KR102202118B1

KR102202118B1 - 수확 전 발아를 조절할 수 있는 신규 유전자

Info

Publication number: KR102202118B1
Application number: KR1020190129276A
Authority: KR
Inventors: 김재윤
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-01-12

Abstract

본 발명은 수확 전 발아에 관여하는 신규한 유전자에 관한 것으로, 본 발명 유전자의 넉아웃을 통해서, 수확 전 발아가 억제된 종자 또는 식물체를 제공할 수 있어, 밀, 쌀, 보리 등 작물에서 수확 전 발아 저항성 품종을 제공하거나, 종래 품종에 수확 전 발아 억제 처리를 하여, 문제가 되는 수확 전 발아를 줄여 생산량 증대에 기여할 수 있다.

Description

수확 전 발아를 조절할 수 있는 신규 유전자{A NOVEL GENE CONTROLLING PRE HARVEST SPROUT}

본 발명은 수확 전 발아에 관여하는 신규 유전자에 관한 것으로, 구체적으로 수확 전 발아가 억제된 종자 또는 식물체 및 상기 유전자 넉아웃을 이용한 수확 전 발아 억제된 식물체 제조방법에 관한 것이다.

음이온 채널은 막 수송의 한 종류로, 식물 막에 편재하게 분포되어 있다. 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC)은 모든 유기체의 외부 미토콘드리아 막에서 발견된다. VDAC는 모든 진핵생물계의 미토콘드리아로부터 분리되며, 혈장 지질 이중층에 혼입될 때 거대한 전압-게이트 공극을 형성한다. VDAC는 채널이 개방된 상태에서 이를 통해 자유롭게 통과할 수 있는 6kDa 미만의 작은 분자에 대해서 투과성이다.

수확 전 발아(수발아)는 성숙기에 가까운 화곡류의 이삭이 도복이나 강우로 젖은 상태가 오래 지속되면 이삭에서 싹이 트는 것을 말하며, 수발아한 씨알은 종자용이나 식용으로 사용이 부적당하고, 수화물의 품질도 떨어뜨리기 때문에, 화곡류 작물에서 수발아 현상을 억제하는 것은 식물 육종 분야에서 매우 중요한 목표 중 하나이다.

최근 유전자 교정 기술을 이용한 수발아 억제 품종이 개발되고 있으나, 아직까지 VDAC 유전자가가 식물의 수확 전 발아에 관여함을 밝힌 문헌은 없었다.

본 발명은 상기 과제를 해결하고자, 수확 전 발아(pre-harvest sprouting; PHS)) 처리 조건에서 한국 밀에서 전사체 분석을 통해 TaVDAC 유전자를 분리하고, 모델 식물에서 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 표적화된 돌연변이 유발 식물을 제조하여, PHS 스트레스 하에서 VDAC 유전자의 생리적 메커니즘을 확인한 결과, VDAC 유전자가 식물 종자에서 수확 전 발아에 관여하는 신규 유전자임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 신규한 VDAC 유전자를 넉아웃하면 밀 등의 종자에서 수확 전 발아를 억제할 수 있는바, 본 발명은 수확 전 발아를 억제할 수 있는 조성물 또는 키트, 수확 전 발아가 억제된 종자 또는 식물체, 수확 전 발아를 억제하는 방법 및 수확 전 발아가 억제된 식물체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

상기한 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 일 양태로 화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하여 VDAC 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함하는 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법을 제공한다.

다른 양태로 본 발명은 화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하는 것; 및 상기 넉아웃에 의하여 VDAC 유전자의 발현을 저해된 화곡류 식물 세포를 재분화하는 것을 포함하는 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태로 본 발명은 VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체를 제공한다.

또 다른 양태로 본 발명은 VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 종자를 제공한다.

또 다른 양태로 본 발명은 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 화곡류 식물의 수확 전 발아 억제용 조성물을 제공한다.

또 다른 양태로 본 발명은 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 조절할 수 있는 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 제공한다.

본 발명은 화곡류 식물에서 종자의 수확 전 발아를 조절할 수 있는 신규 유전자에 관한 것으로, 본 발명의 유전자를 넉아웃하여 수확 전 발아가 억제된 종자를 제조할 수 있어, 밀, 벼, 또는 보리 등 화곡류 식물의 수확량 증대에 기여할 수 있다.

도 1a은 본 발명의 일 실시예에 따라서 수확 전 발아(PHS)를 유도하는 처리를 수행하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 1b는 본 발명이 일 실시예 따른 수확 전 발아 처리된 금강 및과 우리밀의 PHS 처리 1일째(PHS1), 7일 째(PHS2), 10일 째(PHS10) 그리고 14일 째(PHS14)에 수확된 밀의 수확 전 발아 상태를 보여주는 사진이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 금강 밀(K0, K1, K7 및 K14)과 우리밀(W0, W1, W7 및 W14)의 수확 전 발아 처리 과정(PHS 처리 1일째(PHS1), 7일 째(PHS2), 14일 째(PHS14) VDAC 유전자 발현 변화를 보여주는 그래프이다.
도 1d는 본 발명에 일 실시예에 따라 금강 밀(K25, K35, K7 및 K14)과 우리밀(W25, W35, 및 W45)의 출수기 이후 VDAC 유전자 발현을 확인한 그래프이다.
도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따른 종자 발아 단계에서 금강 밀과 우리밀에서 VDAC 유전자 발현을 확인한 그래프이다.
도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따른 종자 발아 단계에서 금강 밀과 우리밀에서 A 게놈, B게놈 및 D게놈 중 VDAC 유전자 발현을 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 VDAC 단백질 서열과 보리의 VDAC 단백질 서열을 비교확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CRISPR/CAS9 시스템을 포함한 형진전환 구조체를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 세포를 재분화하는 단계를 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환체로부터 VDAC 유전자 서열을 확인하여, 형질전환체(VD7, VD8, VD12)의 서열이 야생형 서열 비교(a)하고, 형질전환체에서 RT-PCR을 통한 VDAC 유전자 발현을 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 PCR을 이용해서 형질전환-프리 브라키포디움 변이 식물을 확인한 것으로, (a)는 야생형(WT) 및 T1 형질전환 라인에서 HRM 커브를 보여주고, (b)는 VD7 게놈 DNA의 자손으로부터 증폭된 PCR 산물을 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 형질전환 식물(V7, V8, V10, V11, V12 또는 V13)과 야생형(WT) 브라키포디움에서 VDAC 유전자의 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형과 형질전환체에서 종자 발아를 확인한 것으로, (a)는 호르몬 없이 기본 MS 배지, (b) 내지 (d)는 각각 50 μM GA3, 50 μM PAC 또는 100 μM ABA 호르몬이 각각 포함된 배지에서 발아 결과를 확인한 것이다.

이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.

다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 발명자는 식물의 수확 전 발아를 조절할 수 있는 신규한 유전자로 전압-의존성 음이온 채널을 확인하여, 본 발명을 확인하였다.

이러한, 측면에서 본 발명은 신규한 유전자로서 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 조절할 수 있는 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 제공한다.

전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC)은 모든 유기체의 외부 미토콘드리아 막에서 발견되는 것으로, 물질의 수송에 관여한다. 본 발명에서는 이러한 VDAC 유전자가 화곡류 식물에서 발아와 관련 있음을 새롭게 확인하였고, 발아 시 종자 내 발현이 증가하는 양상을 보이는 VDAC 유전자를 넉아웃하여 발현을 억제하면, 종자의 수확 전 발아가 저해됨을 새롭게 확인하였다. 특히, 본 발명 VDAC 유전자는 발아 시 또는 직전에 발현양이 현저하게 증가하였다가, 발아 이후에는 감소하는 양상을 나타내었고, 이를 통해서, VDAC 유전자가 발아 시에만 발현량이 높게 나타남을 확인하였다. 이후, VDAC를 넉아웃한 종자의 경우 야생형 종자와 비교해서 발아가 저해됨을 확인하여, 본 발명의 VDAC 유전자의 넉아웃에 의하여 종자에서 발아 저해될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자의 수확 전 발아 조절능은 단자엽 식물의 모델 식물인 브라키포디움(서열번호 1 및 서열번호 2)에서 확인하였고, 상기 브라키토디움이 VDAC 단백질이 기 공지된 화곡류 식물 밀(A 게놈: TraesCS5A02G19370000.1; B 게놈: TraesCS5B02G189000.1; D 게놈: TraesCS5D02G196100.1)과 보리의 VDAC 단백질(HORVU3Hr1G051010.2)과 87 내지 97% 유사성이 가짐을 확인하였으므로, 브라키포디움 외에 상기한 밀과 보리를 포함하는 화곡류 식물의 VDAC 유전자 모두 본 발명에 포함되어 동일한 효과를 나타내는 것으로 이해된다.

이러한 측면에서, 본 발명에 따른 VDAC 유전자는 밀, 보리, 벼, 조 또는 옥수수로부터 유래된 VDAC 유전자를 포함하고, 바람직하게는 밀, 보리 또는 벼의 VDAC 유전자를 포함한다. 일 예로, 밀의 VDAC 유전자는 UniProtKB - Q41590 (Q41590_WHEAT)등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, VDAC 단백질은 브라키포디움의 VDAC 단백질 외에 이의 기능적 동등물도 포함한다. 상기 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 브라키포디움 VDAC 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 본 발명에서는 구체적으로 밀(A 게놈: TraesCS5A02G19370000.1; B 게놈: TraesCS5B02G189000.1; D 게놈: TraesCS5D02G196100.1)과 보리(HORVU3Hr1G051010.2)의 VDAC 단백질을 포함한다.

일 양태로서, 본 발명은 화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하여 VDAC 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함하는 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법을 제공한다.

상기 VDAC 유전자는 상기한 기재를 준용한다.

상기 화곡류 식물은 벼, 보리, 밀, 조 또는 옥수수일 수 있고, 바람직하게는 벼, 보리 또는 밀 일 수 있다.

상기 유전자를 넉아웃하는 방법은 본 발명 기술분야에서 통상적으로 사용되는 유전자 넉 아웃 또는 넉 다운하는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명은 일 실시예에서 본 발명의 일 실시예에서 밀에서 발아시기에 VDAC 유전자의 발현이 증가됨을 실험적으로 확인하였고, VDAC 유전자가 넉아웃된 형질전환체에서 수확 전 발아가 저해됨을 실험적으로 확인하였다.

상기한 상기 유전자 발현의 저해는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 유전자 교정법에 의해서 유전자를 넉아웃하여 수행될 수 있다. CRISPR/CAS9 시스템은 특정한 유전체의 좌위에서 돌연변이를 유도할 수 있는 간편하고 쉬운 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(sgRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 역할을 하는 Cas9 nuclease로 구성되어 있으며, 세포에 plasmid DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 완전히 억제할 수 있는 넉 아웃(knock-out)이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는 Cas9 시스템을 이용해서, 브라키포디움의 세포에서 VDAC 유전자를 넉아웃하고, 이를 다시 재분화하여, 해당 식물체에서 VDAC 유전자가 넉아웃되어, 수확 전 발아가 저해됨을 확인하였다.

일 실시예에서, 브라키포디움의 서열번호 1의 VDAC 유전자 중에서 1575 번째 내지 1597번째 서열을 표적 서열로 하여, Cas9 시스템을 설계하고, 이를 아그로박테리움에 삽입하고, 이를 매개로 브라키포디움 식물 세포를 형질전환하여, 식물세포에서 VDAC 유전자를 넉아웃하였다. 그 결과 12개의 형질전환체가 확인되었고, 그 중 3개에서 VDAC 유전자의 표적 부위에서 일부 뉴클레오티드의 결실이 나타남을 확인하였다.

상기 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9 코딩 서열일 수 있고, 벡터 또는 발현 식물에 맞춰 코돈 최적화된 서열도 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 3의 Cas9 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.

본 발명에서 단일 가이드 RNA는 편집하려는 DNA의 위치를 찾아내는 역할을 수행하는 단일가닥 RNA를 의미하며, 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~20bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제되지 않는다.

본 발명에서 단일 가이드 RNA는 가이드 RNA 스캐폴드 서열과 VDAC 유전자에 대한 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 VDAC 유전자에 대한 표적 서열은 단일 가이드 RNA 스캐폴드 서열의 앞 또는 뒤에 연결될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 가이드 RNA 카세트 서열(서열번호 7)을 포함하는 구조체를 구축하여 실험에 이용하였다. 그러나 가이드 RNA는 본 발명의 기술분야에서 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하는 경우 사용될 수 있는 것이라면, 서열번호 7의 가이드 RNA 카세트 서열 외에도 모두 본 발명에 포함될 수 있고, 상기 실시예의 가이드 RNA에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA)의 폴리뉴클레오티드를 통해서 단일 가닥 RNA가 만들어지며, 상기 단일가닥 RNA는 VDAC 유전자 중에서 표적서열과 상보적으로 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다.

본 발명에서는 재조합 벡터가 식물세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 Cas9 단백질과 상기 Cas9 단백질에 결합되며 표적 서열로 Cas9 단백질을 이끄는 sgRNA가 함께 발현되게 된다.

상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP0116718B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히, 바람직한 형태는 EP0120516B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

상기 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 비아포스(bialophos), 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 pKCRISPR_MC 벡터에서 네오마이신 마커를 포함하도록 변경하여 사용하였다.

본 발명의 벡터에서 프로모터를 포함할 수 있고, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, TaU6 또는 히스톤 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머 라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 프로모터의 종류는 본 발명에서 제한되지 않으며, 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 외래의 DNA를 적당한 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP0301316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 식물의 어떤한 세포도 모두 본 발명에 적용 가능하다. 식물 세포는 비성숙 배, 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하는 것; 및 상기 넉아웃에 의하여 VDAC 유전자의 발현을 저해된 화곡류 식물 세포를 재분화하는 것을 포함하는 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 유전자 발현의 저해는 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터로 화곡류 식물 세포를 형질전환하는 것을 포함할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, sgRNA 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA에 의해 생성되는 gRNA를 통해서 VDAC 유전자가 편집되고, 식물세포에서 VDAC 유전자 발현이 저해되어, 비 형질전환체와 비교해서 종자 발아가 억제되어, 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물을 제조할 수 있다.

상기 VDAC 유전자의 종류는 화곡류 식물 유래일 수 있고, 일 예로 벼, 보리, 밀, 조 또는 옥수수일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 바람직하게는 벼, 보리 또는 밀 일 수 있다.

본 발명의 식물체 제조방법에 있어서 기재의 중복을 피하기 위해, 상술한 기재를 준용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 VDAC 유전자가 넉아웃된 경우, 식물체에서 수확 전 발아를 저해할 수 있음을 확인하였는바, 이러한 측면에서 본 발명은 VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체를 제공할 수 있다.

상기한 식물체는 바람직하게는 앞서 기술된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 제조 방법에 따라 제조된 식물체 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 브라키포디움 형질전환체 중에서 서열번호 1의 염기서열에서 1575 내지 1597과 상응하는 염기서열 중 일부가 결실되어, 상기 상응하는 염기서열이 서열번호 20 내지 22의 서열을 나타내는 수확 전 발아 억제된 브라키포디움 형질전환체를 제조하여, VDAC 유전자에 넉아웃에 따른 발아 억제능을 확인하였다.

상기 식물체는 식물 세포, 조직, 묘, 묘목 또는 종자 일 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 종자를 제공한다.

상기 종자는 벼, 보리, 밀, 조 또는 옥수수의 종자일 수 있다. 본 발명에 따른 VDAC가 넉아웃된 종자는 수확 전 발아가 나타나지 않고, 해당 종자로부터 수확 전 발아가 나타나지 않은 식물체를 재배할 수 있어, 화곡류 재배 시 수확 전 발아에 의한 피해를 상당수 줄일 수 있게 해준다.

본 발명의 다른 목적으로 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 화곡류 식물의 수확 전 발아 억제용 조성물을 제공한다.

상술한 기재와 같이 단일 가닥의 가이드 RNA는 VDAC 유전자 서열을 표적서열로 하여 상보적으로 결합하고, 이에 이어 Cas9 단백질이 표적 부위에서 절단 등을 통해 유전자 교정을 일으키게 되며, 이에 의해 표적 유전자가 넉아웃되는 효과를 가질 수 있다.

표적서열이 되는 VDAC 유전자는 식물체의 종류에 따라 표적 부위가 다르게 설정될 수 있으나, VDAC 유전자를 넉 아웃 시키면 수확 전 발아를 억제할 수 있다는 효과는 동일하게 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1] 밀 품종 간 PHS의 표현형 및 발현 분석

발아 종자와 미발아 종자 간의 차이를 확인하기 위해서, 밀 품종간 표현형과 유전자 발현의 차이를 확인하였다. 수확 전 발아(PHS) 조건에서 VDAC 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해서 한국 밀 품종 중 PHS 감수성 품종인 금강과 PHS 저항성 종인 우리를 이용하여 실험을 수행하였다.

수확 전 발아를 유발하기 위해서 금강과 우리 밀을 화분에서 키운 후, 화분을 옆으로 넘어뜨려, 수조에서 물에 접촉하도록 14일 동안 처리하였다(도 1a). 각 실험군에서 길러진 밀 출수 후 25일, 35일 그리고 45일(DAF 25, DAF 35, 및 DAF 45) 째 와 발아단계(파종 후 5일째)에 각각 수확하였다. 대조군으로는 발아시키지 않은 금강과 우리 밀 종자를 이용하였다.

각 실험군의 표현형을 확인하고(도 1a 및 도 1b), 수확 전 발아(PHS) 스트레스 처리 조건에서 한국 밀(품종명: 금강, 및 우리)의 유전자 발현 분석을 위해서 TaVDAC(TraesCS5A02G193700)를 분리하였다.

수확된 금강과 우리 밀 각각에서 발아시키지 않은 종자(NS)에서 분리된 VDAC 유전자의 cDNA와 발아시킨 종자(S)의 VDAC 유전자의 cDNA를 프라이머(TaVDAC_A와 TaVDAC_con, 표 1)를 이용해서 실시간-PCR을 통해서 PHS 스트레스 조건 하에서 TaVDAC의 발현 수준(도 1c) PHS 스트레스 처리 후 DAF 25, DAF 35, 및 DAF 45 시점에서 TaVDAC의 발현 수준(도 1d)을 확인하였다.

도 1c에 나타낸 바와 같이, 금강의 경우 수확 전 발아 감수성 품종으로 PHS 처리시 발아 가능성이 매우 높은 7일 째에 VDAC 유전자 발현량이 매우 높아짐을 알 수 있고, 수확 전 발아가 일어난 PHS 14일 째에는 오히려 VDAC 유전자의 발현량이 낮아짐을 확인할 수 있다. 우리 품종의 경우 PHS 저항성 품종으로 PHS 처리에도 불구하고, VDAC 유전자의 발현 변화가 크지 않은 것을 알 수 있다.

도 1d에 나타낸 바와 같이 출수 후 25일 및 35일 째에 VDAC 유전자의 발현량이 높다가, 45일 째에는 발현량이 낮아짐을 확인하였다. 이는 출수 후 25일과 35일 째에 발아 가능성이 더욱 높게 유지됨을 의미하며, 45일 째에는 출수 후 낱알의 건조가 일어나 발아 가능성이 오히려 낮아짐을 의미한다.

또한, VDAC 유전자가 발아와 관련된 유전자임을 확인하였는바, 수확 전 발아뿐 아니라, 종자 상태에서 발아하는 경우에도 VDAC 유전자가 관여함을 확인하기 위해서, 파종 전 1시간 동안 침윤 처리한 종자를 이용해서 발아 실험을 진행하고, RT-PCR로 발아 단계에서 TaVDAC의 발현 수준을 확인하였다(도 1e).

도 1e에 나타낸 바와 같이, 초기 종자(발아되지 않은 종자)에서는 VDAC 유전자의 발현이 매우 낮으나, 종자 발아 후 5일 째에, VDAC 유전자의 발현이 매우 높아짐을 확인할 수 있고, 이는 VDAC 유전자가 종자발아 에서도 관여함을 의미한다.

더불어, 밀은 이질 6배체 식물로, 상동 염색체가 6개 존재하므로, A, B, D 게놈 중에서, 어느 염색체에 존재하는 VDAC 유전자에 의해 나타남을 확인하기 위해서, A 게놈에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용해서 RT-PCR을 수행하고, A, B, D genome 모두에 결합할 수 있는 보전된(conserved) 부분의 염기서열을 바탕으로 제작된 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 VDAC 유전자의 발현 양상을 확인하였다.

서열번호	유전자	Reference ID	Sense(5'-3')	Antisense(5'-3')
8,9	TaVDAC_A	TraesCS5B02G189000.1	CGGAACTAGTGCTCTAGCTC	TGTTCAGGTTCAGGGATGCG
10,11	TaVDAC_con	TraesCS5B02G189000.1	CAGTACTTGCATGATTATG	AGGTTGACTACAGGATTGG

도 1f에 나타낸 바와 같이, 두 가지 경우 모두에서 종자 발아 시 발현 양상이 동일하게 나타났고, 이는 A, B, 및 D 게놈 모두 관계없이 VDAC 유전자의 발현 양상이 동일함을 확인한 것이다.

[실시예 2] 브라키포디움의 VDAC 유전자(BdBVDAC)의 동정

브라키포디움(Brachypodium, strain Bd21)의 잎에서 추출한 RNA를 기반으로 하여 cDNA 합성 키트(Intron Biotechnology DR, Korea)를 이용하여 cDNA 전환을 수행하여 BdVDAC cDNA를 제작하였다. cDNA 주형은 AMV 역전사 효소에 의해 합성되었다. 합성된 cDNA는 BdVDAC 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되었고, pLUG-Prime TA-cloning vector kit II(Intron Biotechnology DR, Korea)를 이용해서 클로닝되어 pLUG-BdVDAC 플라스미드를 제조하였다. 사용된 모든 프라이머 쌍들은 표 2에 정리하였다.

서열번호	프라이머 명	방향	5'- 3'	기타
12	CRISPR_U6_BdVDAC_F2	정방향	CTTGTTGATGAGCTTGCAGCGCC	gRNA 제작용
13	CRISPR_U6_BdVDAC_R	역방향	AAACGGCGCTGCAAGCTCATCAAC	gRNA 제작용
14	CRI_T7E1_BdVDAC_F	정방향	AACCTGTATCTGTGCAGTGT	T7E1 assay용
15	CRI_T7E1_BdVDAC_R	역방향	TTAGTTCCAAACGAGCCAGA	T7E1 assay용
16	BdVDAC_UTR_F1	정방향	TCGCACTTA GAATATGGG GAC	CDS
17	BdVDAC_UTR_R1	역방향	CGGAATGAA ACACAGCAG TT	CDS
18	BdVDAC_qRT_F2	정방향	GATGTGAAG GCAAACTCA GC	RT-PCR용
19	BdVDAC_qRT_R2	역방향	AACGAGCCA GATAGGTTG AC	RT-PCR용
20	BdUBC18_qRT_F	정방향	GGAGGCACCTCAGGTCATTT	RT-PCR용
21	BdUBC18_qRT_R	역방향	ATAGCGGTCATTGTCTTGCG	RT-PCR용

브라키포디움 VDAC 유전자를 동정하여, 서열번호 1의 브라키포디움의 VDAC 유전자의 게놈 DNA 서열과 서열번호 2의 브라키포디움 VDAC 유전자의 cDNA 서열을 확인하였다.상기에서 서열 확인된 BdVDAC 단백질과 기존에 알려진 밀의 VDAC(A 게놈: TraesCS5A02G19370000.1; B 게놈: TraesCS5B02G189000.1; D 게놈: TraesCS5D02G196100.1), 보리의 VDAC 단백질(HORVU3Hr1G051010.2)과 유사성을 비교해 본 결과, BdVDAC는 밀, 보리의 VDAC 단백질들과 87 내지 97% 유사성을 가지는 것을 확인했다(도 2).

따라서, 외떡잎 식물의 모델식물인 브라키포디움을 이용해서 이후 VDAC 유전자 서열의 기능 및 넉 아웃에 따른 효과를 확인하는 실험을 하였다.

[실시예 3] 플라스미드 제작 및 형질전환 식물 제작

BdVDAC 유전자(Bradi4g28660)의 시퀀스를 기반으로 가이드 RNA를 제작하였다. Cas 단백질은 서열번호 3의 Cas9 단백질을 코딩하는 염기서열에 사용하였다. 비-표적 효과(Off-target effect)를 방지하기 위해서 미스매치(mismatch)가 4개 이상 존재하는 BdVDAC 유전자(Bradi4g28660; http://brachy.bmep.riken.jp/ver.1/hits_table.pl?type=Brachy&search_word=Bradi4g&method=by_GENEID&version=&p=305)의 4번 엑손(exon)을 표적(target)으로하여 VDAC 특이적인 가이드 RNA를 제작하였다. 사용된 모든 프라이머 쌍들은 표 2에 정리하였다.

서열번호	Gene	Reference ID	gRNA 표적(5'-3')	Mismatch
16	BdVDAC	Bradi4g28660	GTTGATGAGCTTGCAGCGCCAGG	>4

TaU6 프로모터 서열 (서열번호 4)

GACCAAGCCCGTTATTCTGACAGTTCTGGTGCTCAACACATTTATATTTATCAAGGAGCACATTGTTACTCACTGCTAGGAGGGAATCGAACTAGGAATATTGATCAGAGGAACTACGAGAGAGCTGAAGATAACTGCCCTCTAGCTCTCACTGATCTGGGTCGCATAGTGAGATGCAGCCCACGTGAGTTCAGCAACGGTCTAGCGCTGGGCTTTTAGGCCCGCATGATCGGGCTTTTGTCGGGTGGTCGACGTGTTCACGATTGGGGAGAGCAACGCAGCAGTTCCTCTTAGTTTAGTCCCACCTCGCCTGTCCAGCAGAGTTCTGACCGGTTTATAAACTCGCTTGCTGCATCAGACTT

gRNA 표적에 대한 BsaI 매개 골든 게이트 클로닝 사이트 (서열번호 5)

GCGGTCCACCATGTCCGCCG

gRNA 스캐폴드 서열 (서열번호 6)

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

벡터는 한국과학기술연구원(KIST)에서 pKCRISPR_MC 벡터를 받아 하이그로마이신 유전자(Hygromycin gene)을 네오마이신(Neomycin) 유전자(NPTII)로 교체하여 사용하였다. 표적 부위 서열 프라이머를 PCR에 의해 합성 한 다음, VDAC특이적인 프라이머와 T4 PNK(NEB, USA)를 이용하여 DNA oligo duplex를 만든 후, T4 DNA ligase(NEB, USA)를 이용하여 벡터에 삽입(pKCRISPR_MC_NPTII)하고, 항시 발현 TaU6 프로모터에 연결시킨 플라스미드 pKCRISPR_NPTII:BdVDAC를 최종적으로 제조하였다(도 3).

상기 구축물들은 동결-용해법(freeze-thaw method, Chen et al., Biotechniques, 16(664-668):670)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL1로 도입시켰다.

브라키포디움(Bd21)의 비성숙 배로부터 얻은 배아 캘러스를 상기 pKCRISPR_NPTII:BdVDACrk 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL1과 공동배양하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 유도하고, 이후, 배지에 4 mg/L 카나마이신을 처리하여, 남은 세포만 선별하였다(구체적인 방법은 Alves et al. 2009, A protocol for Agrobacterium-mediated transformation of Brachypodium distachyon community standard line Bd21.에 따름).

선별된 세포를 종래 알려진 방법에 따라 배양하여, Plant cell Report, 2019, Over-expression of the Brachypodium ASR gene, BdASR4, enhances drought tolerance in Brachypodium distachyon에 기재된 방법에 따라 도 4에 나타낸 바와 같이, 형질전환 식물을 재분화하였다.

13개의 T₀ 형질전환 식물로부터 6개의 돌연변이 식물을 동정하였고, 유전자 분석 결과 형질전환 식물은 표적 부위에서 다양한 결실 돌연변이를 나타냄을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이 형질전환 식물 VD7, VD8 및 VD12는 각각 1개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드가 결실됨을 알 수 있다.

[실시예 4] RNA 분리 및 RT-PCR을 통한 형질전환체 선발

형질전환 브라키포디움 및 야생형 브라키포디움으로부터 RibospinTM Plant kit(GeneAll, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출 및 정제되었다. cDNA 주형은 AMV 역전사 효소에 의해 합성되었다. RT-PCR은 유전자 특이적인 프라이머 쌍과 BrightGreen 2X qPCR MasterMix(abm, Canada)를 이용하여 수행되었다. 브라키포디움 UBC18(Bradi4g00660) 유전자는 내부 대조군으로 사용되었다.

발아된 종자의 총 RNA는 형질전환 브라키포디움(7 및 12 라인)과 야생형 브라키포디움의 발아 10일 후 전체 식물체에서 추출되었다. pKCRISPR_MC_NPTII:BdVDAC 운반체가 삽입되어 변이가 발생한 5개 라인(7, 8, 10, 11, 12 및 13) 중 야생형 BdVDAC 유전자와의 발현을 비교 했을 때, 발현이 적은 7, 12번 독립 라인을 선발하였다(도 5 및 도 7).

[실시예 5] VDAC 넉 아웃 형질전환체에서 발아 특성

종자발아 시기의 형질전환체에서 넉 아웃 BdVDAC의 종자와 야생형 종자를 이용하여 MS 배지에 GA3 50μM, PAC 50μM, ABA 100μM가 각각 함유된 배지들과 기본 MS 배지에서 발아 테스트를 진행하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 기본 MS 배지에서 형질전환체는 모델 식물인 브라키포디움 야생형(Bd21)과 비교해서 발아 및 생장이 억제되는 것을 확인하였으며, GA3가 함유된 배지에서는 억제되었던 생장이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, PAC가 함유된 배지에서는 브라키포디움 야생형(Bd21)과 비교해서 형질전환체의 발아 및 생장이 억제되는 것을 확인하였다. ABA가 함유된 배지에서는 야생형과 형질전환체 모두 생장이 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 VDAC가 GA3 신호전달에도 관여할 수 있음을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> A NOVEL GENE CONTROLLING PRE HARVEST SPROUT <130> P19U25C0972 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2819 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 1 atggttgggc caggcctcta caccgagatc ggcaagaaga ccaggggtac gtatccacgc 60 ctccatgttc ctcaaatcct ccattcccga gctgtggatt ttttttcctt tctccgagct 120 ggattccaag gagatgatga tgttttcccc ctcgctacag atctgctcta cagggactac 180 cagaccgacc acaagttcac cctcctcacc acctacaccg ccaatggcgt cgtaagtgct 240 ccgcaccata ttctctccgg tactccccgt ttggtcaggt tgcgtcgctc cgtggtccgt 300 tgcgcgagaa aagagacgtg gtctgacccg agctttagga gatgacggct cttgatctat 360 tcgctctgta tattgtccta ccatgtgatc tgagggattc gtcgctgggt ggcactgggg 420 gattttgatt ggtattgctg tttatggata agagaaatga ttctgttggt tcgagagaaa 480 gtggtggagc tataatgaag agtcatctac tagccttgtt gtgtcgcgtt tttcttaatg 540 acaatattgt tatcattagt gcttttggtg ttttggtgag ataacttgtt atcattatgg 600 agttttggcg agacagcttg ttatagtaat atgctttata agcatttgta ggtaggttag 660 attgtaaaca atgaaccaca aatttgacat caagccatca actattttgt tgaggtagta 720 tgttgagatt ttctgtcatg gttgacctgc gactcagttt tagctttaat tcatgctagg 780 gaatttgtca tgctttaggc caaaacaaat gggctaatcc aatattataa gctatattgc 840 tgtattgctg gtgcgaccct tcttttggtg tggtgggatg gttctgttct aattttttcc 900 cttggaaata aaatatgata atttattcct aaataaatga tagtttatct tcagggtggt 960 gcaactcaat tcagattcat actgttcaac taatgatata ttttgcaaat gaacactttg 1020 gtggatgccg cctcattctt gcagagtctt tgtttcaagc ggcactacgt caaaatttgt 1080 ataaccgtgt tgatagctat atttttcact gatataatac cgtacatatc tgggcttttc 1140 ttaatattaa taccttttct tgactcaaat gctgttattt ttttagaacc tgtatctgtg 1200 cagtgtctac ggtatatgtt ttgacatccc ttgatatttc ttgatgcagg caattactgc 1260 tacaagttca aagaaggctg atctgatatt tggtgagatc caatcacaga taaagaacaa 1320 gggcgtcact gttgatgtga aggcaaactc agcctcaaat gtaccccctc tctctctctc 1380 acttaacaca cctgtacctt gatgctatgt cgtgaaattc cagtagtatc caactgtcca 1440 tgcatatgat gaaataattg tgatcaattt tctgtgtgac tgattagcat caaacatctc 1500 aagtattctg ctttgtgtcc tgcttttggt attgactgct tcggtctctt gggcaggtca 1560 ttactacagt taccgttgat gagcttgcag cgccaggact gaagaccatc ttcagctttg 1620 ctattcctga tcagagatct ggaaaggtag tgttataact tataaccatc gttgtgatgt 1680 tttcttaatt gaaatttatt attgcttata tttaactttt tttttacagc ttgagcttca 1740 gtacttgcat gattatgctg gtattaatgc aagcattgga ttgactgcca atcctgtagt 1800 caacctatct ggctcgtttg gaactaatgc tctagctgtt ggtgctgatg tttcacttga 1860 tactgccacg aagaatttca ccaaatacaa cgctggtctt agcttcacta atgatgatct 1920 cactgcatcc ctgaacctgt gagttttcaa aatctagcgt tgtgattttt tatgttcaag 1980 attactaatc ttagtttttt ttagaaacaa tctttgctta ttccttgtga gatctgcata 2040 tagtcattat gtggcgtttc tctcttagaa agttatttca gttgtcaaag tatagcttag 2100 taactaaagt atcagttggc aaccttttag aaatagtcat gaaggtttga ttttgttatt 2160 agtccactct gtcgtgtttt aatgtatctg gcagctgcat taactggtct aggcagggga 2220 cattgctctg tggtttgatt agataaagaa aaatacaaat tcgatagttc ctgttgagtt 2280 aatctagcga gtactgctta gtagtgctaa aagttgagat actgggcagt tagaatcttc 2340 gagtgaaacc aactgatgag ctgtgaataa ttgttatttt ctcatcatat gtttgctggt 2400 caaaaattta tcgggtatga gaaggtccta gttacaagga accaacttca actttcagtg 2460 cactgcccgg ctgcccgcca atttccgtga atgaattaat ttcttcttgc aggaacaaca 2520 agggagacag cctcaccgca tcctattacc actttgttga gaaatccaca aagacagctg 2580 ttggagcgga gctgacccac agcttctcaa gcaatgagaa caccctcatc ttcggtaccc 2640 agcatactct ggacccactc acccttgtga aggcccgcat caacaactct ggcaaggcca 2700 gcgctttgat ccagcacgag ttcaggccaa ggtctctgtg cacaatctca gcagaagtcg 2760 acaccaaggc catcgagaag agctcgaagg ttggcattgc agtggccctg aagccttga 2819 <210> 2 <211> 831 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 2 atggttgggc caggcctcta caccgagatc ggcaagaaga ccagggatct gctctacagg 60 gactaccaga ccgaccacaa gttcaccctc accacctaca ccgccaatgg cgtcgcaatt 120 actgctacaa gttcaaagaa ggctgatctg atatttggtg agatccaatc acagataaag 180 aacaagggcg tcactgttga tgtgaaggca aactcagcct caaatgtcat tactacagtt 240 accgttgatg agcttgcagc gccaggactg aagaccatct tcagctttgc tattcctgat 300 cagagatctg gaaagcttga gcttcagtac ttgcatgatt atgctggtat taatgcaagc 360 attggattga ctgccaatcc tgtagtcaac ctatctggct cgtttggaac taatgctcta 420 gctgttggtg ctgatgtttc acttgatact gccacgaaga atttcaccaa atacaacgct 480 ggtcttagct tcactaatga tgatctcact gcatccctga acctgaacaa caagggagac 540 agcctcaccg catcctatta ccactttgtt gagaaatcca caaagacagc tgttggagcg 600 gagctgaccc acagcttctc aagcaatgag aacaccctca tcttcggtac ccagcatact 660 ctggacccac tcacccttgt gaaggcccgc atcaacaact ctggcaaggc cagcgctttg 720 atccagcacg agttcaggcc aaggtctctg tgcacaatct cagcagaagt cgacaccaag 780 gccatcgaga agagctcgaa ggttggcatt gcagtggccc tgaagccttg a 831 <210> 3 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR-associated endonuclease Cas9 <400> 3 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu 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target <400> 5 gcggtccacc atgtccgccg 20 <210> 6 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA scaffold <400> 6 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83 <210> 7 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA expression cassette <400> 7 gaccaagccc gttattctga cagttctggt gctcaacaca tttatattta tcaaggagca 60 cattgttact cactgctagg agggaatcga actaggaata ttgatcagag gaactacgag 120 agagctgaag ataactgccc tctagctctc actgatctgg gtcgcatagt gagatgcagc 180 ccacgtgagt tcagcaacgg tctagcgctg ggcttttagg cccgcatgat cgggcttttg 240 tcgggtggtc gacgtgttca cgattgggga gagcaacgca gcagttcctc ttagtttagt 300 cccacctcgc ctgtccagca gagttctgac cggtttataa actcgcttgc tgcatcagac 360 ttgcggtcca ccatgtccgc cggttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 420 tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttt 465 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for TaVDAC_A <400> 8 cggaactagt gctctagctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for TaVDAC_A <400> 9 tgttcaggtt cagggatgcg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for TaVDAC_con <400> 10 cagtacttgc atgattatg 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for TaVDAC_con <400> 11 aggttgacta caggattgg 19 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_U6_BdVDAC_F2 primer <400> 12 cttgttgatg agcttgcagc gcc 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_U6_BdVDAC_R primer <400> 13 aaacggcgct gcaagctcat caac 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRI_T7E1_BdVDAC_F primer <400> 14 aacctgtatc tgtgcagtgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRI_T7E1_BdVDAC_R primer <400> 15 ttagttccaa acgagccaga 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BdVDAC_UTR_F1 primer <400> 16 tcgcacttag 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Claims

화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하여 VDAC 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함하는 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 유전자 발현의 저해는 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터로 화곡류 식물 세포를 형질전환하여 VDAC 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함하는 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 형질전환은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 전기천공법, 현미주사법, 입자충격법, 또는 아그로박테리움법에 따라 수행되는 것인 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 화곡류 식물은 벼, 보리, 밀, 조 또는 옥수수 인 것인 화곡류 식물에서 수확 전 발아를 저해하는 방법.
화곡류 식물 세포에서 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자를 넉아웃하는 것; 및
상기 넉아웃에 의하여 VDAC 유전자의 발현을 저해된 화곡류 식물 세포를 재분화하는 것을 포함하는 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체를 제조하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 유전자 발현의 저해는 전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터로 화곡류 식물 세포를 형질전환하는 것을 포함하고,
상기 재분화는 형질전환된 식물 세포를 재분화하는 것인 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 제조 방법.
VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체.
제7항에 있어서,
상기 식물체는 제5항 또는 제6항의 방법에 따라 제조된 것인 식물체.
VDAC 유전자가 넉아웃된 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 종자.
제9항에 있어서,
상기 종자는 제5항 또는 제6항의 방법에 따라 수확 전 발아가 저해된 화곡류 식물체의 종자.
제9항에 있어서,
상기 종자는 벼, 보리, 밀, 조 또는 옥수수의 종자인 화곡류 식물체의 종자.
전압-의존성 음이온 채널(voltage-dependent anion channel; VDAC) 유전자에 대한 표적 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 발현시키는 폴리뉴클레오티드 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 화곡류 식물의 수확 전 발아 억제용 조성물.