applied easily in analysis of genomes and proteins of a cell or screening and analysis of medicine, and can serve as a scaffold which can be directly implanted in vivo, raising the prospect for a hybrid ex vivo culture system which performs both ex vivo analysis and in vivo implantation.

Description

세포 입체배양장치로서의 수화젤 마이크로 메쉬구조물 및 이것의 제조방법{INTEGRATED MESHED HYDROGEL CONSTRUCTS FOR CELL DIFFERENTIATED GROWTH AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a hydrogel gel micro-mesh structure as a cell stereogenic device, and a method of manufacturing the same. [0002]

본 발명은 미세패턴이 메쉬 형태로 형성된 수화젤(hydrogel) 마이크로구조물을 이용한 세포 입체배양장치에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 메쉬 형태의 미세패턴이 포함된 수화젤 구조물 내에 인간 또는 동물의 세포 및 줄기세포를 고정화하고, 메쉬 형태의 미세패턴을 따라 입체적인 다세포군을 형성시키며, 동일한 원리를 바탕으로 줄기세포를 췌장세포 등의 특정 타겟세포로 분화 및 분리할 수 있는 세포 입체배양장치 및 이를 이용한 줄기세포 분화 및 분리방법에 관한 것이다. BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0001] The present invention relates to a cell stereostructure using a hydrogel microstructure in which fine patterns are formed in a mesh form, and more particularly, A cell stereogenic device capable of immobilizing cells and forming a stereoscopic multicellular group along a fine pattern of a mesh form and capable of differentiating and separating stem cells into specific target cells such as pancreatic cells based on the same principle, And to a method of differentiation and separation.

세포를 체외배양할 수 있는 다양한 방법은 마이크로 제어기술과 각종 신소재 개발로 매우 빠르게 발전하고 있다. 특히, 체내와 유사한 형태의 입체적 다세포구조형성을 위해 다양한 화학적 조절인자를 사용하거나, 미세크기의 액적(droplet)을 현적배양(hanging drop) 장치 혹은 마이크로웰어레이(microwell array), 여러 가지 종류의 수화젤(hydrogel)로 미리 제작된 스캐폴드(scaffold)를 사용하였다. 이러한 기술을 바탕으로 최근에는 입체적인 3차원프린팅(3D printing) 기술과 더불어 조직재생이라는 분야가 크게 떠오르고 있다. Various methods of culturing cells in vitro have been developing very rapidly due to the development of microcontrol technology and various new materials. In particular, various chemical regulators may be used to form a three-dimensional multicellular structure similar to the body, or micro-droplets may be used for hanging drop devices or microwell arrays, A scaffold prefabricated with hydrogel was used. In recent years, based on these technologies, there has been an emerging field of tissue regeneration in addition to three-dimensional (3D) printing technology.

단일세포를 다세포구조로 형성하기 위해서 세포의 성장을 폭발적으로 증가시킬 수 있는 각종 성장인자(growth factor)들이 생화학적으로 많이 발견되었다. 생화학적 성장인자는 세포 자체의 성장을 제어하기 때문에, 그로 인한 다양한 세포 내 신호가 달라진다는 점에서 세포의 자연스러운 체외배양을 방해할 수 있다는 단점이 있다. 또한, 물리적으로 세포를 작은 공간 안에 집어넣고 다세포구조를 형성할 수 있도록 마이크로 액적이나 마이크로웰어레이 등 다수의 미세유체제어 방법이 제안되었다. 미세유체제어 방법 중 액적이나 마이크로웰어레이를 이용할 경우에는 복잡한 공정과정과 구동과정이 필요하고, 체외배양이 진행되는 동안에 수백마이크로 이상의 다세포군 내에서 확산깊이의 한계로 인하여 세포의 생존능력이 빠르게 떨어지는 것이 문제로 나타난다. In order to form a single cell into a multicellular structure, various growth factors that can explosively increase the cell growth have been found biochemically. Since biochemical growth factors control the growth of the cells themselves, they have a disadvantage in that they can interfere with the natural in vitro culture of the cells in that various intracellular signals are changed. In addition, a number of microfluidic control methods such as microdroplets and microwell arrays have been proposed to physically insert cells into a small space and form a multicellular structure. The use of liquid droplets or microwell arrays in the microfluidic control method requires complicated process and driving procedures and the ability of the cells to survive rapidly due to the limitation of the diffusion depth in the multicellular group of several hundred micro- It appears to be a problem.

수화젤은 수용성 고분자가 물리적 혹은 화학적 공유결합에 의하여 3차원의 가교를 형성하고 있는 구조로서, 다량의 물을 함유할 수 있는 물질이다. 이는 다양한 수용성 고분자로부터 제작될 수 있기 때문에 화학적 조성 및 물성을 다양하게 조절할 수 있으며 UV(ultraviolet) 및 다양한 화학적 가교 반응을 통하여 제작방법이 용이하다. 특히, 높은 물 함유율과 세포외기질(extracellular matrix)과의 물리화학적인 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖기 때문에 단일세포 및 생체분자의 포획, 세포의 장시간 배양, 조직재생을 위한 스캐폴드 기술 등에 적용가능하다. 하지만, 수화젤을 바탕으로 하는 세포의 3D 입체프린팅기술은 고비용의 센서 및 복잡한 기기들이 필요하다. 또한, 아직까지는 세포손상을 줄이면서 고해상도로 미세패턴의 입체프린팅을 하기에는 다소 한계가 있다.The water-soluble gel is a structure in which a water-soluble polymer forms a three-dimensional crosslink by physical or chemical covalent bonding, and is a substance capable of containing a large amount of water. Because it can be prepared from various water-soluble polymers, its chemical composition and physical properties can be controlled in various ways, and the production method is easy through UV (ultraviolet) and various chemical crosslinking reactions. Especially, it has high biocompatibility due to its high water content and physicochemical similarity with extracellular matrix, so it can be applied to capture of single cells and biomolecules, long-time incubation of cells, and scaffolding technology for tissue regeneration Do. However, 3D stereoscopic printing technology for cells based on hydrogel requires expensive sensors and complex instruments. In addition, there is still a limit to the stereoscopic printing of fine patterns at a high resolution while reducing cell damage.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 수화젤 구조물 내에 미세패턴이 형성된 메쉬(mesh) 멤브레인 형태를 제작하고, 다양한 종류의 인간 또는 동물세포를 수화젤 구조물 내에 손쉽게 고정한 후, 체외배양과정을 통해 단일세포를 다세포군집으로 성장 및 분화시켜 수화젤 구조물 내에서 미세패턴부를 따라 다세포군집 어레이형태로 형성시키고, 다세포군집을 성공적으로 획득 및 분리할 수 있는 입체배양장치를 제공하는 것이다. A problem to be solved by the present invention is to prepare a mesh membrane type in which a fine pattern is formed in a hydrated gel structure and various kinds of human or animal cells are easily fixed in a hydrogel structure, It is an object of the present invention to provide a three-dimensional culture apparatus capable of successfully forming and separating a multicellular community by forming a multi-cell cluster array along a fine pattern portion in a hydrated gel structure by growing and differentiating into a multicellular cluster.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 수화젤 구조물을 이용하여 형성된 다세포군집을 유전체 및 단백질 분석뿐만 아니라 체내 이식할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.In addition, a problem to be solved by the present invention is to provide a method for transplanting a multicellular community formed using the hydrogel structure, as well as genome and protein analysis.

본 발명의 상기 과제를 달성하기 위하여, 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포 입체배양장치 및 이것의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object of the present invention, there is provided a three-dimensional cell culture apparatus including a hydrogel structure having a mesh-shaped fine pattern portion and a method of manufacturing the same.

본 발명의 일 양태는 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포 입체배양장치로서, One aspect of the present invention is a cell stereostructure apparatus comprising a hydrogel structure having a mesh pattern of fine pattern portions,

상기 수화젤 구조물은 상면 및 하면을 갖는 멤브레인 구조이고, The hydrogel structure is a membrane structure having an upper surface and a lower surface,

상기 수화젤 구조물에 상기 상면 또는 상기 하면을 관통하는 다수의 미세패턴을 포함하는 미세패턴부가 형성되고, A fine pattern portion including a plurality of fine patterns passing through the upper surface or the lower surface is formed on the hydrogel structure,

상기 미세패턴부는 50 μm 이상의 크기와 500 μm 이하의 폭을 가지는 미세패턴이 적어도 하나 이상 반복되는 것을 특징으로 한다.The fine pattern portion is characterized in that at least one fine pattern having a size of 50 μm or more and a width of 500 μm or less is repeated.

본 발명의 일 양태로서, 상기 미세패턴은 그 크기가 50~500 μm이고, 상기 미세패턴의 간격이 20~500 μm일 수 있다. In an embodiment of the present invention, the fine pattern may have a size of 50 to 500 μm and the fine pattern may have an interval of 20 to 500 μm.

본 발명의 일 양태로서, 상기 미세패턴의 모양은 대칭 또는 비대칭의 원형 또는 다각형일 수 있다. In one aspect of the present invention, the shape of the fine pattern may be symmetrical or asymmetric circular or polygonal.

본 발명의 일 양태로서, 상기 미세패턴은 인간 또는 동물세포의 일정한 세포군집이 형성되는 정도를 미세패턴부 전체 개수 중 세포군집이 형성되는 비율을 통해 해당 세포의 성장 또는 분화를 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the micropattern may measure the growth or differentiation of a certain cell population of a human or animal cell through the rate of formation of a cell population in the total number of micropatterns.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤 구조물은 50 μm 이상의 높이를 가질 수 있다. In one embodiment of the present invention, the hydrated gel structure may have a height of 50 m or more.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤은 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAM) 및 히알루론산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 고분자 물질 또는 둘 이상의 고분자 물질의 혼합 형태일 수 있다.
In one aspect of the present invention, the hydrated gel comprises a polymeric material selected from the group consisting of alginate, gelatin, collagen, chitosan, polyethylene glycol (PEG), poly (N-isopropylacrylamide) Or a mixture of two or more polymeric materials.

본 발명의 다른 양태는 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포군집 형성용 입체배양장치를 제작하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함한다: Another aspect of the present invention is a method for producing a three-dimensional culture apparatus for forming a cell cluster comprising a hydrogel structure having a mesh pattern of fine pattern portions, the method comprising the following steps:

a) 단일 세포를 수화젤과 혼합시킨 액상의 세포수화젤 혼합물을 준비하는 단계;a) preparing a mixture of cell water-hydrating gels in which a single cell is mixed with a hydrating gel;

b) 상기 세포수화젤 혼합물을 미세패턴이 형성된 거푸집에 위치시키는 단계;b) placing the cell hydrated gel mixture in a micropatterned die;

c) 상기 세포수화젤 혼합물을 고형화시켜 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 제조하는 단계; 및c) solidifying the cell hydrated gel mixture to produce a hydrated gel structure having a fine patterned portion; And

d) 상기 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물에서 거푸집을 분리시키는 단계.d) separating the mold from the hydrogel structure having the fine pattern portion.

본 발명의 일 양태로서, 상기 c) 단계에서 수화젤 혼합물의 표면에 미세물방울 형태로 고형화제를 분사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the step (c) may further include the step of spraying the solidifying agent in the form of fine droplets on the surface of the hydrated gel mixture.

본 발명의 일 양태로서, 상기 거푸집은 상기 수화젤 구조물의 상면과 하면을 관통하는 미세패턴의 구조가 형성될 수 있다.
In an embodiment of the present invention, the die may have a fine pattern structure penetrating the upper and lower surfaces of the hydrogel structure.

또한, 본 발명의 또다른 양태는 세포를 체외에서 입체배양하는 방법을 제공할 수 있으며, 다음의 단계를 포함한다:Further, another aspect of the present invention can provide a method for stereoculturing a cell in vitro, comprising the steps of:

본 발명에 따른 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포 입체배양장치를 준비하는 단계; 및Preparing a cell stereostructure culture apparatus comprising a hydrogel structure having a mesh pattern of fine pattern portions according to the present invention; And

상기 수화젤 구조물로 영양분이 공급되는 조건에서 세포를 배양하는 단계.Culturing the cells in a condition that nutrients are supplied to the hydrated gel structure.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤 구조물은 두 개 이상의 개별적인 수화젤 구조물이 결합될 수 있다. In one aspect of the present invention, the hydrogel structure may be combined with two or more separate hydrated gel structures.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤 구조물 내에 두 개 이상의 상이한 종류의 세포를 동시에 배양할 수 있다. As an aspect of the present invention, two or more different kinds of cells can be cultured simultaneously in the hydrogel structure.

본 발명의 일 양태로서, 상기 세포는 다세포군을 형성하면서 메쉬의 구멍 안에서 위치할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cells may be located in the pores of the mesh while forming multicellular groups.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤 구조물은 바닥면에 고정된 상태로 일정한 방향성을 가지는 대류에 의해 영양분을 공급받을 수 있다. In one embodiment of the present invention, the hydrated gel structure may be supplied with nutrients by convection having a predetermined direction while being fixed on the bottom surface.

본 발명의 일 양태로서, 상기 수화젤 구조물은 액체 상에서 자유롭게 부유하면서 사방확산에 의해 영양분을 공급받을 수 있다.
In one aspect of the present invention, the hydrogel structure can be freely floated in a liquid state and can be supplied with nutrients by a four-way diffusion.

본 발명에 따른 미세패턴부가 메쉬 형태로 포함되어 있는 수화젤 구조물은 입체배양장치로서 단일세포 내 고정된 단일세포를 성장 및 분화시킴에 따라 수화젤 구조물 내 디자인된 메쉬 구멍에 따라 일정한 크기의 다세포군집으로 형성시킬 수 있는 특징을 가지고 있다. 본 발명에 따르면, 수화젤 구조물 내에서 다세포군집이 어레이형태로 형성, 획득 및 분리할 수 있도록 제어할 수 있으며, 이러한 멤브레인 형태의 수화젤 구조물을 입체적으로 결합하여 확장된 형태의 입체배양장치 및 스캐폴드 기능을 수행할 수 있다. 간단한 수화젤 구조물의 형성과정을 통해 비교적 쉽게 세포를 체외배양할 수 있을 뿐만 아니라, 원하는 형태로 다세포군집을 효율적으로 제작할 수 있으며 이러한 형태의 입체배양장치는 전체 미세패턴부 대비 세포군집이 형성된 비율을 통해 손쉽게 세포의 성장 및 분화를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 세포의 유전체 및 단백질을 분석하거나 의약품 스크리닝 및 분석에 쉽게 적용할 수 있으며 체내에 직접 이식할 수 있는 스캐폴드로서 역할도 가능하기에 체외분석 및 체내이식이 동시에 가능한 하이브리드 체외배양시스템으로서 기대된다.
The hydrated gel structure in which the fine pattern part according to the present invention is contained in the form of a mesh is a three-dimensional culture device which grows and differentiates single cells immobilized in a single cell, As shown in Fig. According to the present invention, it is possible to control the formation, acquisition and separation of multicellular clusters in the form of an array in a hydrated gel structure, and the membrane-type hydrogel structures are sterically coupled to form a three- Fold function can be performed. In addition to being able to in vitro culture of cells relatively easily through the process of forming a simple hydrogel structure, it is possible to efficiently produce a multicellular community in a desired form. In this type of three-dimensional culture apparatus, In addition to being able to easily identify the growth and differentiation of cells, it is also possible to analyze the genome and protein of a cell or to easily apply it to a screening and analysis of a drug, and it can also act as a scaffold which can be directly implanted in the body. It is expected to be a hybrid in vitro culture system capable of simultaneous transplantation.

도 1은 본 발명에 따른 세포가 포함된 수화젤 구조물 및 이것의 제조를 위한 거푸집의 구조를 나타낸 대표도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 규칙적인 육각 그물망 기반 수화젤 메쉬구조물의 내부구조를 확대한 단면도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 수화젤 메쉬구조물의 내부구조를 확대한 단면도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 세포가 포함된 수화젤 구조물의 공정 순서를 나타내는 순서도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 수화젤 구조물 내에서 MIN6 세포종의 배양결과를 보여주는 이미지이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 수화젤 구조물의 거푸집 제작 공정을 설명하기 위한 공정도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 다양한 간격을 가진 수화젤 메쉬구조물 내에서 MIN6 세포종의 배양 결과를 보여주는 viablity 염색법(A) 및 SEM 이미지(B)이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 다양한 간격을 가진 수화젤 그물 구조물 내에서 MIN6 세포종의 결과를 비교한 이미지 및 그래프이다. (a)는 메쉬 형태에서 Ro는 수화젤 메쉬구조물이고, Rb는 수화젤 메쉬구조물을 형성하는 수화젤 육각 유닛의 크기를 나타낸다. (B)는 동일한 크기의 육각 메쉬 유닛을 갖지만 수화젤 육각 유닛의 크기가 다른 경우의 수화젤 그물 구조물 내에서 MIN6 세포종의 입체배양결과(13일째)를 나타내는 이미지이다. (C)는 동일한 크기의 육각 메쉬 유닛을 갖지만 수화젤 육각 유닛의 크기가 다른 경우의 수화젤 구조물 내에서 MIN6 세포종의 입체배양결과가 형성된 다세포군의 원형 정도를 측정한 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a structure of a hydrogel structure including cells according to the present invention and a mold for manufacturing the same.
2 is an enlarged cross-sectional view of an internal structure of a regular hexagonal mesh-based hydrogel mesh structure according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is an enlarged cross-sectional view of an internal structure of a hydrated gel mesh structure in which a hexagonal net structure and a hexagonal column structure are repeated regularly according to an embodiment of the present invention.
4 is a flowchart illustrating a process sequence of a hydrogel structure containing cells according to an embodiment of the present invention.
5 is an image showing the result of culture of MIN6 cell tumor in a hydrogel structure according to an embodiment of the present invention.
6 is a process diagram for explaining a process of manufacturing a mold for a hydrogel structure according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a viablity staining method (A) and a SEM image (B) showing the results of culture of MIN6 cell tumors in a hydrated gel mesh structure having various gaps according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 is an image and graph comparing the results of MIN6 cell tumors in a multi-spaced hydrated gel netting structure according to an embodiment of the present invention. (a) is the mesh shape, Ro is the hydrated gel mesh structure, and Rb is the size of the hydrated gel hexagonal unit forming the hydrated gel mesh structure. (B) is an image showing a stereochemical culture result (day 13) of MIN6 cell tumor in a hydrated gel net structure in the case of a hexagonal mesh unit having the same size but different size of a hydrated gel hexagonal unit. (C) is a graph showing the degree of roundness of a multicellular group formed by the result of stereoculture of MIN6 cell tumor in a hydrogel structure having a hexagonal mesh unit of the same size but different size of the hydrogel gel hexagonal unit.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 인간 또는 동물의 다세포군 형성용 세포 입체배양장치는, 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 구조로서, 상기 수화젤 구조물은 상면 및 하면을 갖는 멤브레인 구조이고, 상기 수화젤 구조물에 상기 상면 또는 상기 하면을 관통하는 다수의 미세패턴을 포함하는 미세패턴부가 형성되며, 상기 미세패턴부는 50 μm 이상의 크기와 500 μm 이하의 폭을 가지는 미세패턴이 적어도 하나 이상 반복되는 것을 특징으로 한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a cell stereostructure culture apparatus for forming a multicellular group for human or animal, comprising: a hydrogel structure having a fine patterned portion in a mesh shape, the hydrogel structure having an upper surface and a lower surface Wherein the fine pattern portion has a size of 50 μm or more and a fine pattern having a width of 500 μm or less is formed on the upper surface or the lower surface of the hydrogel structure, One or more repeats.

본 발명은 세포를 효율적으로 균일화된 상태로 입체 배양하기 위하여 멤브레인 형태의 정형화된 마이크로 패턴을 포함하는 수화젤 마이크로 메쉬에 세포를 고정화시킴으로써 한정된 개수의 단일세포의 장기체외배양(약 2주 이상)을 통해 효과적으로 균일화된 다세포군을 형성하는 것을 특징으로 한다. The present invention relates to a method for the long-term in vitro culture of a limited number of single cells (about 2 weeks or more) by immobilizing cells in a hydrated gel micro-mesh containing a shaped micropattern in the form of a membrane in order to stably culture the cells in a homogenized state To form an effectively homogenized multicellular group.

여기서, 단일세포(mono-dispersed or dispersed single cell)란 세포 덩어리 혹은 조직으로부터 한 개의 세포상태로 떨어진 세포들을 의미한다. Here, a mono-dispersed or dispersed single cell refers to a cell that has fallen from a cell mass or tissue into a single cell state.

하기 도 1은 본 발명에 따른 미세패턴부를 포함하는 수화젤 구조물을 메쉬 형태로 형성하기 위한 거푸집을 개략적으로 도시한 대표도이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view illustrating a mold for forming a hydrated gel structure including a fine pattern part according to the present invention in a mesh form.

하기 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 수화젤 구조물(1) 내 메쉬 형태를 이루기 위하여 상면과 하면이 통과되는 메쉬 구멍(10)과 메쉬 망(20)으로 이루어진 멤브레인 형태(30)를 특성으로 하며, 이러한 구조물을 형성하기 위한 거푸집(100)은 메쉬 구멍을 위한 멤브레인 두께(130)의 마이크로패턴 어레이(110)와 거푸집 하판(120)으로 이루어진다.
As shown in FIG. 1, in order to form a mesh structure in the hydrogel structure 1 according to the present invention, a membrane type 30 composed of a mesh hole 10 and a mesh net 20 through which the upper and lower surfaces pass, And a mold 100 for forming such a structure includes a micropattern array 110 and a dowel plate 120 having a membrane thickness 130 for a mesh hole.

하기 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 규칙적인 육각 메쉬 형태 기반 수화젤 구조물의 내부구조를 확대한 단면도이다. FIG. 2 is an enlarged cross-sectional view of an internal structure of a regular hexagonal mesh shape-based hydrogel structure according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 실시예에 의하면, 보다 구체적으로 각 메쉬 형태는 원형 또는 세 개 이상의 각을 가지는 대칭 혹은 비대칭 형태의 다각형이 포함되는 형태를 기본으로 하며 이러한 미세패턴부가 적어도 하나 이상 반복되는 것을 특징으로 한다. 육각형 패턴이 규칙적으로 포함된 수화젤 구조물(200)의 경우, 육각형 형태의 메쉬 구멍(210)과 특정 간격으로 떨어진 메쉬 패턴 사이에 존재하는 수화젤(220)로 구성되어 있다. 이 때, 수화젤 구조물을 형성할 당시 수화젤 내에 포함되어 있는 단일세포(500)들은 최초에 메쉬 패턴 사이(220)에 존재하다가 체외배양하는 기간 동안에 다세포군(550)을 형성하면서 메쉬 구멍(210)에 자리를 잡는다.
According to an embodiment of the present invention, more specifically, each mesh shape is based on a circular shape or a shape including a polygon having a symmetric or asymmetric shape with three or more angles, and the fine pattern portion is repeated at least one or more times . In the case of the hydrated gel structure 200 in which hexagonal patterns are regularly included, the hydrated gel structure 220 is formed between the hexagonal mesh holes 210 and the mesh patterns spaced apart from each other by a predetermined distance. At this time, the single cells 500 contained in the hydrated gel at the time of forming the hydrated gel structure are present in the mesh patterns 220 for the first time, and form the multi-cell group 550 during the in vitro culture, ).

하기 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 수화젤 구조물의 내부구조를 확대한 단면도이다. FIG. 3 is an enlarged sectional view of an internal structure of a hydrated gel structure in which a hexagonal net structure and a hexagonal column structure are repeated regularly according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 실시예에 의하면, 다세포군 형성의 효율을 높이기 위하여 육각형 패턴이 규칙적으로 포함된 수화젤 구조물(200')의 경우, 마찬가지로 육각홀 구조의 메쉬 구멍(210')과 특정 간격으로 떨어진 메쉬 패턴 사이에 육각기둥이 존재하는 수화젤(220')로 구성되어 있다. 또한, 수화젤 구조물을 형성할 당시 수화젤 내에 포함되어 있는 단일세포(500)들은 마찬가지로 최초의 메쉬 패턴 사이(220)에 존재하다가 체외배양 기간 동안에 다세포군(550)을 형성하면서 메쉬 구멍(210)에 효율적으로 자리를 잡는다. According to the embodiment of the present invention, in order to increase the efficiency of the multi-cell group formation, in the case of the hydrogel structure 200 'in which the hexagonal pattern is regularly included, the mesh 200' And a hydrated gel 220 'in which hexagonal pillars are present between the patterns. In addition, the single cells 500 contained in the hydrogel at the time of forming the hydrated gel structure are present in the first mesh patterns 220 and are formed in the mesh holes 210 while forming the multicellular group 550 during the in vitro culture period. Effectively.

본 발명에 따른 일정한 다세포군집을 형성하기 위해서는 이러한 미세패턴의 메쉬 구멍의 크기(300)는 50~500 ㎛인 것을 특징으로 하며, 미세패턴의 간격인 메쉬 그물망(400)은 20~500 ㎛인 것으로 디자인한다. 이는 패턴의 모양에 따라 다소간에 차이가 있지만, 대체적으로 미세패턴의 크기(300)와 미세패턴의 간격(400)의 비율이 0.3에 가까울수록 대체적으로 메쉬 구멍(210)에서 최종적으로 다세포군(550)이 자리를 잡는다. 미세패턴의 간격은 Ro-Rb를 의미하고, 미세패턴의 크기는 Rb로 표현할 수 있다. Rb/Ro의 비율이 작아질수록 더 많은 다세포군이 메쉬 구멍에서 자리를 잡아 원형 형태를 잘 보여주는 것을 확인할 수 있다(도8 및 그래프 참조). In order to form a certain multicellular community according to the present invention, the mesh hole size 300 of the fine pattern is 50 to 500 μm, and the mesh network 400, which is an interval of the fine patterns, is 20 to 500 μm Design. Generally, as the ratio of the size 300 of the fine pattern to the spacing 400 of the fine pattern is close to 0.3, the size of the multi-cell group 550 ). The interval of the fine pattern means Ro-Rb, and the size of the fine pattern can be expressed by Rb. As the ratio of Rb / Ro becomes smaller, more multicellular groups are seated in the mesh holes and the circular shape is well visible (see FIG. 8 and the graphs).

본 발명에 따른 일정한 다세포군집(550)을 형성하기 위한 미세패턴부, 특히 미세 구멍(210, 210')은 전체 미세 구멍 개수 중 다세포군집(550)이 형성되는 비율을 통해 해당 세포의 성장 또는 분화정도를 측정할 수 있도록 디자인할 수 있다. The micropatterns 210 and 210 'for forming a certain multicellular community 550 according to the present invention are characterized in that the ratio of the number of the multicellular populations 550 to the total number of the microholes increases the growth or differentiation Can be designed to measure the degree.

상기 수화젤 구조물(200, 200')은 인간 또는 동물세포의 성장 및 분화를 저해하지 않기 위하여 200 이하의 높이를 가지는 멤브레인 형태(230, 230')로 이루어질 수 있도록 한다. 또한, 상기 수화젤은 세포의 종류 및 다세포군 형성방식에 따라 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAM), 히알루론산(hyaluronic acid) 중에서 선택되는 하나 이상의 고분자 물질의 혼합형태를 가지도록 한다. The hydrogel structures 200 and 200 'may be formed of membrane shapes 230 and 230' having a height of 200 or less to prevent growth and differentiation of human or animal cells. The hydrated gel may be dissolved or suspended in an aqueous medium such as alginate, gelatin, collagen, chitosan, polyethylene glycol (PEG) and poly (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM) or hyaluronic acid To have a mixed form of one or more polymeric materials selected.

하기 도 4는 본 발명의 실시예에 따른 세포가 포함된 수화젤 구조물의 공정 순서를 나타내는 순서도이다. 4 is a flowchart illustrating a process sequence of a hydrogel structure containing cells according to an embodiment of the present invention.

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물을 제작하는 방법은 크게 네 가지로 분류된다. There are four methods for producing a hydrogel structure as a three-dimensional culture apparatus for cell community formation.

첫째, 단일세포와 수화젤의 혼합물을 준비한다.First, prepare a mixture of single cell and hydrated gel.

둘째, 상기 미세패턴이 포함된 거푸집에 세포수화젤 혼합물을 위치시킨다.Second, the cell hydration gel mixture is placed on a mold containing the fine pattern.

셋째, 상기 미세패턴이 포함된 수화젤 메쉬구조물을 고형화시켜 거푸집으로부터 분리시킨다.Third, the hydrated gel mesh structure including the fine pattern is solidified and separated from the mold.

넷째, 상기 미세패턴이 포함된 수화젤 메쉬구조물을 체외배양한다.
Fourth, the hydrated gel mesh structure including the fine pattern is cultured in vitro.

본 발명의 구현실시예에 의하면, 다세포군집(550) 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물(1, 200, 200')을 제작하는 방법에 있어서 단일세포(500)와 수화젤의 혼합물을 준비한 후 상기 미세패턴이 포함된 거푸집(100)에 액상의 세포수화젤 혼합물을 위치시킨다. 그리고, 주입된 수화젤을 경화 및 고체화시킨다. 일례로, PEG의 경우에는 UV를 조사하여 고체화 반응을 유도하고, 알지네이트의 경우에는 칼슘 이온이 포함된 고형화제를 미세물방울의 형태로 표면에 골고루 분사하여 미세패턴의 고해상도 형상을 유지할 수 있도록 한다. According to the embodiment of the present invention, in the method of manufacturing the hydrogel structure (1, 200, 200 ') as the stereogenic device for forming the multicellular community 550, a mixture of the single cell 500 and the hydrated gel is prepared A liquid cell-hydrated gel mixture is placed in the mold 100 containing the fine pattern. Then, the injected hydrogel is cured and solidified. For example, in the case of PEG, a solidifying reaction is induced by irradiating UV, and in the case of alginate, a solidifying agent containing calcium ions is uniformly sprayed on the surface in the form of fine droplets to maintain a high-resolution shape of a fine pattern.

이후 상기 고형화된 세포수화젤을 거푸집(100)으로부터 분리시키면 미세패턴이 포함된 메쉬형태의 수화젤 구조물(1, 200, 200')이 제조된다. 이렇게 분리된 세포수화젤은 특정 위치에 고정되지 않은 형태로서 세포를 체외배양할 수 있는 플랫폼이 될 수 있다. 이러한 환경에서 수화젤 안에 고정되어 있던 단일세포(500)들은 미세패턴부가 포함된 메쉬 형태의 구조물에 의해 영양분 및 산소의 확산패턴을 다르게 받아 시간이 지남에 따라 메쉬 구멍에서 다세포군집(550)이 형성될 수 있다. 이러한 현상은 위치가 고정되어 있는 수화젤 구조물에서도 나타날 수 있으나, 영양분 및 산소의 확산패턴이 더욱 활발하게 일어나게 하기 위하여 고정되어 있지 않은 수화젤 구조물 내에서 더욱 효율적으로 나타난다. Then, when the solidified cell hydrated gel is separated from the mold 100, a hydrated gel structure (1, 200, 200 ') having a fine pattern is produced. This separated cell hydration gel can be a platform for in vitro culture of cells as an unfixed form at a specific location. In this environment, the single cells 500 immobilized in the hydrogel are differentiated from the diffusion pattern of nutrients and oxygen due to the mesh-type structure including the fine pattern portions, and the multi-cellular clusters 550 are formed in the mesh holes over time . This phenomenon can also occur in hydrated gel structures with fixed locations, but it is more efficient in hydrogel structures that are not immobilized in order to make diffusion patterns of nutrients and oxygen more active.

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물은 개별적인 입체배양장치로서 기능할 수 있을 뿐만 아니라 모듈로서 결합형 입체배양장치로서 기능할 수 있다. 두 가지 이상의 다른 조건의 세포가 포함된 각기 다른 입체배양장치로서의 수화젤 구조물은 개별적인 배양조건하에서 체외배양을 거친 후 다세포군집의 어레이형태로서 결합되어질 수 있다. 또한, 두 가지 이상의 다른 조건의 세포가 포함된 각기 다른 입체배양장치로서의 수화젤 구조물은 결합된 후 동일한 배양조건하에서 체외배양을 거치면서 다세포군집의 입체 어레이 형태를 형성할 수 있다. 수화젤 구조물의 결합방식은 멤브레인 형태(30, 230, 230')의 수화젤 구조물을 쌓아올리는 방식으로 결합할 수 있으며, 미세패턴의 형태에 따라 대면적 수화젤 구조물을 접거나 돌려 말아서 결합할 수도 있도록 한다. The hydrogel structure as the three-dimensional culture apparatus for cell community formation can function not only as an individual stereostructure but also as a module as a combined stereostructure apparatus. The hydrogel structures as different stereogenic devices containing cells of two or more different conditions can be combined as an array of multicellular populations after in vitro culture under individual culture conditions. In addition, a hydrogel structure as a different three-dimensional culture apparatus containing cells of two or more different conditions can be combined and formed into a three-dimensional array of multicellular populations through in vitro culture under the same culture conditions. The hydration gel structure can be combined by stacking the hydrated gel structures of the membrane type (30, 230, 230 '), and depending on the shape of the fine pattern, the large area hydrated gel structure can be folded or rolled .

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물은 두 가지 이상의 다른 조건의 세포가 동시에 포함되어 이형세포 동시배양이 가능할 수 있는 입체배양장치로서 기능할 수 있다. 특히, 다른 특성을 가진 두 가지 이상의 이형세포군을 하나의 수화젤 구조물에서 동시배양할 경우 동일한 미세패턴과 배양조건에 대하여 세포종류별 다른 성장 및 분화형태로 인하여 메쉬 구멍 및 수화젤 내부에서 자라는 형태가 다르게 되고 이를 통해 특정 세포군의 세포군집을 분리 및 획득할 수 있는 기능을 할 수 있다.The hydrogel structure as the three-dimensional culture apparatus for forming cell clusters can function as a three-dimensional culture apparatus capable of simultaneously co-culturing heterologous cells by simultaneously containing cells of two or more different conditions. In particular, when two or more heterogeneous cell groups with different characteristics are co-cultured in a single hydrated gel structure, the shape of the inside of the mesh hole and the hydration gel is different due to different growth and differentiation forms depending on the cell type and the same fine pattern and culture condition Thereby allowing a cell cluster of a specific cell group to be separated and obtained.

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물은 다양한 인간 또는 동물세포군에 적용이 가능하다. 특히, 상피세포(Epithelial Cell)군과 간엽세포(Mesenchymal Cell)군에 적용을 할 경우 메쉬 구멍에서 다세포군집(550)이 효율적으로 발생하는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 이렇게 자연적으로 형성된 다세포군집(550)은 체외배양 및 분화 과정을 거쳐 상기 수화젤 구조물로부터 자연적으로 분리되어 회수될 수 있다.The hydrogel structure as the three-dimensional culture apparatus for cell community formation is applicable to various human or animal cell groups. Especially, when applied to the epithelial cell group and the mesenchymal cell group, it can be seen that the multicellular cluster 550 is efficiently generated in the mesh hole. In addition, the naturally-occurring multi-cellular populations 550 can be naturally separated from the hydrogel structure through in vitro culture and differentiation and recovered.

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물은 인간 또는 동물세포군의 성장 및 분화를 통한 다세포군집(550)의 유전자 및 단백질 분석이 가능하다. 수화젤 구조물 내 메쉬 구멍에 위치한 다세포군집(550)은 메쉬 구멍의 크기와 간격에 따라 적절한 크기로 성장 및 분화하게 되면 자연적으로 수화젤 구조물에서 탈락 및 분리되어 회수가 가능하다. 이 때, 회수된 다세포군집(550)은 단일 세포화하기 위한 추가적인 작업 없이 유전자 및 단백질 분석이 가능하다. 특히, 특정위치에 고정되지 않은 상태로 다세포군집(550)의 특성을 파악할 수 있다는 측면에서 췌장세포와 같은 특이적 세포에 대해서 응용가능성이 매우 높다. The hydrogel structure as the above-described three-dimensional culture apparatus for cell cluster formation is capable of analyzing genes and proteins of the multicellular community 550 through growth and differentiation of human or animal cell groups. Multicellular community (550) located in the mesh hole in the hydrogel structure is naturally grown and differentiated according to the size and spacing of the mesh holes, so that it can be withdrawn and separated from the hydrogel structure naturally. At this time, the recovered multicellular community 550 can perform gene and protein analysis without further work for single cellization. Particularly, the possibility of application to specific cells such as pancreatic cells is very high in that the characteristics of the multicellular community 550 can be grasped without being fixed at a specific position.

상기 세포군집 형성용 입체배양장치로서 수화젤 구조물은 인간 또는 동물세포군의 성장 및 분화를 통한 다세포군집(550)의 어레이형태를 체내에 직접적으로 이식할 수 있는 스캐폴드로 적용가능하다. 세포 종류와 배양조건에 따라 적당한 시기 동안 체외배양을 진행한 후에 다세포군집(550)이 메쉬 구멍에 형성된 다음, 멤브레인 형태(30, 230, 230')형태의 수화젤 구조물을 직접 체내로 이식할 수 있다. 또한, 수화젤 구조물 내 고정화된 단일세포의 형태로 제작된 후 바로 멤브레인 형태(30, 230, 230')형태의 수화젤 구조물을 직접 체내로 이식한 후 체내에서 배양시킬 수 있는 스캐폴드로도 적용가능하다. The hydrogel structure may be applied as a scaffold which can directly implant an array of multicellular populations 550 through growth and differentiation of human or animal cell groups into the body. After the in vitro culture for a suitable period according to the cell type and culture conditions, a multicellular community 550 is formed in the mesh hole, and then the hydrogel structure of the membrane type (30, 230, 230 ') can be implanted directly into the body have. In addition, the hydrogel structure of the membrane type (30, 230, 230 ') can be transplanted directly into the body and then cultivated in the body as a scaffold in the form of a single cell immobilized in a hydrated gel structure It is possible.

하기 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 수화젤 메쉬구조물의 거푸집 제작 공정을 설명하기 위한 공정도이다. FIG. 6 is a process diagram for explaining a process of manufacturing a mold for a hydrated gel mesh structure according to an embodiment of the present invention.

먼저, 실리콘 웨이퍼(140) 위에 메쉬형태를 위한 울타리 구조체용 첫 번째 마스크(160)을 이용하여 메쉬형태를 위한 울타리 구조체용 첫 번째 포토레지스트(150)를 패터닝한 후, 두 번째 포토레지스트(152)로 메쉬형태의 미세패턴부를 위한 두 번째 마스크(162)로 메쉬형태의 미세패턴부를 패터닝한다. First, a first photoresist 150 for a fence structure for a mesh form is patterned using a first mask 160 for a fence structure for a mesh form on a silicon wafer 140, The fine pattern portion of the mesh shape is patterned with the second mask 162 for the fine pattern portion of the mesh form.

상기 포토레지스트(150, 152)는 반도체 또는 평판형 소자의 공정에 사용되는 것이라면 특별히 한정하지 않으나, 상기 수화젤 구조물을 형성하기 위해서 반드시 메쉬 형태의 미세패턴부를 위한 포토레지스트(152)는 메쉬 형태를 위한 울타리 구조체를 위한 포토레지스트(150)보다 그 높이가 높도록 한다. 또한, UV가 조사된 부분만 경화되는 음성 포토레지스트인 SU-8을 사용하는 것이 좋으며, 디자인 및 공정조건에 따라 포토레지스트의 길이, 너비 및 높이가 조절될 수는 있다. The photoresist 150 and 152 are not particularly limited as long as they are used in the process of a semiconductor or a flat panel device. However, in order to form the hydrogel structure, the photoresist 152 for a mesh- So that the height of the photoresist 150 is higher than that of the photoresist 150 for the fence structure. Further, it is preferable to use SU-8, which is a negative photo-resist which is cured only at the portion irradiated with UV, and the length, width and height of the photoresist can be adjusted according to design and process conditions.

다음으로 폴리디메틸실록산 (PDMS) 중합체를 경화하여 상기 수화젤 구조물의 거푸집(100)을 제작한다. 이 때, 메쉬형태의 미세패턴부를 위한 포토레지스트(152)에 의하여 메쉬구멍 구조를 위한 거푸집 내 어레이 구조체(110)가 형성되고, 메쉬 형태의 수화젤 구조물을 성공적으로 형성하기 위하여 거푸집 내 울타리 구조체(125)가 어레이 구조체(110)보다 낮은 높이로 형성하도록 한다.
The polydimethylsiloxane (PDMS) polymer is then cured to form the mold 100 of the hydrated gel structure. At this time, an array pattern structure 110 for a mesh hole structure is formed by a photoresist 152 for a fine pattern portion of a mesh pattern. In order to successfully form a mesh type watergel structure, a form fence structure 125 are formed at a lower height than the array structure 110.

하기 도 5 및 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 수화젤 메쉬구조물 내에서 MIN6 세포종의 배양결과를 보여주는 이미지이다.5 and 7 are images showing the culture results of MIN6 cell tumor in the hydrogel gel mesh structure according to the embodiment of the present invention.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 췌장 인슐린종(pancreatic insulinoma)의 하나인 MIN6 세포종을 상기 수화젤 구조물 내에 고정시킨 후 2주간 체외배양한 결과 비어있는 메쉬패턴으로 MIN6 세포종의 다세포군집이 효율적으로 형성된다. 특히, 도 8에서 보는 바와 같이, 다양한 크기와 다양한 간격의 육각기반 미세패턴으로 실험한 결과 미세패턴의 간격이 좁고 비어있는 메쉬패턴 주변에 고정된 세포의 수가 많을수록 다세포군집이 효율적으로 형성된다. In one embodiment of the present invention, the MIN6 cell tumor, which is one of the pancreatic insulinomas, was fixed in the hydrogel structure and then cultured for 2 weeks. As a result, do. In particular, as shown in FIG. 8, when hexagonal-based fine patterns having various sizes and various intervals were experimented, the number of cells fixed on the periphery of the fine pattern and the number of fixed cells around the empty mesh pattern were effectively formed.

본 발명의 일 실시예에 있어서, MIN6 세포종이 상기 수화젤 구조물 내에 고정된 후 해당 구조물을 배양액 상에서 자유롭게 부유하는 형태로 체외배양하는 경우 사방에서 영양분이 확산되는 과정을 통해 효율적으로 다세포군집이 형성된다.
In one embodiment of the present invention, when the MIN6 cell tumor is immobilized in the hydrated gel structure and then the in vitro culture is carried out in a form in which the construct is floated freely on the culture medium, multicellular clusters are efficiently formed through nutrient diffusion in the four sides .

1 : 미세패턴이 포함된 수화젤 구조물
10: 수화젤 구조물 내 메쉬구멍구조
20: 수화젤 구조물 내 메쉬연결구조
30: 멤브레인 형태로서 수화젤 구조물의 두께
100: 미세패턴이 포함된 수화젤 구조물을 위한 거푸집
110: 메쉬구멍 구조를 위한 거푸집 내 어레이 구조체
120: 그물망 구조를 위한 거푸집 내 바닥 구조체
125: 그물망 구조를 위한 거푸집 내 울타리 구조체
130: 그물막 구조를 위한 거푸집 내 어레이 구조체의 높이
140: 실리콘 웨이퍼
150: 메쉬형태를 위한 울타리 구조체용 첫 번째 포토레지스트
152: 메쉬형태의 미세패터부를 위한 두 번째 포토레지스트
160: 메쉬형태를 위한 울타리 구조체용 첫 번째 마스크
162: 메쉬형태의 미세패턴부를 위한 두 번째 마스크
200: 규칙적 육각 그물망이 포함된 세포수화젤 구조물
210: 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 메쉬구멍
220: 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물망
230: 규칙적 육각 그물패턴이 포함된 세포수화젤 막 구조물
300: 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물패턴의 크기
400: 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물패턴의 간격
200': 규칙적 육각 그물망과 육각기둥이 포함된 세포수화젤 구조물
210': 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 메쉬구멍
220': 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물망
230': 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 세포수화젤 막 구조물
300': 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물패턴의 크기
400': 규칙적으로 육각 그물망과 육각기둥 구조가 반복되는 세포수화젤 구조물 내 규칙적 육각 그물패턴의 간격
500: 세포수화젤 구조물의 그물망 내 고정된 단일세포
550: 세포수화젤 구조물의 메쉬구멍에 형성된 다세포군
600: 세포수화젤 구조물의 메쉬구멍에 형성된 베타세포의 다세포군1: Hydrated gel structure with fine pattern
10: Mesh hole structure in hydrogel structure
20: Mesh connection structure in hydrogel structure
30: Thickness of hydrogel structure in membrane form
100: Formwork for hydrogel structures containing fine patterns
110: Formwork array structure for mesh hole structure
120: Formwork floor structure for network structure
125: Formwork fence structure for network structure
130: Height of array structure in formwork for netting structure
140: Silicon wafer
150: First photoresist for fence structure for mesh form
152: Second photoresist for mesh-shaped micropatterning
160: First mask for fence structure for mesh form
162: second mask for fine pattern part in mesh form
200: Cellular hydrogel structure with regular hexagonal mesh
210: Regular hexagonal mesh holes in cell hydrated gel structures
220: Regular hexagonal mesh in cell hydrated gel structure
230: Cellular hydration gel membrane structure with regular hexagonal pattern
300: Size of regular hexagonal net pattern in cell hydrated gel structure
400: Spacing of regular hexagonal mesh patterns in cell hydrated gel structures
200 ': Cellular hydration gel structure with regular hexagonal mesh and hexagonal column
210 ': Regular hexagonal mesh holes in cellular hydration gel structures where the hexagonal netting and hexagonal column structures are repeated regularly
220 ': Regular hexagonal netting in cell hydrated gel structures with regular hexagonal netting and hexagonal columnar structures
230 ': Cellular hydration gel membrane structure in which the hexagonal network and the hexagonal column structure are repeated regularly
300 ': Size of regular hexagonal net pattern in cellular hydration gel structure with regular hexagonal mesh and hexagonal column structure repeating
400 ': spacing of regular hexagonal net patterns in cellular hydration gel structures where regular hexagonal netting and hexagonal columnar structures are repeated
500: Fixed single cells in a network of cell hydrated gel constructs
550: Multicellular group formed in the mesh hole of the cell hydrated gel structure
600: Multicellular cells of beta cells formed in the mesh holes of cell hydrated gel structure

Claims (16)

메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포 입체배양장치로서,
상기 수화젤 구조물은 상면 및 하면을 갖는 멤브레인 구조이고,
상기 수화젤 구조물에 상기 상면 또는 상기 하면을 관통하는 다수의 미세패턴을 포함하는 미세패턴부가 형성되고,
상기 미세패턴부는 50 내지 500 μm의 폭을 가지는 미세패턴이 적어도 하나 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치.A cell stereostructure apparatus comprising a hydrogel structure having a mesh-shaped fine pattern portion,
The hydrogel structure is a membrane structure having an upper surface and a lower surface,
A fine pattern portion including a plurality of fine patterns passing through the upper surface or the lower surface is formed on the hydrogel structure,
Wherein the fine pattern part is repeated at least one fine pattern having a width of 50 to 500 占 퐉. 제1항에 있어서,
상기 미세패턴은 그 간격이 20 내지 500 μm인 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치.The method according to claim 1,
Wherein the fine pattern has an interval of 20 to 500 mu m. 제 1항에 있어서,
상기 미세패턴의 모양은 대칭 또는 비대칭의 원형 또는 다각형인 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치.The method according to claim 1,
Wherein the shape of the fine pattern is a symmetrical or asymmetric circular or polygonal shape. 제 1항에 있어서,
상기 수화젤 구조물은 50 μm 이상의 높이를 가지는 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치.The method according to claim 1,
Wherein the hydrogel structure has a height of 50 m or more. 제 1 항에 있어서,
상기 수화젤은 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAM) 및 히알루론산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 고분자 물질 또는 둘 이상의 고분자 물질의 혼합 형태인 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치.The method according to claim 1,
The hydrogel may be a polymeric material selected from the group consisting of alginate, gelatin, collagen, chitosan, polyethylene glycol (PEG), poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) and hyaluronic acid, or a mixture of two or more polymers Wherein the cell culture apparatus further comprises: 메쉬 형태의 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 포함하는 세포 입체배양장치를 제작하는 방법으로서,
a) 단일 세포를 수화젤과 혼합시킨 액상의 세포수화젤 혼합물을 준비하는 단계;
b) 상기 세포수화젤 혼합물을 미세패턴이 형성된 거푸집에 위치시키는 단계;
c) 상기 세포수화젤 혼합물을 고형화시켜 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물을 제조하는 단계; 및
d) 상기 미세패턴부가 형성된 수화젤 구조물에서 거푸집을 분리시키는 단계
를 포함하는 세포 입체배양장치를 제작하는 방법.A method for producing a cell stereostructure culture apparatus comprising a hydrogel structure having a mesh-shaped fine pattern portion,
a) preparing a mixture of cell water-hydrating gels in which a single cell is mixed with a hydrating gel;
b) placing the cell hydrated gel mixture in a micropatterned die;
c) solidifying the cell hydrated gel mixture to produce a hydrated gel structure having a fine patterned portion; And
d) separating the mold from the hydrogel structure having the fine pattern portion
Wherein the cell culture apparatus comprises: 제6항에 있어서,
상기 c) 단계에서 수화젤 혼합물의 표면에 미세물방울 형태로 고형화제를 분사하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치를 제작하는 방법.The method according to claim 6,
Further comprising the step of spraying a solidifying agent in the form of fine droplets on the surface of the hydrated gel mixture in step c). 제6항에 있어서,
상기 거푸집은 상기 수화젤 구조물의 상면과 하면을 관통하는 미세패턴의 구조가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 입체배양장치를 제작하는 방법.The method according to claim 6,
Wherein the die has a fine pattern structure penetrating the upper and lower surfaces of the hydrogel structure. 제1항에 따른 세포 입체배양장치를 준비하는 단계; 및
상기 수화젤 혼합물은 영양분을 공급받음으로써 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 세포를 입체배양하는 방법.Preparing a cell stereostructure culture apparatus according to claim 1; And
The hydrated gel mixture is cultured by receiving nutrients
Lt; / RTI > cells. 제9항에 있어서,
상기 수화젤 구조물은 두 개 이상의 수화젤 구조물을 입체적으로 결합시킴으로써 확장된 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the hydrogel structure has an expanded form by sterically bonding two or more hydrated gel structures. 제9항에 있어서,
상기 수화젤 구조물 내에 두 개 이상의 상이한 종류의 세포를 동시에 배양하는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein at least two different types of cells are simultaneously cultured in the hydrated gel structure. 제9항에 있어서,
상기 세포는 다세포군을 형성하면서 상기 메쉬의 구멍 내에 자리를 잡는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the cells are placed in the pores of the mesh while forming a multicellular group. 제9항에 있어서,
상기 수화젤 구조물은 바닥면에 고정된 상태로 일정한 방향성을 가지는 대류에 의해 영양분을 공급받는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the hydrated gel structure is nourished by convection having a predetermined direction while being fixed on a bottom surface. 제9항에 있어서,
상기 수화젤 구조물은 액체 상에서 자유롭게 부유하면서 사방확산에 의해 영양분을 공급받는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the hydrogel structure floats freely in a liquid phase and is supplied with nutrients by a four-way diffusion. 제9항에 있어서,
상기 세포 입체배양장치를 체내에 직접 이식하여 상기 세포를 체내에서 배양하는 것을 특징으로 하는 세포를 입체배양하는 방법.10. The method of claim 9,
Wherein said cell stereostructure culture apparatus is directly implanted into a body, and said cells are cultured in the body. 제1항에 따른 세포 입체배양기를 포함하는 체내 이식용 스캐폴드.



A scaffold for implantation in a living body comprising the stereostructure incubator according to claim 1.



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KR20200109485A (en) * 2019-03-13 2020-09-23 재단법인대구경북과학기술원 Hydrogel micro-well arrays based on micro-through-hole and method for three dimensional single cell isolation and culture using thereof

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