KR102209028B1 - 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 증포 인삼열매 발효물은 총 진세노사이드 및 폴리페놀 함량이 높고, 항산화 활성을 나타내며, 아세틸콜린에스터라제를 억제하고, 치매 동물모델에서 인지기능 및 공간지각능력을 개선시키며, 치매 동물모델의 뇌조직에서 아세틸콜린의 발현 회복 및 아밀로이드-베타 축적을 억제하고, 치매 동물모델의 뇌 손상을 억제하며, 신경세포주에서 뇌손상과 관련된 유전자의 발현을 촉진함으로써, 상기 증포 인삼열매 발효물은 퇴행성 뇌질환 치료, 인지기능 개선 및 뇌보호에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF NEURODEGENERATIVE DISEASES COMPRISING FERMENTED STEAM-DREID GINSENG BERRY}
본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng C.A. meyer)은 오가피과 인삼속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 질병을 예방하고 수명을 연장시키기 위해 사용되어온 생약이다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암 활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장애개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증 개선 효과, 항스트레스 활성, 항피로 작용, 항산화 활성, 항노화 활성 등이 있다.
인삼열매는 3년생까지는 열매가 미성숙하고, 4년생 이후로 열매가 성숙하게 되며, 약재명은 인삼자(人參子)이다. 인삼열매는 원기를 북돋우고, 신체를 강화하며 노화를 지연시키는 것으로 알려져 있으며, 어지러움, 숨가쁨, 종기, 기력부족 등에도 효능이 있다고 알려져 있다. 그러나, 이와 같은 인삼열매는 농가에서 활용도가 낮아 단순히 인삼재배를 위한 종자 획득의 목적으로 채종하고 있다. 다만, 재배를 목적으로 채종하는 종자외에는 생식기관인 꽃과 열매로 활성성분이 분산되는 것을 차단하고 뿌리로 축적되도록 유도하기 위해 5~6월 경에 인삼열매는 제거된다. 인삼의 대표적인 생리활성성분인 진세노사이드는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으나, 인삼열매의 진세노사이드는 인삼근과는 다른 성분 및 함량을 포함하는 것으로 보고되었다.
진세노사이드는 약 30여종 이상이 보고되어 있는데, 이중 6번 위치 탄소에 수소가 결합된 진세노사이드를 프로토파낙사디올(protopanaxadiol) 계열의 사포닌이라 하고, 6번 위치 탄소에 산소가 결합된 진세노사이드를 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol) 계열의 사포닌이라 한다. 인삼 및 산삼에 가장 많이 함유되어 있는 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 등과 같은 일반 진세노사이드는 인체에 바로 흡수되지 않고, 일부가 장내세균총이나 효소에 의해 분해되어 진세노사이드 F1, F2, Rg3, 컴파운드 K 등으로 성분전환된 후, 흡수된다.
이에, 인삼열매의 약리학적 활성에 관한 다양한 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 대한민국 특허공개 제10-2019-0126713호는 인삼열매 다당체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스의 감염 예방 또는 억제용 조성물에 관한 것으로, 특정 성분 및 구조를 갖는 인삼열매 다당체가 뉴라미니데이즈의 활성을 저해하는 효과가 있음을 개시하고 있다.
한편, 퇴행성 뇌질환은 노화와 함께 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환을 의미하며 혈관성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루이체 치매 및 전측두엽 치매 등을 포함한다. 특히, 알츠하이머병과 루이체 치매는 전체 치매환자의 90%를 차지하고 있으나, 많은 연구 및 개발이 지속되고 있음에도 불구하고 행동, 인지 및 기억력 개선과 같은 증상 개선을 돕는 약물만이 치료에 사용되고 있다. 이에, 최근까지 세계적으로 그 치료제의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 국내에서도 천연물 의약품, 합성 의약품, 줄기세포 치료제 및 펩타이드 의약품 등이 연구중이나 가시적인 성과가 없는 상황이다.
대한민국 특허공개 제10-2019-0126713호
본 발명의 목적은 증포 인삼열매 발효물의 퇴행성 뇌질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 증포 인삼열매 발효물의 인지기능 개선 또는 뇌보호 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌보호용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 증포 인삼열매 발효물은 총 진세노사이드 및 폴리페놀 함량이 높고, 항산화 활성을 나타내며, 아세틸콜린에스터라제를 억제하고, 치매 동물모델에서 인지기능 및 공간지각능력을 개선시키며, 치매 동물모델의 뇌조직에서 아세틸콜린의 발현 회복 및 아밀로이드-베타 축적을 억제하고, 치매 동물모델의 뇌 손상을 억제하며, 신경세포주에서 뇌손상과 관련된 유전자의 발현을 촉진함으로써, 상기 증포 인삼열매 발효물은 퇴행성 뇌질환 치료, 인지기능 개선 및 뇌보호에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 증포 인삼열매 발효물을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3년근(3YGB) 또는 4년근(4YGB)의 증포 인삼열매 발효물에 포함된 총 진세노사이드 함량을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 4년근 증포 인삼열매 발효물에 포함된 진세노사이드를 HPLC 분석으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 3년근(3YGB) 또는 4년근(4YGB)의 증포 인삼열매 발효물에 포함된 총 폴리페놀 함량을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 3년근(A) 또는 4년근(B)의 증포 인삼열매 발효물의 라디칼소거능을 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 3년근(3YGB) 또는 4년근(4YGB)의 증포 인삼열매 발효물의 금속이온촉매 산화억제능을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 치매 동물모델에서 인지기능 개선 활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 치매 동물모델에서 공간지각능력 개선 활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 치매 동물모델에서 뇌조직 내 아세틸콜린 회복 활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 치매 동물모델에서 뇌조직 내 아밀로이드-베타의 발현조절을 웨스턴 블롯(A) 또는 ELISA(B) 방법으로 확인한 결과 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 치매 동물모델에서 뇌 손상 억제 활성을 확인한 결과 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 증포 인삼열매 발효물(SGF)의 신경세포주에서 뇌 손상 관련 유전자인 ChAT(A), VAChT(B) 또는 BDNF(C)의 발현 촉진 활성을 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "증포"는 약재를 찌고 말리는 과정을 의미하는 것으로, 이를 아홉번씩 반복하는 것을 구증구포라고 알려져 있다. 증포는 일반적으로 일부 생약의 활성을 강화 또는 약화시키거나 딱딱한 것을 부드럽게 하거나, 독성을 제거하기 위한 가공과정이다. 약재를 물이 들은 솥에 넣고 약한 불로 가열하는 것을 증(蒸)이라 하고, 이를 햇빛에 건조시키는 것을 포(曝)라 한다.
상기 증포는 통상의 기술분야에 잘 알려진 적절한 횟수 및 방법으로 수행될 수 있고, 상기 횟수 및 방법은 통상의 기술자에 의해 변형될 수 있다. 상기 증포한 인삼열매는 특정 횟수로 증포된 인삼열매를 단독으로 사용하거나, 각각 다른 횟수로 증포된 인삼열매를 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 증포 인삼열매 발효물은 증포 인삼열매 추출물이 발효된 것일 수 있다. 상기 증포 인삼열매 추출물은 하기와 같은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다:
1) 증포 인삼열매에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.
또한, 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올 수 있고, 구체적으로, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 주정일 수 있다. 상기 추출용매는 증포 인삼열매 질량의 5 내지 30배, 5 내지 25배, 5 내지 20배, 10 내지 25배, 10 내지 20배로 첨가될 수 있다.
상기 추출방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 1 내지 70시간, 30 내지 60시간, 40 내지 50시간일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상 반복 추출할 수 있다.
한편, 상기 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 구체적으로는 동결건조일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능음료는 증포 인삼열매 추출물을 하나의 용매로 추출하여 단독으로 사용하거나, 각각 다른 종류의 용매를 사용하여 추출된 추출물을 혼합하여 제조될 수 있다. 이때, 상기 증포 인삼열매 추출물은 추출되고 남은 잔사에 추출용매를 더 추가하여 추출된 추출물도 포함할 수 있다.
상기 증포 인삼열매 추출물은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 발효될 수 있고, 상기 발효는 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 발효는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 바실러스(Bacillus) 속 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균으로 수행될 수 있다. 일례로, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 포함할 수 있다. 한편, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilius) 균주를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 발효는 기탁번호 KCTC21084로 수탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 증포 인삼열매 발효물의 제조를 위해 상기 균주는 통상적인 양으로 접종되어 적절한 시간 및 온도하에서 발효될 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 통상의 기술분야에 알려진 퇴행성 뇌질환을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 퇴행성 뇌질환은 아세틸콜린의 발현 억제 및 아밀로이드-베타의 축적으로 발생하는 퇴행성 뇌질환일 수 있다. 일례로, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington disease), 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운 증후군, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매, 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's ataxia), 루이소체 치매(Lewy Body dementia), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy) 또는 전두촉두엽 치매(frontotemporal dementia)일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 증포 인삼열매 발효물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 증포 인삼열매 발효물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 증포 인삼열매 발효물은 증포 인삼열매 추출물이 발효된 것일 수 있고, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같은 방법으로 발효될 수 있고, 상기 발효는 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 구체적으로, 상기 퇴행성 뇌질환은 아세틸콜린의 발현 억제 및 아밀로이드-베타의 축적으로 발생하는 퇴행성 뇌질환일 수 있다.
본 발명의 증포 인삼열매 발효물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 증포 인삼열매 발효물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 증포 인삼열매 발효물은 증포 인삼열매 추출물이 발효된 것일 수 있고, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같은 방법으로 발효될 수 있고, 상기 발효는 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌보호용 건강기능식품을 제공한다.
상기 증포 인삼열매 발효물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 증포 인삼열매 발효물은 증포 인삼열매 추출물이 발효된 것일 수 있고, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 상기 증포 인삼열매 추출물은 상술한 바와 같은 방법으로 발효될 수 있고, 상기 발효는 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 4년근 인삼을 이용한 증포 인삼열매의 추출물의 제조
채취한 인삼열매를 이용하여 다음과 같은 방법으로 증포 인삼열매 추출물을 제조하였다.
먼저, 4년생 인삼으로부터 익기 직전의 인삼열매를 2018년 5월 하순에 채취하고(경기도, 대한민국), 이를 깨끗한 물로 세척한 뒤 열풍건조기(JW-500ED, Jinwoo Electronic Co. 대한민국)를 이용하여 50℃에서 15시간 동안 건조시켰다. 건조된 인삼열매를 95℃에서 5시간 동안 찌고, 50℃에서 1시간 동안 건조시키는 증포과정을 4회 또는 7회 수행함으로써, 4증4포 또는 7증7포의 인삼열매를 수득하였다. 수득된 4증4포 및 7증7포의 인삼열매를 1:1의 무게비로 혼합하여 이의 30배수 용량의 증류수를 첨가하여 95℃에서 24시간 동안 열수 추출을 수행하여, 증포 인삼열매의 열수 추출물을 수득하였다.
또한, 열수 추출물을 수득하고 남은 잔여물에 이의 10배수 용량의 65% 주정(경기도, 대한민국)을 첨가하고, 상온에서 24시간 동안 추출하는 것을 2회 수행하여 증포 인삼열매의 주정 추출물을 수득하였다.
실시예 2. 3년근 인삼을 이용한 증포 인삼열매의 추출물의 제조
4년근 인삼 대신, 3년근 인삼을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법 및 조건으로, 3년근 인삼으로부터 증포 인삼열매의 열수추출물 및 주정 추출물을 제조하였다.
실시예 3. 4년근 인삼을 이용한 증포 인삼열매 추출물의 발효물 제조
상기에서 제조한 4년근 인삼을 이용하여 제조된 증포 인삼열매 추출물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum, KCTC21084) 균주를 접종하여 발효물을 제조하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 인삼열매의 열수추출물 및 주정 추출물을 모두 혼합하고, 여기에 증류수를 첨가하여 3 브릭스(brix)가 되도록 희석하였다. 희석된 혼합물에 1×107 CFU/㎖의 양으로 락토바실러스 플란타럼 균주를 접종하였다. 이를 30℃에서 72시간 동안 발효시킨 뒤, 발효물을 원심분리하여 17.5 브릭스가 되도록 농축하여 4년근 인삼으로부터 수득한 인삼열매를 이용하여 증포 인삼열매 추출물의 발효물을 제조하였다.
이후, 상기 제조된 발효물에 포함된 극성 잔여물을 제거하기 위해 고상추출(solid phase extraction)을 수행하였다. 고상추출은 YMC-Triart C18(YMC, 일본)을 사용하여 국가기술표준원의 표준번호 KS H 2153에 기재된 인삼 및 인삼 제품-진세노사이드 함량 측정-고속액체크로마토그래피법을 참조하여 수행하였다. 이때, 5 ㎖의 메탄올 및 20 ㎖의 물을 이용하여 사전세척을 하고, 100 ㎎/5 ㎖이 되도록 시료를 주입하였으며, 20 ㎖의 물 및 15 ㎖의 30% 에탄올을 사용하여 사후세척을 하고, 10 ㎖의 메탄올을 이용하여 용출시킴으로써, 증포 인삼열매 발효물의 고상추출물을 32.3% 수율로 수득하였다(도 1).
실시예 4. 3년근 인삼을 이용한 증포 인삼열매 추출물의 발효물 제조
실시예 2에서 제조한 3년근 인삼을 이용하여 제조된 증포 인삼열매 추출물을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 조건 및 방법으로 3년근 인삼으로부터 수득한 인삼열매를 이용하여 증포 인삼열매 발효물의 고상추출물을 33.1% 수율로 수득하였다(도 1).
실험예 1. 증포 인삼열매 발효물의 진세노사이드 함량 확인-(1)
1-1. 총 진세노사이드의 함량 확인
상기 제조된 증포 인삼열매 발효물에 포함된 총 진세노사이드의 함량을 바닐린-황산(vanilin-sulfuric acid) 분석법으로 확인하였다.
먼저, 8%의 바닐린과 72%의 황산 용액을 6:84의 부피비로 혼합하여 얼음위에 두어 사용전까지 차갑게 보관하였다. 한편, 실시예 3 및 4에서 수득된 4년근 또는 3년근 인삼으로부터 수득한 증포 인삼열매 추출물의 발효물을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비하고, 0.2 ㎖ 튜브에 10 ㎕ 첨가하였다. 여기에 90 ㎕의 상기 바닐린-황산 용액을 첨가하고 55℃에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 반응물을 얼음에 방치하여 식히고, 96웰 플레이트로 옮겨 545 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 총 진세노사이드의 함량을 정량하기 위한 검량선은 표준품의 진세노사이드 Re를 500 ㎍/㎖의 농도부터 62.5 ㎍/㎖의 농도까지 1/2로 희석하여 작성하였다. 작성된 검량선을 이용하여 본 발명에 따른 증포 인삼열매 발효물 내에 포함된 진세노사이드의 함량을 계산한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 4년근 또는 3년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물은 모두 높은 함량의 진세노사이드를 포함하였다. 특히, 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물이 3년근에 비해 총 진세노사이드 함량이 약 1.7배 높았다.
1-2. 주요 진세노사이드의 함량 확인
상기 제조된 증포 인삼열매 발효물에 포함된 주요 진세노사이드인 F4, Rg3(S), Rg3(R) 및 Rg5의 함량을 상기 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 확인하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 F4 Rg3(S) Rg3(R) Rg5 합계
3년근 30.36 10.60 5.54 5.94 52.44
4년근 34.69 13.85 6.47 8.69 63.70
표 1에 나타난 바와 같이, 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물이 3년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물에 비해 진세노사이드의 함량이 유의적으로 높았다.
실험예 2. 증포 인삼열매 발효물의 진세노사이드 함량 확인-(2)
상기 제조된 4년근 증포 인삼열매 발효물에 포함된 진세노사이드의 함량을 HPLC(high-performance liquid chromatography) 분석 방법으로 확인하였다. 실험은 울티메이트 3000 HPLC 시스템(ultimate 3000 HPLC system, Thermo Scientific, 미국) 및 YMC-트리아트 C18 컬럼(YMC, 일본)을 이용하여 수행하였다. 시료로서 10 ㎎/㎖의 농도로 용해된 실시예 3에서 수득한 4년근 증포 인삼열매 발효물을 0.22 ㎛ PTFE 주사여과기(Hyundai Micro, 한국)를 이용하여 여과한 후, 10 ㎕ 씩 주입하여 분석하였다. 이때, 분석 조건은 하기 표 2 및 3에 나타내었다.
이동상 3차 증류수(A), 아세토니트릴(B)
유속 1.6 ㎖/min
검출기 DAD3000, 203 ㎚
컬럼 YMC-Triart C18 컬럼(250×4.6 ㎜, S-5 ㎛, 12 ㎚)
컬럼온도 30℃
주입량 10 ㎕
시간(분) 물(%) 아세토니트릴(%)
0-10 80 20
10-40 80→68 20→32
40-55 68→50 32→50
55-70 50→35 50→65
70-72 35→10 65→90
72-82 10 90
82-84 10→80 90→20
84-90 80 20
또한, 대조군으로서 진세노사이드 Rg3(S), Rg3(R), Rg5, F4, Rg1, Re, Rb1, Rc, Rd 및 Rk1(Biopurity, 중국)을 125 내지 2,000 ㎍/㎖의 농도범위로 희석하여 표준검량선을 작성하여 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물에는 다양한 종류의 진세노사이드가 골고루 포함되어 있었다.
실험예 3. 증포 인삼열매 발효물의 총 폴리페놀 함량 확인
상기 제조된 증포 인삼열매 발효물에 포함된 총 폴리페놀의 함량을 폴린-시오칼토(folin-ciocalteu) 분석법을 응용하여 확인하였다.
먼저, 실시예 3 및 4에서 수득된 4년근 또는 3년근 인삼으로부터 수득한 증포 인삼열매 추출물의 발효물을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비하고, 0.2 ㎖ 튜브에 10 ㎕ 첨가하였다. 여기에 160 ㎕의 3차 증류수 및 10 ㎕의 폴린-시오칼토 페놀 리에이전트(folin-ciocalteu's phenol reagent, Sigma-aldrich, 미국)를 혼합하고, 암실에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 반응물을 96웰 플레이트에 옮기고, 20% Na2CO3를 첨가하여 암실에서 20분 동안 더 반응시켰다. 반응 후, 상기 96웰 플레이트를 765 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 총 폴리페놀의 함량을 정량하기 위한 검량선은 표준품의 갈산을 500 ㎍/㎖의 농도부터 62.5 ㎍/㎖의 농도까지 1/2로 희석하여 작성하였다. 작성된 검량선을 이용하여 본 발명에 따른 증포 인삼열매 발효물 내에 포함된 총 폴리페놀의 함량을 계산한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 3년근 또는 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물에 높은 함량의 폴리페놀이 포함되어 있었고, 특히 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물이 더 높은 양의 폴리페놀을 포함하였다.
실험예 4. 증포 인삼열매 발효물의 항산화 활성 확인
4-1. 라디칼소거능 확인
상기 제조된 증포 인삼열매 발효물의 항산화 활성을 라디칼소거능 확인을 통해 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 0.3 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 포함하는 메탄올 용액을 제조하고, 여기에 1, 10, 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 실시예 3 또는 실시예 4의 증포 인삼열매 발효물을 첨가하였다. 이를 실온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 517 ㎚의 파장하에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거능을 계산한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 3년근 또는 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물은 각각 383.7 및 174.6 ㎍/㎖의 DPPH IC50를 나타내었다. 특히 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물은 3년근에 비해 약 2배 높은 항산화 활성을 보였다.
4-2. 금속이온촉매 산화억제능 확인
상기 제조된 증포 인삼열매 발효물의 항산화 활성을 금속이온촉매 산화억제는 방법을 통해 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 0.5 ㎍/㎖의 BSA(bovine serum albumin, sigma-aldrich, 미국)를 포함하는 용액에 100 μM의 Cu2+ 및 2.5 mM의 H2O2를 첨가하여 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical)을 생성하였다. 여기에 10, 50 또는 100 ㎍/㎖의 실시예 3 또는 실시예 4의 증포 인삼열매 발효물을 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각각의 반응물을 10% SDS(sodium dedoxyl sulfate) 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하여 증포 인삼열매 발효물에 의한 BSA 단백질 분해 저해 수준을 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로서 50 μM의 아스코르브산을 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 3년근 또는 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물이 우수한 항산화 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 특히, 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물이 10 ㎍/㎖의 낮은 농도에서도 양성 대조군과 유사한 수준으로 BSA 단백질을 보호하여, 항산화 활성이 현저히 우수함을 확인하였다.
실험예 5. 증포 인삼열매 발효물의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성 확인
총 사포닌 함량 및 폴리페놀 함량이 높고, 항산화 활성이 우수한 4년근 인삼열매로부터 수득된 증포 인삼열매 발효물의 아세틸콜린에스테라제(acetylcholine esterase, AChE) 억제 활성을 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 7주령의 수컷 ICR 마우스(Daehan Bio Link, 한국)를 에테르 흡입을 통해 마취시키고, 10 ㎖의 멸균 생리식염수를 심장에 관류시킴으로써 안락사시켰다. 안락사된 마우스로부터 통상적인 방법으로 뇌 조직을 적출하고, 여기에 차가운 100 mM의 PBS를 첨가한 뒤, 조직파쇄기(polytron PT-MR 2100, Luzern, 스위스)로 파쇄시켜 5%의 균질액을 얻었다. 한편, 아세틸티오콜린 요오드(acetylthiocholine iodide, Sigma-aldrich, 미국) 및 DTNB(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid, Sigma-aldrich, 미국)는 각각 PBS 및 에탄올에 용해시켜 0.5 mM의 농도로 준비하였다. 한편, 실시예 4의 증포 인삼열매 발효물은 1, 3, 6, 12. 5, 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 준비하고, 음성 대조군으로는 PBS를 사용하였다.
큐벳에 10 ㎕의 아세틸티오콜린 요오드 용액, 10 ㎕의 DTNB 용액, 30 ㎕의 파쇄된 마우스 뇌 균질액 및 50 ㎕의 상기 준비된 증포 인삼열매 발효물을 혼합하고, 최종 부피가 500 ㎕가 되도록 PBS를 첨가하였다. 이를 412 ㎚의 파장하에서 1분 간격으로 총 3분 동안 흡광도의 변화(ΔOD/min)를 측정하여 그 값을 음성 대조군의 값을 100%로 하여 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 계산한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 증포 인삼열매 발효물이 농도의존적으로 아세틸콜린에스테라제를 억제하였으며, 특히 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 증포 인삼열매 발효물을 처리한 군은 유의적인 효과를 나타내었다.
따라서, 상기로부터 본 발명의 증포 인삼열매 발효물이 아세틸콜린에스테라제를 억제함으로써 인지능 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 6. 증포 인삼열매 발효물의 인지기능 개선 확인
6-1. 치매 동물모델의 제조 및 증포 인삼열매 발효물의 투여
증포 인삼열매 발효물의 인지기능 개선을 확인하기 위해, 먼저 다음과 같은 방법으로 치매 동물모델을 제조하였다.
먼저, 체중이 25 g 내외인 6주령 ICR 수컷 마우스(C57BL/6J, DBL Co. Ltd., 한국)를 구입하고, 상기 마우스를 그룹당 8마리가 되도록, 6개의 그룹으로 무작위 분배하였다. 마우스는 공기가 조절된 세미-SPF(semi-SPF)실에서 23±2℃의 온도, 55±10%의 상대습도, 12회/시간의 환기 횟수, 12시간의 조명주기, 및 150 내지 300 Lux의 조도하에서 사육되었다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물시험윤리위원회의 승인(CBNUR-1287-19)하에 동기관의 표준작업 지침서에 따라 수행되었다.
사육 1주일 후부터 마우스에 시험물질을 투여하였다. 증포 인삼열매 발효물은 6주 동안 매일 100, 300 또는 500 ㎎/㎏의 투여량으로 경구투여되었다. 이때, 양성 대조군으로서는 100 ㎎/㎏의 EGCG(epigallocatechin gallate) 처리군을, 음성 대조군으로서는 아무것도 처리하지 않은 무처리군 및 아밀로이드-베타(amyloid-β, Aβ1-42)만 투여한 아밀로이드-베타 처리군을 사용하였다(표 5).
그룹 투여약물 및 투여량 동물 수
무처리군 증류수 9
아밀로이드-베타 처리군 증류수 9
증포 인삼열매 발효물 100 100 ㎎/㎏ 6
증포 인삼열매 발효물 300 300 ㎎/㎏ 8
증포 인삼열매 발효물 500 500 ㎎/㎏ 7
EGCG 100 100 ㎎/㎏ 6
시험물질의 투여 마지막날, 마우스를 에테르 흡입으로 마취시키고 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame, Stoelting, 미국)에 고정시켰다. 고정된 마우스의 뇌실 내(AP: 0.6, ML: 1.1, DV: 2.0 ㎜)에 5 ㎕의 5 ㎎/㎖ 아밀로이드-베타를 투여하여 치매를 유발시켰다.
상기 투여기간 동안 매일 체중을 측정하여 이상징후를 판단하였으나, 유의적인 체중변화는 관찰되지 않았다.
6-2. 수동회피반응시험(passive avoidance test, PAT)
실험예 1에서 증포 인삼열매 발효물 및 치매유발 물질인 아밀로이드-베타를 투여한 마우스의 인지기능 개선 효과를 수동회피반응시험을 통해 확인하였다. 수동회피반응시험은 아밀로이드-베타 투여 후, 48시간부터 2시간 간격으로 6회 측정하였다.
먼저, 어두운 방 및 밝은 방으로 나뉜 수동회시 상자의 밝은 방에 마우스를 위치시키고, 상기 마우스가 어두운 방으로 이동하면 1 ㎃의 세기로 2초 동안 전기충격을 가했다. 이를 반복하면서 마우스가 밝은 방에서 체류하는 시간을 측정하여 마우스의 기억력을 평가하였다. 특히 180초 이상의 시간 동안 마우스가 밝은 방에 머무는 경우, 상기 마우스의 기억력이 형성된 것으로 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 마우스는 횟수가 증가할때마다 밝은 방에 머무르는 시간이 점차 늘어났고, 5회차에는 180초 이상 머물러 기억력이 완전히 형성되었다. 반면, 아밀로이드-베타만을 처리한 아밀로이드-베타 처리군은 6회차까지 학습에 의한 기억 형성이 저조하였다.
본 발명의 증포 인삼열매 발효물을 처리한 군은 아밀로이드-베타에 의해 감소된 인지기능 저하가 투여량 의존적으로 증가되었다. 특히, 500 ㎎/㎏의 투여량으로 증포 인삼열매 발효물을 투여한 투여군은 기억력이 정상 수준으로 회복되어 양성 대조군인 EGCG와 유사하게 높은 효능을 보였다.
6-3. 수중미로시험(morris water-maze test, MWMT)
실험예 1에서 증포 인삼열매 발효물 및 치매유발 물질인 아밀로이드-베타를 투여한 마우스의 공간지각능력 개선 효과를 수중미로시험을 통해 확인하였다. 수중미로시험은 증포 인삼열매 발효물을 투여하는 6일동안 1일 1회 수행하였다.
먼저, 원형의 수조에 22±2℃ 온도의 물을 채우고, 스티로폼을 넣어 수면 아래의 피신용 플랫폼을 가려 준비하였다. 마우스를 물에 넣어, 상기 마우스가 수조 주변의 표지물을 기억하고 수조 내 일정한 장소에 위치한 플랫폼을 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 측정하였다. 이때, 마우스가 180초를 경과한 시간에도 플랫폼을 찾지 못하는 경우, 이를 플랫폼에 30초 동안 머물게 하여 기억을 유도하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 마우스는 횟수가 반복될 때마다 플랫폼을 찾아가는 시간이 단축되어 4일째에는 30초 이내에 도달하였다. 반면, 아밀로이드-베타만을 처리한 아밀로이드-베타 처리군은 6회차까지 공간지각능력이 회복되지 않았다.
본 발명의 증포 인삼열매 발효물을 처리한 군은 아밀로이드-베타에 의해 감소된 공간지각능력이 투여량의존적으로 회복되었다. 특히, 500 ㎎/㎏의 투여량으로 증포 인삼열매 발효물을 투여한 투여군은 공간지각능력이 정상 수준으로 회복되어 양성 대조군인 EGCG와 유사하게 높은 효능을 보였다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 증포 인삼열매 발효물이 인지기능이나 공간지각능력을 개선시켜, 치매의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 증포 인삼열매 발효물의 뇌조직 내 아세틸콜린 회복효과 확인
증포 인삼열매 발효물이 뇌조직 내 아세틸콜린(acetylcholine)의 농도를 증가시키는지 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실험예 6에서 증포 인삼열매 발효물을 투여한 마우스의 뇌를 모든 실험이 종료된 후 차가운 식염수를 이용하여 뇌를 충분히 관류시켜 적출하였다. 적출된 뇌조직은 액체질소에 동결하여 보관하다가, 실험 당일 중량을 측정한 후, 이의 10배 부피의 차가운 PBS를 넣고 균질기를 이용하여 균질화시켰다. 균질화된 균질액을 암플렉스 레트 아세틸콜린/아세틸콜린에스터라제 분석 키트(Amplex Red acethylcholine/acethylcholine esterase assay kit, Invitrogen, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 아밀로이드-베타 처리군은 뇌 내 아세틸콜린의 농도가 무처리군에 비해 유의적으로 감소하였다. 그러나, 감소된 아세틸콜린의 농도는 증포 인삼열매 발효물의 처리 농도에 의존적으로 증가하였으며, 500 ㎎/㎏의 투여량으로 증포 인삼열매 발효물을 투여한 투여군은 아세틸콜린의 농도가 정상수준으로 회복되었다.
실험예 8. 증포 인삼열매 발효물의 뇌조직 내 아밀로이드-베타 발현조절 확인
증포 인삼열매 발효물이 뇌조직 내 아밀로이드-베타의 발현을 조절하는지 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, 실험예 7에서 적출한 뇌조직을 이용하여 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하거나, Aβ1-42 ELISA 키트(IBL, 일본)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 그 결과, 아밀로이드-베타의 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 도 11A에, ELISA로 확인한 결과를 도 11B에 나타내었다.
도 11A 및 11B에 나타난 바와 같이, 아밀로이드-베타 처리에 의해 증가된 뇌 내 아밀로이드-베타의 양이 증포 인삼열매 발효물의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. 특히, 300 ㎎/㎏ 이상의 투여량으로 증포 인삼열매 발효물을 투여한 마우스의 뇌조직에서 유의적으로 아밀로이드-베타의 양이 감소하였다.
상기로부터 본 발명의 증포 인삼열매 발효물이 뇌조직 내에서 아밀로이드-베타의 축적을 억제함으로써 뇌 보호 활성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 9. 증포 인삼열매 발효물의 뇌 손상 억제 활성 확인
증포 인삼열매 발효물이 뇌 손상을 억제하는 활성을 나타내는지를 손상된 뇌의 바이오마커인 GFAP 단백질의 발현변화를 통해 확인하였다.
구체적으로, 실험예 7에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 적출한 뇌조직을 4%의 파라포름알데히드 용액에 고정시켜 동결조직 슬라이드를 제작하였다. 상기 슬라이드를 항-GFAP(Abcam, 미국) 항체를 1차 항체로서 사용하고, 알렉사플루오로-488(Alexa Fluor-488)이 결합된 2차 항체(Molecular Probes, 미국)로 면역염색하고, 세포핵을 DAPI(4'-6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 면역염색을 통상적인 방법으로 수행하였으며, 그 결과 염색된 세포를 촬영한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 아밀로이드-베타 처리군은 뇌조직에서 GFAP 단백질이 발현된 별아교세포(astrocyte)가 평균 412개였고, 이는 87개인 무처리군에 비해 4.7배 증가하였다. 그러나, 이는 증포 인삼열매 발효물의 처리 농도에 의존적으로 감소하였고, 특히 500 ㎎/㎏의 투여량으로 증포 인삼열매 발효물을 투여한 투여군은 GFAP 단백질의 발현이 정상수준으로 회복되었다.
실험예 10. 증포 인삼열매 발효물의 뇌보호 유전자 발현조절 확인
증포 인삼열매 발효물이 뇌 손상 억제에 관련된 유전자인 ChAT(choline acetyltransferase), VAChT(vasicular acetylcholine transporter) 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 유전자의 발현 변화를 qPCR 방법으로 확인하였다.
먼저, 마우스의 신경세포주인 Neuro-2a(N2a) 세포주는 10% 우태아혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Hyclone, 미국) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하여 준비하였다. 이때, 배양된 세포가 배양접시의 약 90%까지 증식하였을 때 사용하였고, 20패시지(passage)가 넘지 않도록 조절하였다. 상기 준비된 세포를 6웰 플레이트의 웰당 1.5×106개가 되도록 분주하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 배양된 세포에 1, 5, 10 또는 25 ㎍/㎖의 농도가 되도록 증포 인삼열매 발효물을 처리하고 이를 24시간 동안 더 배양하였다. 이때, 대조군으로서 무처리 대조군을 사용하였다.
배양된 세포에 1 ㎖의 트리졸(trizol, Life Technologies, 미국) 시약을 첨가하여 세포를 용해시키고, 실온에서 방치하였다. 5분 후, 여기에 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 13,500 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 500 ㎕의 상층액에 동량의 이소프로필 알코올을 첨가하여 13,500 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침강시켰다. 침강된 RNA를 DEPC(diethyl pyrocarbonate, Sigma-Aldrich, 미국) 증류수로 희석한 75% 에탄올 0.75 ㎖로 세척하고, 공기중에서 건조시킴으로써 RNA를 수득하였다. 1 ㎍의 RNA를 주형으로 임프롬-II 역전사 시스템(Improm-II reverse transcription system, Promega, 미국) 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여 역전사반응을 수행하였다. 수득된 cDNA를 주형으로 하기 표 6에 기재된 프라이머 및 로터-진 6000(Rotor-Gene 6000, Qiagen, 미국)을 사용하여 qPCR을 수행하여 ChAT, VAChT 및 BDNF 유전자의 발현을 정량적으로 확인하였다. 확인된 유전자의 발현량은 β-액틴 유전자의 발현량으로 정상화(normalization)한 상대 수치로 도 13에 나타내었다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
iNOS_forward TGCCCCTGGAAGTTTCTCTT 서열번호 1
iNOS_reverse ACTGCCCCAGTTTTTGATCC 서열번호 2
ChAT_forward CCTGCCAGTCAACTCTAGCC 서열번호 3
ChAT_reverse GGAAGCCGGTATGATGAGAA 서열번호 4
VAChT_forward TTGATCGCATGAGCTACGAC 서열번호 5
VAChT_reverse CCACTAGGCTTCCAAAGCTG 서열번호 6
BDNF_forward ATGCTCAGCAGTCAAGTGCC 서열번호 7
BDNF_reverse TTTTATCTGCCGCTGTGACC 서열번호 8
β-actin_forward TACAGCTTCACCACCACAGC 서열번호 9
β-actin_reverse AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC 서열번호 10
도 13에 나타난 바와 같이, 증포 인삼열매 발효물의 처리 농도에 의존적으로 ChAT, VAChT 및 BDNF 유전자의 발현이 증가하였다.
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Claims (9)

  1. 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 발효물은 기탁번호 KCTC21084로 수탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주로 발효시켜 수득된 것인 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 증포 인삼열매 발효물은 증포 인삼열매 추출물을 발효시킨 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 증포 인삼열매 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이의 혼합물로 추출된, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올이 에탄올, 메탄올 또는 주정인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington disease), 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운 증후군, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매, 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's ataxia), 루이소체 치매(Lewy Body dementia), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy) 또는 전두촉두엽 치매(frontotemporal dementia)인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 발효물은 기탁번호 KCTC21084로 수탁된 락토바실러스 플란타럼 균주로 발효시켜 수득된 것인 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 증포 인삼열매 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 발효물은 기탁번호 KCTC21084로 수탁된 락토바실러스 플란타럼 균주로 발효시켜 수득된 것인 인지기능 개선용 건강기능식품.
  9. 삭제
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